Lab.med. 9: 63-69 (1985)

Funktionelle und immunologischeUntersuchungsmethoden in der Andrologie*W.-B. SchillDermatologische Klinik und Poliklinik der Ludwig-Maximilians-Universität München (Direktor: Prof. Dr. Dr. h.c. 0. Braun-Falco)

Zusammenfassung:

Neben klassischen Spermaparametern stehen der andrologischen Diagnostik eine Reihe von Untersuchungs-methoden zur Verfügung, die eine funktionelle Charakterisierung der Spermatozoen ermöglichen. Für dieBeurteilung der Vitalität und Befruchtungsfähigkeit einer Spermatozoenpopulation können folgende funktio-neile Parameter herangezogen werden: Das Motilitätsverhalten der Spermatozoen in vitro bzw. die Fähigkeitder Samenzellen, in den Zervixmukus einzudringen, der Schwelltest und die Bestimmung der Aktivitätdes Penetrationsenzyms Akrosin. Aufwendigere Verfahren sind die Messung der Kinetik der akrosomalenReaktion, die LDH-X- und ATP-Bestimmung, die Bindung der Spermatozoen an die Zona pellucida derEizelle und die Penetration Zona pellucida-freier Hamstereizellen (H O P-Test) bzw. die in vitro-Fertilisation.Weitere Untersuchungsmethoden betreffen die Frage der Qualitätsverbesserung von Humansperma für Inse-minationszwecke, wobei die Splitejakulat-Technik und andere Spermatozoen-Anreicherungsverfahren vonInteresse sind. In speziellen Fällen kann der Spermatozoen-Stimulationstest zu therapeutischen Empfehlun-gen für die Insemination führen. Auch die Überprüfung der Gefrierempfindlichkeit der Spermatozoen zumZwecke des Anlegens von Spermakonserven gehört zu den Untersuchungsmethoden, die eine funktioneileBeurteilung der Spermaqualität erlauben.Besteht der Verdacht auf das Vorliegen von Spermatozoen-Antikörpern, so ist die Anwendung immunologi-scher Untersuchungstechniken erforderlich, wobei Screening-Verfahren von spezifischen'Testmethoden zuunterscheiden sind. Zirkulierende Spermatozoen-Antikörper können im Serum, Spermaplasma und Zervix-mukus mit Hilfe des Agglutinationstests nach Kibrick und des Immobilisationstests nach Isojima untersuchtwerden. Neuerdings stehen als sehr empfindliche und reproduzierbare Untersuchungsverfahren Enzyme -Linked-lmmunosorbent-Assays (ELISA) zur Verfügung, die unabhängig von qualitativ hochwertigen Test-ejakulaten sind und sich als Screening-Methoden für zahlreiche Blutproben (Genitalsekrete) eignen.

Schlüsselwörter:

Spermatozoenvitalität - Überlebensfähigkeit - Zervixmukus-Penetration - Stimulationstest - Splitejaku-lat - Gefrierfähigkeit - Akrosin - akrosomale Reaktion - LDH-X - ATP - HOP-Test - in vitro-Fertilisation - immunologische Testverfahren - ELISA-Technik zum Spermatozoen-Antikörpernachweis

Summary:Apart from classical semen parameters the andrological laboratory check-up comprises several methodswhich allow a functional characterization of the spermatozoa. For the judgement of sperm vitality andfertilization capacity ofa sperm population the following functional parameters may be used: assessment ofthe motility and long livety of spermatozoa in vitro, the ability o f sperm cells to penetrate into cervical mucus,the swelling test and the assessment of the activity of the penetration enzyme acrosin. More sophisticatedmethods are procedures which determine the kinetic of the acrosomal reaction, the LDH-X and ATP measure-ment, the binding of spermatozoa to the zona pellucida of the egg, the penetration ofzona free hamster eggs(heterologous ovum penetration test = HOP) and the in vitro fertilization. Additional methods concern theimprovement of the quality of human semen for the purpose of insemination, for example by the split ejaculatetechnique and other sperm concentration procedures. In some cases a sperm Stimulation test may lead totherapeutical recommendations for insemination. Lastly, the examination of freezability of sperm for thepurpose of semen storage in liquid nitrogen is a method to allow the functional judgement of semen quality.Ifthe occurrence ofantisperm antibodies has to beconfirmed immunological techniques are necessary whichwill include screening methods and specific assays. Circulating antisperm antibodies may be detected insejum, semmal plasma and cervical mucus by the agglutination test according to Kibrick and the immobili-zation test according to Isojima. More recently äs a very sensitive and reproducible immunological methodenzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) are available which are independent of test ejaculates ofhigh quality and are suitable äs screening methods for series ofserum samples or genital tract secretions.

Keywords:Sperm vitality - sperm long livety - cervical mucus penetration - Stimulation test - split ejaculate -freezability - acrosin - acrosomal reaction - LDH-X - ATP - HOP test - immunological assays -ELISA technique for the detection ofantisperm antibodies

' Vortrag auf der Herbsttagung der Deutschen Gesellschaft für Labormedizin und des Berufsverbandes fü r Labormedizin, Bad Nauheim.Nov. 1984.

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EinleitungDie konventionelle Spermaanalyse (1) erlaubt keine ein-deutige Aussage zur individuellen Fertilitätsprognoseeines Mannes. Auch die meisten biochemischen Parame-ter des Spermas tragen nicht zur Unterscheidung fertilerund infertiler Ejakulate bei. Dies gilt insbesondere fürMänner aus Ehen mit idiopalhischer Sterilität bei denenbislang keine faßbaren morphologisch-biochemischenVeränderungen nachgewiesen werden können, die aufdie Ursache der Kinderlosigkeit hinweisen. Aus diesemGrunde besteht die Notwendigkeit der Einführung bzw.Entwicklung funktioneller Untersuchungsverfahren, dieüber die Befruchtungsfähigkeit der Spermatozoen Aus-kunft erteilen und insbesondere die Interaktion der männ-lichen Samenzellen mit den Eizellen erfassen.Zur Untersuchung von Spermatozoenfunktionen stehenderzeit folgende Untersuchungsmethoden zur Verfü-gung:1. Messung der Spermatozoenvitalität und Überlebens-

fähigkeit2. Zervixmukus- Penetrationstests3. Spermatozoen-Stimulationstest4. Untersuchung des Splitejakulates5. Untersuchung der Gefrierfähigkeit der Spermatozoen6. Beurteilung der akrosomalen Funktionen und der Be-

fruchtungsfähigkeit der Spermatozoen durch Mes-sung der Akrosinaktivität bzw. Durchführung derakrosomalen Reaktion, des Schwelltests, der LDH-X- bzw. ATP-Bestimmung, des HOP-Tests und der invitro-Fertilisation.

Die genannten Testverfahren sind geeignet, funktionelleStörungen der männlichen Keimzellen zu erkennen. Siewerden daher zur diagnostischen Abklärung von Sterili-tätsfaktoren im Rahmen der interdisziplinären Koopera-tion zwischen Andrologie und Gynäkologie von beidenreproduktionsmedizinischen Fächern wahrgenommen,wobei in Abhängigkeit von den örtlichen Gegebenheitenund den unterschiedlichen wissenschaftlichen Fragestel-lungen an den einzelnen Kliniken und Instituten unter-schiedliche Schwerpunkte bestehen.Im folgenden soll das Prinzip und die Bedeutung dergenannten Untersuchungsverfahren besprochen und de-

70 j

,50

30

10

22" C

(-80%)

0,5 1 2 3 4Inkubationszeit, Std.

Abb. 1: Motilität der Spermatozoen während einer Beobach-tungszeit von 4 Stunden. Die verschiedenen Möglichkeiten desMotilitätsverhaltens sind wiedergegeben. Ein Motilitätsverlustvon mehr als 15% nach einer Inkubationszeit von 4 Stundenweist auf einen männlichen Sterilitätsfaktorhin64 Lab.med. 9: 64 (1985)

ren klinische Wertigkeit diskutiert werden. Im letzten Teilder Übersicht werden der aktuelle Stand und die gegen-wärtig zur Verfügung stehenden immunologischen Un-tersuchungsmethoden zusammengefaßt, die zur Abklä-rung eines immunologischen Sterilitätsfaktors erforder-lich sind.

Bestimmung derSpermatozoenwtaJität

Der wichtigste Spermaparameter für die Erfassung derSamenqualität ist die Motilität der Spermatozoen, da sieam besten mit der Fertilität korreliert, wie zahlreiche Un-tersuchungen gezeigt haben (2). Für die routinemäßigeBestimmung reichen im allgemeinen Schätzverfahren mitHilfe des Phasenkontrast- Mikroskops aus, wenn sie voneiner erfahrenen medizinisch-technischen Kraft durchge-führt werden, wobei zwischen Globalmotilität und Pro-gressivmotilität differenziert wird (1). Für .wissenschaftli-che Zwecke stehen inzwischen Meßverfahren zur Verfü-gung, die objektiv sind und eine ausreichende Genauig-keit der Motilitätsbestimmung garantieren. Es handeltsich dabei um mikrophotographische Verfahren, die soge-nannte „Multiple exposure photography", bei der mittelseiner standardisierten Zählkammer in definierten Zeitein-heiten (1 Sekunde) zurückgelegte Progressionsstreckender Spermatozoen erfaßt werden und sich außer der Glo-balmotilität die mittlere Geschwindigkeit ( /sec) derSpermatozoen berechnen läßt (3, 4). Leider bedarf diesesVerfahren gegenwärtig noch einer zeitaufwendigen ma-nuellen Auswertung. Computerisierte Ab lese verfahre nsind jedoch in Entwicklung (5). Bei Verwendung einesDunkelfeldes in Kombination mit einer Polaroid- Kameraeignet sich das Verfahren ganz besonders zur Dokumen-tation der Spermatozoenmotilität vor in vitro- Fertilisation,aber auch vor Insemination oder im Rahmen von Zervix-mukus- Penetrationstests (6).Die Bestimmung der Spermatozoenvitalität erfolgt mitHilfe des Eosin-Tests, einem Supravital- Färbeverfahren,bei dem nach Zugabe von einem Tropfen 0,5% gelblichesEosin gelöst in Aqua dest, zu einem Tropfen Sperma nach1 bis 2 Minuten tote (Eosin-positive) von vitalen (Eosin-negative) Spermatozoen unterschieden werden können0).Abb.1 zeigt anhand eines theoretischen Beispiels dieMessung des Motilitätsverhaltens der Spermatozoen inAbhängigkeit von der Zeit, wobei es in der Praxis genügt,Motilität und Vitalität (Eosin-Test) der Spermatozoen30 Minuten und 4 Stunden post ejaculationem zu mes-sen. Der Motilitätsabfall nach 4 Stunden darf nicht größerals 15% sein. Kommt es innerhalb des Zeitraums von4 Stunden zu einem erheblichen Motilitätsabfall, weistdies auf einen männlichen Sterilitätsfaktor hin, der einedeutliche Einschränkung der Fertilität bedingt.

( 50%) Zervixmukus-Penetrationstests

Die Zervixmukus-Penetrationstests geben wichtige Basis-informationen über das Penetrationsverhalten der Sper-matozoen in den weiblichen Genitalsekreten (7). BeiDurchführung von gekreuzten Penetrationstests in vitrounter zusätzlicher Verwendung fertiler Spenderejakulateund eines fertilen Spendermukus (Tab. 1) erlaubt die Un-tersuchung die Differenzierung eines männlichen bzw.weiblichen Sterilitätsfaktors (8).Der am häufigsten praktizierte Test ist der Postkoitaltestnach Sims-Huhner, der das Penetrationsverhalten der Sa-

menzellen zum Konzeptionsoptimum in vivo untersucht(9). Dabei ist auf das Einhalten von Standard-Bedingun-gen nach den WHO-Richtlinien zu achten (10). Der Testwird als positiv bewertet, wenn 6 bis 10 Stunden nachdem Geschlechtsverkehr mehr als 10 gut beweglicheSpermatozoen pro Gesichtsfeld bei 400facher Vergröße-rung im ovulatorischen Zervixmukus beobachtet werdenkönnen. Lassen sich nur wenig unbewegliche oder keineSpermatozoen nachweisen, so ist der Test negativ. Späte-stens dann ist eine weiterführende andrologische Dia-gnostik angezeigt einschließlich der Durchführung von invitro Zervixmukus-Penetrationstests nach Kurzrok-Miller(10) bzw. nach Kremer (11) (Abb. 2) und des Ausschlus-ses immunologischer Sterilitätsfaktoren.

Spermatozoen - Stimulationstest

Dieser Funktionstest erlaubt die Überprüfung der Frage,ob bei reduzierter Motilität eine Verbesserung der Sper-matozoenbeweglichkeit durch Zusatz motilitätsstimulie-render Faktoren möglich ist, z.B. 5 Einheiten Kallikreinpro ml Ejakulat bzw. 5 mmol/l Coffein (12). Bei einempositiven Effekt könnte die Stimulation der Spermato-zoenmotilität mit Kallikrein therapeutisch für Insemina-tionszwecke genutzt werden (13).

Splitejakulat- Untersuchung

Durch die Gewinnung von mindestens zwei Fraktionen(z. B. Auffangen der ersten drei Ejakulatstöße in einemGefäß und Sammeln der restlichen Ejakulatfraktionen ineinem zweiten Gefäß) erfolgt bei 95% der Patienten eineKonzentrierung der Spermatozoen in der ersten Splitfrak-tion (14). Bei einem Teil der Patienten ist auch die Motili-tät in der ersten Fraktion besser als im Gesamtejakulat. Isteine Qualitätsverbesserung des Spermas durch die Split-ejakulattechnik möglich, so kann bei entsprechender In-dikation eine Inseminationstherapie unter Verwendungder spermatozoenreichen Fraktion des Splitejakulatesdurchgeführt werden (15). Bei intrauteriner Inserninationdarf allerdings nicht mehr als 0,3 ml Ejakulat intrakavitär

wegen des hohen Prostaglandingehaltes appliziert wer-den. Andere Verfahren der Spermaanreicherung (z.B.Zentrifugation, Konzentrierung, Albumingradient, Ficoll,Percoll, Millipore-Filter, Sephadexsäule, Glassäulen-Fil-tration) zur Verbesserung der Ejakulatqualität sind meistaufwendig und haben sich - nicht zuletzt oft mangelsEffektivität - bisher in der Praxis nicht durchgesetzt (16).

Gefrierfähigkeitsun tersuch ung

Die Beurteilung der Gefrierfähigkeit von .Spermatozoenist ein weiterer Funktionstest, der verwendet wird, um dieResistenz der Spermatozoen gegenüber dem Kälteschock(Tab. 2) zu überprüfen (17). Von praktischer Bedeutungist dabei die Frage, ob das Anlegen von Kryospermakon-serven sinnvoll ist wenn die Langzeitlagerung vonSperma bei Tumor- und Risikopatienten erwogen wird.Der durchschnittliche Motilitätsverlust nach dem Einfrie-ren und Auftauen beträgt 40%.

Akrosomale Funktionstests

Ein funktioneil intaktes Spermatozoenakrosom ist Vor-aussetzung für die Penetration der Eizellhüllen durch dieSpermatozoen. Dafür enthält das Akrosom, das ein modi-fiziertes Lysozom darstellt, drei Penetrationsenzyme, diewie der Schlüssel zum Schloß für jeweils eines der dreiEihüllen notwendig sind (Abb. 3). Es handelt sich um dieHyaluronidase, das Corona-penetrating-enzyme und dietrypsinähnliche Proteinase Akrosin. Letztere ist dasSchlüsselenzym für das Durchdringen der Zona pellucida,die die größte Barriere darstellt. Akrosin wird aus einerinaktiven Vorstufe, dem Proakrosin, durch Autoaktivie-rung gebildet. Die Proenzymaktivierung findet währendder Spermatozoenkapazitation statt, die intrauterin ab-läuft und die Befruchtungsfähigkeit der Spermatozoenerst ermöglicht.

AkrosinbestimmungDie Messung der Akrosinaktivität erfolgt nach Extraktionder Spermatozoen bei pH 2,4-2,7 unter Verwendung des

Abb. 2: Spermatozoen-Penetrationsmeter nach Kremer. Aufeinem Objektträger befindet sich ein Spermareservoirf in das einehorizontal liegende Kapillare eintaucht, die ovulatorischen Zer-vixmukus enthält und auf der gegenüberliegenden Seite mit Pla-stelin verschlossen ist. Die experimentelle Anordnung erlaubtdoppel- und drei fache Ansätze. Messung der Penetrationsstrecke(in cm) des schnellsten Spermatozoons nach einer Inkubations-zeit von 20 Minuten bei 22 "C (lineare Penetration) und Bestim-mung der Spermatozoenzahl pro Gesichtsfeld (Penetrations-dichte) bei 2. 3, 4, 5 und 6 cm Wanderungsstrecke nach einerInkubationszeit von 20, 60 und 120 Minuten bei 320facher Ver-größerung

Tab. 1: Gekreuzter Spermatozoen -Zervixmukus- Penetrationstest

A. Erforderliches Material:- präovulatorischer Zervixmukus (Ehefrau, fertile Spenderin)- Sperma (Ehemann, fertiler Spender)B. Testansatz in vitro:1. Zervixmukus (Ehefrau) gegen Sperma (Ehemann)2. Zervixmukus (Ehefrau) gegen Spendersperma3. Spendermukus gegen Sperma (Ehemann)4. Spendermukus gegen Spendersperma

Tab. 2: Prüfung der Gefrierfähigkeit von Humansperma

Ejakulat + Kryoprotektivum\

Minitüb 0,25 mll

Kühlschrank (15 min, 4*C)l

Stickstoffdampf (20 min)l

Lagerung der Spermakonserve (-196"C)]

Auftauen der Kryospermaprobel

Motilitätsbestimmung nach 30 min

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synthetischen niedermolekularen Substrates BAEE (18).Durch Aktivierung des Proenzyms läßt sich die Gesamt-akrosinaktivitat bestimmen (19, 20).Der Akrosin- bzw. Proakrosingehall der Spermatozoenfertiler bzw. infertiler Männer weist signifikante Unter-schiede auf (21). Da jedoch die Streubreite der einzelnenPatientengruppen sehr groß ist, sind diagnostisch ver-wertbare Ruckschlüsse der Akrosinaktivität einzelnerSpeimaproben mit Vorsicht zu stellen.Klinisch relevant ist die Bestimmung der Akrosinaktivitätzur Sicherung der Diagnose Globozoospermie, einemKrankheitsbild, bei dem ausschließlich akrosomenloseRundkopfspermatozoen vorhanden sind. Aber auch beiPatienten mit einem erhöhten Anteil (>20%) von Rund-kopfspermatozoen konnte kürzlich nachgewiesen wer-den, daß bei einem Teil der Patienten in den morpholo-gisch intakten Spermatozoen kein Akrosin nachgewiesenwerden kann, was insbesondere im Hinblick auf die invitro-Fertilisation von Bedeutung ist (22). Auch bei an-deren Malformationen im Bereich des Spermatozoenkop-fes bestätigt die Akrosinmessung den Verlust der Penetra-tionsenzyme (23). Untersuchungen bei der Polyzoosper-mie, einem bisher nicht einzuordnenden Krankheitsbild,haben ergeben, daß bei einem großen Teil dieser Männerein erheblicher Verlust der Akrosinaktivität beobachtetwird, der möglicherweise die Infertilität erklärt und aufein funkt ionel l defektes Akrosom hinweist (24).Obwohl sicherlich viele Zusammenhänge noch nicht aus-reichend abgeklärt sind, müssen wir aufgrund der Be-funde bei der Polyzoospermie fordern, daß die Akrosinbe-stimmung in allen Fällen durchgeführt wird, in deneneine in vitro-Fertilisation geplant ist, insbesondere beiidiopathischer Sterilität bzw. beim Vorliegen eines andro-logischen Sterilitätsfaktors.

Akrosomreaktiqn

Ein noch im Entwicklungsstadium befindlicher Test stelltdie Untersuchung der Fähigkeit der Spermatozoen zurAusbildung der akrosomalen Reaktion dar. Bei dieserhandelt es sich um eine essentielle funktioneile Verände-rung im Bereich des akrosomalen Membranapparates, diedie Spermatozoen im Anschluß an die Kapazitationdurchlaufen müssen, um die Eizellhüllen penetrieren zukönnen. Es kommt dabei zu einer Fusion der Plasmamem-bran mit der äußeren akrosomalen Membran. Durch dieseVesikulationsreaktion können die Penetrationsenzymefreigesetzt werden und ermöglichen dadurch das Eindrin-gen der männlichen Keimzelle in die weibliche Gamete(Abb. 4).Eine gute Beurteilung des Spermatozoenakrosoms er-laubt eine von Talbot und Chacon (25) entwickelte Diffe-rentialfärbemethode, die sogenannte Triple-Stain-Tech-nik. Mit Hilfe dieser Methode kann durch Trypan-Blau-färbung zwischen toten und vitalen Spermatozoen unter-schieden werden. Die Nachfärbung der fixiertenSamenzellen mit Bismark-Braun und Rose-Bengal er-laubt die Identifizierung von Spermatozoen mit intaktenAkrosomenkappen (Rosafärbung), während akrosomen-reagierte Spermatozoen, also solche Samenzellen, bei de-nen die akrosomale Reaktion bereits abgelaufen ist, imAkrosombereich den Farbstoff nicht mehr aufnehmen(Abb. 5). Mit dieser Differential-Färbetechnik läßt sichdie Kinetik der akrosomalen Reaktion studieren.Erste Untersuchungsergebnisse weisen darauf hin, daßbei einigen Patienten mit normalen Ejakulaten möglicher-weise eine funktionelle Sterilität dadurch existiert daß

die akrosomale Reaktion in einem Zeitraum von 6 Stun-den nicht abläuft (26), Theoretisch ist auch eine zu früh-zeitig ablaufende akrosomale Reaktion dafür verantwort-lich, daß die Spermatozoen nicht mehr zeitgerecht für dieFertilisation vorbereitet sind. Untersuchungen der näch-sten Jahre werden sicherlich unsere Kenntnisse über diefunktionelle Sterilität beträchtlich erweitern, wobei auchder Einsatz monoklonaler Antikörper diagnostisch neuePerspektiven eröffnen wird.

Zono pellucida

Corona rodioto

Cumulus oophoru»

Delcopozifo»ionsfoHor

Plosmamembron

Perivitelliner Spalt Akrosin-Trypsin-Inhibitor

Abb. 3: Schematische Darstellung der drei intraakrosomal gele-genen Penetrationsenzyme und ihre Angriffspunkte an den ver-schiedenen Eihüllen

Abb. 4: Schematische Darstellung der akrosomalen Reaktion.A. Intaktes Akrosom mit dem enzymreichen akrosomalen Inhalt.B. Durch Verschmelzen der Plasmamembran mit der äußerenakrosomalen Membran („Vesikulation") kommt es zum Austrittdes akrosomalen Inhaltes (Penetrationsenzyme). C. Für die Pe-netration derZona pellucida bleibt die innere akrosomale Mem-bran erhalten, an der ein Teil des Akrosins gebunden ist

Nicht-Reagiert Reagiert Nicht-Reagiert Reagiert

Abb. 5: Triple-Stain-Technik nach Talbot und Chacon zur Beur-teilung der akrosomalen Reaktion

66 Lab.med. 9: 66 (1985)

MENSCH

Spermagewinnung

Waschen (3x)in BWW

Beurteilung der funktionellen Integrität des Mittelstücks spermatozoen-vorb^nH

Ein empfindlicher Indikator für die funktionelle Integritätdes Mittelstücks der Spermatozoen ist die Bestimmungder Spermatozoen-spezifischen LaktatdehydrogenaseLDH-X im Seminalplasma. Steigt deren Konzentration imSeminalplasma an, so weist dies auf Störungen im Be-reich des Mittelstücks (Mitochondrien) hin (27). Hochsi-gnifikante Unterschiede zwischen fertilen und infertilenMännern soll auch die Bestimmung des ATP-Gehaltesvon Spermaproben mit Hilfe der Biolumineszenz erlauben(28). Es wird daher die Bestimmung des ATP-Spiegelseines Ejakulates als mögliche biochemische Methode zurQuantifizierung des aktuellen Fertilitätspotentials einesEjakulates vorgeschlagen, da die Konzentration von ATPpro ml Ejakulat mit der Spermatozoendichte, der Zahl derbeweglichen Spermatozoen pro ml, dem Migrationsver-halten der Spermatozoen und dem in vitro-Potential derSpermatozoen zur Penetration Zona pellucida-freierHamstereizellen korreliert (28).

Beurteilung der Befruchtungsfähigkeit

Technisch aufwendige Verfahren zur Erfassung der Be-fruchtungsfähigkeit von Spermatozoen sind Tests zurÜberprüfung des Eindringverhaltens von kapazitiertenSpermatozoen in Zona pellucida-freie Hamstereizellen(=heterologer Ovumpenetrationstest [HOP]) bzw. beider in vitro-Fertilisation (29). Abb.6 illustriert das Prinzipdes HOP-Tests unter Verwendung Zona pellucida-freierHamstereizellen (30). Die Aussagefähigkeit dieses Testsist jedoch begrenzt, da artifizielle Verhältnisse vorliegenund nur Teilaspekte der Gameteninteraktion Berücksich-tigung finden. Neuerdings wird der Schwelltest für dieCharakterisierung der Fertilisationsfähigkeit der Sperma-tozoen empfohlen (31). Dabei werden die Spermatozoenin einem hypoosmotischen Medium inkubiert, was zuSchwellungen und Auftreibung im Schwanzbereichführt. Der Test stellt ein Maß für die funktionelle Integritätder Plasmamembran dar und korreliert nach den bishervorliegenden Untersuchungen gut mit dem Fertilisations-verhalten der Spermatozoen im HOP-Test und bei der invitro-Fertilisation. Der Schwelltest ist einfach und ohnegroßen Aufwand durchzuführen und eignet sich daherbesonders für die andrologische Routinediagnostik.Weitere Testverfahren zur Erfassung von Dysfunktionender Gameteninteraktion sind in Entwicklung und betref-fen die Kapazitation, die Zona pellucida-Bindung und dieZona pellucida-Penetration.Diefunktionellen Untersuchungsverfahren mit Hilfe mor-phologischer, biochemischer und biologischer in vitro-Testsysteme stellen eine wichtige Ergänzung der klassi-schen Spermaanalyse dar. Sie werden in Zukunft vonzunehmender Bedeutung für die andrologische Diagno-stik sein, da sie fehlablaufende molekularbiologischeSchritte im Reproduktionsgeschehen helfen zu erfassen,die zum Verlust der Befruchtungsfähigkeit der Spermato-zoen führen und damit überhaupt erstmals einer Untersu-chung zugänglich werden. Dadurch verspricht man sicheine genaue Differenzierung und bessere Klassifikationdes männlichen Sterilitätsfaktors, nicht zuletzt, um einegezieltere Therapie ausgewählter Patienten durchführenzu können.Im folgenden soll jetzt auf immunologische Untersu-chungsmethoden eingegangen werden, die bei Verdachtauf das Vorliegen von Spermatozoen-Antikörpern (mehr-fach negativer Sims-Huhner-Test) erforderlich sind.

Präparation der ZonafreienHamster-Eizellen

<j * \^ Superovulatioi

* M f̂̂ mit PMS

Dispersion desCumulus mitHyaluronidase

Entfernung derZona pellucidamit Trypsin

Inkubation derSpermatozoen undEizellen (2 Std)

Bestimmung derZahl penetrierterEizellen

Abb. 6: Prinzip des heterologen Ovumpenetrationstests (HOP)

Immunologische UntersuchungenSpermatozoen weisen zahlreiche antigene Komponentenauf. Durch den Kontakt des Immunsystems mit den Sper-matozoen, die extravasal durch Traumata, Verschlüsse imBereich der ableitenden Samenwege oder entzündlicheAdnexprozesse gelangen, kommt es beim Mann zur Aus-bildung von Spermatozoen-Autoantikörpern bzw. bei derFrau zur Bildung von Isoantikörpern gegen männlicheSamenzellen. Diese haben agglutinierende und immobili-sierende Eigenschaften. Sie spielen als Infertilitätsursacheeine Rolle, wenn sie in hohen Titern vorkommen und mitder Zervixmukus-Penetration der Spermatozoen interfe-rieren (32).Neuere Ergebnisse sprechen dafür, daß der direkte Nach-weis der im Genitaltrakt wirksamen Antikörper im Hin-blick auf ihre biologische Relevanz von ausschlaggeben-der Bedeutung ist. Aus diesem Grunde sollte nicht nur imSerum, sondern insbesondere im Seminalplasma und imovulatorischen Zervixmukus nach Antikörpern gefahndetwerden.Zum Nachweis von Spermatozoen-Antikörpern könnendie in Tab. 3 zusammengestellten Methoden verwendetwerden, wobei Screening-Methoden von spezifischenTestverfahren unterschieden werden müssen.

Tab. 3: Methoden zum Nachweis von Spermatozoen-Antikör-pern

- Sims-Huhner-Test- Kurzrok-Miller-Test'- Spermatozoen-Zervixmukus-Kontakt-Test (SCMC)- Mixed-Antiglobulin-Reaction (MAR)-Test- Agglutinationstest (Kibrick)- Tray-Agglutination-Test (Friberg)- Immobilisations-Test (Isojima)- Radio-Labeled-Antiglobulin-Test (RLAT)- Enzyme-Linked-lmmunosorbent-Assay (ELISA)Testmaterial: Serum, Spermaplasma, Zervixmukus

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Zu den Screening-Verfahren zählt die mikroskopischeBeobachtung des Nativspermas, da gelegentlich als Folgevon Antigen-Antikörperreaktionen Agglutinationen vita-ler Spermatozoen beobachtet werden (Kopf zu Kopf,Schwanz zu Schwanz und gemischte Agglutinationen).Relevante Screening-Methoden sind der Sims-Huhner-Test (9). der Kurzrok-Miller-Test (10) und der von Kremerund Jager (33) beschriebene Spermatozoen-Zervixmu-kus-Kontakttest (SCMC-Test), bei dem das „Shaking"-Phänomen auf das Vorliegen von Spermatozoen-Antikör-pern hinweist. Als weiterer Schnelltest zum Nachweisvon Spermatozoen-Antikörpern eignet sich der Mixed-Antiglobulin-Reaction-Test (MÄR) (34) (Abb. 7).Ist der Antikörpernachweis positiv, so stehen spezifischeTestverfahren [Agglutinationstest nach Kibrick (Abb. 8)und Immobilisationstest nach Isojima] zur Verfügung, umden Antikörper-Typ und -Titer festzustellen (35). Da dieEmpfindlichkeit und Reproduzierbarkeit der genanntenMethoden von der Qualität der verwendeten Testejaku-late abhängt, werden Methoden benötigt, die einen ho-hen Grad an Standardisierung und Reproduzierbarkeitaufweisen und von frischen Testejakulaten unabhängigsind. Radioimmunologische und enzymimmunologischeTestverfahren stehen hierfür neuerdings zur Verfügung.Besonders praktikabel sind ELISA-Techniken für den An-tikörpernachweis aus Serum- und Genitalsekreten

(Abb. 9). Es handelt sich dabei um sehr empfindliche undreproduzierter Methoden, für die entsprechende Ausrü-stungen im Handel angeboten werden (36). Im folgendenwird ein von uns modifizierter ELISA beschrieben (Schiltund Wolff, in Vorbereitung), bei dem im Gegensatz zu denmeist verwendeten Polystyrolmikrotiterplatten mit einerpositiven elektrischen Ladung beschichtete Polyvinyl-chloridplatten (Flow Laboratories, Meckenheim) ver-wendet werden, die eine ausgezeichnete Bindung dernegativ geladenen Spermatozoen ermöglichen, so daßauf die übliche Glutaraldehydfixierung der Samenzellenverzichtet werden kann. Die eingesetzte Spermatozoen-menge pro Napf beträgt 1 *105. Die Testnäpfchen wer-den mit Referenz- und Testseren beschickt, 90 Minutenbei 37°C inkubiert und dreimal mit PBS gewaschen, dasTween 20 in einer Konzentration von 0,5% enthält. Da-nach Zugabe von Antihuman-lgG/IgM/lgA gekoppeltmit alkalischer Phosphatase und Inkubation für 90 Minu-ten bei 37°C. Anschließend dreimaliges Waschen mitPBS, Zugabe von p-Nitrophenol mit 45minütiger Inkuba-tion bei 37°C, Stoppen der Reaktion durch 2N NaOHund photometrische Messung der 96 Näpfe enthaltendenMikrotiterplatten mit einem automatisierten Mikrophoto-meter (Titertek Multiscan MC).Abb. 10 zeigt eine typische Titrationskurve, die mit Hilfeder ELISA-Technik gewonnen werden konnte (positives

Frisches Testejakulat Erythrocyten (0/Rh+)

Anti IgG-Semm sensib. mit Anti-RhAK 0

O // 00 //OOO/Positiver Test: mikrosk. Nachweis von beweglichen Spermatozoen-Ery-Agglutinatio-nen(>10%)

Abb. 7: Prinzip des Mixed-Antiglobulin-Reaction (MÄR)-Testszur Verwendung als Spermatozoen-Antikörper-Suchtest

Abb. 8: Makroskopischer Spermatozoenagglutinationstest nachKibrick unter Verwendung von Kapillarröhrchen. Von links nachrechts: Unverdünntes Serum eines vasektomierten Mannes andas sich Serumverdünnungen bis zu 1:512 sowie eine Kontrolleanschließen. Der Agglutinationstiter beträgt 1:256

68 Lab.med.9:68(1985)

r

Absorption vonSpermatotoen (AC) an

Zugabe von Serum,Spermaplasma oder CM.

Zugabe von Enzym-markiertem

Mikrotiterplatten Spei. AK binden an AC Antihumanglobulin

Menge des Hydrolyseproduktes = AntikörpermengeAbb. 9: Prinzip des indirekten ELISA zum Nachweis von Sperma-tozoen-Antikörpern

oJ2c

WHO-ReferenzsemmAgglutinTiter M024

Serum eine» infertilen Mannes

Serum eines fertilen Mannes

1.32 »64 M28 1256 1512 1 024 K2048 1=4096 1:8192 1:16384

Serum-Verdünnung

Abb. 10: Mit Hilfe der ELISA-Technik gewonnene Titrationskur-ven von Kontroll-, Test- und Referenz-Seren

Referenzserum der WHO, Serum eines fertilen Mannes,Serum eines infertilen Patienten mit zirkulierenden Sper-matozoenantikörpern). Als positive Reaktion wird ein Ti-ter von 1:64 angesehen, dessen Extinktion über dem dop-pelten negativen Kontrollserumwert liegt was einem au-ßerordentlichen strengen Bewertungsmaßstab ent-spricht.Die Empfindlichkeit des ELISA ist größer als die des her-kömmlichen Kibrick- bzw. Isojima-Tests. Die Durchfüh-rung der ELISA-Technik ist einfach, schnell und exaktund eignet sich auch als Screening-Methode (100 Tests/5 Stunden). Ein Vorteil des Verfahrens ist die Verwendungvon Nativ- und Kryosperma unterschiedlicher Qualitätund das Entfallen der Glutaraldehydfixierung. Nachteileder ELISA-Technik können falsch-positive Reaktionendurch zirkulierende Immunkomplexe infolge Vorhanden-seins von Fc-Rezeptoren an der Spermatozoenoberflachesein. Beim Verdacht auf das Vorliegen von Immunkomple-xen ist eine Trypsinierung der Spermatozoen bzw. einePolyäthylenglykolfällung der verwendeten biologischenMaterialien durchzuführen.In vorläufigen Untersuchungen wurde mit Hilfe der be-schriebenen ELISA-Technik das Vorkommen von Sper-matozoen-Antikörpern im Serum und Seminalplasma von190 unausgewählten Männern der andrologischenSprechstunde untersucht. Bei 19 der 190 Männer(=10%) konnten im Serum Spermatozoenantikörpernachgewiesen werden (entweder der IgM bzw. der IgG-Klasse). Im Seminalplasma ließen sich bei 15 von 190Männern (=7,5%) Spermatozoenantikörper der IgA bzw.gleichzeitig der IgA- und IgG-Klasse nachweisen. Auffäl-lig war, daß nur bei vier von 190 Männern gleichzeitigSpermatozoenantikörper im Serum und Seminalplasmagefunden werden konnten. Dieser Befund unterstreichtdie Bedeutung der Bestimmung von Spermatozoen-Anti-körpern in den Genitalsekreten.Die Korrelation zwischen dem ELISA und den herkömmli-chen immunologischen Testverfahren ist gut, wobei zwi-schen ELISA und Kibrick-Test eine Übereinstimmung vonetwa 85% besteht. Zur Klärung der klinischen Relevanzder mit dem ELISA nachgewiesenen Spermatozoen-An -tikörper wird empfohlen, einen Spermatozoen-Zervixmu-kus-Kontakttest durchzuführen, da der Nachweis des„Shaking"-Phänomens auf das Vorliegen klinisch rele-vanter Spermatozoen-Antikörper hinweist (33).

Schrifttum:

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Anschrift des Verfassers:Prof. Dr. med. Wolf-Bernhard SchulDermatologische Klinik und Poliklinikder Ludwig-Maximilians-UniversitätFrauenlobstraße 9-118000 München 2

Lab.med. 9: 69 (1985)

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