Analisa DNA

1

ANALISA DNA

I. PENDAHULUAN

Analisis DNA banyak digunakan untuk karakterisasi sifat

genetik pada level molekuler yang secara langsung mencerminkan

sifat genotipe (materi genetik) yang dimiliki oleh organisme

tertentu. Analisa pada level ini, jauh lebih akurat dibanding dengan

analisa fenotipe (morfometrik) karena ciri fenotipe merupakan hasil

interaksi antara genotipe dengan lingkungan. Dengan kata lain,

interpretasi hasil analisa fenotipe tidak persis mencerminkan

genotipe yang dimiliki oleh organisme tertentu.

Aplikasi analisis DNA antara lain penentuan marker (penanda)

dalam mengukur hubungan kekerabatan antar kelompok ikan

dalam populasi, baik yang di alam maupun di lingkungan budidaya,

studi taksonomi, genetika populasi, dan diagnosa penyakit.

Penggunaan marker pada level DNA memiliki beberapa kelebihan

yaitu tidak dipengaruhi oleh lingkungan dan faktor pertumbuhan,

lebih sensitif, hampir semua jaringan dapat digunakan sebagai

sumber material genetik dan dapat digunakan dalam jangka waktu

yang relatif lebih lama. Sedangkan kelemahannya adalah prosedur

yang cukup rumit dan mahalnya biaya analisa.

Prosedur analisa DNA diawali dengan mengekstraksi genom

DNA dari sumber sel yang diikuti dengan proses isolasi sekuen

DNA tertentu. Seperti yang diutarakan oleh Lewin (1994), bahwa

langkah awal dalam menganalisa DNA adalah memecahkan genom

DNA menjadi fragmen-fragmen spesifik yang berukuran lebih kecil.

Ekstraksi DNA dilakukan untuk memisahkan genom DNA dari

molekul-molekul lain di dalam suatu jaringan yang dilarutkan.

Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational ProcedureDepartemen Budidaya Perairan 2011Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB

2

Karena secara alami, DNA adalah suatu molekul primer yang

keberadaannya selalu terkait denga RNA dan protein. Sedangkan

dalam menganalisa DNA yang diperlukan adalah DNA dalam

bentuk murni (Stine, 1973).

Langkah pertama dalam mengekstraksi DNA umumnya adalah

menghancurkan sel dan isolasi asam nukleat. Selanjutnya dilakukan

penghancuran inti sel sehingga DNA akan terlepas dan akan

menyebabkan viskositas larutan meningkat sehingga molekul DNA

terlihat lebih nyata. Langkah kedua adalah pemisahan DNA dari

bahan-bahan kontaminan seperti RNA dan protein.

Dalam ekstraksi DNA, jenis sumber sel yang digunakan ada

beberapa macam seperti hati, otot, sirip, darah dan sel hasil kultur.

Sedangkan kondisi sumber sel meliputi sumber sel segar, sumber

sel terfiksasi dan sumber sel beku.

II. BAHAN DAN ALAT

Bahan

1

. Jaringan ikan uji 7. Primer

2

. Cell lysis solution 8. Master mix PCR

3

.

Protein precipitation

solution9. Marker DNA

4

. RNase

1

0.1 x TBE

5

. Proteinase K

1

1. Etidium bromida


3

6

.

Ion Exchange

water/distilled water

Alat

1

. Inkubator

5

.Mesin PCR

2

. Tabung mikro

6

.Vortex

3

. Pipet mikro

7

.Satu set elektroforesis

4

. Sentrifuse

8

.UV illuminator

III. PROSEDUR KERJA

3.1. PROSEDUR EKTRAKSI DNA

Penghancuran sel (Cell lysis)

1. Semua peralatan yang akan digunakan dalam pembuatan

ekstraksi DNA diautoclave.

2. Sampel ikan ditimbang sebanyak 10 – 20 mg, lalu dimasukkan

ke dalam tabung mikro (1.5 ml).

3. Tambahkan 200 µl Cell Lysis Solution dan 1.5 µl Proteinase K

solution ke dalam tabung mikro.

4. Tabung berisi suspensi kemudian diinkubasi pada suhu 550C

selama 3 – 24 jam.


4

Gambar 5. Inkubasi jaringan dengan Dry Thermo Unit

Eliminasi RNA

1. 1,5 µl RNase (4 mg/ml) dimasukkan ke dalam setiap tabung lalu

diaduk dengan membolak-balikkan tabung sebanyak 25 kali.

Kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 30 – 60 menit.

2. Setelah inkubasi selesai, dinginkan sampel sampai mencapai

kondisi suhu ruang.

Pengendapan Protein

1. 200 µl Protein Precipitation Solution ke dalam larutan sampel

lalu divortex pada kecepatan tinggi selama 20 detik.

2. Inkubasi sampel on ice selama 10 - 15 menit.

3. Kemudian sampel disentrifuse pada kecepatan 12.000 rpm

selama 10 menit hingga terbentuk endapan protein dan larutan

yang mengandung DNA.


5

Gambar 6. Sentrifuse

Pengendapan DNA

1. Larutan supernatan yang terbentuk dituangkan dengan hati-hati

ke dalam tabung baru yang telah berisi 600 µl Larutan

Isopropanol 100%.

2. Tabung yang berisi larutan DNA ini kemudian diaduk dengan

membolak-balikkan tabung sebanyak 50 kali hingga terlihat

untaian pita DNA yang berwarna putih.

3. Kemudian tabung tersebut disentrifuse dengan kecepatan

12.000 rpm selama 10 menit hingga terbentuk pelet DNA di

dasar tabung.

4. Larutan supernatan dibuang.

5. 300 µl Larutan Etanol 70% dingin, kemudian dimasukkan ke

dalam tabung yang berisi pelet DNA. Lalu tabung dibolak-balik

beberapa kali untuk membilas sisa-sisa DNA yang berada di

dinding tabung.

6. Tabung disentrifuse pada kecepatan 12.000 rpm selama 10

menit.

7. Kemudian larutan etanol dibuang dengan hati-hati, lalu tabung

dikeringkan diatas kertas tissue dan dibiarkan kering udara

selama 30 menit.

8. Pelet DNA yang terbentuk dilarutkan kembali dengan

menambahkan 30-50 µl akuades steril (SDW) ke dalam tabung.


6

9. Kemudian larutan DNA disimpan dalam freezer (-20°C) atau

langsung digunakan untuk proses selanjutnya.

Pemurnian DNA

1. Ambil 20 µl sampel DNA dan masukkan ke dalam tabung mikro

(0.6 ml)

2. Kemudian tambahkan 20 µl larutan Phenol/Chloroform mix (1:1)

3. Larutan di vortex dan di inkubasi pada suhu ruang selama 5

menit sampai tebentuk 3 lapisan

4. Ambil lapisan atas (larutan DNA) dengan sangat hati-hati dan

pindahkan ke tabung yang baru.

5. Tambahkan 2 µl NaOAC (3M pH 5.2) kedalam tabung mikro

berisi DNA.

6. Tambahkan 60 µl Etanol absolut dan campuran larutan divortex.

7. Kemudian di inkubasi di dalam freezer -80°C selama 15 menit.

Gambar 7. Tiga lapisan yang terbentuk setelah inkubasi

8. Sentrifuse tabung pada kecepatan 12.000 rpm selama 30 menit

9. Buang supernatant, kemudian cuci pellet DNA dengan 20 µl

Etanol 70%.

10.Sentrifuse pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.

10.Kemudian larutan etanol dibuang dengan hati-hati, lalu tabung

dikeringkan diatas kertas tissue dan dibiarkan kering udara

selama 30 menit.

11.Pelet DNA yang terbentuk dilarutkan kembali dengan

menambahkan 10 µl akuades steril (SDW) ke dalam tabung.


7

12.Kemudian larutan DNA disimpan dalam freezer (-20°C) atau

langsung digunakan untuk proses selanjutnya.

3.2. PROSEDUR PENGUKURAN KONSENTRASI DNA DAN

RNA

1. Larutan DNA diencerkan terlebih dahulu 80 kali dengan SDW

(RNA dengan DEPC) dengan volume akhir 100.

2. Alat Gene Quant dinyalakan, dan kuvet dikeluarkan dari tempat

penyimpanan lalu dibilas dengan akuades.

3. Kalibrasi dilakukan dengan mengukur absorbansi pelarut (SDW

untuk DNA dan DEPC untuk RNA), dengan memasukkan 80 µl

pelarut tersebut ke dalam kuvet. Kemudian kuvet dimasukkan

ke dalam alat, lalu tekan tombol “set ref”, hasil pembacaan akan

menunjukkan nilai absorbansi 0.000. Dilanjutkan dengan

pengukuran konsentrasi DNA atau RNA.

4. Kuvet yang akan digunakan, dibilas terlebih dahulu dengan

akudes. Setelah itu larutan asam nukleat yang akan diukur

dimasukkan ke dalam kuvet sebanyak 80 µl dan kuvet

ditempatkan di dalam alat.

5. Setelah tombol “sample” ditekan dan konsentrasi larutan sudah

terbaca, kuvet dikeluarkan dan dibilas dengan akuades.

Gambar 8. Gene Quant

3.3. PROSEDUR PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)


8

a. Preparasi sampel dapat dilakukan dengan beberapa cara sesuai

dengan Taq Polymerase yang digunakan :

Menggunakan ExTaq Polymerase

1. Pembuatan larutan premix yang terdiri dari :

Bahan Jumlah

10 x Buffer Ex

Taq

1.00 l x jumlah sampel

+ 1

DNTP1.00 l x jumlah sampel

+ 1

Primer

Forward 1.00 l x jumlah sampel

+ 1

Reverse1.00 l x jumlah sampel

+ 1

Ex Taq0.05 l x jumlah sampel +

1

SDW4.95 l x jumlah sampel +

1

2. Larutan premix dibagi ke dalam masing–masing mikrotube

sebanyak 9 l.

3. Masukkan masing–masing sampel DNA sebanyak 1 l

sehingga volume akhir tiap mikrotube adalah 10 l.

Menggunakan Pure Taq Ready-To-Go- PCR Beads

Tambahkan pada tube yang berisi PCR Beads masing-masing

bahan berisi berikut ini, hingga volume akhir setiap mikrotube

adalah 25 l.


9

Sampel DNA 2 l

Primer

Forward

2 l

Primer

Reverse

2 l

SDW 19 l

Total Volume 25 l

Menggunakan My PCR KIT 1 (Vivantis)

1. Pembuatan premix

Bahan Jumlah

2 x Taq Master

Mix


+ 1

MgCl2


+ 1

Primer

Forward 1.00 l x jumlah sampel

+ 1

Reverse1.00 l x jumlah sampel

+ 1

SDW1.5 l x jumlah sampel +

1

2. Larutan premix dibagi ke dalam masing–masing mikrotube

sebanyak 9 l.

3. Masukkan masing–masing sampel DNA sebanyak 1 l

sehingga volume akhir tiap mikrotube adalah 10 l.

b. Masukkan masing-masing mikrotube ke dalam mesin PCR yang

telah diprogram sebagai berikut :


10

ProsesSuhu Lama Waktu Siklu

s

Denaturasi

awal

940C 3 menit 1

Siklus PCR :

Denaturasi

Annealing

Extension

940C

590C

720C

30 detik

30 detik

30 detik

30

Final

ekstension

720C 3 menit 1

Note : Program PCR dapat berubah sesuai DNA yang akan

dianalisa. Suhu annealing disesuaikan dengan sekuen

primer yang digunakan.

Setelah proses PCR selesai mesin dimatikan dan hasil PCR

disimpan di dalam freezer -200C untuk selanjutnya dapat

dielektroforesis.

Gambar 9. Mesin PCR


11

PEMOTONGAN DNA DENGAN ENZIM RESTRIKSI

Pemotongan mtDNA dengan enzim restriksi dilakukan dengan

cara mencampurkan bahan-bahan berikut :

Buffer enzim 1 l

Enzim 1 l

Hasil PCR 2 l

SDW 6 l

Volume Akhir 10 l

Kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 1- 3 jam. Hasil

pemotongan dengan enzim restriksi ini dapat langsung dilihat

dengan elektroforesis.\

Contoh jenis – jenis enzim dan situs pemotongannya.

No

.Nama Sumber

Situs

Pemotongan

1 Hinf I Haemophilus

influenza Rf

G A N T C

C T N A G

2 Hae III Haemophilus

aegyptius

G G C C

C C G G

3 Alu I Arthrobacter luteus A G C T

T C G A


12

4 Mbo I Moraxella bovis sp. G A T C

C T A G

5 Cfr 13 I Citobacter freundii

RFL 13

G G N C C

C C N G

G

PROSEDUR ELEKTROFORESIS

Proses elektroforesis dimulai dengan pembuatan gel agarose yang

kepekatannya disesuaikan dengan sample yang akan dicek, yaitu

sebagai berikut :

No

.Ukuran DNA

Konsentrasi

Gel

1 0.8 – 10 kb 0.7%

2 0.5 – 7 kb 0.9%

3 0.4 – 6 kb 1.2%

4. 0.2 – 4 kb 1.5%

5. 0.1 – 2 kb 2%

Cara pembuatan gel agarose :

1. Larutkan serbuk agarose dalam larutan 1 x Tris Borate EDTA

(TBE) yang mengandung Ethidium Bromide (30 l/1 liter TBE).

2. Panaskan dalam microwave selama 1.5 menit atau larutan

sampai menjadi bening.

3. Larutan dibiarkan sampai hangat kemudian dituangkan ke


13

dalam cetakan (Ganbar 10A) yang telah dilengkapi sisir/comb

sebagai cetakan sumur/well elektroforesis.

4. Gel dibiarkan membeku, kemudian dimasukkan kedalam bak

elektroforesis (Gambar 10B) yang telah berisi larutan buffer

elektroforesis.

Prosedur Elektroforesis :

1. 3 l volume sampel yang akan di cek dicampur dengan 0.5 l

loading buffer yang mengandung bahan pemberat DNA dan

pewarna (Bromophenol Blue).

2. Campuran dimasukkan ke dalam sumur-sumur elektroforesis.

3. Bak elektroforesis ditutup dan lisrik dialirkan dengan tegangan

200 volt dan kuat arus 60 – 100 mA.

4. Setelah DNA bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif

mencapai ¾ bagian dari panjang gel, maka proses elektroforesis

dapat dihentikan.

5. Gel diangkat dari bak elektroforesis dan dilepaskan dari cetakan

untuk selanjutnya diamati dengan menggunakan ultraviolet

transluminator (Gambar 10C) dengan panjang gelombang

pendek (280 nm).

6. Contoh-contoh hasil elektroforesis dapat dilihat pada gambar

11, 12, dan 13.


14

1

2

A B

C

Gambar 10. Seperangkat alat elektoforesis, A= Cetakan agarosa,

1= Sumur dan 2= Cetakan sumur, B= Bak

Elektroforesis, C= Ultraviolet Illuminator

Gambar 10. Hasil Elektroforesis DNA β_Actin Ikan Zebra (M =

Marker GeneRulerTM 1kb DNA Ladder, No.1-5= Sampel

ikan zebra, = DNA β_Actin ukuran 200 bp)


15

Gambar 11. Hasil elektroforesis gen glikoprotein KHV (M = Marker

2-Log DNA Ladder (0.1-10.o kb, = DNA β_Actin ukuran

400 bp)

Gambar 12. Hasil elektroforesis RAPD PCR ikan gurame

(Osprhonemus gouramy)


Analisa DNA

Documents

Transcript of Analisa DNA