PERCOBAAN 4.1

ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF SEDIAAN FARMASI

DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

I. Tujuan Percobaan

1. Dapat melakukan analisis kualitatif tablet parasetamol dengan metode

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

2. Dapat melakukan analisis kuantitatif tablet parasetamol dengan metode

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

3. Dapat menyimpulkan mutu sediaan tablet parasetamol dengan data

kromatogram dan hasil penetapan kadar.

II. Teori Dasar

KCKT adalah instrument untuk pemisahan sejumlah senyawa organik,

anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidak murnian ( impurities)

dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (nonvolatil).

KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa

tertentu seperti asam-asam amino,asam-asam nukleat dan protein-protein

dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan

lain-lain. Beberapa senyawa organik yang mudah terurai (labil) pada

pemanasan dapat dianalisis dengan cara kromatografi cairan kinerja tinggi

atau HPLC karena HPLC dilakukan pada suhu kamar. Selain senyawa

organic teknik HPLC juga dapat menganalisis senyawa anorganik, cuplikan

yang mempunyai berat molekul tinggi atau titik didihnya tinggi seperti

polimer. Kelebihan KCKT antara lain:

- Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran.

- Resolusinya baik.

- Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi.

- Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis.

- Dapat digunakan bermacam-macam detector.

- Kolom dapat digunakan kembali.

- Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan

kuantitatif .

- Waktu analisis umumnya singkat.

- Kromatografi cair preparatif memungkinkan dalam skala besar.

- Ideal untuk molekul besar dan ion.

- Dapat dilakukan pada suhu kamar

- Mudah dioperasikan secara otomatis.

(Putra, Effendy De Lux. 2004:8)

Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali

jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan

lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit

diperoleh. Berikut skema kerja alat yang digunakan dalam HPLC

Larutan sampel yang akan dianalisis diinjeksi kemudian sampel akan

turun ke dalam kolom dan di elusi oleh eluen yang disediakan. Lalu detector

akan mendeteksi waktu retensi dalam bentuk kromatogram. Dari

kromatogram itu kita dapat meganalisis sampel.

HPLC memiliki kekuatan pemisahan yang sangat ampuh bahkan untuk

komponen-komponen yang berhubungan sangat erat; pemisahan penukar ion

yang sukses dari logam tanah yang langka dan asam-asam amino telah

memperlihatkan ini. Komposisi fase gerak dalam HPLC memberikan suatu

dimensi untuk memanipulasi eksperimen yang tidak dijumpai dalam

kromatografi gas. Dalam kromatografi gas faktor pemisahan untuk sepasang

komponen sampel tergantung pada sifat dasar stationer, sedangkan dalam

HPLC faktor itu juga bergantung pada fase gerak. Seringkali pelarut

campuran merupakan fase gerak yang lebih baik daripada cairan murni untuk

memisahkan campuran yang rumit dan pengoptimasian komposisi pelarut

dengan cara coba-coba dapat menjadi lebih rumit.

Pemilihan detektor pada HPLC umumnya didasarkan pada persyaratan

sensitivitas, jenis senyawa yang ada di dalam sampel dan faktor lainnya

seperti biaya. Detector yang paling umum didasarkan pada indeks bias dan

eluat kolom, karena hampir semua zat terlarut akan menghasilkan larutan

dengan indeks bias yang berbeda dengan indeks bias pelarut murni.

Pada dasarnya instrumen HPLC terdiri dari tandon (reservoir) cairan fase

gerak, pompa, injector, kolom, detektor dan rekorder.

1. Tandon (Reservoir)

Reservoir yang baik disertai degessing system yang berfungsi untuk

mengusir gas-gas terlarut dalam solvent. Degassing dilakukan dengan

mengalirkan gas inert dengan kelarutan yang sangat kecil, misalnya

helium. Degassing dapat juga dibuat sendiri dengan erlermeyer yang

dilengkapi dengan pengaduk magnet, pemanas dan pompa vacum.

2. Pompa

Fungsi pompa adalah untuk memompa fase gerak (solvent) ke dalam

kolom dengan aliran yang konstan dan reproducible. Pompa harus

memenuhi persyaratann seperti dapat memberi tekanan sampai 6000 psi

(360 atm), tekanan yang dihasilkan bebas pulsa, dapat mengalirkan fase

gerak dengan kecepatan 0,1 sampai 10 ml/ menit, dapat mengalirkan fase

gerak dengan reprodusibilitas yang tinggi, tahan terhadap korosi (biasanya

terbuat dari baja atau teflon). Ada beberapa jenis pompa, antara lain :

a. Reciprocating pump

b. Displacement Pump

c. Pneumatic Pump

3. Katup Injector

Bagian ini merupakan tempat dimana sampel diinjeksikan untuk

selanjutnya dibawa oleh fase gerak ke dalam kolom.

4. Kolom (Column)

Kolom merupakan jantung dari HPLC, sebab kunci keberhasilan analisis

sangat tergantung pada efisiensi kolom sebagai alat untuk memisah-

misahkan senyawa dalam campuran yang kompleks. Kolom terbuat dari

stainless steel yang dibor halus atau dari gelas. Ada dua jenis packing

kolom yang telah digunakan dalam kromatografi cair. yaitu berupa partikel

porous dan partikel pelliculer.

5. Detektor

Setelah sampel melewati kolom maka komponen-komponennya akan

terpisah-pisah dan keluar dari kolom dengan waktu yang berbeda-beda.

Komponen yang sudah terpisah ini secara berturut-turut akan melewati

suatu detektor dan akan dibaca kadarnya. Detektor yang digunakan harus

sesuai dengan jenis zat yang dianalisis.

a. Detektor UV

Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri abssorbsi. Sampel

yang dianalisis harus menyerap sinar UV. Panjang gelombang sinar

UV yang biasa digunakan adalah 254 nm.

b. Detektor Fluoresensi

Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri. Detektor ini lebih

sensitif daripada detektor UV. Pemakaian sumber sinar laser akan

memberikan sensitivitas yang sangat tinggi. Derivatisasi sering

dilakukan terhadap asam amino.

c. Detektor Indeks Refraksi (Refraksi Index Detector = RID)

Detektor ini bekerja atas dasar perbedaan indeks refraksi sampel

dengan solvent. Semua larutan suatu zat mempunyai indeks bias yang

spesifik, oleh karena itu detektor ini dapat digunakan untuk hampir

semua zat.

6. Recorder

Hasil pembacaan detektor kemudian diolah oleh suatu processor kemudian

dikirim ke recorder. Recorder akan membuat suatu tampilan. Dalam

kromatografi tampilan ini disebut chromathogram. Untuk HPLC

dilengkapi seperangkat software yang dapat menghitung luas

kromatogram dan bahkan sekaligus menghitung kadarnya.

HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif

pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk

degradasi dalam sediaan farmasi. Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk

identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan spektometer

massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah sampel sangat kompleks maka

resolusi yang baik sulit diperoleh.

Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus

kromofor yang dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar

UV. Karakteristik senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC

menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar seperti

methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat dan sempurna melalui saluran

cerna. Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam waktu ½ jam dan masa

paruh plasma antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. Dalam

plasma, 25% parasetamol terikat protein plasma. Parasetamol digunakan

sebagai analgesik dan antipiretik.

III. Data Fisik dan Kimia

a. Parasetamol (Acetaminophen)

Rumus molekul :

Warna : Putih

Rasa : Pahit

Bau : -

Pemerian : Hablur atau serbuk hablur

Kelarutan : Larut dalam air mendidih dan dalam natrium

hidroksida 1N, mudah larut dalam etanol.

Berat molekul : 151,16 g/mol

Bobot jenis : 1,293 g/cm3

pH larutan : 5-7

Stabilitas : Pada suhu > 40C mudah terdegradasi

Titik leleh : 169-172C

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, tidak tembus cahaya.

Fungsi : Analgetik, antipiretik.

(Farmakope Indonesia Edisi IV hal. 649 & MSDS Acetaminophen

ScienceLab.com Chemicals and Laboratory Equipment)

b. Metanol

Rumus molekul : CH4OH

Pemerian : Cairan tidak berwarna, tidak berasa

Titik didih : 64,5C

Bobot jenis : 0,7915 g/cm3

Berat molekul : 32,04 g/mol

Kerapatan : 1,11

Titik beku : -98C

Viskositas : 0,55 Cp

Perhatian : Dapat menyebabkan iritasi pada mata, kulit, rasa

terbakar, inflamasi, kerusakan kornea, mudah terbakar dan bersifat

toksik.

(MSDS Methanol ScienceLab.com Chemicals and Laboratoty

Equipment))

c. Aqua Bidestilasi

Pemerian : Cairan jernih tidak berbau, tidak berasa

pH : 7

Titik didih : 100C

Titik beku : 0C

Stabilitas : Produk yang stabil

Inkompatibilitas : -

(MSDS H2O ScienceLab.com Chemicals and Laboratory Equipment)

IV. Alat dan Bahan

Bahan Alat

- Tablet Parasetamol

- Metanol Pro HPLC

- Aquabidestilata

- Baku pembanding parasetamol

- HPLC Agillent

- Labu takar

- Pipet

- Vial

- Membran filter PTFE 0,45 m

- Detektor UV 243 nm

- ODS

V. Prosedur Kerja

Sistem Kromatografi

Fase Diam : ODS, packing L1

Fase Gerak : Air : Metanol 3:1 (v/v)

Laju Alir : 1,5 ml/menit

Lempeng teoritis : 1000

Tailing factor : maksimal 2

Detektor : UV 243 nm

Uji Kesesuaian Sistem

Larutan standar diinjeksikan berturut-turut sebanyak 7 kali ke dalam

instrumen KCKT, selanjutnya luas area, waktu retensi, faktor ikutan dihitung

nilai simpangan baku relatifnya. Uji kesesuaian sistem dinyatakan memenuhi

syarat jika nilai SBR < 2,0%.

Analisis Kualitatif

Larutan Standar

25 mg baku pembanding parasetamol ditimbang ke dalam labu takar 50 ml

kemudian diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas. Larutan dikocok

hingga homogen. Sebanyak 1 ml larutan dipipet ke dalam labu takar 10 ml

dan diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas. Larutan disaring

dengan membran filter PTFE 0,45 m ke dalam vial. Larutan siap

diinjeksikan ke dalam instrumen KCKT.

Larutan Uji

4 tablet parasetamol ditimbang lalu diserbukkan. Kemudian 50 mg serbuk

parasetamol ditimbang dan dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml.

Sebanyak 50 ml fase gerak ditambahkan ke dalam labu takar berisi serbuk

parasetamol lalu dikocok hingga homogen. Kemudian larutan diencerkan

dengan fase gerak hingga tanda batas. Sebanyak 2 ml larutan dipipet ke dalam

labu takar 25 ml dan diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas.

Larutan disaring dengan membran filter PTFE 0,45 m ke dalam vial. 2 ml

filtrat awal dibuang. Larutan hasil filtrasi siap diinjeksikan ke dalam

instrumen KCKT.

Maisng-masing larutan standar dan larutan uji diinjeksikan ke dalam

instrumen KCKT. Kromatogram yang terbentuk direkam dan dibandingkan

antara kromatogram larutan standar dan larutan uji. Waktu retensi puncak

larutan uji harus sama dengan waktu retensi puncak larutan standar.

Analisis Kuantitatif

Larutan Standar

25 mg baku pembanding parasetamol ditimbang ke dalam labu takar 50 ml

kemudian diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas. Larutan dikocok

hingga homogen (larutan stok baku pembanding). Serangkaian pengenceran

dibuat untuk kurva kalibrasi. Sebanyak 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 dan 1,2 ml

larutan stok pembanding dipipet ke dalam labu takar 10 ml dan diencerkan

dengan fase gerak hingga tanda batas. Larutan disaring dengan membran

filter PTFE 0,45 m ke dalam vial. Larutan siap diinjeksikan ke dalam

instrumen KCKT. Konsentrasi masing-masing larutan kurva kalibrasi

dihitung.

Larutan Uji

4 tablet parasetamol ditimbang lalu diserbukkan. Kemudian 50 mg serbuk

parasetamol ditimbang dan dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml.

Sebanyak 50 ml fase gerak ditambahkan ke dalam labu takar berisi serbuk

parasetamol lalu dikocok hingga homogen. Kemudian larutan diencerkan

dengan fase gerak hingga tanda batas. Sebanyak 2 ml larutan dipipet ke dalam

labu takar 25 ml dan diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas.

Larutan disaring dengan membran filter PTFE 0,45 m ke dalam vial. 2 ml

filtrat awal dibuang. Larutan hasil filtrasi siap diinjeksikan ke dalam

instrumen KCKT.

Cara Kurva Kalibrasi

Masing-masing serangkaian konsentrasi larutan standar dan larutan uji

diinjeksikan ke dalam instrumen KCKT. Luas area masing-masing larutan

standar dan larutan uji kromatogram dicatat kemudian dibuat persamaan garis

dengan kurva kalibrasi. Kadar larutan sampel dihitung.

Metode One Point

Luas kromatogram salah satu larutan pembanding diambil kemudian dihitung

kadar larutan sampelnya menggunakan metode One Point.

𝐶𝑢 =𝐿𝑢

𝐿𝑠 𝑥 𝐶𝑠

VI. Hasil Pengamatan dan Perhitungan

Konsentrasi larutan stok baku pembanding parasetamol

25 𝑚𝑔

50 𝑚𝑙=

25 𝑚𝑔

0,05 𝐿= 500 𝑝𝑝𝑚

Konsentrasi larutan uji

Larutan 0,2 ml

V1 . M1 = V2 . M2

0,2 . 500 = 10 . M2

M2 = 10 ppm

Larutan 0,4 ml

V1 . M1 = V2 . M2

0,4 . 500 = 10 . M2

M2 = 20 ppm

Larutan 0,6 ml Larutan 0,8 ml

V1 . M1 = V2 . M2

0,6 . 500 = 10 . M2

M2 = 30 ppm

V1 . M1 = V2 . M2

0,8. 500 = 10 . M2

M2 = 40 ppm

Larutan 1,0 ml

V1 . M1 = V2 . M2

1,0 . 500 = 10 . M2

M2 = 50 ppm

Larutan 1,2 ml

V1 . M1 = V2 . M2

1,2 . 500 = 10 . M2

M2 = 60 ppm

a. Uji kesesuaian sistem

Penyuntikan Luas Area (Auc/Voltz) Waktu Retensi

1 39018837 3,783

2 39347640 3,740

3 39773472 3,713

4 39429424 3,690

5 40040691 3,687

6 39818200 3,673

7 40068274 3,680

Rata-rata 39642363 3,709429

SD 389264,89 0,039652

SBR 0,9819417 % 1,068953 %

b. Uji Kualitatif

Kromatogram Larutan Standar

Kromatogram Sampel Uji

Waktu retensi sampel uji tablet parasetamol (3,633 menit) mendekati nilai

waktu retensi larutan standar (3,783 menit).

c. Uji Kuantitatif

Konsentrasi (ppm) Luas Area (Auc/Voltz)

10 11567757

20 14719539

30 18640502

40 30642229

50 38088918

60 45449769

Kadar parasetamol dalam tablet parasetamol (Cara kurva kalibrasi)

Y1 = bx + a

29233045 = 718628,3029x + 1366131,4

718628,3029x = 29233045 - 1366131,4

718628,3029x = 27866913,6

x = 38,778 ppm

% konsentrasi

𝑥

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑡𝑖𝑚𝑏𝑎𝑛𝑔 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡 𝑥 100%

38,778

62,025 𝑥 100% = 62,521 %

Y2 = bx + a

27961457 = 718628,3029x + 1366131,4

718628,3029x = 27961457 - 1366131,4

718628,3029x = 26595325,6

x = 37,008 ppm

% konsentrasi

𝑥

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑡𝑖𝑚𝑏𝑎𝑛𝑔 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡 𝑥 100%

37,008

61,85 𝑥 100% = 59,835 %

Kadar parasetamol dalam tablet parasetamol (Metode One Point)

Diambil konsentrasi 60 ppm

Sampel Uji Tablet 1

𝐶𝑢 =𝐿𝑢

𝐿𝑠 𝑥 𝐶𝑠

𝐶𝑢 =29233045

45449769 𝑥 60

𝐶𝑢 = 38,591 𝑝𝑝𝑚

Sampel Uji Tablet 2

𝐶𝑢 =𝐿𝑢

𝐿𝑠 𝑥 𝐶𝑠

𝐶𝑢 =27961467

45449769 𝑥 60

𝐶𝑢 = 36,913 𝑝𝑝𝑚

y = 718628x + 1E+06R² = 0.9675

0

10000000

20000000

30000000

40000000

50000000

0 20 40 60 80

Axi

s Ti

tle

Axis Title

Kurva Kalibrasi Sampel Uji Tablet Prasetamol

Series1

Linear (Series1)

% konsentrasi

𝑥

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑡𝑖𝑚𝑏𝑎𝑛𝑔 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡 𝑥 100%

38,591

62,025 𝑥 100% = 62,218 %

% konsentrasi

𝑥

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑡𝑖𝑚𝑏𝑎𝑛𝑔 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡 𝑥 100%

36,913

61,85 𝑥 100% = 59,681 %

VII. Pembahasan

Pada percobaan kali ini dilakukan analisis kualitatif dan kuantitatif

terhadap tablet parasetamol dengan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi. Analisis ini bertujuan untuk mengetahui mutu sediaan dari tablet

parasetamol. Prinsip kerja dari KCKT adalah pemisahan suatu senyawa

berdasarkan sifat kepolarannya. Sistem kromatografi yang digunakan pada

percobaan ini yaitu fase balik, dimana fase diam yang digunakan bersifat non

polar sedangkan fase geraknya bersifat polar. Fase diam yang digunakan

adalah ODS atau Okta Desil Silica. ODS merupakan kolom berisi silika yang

bersifat polar yang kemudian ditambahkan 18 atom C sehingga ODS bersifat

non polar. ODS banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa dari

tingkat kepolaran terendah hingga tertinggi. ODS digunakan karena

parasetamol bersifat polar sehingga senyawa parasetamol tidak akan tertahan

pada fase diam tetapi ikut keluar bersama fase gerak yaitu metanol : air.

Pengujian tablet parasetamol diawali dengan penginjeksian sampel uji

yang telah disaring dengan membran filter PTFE, penyaringan ini dilakukan

agar tidak terjadi penyumbatan didalam kolom. Dengan bantuan pompa

bertekanan tinggi, sampel masuk ke dalam kolom. Di dalam kolom,

komponen-komponen sampel dipisahkan berdasarkan kepolarannya.

Parasetamol yang bersifat polar akan keluar lebih dulu bersama fase gerak,

dan eksipien lain yang bersifat non polar akan tertahan di dalam kolom.

Pada pengujian ini detektor yang digunakan adalah detektor UV 243 nm

karena parasetamol memiliki gugus kromofor yang dapat terbaca oleh

detektor UV. Panjang gelombang yang digunakan 243 nm karena merupakan

panjang gelombang maksimal dari parasetamol, dimana pada panjang

gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal dan memenuhi hukum

Lambert-Beer, selain itu jika dilakukan pengulangan maka kesalahannya akan

kecil.

Dari hasil pengamatan, nilai SBR pada uji kesesuaian sistem telah

memenuhi syarat yaitu <2 %. Pada SBR luas area didapat nilai 0,982 % dan

pada waktu retensi 1,069 %. Hal ini menunjukkan bahwa sistem kromatografi

telah siap digunakan. Dari hasil perhitungan kadar dengan menggunakan

kurva kalibrasi yang dilakukan secara duplo, didapat kadar sampel sebesar

62,…. % dan 59,….% sedangkan dengan cara One Point didapat kadar

sampel sebesar 62,…. % dan 59,….%. Berdasarkan Farmakope Indonesia IV,

kadar parasetamol dalam tablet tidak boleh < 90% dan >110%, hal ini berarti

kadar parasetamol dalam tablet parasetamol tidak memenuhi syarat. Hal ini

disebabkan :

- Kondisi alat yang digunakan yang telah digunakan berulang kali.

- Kemungkinan tablet parasetamol yang sudah kadaluarsa.

- Kemungkinan penyimpanan tablet yang tidak baik sehingga, kadar

parasetamol terdegradasi dan teroksidasi karena paparan cahaya.

- Adanya kontaminasi selama pengerjaan.

Dilihat dari kromatogram yang terbentuk, terdapat tailing factor dari setiap

konsentrasi. Tailing factor ini disebabkan oleh beberapa faktor antara lain:

1. Guard column yang sudah mulai rusak.

2. Fase gerak yang sudah mulai rusak.

3. Partikel silika yang dipakai di dalam bahan pendukung bukanlah partikel

silika yang baik.

4. Adanya komponen lain yang keluar tepat setelah peak.

5. Sampel bereaksi dengan gugus silanol pada partikel silika.

6. pH fase gerak yang tidak tepat.

7. Pemilihan kolom yang tidak teapat dengan senyawa yang menjadi target

analisa.

8. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel tidak kompatibel dengan

fase gerak.

ONE POINT SAMA KALIBRASI

KELEBIHAN KEKUKRANGAN UV SAMA HPLC