Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V21 ploča – 96 72561

5 ploča – 480 72562

KOMBINOVANI KIT ZA SKRINING NA ANTI-HCV ANTITELA I VIRUSNI ANTIGEN HEPATITIS C VIRUSA U SERUMU ILI HUMANOJ PLAZMI KORIŠĆENJEM TEHNIKE ENZIMSKOG IMUNOESEJA

1. PREDVIĐENA NAMENAMonolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 je kvalitativni enzimski imunoesej za detekciju infekcije hepatitis C virusom (HCV)koji se zasniva na detekciji anti-HCV antitela i antigena kapsida u serumu ili humanoj plazmi. Ovaj skrining test na hepatitisC mogu da koriste dijagnostičke laboratorije i banke krvi.

2. SAŽETAK I OBJAŠNJENJE TESTAHepatitis C virus (HCV) je (+) RNA virus (9.5 kb) sa omotačem, iz familije Flaviviridae, kod koga je identifikovano šestglavnih genotipova. HCV je prepoznat kao glavni uzrok non-A i non-B virusnog hepatitisa. HCV infekciju karakterišu akutnii hronični oblik koji može da dovede do ciroze jetre i hepatocelularnog karcinoma.Serološki dokaz HCV infekcije se može dobiti skrining testovima krvi na HCV antigene i/ili antitela i/ili RNA. U poređenjusa skrining testom samo na anti-HCV antitela, korišćenjem kombinovanih skrining testova za anti-HCV antitela i antigenHCV kapsida može se skratiti period serološkog prozora i unaprediti otkrivanje infekcije.

3. PRINCIPI PROCEDUREMonolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 se zasniva na korišćenju čvrste faze obložene prečišćenim antigenima: dvarekombinantna proteina iz nestrukturnog regiona (NS3 i NS4) i peptid iz strukturnog regiona (kapsida) hepatitis C virusa, imonoklonskog antitela na kapsid hepatitis C virusa. Tečna faza sastoji se iz dva konjugata. Prvi konjugat (R6) se sastoji odbiotinilovanih mišjih monoklonskih antitela na kapsid hepatitisa C. Ovo monoklonsko antitelo ne reaguje sa peptidimakapsida korišćenim u čvrstoj fazi. Drugi konjugat (R7) je mešavina mišjih anti-humanih IgG antitela obeleženihperoksidazom i streptavidina obeleženog peroksidazom.Procedura testa uključuje sledeće korake:1) Konjugat 1, uzorci koje treba testirati i kontrolni serum nanose se u bunarčiće mikroploče. Ukoliko su prisutna antitela na

HCV, ona će se vezati za antigene fiksirane na čvrstoj fazi. Ukoliko je prisutan antigen kapsida hepatitis C virusa, ovajantigen će biti vezan od strane monoklonskih antitela kojima je obložena čvrsta faza i biotinilovanih monoklonskihantitela na antigen kapsida hepatitis C virusa (konjugat 1).

2) Nakon inkubacije na 37°C tokom 90 minuta i koraka ispiranja, u svaki bunarčić na mikroploči dodaju se konjugat 2 kojisadrži anti-humana IgG antitela obeležena peroksidazom i streptavidin obeležen peroksidazom. Ukoliko je prisutanhumani IgG nakon što je reagovao sa čvrstom fazom, konjugat sa anti-humanim IgG se vezuje za humana antitela.Konjugat peroksidaza/streptavidin se vezuje za biotin iz konjugata 1 ukoliko je antigen HCV kapsida prisutan u uzorku.

3) Nakon 30 minuta inkubacije na 37°C, nevezani enzimski konjugat se uklanja korakom ispiranja i prisustvo kompleksaantigen-antitelo-peroksidaza se detektuje dodavanjem supstrata.

4) Nakon 30 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi (18-30°C) i nakon što je reakcija zaustavljena, vrši se očitavanjespektrofotometrom na 450/620-700 nm. Apsorbanca izmerena za uzorak omogućava detekciju prisustva ili odsustvaHCV antitela i/ili antigena kapsida hepatitisa C u uzorku. Intenzitet boje je proporcionalan količini HCV antitela i/iliantigena kapsida hepatitisa C vezanih na čvrstoj fazi.

2

4. REAGENSI

4.1. Opis

Identifikacija na nalepnici Opis Prezentacija/Priprema

72561 72562

R1 Mikroploča

Mikroploča 12 traka sa po 8 bunarčića svaka, obloženih monoklonskim anti-kapsidnim antitelom HCV, prečišćenim rekombinantnim antigenima hepatitisa C (NS3, NS4) i peptidom HCV kapsida. Specifični ID broj = 93

1 ploča Spremno za

upotrebu

5 ploča Spremno za

upotrebu

R2 Koncentrovani rastvor za ispiranje (20X)

Koncentrovani rastvor za ispiranje (20X) Tris NaCl pufer pH 7.4 Konzervans: Proclin™ 300 (0,04%)

1 bočica 70 ml

Razblažiti

1 bočica 235 ml

Razblažiti

R3 Negativna kontrola

Negativna kontrola Tris HCI pufer, koji sadrži BSA (Bovine Serum Albumin, goveđi serumski albumin) Konzervans: ProClin™ 300 (0.1%)

1 bočica 1 ml

Spremno za upotrebu

1 bočica 1 ml

Spremno za upotrebu

R4 Pozitivna kontrola

Pozitivna kontrola Humani serum koji sadrži antitela na HCV, negativan na HBs antigen i na anti-HIV-1 i anti-HIV-2 antitela, razblažen u Tris HCl puferu koji sadrži BSA, inaktivisan fotohemijski Konzervans: ProClin™ 300 (0.1%)

1 bočica 1,5 ml

Spremno za upotrebu

1 bočica 3 ml

Spremno za upotrebu

R5a Antigen pozitivna kontrola

Antigen pozitivna kontrola Sintetička antigen pozitivna kontrola koja sadrži liofilizovani peptid kapsida

1 bočica q.s. ad 1 ml

Rastvoriti

1 bočica q.s. ad 1 ml

Rastvoriti

R5b Diluent antigena Diluent za R5a Destilovana voda koja sadrži konzervans: ProClin™ 300 (0.5%)

1 bočica 1 ml

Rastvoriti

1 bočica 1 ml

Rastvoriti

R6 Konjugat 1

Konjugat 1 Mišja biotinilovana monoklonska antitela na antigen HCV kapsida Ljubičasto obojen Konzervans: Natrijum-azid (< 0.1%), CosmocilTM CQ (0.025%)

1 bočica 15 ml

Spremno za upotrebu

2 bočice 2 x 30 ml

Spremno za upotrebu

R7 Konjugat 2

Konjugat 2 Mišja antitela usmerena na komplekse humani IgG/peroksidaza i streptavidin/peroksidaza Zelene boje Konzervans: ProClin™ 300 (0.5 %)

1 bočica 15 ml

Spremno za upotrebu

2 bočice 2 x 30 ml

Spremno za upotrebu

R8 Supstratni pufer Supstratni pufer Rastvor limunske kiseline i natrijum-acetata pH 4.0 koji sadrži H2O2 (0.015%) i dimetil-sulfoksid (DMSO) 4%

1 bočica 60 ml

Rastvoriti

2 bočice 2 x 60 ml Rastvoriti

R9 Hromogen: TMB rastvor (11X)

Hromogen: TMB rastvor Rastvor koji sadrži 3.3’, 5.5’ tetrametilbenzidin (TMB)

1 bočica 5 ml

Razblažiti

2 bočice 2 x 5 ml

Razblažiti

R10 Stop rastvor Stop rastvor Rastvor sumporne kiseline (H2SO4 1N)

1 bočica 28 ml

Spremno za upotrebu

3 bočice 3 x 28 ml

Spremno za upotrebu

3

4.2. Uslovi čuvanja i rukovanja

Kit treba čuvati na +2-8°C. Svaka komponenta kita, čuvana na +2-8°C može se koristiti do isteka roka upotrebe naznačenog na pakovanju (osim ukoliko nije drugačije navedeno). Nakon otvaranja a u odsustvu kontaminacije, reagensi R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9 i R10, čuvani na 2-8°C, mogu se koristiti do isteka roka upotrebe prikazanog na nalepnici.

Identifikacija Čuvanje

R1 Nakon otvaranja vakumirane kese, stripovi sa bunarčićima čuvani na +2-8°C u pažljivo zatvorenoj originalnoj kesi mogu se koristiti 1 mesec.

R2 Razblaženi rastvor za ispiranje se može čuvati 2 nedelje na +2-30°C. Koncentrovani rastvor za ispiranje (R2) može se čuvati na +2-30°C.

R5a + R5b Nakon rastvaranja, radni rastvor antigen pozitivne kontrole (R5) može se čuvati 1 mesec na +2-8°C i 2 meseca na -20°C (do 5 ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja nakon zamrzavanja na -20°C).

R8 + R9 Nakon rastvaranja, reagensi čuvani u mraku na sobnoj temperaturi (18-30°C) mogu se koristiti 6 sati.

5. UPOZORENJA I MERE OPREZAZa in vitro dijagnostičku upotrebu od strane zdravstvenih radnika.

5.1. Mere opreza vezane za zdravlje i bezbednost pri radu

• Ovim test kitom bi trebalo da rukuje samo kvalifikovano osoblje, obučeno za laboratorijske procedure i upoznato sanjihovim potencijalnim opasnostima. Nosite odgovarajuću zaštitnu odeću, rukavice, zaštitu za oči/lice i rukujte ovimproizvodom pridržavajući se principa dobre laboratorijske prakse.

• Test kit sadrži komponente humane krvi. Materijal humanog porekla korišćen u pripremi reagensa R4 (pozitivnakontrola), testiran je i bio je nereaktivan na hepatitis B površinski antigen (HBsAg) i antitela na viruse humaneimunodeficijencije (HIV-1 i HIV-2 At), a pozitivan na anti-HCV antitela. Pozitivna kontrola R4 je inaktiviranazagrevanjem. Nijedan poznati metod testiranja ne može da garantuje potpuno odsustvo infektivnih agenasa. Iz tograzloga, sa svim derivatima humane krvi, reagensima i humanim uzorcima treba rukovati kao da su potencijalnoinfektivni, pridržavajući se univerzalnih mera opreza za patogene koji se prenose krvlju na način definisan u lokalnim,regionalnim i nacionalnim propisima.

• Prosipanje biološkog materijala: Prosut materijal humanog porekla trebalo bi tretirati kao potencijalno infektivan.Prosut sadržaj koji ne sadrži kiselinu bi trebalo odmah dekontaminirati, uključujući kontaminirano područje, materijale isve kontaminirane površine ili opremu, pomoću odgovarajućeg hemijskog dezinficijensa koji je efikasan za potencijalnebiohazardne opasnosti koje se očekuju u ispitivanim uzorcima (najčešće 1:10 razblaženje kućne varikine, 70-80% etanolili izopropanol, jodofor poput 0,5% WescodyneTM Plus, itd.), i dobro obrisati.Prosut sadržaj koji sadrži kiselinu bi trebalo pravilno apsorbovati (obrisati) ili neutralisati, oblast isprati vodom i dobroobrisati; materijale koji se koriste za apsorbovanje prolivenog sadržaja može biti potrebno ukloniti kao biohazardniotpad. Nakon toga, oblast treba dekontaminirati nekim od hemijskih dezinficijenasa.NAPOMENA: Nemojte stavljati rastvore koji sadrže varikinu u autoklav!

• Uklonite sve uzorke i materijal korišćen za izvođenje testa na način kao da sadrže infektivan agens. Laboratorijskim,hemijskim ili biohazardnim otpadom mora se rukovati i isti se mora ukloniti u skladu sa svim lokalnim, regionalnim inacionalnim propisima.

• Za preporuke u vezi opasnosti i mera opreza povezanih sa nekim hemijskim komponentama iz ovog test kita, pogledajtepiktogram(e) naznačen na nalepnicama i informacije navedene na na kraju uputstva za upotrebu. Bezbednosni list (SafetyData Sheet) je dostupan na www.bio-rad.com.

5.2. Mere opreza povezane sa procedurom rada

5.2.1. Priprema Pouzdanost rezultata zavisi od ispravne implementacije sledećih pravila dobre laboratorijske prakse: • Ne koristiti reagense kojima je istekao rok upotrebe.• Ne mešati ili spajati reagense iz različitih lotova unutar jedne serije testa.• Pre upotrebe sačekati 30 minuta da se reagensi stabilizuju na sobnoj temperaturi (18-30°C).

4

• Naziv testa, kao i specifični identifikacioni broj za testa, napisani su na okviru svake mikroploče. Specifični identifikacioni broj je, takođe, naveden na svakom stripu.

Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2: Specifičan ID broj= 93 Proverite specifičan identifikacioni broj pre upotrebe. Ukoliko nedostaje identifikacioni broj, ili se razlikuje od navedenog broja koji odgovara testu koji treba ispitati, traku ne treba koristiti. NAPOMENA: Za rastvor za ispiranje (R2, identifikacija na nalepnici: 20X obojeno zeleno), pufer supstrata peroksidaze (R8, identifikacija na nalepnici: TMB pufer, obojeno plavo), hromogen (R9, identifikacija na nalepnici: TMB 11X, obojeno ljubičasto) i rastvor za zaustavljanje reakcije (R10, identifikacija na nalepnici: 1N obojeno crveno), moguće je koristiti reagense iz drugih lotova u odnosu na one sadržane u kitu, pod uslovom da se reagens iz istog lota koristi tokom date serije testa. Ovi reagensi se mogu koristiti sa još nekim proizvodima naše kompanije. Kontaktirajte našu lokalnu tehničku službu za detaljne informacije. • Pažljivo rastvorite reagense izbegavajući bilo kakvu kontaminaciju. • Koristite stakleno posuđe temeljno oprano i isprano dejonizovanom vodom ili, po mogućstvu, materijal za jednokratnu

upotrebu. • Nemojte dozvoliti da se mikroploča osuši između kraja postupka ispiranja i dodavanja reagenasa. • Enzimska reakcija je veoma osetljiva na prisustvo jona metala. Zbog toga, nemojte dozvoliti da ma koji metalni element

dođe u kontakt sa različitim rastvorima konjugata ili supstrata. • Rastvor za razvoj reakcije (pufer supstrata + hromogen) mora biti obojen ružičasto. Modifikacija ove ružičaste boje u roku

od nekoliko minuta nakon rekonstituisanja ukazuje na to da se reagens ne može koristiti i da se mora zameniti. Priprema rastvora za razvoj reakcije može se obaviti u čistoj plastičnoj posudi za jednokratnu upotrebu ili staklenom kontejneru koji je prethodno bio opran sa 1N HCl i temeljno ispran destilovanom vodom i osušen. Ovaj reagens se mora čuvati u mraku.

• Nikada nemojte koristiti istu posudu za raspodelu konjugata i rastvora za razvoj reakcije.

5.2.2. Obrada • Nemojte menjati proceduru testa. • Nemojte izvoditi test u prisustvu reaktivnih isparenja (isparenja kiselina, baza, aldehida) ili prašine jer mogu da izmene

enzimsku aktivnost konjugata. • Koristite novi nastavak za pipetu za svaki uzorak. • Ispiranje bunarčića je ključan korak u ovom postupku: poštujte preporučeni broj ciklusa ispiranja i uverite se da su svi

bunarčići potpuno napunjeni i zatim potpuno ispražnjeni. Neispravno ispiranje može dovesti do netačnih rezultata. • Pažljivo sledite opisani postupak ispiranja da bi se dobile maksimalne performanse testa. Sa nekim aparatima, moglo bi biti

neophodno da se postupak ispiranja optimizuje (poveća broj ciklusa koraka ispiranja i/ili zapremina pufera za ispiranje za svaki ciklus) kako bi se dobio prihvatljiv nivo bazične OD za negativne uzorke.

• Kontaktirajte našu kompaniju za informacije o prilagođavanjima i posebnim procedurama.

6. UZORCI Uzorke krvi uzimati u skladu sa važećom praksom. Testove treba izvoditi sa nerazblaženim serumom ili plazmom (uzetom sa EDTA, natrijum- citratom ili ACD). Upotreba uzorka iz epruvete koja sadrži litijum-heparin nije preporučljiva. Niži signal je primećen na uzorcima koji su u testu bili pozitivni na HCV antigen. Uzorci koji sadrže agregate moraju biti prečišćeni centrifugiranjem pre testa. Suspendovane čestice fibrina ili agregati mogu da daju lažno pozitivne rezultate. Uzorci se čuvaju na +2-8°C ukoliko će test biti izveden u roku od 7 dana ili se mogu zamrznuti na -20°C. Ne ponavljati više od 3 ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja. Uzorci moraju biti odmrzavani na sobnoj temperaturi (18-30°C). Preporučuje se da se homogenizuju obrtanjem gore-dole pre upotrebe. Uzorci koji sadrže do 120 g/l albumina, 50 µg/l biotina i 200 mg/l bilirubina, uzorci koji sadrže do 33 g/l trioleina i uzorci koji sadrže do 2 g/l hemoglobina, ne utiču na rezultat testa. Ipak, ne preporučuje se korišćenje kontaminiranih hiperlipemičnih i hiperhemolizovanih uzoraka. Ne preporučuje se zagrevanje uzoraka jer bi to moglo značajno da umanji detekciju HCV antigena. Ukoliko uzorke treba transportovati, moraju da budu upakovani u skladu sa važećim propisima koji se odnose na transport infektivnih agenasa i poželjno ih je transportovati zamrznute.

5

7. PROCEDURA

7.1. Potreban materijal koji je potreban a nije obezbeđen

• Destilovana voda.• Natrijum-hipohlorit (kućna varikina) i natrijum-bikarbonat.• Upijajuća hartija.• Adhezivni filmovi.• Rukavice za jednokratnu upotrebu.• Zaštitne naočare.• Epruvete za jednokratnu upotrebu.• Automatske ili poluautomatske, varijabilne ili fiksne pipete ili multipipete za odmeravanje 50 µl, 80 µl, 100 µl, 200 µl i 1

ml.• Graduisane menzure zapremine 10 ml, 200 ml i 1000 ml. Vorteks mućkalica.• Automatski, poluautomatski ili manuelni sistem za ispiranje mikroploča.• Vodeno kupatilo ili ekvivalentni inkubator za mikroploče, termostatski podešen na 37°C ± 1°C (*).• Kontejner za biohazardni otpad.• Čitač mikroploča opremljen sa 450, 490 nm i 620-700 nm filterima (*).(*) Konsultujte nas za detaljne informacije o opremi preporučenoj od strane našeg tehničkog sektora.

7.2. Priprema reagenasa

7.2.1. Reagensi spremni za upotrebu Reagens 1 (R1): Mikroploča Svaki okvir koji nosi 12 stripova nalazi se u zaptivenoj aluminijumskoj kesi. Isecite kesu koristeći makaze ili skalpel 0,5 do 1 cm iznad vara. Otvorite kesu i izvadite okvir. Vratite neupotrebljene stripove nazad u kesu. Pažljivo zatvorite kesu i vratite je u skladište na +2-8°C.Reagens 6 (R6): Konjugat 1Homogenizovati obrtanjem gore-dole pre upotrebe.Reagens 7 (R7): Konjugat 2Homogenizovati obrtanjem gore-dole pre upotrebe.

7.2.2. Reagensi koje treba rastvoritiReagens 2 (R2): Koncentrovani rastvor za ispiranje (20X)Razblažiti u odnosu 1:20 u destilovanoj vodi da bi se dobio radni rastvor za ispiranje. Pripremiti 800 ml za jednu ploču od 12 stripova. Reagens 8 (R8) + Reagens 9 (R9): Rastvor za razvoj enzimske reakcije Razblažiti u odnosu 1:11 hromogen (R9) u supstratnom puferu (npr. 1 ml reagensa R9 + 10 ml reagensa R8) imajući u vidu da je 10 ml neophodno i dovoljno za tretiranje 12 stripova. Homogenizovati. Reagens 5a (R5a) + Reagens 5b (R5b): Radni rastvor (R5) Sipati sadržaj diluenta R5b u bočicu liofilizovanog Ag R5. Ponovo zatvoriti bočicu i ostaviti je da odstoji 10 minuta na sobnoj temperaturi (18-30°C) uz povremeno mućkanje i obrtanje bočice gore-dole kako bi se olakšalo rastvaranje.

7.3. Postupak testa

Strogo sledite proceduru izvođenja testa. Koristite negativne i pozitivne kontrolne serume za svaki test u cilju validacije kvaliteta testa. Sledite sledeće smernice dobre laboratorijske prakse: 1) Pažljivo napravite plan za raspodelu i identifikaciju uzorka.2) Pripremite razblaženi rastvor za ispiranje R2 i radni rastvor antigen pozitivne kontrole (R5a + R5b). (videti § 7.2)3) Iz zaštitnog pakovanja izvadite potporni okvir i neophodan broj stripova (R1). Vratite neupotrebljene stripove nazad u

originalno pakovanje. Zatvorite pakovanje i vratite ga na +2-8°C.4) Raspodelite sadržaj u bunarčiće sledećim redosledom (preporučeni raspored na ploči):

• 100 µl konjugata 1 (R6) u svaki bunarčić, zatim

6

• 50 µl negativne kontrole (R3) u bunarčić A1, • 50 µl pozitivne kontrole (R4) u bunarčiće B1, C1, D1, • 50 µl radnog rastvora pozitivne kontrole antigena (R5a + R5b) u bunarčić E1, • 50 µl prvog uzorka u bunarčić F1, • 50 µl drugog uzorka u G1, itd.

Homogenizovati smešu pomoću najmanje 3 aspiracije ili pomoću šejkera za mikroploče, tokom 5 sekundi. Ukoliko je za raspodelu uzoraka potrebno više od 10 minuta, preporučuje se raspodela negativnih i pozitivnih kontrola nakon uzoraka koje treba testirati. U zavisnosti od korišćenog sistema rada, moguće je modifikovati poziciju kontrola ili redosled raspodele. NAPOMENA: Nakon raspodele uzoraka, bunarčići koja sadrže uzorke (ili kontrole) prelaze u ljubičastu do plavu boju. Moguće je proveriti prisustvo kombinacije (uzorak + konjugat 1) u poljima pomoću spektrofotometrijskog očitavanja na 620 nm (videti § 7.7). 5) Čim je moguće, pokriti ploču novim adhezivnim filmom. 6) Inkubirajte mikroploču 90 minuta (± 5 min.) na 37°C ± 1°C. 7) Ukoliko je neophodno, uklonite adhezivni film. Aspirirajte sadržaj svih bunarčića u kontejner za tečni otpad i dodajte

minimum 370 µl rastvora za ispiranje u svaki bunarčić. Ponovo aspirirajte i ponovite ispiranje minimum 5 puta. Rezidualni volumen mora biti niži od 10 µl (ukoliko je neophodno, osušite stripove okretanjem naopako na apsorbujući papir). Ukoliko imate automatski uređaj za ispiranje ploča, sledite isti radni ciklus.

8) Brzo raspodelite 100 µl rastvora konjugata 2 (R7) u svaki bunarčić na ploči. Konjugat mora biti pažljivo promešan pre upotrebe. Pokriti, ukoliko je moguće, novim adhezivnim filmom i inkubirati 30 minuta (± 5 min) na 37°C± 1°C.

NAPOMENA: Konjugat je obojen zeleno. Moguće je potvrditi prisustvo konjugata u poljima pomoću spektrofotometrijskog očitavanja na 620 nm (videti § 7.7). 9) Uklonite adhezivni film, ispraznite sve bunarčiće aspiracijom i ispirajte minimum 5 puta na način opisan iznad. 10) Pripremite rastvor za razvijanje enzimske reakcije (reagens R8 + R9). 11) Brzo raspodelite 80 µl pripremljenog rastvora za razvijanje enzimske reakcije (R8 + R9) u sve bunarčiće.

Ostavite da se reakcija razvije u mraku tokom 30 minuta (± 5 min) na sobnoj temperaturi (18-30°C). Nemojte koristiti adhezivni film tokom ove inkubacije.

NAPOMENA: Raspodela rastvora za razvijanje reakcije, koji je obojen ružičastom bojom, može se vizuelno kontrolisati u ovom koraku rada. Postoji jasna razlika u obojenosti između praznog bunarčića i bunarčića koje sadrži ružičasti rastvor supstrata. (Videti § 7.7) 12) Dodajte 100 µl rastvora za zaustavljanje reakcije (R10) koristeći isti redosled i istu brzinu raspodele kao i u slučaju

rastvora za razvijanje. NAPOMENA: Raspodela bezbojnog rastvora za zaustavljanje reakcije može se vizuelno kontrolisati u ovom koraku rada. Boja supstrata, ružičasta (za negativne uzorke) ili plava (za pozitivne uzorke) nakon dodavanja rastvora za zaustavljanje reakcije isčezava iz bunarčića, koji postaju bezbojni (za negativne uzorke) ili žuti (za pozitivne uzorke). 13) Pažljivo obrišite dno svake ploče. Sačekajte najmanje 4 minuta nakon dodavanja rastvora za zaustavljanje reakcije, i u

roku od 30 minuta od zaustavljanja reakcije, čitajte optičku gustinu na 450/620-700 nm koristeći čitač mikroploča. 14) Proverite slaganje između spektrofotometrijskih i vizuelnih očitavanja naspram ploče i plana za raspodelu i identifikaciju

uzorka.

7.4. Kontrola kvaliteta

Koristite pozitivne kontrole (R4 i R5) i negativnu kontrolu (R3) u svakoj seriji testa u cilju validacije testa. (Videti §7.5).

7.5. Kriterijumi za validaciju testa

Test je validiran ukoliko su uslovi navedeni ispod ispunjeni: 1) Za negativnu kontrolu R3:

Izmerena vrednost apsorbance mora biti manja od 60% cut-off vrednosti: O.D. < cut off x 0.6

2) Za antitela pozitivnu kontrolu R4: 0,800 ≤ Srednja vrednost O.D. R4 ≤ 2,700 Ukoliko se jedna od pojedinačnih vrednosti za pozitivnu kontrolu R4 razlikuje za više od 30% od srednje vrednosti,

7

odbacite tu vrednost i izvedite izračunavanje ponovo sa preostale dve vrednosti pozitivne kontrole. 3) Za radni rastvor R5:

O.D. > 0.500

7.6. Izračunavanje/Interpretacija razultata

Cut-off vrednost se određuje pomoću R4 pozitivne kontrole: Izračunajte srednju vrednost izmerene vrednosti za apsorbancu za pozitivnu kontrolu R4. Uzračunajte cut-off vrednost:

CO =Srednja vrednost OD R4

5

Prisustvo ili odsustvo anti-HCV antitela i/ili antigena HCV kapsida određuje se poređenjem registrovane apsorbance sa izračunatom cut-off vrednošću za svaki uzorak.

Sledeći odnos se izračunava za svaki uzorak: Odnos = OD uzorka / CO vrednost

Uzorci sa optičkom gustinom nižom od cut-off vrednosti smatraju se negativnim (odnos <1) sa Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 testom. Rezultate odmah ispod cut-off vrednosti (CO-10 % < O.D. < CO, odnos između 0.9 i 1) treba, međutim, interpretirati uz oprez. Savetuje se ponovno testiranje odgovarajućih uzoraka u duplikatu, kada to sistem rada i laboratorijske procedure dozvoljavaju. Uzorci sa optičkom gustinom većom ili jednakom cut off vrednosti (odnos ≥ 1) smatraju se inicijalno pozitivnim sa Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 testom. Njih pre konačne interpretacije treba ponovo testirati u duplikatu. Ukoliko je vrednost odnosa bar jednog od 2 duplikata nakon ponovnog testiranja jednaka ili veća od 1, inicijalni rezultat je ponovljiv i uzorak se proglašava pozitivnim sa Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 testom. Ako su vrednosti odnosa 2 duplikata manje od 1, inicijalni rezultat nije ponovljiv i uzorak se proglašava negativnim. Uzorci koji su bili ponovo testirani dva puta i za koje je nađeno da su negativni sa Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 testom, ali sa jednom vrednošću blizu cut-off vrednosti (odnos između 0.9 i 1) trebalo bi pažljivo razmatrati. Savetuje se ponovno testiranje pacijenta drugom metodom ili na drugom uzorku. U slučaju veoma niske optičke gustine za testirane uzorke (negativna OD), a kada je prisustvo uzoraka kao i reagenasa kontrolisano, rezultati se mogu interpretirati kao negativni. Preporučuje se potvrđivanje pozitivnih uzoraka prema trenutnim nacionalnim preporukama i algoritmima.

7.7. Spektrofotometrijska verifikacija pipetiranja uzorka i konjugata (opciono)

Verifikacija pipetiranja uzoraka i konjugata 1 (R6) Moguće je potvrditi prisustvo konjugata 1 (R6) + uzorka u bunarčiću automatskim očitavanjem na 620 nm. Svaki bunarčić koje sadrži uzorak i konjugat 1 (R6) mora imati OD veću od 0.800. NAPOMENA: Nakon dodavanja uzorka, konjugat 1 (R6) prelazi iz ljubičaste u plavu boju. Verifikacija pipetiranja konjugata 2 (R7) Konjugat 2 (R7) je obojen zeleno. Prisustvo konjugata 2 (R7) u poljima može se kontrolisati automatskim očitavanjem na 620 nm: OD vrednost svakog bunarčića mora biti veća od 0.300 (vrednost niža od ove obično ukazuje na loše pipetiranje konjugata). Verifikacija pipetiranja rastvora za razvijanje reakcije Moguće je verifikovati prisustvo ružičastog rastvora za razvijanje reakcije u poljima automatskim očitavanjem na 490 nm. Bunarčić sa rastvorom za razvijanje reakcije mora imati optičku gustinu veću od 0,100 (niža OD ukazuje na loše pipetiranje rastvora za razvijanje reakcije). Postoji značajna promena boje u slučaju praznih bunarčića iz bezbojne u ružičastu nakon dodavanja pripremljenog rastvora hromogena/supstrata.

8. OGRANIČENJA TESTA Usled različitih imunoloških odgovora pacijenata inficiranih hepatitis C virusom (naročito tokom serokonverzije), mogu se primetiti neke razlike u detekciji između testova u zavisnosti od tipa korišćenih antigenskih proteina. Stoga, negativan rezultat tokom skrining testa ne isključuje mogućnost izloženosti virusu ili infekcije hepatitis C virusom.

8

Prema literaturi, HCV nosioci podvrgnuti imunosupresivnoj terapiji ili oni sa koinfekcijom HIV-HCV mogu imati izrazito niske nivoe antitela, ispod detekcionog limita HCV testova. Svaka ELISA tehnika može dati lažno pozitivne reakcije. Preporučuje se provera specifičnosti reakcije za svaki uzorak koji je bio ponovljeno pozitivan, u skladu sa kriterijumima za interpretaciju Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 kita, korišćenjem pogodnog metoda: korišćenjem ELISA anti-HCV antitelo skrining testa samog ili uz imunoblot test za detekciju anti-HCV antitela, da bi se dokazalo prisustvo anti-HCV antitela. Ukoliko je neophodno, koristite testove molekularne biologije za skrining HCV genoma. Kolorimetrijski metod za proveru deponovanja uzoraka i/ili konjugata i/ili rastvora za razvijanje reakcije ne dozvoljava procenu tačnosti raspodeljenih zapremina već samo otkriva prisustvo uzorka i/ili konjugata i/ili rastvora za razvijanje reakcije. Stepen pogrešnih rezultata dobijenih ovim metodom je blisko povezan sa tačnošću korišćenog sistema rada (kumulativni koeficijent varijacije raspodele i očitavanja iznad 10% značajno smanjuje kvalitet verifikacije). Upotreba Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 testa nije odobrena za pulove uzoraka ili razblažene uzorke. Fine čestice mogu se videti naročito u konjugatu (R6), pri čemu njihovo prisustvo ni na koji način ne menja kvalitet reagensa.

9. KARAKTERISTIKE IZVOĐENJA

9.1. Određivanje preciznosti

Reproducibilnost i intermedijarna preciznost određene su korišćenjem uzoraka sa različitim koncentracijama anti-HCV antitela i HCV antigena. Uzorci su bili testirani 30 puta tokom iste serije testova kako bi se odredila ponovljivost. Intermedijarna preciznost bila je procenjena testiranjem uzoraka u duplikatu tokom 20 dana u 2 nezavisne serije svakog dana. Izračunate su srednje vrednosti odnosa, standardne devijacije i koeficijenti varijacije (CV).

9.1.1. Ponovljivost Uzorci N Srednja vrednost odnosa Standardna devijacija CV %

Negativan S1 30 0,23 0,024 10,4

HCV antigen pozitivan

S2 S3 S6

30 30 30

1,21 1,43 7,18

0,048 0,053 0,166

4,0 3,7 2,3

Anti-HCV antitela pozitivan

S4 S5 S7

30 30 30

1,42 1,35 6,73

0,046 0,083 0,153

3,2 6,1 2,3

CV dobijeni na 6 pozitivnih uzoraka su <10%.

9.1.2. Intermedijarna preciznost

Uzorci N Srednja vrednost odnosa

Unutar testa Između

testova/operatora Između dana Ukupna

reproducibilnost

SD CV % SD CV % SD CV % SD CV %

Negativan S1 80 0,22 0,017 7,5 0,028 12,5 0,029 12,7 0,043 19,4 HCV

antigen pozitivan

S2bis S3 S6

80 80 68

2,80 1,56 6,69

0,143 0,124 0,500

5,1 7,9 7,5

0,277 0,129 0,621

9,9 8,2 9,3

0,283 0,083 0,557

10,1 5,3 8,3

0,421 0,197 0,973

15,0 12,6 14,5

Anti-HCV antitela

pozitivan

S4 S5 S7

80 80 80

1,57 1,75 7,69

0,062 0,075 0,285

3,9 4,3 3,7

0,125 0,164 0,531

8,0 9,3 6,9

0* 0* 0*

N/A N/A N/A

0,140 0,181 0,603

8,9 10,3 7,8

*: Negativna vrednost varijanse se procenjuje na 0. CV dobijeni na 6 pozitivnih uzoraka nisu veći od 15%.

9.2. Kliničke performanse

Performanse Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 testa određene su testiranjem uzoraka nasumično izabranih dobrovoljnih davalaca krvi, hospitalizovanih pacijenata, pacijenata sa akutnim i hroničnim infekcijama hepatitis C virusom i pacijenata sa kliničkim znacima nepovezanim sa infekcijom hepatitis C virusom. Studije su sprovedene na 2 lokacije davanja krvi, u bolnici i na Bio-Rad-ovoj lokaciji.

9

9.2.1. Dijagnostička specifičnost Studija je izvedena na uzorcima seruma i EDTA plazme, prikupljenim u 2 donorska centra, od nasumično izabranih davalaca. Studija specifičnosti je takođe izvedena na uzorcima hospitalizovanih pacijenata. Svi uzorci su testirani anti-HCV testom sa CE znakom.

Populacija Lokacija Tip Uzorka Broj Ponovljeno reaktivni

uzorci (RR) Specifičnost

(%) Interval poverenja

95%

Dobrovoljni davaoci krvi

#1 serum 537 1 536/537 plazma 2002 0 2002/2002

#2 serum 2638 2 2636/2638

#1 + #2 5177 3 99.94%

5174/5177 99.83%-99.99%

Hospitalizovani pacijenti #3 serum 502 1

99.80% 501/502 98.92%-100.00%

*: 3 donora za koje je u referentnom testu nađeno da su uzorci neodređeni bili su izuzeti iz izračunavanja.

9.2.2. Dijagnostička osetljivost Dijagnostička osetljivost je bila proučavana na 575 uzoraka pacijenata inficiranih hepatitis C virusom. Među ovim uzorcima, 25 je poteklo od pacijenata od kojih je uzorak uzet 24 časa pre analize. Testirano je 481 različitih genotipiziranih uzoraka (1; 2; 3; 4; 5; 6).

Tabela 1: Testirani genotipovi

Genotipovi 1

(1, 1a, 1b, 1a/b)

2 (2 2a/c, 2a, 2b, 2b/3)

3 (3, 3a, 3b, 3c)

4 (4, 4a, 4a/c, 4a/c/d, 4c,

4e, 4h, 4n, 4r)

5 (5, 5a)

6 (6, 6a, 6a/b,

6n) Ukupno

N 241 56 107 63 8 6 481 Dijagnostička osetljivost na svim testiranim uzorcima je 100% (575/575) sa intervalom poverenja 95% od [99.4-100.0].

Uzorci pacijenata sa akutnom infekcijom: 39 serokonverzijskih panela (10 profila kapsida, 10 NS3 profila i 19 multiplih profila) bilo je testirano pomoću Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 testa i upoređeno sa kombinovanim antigen/antitelo testom i sa testom na anti-HCV antitelo, oba sa CE znakom. Rana detekcija je bila merena za sve panele. Od ovih 39 panela, jedan panel nije bio detektovan od strane Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 testa, a tri nisu bila detektovana od strane kombinovanog Ag-At testa s kojim je vršeno poređenje. Od 38 panela detektovanih Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 testom, 5 je imalo raniju detekciju, 27 je imalo ekvivalentnu detekciju a 6 je imalo kasniju detekciju u poređenju sa kombinovanim Ag-At testom. U poređenju sa testom na anti-HCV antitelo, 28 panela je imalo raniju detekciju, 9 je imalo ekvivalentnu detekciju a 1 je imao kasniju detekciju.

Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 naspram kombinovanog Ag-Ab HCV testa

Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 naspram Anti-HCV testa

Broj panela 38 38 Ranija detekcija 5 28

Ekvivalentna detekcija 27 9 Kasnija detekcija 6 1

9.3. Studija analitičke specifičnosti/ukrštene reaktivnosti

365 potencijalno interferirajućih uzoraka koji su sadržali antitela na uzročnike infektivnih bolesti (citomegalovirus, Epstein Barr virus, VZV, morbili virus, rubela virus, mumps virus, herpes virus, virus gripa, hepatitis A virus, hepatitis B virus, HIV 1/2, HTLV 1/2, sifilis, Toxoplasma gondii, denga, Chagasova bolest), uzorci iz rizičnih grupa pacijenata (pacijenti na dijalizi, pacijenti sa cirozom, trudnice, multiparne žene) ili uzorci pacijenata sa poremećajima imunskog sistema (autoantitela, reumatoidni faktori, anti-mišja antitela i mijelomi) bili su ispitivani pomoću Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 testa.

Za dva uzorka je nađeno da su bili ponovljeno pozitivni sa Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 testom. Specifičnost od 99.45% (363/365), uočena u ovoj ciljnoj populaciji, bila je slična specifičnosti nađenoj kod kliničkih uzoraka.

9.4. Fenomen prozone („hook" efekat)

Postojanje mogućeg efekta prozone („hook“ efekta) proučavano je testiranjem 5 uzoraka sa visokim titrom u različitim razblaženjima. Ekvivalentnost rezultata, uočena među nerazblaženim i razblaženim uzorcima, ukazuje na odsustvo „hook“ efekta.

10. BIBLIOGRAFSKE REFERENCE• Bhartia A.R., Letendrea S.L., Wolfsona T. Clinical variables identify seronegative HCV co-infection in HIV-infected

individuals. J. of Clin. Virol. 2011, 52 : 328–332.• Bouvier-Alias M, Patel K, Dahari H, Beaucourt S, Larderie P, Blatt L, Hezode C, Picchio G et al. Clinical utility of total

HCV core antigen quantification: a new indirect marker of HCV replication. Hepatology. 2002, 36 : 211-218.• Choo Q.L., Richman K.H., Han J.H., Berger K., Lee C., Dong C., Gallegos C., Coit D., Medina- Selby A., Barp P.J.,

Weiner A.J., Bradley D.W., Kuo G. and Houghton M.Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991, 88:2451-2455.

• EASL Clinical Practice Guidelines: Management of hepatitis C virus infection. Journal ofHepatology. 2011, 55(2):245-64.

• Jackson BR, Busch MP, Stramer SL, AuBuchon JP. The cost-effectiveness of NAT for HIV, HCV and HBV inwhole–blood donations. Transfusion.2003, 43: 721-729.

• Lambert N. Value of HCV Antigen-Antibody Combined HCV Assay in Hepatitis C Diagnosis. Dev. Biol. (Basel),2007,127: 113-121.

• Laperche S., Le Marrec N., Girault A., Bouchardeau F., Servant-Delmas A., Maniez-Montreuil M., Gallian P., Levayer T.,Morel P., Simon N. Simultaneous detection of hepatitis C virus (HCV) core antigen and anti-HCV antibodies improvesthe early detection of HCV infection. J. Clin. Microbiol. 2005, 43(8): 3877-83.

• Nübling CM, Unger G, Chudy M, Raia S, Löwer J. Sensitivity of HCV core antigen and HCV RNA detection in the earlyinfection phase. Transfusion. 2002. 42: 1037-1045.

• Rider P.J. and Liu F. Crosstalk between HIV and hepatitis C virus during co-infection. BMC Medicine. 2012, 10: 32.• Schnuriger A., Dominguez S., Valantin M.A., Tubiana R., Duvivier C., Ghosn J., Simon A., KatlamaC. and Thibault V.

Early Detection of Hepatitis C Virus Infection by Use of a New Combined Antigen-Antibody Detection Assay :Potential Use for High-Risk Individuals. J. Clin. Microbiol. 2006, 1561-1563.

• Strader DB, Wright T, Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, management and treatment of Hepatitis C. AASLD PracticeGuideline. Hepatology. 2004, 39 : 1147-1171.

• Widell A., Busch M. Exposed or not exposed - that is the question: evidence for resolving and abortive hepatitis C virusinfections in blood donors. Transfusion. 2009, 49: 1277-1281

Opasnost Uzrokuje teške opekotine kože i povrede oka. Može da izazove alergijsku reakciju na koži. Nositi zaštitne rukavice/zaštitnu odeću/zaštitu za oči/zaštitu za lice. U SLUČAJU DODIRA S OČIMA: oprezno ispirati vodom nekoliko minuta. Ukloniti kontaktna sočiva ukoliko ih nosite i ako se ona lako uklanjaju. Nastaviti ispiranje. AKO SE PROGUTA: isprati usnu duplju. NE izazivati povraćanje. U SLUČAJU DODIRA S KOŽOM (ili kosom): odmah ukloniti/skinuti svu kontaminiranu odeću. Isprati kožu vodom/tuširanjem. U slučaju nadražaja ili osipa na koži: zatražiti savet/pomoć lekara. Odložite materijal /kontejnere u skladu s lokalnim/ regionalnim/ nacionalnim/ međunarodnim odredbama.

Ovaj proizvod sadrži humane ili životinjske sastojke. Pažljivo rukovati.