RONE CHARLES MARANHO

DIVERSIDADE GENÉTICA ENTRE E DENTRO DE VARIEDADES DE CANA-DE-AÇÚCAR (Saccharum spp.) UTILIZANDO MARCADORES

MICROSSATÉLITES

MARINGÁ PARANÁ – BRASIL

JUNHO – 2012

RONE CHARLES MARANHO

DIVERSIDADE GENÉTICA ENTRE E DENTRO DE VARIEDADES DE CANA-DE-AÇÚCAR (Saccharum spp.) UTILIZANDO MARCADORES

MICROSSATÉLITES

Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Maringá, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, para obtenção do título de Mestre.

MARINGÁ PARANÁ – BRASIL

JUNHO – 2012

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil) Maranho, Rone Charles M311d Diversidade genética entre e dentro de variedades

de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) utilizando marcadores microssatélites / Rone Charles Maranho. -- Maringá, 2012.

47 f. : il. col., figs., tabs. Orientador: Profª. Drª. Maria de Fátima Pires

Machado da Silva. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de

Maringá, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Agronomia, 2012.

1. Saccharum spp. 2. Marcador SSR. 3. Diversidade

genética. I. Silva, Maria de Fátima Pires Machado da, orient. II. Universidade Estadual de Maringá. Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Agronomia. III. Título.

CDD 21.ed. 633.6753

AHS-00926

RONE CHARLES MARANHO

DIVERSIDADE GENÉTICA ENTRE E DENTRO DE VARIEDADES DE CANA-DE-AÇÚCAR (Saccharum spp.) UTILIZANDO MARCADORES

MICROSSATÉLITES

Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Maringá, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, para obtenção do título de Mestre.

APROVADA EM JUNHO 2012

ii

A meus pais José Maranho e Inervina Barizon Maranho, meu irmão

Gustavo Barizon Maranho, minha amiga, companheira e namorada Lígia

Adriana Cavalcante Jovino, pela força, amor e carinho.

DEDICO

iii

AGRADECIMENTO

A todas as pessoas que fizeram parte desse trabalho e contribuíram para

que o mesmo fosse concluído:

À professora Dra. Maria de Fátima Pires da Silva Machado pela

oportunidade, orientação, confiança e amizade.

À professora, amiga, Dra. Claudete Aparecida Mangolin, pelo seu

exemplo profissional, pelo aprendizado, crescimento e carinho dedicado.

Ao professor e amigo Dr. Clândio Medeiros da Silva pelo apoio,

aprendizado e exemplo de vida e profissional.

À Usina Alto Alegre S/A pelo fornecimento das variedades de cana-de-

açúcar utilizada neste trabalho.

Aos demais professores do laboratório 17 e 21 pelo aprendizado e

convívio, juntamente com os colegas Raphael Augusto, Liriana Cantagalli,

Carlos Alexandre Marochio, Paulo Henrique Marquiori e os demais

companheiros de bancada que me forneceram os primeiros ensinamentos sobre

as técnicas de trabalho em laboratório e manuseio de equipamentos, auxiliando

no desenvolvimento das pesquisas.

Aos técnicos de laboratório, Sérgio e Leila, pelo auxílio durante o

desenvolvimento deste trabalho assim como os secretários Reinaldo e Érika do

Programa de pós-graduação em Agronomia.

Aos meus pais Inervina e José, meu irmão Gustavo e minha namorada

Lígia Adriana pelo carinho e apoio.

iv

BIOGRAFIA

Rone Charles Maranho, filho de José Maranho e Inervina Barizon

Maranho, nasceu em Jussara, Estado do Paraná, em 06 de maio de 1985.

Realizou o ensino fundamental e médio no Colégio Estadual Igléa

Grollmann na cidade de Cianorte – PR.

Em 30 de janeiro de 2010 diplomou-se licenciado em Ciências

Biológicas pela Universidade Estadual de Maringá (UEM) na cidade de Maringá-

PR.

Em março de 2010 iniciou o curso de mestrado em agronomia pelo

programa de pós-graduação em agronomia na área de produção de plantas na

Universidade Estadual de Maringá.

v

ÍNDICE

RESUMO vi

ABSTRACT viii

1. INTRODUÇÃO 1

2. REVISÃO DE LITERATURA 4

2.1 Classificação Botânica da cana-de-açúcar 4

2.2 Divergência genética em cana-de-açúcar 6

2.3 Uso de marcadores moleculares em Saccharum spp. 7

2.4 Marcadores microssatélites (Simple Sequence Repeats) 9

2.5 Marcadores SSR em Saccharum spp. 12

3 MATERIAIS E MÉTODOS 15

3.1 Variedades de cana-de-açúcar utilizadas 15

3.2 Extração do DNA das folhas de cana-de-açúcar 17

3.3 Seleção dos primers de microssatélites 19

3.5 Análise dos Resultados 21

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 23

5 CONCLUSÃO 38

6 REFERENCIAS 39

vi

RESUMO

MARANHO, Rone Charles, M.Sc. Universidade Estadual de Maringá, junho de 2012. Diversidade Genética Entre e Dentro de Variedades de Cana-de-açúcar (Saccharum spp.) Utilizando Marcadores Microssatélites. Professora Orientadora: Dra. Maria de Fátima Pires Machado da Silva. Professora conselheira: Dra. Claudete Aparecida Mangolin.

O objetivo do presente trabalho foi a caracterização molecular de nove variedades de

cana-de-açúcar cultivadas na região norte do Paraná, e utilizadas por uma das unidades

produtoras de etanol e açúcar, analisando locos microssatélites. A análise do

polimorfismo em locos microssatélites dessas variedades deve informar sobre a

variabilidade presente dentro de cada cultivar e a divergência e similaridade genética

entre as mesmas. Foram testados 40 primers dos quais 17 foram utilizados para análise

das 9 variedades de cana-de-açúcar, por apresentarem melhor definição. Dos 17 primers

utilizados apenas os primers UGSM148 e UGSM59 foram monomórficos sendo úteis

para o estudo de uniformidade genética das variedades. Com os primers UGSM35,

SEGMS240, SEGMS1069, SMC226CG, ESTB130, SMC1237FL, SMC165A,

UGSM117, ESTB41, ESTB145, SMC1047HA, SMC2017FL, ESTC66, mSSCIR56, e

ESTB50, foi encontrado um total de 70 alelos variando de 2 a 6 alelos, sendo uma

média de 4,12 alelos por locos. A análise do polimorfismo nos 15 locos SSR de

Saccharum spp mostrou que os locos Smc226CG, Smc1237FL, Smc1047HA, mSscir56,

e EstB60 apresentaram os valores maiores para as estimativas de heterozigosidade

observada, e no loco Smc1047HA foi encontrado o maior número de alelos. As

variedades RB72454, RB92579 e RB867515 apresentaram os valores mais altos de

heterozigosidade média observado. A diversidade genética calculada mostrou maior

identidade genética entre as variedades RB92579 e RB72454 com 86,31% de

similaridade e a menor similaridade encontrada foi entre as variedades RB845210 e

RB835054. Os locos SSR em variedades de cana-de-açúcar são marcadores promissores

para avaliar a real diversidade genética em nível molecular de variedades que

apresentam características morfoagronômicas uniformes, contrariando o postulado de

que existe uniformidade genética em variedades comerciais de cana-de-açúcar.

Palavras-chave: Saccharum spp. Marcador SSR. Diversidade genética.

vii

ABSTRACT

MARANHO, Rone Charles, M.Sc. State University of Maringá, June 2012. Genetic Diversity In and Among Varieties of Sugarcane (Saccharum spp.) Using Microsatellite Markers. Advisor Professor: Dra. Maria de Fátima Pires Machado da Silva. Assistant Professor: Dra. Claudete Aparecida Mangolin.

The purpose of this study was the molecular characterization of nine varieties of

sugarcane grown in the northern region of Paraná, and used by one of the units

producing sugar and ethanol, analyzing microsatellite loci. The analysis of

polymorphism in microsatellite loci of these varieties should provide information on the

variability present within each cultivar and genetic similarity and divergence between

them. Forty primers were tested of which 17 were used for analysis of nine varieties of

sugarcane, because they presented better definition. Among the 17 primers used only

primers were monomorphic UGSM59 UGSM148 and being useful for the study of

genetic uniformity of varieties. With the primers UGSM35, SEGMS240, SEGMS1069,

SMC226CG, ESTB130, SMC1237FL, SMC165A, UGSM117, ESTB41, ESTB145,

SMC1047HA, SMC2017FL, ESTC66, mSSCIR56 and ESTB50, were found a total of

70 alleles ranging from 2 to 6 alleles, a average of 4.12 alleles per locus. The analysis of

polymorphism at 15 SSR loci of Saccharum spp showed that the loci Smc226CG,

Smc1237FL, Smc1047HA, mSscir56 and EstB60 showed higher values for the

estimates of observed heterozygosity, and in situ Smc1047HA found the largest number

of alleles. The varieties RB72454, RB92579 and RB867515 showed the highest values

of heterozygosity was observed. The calculated genetic diversity showed greater genetic

identity among the varieties RB92579 and RB72454 with 86.31% similarity and the

lowest similarity was found between the varieties and RB845210 RB835054. The SSR

loci in varieties of sugarcane are promising markers for assessing the actual genetic

diversity at the molecular level of varieties that have uniform agronomic characteristics,

contradicting the assumption that there is genetic uniformity in commercial varieties of

sugarcane.

Keywords: Saccharum spp. SSR Marker. Genetic Diversity.

1

1. INTRODUÇÃO

A cana-de-açúcar (Saccharum spp.), com provável origem em Nova

Guiné, vem a cada ano gerando riquezas e movimentando a economia nacional e

regional através de seus produtos como o etanol e o açúcar. O setor

sucroenergético é responsável por grande movimentação econômica e social

onde a empregabilidade e as riquezas financeiras são reflexos da produtividade e

demanda pelos derivados da cana-de-açúcar. A safra de 2009/2010 movimentou

56 bilhões de reais na produção de cana, etanol, açúcar e bioeletricidade,

representando cerca de 2% do PIB nacional e gerando 4,5 milhões de empregos

diretos e indiretos. (Cana Web/dados e estatísticas, 2012;

www.jornalcana.com.br).

Para a obtenção de etanol e açúcar foram moídas 624 milhões de

toneladas de cana-de-açúcar na safra de 2010/2011, produzindo 33 milhões de

toneladas de açúcar e 27,6 bilhões de litros de etanol. O setor é composto

atualmente por 437 unidades produtoras sendo 168 produtoras de álcool, 16 de

açúcar e 253 de álcool e açúcar (Ministério do Desenvolvimento, Indústria e

Comércio Exterior, 2012). O total de área plantada equivalente a 7,8 milhões de

hectares, correspondendo a 3,5 % da área agricultável do Brasil (Cana Web/

dados e estatísticas, 2012; www.jornalcana.com.br).

O aumento da demanda de cana-de-açúcar implica num investimento no

valor de R$ 97 bilhões até 2020, para suprir o aumento do consumo interno de

170% (EPE- Empresa de Pesquisa Energética, 2011) junto com o aumento de

exportação do álcool combustível para países como Estados Unidos da América,

Japão, Jamaica e outras nações que compram o etanol do Brasil. No Brasil, a

utilização do bagaço da cana-de-açúcar tem sido proposta como matéria prima

adicional para a produção de etanol, no programa de Bioetanol Brasileiro (Zanin

et al., 2000), e para a obtenção de filme de celulose (Ruzene et al., 2009). As

cinzas de bagaço de cana-de-açúcar também têm sido apontadas como um

material interessante para ser usado na indústria de cimento (Sousa, 2009). O

2

potencial biotecnológico do bagaço da cana-de-açúcar para ser utilizado em

processos de bioconversão usando microorganismos foi destacado como uma

fonte promissora em relação a outras fontes de bagaço, nas investigações de

Pandey et al. (2000).

A crescente utilização dos derivados da cana-de-açúcar e a consequente

necessidade do aumento de produção criam elevada expectativa sobre os

programas de melhoramento genético. Os estudos realizados por esses programas

são de vital relevância para o aumento da produtividade do setor sucroenergético

permitindo suprir a demanda de álcool e açúcar do mercado interno e externo.

Segundo Barbosa et al. (2000) o melhoramento genético da cana-de-açúcar foi

fundamental para o desenvolvimento do setor canavieiro nacional.

Outra característica importante a ser considerada na produção de cana-

de-açúcar, é o estreitamento genético devido à origem comum das variedades

comerciais atualmente plantadas, podendo causar assim um fenômeno genético

conhecido como vulnerabilidade genética (Barbosa, 2001) em que tornam

vulneráveis a diversos fatores como doenças e pragas, os canaviais atualmente

estabelecidos no Brasil. Para obter melhores e mais rápidos resultados em

programas de melhoramento genético vegetal, ferramentas biotecnológicas vem

sendo amplamente utilizadas na caracterização molecular de grandes culturas,

gerando informações que podem ajudar no trabalho de melhoramento genético,

auxiliando na escolha dos progenitores geneticamente mais divergentes para o

desenvolvimento de clones e posterior variedade de uso comercial.

A seleção dos progenitores é uma etapa fundamental nos programas de

melhoramento genético, onde a análise de divergência genética fornece

parâmetros para a identificação de progenitores que após o cruzamento,

possibilitam maior efeito heterótico na progênie e maior possibilidade de

recuperação de genótipos superiores nas gerações segregantes (Cruz et al., 2004).

Desta forma, conhecer a variabilidade genética das variedades cultivadas é

importante para orientar o melhoramento.

Dentre os marcadores moleculares utilizados para estimar a diversidade

genética em cana-de-açúcar estão as sequências simples repetidas de DNA,

3

denominadas de locos SSR ou locos microssatélites, descritas em plantas na

década de 1990 por Lagercrantz et al.(1993) e Wang et al. (1994). O número e a

frequência de alelos diferentes nos locos microssatélites podem ser usados para

expressar a diversidade genética em variedades de plantas e a divergência

genética entre variedades. A análise de locos microssatélites também é útil para

monitorar a estabilidade genética de genótipos selecionados (clones) para

características de interesse morfoagronômico.

A análise do polimorfismo em locos microssatélites destas variedades

deve informar sobre a variabilidade presente dentro de cada cultivar e a

divergência e similaridade genética entre as mesmas. O padrão de diversidade

genética em locos microssatélites de cada variedade pode ser acrescentado à

relação de características morfoagronômicas de cada uma delas, para traçar

estratégias de utilização de cada genótipo em programas de melhoramento, no

cultivo destas em áreas geográficas distintas, no controle de doenças, e como

matéria prima para as indústrias de produção de seus derivados.

Por isso, o objetivo no presente trabalho foi a caracterização molecular

de nove variedades de cana-de-açúcar cultivadas na região norte do Paraná, e

utilizadas por uma das unidades produtoras de etanol e açúcar, analisando locos

microssatélites.

4

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Classificação Botânica da cana-de-açúcar

Em 1758, Linneu descreveu a cana-de-açúcar como Saccharum

officinarum e Saccharum spicatum. O gênero Saccharum a que pertence à cana-

de-açúcar (Saccharum spp.) é apresentado por Matsuoka et al. (1999) como

integrado a família Poaceae, tribo Andropogeneae, sendo uma espécie alógama

de ciclo perene naturalmente e semiperenes quando cultivada. A classificação

taxonômica mais completa e aceita atualmente inclui a cana-de-açúcar na família

Poaceae, subfamília Panicoideae, tribo Andropogoneae, subtribo Saccharinae,

grupo Saccharastrae e gênero Saccharum (Daniels e Roach,1987).

A origem da cana-de-açúcar ainda é discutida nos meios científicos

sendo que sua provável origem é em Nova Guiné, porém a grande variedade de

hibridização encontrada atualmente dificulta a precisão de sua origem. O grupo

“Saccharum” é denominado por alguns estudiosos da cana-de-açúcar como um

complexo composto pelos gêneros Saccharum, Erianthus, Sclerostachya,

Narenga e Miscanthus. O intercruzamento entre os integrantes deste complexo

foi responsável pela domesticação da cana-de-açúcar no continente Asiático no

início de sua domesticação (Matsuoka et al., 2005).

As variedades atuais de cana-de-açúcar surgiram após vários

cruzamentos interespecíficos, e retrocruzamentos com cana nobre (Saccharum

officinarum) obtendo-se números variáveis de cromossomos (Figura 1) que

também ocorre devido à aneuploidia, comum em plantas poliplóides (Barreto e

Simon, 1982). Atualmente encontramos variedades comerciais de cana com

número cromossômico que varia de 100 a 130, sendo que 80% dos cromossomos

derivados de S. officinarum, 10% de S. spontaneum e 10% dos cromossomos

recombinantes entre os dois genomas (D´Hont et al., 1996; Ferreira, 2010).

5

Figura 1 – A,B,C: Esquemas mostrando o processo de obtenção de variedades atuais de cana-de-açúcar através do processo de Nobilização. (Ming et al., 2006; Ferrari, 2010).

6

2.2 Divergência genética em cana-de-açúcar

A diversidade genética disponível atualmente nos clones e variedades de

cana-de-açúcar provém, segundo Ferreira (2010), de cruzamentos realizados no

início do século XX pelos programas de melhoramento genético de cana-de-

açúcar da Índia (Coimbatore) e de Java, onde foram desenvolvidos híbridos

interespecíficos entre S. officinarum e S. spontaneum. Após o processo de

nobilização (cruzamento de S. officinarum com outras espécies de cana-de-

açúcar, seguido de retrocruzamento com S. officinarum ) foram obtidos genótipos

com números variados de cromossomos e características agronômicas também

variadas.

No Brasil as primeiras variedades foram desenvolvidas pelo Instituto

Agronômico de Campinas (IAC) e foram nomeadas de IAC36-25 e IAC47-31

(Figueiredo, 2008; Ferreira, 2010). Vários outros programas de melhoramento

foram criados no Brasil, sendo os mais importantes representados por:

PLANALSUCAR [atualmente denominado RIDESA e detentora das variedades

RB (República do Brasil)]; COPERSUCAR [detentora das variedades SP (São

Paulo) e que atualmente é chamado de Centro de Tecnologia Canavieira

(desenvolvendo variedades com prefixo CTC]; e o mais recente programa de

melhoramento genético de cana-de-açúcar do Brasil é representado pela

CanaVialis S.A (Ferreira, 2010).

Atualmente no Brasil a cultura da cana-de-açúcar é caracterizada pelo

monocultivo de híbridos com uma base genética estreita apresentando

populações com alta similaridade genética como observado por Duarte-Filho et

al. (2010) em seu trabalho com variedades comerciais RB. A vulnerabilidade

genética (Barbosa, 2001; Almeida, 2005) da cultura de cana-de-açúcar no Brasil,

pode ocasionar a redução de produtividade devido ao aumento de ocorrência de

doenças e outras anomalias causadas pela uniformidade genética das plantações.

Durante muitos anos os programas de melhoramento genético de cana-de-açúcar

utilizaram marcadores morfológicos para a obtenção de progenitores com maior

variabilidade genética, visto que, o conhecimento da diversidade genética entre

7

variedades comerciais em programas de melhoramento genético é de vital

importância para os melhoristas na identificação e organização dos recursos

genéticos disponíveis, visando à utilização desses na produção de novas

variedades promissoras (Palomino et al., 2005; Silva et al., 2011). Os marcadores

morfológicos apresentam algumas limitações como instabilidade decorrente da

relação com o ambiente, e a dependência de um estado adulto da planta para

análise dos caracteres agronômicos. Outro fator prejudicial à utilização de

marcadores morfológicos no estudo da divergência genética é o estreitamento da

base genética em grandes culturas como a da cana-de-açúcar, conferindo às

cultivares, características agronômicas em comum, não podendo ser distinguidas

(Schuster et al., 2006; Silva, 2010).

2.3 Uso de marcadores moleculares em Saccharum spp.

Atualmente as pesquisas para o desenvolvimento de novas variedades

não se restringem ao melhoramento convencional, mas sim, do uso de técnicas

moleculares que facilitam e geram informações confiáveis sobre a estrutura

genética da cana-de-açúcar. O polimorfismo do DNA pode ser explorado através

das técnicas de análise molecular, onde, um grande número de marcadores

moleculares pode ser encontrado. Um marcador molecular pode ser definido

como locos cromossômicos, genes ou sequências de DNA que apresentam

segregação mendeliana (Borém et al., 2009) e que sejam úteis no estudo de

polimorfismos na comparação entre indivíduos.

As ferramentas biotecnológicas estão sendo expressamente utilizadas

para caracterização genética, criação de mapas de ligação e uma infinidade de

outras aplicações que favorecem o conhecimento sobre um determinado genótipo

e sua relação intra e interespecífica. Entre as técnicas mais utilizadas em cana-de-

açúcar encontramos trabalhos com o RFLP (Restriction Fragment Lenght

Polymorphic; Botstein et al., 1980) o RAPD (Random Amplified Polymorphic

DNA; Williams et al., 1990) além de outros marcadores como as SSR (Simple

Sequence Repeats; Hamada et al.,1982; Litt e Luty, 1989; Weber e May, 1989;

8

Jacob et al., 1991) também chamados de marcadores microssatélites, e o AFLP

(Amplified Fragment Lenght Polymorphism; Vos et al., 1995).

A utilização de marcadores moleculares para estudos genéticos em cana-

de-açúcar vem se expandindo com a adaptação dos protocolos e desenvolvimento

de novas técnicas mais economicamente viáveis e informativas. Silva (2006a)

utilizou marcadores RAPD em 8 genótipos de cana-de-açúcar proveniente de 2

programas de melhoramento genético, para investigar a indução de variabilidade

genética na micropropagação das variedades. No estudo o autor testou 61

primers, e usou 13 para a avaliação dos genótipos. A análise dos fragmentos

aleatórios demonstrou a diversidade gerada pelo cultivo in vitro e agrupou as

variedades cultivadas tradicionalmente e micropropagadas em grupos distintos.

Os resultados sugeriram a eficiência do uso de marcadores RAPD no estudo de

diversidade em cana-de-açúcar para as variedades estudadas.

Silva (2006b) também fez uso de marcadores tipo RAPD e caracteres

morfoagronômicos para analisar a divergência genética em cana-de-açúcar,

obtendo correlação significativa de média magnitude (r=0,47) entre a divergência

genética e os caracteres morfoagronômicos.

Selvi et al. (2005) utilizaram marcadores AFLP para caracterização

molecular de 28 variedades de cana-de-açúcar cultivadas na Índia utilizando

eficientemente apenas 11 primers para separar individualmente cada cultivar.

Segundo os autores, a técnica utilizada foi eficiente na caracterização de todas as

variedades e permitiu observar a maior diversidade genética entre as variedades

tropicais e subtropicais quando comparadas entre as variedades de cada uma das

regiões.

Estudos utilizando marcadores AFLP em cana-de-açúcar também foram

realizados por Lima et al. (2002), onde os objetivos foram avaliar o nível de

similaridade genética entre 79 cultivares (híbridos interespecíficos) e a correlação

entre similaridade genética e coeficiente de parentesco utilizando fragmentos de

segmentos polimórficos (AFLP) e dados de genealogia. Foram testados 64

primers e destes, 40 combinações foram selecionados por apresentarem alto

número de bandas polimórficas sendo que para a produção do perfil AFLP foram

9

selecionados apenas as 21 melhores combinações de primers. Os autores

relataram que através das análises dos clusters foi possível sugerir uma

importante relação genética entre as cultivares. Os dados analisados permitiram

observar a existência de correlação (r=0,42, P<0,001) entre similaridade genética

e o coeficiente de parentesco, sugerindo que os dados de AFLP podem ajudar na

quantificação do grau de relação com maior precisão entre cultivares de cana-de-

açúcar.

Palhares (2010) utilizou em seus estudos, marcadores AFLP e

marcadores baseados em retrotransposons para construção de mapa de ligação

em cana-de-açúcar. Foram analisados os marcadores de 188 indivíduos e foram

obtidos 600 marcadores de dose única a partir de 22 combinações de enzimas de

restrição e primers de AFLP. Segundo a autora do trabalho, a grande quantidade

de locos polimórficos possibilitou a geração dos mapas de ligação presente nos

resultados.

2.4 Marcadores microssatélites (Simple Sequence Repeats)

Os microssatélites, também denominados de SSR (Simple Sequence

Repeats) ou STR (Short Tandem Repeats), segundo Borém et al. (2009), são

sequências simples, repetidas e presentes densamente nos genomas eucariotos e

que consistem em um a seis nucleotídeos repetidos em tandem. A conservação

das sequências de DNA que flanqueiam os microssatélites, permitem a seleção

de primers específicos que amplificam, via PCR, fragmentos contendo o DNA

repetitivo em todos os genótipos (Borém e Caixeta, 2009).

A reprodutibilidade e simplicidade técnica, a pequena quantidade de

DNA requerida, o custo baixo em relação ao RFLP e AFLP, o grande poder de

resolução e os altos níveis de polimorfismo são as principais características que

justificam o desenvolvimento de marcadores microssatélites em plantas

cultivadas. Os microssatélites parecem ter distribuição frequente e aleatória,

permitindo uma cobertura completa do genoma (Rallo et al., 2000). Além disso,

para Ferreira e Grattapaglia (1998), os microssatélites constituem uma das

10

classes de marcadores moleculares mais polimórficos. Os microssatélites também

apresentam vantagens sobre os demais marcadores baseado em PCR, como o

RAPD, porque são codominantes e facilmente reproduzíveis (Borém e Caixeta,

2009).

Em cana-de-açúcar, marcadores microssatélites podem ser desenvolvidos

a partir de sequências genômicas ou de sequências depositadas nos banco de

dados de EST (Expressed Sequence Tag; Cordeiro et. al., 2003). Muitas das

caracterizações de microssatélites foram realizadas através de pesquisas em

banco de dados, de sequências publicadas, e da construção de bibliotecas

genômicas (Cordeiro et al., 2000).

O nível alto de diversidade alélica dos marcadores SSR, possibilita a

obtenção de polimorfismo em populações multiparentais e em populações

derivadas de híbridos de genótipos relacionados, além de distinguir acessos de

germosplasma intimamente relacionados (Borém e Caixeta, 2009). O alto nível

de polimorfismo dos marcadores microssatélites os torna efetivos no estudo da

diversidade genética das mais diversas espécies e organismos vegetais. Borba et

al. (2009) utilizou 12 marcadores microssatélites em 417 variedades locais de

arroz (Oriza sativa) coletados em diferentes anos de produção. Os pesquisadores

encontram um aumento na variabilidade genética e relacionaram essa variação a

provável introdução de variedades modernas conforme necessidades de mercado.

Salem et al. (2008) estudou a diversidade genética em variedades de

trigo (Triticum aestivum L.) utilizando marcadores SSR e marcadores

morfológicos, associando ambos os resultados para verificar a eficiências desses

parâmetros. Os autores obtiveram de 2 a 7 alelos por locos e 1 valor de PIC

(conteúdo de informação de polimorfismo) igual a 0,278 para o primer Xgwm95

a 0.816 para o primer Xgwm437, obtendo uma média de 0,548. Para os

pesquisadores ambos os parâmetros analisados geraram informações coerentes

entre as técnicas e julgaram pertinente a utilização de marcadores microssatélites

para distinção dos genótipos e análise da diversidade genética.

11

Silva (2010) utilizou sequenciador automático para estudar locos

microssatélite em trigo, e fazer a caracterização molecular de variedades de trigo

nacional. O autor do trabalho obteve 21 marcadores polimórficos, revelando de 2

a 8 alelos por loco com média de 4,29 alelos por loco. O PIC encontrado teve a

média de 0,593. Para o pesquisador os locos SSR se mostraram bastante

eficientes na caracterização de trigo estando assim disponíveis dados para fins de

registro e proteção de cultivares segundo leis vigentes.

No estudo com soja (Glycine max (L.) Merrill ) Vieira et al. (2009)

analisaram a variabilidade genética de 53 cultivares utilizando 283 marcadores

SSR sendo que destes 53 foram selecionados por serem evidentemente mais

polimórficos. No trabalho os autores obtiveram 124 alelos, com média de 2,34

alelos por loco e PIC (Conteúdo de Informação de Polimorfismo) médio de 0,47.

Foi obtida também a distância genética média de 0,47. Os valores obtidos

indicaram o bom caráter informativo do marcador microssatélite para o estudo e

identificação das variedades comerciais, mesmo as elites, de soja presente no

mercado.

No estudo da diversidade em milho, frequentemente são utilizados

marcadores microssatélites assim como encontrado no trabalho de Meirelles

(2009). A pesquisadora analisou 18 locos SSR em 40 linhagens de milho

oriundas de 2 grupos compostos: Dentado e Flintisa. Foi encontrado

polimorfismo em todos os locos sendo observada diversidade entre os dois

grupos com um total de 117 alelos. Os valores de heterozigosidade encontrados

foram abaixo dos valores esperados para a população em equilíbrio de Hardy-

Weinberg, sendo que o valor médio da heterozigosidade esperada foi de 0,7 e o

valor médio da heterozigosidade observada foi de 0,06. O desvio no equilíbrio de

Hardy-Weinberg, segundo a autora, foi devido alto índice de endogamia o que é

corroborado pelos índices de fixação que variou de 0,83 a 1,00.

12

2.5 Marcadores SSR em Saccharum spp.

A geração de informações genéticas da cana-de-açúcar através de

marcadores microssatélites tem aumentado consideravelmente com o

aprimoramento das técnicas de análises. Os marcadores SSR há alguns anos já

são utilizados para criação de mapas genéticos (McIntyre et al., 2001) e

Fingerprint de clones de cana-de-açúcar (Pan et al., 2002) porém sua utilização

para estudos de diversidade genética tem aumentado consideravelmente com a

caracterização de novos marcadores microssatélites e desenvolvimento de novos

primers para Saccharum spp..

Cordeiro et al. (2000) desenvolveram uma biblioteca genômica com a

cultivar Q124 e desenhara um total de 124 primers SSR onde 71 foram derivados

de repetições dinucleotideos e 29 de repetições trinucleotideos, sendo que dos

124 primers 91% apresentaram-se polimórficos. Pan (2006) avaliou um conjunto

de 221 primers microssatélites desenvolvidos pelo ISMC (Consórcio

Internacional de Microssatélites de cana-de-açúcar). Os primers foram testados

em cinco clones elite americanos incluindo as variedades LCP85-384

(Louisiana), HoCP 96-540 (Louisiana), CP72-1210 (Florida) e CP85-1308

(Florida). No total foram identificados 467 alelos onde 350 eram polimórficos

com média de cinco alelos polimórficos por marcador com tamanho variando de

80 a 460 pb. Parida et al. (2009) desenvolveram duas bibliotecas genômicas com

as variedades indianas Co 7201 e Co 86011, e foram desenhados um total de 567

marcadores moleculares Classe I. O nível de polimorfismo detectado entre

espécies, gênero e variedades de cana-de-açúcar, para os marcadores

desenvolvidos foi de 88,6%. Parida et al. (2009) também analisaram a

transferência cruzada e obtiveram taxa de transferência igual a 93,2% entre o

complexo Saccharum e 25% para cereais.

Oliveira et al. (2009) utilizando o banco de dados de EST (Expressed

Sequence Tags) da SUCEST (Sugar Cane EST Project) para desenvolver 342

marcadores microssatélites (EST-SSRs) em 18 variedades de cana-de-açúcar

brasileiras, encontraram uma média de 7,55 alelos por locos, sendo que 65,5%

13

dos fragmentos encontrados eram polimórficos. Para as análises os referidos

autores desenvolveram uma matriz binária e utilizaram o coeficiente de Jaccard

para determinar a similaridade genética (GS), utilizando também a matriz de

similaridade para desenho do dendrograma seguindo o método UPGMA

(Unweighted Pair Group Method using Arithimetic Average).

Singh et al (2008) no trabalho analisaram o potencial polimórfico de

marcadores microssatélites em duas variedades comerciais indianas de cana-de-

açúcar (Co86011; CoH70) utilizando primers desenhados pela National Reserch

Centre on Plant Biotechnology, Indian Agricultural Institute. Foram testados um

total de 702 primers SSR sendo destes: 176 marcadores microssatélite Class I

derivados de unigenes de cana-de-açúcar (UGSM), 272 marcadores

microssatélites classe I de genoma enriquecido de cana-de-açúcar (SEGM), 50

marcadores microssatélites genômico classe I de cana-de-açúcar (SGM), 32

marcadores microssatélites classe I derivados de cDNA de cana-de-açúcar

(SCM) e 172 marcadores microssatélites classe 2 derivados de unigenes de cana-

de-açúcar (UGSM). Do total de primers utilizados 494 (74,6%) detectaram locos

monomorficos e 168 (26%) detectaram locos polimórficos. Os primers que

detectaram polimorfismo foram: oitenta e sete (51,7%) UGSM, quarenta e cinco

(26,7%) SEGM, dezessete (10,1%) SGM, dezenove (11,3%) SCM.

Com o objetivo de determinar a diversidade genética entre o complexo

Saccharum, Cordeiro et al. (2003) utilizaram seis marcadores microssatélites em

sessenta e seis acessos do gênero Saccharum e Erianthus. Os autores

encontraram um total de 187 alelos para os seis marcadores utilizados, sendo que

um mínimo de dois marcadores foi suficiente para distinguir todo material.

Foram encontradas as médias de 3,8 alelos para espécies de Sorghun, 14,3 alelos

para espécies Erianthus e 17,8 alelos para as espécies de Saccharum incluindo as

variedades de cana-de-açúcar. Para as espécies que originam as variedades

comerciais brasileiras os autores encontraram uma maior variabilidade genética

em Saccharum spontaneum (GS= 0.30) que em Saccharum officinarum (GS=

0.50), segundo os autores a maior variabilidade de S. spontaneum é

provavelmente devido a sua maior distribuição geográfica, maior variabilidade

14

cromossômica e maior variedade de fenótipos. Já a espécie de S. officinarum

apresentou menor variabilidade; segundo os autores, devido à pressão seletiva

para a alta quantidade de sacarose requerida no processo de domesticação da

cana-de-açúcar.

Duarte-Filho et al. (2010) analisaram a similaridade genética entre

cultivares comerciais (RB) de cana-de-açúcar brasileiras utilizando marcadores

SSR e coeficiente de parentesco (COP). Foram utilizadas 30 variedades de cana-

de-açúcar dos cultivares República do Brasil (RB) onde do total de 19

marcadores gerados, 10 apresentaram-se polimórficos. Foi encontrado um total

de 57 alelos com média de 3,2 alelos por locos. Utilizando o coeficiente de

similaridade de Jaccard foi encontrado GS variável de 0,95 entre os genótipos

RB93509 e RB931011, e 0,56 entre os genótipos RB928064 e RB813804, com

uma similaridade média de 0,78. Para o coeficiente de parentesco encontrado

entre 28 acessos de cana-de-açúcar foi encontrado um COP de 0 a 0,76 com

média de 0,14, demonstrando que os genótipos estudados apresentaram alto

COP.

15

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Variedades de cana-de-açúcar utilizadas

Foram utilizadas oito variedades comerciais de cana-de-açúcar dentre as

mais plantadas e com melhores características agronômico-econômicas,

amplamente cultivadas na região norte do Paraná, e um clone (RB036152) em

fase de teste para ser lançado como variedade. As variedades foram

desenvolvidas pelos programas de melhoramento RIDESA (Rede

Interuniversitária para o desenvolvimento do setor sucroenergético; variedades

RB) e COPERSUCAR. Foram analisadas oito plantas de cada variedade

SP813250, RB845210, RB935744, RB867515, RB036152, RB835054,

RB855453, RB92579, e 10 plantas da variedade RB72454. As amostras estavam

disponíveis nos canaviais localizados na Fazenda Junqueira no distrito de Alto

Alegre em Colorado no Paraná, e são usadas pela indústria para a fabricação de

álcool e açúcar.

Folhas jovens do cartucho foram coletadas diretamente dos canaviais,

armazenadas em sacos de sombrite e devidamente etiquetadas para serem então

acondicionadas numa caixa térmica contendo gelo e separadas em camadas com

folhas de jornal para evitar que as amostras fossem molhadas. A identificação foi

feita com a nomenclatura das respectivas variedades e numeradas conforme

coletadas. No laboratório as amostras foram devidamente congeladas em

nitrogênio líquido e guardadas em ultrafreezer (-80 °C). Na Tabela 1 estão

relacionadas as variedades com suas principais características agronômicas e

genealogia.

16

Tabela 1 - Principais características agronômicas e genealogia das variedades de cana-de-açúcar estudadas

VARIEDADES

PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS AGRONÔMICAS

GENEALOGIA

RB72454 - Alta produtividade

- Ampla adaptabilidade CP53-76 X ?

RB845210 - Alta produtividade

- Ótimo teor de sacarose

RB72454 X SP70-1143

RB935744 - Alta produtividade

- Excelente sanidade RB835089 X RB765418

RB867515 -Alta produtividade

- Alto teor de sacarose RB72454 X ?

RB036152 - Precocidade SP835073 X RB867515

RB835054 - Alta produtividade

- Ampla adaptabilidade RB72454 X NA56-79

RB 855453 - Alta produtividade

- Alto teor de sacarose TUC71-7 X ?

RB92579 - Resistente a pragas

- Alta produtividade RB75126 X RB72199

SP813250 - Alta produtividade

-Alto teor de sacarose CP70–1547 X SP71–127

Fonte: RIDESA; COPERSUCAR.

17

3.2 Extração do DNA das folhas de cana-de-açúcar

Para a extração do DNA das folhas de cana-de-açúcar, foi utilizado o

protocolo de extração descrito por Hoisington et al. (1994), amplamente utilizado

em pesquisas com cana-de-açúcar e outras culturas. O material vegetal

corretamente identificado foi macerado em nitrogênio líquido com auxílio de

almofariz e pistilo até a obtenção de um pó fino e com poucas fibras visíveis.

Foram colocados 300 mg de folha macerada em tubo eppendorf (2 mL) e 800 µL

de solução de extração CTAB (NaCl 5M; Tris-HCl 1M pH 7,5; EDTA 0,5 M pH

8,0; CTAB 1% (Cationic Hexadecyl trimethyl ammonium bromide) e 140 mM de

β-mercaptoetanol). Todos os tubos foram homogeneizados com agitação manual

até completo contado da superfície das partículas vegetais com a solução de

extração. Os tubos foram mantidos em banho-maria a 65°C por 1 hora e com

suave agitação manual a cada 5 minutos. Depois de incubados, os tubos foram

mantidos à temperatura ambiente por 5 minutos. Na sequência foram acrescidos

800 µL de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) e agitados lentamente por 5

minutos. Os tubos foram centrifugados em rotação de 15.000 RPM e à

temperatura ambiente por 15 minutos sendo posteriormente recuperada a fase

líquida e transferida para eppendorf limpo. Foram adicionados 800 µL de

clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) à fase recuperada, posteriormente, a mistura

foi centrifugada a 15.000 RPM por 10 minutos.

O sobrenadante foi transferido para tubo eppendorf limpo. Para a

precipitação do DNA foram adicionados 300 µL de isopropanol gelado com

agitação manual por inversão durante 1 minuto. Após a visualização do

precipitado os tubos foram armazenados em freezer (-20 ºC) por 12 horas para

melhor precipitação do DNA. Após esse período de precipitação os tubos foram

centrifugados com 10.000 RPM por 10 minutos. O sobrenadante de cada tubo foi

descartado e foram acrescentados 800 µL de álcool etílico 70% com posterior

agitação por inversão durante 1 minuto. Os tubos foram então centrifugados com

10.000 RPM em temperatura de 4°C por 10 minutos. O sobrenadante foi

18

novamente descartado e o pellet de DNA obtido foi seco por 1 hora na

temperatura ambiente.

Após a secagem do pellet foram adicionados 400 µL de TE (1 M

TRIS/HCl e 0,5 M EDTA). Decorrido 1 hora de suspensão do DNA em TE

foram adicionados 2µL de RNAse 20 ng/µL, deixando em temperatura ambiente

por 2 horas. Em seguida foram adicionados 200 µL de fenol equilibrado (pH 8,0)

e 200 µL de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1). Os tubos foram então agitados

por 5 minutos e centrifugados com 10.000 RPM em temperatura ambiente por 10

minutos. A fase aquosa foi transferida para eppendorf limpo e acrescido 400 µL

de cloroformio-álcool isoamilico (24:1). Em seguida os tubos foram agitados por

5 minutos e então centrifugados com 10.000 RPM por 10 minutos à temperatura

ambiente. O líquido da fase superior foi retirado e transferido para tubo

eppendorf limpo onde foram adicionados 250 µL de isopropanol gelado e 25 µL

de NaCl 5M com posterior agitação suave por 1 minuto. Após visualização do

precipitado os tubos foram condicionados em freezer (-20 °C) por 12 horas para

maior precipitação.

Decorrido esse período os tubos foram novamente centrifugados a

10.000 RPM por 10 minutos em temperatura de 4ºC. O sobrenadante foi

descartado e o precipitado foi lavado com 800 µL de etanol 70% gelado sendo

misturado por inversão durante 1 minuto. Foi realizada uma centrifugação com

10.000 RPM durante 10 minutos à temperatura de 4°C. O sobrenadante foi

descartado e o pellet de DNA foi seco por 1 hora sendo então ressuspendido em

50 µL de solução de TE (1 M TRIS/HCl e 0,5 M EDTA). Os tubos contendo a

suspensão de DNA foram armazenados em geladeira a 4°C. As amostras de DNA

obtidas foram quantificadas utilizando amostras de DNA padrão (Fago λ) em gel

de agarose 0,8% com tampão TAE 1x (TRIS, EDTA, Acetato de Sódio, pH 8,0)

(Hoisington et al.,1994). Com a quantificação em gel de agarose a 0,8% foi

possível observar a integridade do DNA extraído e com o auxílio do fago λ,

verificar a concentração de DNA disponível para a reação de amplificação via

PCR. Para o processo de quantificação foram utilizados fago λ de concentração

do DNA extraído.

19

3.3 Seleção dos primers de microssatélites

Os primers foram selecionados a partir de 40 primers descritos na

literatura para utilização em reações de microssatélite em Saccharum spp. e que

apresentavam maior polimorfismo e maior número de alelos segundo os autores

dos trabalhos consultados. Ao final dos testes foram selecionados 17 primers

para analisar o DNA das nove variedades de cana-de-açúcar (Tabela 2). Os

primers selecionados foram descritos nos trabalhos de Cordeiro et al. (2000),

Singh et al. (2008) e Oliveira et al. (2010), sendo a maioria desenvolvidos pela

International Sugarcane Microssatelite Consortiun (ISMC) e todos os primers

foram sintetizados pela Invitrogen, USA.

3.4 Reação de amplificação do DNA

O DNA amostrado das variedades de cana-de-açúcar foi amplificado

com utilização de um termociclador marca Techne TC-512. Para as reações de

PCR foi utilizado um volume final de 20 µL, sendo composto por 13,1 µL de

água ultrapura (Millipore Corporation), 1,5 µL de DNA genômico (10 ng ∙ µL-1),

0,4 µL de primer forward e reverse (Invitrogen, Life Technologies Corporation),

0,8 µL de dNTPs, 1,6 µL de MgCl2 (2 mM), 0,2 µL (1 U) de Platinum® Taq

DNA polimerase (Invitrogen), 2,0 µL de buffer 1x (Invitrogen). Além da

concentração de DNA supracitada, foram testadas as concentrações de 25 e 10 ng

para padronização das reações.

Duas configurações do termociclador foram utilizadas para o presente

trabalho, sendo uma PCR-TD (Touchdown) e outra com a Temperatura de

anelamento (T °A) específica para cada primer. A PCR-TD foi composta por

20

Tabela 2. Relação dos primers e temperaturas utilizadas para a amplificação do DNA das nove variedades de Saccharum spp. analisadas.

Primer

Repetição

SSR

Tamanho

(pares de Base)

°C

Sequência Forward do Primer Sequência Reverse do Primer

SMC1237FL (CA)6 100-140 58 TTCACGAACACCCCACCTA GCGCCAGGTAACCTACTGAA

SMC1047HA (GA)26 110-170 62 TGAGCCTAAGCCAGAAAGAAG GGAACTAATTTCCTACGAGAA CAC

SMC2017FL (CTT)13 210-260 62

CACAAGTGAAGATAATAG TGT CCCT GAT CCC AAA TCC CTT GAT CTC

SMC165A (SGA)11 90-130 58 GCAACCGCGTCCTCATAC GAGCTTCTGATCGGCCTTC

SMC226CG (CA)10 136 TD GAGGCTCAGAAGCTGGCAT ACCCTCTATTTCCGAGTTGGT

UGSM148 (GAA)5GGGCA..(GAG)5 42-647 TD GATGACTCCTTGTGGTGG CTTGACGACCCTGCTGCT

UGSM59 (GGC))7 71-500 55 GTGAACGACTCCATCGCC TTGAAACCACCGTAAATAAGA

UGSM38 (ACG)7 50-1185 55 CCGAGTGATGATGTGATGT GGGACAACTAATGTAACTGATT

UGSM117 (GCT)5GCCAT..(TG) 93-867 TD GAGGAGGTGACGGTGGAG GACGCTACGGTTCATTCA

SEGMS240 (GTT)12 100-900 53 CAACAAGAAAGAACACAATGAG AATGTGAATAACTAGGTGGTCC

SEGMS1069 (AGA)10 100-600 53 CGGGAATTCGATTTCATGGGTTC GACTACTCTAAGCATCGTCCTC

ESTB130 (CAA)13 124 50 GCCCAGGTAATTATCCAGACTC GCTGTTGCTCACTGGTTCC

ESTB41 (CGA)8 163 63 CATGGAGAGCTGGGCGACCTG GGCGGCGGCGAGGATGA

ESTB145 (CCT)5 234 68 GGGAAGCAAGCGAGAGCAGCAGAG GAGCGCGAGGCCGTTGTTGAG

ESTB60 (TTG)10 198 53 AGCCGCAATGAATCCAACTG CTCTAGCTCCGACGATGATACCTC

ESTC66 (CCGC)3 152 61 AGTACAGGCTGCTCTCAATCAA TCTGTCATCTGTGTTCGTTCTG

mSSCIR56 (GT)24 125-170 58 ATTTGACGCTACGATGGTG ATCCGTTTTTCAGCAGAGC

Fonte: Cordeiro et al. (2000), Singh et al. (2008) e Oliveira et al. (2010).

21

desnaturação inicial de 1 minuto a 94°C seguido de 10 ciclos, com 1 minuto a

94°C, 1 minuto com temperatura inicial de 65 °C ocorrendo a redução de 1 °C a

cada ciclo, 2 minutos a 72 °C e mais 20 ciclos de 1 minuto a 94 °C, 1 minuto a

55 °C e 2 minutos a 72 °C, sendo finalizado com extensão final de 5 minutos a

72 °C. A reação de PCR em que se utilizaram as temperaturas específicas de

anelamento do primer (Tabela 2) foi constituída de temperatura de 94 °C por 5

minutos para a desnaturação da dupla fita de DNA, uma sequência de 30 ciclos

foi realizada após a desnaturação do DNA onde cada ciclo era composto por uma

etapa inicial a 94 °C por 1 minuto; a segunda etapa com a respectiva temperatura

de anelamento de cada primer por 1 minuto, e a última etapa do ciclo a 72 °C por

1 minuto. Finalizando a reação, foi realizada uma extensão final por mais 15

minutos a 72 °C.

As amostras após a reação de PCR foram armazenadas em freezer com -

20 °C até sua utilização. O DNA amplificado obtido pós-reação foi preparado

para aplicação em gel de agarose e posterior análise dos produtos. A separação

dos segmentos amplificados foi feita em gel de agarose 4% (50% agarose

ultrapure e 50% agarose Metaphor™) utilizando tampão TBE 0,5X (89 mmol/L

TRIS, 89 mmol/L, Ácido Bórico e 2 mmol/L EDTA) com 60 Volts por 4 horas.

Foi utilizado ladder (Invitrogen) de 100pb como marcador de peso molecular.

Após a eletroforese o gel foi corado em banho de brometo de etídio a 0,5 µg/mL

e fotografado utilizando transiluminador com luz UV da Loccus Biotecnologia e

software L-Pix image 1.21.

3.5 Análise dos Resultados

As bandas geradas pelas reações de PCR foram analisadas como caráter

único e matrizes binárias foram geradas a partir do perfil de alelos apresentados

em cada gel, sendo atribuído o valor 1 para a presença de banda e 0 para a

ausência.

22

Marcadores SSR são considerados codominantes, porém a cana-de-

açúcar por possuir genoma altamente poliplóide, pode apresentar vários

cromossomos com mais de dois alelos diferentes, simultaneamente para um

único loco. Isto torna complexa a estimativa das frequências dos alelos, e

consequentemente, os cálculos dos valores de heterozigosidade média esperada, e

do déficit de heterozigotos na amostra de cada variedade. Somente os valores de

heterozigosidade média observada podem ser obtidos por contagem direta de

plantas heterozigotas para dois ou mais alelos.

Após a construção da matriz binária, foram utilizados os softwares

estatísticos Popgene 1.32 (Yeh et al., 1999) e NTSYSpc versão 2.1 (Rohlf,

2000). Para o cálculo da distância genética foi utilizado o índice de similaridade

de Jaccard, sendo a distância genética representada nos dendrogramas

empregando-se o método de agrupamento UPGMA (Unweighted Pair_Group

Method Using Arithmetic Avarage).

23

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

O protocolo de extração descrito por Hoisington et al. (1994), foi

eficiente para a extração do DNA de cana-de-açúcar, onde foi obtido

concentrações variáveis de 10 a 100 ng ∙ µL-1 (Figura 2). Silva (2006), utilizando

o mesmo protocolo para cana-de-açúcar obteve concentrações variáveis de DNA

entre 60 e 200 ng ∙ µL-1, sendo que essas diferenças de concentrações podem

estar relacionadas a fatores externos como a idade do material coletado e na

habilidade de desenvolvimento da técnica.

A temperatura de anelamento para cada primer está registrada na Tabela

2; foram realizadas várias reações para padronização dos primers cuja

temperatura efetiva não foi coincidente com a temperatura registrada na

literatura. Os primers que tiveram suas respectivas temperaturas alteradas para as

reações foram: SMC226CG (T °A = 50 °C); UGSM148 (T °A = 52 °C);

UGSM117 (T °A = 57 °C); SEGMS240 (T °A = 55 °C); SEGMS1069 (T °A =

55 °C); ESTB60 (T °A = 55 °C); mSSCIR56 (T °A = 56 °C). A metodologia de

PCR-Touchdown (PCR-TD) foi eficiente (Figura 3), evitando leituras

equivocadas de bandas inconsistentes. A PCR-TD possui o potencial de superar

problemas associados com altas temperaturas de anelamento requeridas por

algumas combinações de modelos de primers e, é particularmente útil para

modelos com dificuldades de amplificação, tais como aqueles com estruturas

extensíveis secundárias, com alto percentual de guanina e citosina no genoma e

com valor maior que 60% de G+C (Korbie e Mattick, 2008). A presença de

bandas não representativas pode interferir na leitura dos alelos, gerando

informações equivocadas e diminuindo o poder informativo do marcador SSR.

Portanto a padronização das temperaturas de anelamento foi fundamental para a

real caracterização dos genótipos de cana-de-açúcar estudados, assim como pode

ser observado na Figura 3A, onde bandas não alélicas de diversos pesos

moleculares apresentaram-se visíveis após a eletroforese durante 4 horas com 60

V. Após padronização da temperatura de anelamento é possível ver o mesmo

24

primer da Figura 3A, porém com os reais alelos característicos do genótipo em

questão.

Foi encontrado um total de 70 alelos para os dezessete pares de primers.

Dos dezessete primers utilizados para o estudo da diversidade genética entre e

dentro das variedades de cana-de-açúcar, apenas os primers UGSM148 e

UGSM59 foram monomórficos para as variedades estudadas. Portanto, o

polimorfismo nos locos SSR das nove variedades de cana-de-açúcar foi 88,2%.

Valores altos de polimorfismo nos locos SSR de cana-de-açúcar também foram

descritos por Cordeiro et al. (2000) que encontraram 91% e por Oliveira et al.

(2009) que encontraram 93% de polimorfismo trabalhando com EST-SSR em

Saccharum sp., evidenciando assim, o potencial desses marcadores para o estudo

da diversidade genética de cana-de-açúcar.

O número de alelos nos locos SSR polimórficos variou de dois alelos

(primers SGMS240, ESTB145) a oito alelos (primer mSSCIR56), sendo uma

média de 4,12 alelos por locos. Duarte-Filho et al. (2010) encontrou uma

quantidade média de 3,2 alelos por locos usando 18 marcadores microssatélite

em 30 variedades República do Brasil (RB).

A Figura 4 apresenta os produtos de amplificação do primer

SMC1237FL altamente polimórfico, sendo evidente o polimorfismo entre e

dentro das variedades. As variedades RB72454 e RB845210 foram as que

apresentaram maior número de locos polimórficos, apresentando 100% de

polimorfismo para os primers utilizados no presente estudo. As variedades

RB835054 e RB855453 apresentaram menor número de locos polimórficos

(33,3% para as duas variedades).

25

Figura 2 - Gel de agarose 0,8% utilizado na quantificação das amostras de DNA das variedades de cana-de-açúcar. As amostras 3 e 4 correspondem à variedade RB867515. As amostras 5 a 13 correspondem à variedade RB036152. O DNA padrão (fago λ) é representado nas amostras 1 e 2 sendo de concentração respectiva de 50 e 100 ng ∙ µL-1 .

A análise do polimorfismo nos 15 locos SSR de Saccharum spp. mostrou

que os locos Smc226CG, Smc1237FL, Smc1047HA, mSscir56, e EstB60

apresentaram os valores maiores (Ho = 1,000) para as estimativas de

heterozigosidade observada (Tabela 3), e no loco Smc1047HA foi encontrado o

maior número de alelos indicando que estes locos podem ser recomendados para

analisar divergências genéticas entre variedades de cana-de-açúcar. Nos locos

Segms1069, EstB130, Smc165A, EstB41, Ugsm38, e EstC66 as estimativas de

heterozigosidade observada também foram altas (Ho > 0,50) e os primers para

estes locos podem ser indicados para avaliar a diversidade genética entre

variedades de cana-de-açúcar.

26

Figura 3 - Gel de agarose 4% demonstrando os produtos de amplificação da PCR para primers e temperaturas específicas pré e pós-padronização. A- Primer SMC226CG com T°A de 50°C (pré padronização). B- Primer SMC226CG pelo método PCR-TD (pós padronização). C- Primer SEGMS2405 com T°A de 55°C (pré-padronização). D- Primer SEGMS2405 pelo método PCR-TD (pós-padronização). A amostra 1 é representado pela variedades RB867515, 2 e 3 pela variedade RB036152.

27

Figura 4 - Gel de agarose 4% demonstrando os produtos de amplificação da PCR para o primer SMC1237FL. Amostras 1 a 8 – variedade SP813250; 9 a 16 – variedade RB845210; 17 a 24 – RB935744; 25 a 32 – variedade RB867515; 33 a 40 – variedade RB036152; 41 a 48 – variedade RB835054; 49 a 56 – variedade RB855453; 57 a 64 – variedade RB92579; 65 a 72 – variedade RB72454. L representa o Ledder de 100 pb utilizado como marcador de peso molecular.

28

Tabela 3 - Parâmetros de diversidade genética avaliados para as nove variedades de cana-de-açúcar obtidos na análise dos dezessete locos SSR Locos N Na Ne Ĥo Ugsm38 74 3,0 2,7552 0,2838 Segms240 74 2,0 1,6172 0,4865 Segms1069 74 3,0 2,9104 0,7973 Smc226CG 74 6,0 2,9221 1,0000 EstB130 74 5,0 3,4473 0,9865 Smc1237FL 74 6,0 3,9283 1,0000 Smc165A 74 5,0 2,9883 0,5676 Ugsm117 74 3,0 2,5715 0,2838 EstB41 74 5,0 2,9640 0,6486 EstB145 74 2,0 1,7951 0,2838 Smc1047HA 74 7,0 4,7411 1,0000 Smc2017FL 74 4,0 3,1336 0,8919 EstC66 74 3,0 2,5679 0,6892 mSsir56 74 8,0 3,0212 1,0000 EstB60 74 6,0 2,5904 1,0000 Média 4,12 2,9302 0,7279

Na=número de alelos observados; Ne=número efetivo de alelos; Ho=heterozigosidade observada.

Os valores altos para heterozigosidade observada em 73,3% dos locos

SSR e nas nove variedades comercias de Saccharum ssp. contrariam as

descrições de baixa variabilidade genética e de uniformidade genética nas

variedades de cana-de-açúcar (Barbosa, 2000; Almeida, 2005). Somente nos

locos Ugsm148 e Ugsm59 foi verificada uniformidade genética (100% de plantas

homozigotas) indicando que estes locos são adequados para monitorar a

estabilidade de genótipos quando for necessário. Os primers UGSM148 e

UGSM59 podem ser usados, por exemplo, como marcadores moleculares para

monitorar a estabilidade de determinada variedade durante os ciclos de rebrota,

para indicar em qual ciclo se verifica a ocorrência de variação no referido loco.

Desta forma, a uniformidade genética descrita para as diversas

características morfológicas e agronômicas das variedades de cana-de-açúcar não

podem ser estendidas para os 88,8% dos locos SSR analisados nas variedades

RB72454, RB845210, RB935744, RB867515, RB036152, RB835054,

29

RB855453, RB92579, e SP813250. O significado funcional dos locos SSR em

cana-de-açúcar é desconhecido. Em outras espécies o significado funcional dos

locos SSR tem sido motivo de especulações por grupos de investigadores.

Enquanto os locos SSR têm sido considerados como marcadores moleculares

evolutivamente neutros (Schlötterer and Wiehe, 1999; Schlötterer, 2000), alguns

pesquisadores tem indicado que os microssatélites com motivos repetidos

diferentes podem estar envolvidos na determinação da estrutura de cromossomos

(Subirana and Messeguer, 2007), ou estarem contidos em genes que apresentam

expressão diferencial durante diferentes estágios de desenvolvimento (Ince et al.,

2010). Portanto, os valores altos para a heterozigosidade observada nos locos

SSR de cana-de-açúcar pode ser decorrente do caráter neutro e independente dos

alelos que conferem características selecionadas para o melhoramento de cana-

de-açúcar (seleção artificial), ou resultado dos cruzamentos interespecíficos e/ou

de heterose. Valores de heterozigosidade média observada altos (1,000 e 0,9865),

intermediários (0,6892 e 0,6486), e baixo (0,2838) foram observados nos locos

microssatélites de sequências expressas (Expressed Sequence Tag) EstB60,

EstB130, EstC66, EstB41, e EstB145, respectivamente (Tabela 3), de Saccharum

spp.

Apesar dos marcadores microssatélites apresentarem característica

codominante, a frequência dos alelos nos locos SSR de cana-de-açúcar não pode

ser estimada porque por ser um híbrido com genoma poliplóide, em alguns locos

foram evidentes de dois a oito alelos. Por isso os marcadores microssatélites

(sequências amplificadas) foram considerados como marcadores dominantes

nesse trabalho. Não foi possível calcular os valores de heterozigosidade média

esperada para cada variedade, mas foi possível analisar a heterozigosidade média

observada para dois ou mais alelos (Ĥo = 1-Pii, em que Pii é a frequência de

genótipos homozigotos) diretamente através da leitura dos géis com as

amplificações.

As variedades RB72454 (Ĥo=0,833), RB92579 (Ĥo=0,808) e RB867515

(Ĥo=0,792) apresentaram os valores mais altos de heterozigosidade média

observada (Tabela 4). Para um marcador genético, um loco com heterozigosidade

30

maior do que 70% é comumente considerado um marcador altamente polimórfico

(Ott, 1992).

Tabela 4. Heterozigosidade média observada (Ĥo), número total de alelos encontrados e porcentagem de locos em heterozigose (%P) para cada variedade de cana-de-açúcar.

Variedade Na/loco Ne Hom(o) Ĥo (%P)

SP813250 2,823 1,744 0,4250 0,5750 87,50 RB845210 2,823 1,897 0,3500 0,6500 87,50 RB935744 2,94 2,05 0,2580 0,7420 100 RB867515 2,47 2,01 0,2080 0,7920 93,75 RB036152 2,35 1,92 0,2670 0,7330 81,25 RB835054 2,59 1,76 0,3420 0,6580 75 RB855453 2,29 1,83 0,2670 0,7330 87,50 RB92579 2,59 2,03 0,1920 0,8080 93,75 RB72454 3,12 2,31 0,1670 0,8330 100 Total 4,12 2,93 0,2720 0,7280

Na: número de alelos; Ne: Número efetivo de alelos; Hom(o): Homozigosidade

média observada; Ĥo: heterozigosidade média observada

Das três variedades que apresentaram a maior heterozigosidade

observada, duas são as variedades mais cultivadas no Brasil (RB867515 e RB

72454). É possível que o alto polimorfismo encontrado nessas variedades seja o

fator que favorece o estabelecimento das culturas, tornando-as menos suscetíveis

a problemas como doenças e clima.

A variedade RB72454 segundo censo varietal de 2011 (RIDESA, 2011;

www.ridesa.com.br) foi a sexta variedade mais cultivada no Brasil, e a sua ampla

adaptabilidade justifica sua utilização em várias regiões do país. Essa variedade é

amplamente utilizada como genitor de outras variedades de cana-de-açúcar

(Tabela 1; Figura 4) para obtenção de cultivares que se desenvolvam nos

diversos tipos de solos presente nos canaviais brasileiros. A alta heterozigosidade

observada para a variedade RB72454 pode justificar a sua utilização como

31

genitora de outras variedades propiciando combinações genotípicas que

aumentam a capacidade de adaptação das variedades a possíveis mudanças

ambientais (Sebbenn et al., 2000). A variedade RB72454 foi usada como

genitora das variedades RB845210, RB867515, e RB835054. Com o aumento da

área de plantio na região norte e noroeste do Paraná em regiões de solo com

textura superficial franco-arenoso, elevada acidez, com baixa fertilidade natural

(Sambatti, 2003; Fidalski, 1997), os programas de melhoramento têm o desafio

de desenvolver variedades mais resistentes e com ampla adaptabilidade; a alta

heterozigosidade observada na variedade RB72454 favorece sua utilização no

desenvolvimento dessas novas variedades.

A variedade RB92579 liberada comercialmente em 2003, também

apresentou alta heterozigosidade (0,8080), e segundo o censo varietal de 2011, a

variedade passou do 19° lugar em plantio geral em 2010 (Censo

Varietal/PMGCA, 2010) para o terceiro lugar no censo varietal de 2011, sendo

mais explorada devido sua baixa floração que favorece maiores teores de

sacarose no colmo. A variedade RB867515 foi a variedade mais plantada em

2010 e 2011, ocupando 1.311.017 ha em 2011, obtendo excelente produtividade;

sua heterozigosidade foi alta (0,7920), porém menor do que a da sua genitora

RB72454 (0,8330). A alta heterozigosidade observada (Ho > 0,50) é uma

característica comum a todas as nove variedades de cana-de-açúcar que,

igualmente, apresentam alta produtividade (Tabela 1).

A diversidade genética estimada com base nos coeficientes de Identidade

Genética de Nei (1978) indicou uma base genética estreita para as nove

variedades de cana-de-açúcar. A diversidade genética calculada mostrou maior

identidade genética entre as variedades RB92579 e RB72454 com 86,31% de

similaridade e a menor similaridade encontrada foi entre as variedades

RB845210 e RB835054 (61,99%). A base genética estreita entre essas variedades

é demonstrada pelo baixo valor de variação entre o mais similar e o menos

similar (24,32%) para os primers utilizados neste trabalho. Muitas das variedades

utilizadas no presente trabalho têm genitores comuns em alguma etapa do

melhoramento como pode ser observado na Tabela 1 e na Figura 5, contribuindo

32

para o estreitamento da base genética entre as nove variedades, considerando os

locos SSR analisados.

Figura 5 - Genealogia de 4 variedades utilizadas nesse trabalho. A – RB72453; B – RB935744; C – RB92579; D – RB867515. (?): Policruzamento. RIDESA (2010).

Na Tabela 5 é possível observar as similaridades e as distâncias entre as

variedades segundo Nei (1978). A maior distância genética encontrada entre as

variedades RB935744 e RB92579 (0,4874), RB845210 e RB835054 (0,4782),

RB92579 e RB835054 (0,4749), RB855453 e RB92579 (0,4098), torna

promissora o cruzamento entre essas variedades gerando populações segregantes

mais divergentes entre si.

33

Ao analisar a Tabela 5 é possível destacar a variedade RB92579 como a

que mais se distancia das outras variedades, exceto a variedade RB72454. Essa

variedade foi considerada pelos produtores do Nordeste brasileiro como a

variedade “Fantástica” por apresentar cerca de 30 a 40% de produtividade maior

que outras variedades cultivadas na região. A variedade RB92579 além de alta

produtividade apresenta ótimo perfilhamento, boa resistência a adversidades de

solo e clima (RIDESA, 2010), porém seu caldo é escuro prejudicando a sua

utilização pela indústria de açúcar no Brasil. Este é um exemplo de que para

algumas variedades de cana-de-açúcar, as excelentes características agronômicas

não estão associadas com as características desejáveis para o processamento

destas pela indústria de açúcar e álcool. Por isso é importante a caracterização

genética molecular destas variedades e as estimativas de divergência genética

entre elas, para orientar o melhoramento das características desejáveis pela

indústria. O agrupamento representado na Figura 6 organizou as nove variedades

em quatro grupos que representam a formação de grupos heteróticos em nível

molecular que podem ser usados pelos melhoristas, para orientar os cruzamentos

entre os grupos considerando as características morfoagronômicas e as de

interesse da indústria produtora de álcool e açúcar.

Tabela 5. Identidade (acima da diagonal) e Distância (abaixo da diagonal) genética de Nei (1978). SP813250(1); RB845210(2); RB935744(3); RB867515(4); RB036152(5); RB835054(6); RB855453(7); RB92579(8); RB72454(9)

Variedade 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 **** 0.8069 0.7030 0.7311 0.7717 0.6979 0.7649 0.6869 0.6654 2 0.2146 **** 0.7586 0.8160 0.6915 0.6169 0.8288 0.7283 0.7939 3 0.3524 0.2762 **** 0.7539 0.7163 0.8049 0.7961 0.6142 0.7330 4 0.3132 0.2034 0.2825 **** 0.7213 0.6522 0.8063 0.6703 0.7488 5 0.2592 0.3689 0.3336 0.3268 **** 0.6844 0.7182 0.6500 0.7183 6 0.3596 0.4782 0.2171 0.4273 0.3791 **** 0.7039 0.6219 0.6797 7 0.2680 0.1878 0.2281 0.2153 0.3310 0.3511 **** 0.6638 0.7514 8 0.3756 0.3171 0.4874 0.4000 0.4307 0.4749 0.4098 **** 0.8631 9 0.4074 0.2308 0.3106 0.2892 0.3309 0.3861 0.2859 0.1472 ****

34

Com base nas distâncias genéticas de Nei (1978) o dendrograma gerado

por agrupamento das variedades, pode ser observado na Figura 6.

A estimativa da divergência genética entre as nove variedades de cana-

de-açúcar quantificadas usando o coeficiente GST de Nei (1975) também mostrou

que apesar destas variedades apresentarem características morfoagronômicas

similares (Tabela 1) elas estão geneticamente estruturadas (GST = 0,7034).

Figura 6. Agrupamento obtido para as nove variedades de cana-de-açúcar, realizado através do método UPGMA e obtida a partir da análise de 70 alelos amplificados com primers para SSR.·.

Valores de GST ≥ 0,25 indicam que as populações analisadas apresentam

uma divergência genética muito alta decorrente de frequências diferentes dos

alelos nestas populações. Não foi verificada a presença de alelos exclusivos em

uma ou outra variedade, mas as frequências dos alelos comuns nas nove

variedades foram diferentes o suficiente para diferenciar geneticamente estas

variedades.

O dendrograma construído a partir da análise dos alelos como

marcadores dominantes, usando o programa NTSYSpc versão 2.1 (Rohlf, 2000)

para comparar as 74 plantas das nove variedades ilustra claramente a

35

variabilidade genética contida nos 17 locos microssatélites de cada uma das

variedades comerciais de cana-de-açúcar (Figura 7). A organização das plantas

de cada genótipo num determinado grupo mostra como as variedades estão

altamente estruturadas, e a organização das plantas das variedades RB92579 e

RB72454 num grupo, ilustra a maior similaridade (0,8631) observada entre estas

duas variedades. Este dendrograma ilustra também a presença de plantas com

100% de similaridade (clones) para os 17 locos microssatélites somente nas

variedades SP813250 (plantas 4 e 5; 7 e 8) que foi considerada como

geneticamente mais uniforme, RB935744 (plantas 21 e 22) e RB835054 (plantas

43,44 e 45).

36

Figura 7. Agrupamento obtido para as 74 plantas das nove variedades de cana-de-açúcar, realizado através do método UPGMA e obtido a partir da análise de 70 alelos amplificados com primers para SSR. I- SP13250; II-RB036152; III-RB935744; IV-RB835054; V- RB845210; VI- RB867515; VII- RB855453; VIII- RB72454; IX – RB92579.

I

II

III

IV

V

VI

VII

VIII

IX

VIII

37

A amplitude de variação alélica entre as nove variedades foi baixa (0,6142

entre as variedades RB92579 e RB935744, e 0,8631 entre as variedades

RB92579 e RB72454) concordando com a base genética estreita que tem sido

descrita para os genótipos de cana-de-açúcar (Barbosa, 2000; Almeida, 2005;

Duarte-Filho et al., 2010; Silva et al., 2012). Por outro lado, no dendrograma da

Figura 7 está representada uma base genética ampla (0,45 – 1,00) quando oito ou

dez exemplares de plantas de cada variedade foram comparados analisando os 17

locos microssatélites. Os estudos com outras variedades de cana-de-açúcar

comparam somente as variedades, tomando como amostras bulk de cada

variedade (Singh et al., 2008; 2011), numa análise que não identifica os

genótipos heterozigotos para expressar a variação contida dentro de cada

variedade.

No presente estudo, considerando o número de alelos (4,12 alelos/locos),

os valores de heterozigosidade média observados (de 0,575 a 0,833), e os índices

de similaridade genética entre as plantas (0,44 a 1,00), como parâmetros para a

análise de diversidade genética nas nove variedades de cana-de-açúcar usando os

17 primers de microssatélites, foi possível verificar uma diversidade genética alta

e uma base genética ampla para as amostras da espécie Saccharum spp..

38

5 CONCLUSÃO

5.1 A análise dos locos Ugmsm38, Segms240, Segms1069, Smc226CG,

EstB130, Smc1237FL, Smc165A, Ugsm117, EstB41, EstB145, Smc1047HA,

Smc2017FL, EstC66, mSscir56, e EstB50, mostrou que existe uma diversidade

genética alta dentro das variedades SP813250, RB845210, RB935744,

RB867515, RB036152, RB835054, RB855453, RB92579, e RB72454 de cana-

de-açúcar, e uma divergência genética alta entre estas variedades.

5.2 Os locos Ugsm148 e Ugsm59 (100% de plantas homozigotas) podem ser

indicados para monitorar a estabilidade dos nove genótipos de cana-de-açúcar,

quando for necessário.

5.3 Os primers para os locos Segms1069, EstB60, Smc226CG, Est130,

Smc1237FL, Smc165A, EstB41, Smc1047HA, Smc2017FL, EstC66, e mSscir56

(Ho > 0,50), são promissores para avaliar a diversidade genética dentro e entre

variedades de cana-de-açúcar.

5.4 Os locos SSR em variedades de cana-de-açúcar são marcadores promissores

para avaliar a real diversidade genética em nível molecular de variedades que

apresentam características morfoagronômicas uniformes, contrariando o

postulado de que existe uniformidade genética em variedades comerciais de

cana-de-açúcar.

39

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