Ocorrência de bactérias diazotróficas em diferentes genótipos de cana-de-açúcar

10
Pesq. agropec. bras., Brasília, v.35, n.5, p.985-994, maio 2000 OCORRÊNCIA DE BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS EM DIFERENTES GENÓTIPOS DE CANA-DE-AÇÚCAR 1 FÁBIO BUENO DOS REIS JUNIOR 2 , LUCIA GRACINDA DA SILVA 3 , VERÔNICA MASSENA REIS 4 e JOHANNA DÖBEREINER 4 RESUMO - O objetivo deste trabalho foi avaliar a localização e o número de bactérias endofíticas em quatro genótipos de cana-de-açúcar e investigar sobre a possível existência de correlação com os resul- tados apresentados em trabalhos de quantificação da fixação biológica de nitrogênio (FBN). Fez-se um levantamento das bactérias diazotróficas presentes, e quantificou-se a população de Herbaspirillum spp. e Acetobacter diazotrophicus, em genótipos de cana-de-açúcar contrastantes quanto à capacidade de obter N da FBN. De acordo com o levantamento realizado neste trabalho, as bactérias estudadas ( Azospirillum lipoferum, A. brasilense, A. amazonense, Herbaspirillum spp. e Acetobacter diazotrophicus) estavam presentes nos quatro genótipos avaliados e em todas as partes da planta, exceto A. amazonense, que não foi isolado de amostras de folhas. A quantificação das bactérias Herbaspirillum spp. e A. diazotrophicus mostrou não haver diferenças significativas entre os genótipos, e que, geralmente, elas estão presentes em maior número nas raízes. Enquanto Herbaspirillum spp. mantém-se mais estável ao longo do ciclo da cultura, a população de A. diazotrophicus decresce com a aproximação do final do ciclo comercial. Pode-se sugerir que as diferenças entre as taxas de FBN encontradas nos diversos genótipos não é causada por diferenças na presença ou no número das bactérias aqui estudadas. Termos para indexação: fixação de nitrogênio, Azospirillum, Acetobacter, Herbaspirillum. OCCURRENCE OF DIAZOTROPHIC BACTERIA IN DIFFERENT SUGAR CANE GENOTYPES ABSTRACT - The objective of this work was to find out the localization and number of endophytic bacteria in four sugar cane genotypes and investigate upon the possible existence of correlation to the results obtained in some studies about quantification of biological nitrogen fixation (BNF). A survey of the diazotrophic bacteria present in sugar cane genotypes differing in their capacity to obtain nitrogen through BNF was performed, and population of Herbaspirillum spp. and Acetobacter diazotrophicus was quantified. The bacteria tested in the survey were Azospirillum lipoferum, A. brasilense, A. amazonense, Herbaspirillum spp. and Acetobacter diazotrophicus. All these bacteria were present in the four genotypes and were found in all parts of the plants, except A. amazonense which was not isolated from leaf samples. The quantification of Herbaspirillum spp. and A. diazotrophicus showed that there were no significant differences among the sugar cane genotypes and, generally, the bacteria were in greater number in roots. While number of Herbaspirillum spp. remained stable during the life- cycle of the culture, the population of A. diazotrophicus suffer a decrease with the approach of the end of the commercial cycle. It is suggested that the differences in the rates of BNF found in sugar cane genotypes are not caused by differences in the presence or the number of the bacterial species studied here. Index terms: nitrogen fixation, diazotrophy, Azospirillum, Acetobacter, Herbaspirillum. INTRODUÇÃO Quando se aborda o processo de fixação biológi- ca de nitrogênio (FBN) em plantas não-leguminosas, são comuns relatos em que o genótipo da planta exerce forte influência na FBN. App et al. (1986) em estudos de balanço de N no que se refere à quan- tificação da FBN em arroz utilizaram 83 variedades e encontraram grandes diferenças entre elas. Oliveira 1 Aceito para publicação em 7 de junho de 1999. Extraído da dissertação de mestrado do primeiro autor apre- sentada à UFRRJ. 2 Eng. Agrôn., M.Sc., Embrapa-Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia (CNPAB), km 47 Antiga Rodovia Rio-São Paulo, Caixa Postal 74505, CEP 23851-970 Seropédica, RJ. E-mail: [email protected] 3 Bióloga, Embrapa-CNPAB. 4 Eng. Agrôn., Ph.D., Embrapa-CNPAB. E-mail: [email protected]

Transcript of Ocorrência de bactérias diazotróficas em diferentes genótipos de cana-de-açúcar

������������� ��������������������������������������������

��� !"�#$�%&��$�'( #$)�%#$*�' +,#�$) ���

���������������� �������������������������������������������������

������������������� ���������������������������������������������������� ��������������

&)-.������ /�0���1��0��0� ��2�3����������������4�56�����7���1�� ��08������13�0��������9�0����:0����1�������1���57����������0����� �������������;��0<�����1������56��������9��0�1��������0�1�����0� ��2��1���9��0�3���56�1��3�;�56� ��:�����1����0�<���=,�">��,�4����9������0����0�1��� ��08����1��40:3����������0�������9��0�3��9��������9��56�1�������������

������� ��������������������������������:0����1�������1���57�����0��0��0����9��0�?�������1�1�1�� 0��"�1��,�"��%����1����������0����0�����4�1����0��0� ��2����� ��08������091�1��= ��������� ��������� �� ����������� �� ������������������������ ����� �� ����������

�������������>� ��0����������0��� ��� �9�0� ���:0���� ������1�� �� ��� 01��� ��� ��0��� 1�� ����0���;��0� �� ������������ �9�� �6� 3�� ����1� 1�� ���0��� 1�� 3�2����$� �9��0�3���56� 1��� ��08����������������������� ������������������09��6�2����1�3���5��������3���0�������0�������:0�������9����������0����������06������0�����������7���������4����&��9��0��������������������08������������0@����������1������1���9�09�������9��56�1�� ����������������1�������������;���56�1�3�����1����������������1������9�����9�����1�3���5�����0����� 0�;���1��,�"����0�1��� ��� 1������ ���:0���� �6� 8� ��9��1�� �� 1�3���5��� ��� �����5�� 9� �� �7��� 1�� ��08������9����091�1���

'����������1�;�56A�3�;�56�1����0�<���� ���������� ������������������������

���- &"�&��,�%#$*�' ��B#���$�'& #$�#"�%#,,& &"'�)-C$ ��$"&�C&"�'D�&)

$�)' $�'���'2�� /��0����3�02���EF�E���0�3��1�90�02�������4�0�����1��9� ��3���1�2G0�� ��0�������39��9�����������0G������1������0���0��9���02������ ����;��0�����3�����0���0�02���9�0�� 0����1���������091����� 90��9��0�3���0���3� ����������0����3�;�0���=�",>��$��9��G�302��1��40�2��� ��0���������0�����9�����������0G����1�33��������02���������0G�0� 0������0���029�2��",�E�����3��1����1���9��0���3��������������������1� ������������������������

E��� �9��0�3��1�� '2�� ��0���� 0��0�1� ��� 02�� �9��G�E��� ��������� ��������� �� ���������� ���������������������������������1� ��������������������������$���02���� ��0����E��������0���02��39����0G������1�E���39�1����������0��3�02������0����;���0� �������������E2��2�E����0����0�1�3�����3����������'2���9��0�3���0���3��������������������1� �����������������2E�102�0�02���E����������3����0�1�33������������02���9�����������0G������1���������G��02�� ��0���E���������0���9� �����0���H2�����9� ��3������������������������1��0� ���19����02����3���G����3�02���9�09���02����9��0���3� �����������������933����1�������E�02�02�������2�3�02����13�02������������G�����#0�����9����0�1�02�0�02��1�33����������02���0���3��",�39�1�����9����������0G��������0���9��1� G�1�33����������02�����������02���9� ��3�02�� ��0��������������091��12���

#�1�;�0���A���0����3�;�0����1��40�2G�� ���������� ������������������������

���������

I9��1����� 1���������1��3�;�56� ��:������1����0�<���=,�">��������0����6����9��������6� ��9��� ���0�� ��� �9�� � ���:0��� 1�� ����0��;����30����3�9<��������,�"��$����0J����=K��L>�����091��1�� ����5�1��"����9������3���?��9���0�3���56�1��,�"�����4��90���4�����������1�1��������0�������1���1�3���5�����0���������������

K�$���0� ���� �9 ����56� ��� M� 1�� /9�2� 1�� K����&;0��1� 1�� 1����0�56� 1�����0�1� 1� ������ �90� �������0�1�� ?�-, N�

� &����$�O����.�)���� &� �������0�"������� 1�� ����9���1��$� ������ =�"�$�>�� F�� �M�$�0���� 1���� ��)6��9��� ���;�� ��0��� M������ �&�� ����K��M�� )��81���� N�� &�����A� ��3P���� ��� ����

�� ��:����� &� �����"�$��� &���� $�O���� �2�%��� &� �����"�$��� &�����A������P���� ��� ����

������������� ��������������������������������������������

,����%�)� &#)�N-"#� ��0������L

=K���>�� 0� ��2��1� ��� ��801� 1�� 1��9�56��0:�����1��K�"�����������1�1���1���4��0�� 8�����09�1�3���5�������1�@�������0����������1�1��� �� �9�� ��� �3��� ?� ��0� 9�56� 1�� ,�"�.���1���0J����=K���>���9��0�3����1���3�;�56�1��"�

���� �801� 1�� 1��9�56� ��0:����� 1�� K�"���������0�1���� ����5�1��"�����������@������:0����1�������������������0�� 8�� ���������9��2�����1�3���5�����0��������0����1��"��������0��1��,�"��1����1�������:0��1�� ����0��� &�� ��1�5Q��� 1�� ������ )������R%S ������=K��L>�������0������9�0�1������9�1�3���0������:0����1�����2�����1����1�3����0����0�� ?� ���9��56� 1�� ���������� �� ��0����:0������0�����9���0�1���1956�1���08K��T��)�2�0��R�B�0����=K���>���0����9����������������3�;�1���1��"���0�������1��������1�3���0�� �������0��� 1�� 0���� 1�� ��1� ��� ������1�1�������9��3������9��1��%�3���5���1�� ��0� 9�56�1��,�"��1�� ��1

�������:0���1�������0����0�� 8����06�������0����9��1����0�0��1���9�09��1�������1���57����"�;������0���194�1���-�9������0J����=K���>�3���90���4�1�����801��1��1��9�56���0:�����1�K�"��� ����5�1��"��������9��0�3���56�1���0�;���1�,�"��%�4�1�3���0��� ���:0���� 1����������� ���3���90���4�1�����9������1������56�1���0�;���1�,�"� 3�� ����0�1�� ��0�� �� ���:0�����U�F�0�9=������������>�����2� �1�������������J������)�JM��KK���������0�����������81���1����0�� 9�56�1��,�"��9��������L�T�1�00���1�"���9��9��1� ����� ����0��� ��� ���56� ?� ��J�M����"���L�M���#$�����K����)��MK�M�����)��M����K���3��������0�1��� 0�;��� 1�� ,�"� ��� 0�� 1�� ��T���� ���:0���� �29���� =��� �������>� �� ������=�������������>��6��2�������� 0����T�1�00��1��"���9�9��1��������0��1��,�"�� ��9�0�1������2��0���3��� 0�1����)���2�=K���>���9��0� ��2��1� ������� ��� � �801� 1�� 1��9�56��0:�����1��K�"�� ���9�9�����0� 9�56�1��,�"1�� L�T� ���U�F�0�9� =��� ���������>�� ��T� �����������������T�����29����=����������>�&;������0������9��3���90���4�1���1�3���0��

��01������0�� 8����1�������3��0�����0����� �����0���1�1��1��,�"��������0���1�������1���57����� 9��2���R� 9��2���=K�MM>�������������0���1�1�1���1956�1�����0�����=$ $>������4�������0��0��

���������0����0��������1���������1���1�1��������0�������0��0�����09 �1����� ������6�1��;��<�� ��;������������1����0����1�3���0�����1�1��1��$ $��������������1�1��������������091�1��� 9��2����0J����=K�M�>�0���������1<������1���9��1�3����5�������0������3�9�������0���1�1��1����0�������'� ��2��1� ��� 0<�� ����1�1���� �� �90��� 1�����0�����9��������1�1������L��M�3�;9������"�����1�1�����2��� =K�M��µ��1��">�1��9����90��� ����1�1���� 01��� �9�1��� 1���������6���8��1������1�3���0���11�G�=K���>��9�����9��������0���0����1�� �

0��9��������3����0����0� 9�56�1��,�"�������0��������1�1��� ���������1�������1���57�����1������9��1�����������1�����2����0��������56�1��������1�� �����1�5Q���1�� ��;��������1��"��V������� ���9���������1���57���8���0����0�2�0�4��0���1�� �0���9�����94����0�1��19������1�1��������� ���56��<������������1������� ���1�1����,K����9���9���0�������� ���1�1��1�����56�1������0���0�������0��9�����$�� ��08���� 1��40:3����� ��13�0����

��������������������������������������� ��������������������������� �����@�������������0��0�;���1��,�"� ����1�������9�09��1�������1���57����=�11�G��K���>��-������������;�����56�������1�3���5�������0������������1��������,�"�����9��09���������3�0�1���9������1�1���1�3���0����������0���������0���0�����1��0��0���������56�?����9��56�1�� ��08������13�0�����"��0��0� ��2�� 9��9���� ������������4�56

����7���1�� ��08������13�0���������9�0�1�3����0��� ���:0���� 1�� �����1���57���� �� �����0���� �������������;��0<�����1������56���������9�0�1��������0�1�����0� ��2��1���9��0�3���561��,�"�

������ ���������

������������������������������������������ ���!"�������#��!��$����������%��%�&'���

,��3��0�9�������0����0�������������������5��1�1�3���0��� ��08����1��40:3���������9�0����:0����1������1���57����$������0���90���4�1���3����9�1���1�9�� �;������0� =��� ���>� ����0�1� ��� ��� �14:���V����2�$�����=�V$>��8���#0��9�����������4�1����@���;������0���1��&� �������0�"�������1������9����1�

������������� ��������������������������������������������

��� !"�#$�%&��$�'( #$)�%#$*�' +,#�$) ��M

$� ������=�"�$�>��������:0�������0�1��3��AU�F�0�9����J������)�JM��KK�������������3�����0����������56�?�,�"�1����1������;������0�1��-�9�����0J����=K���>�����29�������0�1������������3�����0��1����:0������091�1�����0�������0� ��2�

$�:����� 0��1����������������1�����1������9��00��1��0<�����0������������9�����������5��1��� ��08���1��40:3�����������0���1����4�����������3�2���1���1��9��1�����:0������091�1���,���90���4�1������1���9�0���������:��1�������1�56�1��"������ �A�WC#������������0��� ���� � �������0� 1�� ����������

�������������X�WC#������ �������������������X�", ����� �����������������9� ������������������X��N", �����������������������=%S �������0J�����K����>�$��0���1��K����=����1����08���3����>�3�������1�����@�9�����0���0�09�1����������W�1����956���������1��9�1�����������0���,���90���4�1������1��9�5Q���K����K������K��L��%����1��1��9�56�3����0��1�������90���1���K��W������9��1������3������������1���9�09�����3����� 3��� ���9 �1�� �� ��Y�� �� ��� ��� �� �� M� 1����� ��������0� ��0�����3��������1����3����1���������������0�1�������9�������0���0����

���3����������������0����0�����������1��9��56�1����1��9��1��������3���90���4�1�����������������9���������������:��1��$�:�������9 �56�3���0��1�������90���� ����1����������:���1����0���0��1��3��������������3���56�1���3�����1����8�9����&�0���������3�����3���90���4�1�������������������������������:��1��������1�������:��1���������1�� 1�� �;0�0� 1�� ����19���$�� ��O����� 3��1��� ��������:��1��3��������1��������������������:��1�����:������1�1�����9 �56��3�������1������������1��������:��1�� �0�0��9� �0�0����= ���������������>������9�3���56�3�����=%S �������0J�����K����>�

$� ����56�1���3�����1����8�9����� ���������:0����1����0��0��1��3����������3�����1�����O�����������������������3����=WC#����WC#��", ���N", >�����������= �0�0���� �0�0���>�3���90���4�1���������9����� ��08��������1��������1��9��1�����:0����1�������1���57���

()����"���&*�� ��� ����������� ������ ������ ������ ��������$$+����#��!��$����������%��%�&'���

,��������0�1�9���;������0����0���9��1�������0�� �1�� 3��� ����0�1�� �������� �9�0� ���:0���������1����0�����0�����0���9�����9���1�����Q���1����;�L�;�����������1�1��1������������2�1�������V$��8���#0��9����%����1��������@�����1�������0��3��19 �1�������U������.��������90���0���=����9��1��� 1<��>������9��1�1��3�����0�1�����������1�1��1�

�����������9���7����3�0�����0��0������������0�1������0���3�����"�

��1����2��;������0���3��1�� ��������������9�����/�������9����3�0����1����=���:0���>�;���=���0���1������0�>�;���=���0�����>�����9�0����0�5Q�����1��9��1���9�0� ����3��1���1�1�����9�0��������1������;�������������1�����0��2���1�������0��08��39�11�0���9�����3���1�������������4���1����1�����:0����$���0������0�1���1�������0���Z���4�������� ����������� ������� �� 3�2��Z� 3�������1��1��� �9 �������� 1����:0���������8����1������0�����9 ��������1���� ��$�����0���3���3��0���������M���K����������:�������0��

������ 0��56�1��7���1��� ��08����������0��������0��� 1��� ����0��� ���0�1���� 90���49���� �� 08������ 1"7���.������@����=".�>������0��0������4������1��9�5Q�������1���=�46�K�>�1��K�����08�K��M��1����1����0�1������0������9��1����������������:��1�����"�=WC#������ ������������������N", ���������������������>����7�����9��������3�� 0�1�����9��1��0� ����1�.���1G��0���1������ ������7���1��3���������0���������1��1��9�56�=%S �������0J�����K����>�

���0��0�����0�0��0����=��@�����1�����[�������0��0���1��81���>�3���3��0�������90���4�56�1�������.)'$'��=.��2�����)0�0��-������0G>�

���� �����������,����

��������������������������� ���!"��������#��!��$���������%��%�&'���

�����9�0�1��1������0����0�1���<�����1� ��08����1��40:3�����������1�������9�0�1�3����0��� ���:0���� 1�� �9�09�� 1�� �����1���57��='� ���� K>� ��0���� �� �����5�� 1��� ��08����� ��������� ������� �� �� ���������� ��������������������������������� ����������

������������������9�0����:0���������01�������0������0�1���=��4�����������3�2��>������;���56� 1�� �� ����������� �9�� �6� 3�� ����1� 1��3�2���������29���1���0<�����0���$�����3��\<�����1���������0�� ����1����

01������ ��08������091�1�������9�0����:0������9�������4���1�������0�������9�1��1��������3�2���������0������0������1����������09�1����� ��08����1��<��� ����������N@������������

����� �� �� �������������� ������0���� 3��\<����1���������0������2��<����������0���1������0����3������ ��08��������1�����������7����������������0����� ��08����1��<���������������

������������� ��������������������������������������������

,����%�)� &#)�N-"#� ��0�������

'1������ ��08������091�1���/@�2��������1� �����1������������56��������0���1�������1���57����=���1�����0J�����K��M>�$������5��1�� ��08����1��<��� ��������

���01��������0���1�������0���0�� 8��3�����0�1������1�����0J����=K��M>���N�����R���������=K��M>�$�����1�������������������������������0�����1��1����� ��08����1���4�3��������4���1������������0�����4����1�������56������<���1��9����� =%S ������ �0J����� K��� X� ��F�RV��1���G1����K���>�����9������0������1���0��� 8�������13�0��������6�����0�1�������0���1���4��� ����0�� �8���1��1������� ���8����� =���1����0J�����K��M>�

���0��� ���������5��1�� ������������������4��1�����0���8���1������0����6������3��\���0��X�����0��0��������=K���>����091��1�������1<������1�� ��08����1��<��� ������������1�3����0������:0����1�����2�����09��������5��1����� ���08���������1����0������0���$� �<����� 1�� ���8����� 1��40:3����� 1�

�������������� ������������������0���1�������1���57���� ����4��1� 0��0� � ��0��� 1��� ��4���������0���8����/@�3����������0�����0�1��=N����R����������K��M>�������9�0�1��1�����0:����1�����0��� �9�� ���:0���� ��0��0��0��� �9��0� ����2�1��"�����3�;�56� ��:�����1��"��������0������������1�����01������ ��08������091�1���

��4�� ���� ,�2��

(����1�����0� (����1�����0� (����1�����0�

���08��

� � � � � � � � �

C��:0���U�F�0�9 ����������� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K���

��������� K��� K��� K��� K��� K��� K��� "% K��� "% ������������ K��� K��� K��� "%K "% K��� "% "% "%���������������� K��� K��L K��� K��� K��� K��� K��� K��� K���

��������������� K��� K��� K��� K��� K��� K��� "% K��� "%

C��:0����29��� ����������� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K��� "% K���

��������� K��� K��� K��� K��� "% K��� K��� "% "% ������������ K��� K��� K��� "% K��� "% "% "% "%���������������� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K���

��������������� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K���

C��:0���)��M��KK��

����������� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K��� "% K���

��������� K��� K��� K��� K��� K��� K��� "% "% K���

������������ K��� K��� K��� "% "% K��� "% "% "%���������������� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K���

��������������� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K��� "% K���

C��:0����������

����������� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K���� K���

��������� K��� K��� K��� K��� K��� K��� "% "% K���

������������ K��� K��� K��� K��� "% K��� "% "% "%���������������� K��� K��� K��L K��� K��� K��� K��� K��� K���

��������������� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K��� K���

��-� ��.+ ��������������������������� ���!"����������/ ��0���1������"�12������3)�������"��������#��!��$���������%��%�&'���0����������$����������1����4�������$!���������5+������1������*����"��������6�������1�����1)�&*������������������$�������+

K "6�1�0��0�1�

������������� ��������������������������������������������

��� !"�#$�%&��$�'( #$)�%#$*�' +,#�$) ���

()����"���&*���������������� ������ ������ ������ ��������$$+����#��!��$����������%��%�&'%���

&3��0�1����:0��

"6� 29��� 1�3���5��� �����3���0����� �9��0� ��7���1�������������������9� ���������������

��� ���56� ��� �9�0� ���:0���� ��091�1��� '��� 8���6�3��� ����1���1�3���5��������9��561���������������������1�3���0�����0���1�������0��9�8����1�����0��=,�����K����>��'������9�0�1�������� �9���� �9�� � �7��� 1�� ��08���

= ����������������9�����������������>�������0��������1��9��1�����:0�����6��;���������1�3����5�������0�1����9��0�?���0� 9�56�1��,�"���� �� �90�56� ��0����1�� 1������ ����0����B���0J����=K���>��0� ��2��1�����4��1����0����9����0���������1�1�����091�1����6�2�����1�3����5��������3���0������9��0����7���1��� ��08�����1��40:3�����������1���&��39�56�1���6�0������1� ����1���1�3����

5�����0����7���1�� ��08���������0�������9���2��:0������1�������9���1��������;�������������56� ��0�� �� ���:0���� 1��� ����0��� ��� ���56� ?�

7�8+�.+ �#������� ��� �'����� ��� ��1)1��� ������������������� ������4�5�������� ������

�$$+� 4-5� $��������� ���� ��/ ��� ��� 3)����#��!��$��� ��� ����%��%�&'���� ���1������ �����1���������90�:���.;��������$!����$1�����+

W��1���1���8�9������K ���08���3����

=�>

K

L

M

� M K�

(����1�����0��=�����>

U�F�0�9 �29��� )��M��KK�� �������

=$>

K

L

M

� M K�

7�8+�<+ �#������� ��� �'����� ��� ��1)1��� ������������������� ������4�5�������� ������

�$$+�4-5�$����������������������1������3)����#��!��$��� ��� ����%��%�&'���� ���1������ �����1���������90�:���.;��������$!����$1�����+

W��1���1���8�9������K ���08���3����

=�>

K

L

M

� M K�

(����1�����0��=�����>

U�F�0�9 �29��� )��M��KK�� �������

=$>

K

L

M

� M K�

������������� ��������������������������������������������

,����%�)� &#)�N-"#� ��0�������

0�;���1��,�"�����0���������0�1��A�K>�������������0��1��7�������������1��1��40:3�����2@������ ���1�1��1���9������0��56�����0��;���������������/��1�3���0����0�������:0����1������0��������0���)������R�%S ������=K��L>�)���0�R�N�����=K���>��3������9�����������9���3�0������� ����������������9�������� ����5��0����1������ ��0���8��;0������0��1�����1�"���9�09��1�������1���57����9�� ���;�����8�3�0�1�����������������������������9���1��19��� ��08����1��40:3�����1������<�������������0�� ��9���� 1�� 1��5�� ��2���1�� ��� ��0��

���9��1�� ��� ���:0���� �9����0������ =��������0J�����K��M>��%������������0��0�� 8���9�����3���<������30����080���������;��<�������90�����������������0<�����?����1�5Q���1��3��@��������0��90����6�����0���0���������1��������:0���1�������0���9���1���������0����3�9<���������3���<�����1��3��;�56�1��"�������� ��08����������1�������0��X��>�$1�����1�1�� ���80���� 1�� ��08���� 1��40:3����� 1����������8�����������1���������:0���1�������0��=��]���0J�����K���X��� ���0������K���>�0�� 8�1�����������1��1�����9��3�0����0��0�������������������1�3���5���������56�?�,�"�����9��

7�8+�=+ �#������� ��� �'����� ��� ��1)1��� ������������������� ������4�5�������� ������

�$$+�4-5�$������������>$���������1������3)�%����#��!��$����������%��%�&'��� ���1�����������1���������90�:���.;��������$!����$1�����+

W��1���1���8�9������K ���08���3����

=�>

K

L

M

� M K�

(����1�����0��=�����>

U�F�0�9 �29��� )��M��KK�� �������

=$>

K

L

M

� M K�

7�8+�9+ �#������� ��� �'����� ��� ��1)1��� ������������������� ������4�5�������� ������

�$$+� 4-5� $��������� ���� "�12��� ��� 3)����#��!��$��� ��� ����%��%�&'���� ���1������ �����1���������90�:���.;��������$!����$1�����+

W��1���1���8�9������K ���08���3����

=�>

K

L

M

� M K�

(����1�����0��=�����>

U�F�0�9 �29��� )��M��KK�� �������

=$>

K

L

M

� M K�

������������� ��������������������������������������������

��� !"�#$�%&��$�'( #$)�%#$*�' +,#�$) ��K

09��1�������1���57��X��>�%���������� �1��9���7��� 1�� ��08���� ��2���1���� ��� 0�� 8�� �7��� 1�� ��08���� �9�� �6� �9�09@������ 8��9�0���9����&�0��������9�������1��K�T�1�00���1�������������;��0��0����6���2���1��=$�����0J�����K���>�����0��0��90������ ���1�1����9��0��� 8���6��1�����1����0�1����1������0����������1������������5��1��9���9������ ��08�������1��6�1����0���(�3�0��9����3�;�56� ��:�����1��"��������0���1�

�����1���57���8�9�������������;����9���������� 9��� ����� 1�� 3�0��� �������1�� ��� ���:0��� 1��� ����0��� �� 1��� ��08���� ������1��� ���0����$��2��:0������9���1���������1����������������1��������/9�0�� �� ���1�����90����9�����������������������0�1���������9�����������������1����3��O������9������������������56�

&3��0�1�����0���1������0����8����1�����0�

%�� ����� � � ��� � � � �� � ��9��5Q�� � 1� ����������������������������������3�����0��0��0������0�� �9���������� ��4���� ���6� �3�������������5Q���������56�?��90�����0���1�����0��='� �����>�� ����=K��K>�0�� 8��������09����9�0�1�� 1�� �9��0�3���56� ��� ���56� ?� ���8��� ������������������������1���57��������������1������0��������4���������0���������7���1� ��08���� ��� ���56� ?�� 90��� ��0��� 1�� ����0����������=K��M>�����0� ��2�1�������0����0�1��������5��1����������������������1�3���0��������1�1���1�������1���57���� 0���������7���1�����1���������0���1�����4����'������9�0�1�����1������9�����������0��8�������4������0����3��

�������1�� �����4�56�1������ ��08�����$��1���6����� �� ������9���������������4�����3�����������0�� ���� ��4���� �8��� 8� �� �1� �9�� � ���0����1��9���8�9�����1��1���1��30��������1����194�1�������0���8����������������0���6�90����4�1�������� ��08���������9��� ����<������$�8�1����� 2@� ���0�� ��1����1� �9��� ��� ��0��0�� ��0� ��2��1��N������0J����=K���>���)���0�R�N����=K���>����0������56�1������ ��08������������0��8����0��8��1�������1�;��������/��1�3��9�0�1�=%����0J�����K���>��'� ��2��1�����������1�1��1�������1���57���.�1���W9�����N��L������������90�������0�����9���9��1� ����������������3�����0194�1���;��������9�9���30����56�����8�9����1���������������������0�1��9�����������2���9��1����������1���3�9;������1��� ��08������0��8��1�������8�9�����%����0J����=K��M>����1�1���90���� �� 1�3��9�1�1�� 1�� 0������56� 1� �����������������0��8��1�������;����@0������� ���� ��� ��091�� ���0O����� �� ������� 1�� 0�������56�1�����0������0��9����1���@0�;����9�����61���8�9����1�� ��08�����������1�;������1�������0����19�0���1������1�1��N��L�����$�1�3��9�1�1��1�0������56�1��� ��08������������0���8����1�����0�� 8�����9���1����4Q����������7�9��1�� ��08����������4������ ���56� ?� 8���� 1�� ���0��� ���� �

�9�0� ���:0���� ��091�1��� �� ��9��56� 1���������������������0����������0������0����0@���������� �� ��9��56�1�� ���������������� �3�91��8����������3���0����������;���56�1�3����1��������������1���9�09��=���0�����K�������>='� �����>��$����1�5Q���������0�1��������������0�����3�����1��������������3�0������9��56�1�

K V��������9�1��1����0���1�3���0���1�3�����������0��0��'9F�G����T�1��� � ���1�1�X�1�1���3���0���?���81����1���9�0����0�5Q����3���0������9�0����:0��������0<��8�����1�����0��

��0���1������0� ���������������=W��1���1���8�9������K�1����08���3����>

���������������=W��1���1���8�9������K�1����08���3����>

��4�� ��LK$ ����$�����1���� ��K�� ��MM�^�����1���� ����� �����,�2�� ��K�� ��K��

�V�=T> ����� �����

��-� ��<+ �#�����������'����������1)1����������������������� ������������� ��������$+�$���������������������$���������$1������������%��%�&'�������1��#������?$��������.+

������������� ��������������������������������������������

,����%�)� &#)�N-"#� ��0�������

�������������������0��R� 9��2���=K��K>���0������9������9��56�1�������������1��40:3�����������1���57����3����3�9<�����1��8����1������8� �����@�����0�� 8����9�����0�1�3����:���1���9�09��������0����3�9<������ ��������������������

,��, ��@��

K�� ��������� ������� �� ��������

����������� ��������������������� ����������

�����������������������������������06�������0���0��0�������:0����1�������1���57���1�0���3������0����9��0������:0����6��3�����0��������56?�3�;�56� ��:�����1����0�<����������;��56�1�� ���������������9���6�3�

����1�1��3�2������� ��08������06������0��������4�����������3�2���1�������0����������7������9���������1�� ���������������

������������� � ����� �6� �6� 1�3���0��� �����:0���� 1�� �����1���57��� ��0��0��0��� �9��0���0�������1��3�;�56� ��:�����1����0�<����������7������9���������1�� ���������������

��������������������6�������������4����������56�?��90�����0���1������0�����$� ��9��56� 1�� �� �������������� �3�� 9�

1��8������������;���56�1�3�����1���������������1���9�09��1�������1���57���

�8����,������

$�������� �"&_�##`,#"&�����$%�'�###���9�3������9����������0����0��0� ��2X���%����1�)��0��,8��;���������56�1�� � ����3���

��7��A�,���

$.$""�� �X�W-%H#C��H�X�)�BW&#,& ��U��B��#1��0��3���0���3�9��9�09�1� ��0���A����2����������0��F�3����9��� 0�;����0��������B���H��2���0����L������L���L���K����

$����$�$�X�H$'$"$�&��#�X�V&"'- $��'�)�X�� $V��.�X�N- &D����%��'2���33��0�3��9�0���0�1���1�E��1��������0������02����0���� �������3�3�1�1��������1� �������� ������C� �"� �������+� D�)���1�.�1�������K�K�������������K��L�

�$W%$"#��N�#�X��$ -)���W�X��$W%$"#��V�W�%�X�C�#�)� �X�%a�& &#"& ��N�� ����0��1������� ����",E�02� ������9��� ����0��� ���1� -��1�#C� E-���2������C��&���31�����������KK������K��M�

��%%&D�� �.�������������0����3�;�0�������9�������A�� F�G� 0� �����0�����G� ��� ��� �39��� �19�0���,������1������B�����F1������������������ �0����K������L���M���K����

� �&U�� $�� ���1�X� V$"%& W&D%&"�� N�� ����E����0����3�02�� �������������0�0�������0���,������1������B�����F1������������������ �0����K����������LL��K����

��.�&��.�W�X���")��N�W�X�)&)��-&�� �X�.$ '#"�N���� &���0�2�0��� 0���3�� 3�� ��G��G����1����� 0� ��0����9���� �2��0�A� �� ��E� ��021� 0�2���0��4�� �9�0���9�� ��4G��� ���0G���� 3�������� �0�������$$1���� ����������������1�������1�#C��H��2���0�����L������L�����K����

��)'$��N�.�'�X� -)�B&W��$����)�����������0��� ��02����� ������9��0����3��9������������0���#�AV�)&������X� -)�B&W��$���� =&1��>�������������

K V��������9�1��1����������0������7��9����������9���������7��9�����������2�����6��6������3���0������0��1�3���0�������0��0��1��'9F�G����T�1�� � ���1�1��

C��:0��� .81�����0���=��������:�������0�>

U�F�0�9 �29��� )��M��KK�� �������

=W��1����8�9������K�1����08���3����>

� ����� ��KM� ����� ��K��� �����$M ��M�� ��M�� ���M� ��K�M� �����$K� ���� ���� ���� ����� ���L��

��V�=T> �����

��-� ��=+ �#�����������'����������1)1����������������������� ������$�������������3)�����#��!��$���������%��%�&'�������1������������1���������90�:���.;��������$!����$1�����.+

������������� ��������������������������������������������

��� !"�#$�%&��$�'( #$)�%#$*�' +,#�$) ���

�<�%�"�?����������� �0��A�� ���K��K���������K���

KK��

%a�& &#"& ��N�X��$W%$"#��V�W�%�X��$W%$"#��N�#�,�������1�����������"������������������ ���!"�������$1�������*��1�#)�����������������A�&.� $�$�)�#�`�#0��9���A�&� �����"�$���K����������

%a�& &#"& �� N�X� �$W%$"#�� V�W�%�X� &#)�� V�.�&�1�2G0�����9�����3�1��40�2��� ��0���� ��������9���9�� ����� #�A� ,&"% #U�� #�X� %&WC$WW��� .�X� V$"%& W&D%&"�� N�X*$.$ ��*D��.��1���=&1��>������ �������G�������1������������#��������������A�)�������K��� �����K��

%�"C�� *�X� �$""D�� .�N�X� .��-WWD�� .�&�X ��� &%��� .� �X� �$�$%#WW$�� ��,�X� '&C$�� &�X� �%()�� �� $� ��0����3�;�����1�2G0��3� �9������� �0�����F1����F2C���1�#C� �F���������K������KK���KK�M��K����

%�"C�� *�X� .��-WWD��.�&�X� �$""D��.�N�� %�� ����������� �������������� ����� ��1����� ��� 02�;G���� 3� �9������� �0���b� )��� ���0������ ��1�2G���������1�0�������1���"�-����C��W�1����������K�M�K����K��M��

B�W.�� W�B�N�� ���X� "#&-H&"B�V&�� ��� ���X)'&&"B�-%'��U�X�V$"$U&"��B�X�VW$))$U�U�� �2������ ��� 02�� 1���0���� 3�;���� ��0������9��0���3�����2�4��2��������3�9����1� G�����9�0������ 0���� ��1� ���� 0G���� #�A�B&C$*#��"�$�X,$D&*�� .�X� .�"#��� .�� =&1��>�� #�A#"'& "$'#�"$W� )D.��)#-.� �""#' �C&"�,#_$'#�"�H#'B�"�"�W&C-.&)�L���K�����#��������������#���"�?������B��2����%1�%#)���������A�'2��$�������-������0G�������������K��������M���M��

N$.&)��&�U�X��W#V$ &)��,�W��#�3��0�����1�����4�0��3� �9��� ����� ��1� 02�� ���������9�� ����0�� G��1�2G0���1��40�2���,������1������B�����F1����������������� �0�����KM����MM�KK���K��M�

N$.&)��&�U�X� &#)��V�.�X��W#V$ &)��,�W�X��$W%$"#�N�#�X�%a�& &#"& ��N��#�3��0���3��9�������� G02�� ��0����3�;���� ��0��9�� ����������

���������������D�)���1��"��?$��������1�-����C��;31����������M�M�MLL��K����

.# $"%$����B���X�- I-#$C$��)�X���%%&D�� �.�)����0��� 3� ��0G���� 3�������� ������� 3������0�1� ����������0����3�;�0���9�����02��K�"��0��� 1��90��� 0��2���9��� ���1� -��1�#C� E-���2������C��&���31����������L�M�LL���K����

�W#V$ &)�� ,�W����?������0� ���1�#��� ����������������1�����������"��&*������1��� �&*�����$1������������%��%�&'����4����������$+�2/�����5�$����������������"/���������#����������� �������#0��9���A�-, N��K��M��������'����1��%90�1�

�W#V$ &)�� ,�W�X� N$.&)�� &�U�X� �$W%$"#�� N�#�X%a�& &#"& �� N�� #�3��0��� 3� �00��1� �0���1��������9����0� �����1�����0��0��9������������0��� G�02����1�2G0���1��40�2����������������BF2C��1�#�������� �1����C6���0��2�����K�������M����M��K��M�

�W#V&# $�������()����"���&*����� "�?�&*�����1!#�����������#������������ �4�����������0� +5���)���%���� #0��9��� A�-, N�� K����� ������%����0�56� 1�.��0�1�

�& &# $�� N�$� ��-��������� �����!"����� �� ")�#��������/ ����� ���)��)1����� ��� ��"�������#��!��$��������12��4��������� +5��W�����A�-,W$�K�����KK����%����0�56�1��.��0�1�

�#c& ���%�X�.$ 'd"&*��&�X�)&W$"%& �� �U��C���0��1�����0G� ��1� ���0���2���� ����� ����0��� 3�������������������� ��������������$$1�������������������1��������1�#C��H��2���0���������������������K����

&#)��V�.����$���������1!#�������"����1!#�������������%���� "�?������ ����

<������������ ������ ������

#0��9��� A� -, N�� K��K�� KK���� %����0�56� 1�.��0�1�

-)�B&W�� $���X� -)�B&W�� �� V���0��� 1�33�������33��0������0���������0���0G�����4��2���3��9��������F��������#��"���������������1�������C��)%#���,���������1�#C���������K��K�K��M��K�MM�

-)�B&W��$���X�V#�'� #$�� �W�X�)$W$'#��&�X�B&"#)�D�� "�0���� 3�;�0��� ��� �9��� ����� =��������

����������>�� #�A� C $"B$WW�� V�� =&1�>�������������1� ��1�� �"� �����#��%"�?��#� �1)�%#������1#���������C������������������-������� A)E�1��2�"�09���)������� �����2��9������K�M������M�����

)$W�.�"&��#�C��1�X�%a�& &#"& ��N��.��4�����0G���33��0����02���������0� ������������9��0���-��1�#C�����7����1��C��"����1�������������K����K���K�L��K��L�

)�BW�'& �� .�X� B$ '.$"�� $�� &�1�2G0��� ��1�93���� ����4�0��� 3� E2��0� 0�� =�������

�������>� G�1�33���0� ��������������������0����

������������� ��������������������������������������������

,����%�)� &#)�N-"#� ��0�������

�091��1�E�02��0���������3�������������0� 1�����C��������� �2�0����������K���KM���K����

)#"CB��.��&�0���0���3���0����3�;�0��������������

����� G� K�"� 1��90�����021��D�)���1��"��)�1����#���)1�)�������-��1�#C��"�E�%��2�����������K���K����

)� &"'��N�#�X�N$.&)��&�U��"����3�;�0��� G���1�2G0��

��0���A� �9��0���� 3� ��0G� ��1� ���0���

#�A� ,&"% #U�� #�X� %&W� C$WW��� .�XV$"%& W&D%&"�� N�X� *$.$ ��*D��.�� 1�=&1��>������ �������G��������1������������#��%������������A�)�������K�������K�����

- I-#$C$�� )�X� � -*�� U�B�)�X� ��%%&D�� �.���0� 90��� 3� ��0���� 3�;�0��� 0� �9��� ����A��0����K�� ��1� ��0���� ������� ��0���0�������1��������������C� �"��������+� D�)���1��.�1�������L����K���KK���K����