Post on 12-Apr-2016
description
Sejarah ELISA
Sebelum pengembangan ELISA, satu-satunya pilihan untuk melakukan
suatu immunoassay adalah radioimmunoassay, teknik menggunakan antigen
berlabel radioaktif atau antibodi. Dalam radioimmunoassay, radioaktivitas
memberikan sinyal, yang menunjukkan apakah suatu antigen tertentu atau
antibodi hadir dalam sampel. Radioimmunoassay pertama kali dijelaskan dalam
kertas oleh Rosalyn Sussman Yalow dan Salomo Berson diterbitkan pada tahun
1960. Sebuah mikrobiologi menggunakan enzim suatu Linked tes Assay (ELISA)
immunosorbent, dalam rangka untuk mengembangkan metode untuk deteksi cepat
antigen p24 HIV dalam sampel darah.
Karena radioaktivitas menimbulkan ancaman kesehatan potensial,
alternatif yang lebih aman itu dicari. Sebuah alternatif yang cocok untuk
radioimmunoassay akan mengganti sinyal non-radioaktif di tempat sinyal
radioaktif. Ketika enzim (seperti peroksidase) bereaksi dengan substrat yang
sesuai (seperti ABTS atau 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine), perubahan warna
terjadi, yang digunakan sebagai sinyal. Namun, sinyal tersebut harus dikaitkan
dengan keberadaan antibodi atau antigen, yang mengapa enzim harus
dihubungkan dengan antibodi yang sesuai. Proses menghubungkan secara
independen dikembangkan oleh Stratis Avrameas dan GB Pierce. Karena itu perlu
untuk menghilangkan antibodi atau antigen terikat dengan mencuci, antibodi atau
antigen harus tetap ke permukaan wadah;. Yaitu, immunosorbent telah harus
dipersiapkan. Sebuah teknik untuk mencapai hal ini diterbitkan oleh Wide dan
Jerker Porath pada tahun 1966.
Pada tahun 1971, Petrus Perlmann dan Eva Engvall di Universitas
Stockholm di Swedia, dan Anton Schuurs dan Bauke van Weemen di Belanda
mandiri makalah yang disintesis pengetahuan ini ke dalam metode untuk
melakukan EIA / ELISA.
Pengertian ELISAEnzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik
biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi
kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan
sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai
bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal
ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada
permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini
terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang
dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA
fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada
suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah
antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.
Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk
antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi
pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene),
baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik
(melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang sama,
disebut ‘sandwich’ ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi
ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat
berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi secara langsung oleh antibodi
sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap,
plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan
protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam
plate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel,
yang menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama
menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru
mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif.
Aplikasi ELISAELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu
sampel, karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi
konsentrasi antibodi dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk
mendeteksi kehadiran antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam industri
makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu,
kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA juga dapat digunakan dalam bidang
toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat.
ELISA adalah tes skrining dahulu banyak digunakan untuk HIV karena
kepekaan tinggi. Dalam ELISA, serum seseorang diencerkan 400 kali lipat dan
diterapkan pada pelat yang antigen HIV yang terpasang. Jika antibodi terhadap
HIV hadir dalam serum, mereka dapat mengikat antigen HIV. Pelat ini kemudian
dicuci untuk menghapus semua komponen lain dari serum. Sebuah "antibodi
sekunder" khusus disiapkan - antibodi yang mengikat antibodi lain - kemudian
diterapkan ke piring, mencuci diikuti oleh yang lain. Ini antibodi sekunder secara
kimiawi terkait di muka untuk enzim.
"Anti IgG manusia" Antibodi Ganda Sandwich ELISA
Dengan demikian, piring akan berisi enzim sebanding dengan jumlah
antibodi sekunder terikat ke piring. Sebuah substrat untuk enzim diterapkan, dan
katalisis oleh enzim mengarah ke perubahan pada warna atau fluoresensi. Hasil
ELISA dilaporkan sebagai nomor; aspek paling kontroversial dari tes ini adalah
menentukan "cut-off" titik antara positif dan hasil negatif. Sebuah titik cut-off
dapat ditentukan dengan membandingkannya dengan standar yang dikenal. Jika
tes ELISA digunakan untuk skrining obat di tempat kerja, konsentrasi cut-off, 50
ng / mL, misalnya, didirikan, dan sampel yang berisi konsentrasi analit standar
akan disiapkan. Diketahui bahwa menghasilkan sinyal yang lebih kuat daripada
sampel dikenal adalah "positif." Mereka yang menghasilkan sinyal lemah, yang
"negatif." Dokter Dennis E Bidwell dan Alister Voller menciptakan tes.
Kegunaan lain dari ELISA meliputi:
1. deteksi antibodi mikobakteri dalam TB.
2. deteksi rotavirus dalam tinja.
3. deteksi penanda hepatitis B dalam serum.
4. deteksi enterotoksin E. coli dalam tinja.
Tipe-tipe ELISAAda beberapa tipe-tipe ELISA, diantaranya adalah sebagai berikut:
1. Indirect ELISA
2. Sandwich ELISA
3. Competitive ELISA
1. Indirect ELISA
(Gambar Mekanisme Indirect ELISA)
Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk
mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum adalah:
a) Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada
permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada
permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang
diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang digunakan untuk
mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.
b) Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin
(BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini
dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik
dari protein lain ke plate.
c) Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel
serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama
dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam
tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus
sama dengan antigen standar.
d) Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji
dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen
terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau
protein yang terbloking.
e) Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi,
ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi
enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi
berkonjugasi dengan enzim.
f) Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak
terikat.
g) Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal
kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.
h) Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/
elektrokimia lainnya.
Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi
terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai
molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode
imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan
menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil
dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada
permukaan lubang.
2. Sandwich ELISA
Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:
a) Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’
b) Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
c) Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
d) Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
e) Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen
f) Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan
berikatan dengan antibodi primer
g) Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang
h) Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/
berfluoresensi/ elektrokimia
i) Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen
Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya
menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen
yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein
pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh
permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi.
Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:
3. Competitive ELISATahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang
telah dibahas sebelumnya, yaitu:
a) Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
b) Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah
dilapisi antigen
c) Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam
sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel
pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi
d) Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi
sekunder ini berpasangan dengan enzim
e) Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal
kromogenik/ fluoresensi.
Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal,
semakin lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar
berikut ini:
Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai
berikut:
http://pandalikespurple.blogspot.co.id/2012/04/test-elisa.html