1. Perhitungan massa sel secara langsung :

a. Volumetrikb. Grafimetrikc. Turbidimetrik

Gravimetri dan volumetri merupakan metode analisis

kuantitatif suatu zat atau komponen yang telah diketahui

dengan cara menimbang berat residu (gravimetri)/mengukur

volume larutan (volumetri) setelah melalui proses

pemisahan.

Dalam bidang mikrobiologi, kedua metode ini jarang

dilakukan karena memiki tingkat kesulitan yang tinggi

sehingga membutuhkan sarana dan prasarana.

Analisis kuantitatif secara turbidimetri merupakan analisis

berdasarkan pengukuran turbiditas atau kekeruhan dari

suatu suspensi. Metode ini meliputi pengukuran cahaya yang

diteruskan.

Turbiditas berbanding lurus terhadap konsentrasi sel.

Perhitungan mikroorganisme dilakukan dengan cara

mengukur persentase cahaya yang melewati larutan yang

diperiksa.

Alat yang biasa digunakan pada metode ini adalah

spektrofotometer. Prinsip umum dari alat ini adalah sinar

yang datang mengenai suatu partikel ada yang diteruskan

(transmittan) dan ada yang diserap (absorban), maka sinar

yang diteruskan digunakan sebagai dasar pengukuran.

Sejumlah cahaya ditembakkan dari sebuah sumber cahaya menuju monokromator.

Monokromator akan menguraikan cahaya dan meneruskannya menuju kuvet yang berisikan suspensi sel

Ketika cahaya melewati kuvet:1.Cahaya akan diserap sebagian oleh partikel tersuspensi.2. Sebagian cahaya diteruskan.3. dan sebagian lagi menyebar ke segala arah

Jumlah cahaya yang diserap akan sebanding dengan jumlah partikel tersuspensi (konsentrasi sampel).

2. Perhitungan massa sel secara tidak langsung :

a. Analisis komponen sel (protein, DNA, ATP)

b. Analisis produk katabolisme (energi, metabolisme primer, metabolisme sekunder)

c. Analisis konsumsi nutrien (karbon, N, O, asam amino, mineral)

Analisis kuantitatif secara tidak langsung sering dilakukan

untuk mengetahui adanya pertumbuhan mikroorganime

melalui pengamatan aktivitas biokimianya. Misalnya, uji

metil biru, uji molish, uji TSIA, uji Voges-Proskauer, uji

Merah Metil, uji indol dan lain-lain.

Sebagai contoh dilakukan pengujian uji metil biru pada

susu. Pada uji tersebut, ditambahkan metil biru dalam

jumlah tertentu ke dalam sampel susu. Selanjutnya

dilakukan pengamatan terhadap kemampuan m.o. (bakteri)

untuk tumbuh dan menggunakan oksigen sehingga warna

biru berubah menjadi warna putih metilen.

Organisme yang tumbuh dalam susu akan menggunakan oksigen yang ada. Karena jumlah oksigen mulai berkurang/habis, maka terjadi reaksi oksidasi-reduksi untuk kelangsungan hidup mikroba.

Sitrat yang merupakan metabolit mikroba berfungsi sebagai donor hidrogen, methylene blue sebagai aseptor hidrogen, dan enzim reduktase yang diproduksi mikroba merupakan katalis. Reaksi oksidasi yang terjadi harus dapat menyediakan energi untuk pertumbuhan mikroba. Oleh karena itu, dengan enzim reduktase mikroba menurunkan potensial oksidasi-reduksi, dengan mereduksi metilen biru. Karena tereduksi maka metilen biru berubah warnanya dari biru menjadi putih metilen/methylene white.

Uji ini memberikan perkiraan jumlah koloni bakteri yang

terdapat di dalam susu dengan mengamati waktu yang

dibutuhkan oleh bakteri untuk melakukan reaksi reduksi dapat

menyebabkan perubahan zat warna biru dari metilen biru.

Semakin tinggi jumlah bakteri dalam susu, semakin cepat

terjadinya perubahan warna.

Beberapa hasil penelitian melaporkan bahwa perkiraan jumlah

koloni pada uji ini diperoleh dengan metode hitung cawan

yang dihubungkan dengan waktu reduksi.

Perkiraan hubungan antara jumlah koloni dengan waktu

reduksi menggunakan metil biru, sebagai berikut:

Waktu reduksi (jam) Perkiraan koloni

(x 10-4)

Mutu susu Keterangan

½ - 3½ 80 atau lebih Buruk/sedang Buruk, berubah warnanya dalam waktu kurang dari 2 jam

setelah di mulai uji BM

4 40 Sedang Sedang, berubah warna dalam waktu 2 jam sampai kurang

dari 6 jam uji BM

4½ 25 Sedang -

5 15 Sedang -

5½ 10 Sedang -

6 6 Sedang -

6½ - 8 2,5 Baik Baik, berubah warna dalam waktu 6 jam sampai kurang

dari 8 jam uji BM

8 1 Sangat baik Sangat baik, tidak berubah warnanya setelah 8 jam uji BM

3. Perhitungan jumlah sel : a. Hitungan mikroskopik :

- Metode Breed- Metode Petroff-Hausser

b. Hitungan cawan : - SPC bakteri - SPC kapang

c. MPN

a. Metode Breed

Metode analisis ini digunakan untuk menganalisis

susu.

Metode ini dilakukan dengan terlebih dahulu

mengukur luas areal pandang pada mikroskop yang

akan digunakan, dengan menggunakan mikrometer.

Mikrometer yang digunakan adalah mikrometer

objek gelas yang berskala terkecil 0,01 mm.

Areal pandang mikroskop biasanya mempunyai

ukuran 0,14 – 0,16 mm

Metode Breed ini merupakan metode yang cepat

karena hanya menggunakan mikroskop untuk

menghitung mikroorganisme secara langsung.

Selain itu, metode ini juga mempunyai kelemahan

yaitu tidak dapat dilakukan terhadap sampel susu

yang telah mengalami pasteurisasi.

Hal ini disebabkan karena sel-sel m.o yang telah mati

dengan sel m.o yang masih hidup secara mikroskopik

tidak dapat dibedakan sehingga sel-sel m.o yang telah

mati juga ikut terhitung.

b. Metode Petroff-Hausser

Metode analisis ini menggunakan gelas

objek khusus yang memiliki kotak-kotak

skala.

Pada alat tersebut, kotak berskala

tersebut memiliki luas 1 mm2 yang terdiri

dari 25 kotak besar dengan luas masing-

masing kotak besar 0,04 mm2. Dan setiap

kotak besar terdiri 16 kotak kecil.

Tinggi sampel yang terdapat di antara gelas objek dan gelas penutup yaitu ± 0,02 mm.

Perhitungannya dimulai dengan menghitung jumlah sel yang terdapat dalam beberapa kotak besar, kemudian dihitung jumlah sel rata-rata dalam kotak besar.

Jumlah sel per ml sampel dapat dihitung, sebagai berikut:

1

Jumlah sel /ml sampel = A x 25 kotak x x 103

0,02 A= jumlah sel per kotak besar

Hitungan mikroskopik mempunyai beberapa kelemahan

selain sebagai pilihan metode kuantitatif yang cepat dan

murah, antara lain:

Sel-sel yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel-sel

yang hidup.

Sel-sel yang berukuran sangat kecil, sukar dilihat di bawah

mikroskop.

Agar diperoleh ketelitian yang tinggi, jumlah sel dalam

suspensi sampel harus cukup tinggi. Mis.x untuk bakteri min.

106 sel/ml.

Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel m.o pada

bahan yang mengandung sel debris atau ekstrak makanan.

Metode hitung cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan jumlah mikroorganisme, karena beberapa hal sebagai berikut:1.Hanya sel yang masih hidup yang dihitung2.Beberapa jenis mikroorganisme dapat dihitung sekaligus3.Dapat digunakan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi mikroorganisme, karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari suatu mikroorganisme yang penampilan pertumbuhannya yang spesifik

Metode hitung cawan juga memiliki kelemahan, yaitu:

1.Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk koloni.

2.Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda.

3.Mikroorganisme yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar.

4.Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama, kemudian pertumbuhan koloni dapat dihitung.

Jumlah koloni dalam sampel dapat dihitung sebagai berikut:

1 Koloni per ml atau per gram = jumlah koloni per cawan x

faktor pengenceran

Range Mikroba Untuk Dihitung :Bakteri : 30 – 300 koloniJamur : 10 – 150 koloni

1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30 – 300/cawan (bakteri) atau antara 10 – 150/cawan (jamur)

2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan satu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan dapat dihitung sebagai satu koloni saja

3. Satu deretan rantai koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni

1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari 2 angka yaitu angka kesatu (satuan) dan angka kedua (desimal). Jika angka ketiga ≥ 5 harus dibulatkan 1 angka lebih tinggi pada angka kedua.Contoh : 1,65 x 103 unit koloni/ml atau gram

= 1,7 x 103 unit koloni/ml atau gram

2. Jika pada semua pengenceran dihasilkan < 30 koloni pada cawan petri maka dilaporkan pengenceran terendah.Contoh:

jumlah koloni SPCKeterangan

10-4 10-5 10-6

15 5 2 < 3,0 x 105 yg terendah

ada di 10-4

3. Jika semua pengenceran dihasilkan > 300 koloni pada cawan petri maka dilaporkan pengenceran tertinggi.contoh:

jumlah koloni SPCKeterangan10-4 10-5 10-6

TBUD TBUD 345 > 3,0 x 108 ada pada 10-6

(3,5 x 108) TBUD 315 15 > 3,0 x 107

ada pada 10-5 (3,2 x 107)

4. Jika pada cawan petri dari dua tingkat pengenceran dihasilkan koloni dengan jumlah antara 30 – 300, maka keduanya dibandingkan antara pengenceran tertinggi dan pengenceran terendah. Sehingga pelaporannya :

Bila hasilnya > 2 maka dilaporkan pengenceran tertinggi (pekat) dan

Bila hasilnya 2 maka dirata-ratakan dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan pengencerannya dan dilaporkan adalah pada pengenceran terendah (encer)

jumlah koloni SPC Keterangan10-4 10-5 10-6

293 41 10 4,1 x 106 hitung rata-ratanya,

krn 4100000/2930000 = 1,4 → (< 2)

140 32 5 1,4 x 106 hitung rata-ratanya,

krn 3200000/1400000 = 2,3 → (>2)

5. Jika digunakan 2 cawan petri (duplo) pengenceran, maka data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut.

MPN adalah suatu metode numerasi mikroorganisme yang

menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme

pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari

sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah

sampel atau diencerkan menurut tingkat seri tabungnya

sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji

dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel.

Contoh :

Data yang didapat adalah : 3 tabung positif dari pengenceran

1/10, 2 tabung positif dari pengenceran 1/100 dan 1 tabung

positif dari pengenceran 1/1000.

Lalu dicocokkan dengan tabel, menghasilkan nilai : 150 MPN/g

Digunakan medium yang berbentuk cair (Laktosa

Broth) yang dimasukkan dalam tabung-tabung

reaksi yang diisi penuh dengan tabung kecil yang

disebut dengan tabung durham.

Cara perhitungannya didasarkan pada banyaknya

tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi oleh

mikroorganisme yang ditandai dengan terjadi

perubahan warna dari medium dari warna hijau

menjadi kuning dan terbentuk gelembung gas

yang terperangkap di dalam tabung durham.

Tujuan untuk menghitung jumlah m.o. tertentu yaitu bakteri coliform yang terdapat diantara campuran m.o. lainnya.

Pada metode ini pengenceran harus dilakukan lebih tinggi daripada hitungan cawan sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran sampel tersebut mengandung sedikitnya satu sel.

Dengan demikian, setelah diinkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung yang dinyatakan positif sedangkan yang lainnya dinyatakan negatif.

Rumus : 1

MPN = Nilai MPN (tabel) x Fp tengah

NB: nilai MPN dilihat pada tabel berdasarkan jumlah tabung yang hasilnya

positif

Uji Angka Staphylococcus aureus Prinsip pengujian: Adanya pertumbuhan Staphylococcus aureus pada

medium yang sesuai, adanya proses reduksi kalium telurit, adanya proses hidrolisa kuning telur, dan adanya koagulasi plasma.

Medium :Buffered Pepton Water, Baird Parker Agar, Brain

Heart Infusion Broth (BHIB). Pereaksi :

Plasma kelinci, Egg Yolk (EY)

BPA merupakan medium pengaya non selektif. Medium BPW,

komposisinya terdiri dari pepton, natrium klorida, dan dapar

fosfat.

Medium pengencer ini digunakan untuk memulihkan/

menguatkan sel bakteri yang mungkin kehilangan

vitalitasnya (lemah) karena kondisi di dalam sampel yang

kurang menguntungkan selama proses pengolahan makanan.

Pengenceraan suspensi sampel dilakukan untuk

mendapatkan koloni yang tumbuh secara terpisah dan dapat

dihitung dengan mudah, hal ini akan sangat membantu

terutama untuk sampel dengan cemaran yang sangat tinggi.

Baird-Parker Agar dengan Kuning Telur tellurite merupakan media selektif untuk yang digunakan untuk mendeteksi Staphylococcus aureus dalam sampel biologi, produk farmasi, kosmetik, makanan dan air.

Komposisi medium ini terdiri dari litium klorida dan tellurite yang berfungsi untuk menghambat pertumbuhan flora mikroba alternatif sedangkan natrium piruvat dan glisin untuk mendukung pertumbuhan Staphylococcus aureus.

Hasil positif yang ditunjukkan pada medium ini yaitu koloni Staphylococcus yang muncul berwarna hitam dengan zona jernih di sekitar koloni.

BHIB merupakan medium bernutrisi tinggi yang

umumnya digunakan untuk kultivasi

mikroorganisme yang bersifat patogen.

Nitrogen, vitamin, dan sumber karbon disediakan

oleh Brain-Heart Infusion dan intisari enzimatik dari

gelatin; dekstrosa sebagai sumber karbohidrat;

natrium klorida untuk mempertahankan

keseimbangan osmotik lingkungan; dan dinatrium

fosfat sebagai bahan pendapar di medium.

1. Secara aseptik ditimbang 25 g sampel atau dipipet 25 ml

sampel, dimasukkan ke dalam erlenmeyer steril dan

ditambahkan 225 ml BPW atau dilakukan homogenisasi selama

30 detik hingga diperoleh suspensi yang homogen dengan

pengenceran 10-1.

2. Disiapkan dua tabung yang masing-masing telah diisi dengan 9

ml BPW. Dipipet 1 ml dari pengenceran 10-1 ke dalam tabung

berisi 9 ml BPW hingga diperoleh pengenceran 10-2. Dibuat

pengenceran berikutnya hingga10-3.

3. Dari sampel setiap pengenceran masing-masing dipipet 0,25 ml

ke dalam cawan petri yang telah berisi 15-20 ml medium BPA-EY

yang telah memadat dan dibuat triplo.

3. Suspensi segera disebar-ratakan dengan menggunakan batang gelas bengkok (hokky stick). Disiapkan pula cawan lain yang hanya diisi dengan media BPA-EY sebagai kontrol media.

4. Apabila inokulum belum terserap semua oleh agar, biarkan cawan dengan posisi ke atas di dalam inkubator selama 10-60 menit, kemudian inkubasi cawan dengan posisi dibalik pada suhu 35ºC-37ºC selama 24-48 jam.

5. Pilih dan hitung cawan yang mengandung 20-200 koloni yang diduga Staphylococcus aureus. Koloni Staphylococcus aureus memiliki ciri-ciri bulat, halus, lembab, diameter 2-3 mm, berwarna abu-abu kehitaman, memucat di tepi koloni, dan apabila dicuplik dengan ose koloni tampak seperti mentega sampai lengket.

6. Dipilih 10 koloni spesifik yang diduga S.aureus dari tiga cawan terhitung, kemudian diinokulasikan 1 ose ke dalam tabung reaksi kecil berisi 0,2-0,3 ml BHIB, diinkubasi pada suhu 35ºC-37ºC selama 18-24 jam.

7. Ditambahkan 0,5 ml plasma kelinci dan diaduk merata, diinkubasi 35ºC-37ºC selama 6 jam. Diamati terjadinya koagulasi plasma kelinci dalam setiap tabung dengan membalikkan tabung, apabila media tetap ditempatnya berarti dipertimbangkan positif  S.aureus.

Angka S. aureus dinyatakan berdasarkan persentase koloni spesifik yang telah dikonfirmasi sebagai S. aureus (koagulasi positif) dikalikan jumlah koloni dari tiga cawan (triplo) dan faktor pengenceran.  AAngka S.aureus: = x B x C

10A : Koloni spesifik S.aureus (koagulasi positif)B : jumlah koloni terduga S.aureus dari tiga cawan (triplo)C : faktor  pengenceran

Contoh:Perhitungan koloni terduga S. aureus pada

pengenceran 10-2 (C) adalah 90 (B), dan dari 10 koloni yang dikonfirmasi ternyata 9 positif sebagai S. aureus, maka angka S. aureus per gram atau per ml sampel adalah :

Angka S. Aureus : 9

x 90 x 102 = 81 x 102 koloni 10