Sistemas celulares de degradación. - U-Cursos

Sistemas celulares de degradación.

Dr. Alejandro Roth (Biología Celular, 2011)

2http://www.tmd.ac.jp/med/phy2/E_senmon.html

¿Por qué es importante degradar proteínas?

• Reciclaje de proteínas viejas o dañadas.

• Control de la función de una proteína o la vía regulada por ella.

• Prevención de acumulación de proteínas mal construídas.

La síntesis protéica es un proceso metabolicamente “caro”, donde buena parte del costo proviene de los sistemas de control de calidad.

Las células presentan dos vías de degradación de proteínas: • Autofágia (degradación “en bulto”)• Proteosoma (selectiva)

Organelos yProteínas de vida larga

Síntesis proteica

Degradación de proteínasdel Retículo

EndoplasmáticoProteínas anormales

Daño

Adaptación Metabólica

Diferenciación celular

reciclaje

Sistema de Ubiquitinación

Degradación Citosólica

Lisosoma(vacuola)

Degradación Lisosomal • Nutrientes extra-celulares.• Degradación en bulto

Proteínas vida corta

• Organelos con una sola membrana y con forma heterogénea

• Son el principal sistema de degradación de las células:

– Nutrientes incorporados por endocitosis– Componentes celulares para ser reciclados

• pH ácido generado mediante bomba de protones de tipo V (vacuolar) homóloga a F0F1.

• 40 enzimas Hidrolasas: Hidrolasas ácidas (proteasas, lipasas, nucleasas, glicosidasas y sulfatasas)

• La actividad de estas enzimas a pH 7.2 es limitado. ¿Sistema de seguridad?

• Formadas a partir de la maduración del endosoma tardío

• Proteínas residentes tienen señal de destinamiento dependiente de glicosilación.

Lisosomas y Vacuolas

0.2 a 0.5 um

Las Tres Rutas de Degradación dependientes de los Lisosomas

1º Endocitosis:

-El material se descarga en los Endosomas Tempranos donde:

Parte del material se recicla a la membrana plasmática

P a r t e s e d e s c a r g a e n l o s Endosomas Tardíos, organelos que vienen del RE con hidrolasas ácidas (pH del organelo = 6)

A partir de los Endosomas Tardíos se generan los Lisosomas.

2 º R u t a d e D e g r a d a c i ó n e n Lisosomas

Degradación de partes de la propia célula. Ejemplo: organelos como la mitocondria.

Membranas del RE engloban a la m i t o c o n d r i a f o r m á n d o s e u n Autofagosoma, el que posteriormente se unirá a un Lisosoma.

3º Ruta de Degradación en Lisosomas

Ocurre en células especializadas en fagocitar microorganismos (macrófagos y neutrófilos).

Se forman fagosomas los que formarán más tarde Lisosomas.

Las Tres Rutas de Degradación dependientes de los Lisosomas

Ruta Biosintética secretora: proteínas van desde RE a membrana plasmática, o mediante endosomas tardíos a los lisosomas.

Ruta Endocítica, las moléculas son ingeridas y trasladadas a endosomas tempranos y vía endosomas tardíos van a los lisosomas

Rutas de Recuperación (de retorno)

Los lisosomas son producidos mediante maduración de los endosomas

Transporte desde la Red Trans Golgi hacia los Lisosomas

Todas las proteínas llegan hasta la zona trans para ser destinadas (con excepción de las proteínas residentes permanentes del A. de Golgi)

ADN (Núcleo) en azul (Hoechst). Mitocondrias en verde (MitoTracker) Lisosomas, en rojo (LysoTracker).

Formación de Lisosomas:

Maduración

Más que “formar” un lisosoma, las células “maduran” los endosomas tardíos. pH: 5

H+ATP ADP + Pi

pH: 5Aminoácidos

azúcares

nucleótidos

Autofagia• “Auto-canibalismo celular”

– Proceso mediante el que membranas internas de la célula realizan una captura de elementos citoplasmáticos (organelos, acúmulos de proteínas, membranas, etc..) dentro de una vesícula de doble membrana, denominada autofagosoma, la cual es destinada a lisosomas, donde el contenido es degradado.

• Mecanismo de las células para:– Reciclaje de organelos dañados o superfluos– Requerimientos energéticos (“hambruna”)– Evitar la acumulación de agregados proteicos

• Presente en células de plantas, hongos y animales.• Altamente regulado por una cascada de señales fosforilativas

Control Tamoxifen

Células de cáncer de mama, tratadas con Tamoxifen (b) presentan fagosomas (flechas)

• Inducción:• Formación de autofagosoma• Unión a lisosoma• Degradación del contenido y

eliminación del autofagosoma.• Enfermedades asociadas a

autofagia.• Autofagia en: cancer vs apoptosis

Autofagia: etapas

Lumenautofagosoma

No hay consenso

• Inducción: Autofagia: etapas

S6SubU

ribosomal

PP76S6K (quinasa)

mTor

(-)Autofagia:

• No dilucidado 100%

• mTor actúa como un sensor de los niveles de ATP (¿qué procesos fallan en caso de falta de ATP?), nutrientes y estado Redox celular.

• Si existe suficiente ATP, se inhibe la autofagia.

mTor: mammalian target of rapamycin

ATP

nutrientes

[H+]

• Inducción: Autofagia: etapas

S6ribosomal

P

(+)

P76S6K (quinasa)

mTOR

Autofagia

•Disminución en [nutrientes]>> mTOR (FRAP) controla la síntesis de ribosomas y los niveles de crecimiento.

Rampamicina

(-)(-)

ATP

P

Klionsky et al.(2000) Science 290: 1717

Rampamicina: agente anticancerígeno utilizado contra tumores sólidos.Aumento de masa tumoral depende del reclutamiento de mitógenos y nutrientes.

mTor: mammalian target of rapamycin

Autofagia: Resumen

Levine (2007) Nature 446: 745

Fig. 5 In vivo analysis of autophagy using GFP-LC3 transgenic mice(Upper) Gastrocnemius muscle samples were prepared from GFP-LC3 transgenic mice before (left) or after 24-h starvation (right). Small dots represent autophagosomes.(Lower) Embryonic fibroblasts from GFP-LC3 mice were cultured in Hanks' solution for 2 hours. Bar, 10 um.

No existe claridad de la función homeoestatica de la Autofagia.

El desarrollo de animales transgénicos (GFP-LC3, donde LC3 es un marcador de la membrana autofágica) ha permitido detectar los eventos autofágicos a los que se someten diversos tejidos durante el desarrollo (particlarmente postembrionario)

Laboratorio de Noboru Mizushimahttp://www.tmd.ac.jp/med/phy2/english/index.html

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La AUTOFAGIA es una respuesta a la falta de nutrientes, sin embargo, también permite a las células destruir proteínas anormales que se acumulan (por ejemplo en el SNC). Al bloquear la autofagia se acumulan proteínas mal formadas y se lleva a neurodegeneración. Laboratorio de Noboru Mizushima

http://www.tmd.ac.jp/med/phy2/english/index.htmlNature 441, 885-889 (2006).

Figure 6-95a,b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

¿destruir proteínas anormales?PROTEINOPATÍAS:Enfermedad de Alzheimer (y múltiples amiloidosis), Priones, Enfermedad de Huntington, Enfermedad de Parkinson, Cataratas, Fibrosis Quística, Anemia Falsiforme, etc...

Enfermedad de Alzheimer: Daño Cortical

La enfermedad de Alhzeimer se caracteriza por la pérdida de tamaño de las cortezas cerebrales y el aumento del volumen de los ventrículos.

Esta atrofia cerebral es en parte producida por la muerte neuronal y la pérdida de conexiones entre las neuronas.

Esta enfermedad se considerada una proteínopatía, una enfermedad producida por proteínas anormales, las cuales forman acúmulos tóxicos para las neuronas:

• Las Placas Amiloides (péptido ABeta)

• Ovillos Neurofibrilares (Prot. Tau)

http://www.exploralasalud.com/tag/alzheimer/

Basic Neurochemistry, Agranoff et al. 1998

Lesiones histopatológicas de la EA. Tinción de plata de Bielschowsky de una sección de la amígdala de un hombre de 69 años con historia de EA (6 años). Placa senil o Placa Amieloide en el centro (A), rodeada de ovillos neurofibrilares oscuros (cuerpos oscuros, compara con flechas) y un halo de neurtas distróficas (cabeza de flecha)

Imágenes: National Institute on Aging. NIH. USA

Placa Amieloide

Neuronas en degeneración

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1.La proteína APP (ABeta precursor protein) se encuentra en la superficie de las células del Cerebro.


2.La APP es cortada por α-secretasa, cortando el Abeta en mitad y generando un fragmento soluble que promueve la sobrevivencia neuronal

4.La γ-secretasa libera el Abeta de la membrana, dejándolo disponible para formar acúmulos

3. El corte por una β-secretasa deja el fragmento ABeta completo.

sAPPβ

γ-secretasa

β-secretasa

sAPPβAβ

γ-secretasa

β-secretasa β-secretasa

APP

γ-secretasa α-secretasa

sAPPα

γ-secretasa α-secretasa



Neurona Muriendo

Ovillos Neurofibrilares

Figure 6-85 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Durante la síntesis de proteínas se exponen dominio hidrofóbicos y señales de degradación. Existe una competencia entre las proteínas que ayudan a encontrar el punto correcto y las que intentan degradar las proteínas.

Origen de proteínas anormales

26Figure 6-88 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

• La función de cada proteína dependen de que adquieran su estrucutra tridimensional adecuada.

– La hidrofobia de los aa apolares determina la formación de los dominios internos de las proteínas. Sin embargo, pueden asociarse de manera equivocada en la medida que la proteína es sintetizada.

– Las proteínas Heat shock son de las más abundantes en las células. Su expresión es inducida en respuesta a estrés celular (por ejemplo, por aumento de temperatura). Corresponden a 1–2% de la proteína total en células en condiciones normales

Chaperonas

Durante la traducción de proteínas citosólicas, las chaperonas se unen al amino (N) terminal del polipéptido creciente, estabilizándolo en una configuración no plegada hasta que la síntesis se ha completado. Completada la síntesis, la proteína se libera del ribosoma y adquiere su correcta conformación tridimensional.

ADP+Pi

ADP+Pi

Hsp70 o Hsp90

El complejo de Hsp60 genera un espacio con dominios de unión hidrofóbicos que ayudan a las proteínas mal formadas a ser re-estrucutradas. Actúa post-traduccionalmente

• Hsp100: Desestructurasas. Obligan a las proteínas mal formadas a pasar por un poro de 20 A. Pueden estar asociadas a serina proteasas y degradar automáticamente

Chaperonas•Hsp60/TCP-1 o GroESbacterias: Chaperonina (14 SubU. 1000 KDa)

Vía de Ubiquitinación y destinamiento a Proteosomas

Ubiquitina: Ubicua

Los sistemas proteolíticos intracelulares reconocen y destruyen proteínas dañadas, mal ensambladas y proteínas regulatorias y/o de vida corta (por ejemplo, las ciclinas, receptores, sistemas de presentación de antígenos).

Síntesis proteica

Proteínas anormales

Proteínas vida corta

Sistema de Ubiquitinación

Cascada de ubiquitinación Se genera una cascada de ubiquitinaciones múltiples:

unión covalente de ubiquitina (76aa) a cadenas de lisina de proteínas blanco.

1. Activación: E1 + Ubiquitina + ATP

E1ADP+Pi

E3




2. Transferencia: E1 transfiere Ubiquitina activada a complejo E2-E3 (ubiquitina ligasa)E1

ADP+Pi

E3




3. Reconocimiento de señal de degradación en una proteínas y traspaso de ubiquitina:

Fosforilación (de E3 o sustrato)

Desenmascaramiento (sustrato) Des-estabilización N-terminal (sustrato) Ligando (de E3)


ADP+Pi

E3




3. Reconocimiento de señal de degradación en una proteínas y traspaso de ubiquitina:

Fosforilación (de E3 o sustrato)

Desenmascaramiento (sustrato) Des-estabilización N-terminal (sustrato) Ligando (de E3)


ADP+Pi

E3

4. Repetición del ciclo y elongación de lacadena

De ubiquitinación a proteosoma

Vía de immunoproteosoma

Figure 6-89 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

20s

19s

19s

26s

36

Before they are targeted for proteasomal degradation, most proteins are covalently modified with ubiquitin (Ub). Typically, three enzyme types are involved in this process — ubiquitin-activating (E1), ubiquitin-conjugating (E2) and ubiquitin ligase (E3) enzymes. Proteins tagged with chains of four or more ubiquitins are shuttled to the the proteasome by various proteins such as CDC48/p97. In the proteasome, proteins are reduced to peptides, which are then released into the cytosol and further broken down by peptidases. See the text for more details.

The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegenerationDavid C. RubinszteinNature 443, 780-786(19 October 2006)

37

When proteins are accessible to both the ubiquitin (Ub)–proteasome and autophagy pathways, the greater efficiency of the ubiquitin–proteasome system makes it the favoured and dominant clearance route. When a cytosolic protein is aggregate prone and a poor proteasome substrate, then autophagy becomes the main clearance route by default — under these circumstances, the autophagy route becomes more effective than the proteasome.


38

Under normal conditions of substrate synthesis and basal autophagy, the direction of the equilibrium of an aggregate-prone protein is towards aggregate formation (grey arrows). If substrate synthesis is stopped (for example, in a conditional transgenic mouse) or clearance of the soluble/oligomeric forms is enhanced (for instance, by autophagy) then this equilibrium can be reversed and aggregates are indirectly cleared (red arrows).


Tareaopcional (para aprovechar el tiempo y practicar

inglés)

• Podcast:

– This week in Science (www.twis.org)– The Nature PodCast (http://www.nature.com/

podcast/index.html)– The Science Podcast (http://www.sciencemag.org/

multimedia/ )– Cell Podcast (http://www.cellpress.com/misc/page?

page=podcast

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