Ciencias Marinas (2000), 26( 1): 79-96

PIGMENT VARIATIONS INDUCED BY THE OXYGEN LEVEL OF THEMEDIUM IN A MARINE BACTERIUM Alteromonas sp.

(STRAIN CECT 4800)

VARIACIONES INDUCIDAS POR EL NIVEL DE OXÍGENO DEL MEDIOEN LOS PIGMENTOS DE LA BACTERIA MARINA Alteromonas sp.

(CEPA CECT 4800)

Manuel A. González-del ValleOlimpio Montero

Ignacio Moreno-GarridoLuis M. Lubián*

Instituto de Ciencias Marinas de Andalucía (CSIC)Polígono Río S. Pedro sln

115 10 Puerto Real, Cádiz, España* E-mail: luis.lubian@icman.csic.es

Recibido en marzo de 1999; aceptado en septiembre de 1999

ABSTFUCT

A red-pigmented bacteria1 strain was isolated from indoor cultures of the marine microalgaTetraselmis suecica Butcher (Prasynophyceae) and identified as belonging to the genus AIteromonas(strain CECT 4800). Pigment composition was analyzed by means of high-performance liquidchromatography (HPLC), and spectral characteristics of three majar pigments with reddish and yellowishcolorations were determined. Changes in pigment composition during growth in liquid mediumcontaining either ferric citrate, sodium citrate, glucose or glucose plus iron, as well as in relation to theoxygen concentration in the liquid medium were investigated. Pigment production was found to beenhanced with culture aging, the highest enhancement occurring in iron-deprived cultures. An increase inthe mrjor pigment (a red pigment) content of 70% in relation to the initial one took place when a culturefed with ferric citrate was bubbled with molecular oxygen. In contrast, red pigment content decreased toabout 50% of the initial content when the culture was sparged with nitrogen. Other pigments did notexhibit substantial modifications. Increase in the red pigment content was also observed after thedifferent cultures were exposed to diverse oxygen concentrations for one hour. Similar results wereobtained in cultures submitted to both strong aeration and agitation (5 mL min-’ air and 500 rpm,respectively). Findings of this study suggest that pigment production by Alteromonas sp. (strain CECT4800) in particular that of the red pigment, could rely on the oxygen concentration in the culture mediumdue to antioxidative reactions.

Key words: marine bacteria, Alteromonas sp., molecular oxygen, pigment, HPLC.

79

Ciencias Marinas, Val. 26, No. 1, 2000

RESUMEN

Se ha aislado una cepa bacteriana de color rojo a partir de cultivos de laboratorio de la microalgamarina Tetraselmis suecica Butcher (Prasynophyceae), siendo identificada taxonómicamente como perte-neciente al género Alteromonas (cepa CECT 4800). Su composición pigmentaria fue analizada mediantecromatografía líquida de alta resolución (HPLC), y se determinaron las características espectrales desus tres pigmentos mayoritarios, que presentaban coloraciones rqja y amarilla. Asimismo, se investigaronlos cambios pigmentarios durante el crecimiento en medio líquido que contenía ya sea citrato sódico,citrato férrico, glucosa o glucosa más hierro, así como en relación con la concentración de oxígenodisuelto en el medio líquido. Se observó que la producción de pigmento se incrementaba con la edad delcultivo, siendo las producciones más altas en cultivos carentes de hierro. Se detectó un incremento del70% en el contenido del pigmento mayoritario (de color rojo) en relación con el contenido inicial cuandoun cultivo suplementado con citrato férrico se burbujeaba con oxígeno molecular. Por el contrario, laconcentración de pigmento rojo sufrió un descenso del 50% con relación a la concentración originalcuando el cultivo fue burbujeado con nitrógeno. El resto de los pigmentos no mostraron variacionessubstanciales. Asimismo, se produjo un incremento de la concentración del pigmento rojo tras la exposi-ción de distintos cultivos a diversas concentraciones de oxígeno durante una hora. Resultados similares seobtuvieron en cultivos sometidos a aireacibn fuerte y agitacion (5 mL min-’ y 500 rpm, respectivamente).Los resultados de este estudio sugieren que la producción de pigmentos por parte de Alteromonas sp.(cepa CECT 4800) en particular la producción de pigmento rojo, podría estar relacionado con la cantidadde oxígeno disuelto debido a reacciones antioxidativas.

Palabras clave: bacterias marinas, Alteromonas sp., oxígeno molecular, pigmento, HPLC.

INTRODUCTION INTRODUCCIÓN

Evidente exists on associations betweenalgal and bacteria1 populations in both naturalenvironments and cultures (Caldwell, 1977;Jones, 1982; Paerl and Pinckney, 1996) and theinteractions involved in those associations havebeen shown to be mainly assimilation bybacteria of organic compounds released byalgae (Bell, 1983), while bacteria might supplyCOZ to algae (Marshall, 1989). In fact, it hasbeen found that a number of algae grow inbacteria-contaminated cultures better than inaxenic ones (Berland et af., 1970; Fitzsimonsand Smith, 1984; Tranvik, 1990; Sundh, 1992).Molecular oxygen is the main product releasedby algae during photosynthetic activity, andconsumption by associated bacteria of thisphotosynthetically produced oxygen has beenproposed as an important factor in regulating

Existen evidencias acerca de la asociaciónentre algas y bacterias, tanto en ambientesnaturales como en cultivos (Caldwell, 1977;Jones, 1982; Paerl y Pinckney, 1996) y se hademostrado que las interacciones implicadas entales asociaciones son principalmente laasimilación por parte de las bacterias decompuestos orgánicos liberados por las algas(Bell, 1983), mientras que las bacterias podríanproporcionar COZ a las algas (Marshall, 1989).De hecho, se ha comprobado que un grannúmero de algas crecen mejor en cultivoscontaminados con bacterias que en cultivosaxénicos (Berland et al., 1979; Fitzsimons ySmith, 1984; Tranvik, 1990; Sundh, 1992). Eloxígeno molecular es el principal productoexcretado por las algas durante la actividadfotosintética y se ha propuesto que el consumo

__

80

González-del Valle et al.: Oxygen-induced pigment variations in Alteromonas sp.

photosynthesis of the alga due to reduction ofoxygen tension within the microenvironment ofthe alga1 cells (Caldwell, 1977; Esther andCharacklis, 1982; Mouget et al., 1995). How-ever, at higher rates of photosynthesis, oxygencould result harmful for the associated bacteriaas well.

Species of the genus Alteromonas are com-mon in the marine environment but appear tobe rare or absent in most terrestrial habitats(Baumann et al., 1984; Andrykovitch andMarx, 1988). They are chemoorganotrophscapable of respiratory but not fermentative

- metabolism with molecular oxygen as univer-sal electron acceptor. Some species showpigmentation from lemon-yellow to violet. So,coloration is dueto prodigiosin in Alteromonasrubra (Gerber and Gauthier, 1979), to violaceinin A. luteoviolacea (Gauthier, 1976), to uniden-tified non-carotenoid pigments in A. citrea andA. aurantia (Gauthier and Breittmayer, 1979),and melanins in A. hanedai, A. nigrtjaciens andthe novel strain MMB-1 (CECT 4803)(Baumann et al., 1984; Solano et al., 1997).Species of Al teromonas have deservedattention because they are producers of com-pounds with antibiotic or inhibitory properties,including some of the aforementioned pig-ments (Gauthier and Flatau, 1976; Ballester etal., 1977; Wratten et al., 1977; Lemos et al.,1985), and siderophores (Reid et al., 1993;Riquelme, 1996). Interestingly, antibiotics andgrowth inhibitory compounds from species of-the genus Alteromonas have been shown to actthrough increasing oxygen uptake, with con-current deficient reduction and formation ofradicals (Gauthier and Flatau, 1976; Austin,1988).

From diverse microalgae cultures, red bac-terial colonies were isolated at our laboratory(González-del Valle, 1997) that were identifiedas belonging to the genus Alteromonas. Inthis paper, we report changes in pigmentcomposition of one of them during its growth

de este oxígeno por parte de las bacteriasasociadas es un factor importante en losprocesos de regulación de la fotosíntesis,debido a la reducción de la tensión de oxigenoen el microambiente adyacente a las célulasalgales (Caldwell, 1977; Esther y Charaklis,1982; Mouget et al., 1995). Sin embargo, atasas altas de fotosíntesis el oxígeno puederesultar también perjudicial para las bacteriasasociadas.

De entre las bacterias marinas pigmen-tadas, son comunes las especies del géneroAlteromonas, que parecen estar ausentes oencontrarse raramente en la mayoría de loshábitats terrestres (Baumann et al., 1984;Andrykovitch y Marx, 1988). Son quimio-organotrofas con un metabolismo respiratoriopero no fermentativo, que utilizan el oxígenocomo aceptor universal de electrones. Algunasespecies muestran coloraciones desde amarillohasta violeta. Así, la coloración se debe al pig-mento prodigiosina en Alteromonas rubra(Gerber y Gauthier, 1979), a la violaceína en A.luteoviolacea (Gauthier, 1976), a pigmentosno carotenoides no identificados en A. citrea yA. awantia (Gauthier, 1977; Gauthier yBreittmayer, 1979), y melaninas en A. hanedai,A. nigrfaciens y la cepa nueva MMB-1 (CECT4803) (Baumann et al., 1984; Solano et al.,1997). Ciertas especies de Alteromonas hanatraído la atención debido a su producción decompuestos con actividad antibiótica, inclu-yendo algunos de los pigmentos anteriormentemencionados (Gauthier y Flatau, 1976;Ballester et al., 1977; Wratten et al., 1977;Lemos et al., 1985) y sideróforos (Reid et al.,1993; Riquelme, 1996). Es interesante observarque tanto los antibióticos como los compuestosinhibidores del crecimiento obtenidos de espe-cies del género Alteromonas actúan incremen-tando la incorporación de oxígeno, provocandouna reducción deficiente y la formación deradicales (Gauthier y Flatau, 1976; Austin,1988).

81

Ciencias Marinas, Vol. 26, No. 1, 2000

in culture and under different oxygen-involvingtreatments.

MATERIALS AND METHODS

Culture

The bacterium used in this study was iden-tified as belonging to the genus Alteromonas(Alteromonas sp., strain CECT 4800)(González-del Valle, 1997), and was isolatedfrom cultures of the marine microalgaeTetraselmis suecica (Prasynophyceae), whichwas obtained from the Microalga CultureCollection of the Instituto de Ciencias Marinasde Andalucía (CSIC, Cádiz, Spain). A stockbacteria culture was kept at 4’C on marine agar2216 medium (DIFCO) and renewed monthly.In all experiments, 2 L of liquid medium wasinoculated with cells from the stock bacteria1culture in the exponential growth phase. Themedium was prepared in artificial seawater,with the following salt concentration (w/v):2.43% NaCl, 0.01% CaCl,, 0.40% MgCI,,0.007% NaBr, 0.06% KCl, 0.002% KHCO,,and 0.63% MgSO,, to which 0.1% yeastextract, 0.5% protease peptone and a carbonsource were added. Bacteria1 cell density wasachieved by determining the number of colonyformation units (CFU), according to themethodology described by Buck (1979).

Experimental

Pigment content was determined duringbacteria1 growth in cultures to which citrate,either as sodium or ferric Salt, and glucose,either alone or implemented with iron (FeCl,),were added as carbon source, all of them to afinal concentration of 0.01% (w/v).

In order to verify the hypothesis on theexistence of a relationship between oxygensaturation level and pigment content, threeindependent experiments were conducted in a

A partir de diversos cultivos de microalgas,en nuestro laboratorio se aislaron colonias debacterias de color rojo (González-del Valle,1997) que se identificaron como pertenecientesal género Alteromonas. En este trabajo se des-criben cambios en la composición pigmentariade una de ellas, durante su crecimiento en cul-tivo y bajo distintos tratamientos, relacionadoscon la concentración de oxígeno en el medio.

MATERIAL Y MÉTODOS

Cultivos

La bacteria utilizada en este estudio seidentificó como perteneciente al géneroAlteromonas (Alteromonas sp., cepa CECT4800) (González-del Valle, 1997), y fue aisladaa partir de cultivos de la microalga marinaTetraselmis suecica (Prasinophyceae), obte-nida de la Colección de Microalgas Marinas delInstituto de Ciencias Marinas de Andalucía(CSIC, Cádiz, España). Un cultivo bacterianostock se mantuvo a 4°C en medio agar marino2216 (DIFCO), sujeto a renovación mensual.Para todos los experimentos se inocularon 2 Lde medio líquido con células obtenidas a partirdel stock bacteriano en fase de crecimientoexponencial. El medio se preparó en agua demar artificial con la siguiente composiciónsalina (p/v): 2.43% NaCI, 0.01% Ca&, 0.40%MgCl,, 0.007% NaBr; 0.06% KCI, 0.002%KHCO,, y 0.63% MgSO,, adicionada con 0.1%de extracto de levadura y 0.5% de proteasapeptona, además de una fuente de carbono. Laconcentración de bacterias se evaluó por deter-minación de las unidades formadoras de colo-nias (CFU), según el método mostrado en Buck(1979).

Experimentación

El contenido en pigmentos durante el creci-miento bacteriano se determinó en cultivos a

82

González-del Valle et al. : Oxygen-induced pigment variations in Alteromonns sp.

bench-top fermentor system equipped with a2-L capacity cuvette. Temperature was main-tained constant at 35’C (the optima1 tem-perature for growth) by means of circulatingwater connected to a recirculation cooler. In afirst experiment, a culture grown for 24 hoursat a cell density of 5.0 IO6 cells mL_’ wasbubbled with oxygen at 100% saturationfor one hour. A 250-mL sample was thentaken for pigment analysis. Afierwards, theremaining culture was bubbled with N, forup to 24 hours and samples for pigment analy-sis were taken at time intervals of 2, 12 and24 hours (cell densities were 5.7 10ú, 1.4 IO*and 2.0 IO* cells mL-‘, respectively). The aimof NZ bubbling was to check whether removalof oxygen brought about a depletion in pigmentcontent. In a second experiment, cultures fedwith citrate and with glucose (see above) wereexposed to a fixed saturation of oxygen,namely 20%, 50% and 100% for one hour, andinduced-changes in pigments then determined.In a third experiment, two cultures wereaerated with atmospheric air (air flows were0.5 and 5 mL min-‘); two other cultures weremaintained without aeration but agitated at50 or 500 rpm; and, finally, a culture wassubmitted to an air flow of 0.5 mL min-’ andagitated at 50 rpm (soft conditions), andanother culture was submitted to 5 mL min’ ofair flow and agitated at 500 rpm (strongconditions). A culture with neither aeration noragitation was used as control. Pigment analy-sis was carried out after 48 hours of growth(about lo* cells mL-‘). In this latter experiment,cultures (2 L) were inoculated with anappropriate volume of the stock culture toyield a cell density of about IO6 cells mL-‘.Oxygen saturation level and pH were measuredon-line with an Ingold O2 sensor and anIngold 405-OPAS/ electrode, respectively,immersed in the culture cuvette, and valuesregistered every 15 minutes.

los que se añadió citrato, como sal sódica o salférrica, 0 glucosa, tanto sola como suplemen-tada con hierro (FeCl,), como fuente de car-bono, siempre a una concentración final de0.01% (piv).

Con objeto de verificar la hipótesis de laexistencia de una relación entre el nivel desaturación de oxígeno y el contenido en pig-mentos, se desarrollaron tres experimentosindependientes en un fermentador equipadocon una cubeta de 2 L de capacidad. La tempe-ratura se mantuvo constante a 35°C (tempera-tura óptima de crecimiento) mediante aguacirculante conectada a un sistema refrigerante.En un primer experimento, un cultivo crecidodurante 24 horas con citrato férrico a una densi-dad de 5.0 IO6 células rnL_’ se burbujeó conoxígeno hasta saturación durante una hora,después de la cual se tomó una alícuota de250 mL para su análisis pigmentario. El restodel cultivo se burbujeó con N, durante 24 horasy se tomaron muestras para análisis pigmen-tario a las 2, 12 y 24 horas (las densidades celu-lares en esos tiempos fueron 5.7 . 10ú, 1.4 IO*y 2.0 . IO* células mL-‘, respectivamente). Elobjeto de burbujear con nitrógeno fue compro-bar si la remoción de oxígeno conllevaba unadisminución en los contenidos pigmentarios.En un segundo experimento, cultivos suple-mentados con citrato y con glucosa (verdescripción anterior) se expusieron a una con-centración fija de oxígeno (20%, 50% y 100%de saturación) durante una hora y se determi-naron los cambios inducidos en los pigmentos.En un tercer experimento, se burbujearon doscultivos con aire atmosférico con flujos de 0.5y 5 mL mini, respectivamente; otros dos culti-vos se mantuvieron sin aireación pero sujetos aagitación orbital de 50 y 500 rpm, respectiva-mente; y finalmente un cultivo se sometió a unflujo de aire de 0.5 mL mm ’ y agitación de50 rpm (condiciones suaves), mientras que otrose sometió a un flujo de aire de 5 mL min-’ y

83

Ciencias Marinas, Vol. 26, No. 1, 2000

Pigment analysis

For high-performance liquid chromatogra-phy (HPLC) analysis of pigments, 250-mLsamples of a 48-hour grown culture were cen-trifuged at 4500 rpm for 30 minutes; the super-natant was discarded and pellet sonicated with2 mL chloroform for pigment extraction. Afiera new centrifugation, the supernatant was col-lected, solvent evaporated to dryness and pig-ments resuspended in an appropriate volume ofmethanol. Analyses were performed with aWATERS 600E Multisolvent Delivery System,equipped with a RP-Cl8 column packedwith Spherisorb ODS-2 (15 cm x 4 mm i.d.and 5-Pm particle size). Samples were filteredthrough a 0.22~um nylon membrane and 20 uLthen injected. Elution was according to thegradient system developed by Mínguez-Mosquera et al. (1992), at a constant flow of1.0 mL min-’ during 30 minutes. A Program-mable Photodiode Array Detector (PDA,WATERS 991) was used for pigment detec-tion, with data being acquired three-dimensionally (absorbance-time-wavelength)over the wavelength range of 350 to 750 nm.

Pigments were quantified using the spe-cific extinction coeffrcients (Er”,,,) of12.5 L g-r cm-’ for pigments 1 (red pigment)and 2, and of ll.7 L g-r cm-’ for pigments3 (yellow pigment) and 4. These coefficientswere determined spectrophotometrically fromthe slope of the linear regression between theabsorbance of 100% acetone solutions con-taining a known amount of the red pigment andtheir concentration in percent (w/v).

RESULTS

HPLC and spectrophotometrical analyses ofpigments

A typical HPLC-chromatogram of pig-ments from Alteromonas sp. (strain TSHR3,

agitación de 500 rpm (condiciones fuertes). Seusó un cultivo sin aireación ni agitación comocontrol. Se llevo a cabo el análisis de pigmen-tos tras 48 horas de crecimiento (alcanzándoseentonces una densidad celular de lOs célulasmL-‘). En este último experimento, los cultivosde 2 L se inocularon con un volumen apropiadode cultivo stock para alcanzar una densidadcelular de alrededor de IO6 células mL-‘. Elnivel de saturación de oxígeno se midiópolarográticamente mediante un sensor de O2Ingold y el pH se midió con un electrodoIngold 405-OPAS/200, ambos sumergidos enla cubeta de cultivo, con registros de ambasvariables a intervalos de 15 minutos.

-

Análisis de pigmentos

Para el análisis de pigmentos mediantecromatografía líquida de alta resolución(HPLC), se centrifugó en cada caso una mues-tra de 250 mL de cultivo durante 30 minutos a4500 rpm tras 48 horas de crecimiento. Sedescartó el sobrenadante y el residuo sólido sesonicó con 2 mL de cloroformo para la extrac-ción de los pigmentos. A continuación sevolvió a centrifugar y una vez recogido elsobrenadante, se evaporó el disolvente a seque-dad y los pigmentos se resuspendieron en unvolumen apropiado de metanol. Los análisis sellevaron a cabo con un sistema multisolventeWATERS 600E, equipado con una columnaRP-C 18 empaquetada con Spherisorb ODS-2 _(15 cm x 4 mm d.i. y 5 um de tamaño de partí-cula). Las muestras se filtraron por una mem-brana de nylon de 0.22 um de tamaño de poro,y después se inyectaron 20 uL. La elución sellevó a cabo según un sistema en gradientedesarrollado por Mosquera et al. (1992), aun flujo constante de 1.0 mL min-’ durante30 minutos. Para la detección de los pigmentosse usó un detector PDA (Programmable Photo-diode Array Detector, WATERS 991). Losdatos se adquirieron de forma tridimensional

84

González-del Valle et al. : Oxygen-induced pigment variations in Alteromonas sp.

CECT 4800) is shown in figure la. A red pig-ment, corresponding to the chromatographicpeak 1, always predominated in content overthe other pigments. A second major pigmentcorresponding to the chromatographic peak 3presented a yellow coloration. These pigmentscould not be identifíed. Spectra of these pig-ments and of pigment 2 (peak 2 in fig. la) areshown in figure lb. Pigments 1 and 2, on theone hand, and pigments 3 and 4, on the other,presented similar spectral characteristics.Maximum absorption wavelengths of the redand yellow pigments in different solvents aregiven in table 1. The red pigment onlyexhibited a maximum at about 475 nm in everysolvent, apart from in benzene and inchloroform, which was at 491 and 488 nm,respectively. In contrast, the yellow pigmentspectrum exhibited three maxima, peaking atsimilar wavelengths in al1 solvents.

Pigment variations during culture growth

The contents (in pg 1 O6 cells) of pigments1, 2 and 3 at different time intervals duringculture growth are depicted in figure 2 for thecultures fed with sodium citrate, ferric citrate,glucose and glucose plus iron. No significant(P < 0.01) differences in the growth patternwere observed among the diverse cultures (datanot shown). In all of them, red and yellow pig-ment contents per cell rose to a maximum afteran eight-hour time interval of growth, this risecoinciding with the onset of the log phase. Thepigment contents then fell close to zero and,with culture aging, the pattern of evolution ofeach pigment was dependent on the culturetype. So, after 48 hours of culture growth, thered pigment content augmented in all of them,the maximum value being obtained withsodium citrate and the minimum value withglucose plus iron; the yellow pigment contentonly rose in both iron-deprived cultures, and

(absorbancia-tiempo-longitud de onda) sobre elintervalo de longitudes de onda entre 350 y750 nm.

Los pigmentos se cuantificaron aplicandolos coeficientes específicos de extinción(El”,,,,) de 12.51 L g-’ cm-’ para los pigmen-tos 1 y 2 (pigmento rojo), y de 11.7 L g-’ cm-’para los pigmentos 3 (pigmento amarillo) y 4.Estos coeficientes de extinción se determinaronespectrofotométricamente a partir de la pen-diente de la regresión lineal entre la absorban-cia de una cantidad conocida de pigmentodisuelta en acetona y la concentración de pig-mento expresada en porcentaje (piv).

RESULTADOS

Análisis espectrofotométrico y por HPLC delos pigmentos

Un cromatograma típico de los pigmentosde Alteromonas sp. (CECT 4800) obtenidomediante HPLC se muestra en la figura la. Elpigmento de color rojo, que corresponde alpico cromatográfico 1, siempre fue mayoritariorespecto al resto de los pigmentos. El segundoen importancia desde el punto de vista cuantita-tivo corresponde al pico cromatográfico 3 ymostró un color amarillo. Ninguno de los dospigmentos pudo ser identificado. Los espectrosde estos dos pigmentos, así como el correspon-diente al pico 2, se muestran en la figura 1 b.Los pigmentos 1 y 2 presentaron característicasespectrales similares y, aunque no se ha repre-sentado el espectro correspondiente al pico 4,su espectro de absorción es muy similar al delpico 3. Los máximos de absorción para los pig-mentos rojo y amarillo en diferentes disolven-tes se muestran en la tabla 1. El pigmento rojopresentó un único pico sobre 476 nrn en los sol-ventes ensayados excepto en benceno y cloro-formo, en los que los máximos de absorciónfueron a 49 1 y 488 nm, respectivamente. Por el

85

Ciencias Marinas, Val. 26, No. 1, 2000

1.0

0.8

0.6ti3g 0.4ln$

0.2

0.0 l(4 1

0 5 10 15 20 25 30

Time (min)

0.8

0.6

0.4

02

0.0I I I I I I I

350 400 450 500 550 600 650

Wavelength (nm)

Figure 1. (a) Chromatographic and (b) spectrophotometric characteristics of pigments from Alteromonassp. (strain CECT 4800). (For details see text.)Figura 1. Características (a) cromatográficas y (b) espectrofotométricas de los pigmentos de Alteromonassp. (cepa CECT 4800). (Ver texto.)

Table 1. Maximum absorption wavelengths (nm) in different solvents of the two major pigments (peaks 1and 3 in the chromatogram of fig. 1) from Alteromonas sp. (strain CECT 4800).Tabla 1. Máximos de absorción (nm) en diferentes disolventes de los dos pigmentos mayores (picos 1 y 3en el cromatograma de la fíg. 1) de Alteromonas sp. (cepa CECT 4800).

Solvent Peak 1 Peak 3

Trichloromethane 488 _

Diethyl ether 476 44414701502

n-Hexane 476

Bencene 491

Acetone 477 448/473/505

Ethanol 477 44214721503

Methanol 475 446/469/500

86

González-del Valle et al.: Oxygen-induced pigment variations in Alteromonas sp.

2.001.751.50

1.251.000.750.500.250.00

2.00

:

05

0.50

5g 0.25P

B 0.00

2.00

(b)

0.25

0 24

Time(h)

36 40

Figure 2. Changes in main pigment contents during 48 hours of growth of cultures of Alteromonas sp.(strain CECT 4800) in liquid medium and fed with sodium citrate (square), ferric citrate (circle), glucose(triangle) or glucose plus iron (inverted triangle). (a) Peak 1 (red pigment) in figure 1, (b) peak 2 infigure 1 and (c) peak 3 (yellow pigment) in figure 1. Values are the mean of three independentexperiments. (Note the differenty-axis scales.)Figura 2. Cambios en los contenidos de los pigmentos principales de Alteromonns sp. (cepa CECT 4800)durante 48 horas de crecimiento en medio líquido suplementado con citrato sódico (cuadrado), citratoférrico (círculo), glucosa (triángulo) o glucosa más hierro (triángulo invertido). (a) Pico 1 (pigmento rojo)en la figura 1, (b) pico 2 en la figura 1 y (c) pico 3 (pigmento amarillo) en la figura 1. Los valores repre-sentan la media de tres experimentos independientes. (Nótese la diferencia de escala en las ordenadas.)

pigment 3 content rose in the glucose-fedculture.

Oxygen-induced variations in pigmentcontents

Red pigment content (expressed in pg 1 0m6cells) rose with increasing oxygen concentra-tions in all the experiments. In the first experi-ment, after sparging with molecular oxygen for

contrario, el espectro del pigmento amarillomostró tres picos a longitudes de onda simila-res en todos los disolventes utilizados.

Variaciones de los pigmentos durante elcrecimiento del cultivo

Los contenidos (en pg lOb células) de lospigmentos 1, 2 y 3 en diferentes intervalos detiempo durante el crecimiento del cultivo se

87

Ciencias Marinas, Vol. 26, No. 1, 2000

one hour, the red pigment content had risenabout 1.7-fold in relation to the initial content(hg. 3). Even though a minimal increase in thered pigment content was still detected after twohours of nitrogen bubbling, it dropped to about15% and 9% of the initial content following12 and 24 hours, respectively, of bubblingwith nitrogen. Pigment 3 did not augment withoxygen but dropped after bubbling with nitro-gen for 12 hours. Pigment 2 underwent similarvariations to those of the red pigment, thoughto a lesser extent.

Figure 4 illustrates the results of the secondexperiment. The oxygen saturation leve1 in thecultures before the treatment ranged between8% and 12%. Initial contents of the redpigment were in the order of 1.83 k 0.22 pgpigment 10” cells. Increases in the red pig-ment content were related to the increase inoxygen levels in both glucose-fed cultures,but they did not differ substantially in thecitrate-fed cultures among the three oxygensaturations assayed.

The contents of pigments 1 and 2, as wellas the sum of both pigments, in a glucose-fedculture under different regimes of aeration andagitation are shown in figure 5. The highercontents were obtained in the experiment com-bining agitation and aeration; however, undersoft conditions (0.5 mL min-’ of air flow andagitation at 50 rpm), it was about 50% of thecontent under strong conditions (5 mL min-’of air flow and agitation at 500 rpm), wherethe red pigment content accounted for morethan 95% of the total. In general, aerationraised the pigment pool content more thanagitation.

Evolutions of oxygen saturation and pH ofthe medium over the course of these experi-ments are displayed in figure 6. From initiallevels of 90% to lOO%, oxygen saturationlevels soon fell to zero in cultures without orsoft aeration, while in cultures submitted to

detallan en la figura 2 para los cultivos suple-mentados con citrato sódico, citrato férrico,glucosa y glucosa más hierro. No se observarondiferencias significativas (P < 0.01) entre losparámetros de crecimiento de los diferentescultivos (datos no mostrados). En todos ellos,el contenido de los pigmentos rojo y amarillopor célula creció durante las primeras ochohoras, coincidiendo con el inicio de la faselogarítmica. A continuación los contenidos enpigmentos disminuyeron hasta casi cero y, apartir de las 24 horas, conforme envejece elcultivo, la variación de cada pigmento depen-dió del tipo de cultivo. Así, tras 48 horas decrecimiento, el pigmento rojo aumentó entodos ellos, obteniéndose el valor máximo enmedios suplementados con citrato sódico,mientras que el mínimo se obtuvo en mediossuplementados con glucosa más hierro. El con-tenido en el pigmento correspondiente al pico 2

sólo aumentó en los cultivos carentes de hierroy el contenido del pigmento amarillo lo hizo enlos cultivos suplementados con glucosa.

-

Variaciones en los pigmentos inducidas porel oxígeno

En todos los experimentos realizados, elcontenido del pigmento rojo (expresado enpg 10” células) aumentó con el incremento dela concentración del oxígeno. En el primerexperimento, tras burbujear el cultivo con oxí-geno molecular durante una hora, el contenidocelular de pigmento rojo aumentó alrededor de1.7 veces en relación con el contenido inicial(fig. 3). A partir de este momento se burbujeócon nitrógeno y aunque se detectó un pequeñoincremento tras dos horas, la concentracióncelular del pigmento disminuyó hasta el 15% yel 9% respecto al contenido inicial al cabo de12 y 24 horas, respectivamente. El pigmentocorrespondiente al pico 3 no aumentó con eloxígeno, pero cayó tras 12 horas de burbujeo

_

88

González-del Valle et al. : Oxygen-induced pigment variations in Alteromonas sp

0.55

0.50

8 0.45u

<D

$

f0 0.15FseE 0.109a

0.05

0.00

j Initial

DLi C2’h

Exl N2 2h&Xj Np 12h

m N224h

1 2 3

Pigment (Chromatographic peak)

Figure 3. Changes in major pigment contents induced by bubbling the culture with molecular oxygen forone hour and with nitrogen for up to 24 hours. Pigment number corresponds to the peak number infigure 1.Figura 3. Cambios en los contenidos de los pigmentos mayoritarios inducidos por el burbujeo de oxígenomolecular al medio durante una hora y de nitrógeno durante 48 horas. Los números de los pigmentoscorresponden a los números de los picos en la figura 1.

strong aeration (5 mL min-‘) oxygen droppedinitially but rose to about 90% saturation withprolonged treatment. In cultures without aera-tion, as in control cultures, pH values alwayskept below 7 during the experimental period,while pH values gradually rose to about 8.0 incultures with aeration.

-DISCUSSION

Despite the important number of reports onAlteromonas species isolated from naturalmarine waters, few deal with Alteromonasspecies inhabiting indoor cultures of micro-algae. In addition, little information exists onpigments from Alteromonas species apart fromprodigiosin, violacein and melanin (Harwoodand Russell, 1984; Margalith, 1992). Uniden-tified non-carotenoid pigments were also

con nitrógeno. El pigmento 2 siguió variacio-nes similares a las del pigmento rojo aunque enmenor medida.

La figura 4 muestra los resultados obteni-dos en el segundo experimento. El nivel desaturación de oxígeno en los cultivos antes deltratamiento se hallaba entre 8% y 12%. El con-tenido inicial de pigmento rojo fue de 1.83 f0.22 pg de pigmento . 10” células. Los aumen-tos en los contenidos de pigmento se relaciona-ron con el incremento de los niveles de oxígenoen los dos cultivos suplementados con glucosa,pero no difirieron substancialmente en loscultivos suplementados con citrato en las tressaturaciones de oxígeno ensayadas.

Los contenidos de los pigmentos 1 y 2, asícomo la suma de ambos pigmentos en un cul-tivo con glucosa bajo diferentes regímenes deaireación y agitación se muestran en la figura 5.

89

Ciencias Marinas, Val. 26, NO. 1, 2000

8

6

FC SC G GFe

Culture

Figure 4. Sum of pigments 1 and 2 contents in pg 10”cells (mean value * standard deviation with n = 3)from Alteromonas sp. (strain CECT 4800) in cultures fed with ferric citrate (FC), sodium citrate (SC),glucose (G) and glucose plus iron (GFe), and submitted to different oxygen saturation levels (20%. 50%and 100%). Oxygen saturation in the initial cultures ranged between 8% and 12%. Pigments 1 and 2correspond to peaks 1 and 2, respectively, in figure 1.Figura 4. Suma de los contenidos de los pigmentos 1 y 2 expresados en pg 10m6 células (valores mediosf desviación típica con n = 3) extraídos de Alteromonas sp. (cepa CECT 4800) en cultivos con citratofërrico (FC), citrato sódico (SC), glucosa (G) y glucosa con hierro (GFe), y sometidos a distintos nivelesde saturación de oxígeno (20%, 50% y 100%). Los niveles de saturación de oxígeno en los cultivosiniciales variaron entre 8% y 12%. Los pigmentos 1 y 2 corresponden a los picos 1 y 2, respectivamente,en la figura 1.

reported for A. citrea and A. aurantia (Gauthierand Breittmayer, 1979). In this study, spectro-photometrical and chromatographic character-istics of the major pigments from Alteromonassp. are shown, even though they do not coin-cide with those reported in the literature forknown pigments and pigments could not bethereby identifíed. Similarity in these charac-teristics between pigments 1 and 2, on the onehand, and between pigments 3 and 4, on theother, suggests that they could be relatedchemically and, perhaps, biosynthetically.

Pigment production was always found toincrease with enhanced oxygen concentrationin the medium, while the red pigment contentdropped when oxygen was removed from themedium by bubbling with nitrogen. Hence, it

Los contenidos más altos se obtuvieron en losexperimentos que combinaban agitación yaireación, pero bajo condiciones suaves loscontenidos de pigmentos fueron de un 50% res-pecto a los obtenidos bajo condiciones fuertes,en las cuales el contenido de pigmento rojocorrespondió a más del 95% del total. E ngeneral, la aireación incrementó el contenidopigmentario más que la agitación.

Las evoluciones de la saturación de oxí-geno y del pH en el medio durante el curso deestos experimentos se muestran en la figura 6.Desde niveles iniciales de 90% a lOO%, losniveles de saturación de oxígeno prontocayeron a cero en cultivos sin aireación 0 conaireación débil, mientras que en cultivossometidos a aireación fuerte, el oxígeno cayó

90

González-del Valle ef al.: Oxygen-induced pigment variations in Alteromonas sp.

50I (4

0 0.5 5

Air flow (ml min-‘)50 ,

(b)3 40-

Wz 30 ->2E 20 -.g

a IO-

50Agitation (rpm)

o/o 0.5/50 5/500

Air flow (ml min-‘)/Agitation (rpm)

Figure 5. Changes in pigments 1 (white bars) and 2 (hatched bars) (peaks 1 and 2 in the chromatogram offíg. 1) and in the sum of both pigments (dark bar) from Alteromonns sp. cells under different treatmentswith aeration and/or agitation: (a) aeration, (b) agitation, and (c) aeration + agitation.Figura 5. Cambios en los pigmentos 1 (blanco) y 2 (rayado) (picos 1 y 2 en la tig. 1) y en la suma deambos pigmentos (sombreado) obtenidos de células de Alteromonas sp. bajo diferentes tratamientos deaireación y/o agitación: (a) aireación, (b) agitación y (c) aireación + agitación.

91

Ciencias Marinas, Vol. 26, No. 1, 2000

120-

100-/

80

0”60

a,P 46

20

0

120

100I

80

0”60

,% 400

20

0

120

100 T

580

0”60

aS 40

20

0

A+(4

4

4

-

0 6 12 18 24 4248

Time (hours)

9

8

6

9

8

6

8

6

5

-+(b)

-A-0 6 12 18 24 4248

Time (hours)

Figure 6. Evolution of oxygen saturation leve1 (left panel) and pH (right panel) in the culture mediumduring the agitation/aeration treatments. (a) Aeration: circle = control, square = 0.5 mL air min’, andtriangle = 5.0 mL air min-‘. (b) Agitation: circle = control, square = 50 rpm, and triangle = 500 rpm.(c) Aeration + agitation: circle = control, square = 0.5 mL air min-’ + 50 rpm, and triangle = 5.0 mLair min-’ + 500 rpm.Figura 6. Evolución de los niveles de saturación de oxígeno (panel izquierdo) y de pH (panel derecho) enel medio de cultivo durante los tratamientos de agitación/aireación. (a) Aireación: círculo = control,cuadrado = 0.5 mL de aire min-‘, y triángulo = 5.0 mL de aire min-‘. (b) Agitación: círculo = control,cuadrado = 50 rpm, y triangulo = 500 rpm. (c) Aireación + agitación: círculo = control, cuadrado =0.5 mL de aire min-’ + 50 rpm, y triángulo = 5.0 mL de aire min-’ + 500 rpm.

92

González-del Valle et al. : Oxygen-induced pigment variations in Alteromonas sp.

seems likely that pigment production byAlteromonas cells is related to an enhancementin oxygen concentration. Respiratory capacityhas been shown to decrease strongly during thesenescente growth phase as compared with thatduring the exponential growth phase (Packardet al., 1996), and Kjeldgaard (1963) pointedout that biosynthetic abilities diminish with thegrowth rate. Therefore, higher pigment contentwith culture aging seems to be bound to oxygenoversaturation inside the cell during lategrowth stages as a consequence of a reducedmetabolic capacity and, consequently, sub-optima1 substrate metabolization. Otherwise,since one of the known mechanisms of dis-solved organic removal implies hydroxylationof substrate in cell membrane lipid through theaction of membrane bound oxygenases(Button, 1994), the observed differences inpigment content between the cultures fed withglucose and with citrate suggest that pigmentformation could be related to substrate intake.Indeed, cultures in solid medium also exhibiteddeep reddish coloration after seven days ofgrowth.

Molecular oxygen may inhibit nutrientmetabolization and oxidize membrane lipids(Krieg and Hoffman, 1986; Fay, 1992; Paerland Pinckney, 1996); consequently, survival inthe aquatic environment may rely on the abilityto ameliorate the harmful potentialities of oxicconditions. Indeed, the function of non-photosynthetic pigments seems to be defense_against oxidants and free radicals (Harwoodand Russell, 1984; Margalith, 1992). So, takinginto account that bacteria associated withmicroalgae may have to cope with excessiveoxic conditions due to oxygen released in pho-tosynthesis, the red pigment could be the resultof a mechanism to avoid a possible damagefrom those oxic conditions, either as a directagent or as a secondary metabolite.

In conclusion, our results show that the redpigment production by Alteromonas sp. (strain

inicialmente pero se incrementó hasta cerca de90% de saturación tras prolongarse el trata-miento. En cultivos sin aireación, los valores depH siempre se mantuvieron por debajo de 7durante el periodo experimental, al igual que enlos cultivos control, mientras que los valores depH se incrementaron gradualmente hasta cercade 8.0 en cultivos con aireación.

DISCUSIÓN

A pesar de que existe un número impor-tante de informes acerca de especies del géneroAlteromonas aisladas a partir de muestras deagua de mar natural, pocos trabajos se ocupande especies del citado género que crezcan encultivos microalgales de laboratorio. Además,existe poca información acerca de lospigmentos producidos por Alteromonas, aexcepción de la prodigiosina, la violaceína yla melanina (Harwood y Russell, 1984;Margalith, 1992). También se ha citado lapresencia de pigmentos no carotenoides sinidentiticar en A. citrea y A. aurantia (Gauthiery Breittmayer, 1979). En este estudio se mues-tran las características espectrofotométricas ycromatográficas de los pigmentos mayoritariospara Alteromonas sp., si bien no coinciden conninguno de los descritos en la bibliografia y nohan podido ser identificados. Las similitudesentre los pigmentos I y 2, por un lado, y entrelos pigmentos 3 y 4, por otro, sugieren quepodrían estar relacionados químicamente y, talvez, biosintéticamente.

Cuando se elevaron los niveles de oxígenodel medio se incrementó la producción de pig-mento rojo, mientras que su contenido decreciócuando se retiró el oxígeno del medio medianteburbujeo con nitrógeno. Así, parece que la pro-ducción de pigmentos por Alteromonas estárelacionada con un incremento de la concentra-ción de oxígeno. Se ha observado un fuertedetrimento de la capacidad respiratoria durantela fase de envejecimiento en comparación

93

Ciencias Marinas, Vol. 26. No. 1, 2000

CECT 4800) depends upon the oxygen concen-tration in the medium, which leads to enhancedproduction with culture aging. Therefore,pigment formation is interpreted in terms ofdeficiencies during substrate metabolizationandlor uptake. On the other hand, the redpigment could be involved in a protectivemechanism against excessive oxic conditions.Elucidation of its chemical structure by meansof instrumental analysis techniques may help toclarify this issue; however, one of the mainproblems that we encountered is the achieve-ment of the purity grade necessary to accom-plish these analyses.

ACKNOWLEDGEMENTS

This work was funded by the Agricultureand Fisheries Regional Council (Junta deAndalucía) in a collaboration program with theSpanish Council of Scientific Research (CSIC).

REFERENCES

Andrykovitch, G. and Marx, Y. (1988). Isolationof a new polysaccharide-digesting bacteriumfrom salt marsh. Appl. Environ. Microbiol., 54:1061-1062.

Austin, B. (1988). Marine Microbiology. CambridgeUniv. Press, Cambridge, 222 pp.

Ballester, M., Ballester, J.M. and Belaich, J.P.(1977). Isolation and characterization of a highmolecular weight antibiotic produced by amarine bacterium. Microbial Ecol., 3: 289-303.

Baumann, P., Gauthier, M.J. and Baumann, L.(1984). Genus Alteromonas. In: N.R. Krieg andJ.G. Holt (eds.), Bergey’s Manual of SystematicBacteriology. Vol. 1. Williams and Wilkins,Baltimore, pp. 342-352.

Bell, W.H. (1983). Bacteria1 utilization of algalextracellular products. 3 . The speciticity o falgal-bacteria1 interaction. Limnol. Oceanogr.,28: 1131-1143.

Berland, B.R., Bonin, D.J. and Maestrini, S.Y.(1970). Study of bacteria associated with marine

con la que se mide durante la fase exponencialde crecimiento (Packard et al., 1996), yKjeldgaard (1963) ya apuntó que las capacida-des biosintéticas disminuyen con la tasa de cre-cimiento. Por lo tanto, contenidos más altos depigmentos parecen estar ligados a una sobresa-turación de oxígeno dentro de la célula durantelas fases más tardías de crecimiento como con-secuencia de una capacidad metabólica redu-cida y, consecuentemente, una metabolizaciónsubóptima de los substratos. Por otra parte, yaque uno de los mecanismos conocidos para laeliminación de compuestos orgánicos disueltosimplica la hidroxilación de los substratos en loslípidos de la membrana celular mediante laacción de las oxigenasas ligadas a membrana(Button, 1994), las diferencias observadas enlos contenidos pigmentarios entre los cultivossuplementados con citrato y con glucosa, asícomo las diferencias encontradas entre loscultivos suplementados y carentes de hierrosugieren que la producción de pigmentos puedeestar relacionado con la incorporación de lossubstratos. De hecho, cultivos en medio sólidotambién mostraron una intensa coloración rojatras siete días de crecimiento.

El oxígeno molecular puede inhibir elmetabolismo de nutrientes y oxidar los lípidosde membrana (Krieg y Hoffman, 1986; Fay,1992; Paerl y Pinckney, 1996), de modo que lasupervivencia en el medio acuático podría estarrelacionada con la capacidad para atenuar latoxicidad potencial de las condiciones óxicas.De hecho, la función de los pigmentos no foto-sintéticos parece ser la defensa contra oxidan-tes y radicales libres (Harwood y Russell,1984; Margalith, 1992). Así, teniendo encuenta que las bacterias asociadas con micro-algas podrían tener que enfrentarse a unascondiciones óxicas excesivas debidas al aportede oxígeno fotosintético, el pigmento rojopodría ser el resultado de un mecanismoencaminado a prevenir un posible dano cau-sado por la sobresaturación de oxígeno, bien

94

González-del Valle et al. : Oxygen-induced pigment variations in Alteromonas sp.

algae in culture. III. Organic s u b s t r a t e s como agente principal o como un metabolitosupporting growth. Mar. Biol., 5: 68-76. secundario.

Buck, J.D. (1979). The plate count in aquaticmicrobiology. In: S.W. Costerton and R.R.Colwell (eds.), Native Aquatic Bacteria:Enumeration, Activity and Ecology. AmeritanSociety for Testing and Materials, Philadelphia,pp. 19-28.

. .

Button, D.K. (1994). The physical base of marinebacteria1 ecology. Microbial Ecol., 28: 273-285.

Caldwell, D.E. (1977). The planktonic microflora oflakes. In: A. Laskin and H. Le Chevalier (eds.),CRC Critica1 Reviews in Microbiology. CRCPress, Cleveland, pp. 305-370.

Esther, A. and Characklis, W.G. (1982). Algal-bacteria1 interactions within aggregates.Biotechnol. Bioeng., XXIV: 2283-2290.

Fay, P. (1992). Oxygen relations of nitrogen fixa-tion in cyanobacteria. Microbiol. Rev., 546:340-373.

Fitzsimons, A.G. and Smith, R.V. (1984). Theisolation and growth of axenic cultures ofplanktonic blue-green algae. Brit. Phycol. J., 19:157-162.

En conclusión, nuestros resultados mues-tran que la producción de pigmento rojo porAlteromonas sp. (cepa CECT 4800) depende dela concentración de oxígeno en el medio, lo quelleva a un incremento de la producción con elenvejecimiento del cultivo. Por lo tanto, laformación de pigmento rojo es interpretada entérminos de deficiencias durante la metaboliza-ción o incorporación del substrato. Por otraparte, el pigmento rojo podría estar involucradoen un mecanismo protector contra condicionesóxicas excesivas. La determinación de suestructura química mediante técnicas de análi-sis instrumental puede ayudar a clarificar estascuestiones, si bien uno de los problemas princi-pales que hemos encontrado es la obtención delgrado de pureza necesaria para realizar estosanálisis.

AGRADECIMIENTOSGauthier, M.J. (1976). Morphological, physiological,

and biochemical characteristics of some violet-pigmented bacteria isolated from seawater. Can.J. Microbio¡., 22: 138-149.

Gauthier, M.J. and Flateau, G.N. (1976).Antibacterial activity of marine violet-pigmented Alteromonas with special referenteto the production of brominated compounds.Can. J. Microbiol., 22: 1612-1619.

Este trabajo fue financiado por la Conseje-ría Regional de Agricultura y Pesca de la Juntade Andalucía (Espafia), en un programa decolaboración con el Consejo Superior de Inves-tigaciones Científicas (CSIC).

Gauthier, M.J. and Breittmayer, V.A. (1979). Thegenera Alteromonas and Marinomonas. In: M.P.Starr, H. Stolp, H.G. Truper, A. Balows and-

Traducido al español por los autores.

H.G. Shlegel (eds.), The Prokaryotes. Springer-Verlag, Berlin, pp. 30463070.

Gerber, N.N. and Gauthier, M.J. (1979). Newprodigiosin-like pigment from Alteromonasrubra. Appl. Environ. Microbiol., 37: 11761179.

Harwood, J.L. and Russell, N.J. (1984). Lipids inPlants and Microbes. George Allen & Unwin,London, 162 pp.

González-del Valle, M.A. (1997). Caracterización ycrecimiento de las poblaciones bacterianasasociadas a cultivos de microaigas marinas.Producción de compuestos de potencial interés.Tesis de doctorado, Universidad de Sevilla,Sevilla, España, 159 pp.

Jones, A.K. (1982). The interaction of algae andbacteria. In: A.T. Bull and J.H. Slater (eds.),Microbial lnteractions and Communities.Academic Press, New York, pp. 189-247.

K.jeldgaard, N.O. (1963). Endogenous metabolismwith special referente to bacteria. Annual N.Y.Atad. Sci., 102: 515-793.

Krieg, N.R. and Hoffman, PS. (1986). Micro-aerophly and oxygen toxicity. Annual Rev.Microbiol., 40: 107-130.

95

Ciencias Marinas, Vol. 26, No. 1, 2000

Lemos, M.L., Toranzo, A.E. and Barja, J.L. (1985).Antibiotic activity of epiphytic bacteria isolatedfrom intertidal seaweeds. Microbial Ecol., ll:149-163.

Margalith, P.Z. (1992). Pigment Microbiology.Chapman and Hall, London, 156 pp.

Marshall, K.C. (1989). Cyanobacterial-heterotrophicbacteria interactions. In: Y. Cohen and E.Rosenberg (eds.), Microbial Mats: PhysiologicalEcology of Benthic Microbial Communities.Ameritan Society of Microbiology, WashingtonDC, pp. 239-245.

Mínguez-Mosquera, MI., Gandul-Rojas, B. andGallardo-Guerrero, M.L. (1992). Rapid methodof quantitication of chlorophylls and carotenoidsin virgin olive oil by high-performance hquidchromatography. J. Agrie. Food Chem., 40:60-63.

Mouget, J.L., Dakhama, A., Lavoie, M.C. and de laNoüe, J. (1995). Alga1 growth enhancement bybacteria: 1s consumption of photosyntheticoxygen involved? FEMS Microbiol. Ecol., 18:35-44.

Packard, T.T., Berdalet, E., Blasco, D., Roy, S.O.,St-Amand, L., Lagacé, B., Lee, K. and Gagné,J.-P. (1996). Oxygen consumption in the marinebacterium Pseudomonas nautica predicted fromETS activity and bisubstrate enzyme kinetics.J. Plankton Res., 18: 1819-1835.

Paerl, H.W. and Pinckney, J.L. (1996). A mini-review of microbial consortia: their roles inaquatic production and biogeochemical cycling.Microbial Ecol., 3 1: 225-247.

Reid, T.R., Live, D.H., Faulkner, D.J. and Butler, A.(1993). A siderophore from a marine bacteriumwith an exceptional ferric ion affinity constant.Nature, 366: 455-458.

Riquelme, M. (1996). Fungal siderophores in plant-microbe interactions. Microbiología SEM, 12:537-546.

Solano, F., García, E.. Pérez de Egea, E. andSánchez-Amat, A. (1997). Isolation andcharacterization of strain MMB- 1 (CECT 4803)a novel melanogenic marine bacterium. Appl.Environ. Microbiol., 63(9): 3499-3506.

Sundh, 1. (1992). Biochemical composition of dis-solved organic carbon derived from phyto-plankton and used by heterotrophic bacteria.Appl. Environ. Microbiol., 58: 2938-2947.

Tranvik, L.J. (1990). Bacterioplankton growth onfractions of dissolved organic carbon ofdifferent molecular weights from humic andclear waters. Appl. Environ. Microbiol., 56:1672-1677.

Wratten, S.J., Wolfe. MS., Anderson, R.J. andFaulkner, D.J. (1977). Antibiotic metabolitesfrom a marine pseudomonad. AntimicrobialAgents Chemother., ll: 41 l-414.

96