Post on 05-Dec-2014
LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA DASAR
KI-3261 METABOLISME DAN INFORMASI GENETIK
Percobaan 6
UREASE
Nama : Nisrina Rizkia
NIM : 10510002
Kelompok : 6
Tanggal Percobaan : 21 Maret 2013
Tanggal Laporan : 28 Maret 2013
Asisten Praktikum : Ka Sari
LABORATORIUM BIOKIMIAPROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMINSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2013
UREASE
I. Tujuan
Menentukan kadar urea dalam sampel urin dengan metode titrasi
II. Dasar Teori
Urin adalah cairan yang disekresikan oleh ginjal dan dikeluarkan dari tubuh
melalui proses urinasi. Kandungan urin diantaranya garam anorganik, urea, senyawa
organik dan garam ammonium organik. Diantara kandungan tersebut urea adalah
kandungan terbanyak yaitu 13.4 mg/L dari 37.057 mg/L (Putnam, 1971). Penetapan
kadar urea dalam tubuh sangatlah penting karena dapat dijadikan analisis untuk
mengetahui disfungsi ginjal. Kadar urea di dalam urin atau cairan lainnya dapat
ditentukan secara enzimatik dengan enzim urease menggunakan alat Conway. Urea
akan diubah menjadi ammonium karbonat. Dengan penambahan alkali, ammonia akan
dibebaskan. Amonia yang bebas akan berdifusi ke dalam cawan-cawan yang berisi
larutan asam borat, sehingga terikat menjadi ammonium tetraborat. Kemudian dititrasi
dengan asam sulfat atau asam klorida menggunakan indikator Tashiro, sehingga kadar
urea dapat ditentukan. Reaksi yang terjadi adalah:
CO (NH2)2 + 2 H2O ⟶ (NH4)2CO3
(NH4)2CO3 ⇌ 2 NH4+ + CO3
2-
2 NH4+ + 2OH- ⇌ 2 NH4OH
2 NH4OH ⟶ 2 NH3 + 2H2O
2 NH3 + 2 H3BO3 ⟶ 2 NH4+ + 2 H2BO3
-
2 NH4+ + 2 H2BO3
- + 2H+ ⟶ 2 NH4+ + 2 H3BO3
III. Data Pengamatan
Alat Conway V titran (mL)
Conway I 0.725
Conway II 0.1
Conway III 4.35
Conway IV 0.075
IV. Perhitungan dan Pengolahan Data
V NH4+ = (VIII - VIV ) – ( VI – VII )
V NH4+ = (4.35 - 0.075 ) – ( 0.725 – 0.1 ) mL
V NH4+ = 3.65 mL
Mol NH4+ = V NH4
+ [HCl]
Mol NH4+ = 3.65 mL x 0.005 M
Mol NH4+ = 0.01825 mmol
Mol urea = ½ mol NH4+
Mol urea = ½ 0.01825 mol
Mol urea = 0.009125 mol
Massa urea = mol urea x Mr urea
Massa urea = 0.009125 mmol x 60 gram/mol
Massa urea = 0.5475 mgram
Kadar urea = massa urea
volumeurine
Kadar urea = 0.5475 mg
0.2mL = 2.7375 mg/mL
V. Pembahasan
Pada percobaan ini ditentukan kadar urea dalam sampel urin manusia. Teknik yang
dilakukan dalam percobaan ini adalah microdifusi Conway. Pada salah satu sisi pemisah
ditambahkan K2CO3 jenuh kemudian pada sisi lainnya ditambahkan urin, aquadest, urin dan
larutan urease, atau aquadest dan laruan urease. Pada bagian tengah diisi dengan asam borat
dan ditambahkan indikator Tashiro. Alat Conway ditutup dengan menambahkan gliserin,
NaOH dan PP. Larutan pada kedua sisi pemisah dicampurkan. Amonia yang dibebaskan dari
reaksi akan ditangkap oleh asam borat yang terlihat dengan adanya perubahan warna
(Institut Pertanian Bogor, 2010).Semula asam borat yang ditambahkan indikator Tashiro
berwarna biru kemudian berubah menjadi berwarna hijau tosca. Pada penentuan kadar urea
ini menggunakan metode titrasi balik di mana, asam borat yang menangkap ammonia
dititrasi dengan menggunakan HCl hingga warnanya berubah seperti semula yaitu berwarna
biru.
Pada percobaan ini menggunakan beberapa reagen yaitu asam borat, gliserin + NaOH
+ PP, K2CO3 jenuh, larutan urease yang mengandung bufer fosfat dan EDTA. Fungsi dari
asam borat adalah untuk menangkap NH3 yang dihasilkan dari reaksi sehingga menjadi
ammonium tetraborat. Gas ammonia yang dilepaskan bersifat basa sehingga diperlukan
larutan yang bersifat asam untuk menangkapnya (Heny Yusrini, 2002). Selain asam borat,
larutan H2SO4 0.1 M juga dapat digunakan untuk menangkap NH3 (Yohanes Setyo, 2007).
EDTA yang ditambahkan berfungsi untuk mengikat logam-logam yang terdapat pada
sampel urin, sehingga terbentuk kompleks dengan logam-logam contohnya saja dengan Ca2+
dan Mg2+. Urease memiliki gugus –SH yang peka terhadap logam, sehingga apabila apabila
gugus –SH berikatan dengan logam tersebut akan menyebabkan enzim urease tidak aktif.
EDTA yang merupakan chelating agent dapat mengikat ion logam lebih kuat daripada –SH.
Dengan adanya logam dan terbentuk kompleks logam-protein akan membuat protein sulit
larut, entalpi pelarutan akan naik. Sehingga menyebabkan protein terdenaturasi. Gliserin
dibutuhkan untuk memvakumkan alat Conway agar tidak adanya amoniak yang keluar. Pada
gliserin juga ditambahkan dengan NaOH dan PP yang berfungsi untuk mengetahui adanya
kebocoran aliran gas NH3, hal tersebut dapat terlihat dengan warna merah muda pada tutup
alat Conway. K2CO3 jenuh berfungsi untuk menghasilkan OH- sehingga reaksi bergeser ke
arah pembentukan NH4OH dan NH3. Buffer digunakan untuk menstabilkan ion ammonium
yang terbentuk karena dalam air akan membentuk NH4OH. Pada alat Conway I berfungsi
untuk mengetahui kadar ammonia dari urin, pada Conway II sebagai control ammonia dari
aquadest, pada Conway III untuk mengetahui ammonia dari hasil kerja urease, sedangkan
Conway IV untuk mengetahui ammonia yang berasal dari urease itu sendiri.
Batas kadar urea normal dalam urin manusia adalah 9.3 g/L, dalam percobaan kali ini
diperoleh kadar urea dalam sampel urin adalah 2.7375 mg/mL atau 2.7375 g/L, hal tersebut
menandakan bahwa kadar urea dalam urin termasuk normal. Apabila kadar urea dalam urin
cukup tinggi dapat disebabkan oleh penyakit ginjal yang berakibat pada penurunan aktivitas
filtrasi glomerulus untuk urea sehingga urea meningkat dan juga obstruksi saluran keluar
urin. Kadar urea yang rendah dapat disebabkan karena kecepatan anabolisme protein yang
tinggi dapat timbul selama pengobatan untuk karsinoma payudara dan juga malnutrisi
protein jangka panjang.
Di dalam tubuh manusia terdapat siklus urea. Reaksi keseluruhan dari siklus urea
tersebut dapat dilihat pada gambar 1. Gugus asam amino yang pertama masuk dalam siklus
urea adalah ammonia bebas dari deaminasi oksidatif glutamat yang dikatalisis oleh
glutamate dehidrogenase di dalam mitokondria sel hati.
Gambar 1. Siklus urea
Glutamat - + NAD + + H2O α- ketogluarat 2- + NH4+ + NADH + H+
Kemudian ammonia tersebut bereaksi dengan CO2 yang dihasilkan di dalam mitokondria
karena adanya proses respirasi, sehingga akan terbentuk karbamoil fosfat. Reaksi ini
membutuhkan ATP dan enzim karbamoil fosfat sintese I.
Kemudian karbamoil fosfat memberikan gugus karbamoil kepada ornitin untuk membentuk
sitrulin dan melepaskan fosfat, dalam reaksi ini memerlukan Mg2+ dan ornitin
transkarbamoilase.
Sitrulin yang terbentuk meninggalkan mitokondria dan menuju sitosol sel hati. Gugus amino
selanjutnya berasal dari L-aspartat yang dihasilkan dari reaksi transaminasi dengan bantuan
aspartat transaminase.
Oksaloasetat + L-glutamat L-aspartat + α-ketogluarat
Aspartat dan sitrulin bereaksi dengan bantuan ATP dan argininosuksinat sintetase – enzim
yang bergantung pada Mg2+- , sehingga membentuk argininosksinat.
Kemudian argininosuksinat berubah menjadi arginin dan fumarat dengan bantuan enzim
argininosuksinase
Kemudian arginase hati menguraikan arginin untuk menghasilkan urea.
Urease disebut juga urea amidohidrolase. Urea ditemukan dalam jumlah besar pada
jack bean, kacang kedeai dan biji tanaman, beberapa jaringan binatang dan pencernaan
mikroorganisme. Urease bekerja pada ph optimum 7.4 dan suhu optimim 64oC. Urease
adalah enzim metallo nikel yang mengkatalisis degradasi urea menjad ammonia. Peran
utama urease adalah menyediakan energy internal dan eksternal bagi organism untuk
menyediakan urea atau hidroksiurea sebagai sumber Nitrogen. Enzim urease yang
ditemukan dalam Helicobacter pylori diperkirakan memberikan stabilitas tambahan yang
berfungsi memproduksi amoniak untuk menetralisisr asam lambung. Urease juga digunakan
untuk mendeteksi ion logam berat pada pencemaran air, yang terdiri dari elektroda emas dan
selaput enzim yang terbentuk pada bagian sensitif. Mekanisme reaksi urease dapat terlihat
pada gambar 2.
Gambar 2. Mekanisme reaksi urease (Estiu and Merz, Jr., 2007)
Pertama kali urease diisolasi oleh James B. Sumner, pertama kita ekstrak urease dari
jack bean dengan menggunakan alkohol 30%. Ekstrak alkohol disaring dengan cepat namun
endapan yang terbentuk terdiri dari urease, concavalin A, concavalin B dan protein lain.
Kemudian digunakanlah aseton untuk menggantikan alkohol 30%, melarutkan 316 mL aseton ke
dalam 1000 mL untuk mengekstaksi urease. Setelah ekstrak aseton ditunggu semalaman tidak
timbul adanya endapan. Namun ketika dilihat dibawah mikroskop banyak sekali kristal kecil
yang terbentuk hal tersebut menandakan urease berhasil diisolasi (Sumner, 1946). Filtrat
disentrifuga dan endapan kristal urease dicampurkan dengan 31.6% aseton dan disentrifuga
kembali. Kristal urease yang berhasil diisolasi nampak pada gambar 3.
Prosedur lebih jelas mengenai isolasi urease ini dijelaskan dalam sebuah jurnal.
Pertama digunakan aseton untuk menghilangkan air dan asam dari campuran CaCl2 dan
Ca(OH)2 . Tempatkan 158 cc distilat dalam 500 cc dengan melakukan pengenceran dengan air
suling. Dinginkan hingga suhu mencapai 22oC. dimasukkan 100 gram jack bean. Diaduk hingga
3 sampai 4 menit untuk memecahkannya. Kemudian setelah itu disaring. Kemudian filtrate
ditempatkan pada suhu 2-2.5 oC selama semalam, kemudian sentrifuga Kristal yang terbentuk
dari filtrate tersebut. Kristal yang terbentuk dilarutkan dalam 5-10 cc 31.6% aseton kemudian
disentrifuga dan kemudian disaring. Kristal dilarutkan dalam air suling kemudian disentrifuga
dan diamati Kristal tersebut di bawah mikroskop (Sumner, 1926).
Gambar 3. Kristal urease
Analisis urea di dalam urin dapat dilakukan dengan beberapa metode:
1. Kolorimetri
Urea dihidrolisis menjadi ammonia dan karbondioksida. Kemudian ammonia bereaksi dengan
alkalin hipoklorit dan sodium salisilat, dengan adanya natrium nitroprusida maka akan
terbentuk kompleks berwarna hijau. Diukur abdorbansi dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 550 nm. Intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan kadar urea
dalam sampel.
2. UV Auto Fast-rate
Urea ditambah air dengan adanya urease dan membentuk ammonium dan HCO3- . Amonium
yang terbentuk bereaksi dengan Oxoglutarate dan NADH dengan adanya glutamate
dehidrogenase menjadi L-Glutamat, NAD+ dan air. Penurunan absorban dari NAD+, semakin
rendah berarti semakin banyak NADH yang digunakan dan semakin banyak kandungan urea.
Absorban diukur pada panjang gelombang 340 nm.
3. Metode Barthelot
Urea dipecah menjadi ammonia dan karbondioksida. Amonia yang dibebaskan direaksikan
dengan sodiumphenate dan hypochloric dan membentuk senyawa indofenol kemudian sampel
dibaca absorbansinya pada 546 nm.
4. Kadar urea dalam urin dan dalam darah dapat ditentukan dengan mengguankan 1H NMR
dengan menggunakan sinyal air sebagai referensi konsentrasi. Metode ini bersifat non-
destructive bagi sampel yang akan dianalisis (Liu L, 2011).
VI. Kesimpulan
Kadar urea pada sampel urine yang dianalisis adalah 2.7375 mg/mL
VII. Daftar Pustaka
Heny Yusrini, Penangkapan dan Pengukuran Gas Amonia pada Kotoran Ayam, Temu
Teknis Fungsional non Peneliti, 2002, 98-103
Yohanes Setyo, Kajian Tingkat Pencemaran Udara oleh Gas NH3 dan H2S Pada Proses
Pengomposan Secara Aerob. Agrotekno 13 (1), 2010, 25-28.
http://repository.ipb.ac.id/bitstream/handle/123456789/55389/BAB%20III%20MATERI
%20DAN%20METODE.pdf?sequence=5 (diakses tanggal 27 Maret 2013 pukul
09.09)
http://digilib.unimus.ac.id/files/disk1/103/jtptunimus-gdl-datiastuti-5150-2-bab2.pdf
(diakses tanggal 27 Maret 2013 pukul 10.50)
Guillermina Estiu and Kenneth M. Merz, Jr, Competitive Hydrolytic and Elimination
Mechanisms in the Urease Catalyzed Decomposition of Urea. J. Phys. Chem. B 2007,
111, 2007, 10263-10274
Sumner J.B, The Chemical Nature of Enzyme, Nobel Lecture, 1946
Sumner J.B, The Isolation and Crystallization of The Enzyme Urease, 1926, 435-441.
Liu L, Mo H, Wei S, Raftery D, Quantitative analysis of urea in human urine and serum
by 1H nuclear magnetic resonance, NCBI, 2012, 595-600
David F. Putnam, Composition and Concentrative Properties of Human Urine, National
Aeronautics and Space Administration, 1971, 40.