MANUAL PRÁCTICO DEMANUAL PRÁCTICO DEMANUAL PRÁCTICO DEMANUAL PRÁCTICO DEMANUAL PRÁCTICO DEBACTERIOLOGÍA MÉDICABACTERIOLOGÍA MÉDICABACTERIOLOGÍA MÉDICABACTERIOLOGÍA MÉDICABACTERIOLOGÍA MÉDICA

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Miguel F. TorresMiguel F. TorresMiguel F. TorresMiguel F. TorresMiguel F. Torres

Portada interna:Microfotografía electrónica de Salmonella typhi en división. Muestra los flagelos, lasfimbrias y la pared celular de la bacteria que causa la fiebre tifoidea. Inserto: dibu-jos de bacterias de la microbiota oral, por A. van Leeuwenhoek, siglo XVII.

© 1996, Miguel Francisco Torres Rubín

Químico Biólogo graduado de la Universidad de San Carlos de Guatemala. PoseeMaestría en Microbiología Médica de la Universidad de Duke, Carolina del Norte,Estados Unidos.

Fundador del Laboratorio Microbiológico de Referencia (LAMIR) y catedrático ti-tular de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Microbiología, Escuela deQuímica Biológica, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de SanCarlos de Guatemala.

Por muchos años fue microbiólogo del Instituto Guatemalteco de Seguridad Social(IGSS) y del Hospital Militar en la ciudad de Guatemala. Es miembro de la Acade-mia de Ciencias Médicas, Físicas y Naturales de Guatemala, y fundador de la Aca-demia Guatemalteca de Historia de la Medicina.

Los criterios expresados en esta publicación son de la exclusiva responsabilidaddel autor e incluyen su experiencia personal.

Impreso en Editorial Serviprensa C.A.3a. avenida 14-68, zona 1

Tels. 232-5424, 232-9025 Fax: 232-0237Guatemala, Guatemala, 1996

ÍNDICE

PRESENTACIÓN / 11

AGRADECIMIENTOS / 13

PRÓLOGO / 15Foto: Antonio van Leeuwenhoek. Foto: Luis Pasteur. Foto: Roberto Koch.

CAPÍTULO 1:BREVE INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA / 21El Nombre Correcto de los Microorganismos. Recomendaciones de Bioseguridadpara el Laboratorio de Microbiología. Medidas de Bioseguridad. Métodos deEsterilización o Desinfección. Descontaminación. Antisepsia. Uso efectivo deAntisépticos, Desinfectantes y Procedimientos de Esterilización. Resistencia deMicroorganismos a Germicidas Químicos.

CAPÍTULO 2:INTRODUCCIÓN A LA BACTERIOLOGÍA / 29Cómo Organizar el Area de Trabajo de Bacteriología. Fig. 1 Mesa de Trabajo paraBacteriología. La Coloración de Gram. Foto: Hans Gram. Fórmulas: Reactivos parala Coloración de Gram. Fig. 2 Clases de Asas Microbiológicas y su Uso, 1 Asas paraBacteriología, 2 Asas para Micología y Micobacterias. Fig. 3 Inoculación de MediosSólidos por Estrías.

CAPÍTULO 3:COPROCULTIVO / 41Propósito. Muestra. Procedimiento. Fig. 4 Marcha Bacteriológica para Coprocultivo.Interpretación de Resultados. Fig. 5 Observación y Señalamiento de ColoniasSospechosas. Fig. 6 Técnica para tomar Inóculo de Colonias Individuales. Reaccionesde varias Enterobacterias en TSI/LIA. Diferenciación de las Especies del GéneroShigella. Diferenciación de las Especies del Género Salmonella. Informe.Procedimiento para Cultivo de Cuerdas Encapsuladas (Enterotest) para Colecciónde Muestras Duodenales. La Epidemiología y Etiología de la Diarrea. PatógenosFrecuentemente Identificados en Niños con Diarrea Aguda, Atendidos en Centrosde Tratamiento, en Países en Desarrollo.

CAPÍTULO 4:COPROCULTIVO PARA CÓLERA / 63Propósito. Muestra. Procedimiento. Interpretación de Resultados. Fig. 7 MarchaBacteriológica Acortada para Aislamiento de Vibrio cholerae 01. Informe. Fórmulas:1 Agua Peptonada Alcalina (APA), 2 Medio de Transporte Cary-Blair.

CAPÍTULO 5:COPROCULTIVO PARA Campylobacter jejuni / 71Propósito. Muestra. Condiciones necesarias. Procedimiento. Interpretación deResultados. Informe.

CAPÍTULO 6:INVESTIGACIÓN DE Helicobacter pylori / 75Propósito. Muestra. Observación Directa. Prueba de Ureasa. Cultivo. Informe.

CAPÍTULO 7:UROCULTIVO / 79Propósito. Manifestaciones Clínicas y Microorganismos Asociados con Varios Tiposde Infecciones Urinarias. Toma de la Muesta. Toma de Urocultivo en el Hombre.Toma de Urocultivo en la Mujer. Toma de Urocultivo en Niños Pequeños. PunciónSupra-púbica (PSP). Procedimiento. Foto: Biplaca para Urocultivo. Fig. 8 MarchaBacteriológica para Urocultivo. Interpretación de Resultados. Informe. Detecciónde Bacteriuria por la Coloración de Gram de Orina no Centrifugada.

CAPÍTULO 8:CULTIVO DE GARGANTA / 91Propósito. Muestra. Procedimiento. Fig. 9 Marcha Bacteriológica para Cultivo deGarganta/Exudado Faríngeo. Interpretación. Foto: Interpretación de la Prueba deBacitracina. Identificación Presuntiva de Streptococcus agalactiae (Grupo B), Pruebade CAMP. Fig. 10 Siembra e Interpretación de la Prueba de CAMP. CaracterísticasFísicas, Hematológicas y Químicas de la Sangre de Carnero. Ventajas del Uso de laSangre de Carnero en el Laboratorio Clínico.

CAPÍTULO 9:CULTIVOS DE GARGANTA ESPECIALES / 105Propósito. Investigación de Corynebacterium diphtheriae. Muestra y Procedimento.Interpretación de Resultados. Informe. Investigación de Neisseria meningitidis enCultivos de Garganta de Contactos. Muestra y Procedimiento. Interpretación.Informe.

CAPÍTULO 10:CULTIVO DE ESPUTO / 121Propósito. Muestra. El Frote Gram de Esputo. Interpretación del Frote Gram deEsputo. Cultivo de Esputo. Interpretación de Resultados e Informe. Etiología ySintomatología de Neumonía y Bronquitis.

CAPÍTULO 11:HEMOCULTIVO / MIELOCULTIVO / 129Propósito. Muestra. Procedimiento. Observaciones en Hemocultivos que Orientanel Diagnóstico Bacteriológico. Interpretación de Resultados. Etiología ySintomatología de Septicemia. Informe.

CAPÍTULO 12:SECRECIONES DIVERSAS / 137Propósito. Muestra. 1 Piel. Etiología y Sintomatología de Heridas Infectadas. 2 Ojos.Etiología y Sintomatología de Infección Ocular. 3 Oídos. Etiología y Sintomatologíade Otitis Media. 4 Misceláneos. Procedimiento. Interpretación de Resultados eInforme. Principales Pruebas para la Diferenciación de Tres Especies del GéneroStaphylococcus de Origen Humano.

CAPÍTULO 13:SECRECIONES GENITALES / 147Propósito. Diagnóstico de Gonorrea. Foto: Neisseria gonorrhoeae, Frote Gram de PusUretral Masculino. Diferenciación de Dos Especies de Neisseria de ImportanciaClínica. Diagnóstico de Chancro Blando (Chancroide). Diagnóstico Directo de laSífilis. Foto: Treponema pallidum, Campo Oscuro de Chancro. Agentes Infecciososdel Tracto Genital Femenino. Introducción. Vaginitis. Cervicitis. Otros AgentesEtiológicos.

CAPÍTULO 14:LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Y FLUIDOS CORPORALES / 163Propósito. Muestra. Etiología y Sintomatología de Infección Osea y Articulaciones.Procedimiento. Fig. 11 Marcha Bacteriológica para Líquido Cefalorraquídeo (LCR).Interpretación de Resultados. Informe.

CAPÍTULO 15:TEJIDOS Y BIOPSIAS / 171Propósito. Muestra. Procedimiento. Interpretación de Resultados e Informe.

CAPÍTULO 16:PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA) / 177Propósito. Medio de Cultivo. Procedimiento. Esquema: Jarro Gas-Pak. Fig. 12Marcha Bacteriológica para Antibiograma. Antibióticos Aprobados (FDA-USA) quedeben Usarse Rutinariamente para Pruebas de Susceptibilidad en Varios GruposBacterianos. 1 Enterobacterias, 2 Pseudomonas aeruginosa y otros Bacilos gram-negativo no de la Familia Enterobacteriaceae, 3 Sthapylococcus spp. Interpretación deResultados. Interpretación de los Diámetros de las Zonas de Inhibición (mm) paraMiembros de la Familia Enterobacteriaceae. Interpretación de los Diámetros de lasZonas de Inhibición (mm) para Staphylococcus spp. Control de Calidad. LímitesAceptables de los Halos de Inhibición (mm) que Deben Obtenerse con las CepasControl. Fuentes Comunes de Error.

CAPÍTULO 17:ANAEROBIOS / 193Propósito. Muestra. Toma de Muestra para Cultivo de Anaerobios. Transporte delas Muestras al Laboratorio. Procedimiento. Interpretación de Resultados.Características Morfológicas de Algunos Bacilos Anaerobios Gram-negativo deImportancia Médica. Interpretación del Cultivo. Morfología Microscópica. Fig. 12Diversas Morfologías Bacterianas. Informe.

CAPÍTULO 18:MICOBACTERIAS / 203Propósito. Muestras. 1 Esputo, 2 Lavado Gástrico, 3 Orina, 4 Otro Tipo de Muestras.Procedimiento. Procedimiento de la Coloración de Ziehl-Neelsen. Fórmulas:Reactivos para Ziehl-Neelsen. Coloración de Kinyoun. Fórmulas: Reactivos paraKinyoun. Interpretación e Informe de Baciloscopías. Reporte de Frotes paraMicobacterias. Cultivo para Micobacterias. Digestión y Descontaminación deEsputos. Método de Digestión y Descontaminación con N-acetil-levo-cisteína(NALC). Fórmulas. Digestión y Descontaminación de Esputos por el MétodoConvencional de Hidróxido de Sodio. Fórmulas. Procedimiento de Digestión/Descontaminación para Esputos de Pacientes cuyas muestras están constantementecontaminadas con Pseudomonas sp. o Proteus sp. Procedimiento para LavadosGástricos. Procedimiento para Orina. Procedimiento para Hisopo Faríngeo.Procedimiento para Tejido o Piel. Procedimiento para Otros Fluidos Corporales.Interpretación del Cultivo. Prueba de Niacina. Grupos de Runyon (Micobacterias“Atípicas”).

BIBLIOGRAFÍA / 223

ÍNDICE DE FIGURAS

Fig.1 / 34MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍA

Fig.2 / 39CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USO1 Asas para Bacteriología2 Asas para Micología

Fig.3 / 40INOCULACIÓN DE MEDIOS SÓLIDOS POR ESTRÍAS

Fig.4 / 45MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVO

Fig.5 / 46OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS

Fig.6 / 48TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES

Fig.7 / 67MARCHA BACTERIOLÓGICA ACORTADA PARA AISLAMIENTO DE Vibriocholerae 01

Fig.8 / 84MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA UROCULTIVO

Fig.9 / 94MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA CULTIVO DE GARGANTA

FIG.10 / 100SIEMBRA E INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE CAMP

Fig. 11 / 166MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR)

Fig.12 / 181MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA ANTIBIOGRAMA

Fig.13 / 201DIVERSAS MORFOLOGÍAS BACTERIANAS

Nota:Al centro del libro, a partir de la página 111 aparecen 32 fotografías a color ysus explicaciones correspondientes.

Guatemala, agosto de 1996

PRESENTACIÓNPRESENTACIÓNPRESENTACIÓNPRESENTACIÓNPRESENTACIÓN

Las enfermedades infecciosas continúan siendo la principal causa de morbi-mortalidad en Mesoamérica. Entre las variadas infecciones que afectan la saludpública de nuestros pueblos, las infecciones de origen bacteriano son unas de lasmás frecuentes. Por este motivo, cualquier esfuerzo orientado a capacitar personalde salud en diagnóstico bacteriológico, incide directamente en su mejor tratamientoy control.

La Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlosde Guatemala, se complace en presentar el siguiente MANUAL PRÁCTICO DEBACTERIOLOGÍA MÉDICA a la comunidad científica de Guatemala y Centroamérica.Como su título lo indica, se trata de un libro fácil de leer, comprender y aplicar,dirigido a profesionales, estudiantes y técnicos que estudian o trabajan directamentela bacteriología en los laboratorios clínicos privados o estatales.

El autor es catedrático titular desde hace 22 años en el Departamento deMicrobiología, Escuela de Química Biológica de esta Casa de Estudios. Durante estosaños, ha tenido a su cargo la enseñanza de la bacteriología médica a los estudiantesde Química Biológica. Cuenta con una gran trayectoria profesional dentro y fuerade la Universidad de San Carlos de Guatemala. Se ha destacado no sólo comocatedrático e investigador a través de sus múltiples publicaciones en revistascientíficas nacionales e internacionales, sino también a lo largo de los años hademostrado su empeño por mejorar la microbiología en nuestro medio. Uno de susprincipales logros fue la creación del Laboratorio Microbiológico de Referencia-LAMIR- en 1991.

La experiencia de Miguel F. Torres en la docencia e investigación enbacteriología, parasitología y micología, aunados a sus conocimientos y experienciaadquiridos durante varios años de servicio como microbiólogo clínico del InstitutoGuatemalteco de Seguridad Social y del Hospital Militar, garantizan el contenidodel manual.

Esta obra fue completada por el autor durante su año sabático de la Universidadde San Carlos. Constituye un valioso libro de texto para los estudiantes de diversascarreras. Por este motivo, no dudamos en recomendarlo y desearle muchos éxitos.

Atentamente,

Lic. Jorge Rodolfo Pérez FolgarDecano

Lic. Gerardo Arroyo Catalán Licda. Heidi Logemann LimaDirector de la Escuela Jefe del Departamentode Química Biológica de Microbiología

AGRADECIMIENTOSEl autor desea patentizar sus agradecimientos a los siguientes destacados

bacteriólogos de Centroamérica y el Caribe, por su valiosa colaboración al haberrevisado el manuscrito de este libro. Los distinguidos colegas efectuaron valiososcomentarios y sugerencias, los cuales dada su gran experiencia y prestigio,enriquecen la obra.

Licda. Floridalma Cano GranadosSupervisora del Laboratorio de Bacteriología y Parasitología IntestinalLaboratorios de Microbiología “Dr. Leonardo J. Mata”Instituto de Nutrición de Centroamérica y PanamáGuatemala

Dr. Edmundo E. PoujolEx-Director del Departamento de MicrobiologíaUniversidad Nacional AutónomaHonduras

Dr. Jaime Guevara R.Jefe de la Sección de LaboratoriosDirección Técnica de Servicios de SaludCaja Costarricense de Seguro SocialCosta Rica

Dra. Marion C. de MartinVice-decana de la Facultad de MedicinaUniversidad NacionalPanamá

Dr. Gerardo F. MartínezJefe del Departamento de Bacteriología / MicologíaSub-Dirección de MicrobiologíaInstituto de Medicina Tropical “Dr. Pedro Kourí”Cuba

A los personeros del Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social deGuatemala que brindaron su apoyo para lograr el financiamiento de 250 copias dela Segunda Edición del presente Manual. Ellos permitieron hacer llegar nuestromensaje académico y guía de trabajo a profesionales, técnicos de laboratorio yestudiantes. Actualizar y estandarizar la bacteriología médica en nuestros países,debe ser la meta. Estas labores deben ser dinámicas y constantes.

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PRÓLOGO A LA SEGUNDA EDICIÓN

Las tres diferentes formas que presentan las bacterias fueron observadas porprimera vez por Antonio van Leeuwenhoek en Delft, Holanda, en el siglo XVII. Sinembargo, la bacteriología médica surgió como tal hacia fines del siglo XIX, con losgeniales descubrimientos de Pasteur en Francia y Koch en Alemania. Por primeravez en la historia, en 1876, Roberto Koch propagó una bacteria patógena en cultivopuro fuera del cuerpo. Al aislar Bacillus anthracis no sólo estableció ésta bacteriacomo causa del ántrax en el ganado vacuno, sino inauguró un método deinvestigación de las infecciones, actualmente vigente.

Hoy en día, la bacteriología clínica ha avanzado enormemente y en la últimadécada del siglo XX es muy extensa y diversa. Por este motivo, se hace necesarioextraer de la literatura actualizada los conocimientos, técnicas y criteriosinterpretativos necesarios para efectuar adecuadamente los análisis bacteriológicosmás frecuentes, y ordenarlos de manera simple y comprensible. Estos son lospropósitos fundamentales de la presente publicación.

Este MANUAL PRÁCTICO DE BACTERIOLOGÍA MÉDICA no es un textoexhaustivo de la materia, ni mucho menos un tratado de taxonomía bacteriana. Esuna guía simplificada de trabajo, orientada hacia la obtención de resultados lo másrápido posible y con el mayor significado clínico. Al final del libro, se seleccionanlas referencias bibliográficas más relevantes.

Anteriormente se aceptaba que el buen bacteriólogo clínico era aquel capazde identificar hasta especie todas las bacterias presentes en determinado cultivo.Hoy en día este concepto ha cambiado y el buen bacteriólogo clínico es quiendiscrimina efectivamente los microorganismos potencialmente patógenos de lamicrobiota normal, los identifica total o presuntivamente lo más pronto posible yemite un informe claro y correcto. Por este motivo, en el presente manual prácticose hace énfasis en los criterios actualizados de interpretación.

El estudio de la Historia de la Humanidad, permite comprender la realidadpresente y proyectarse mejor hacia el futuro. En el caso de la bacteriología médica,los inspiradores escritos, sus retratos y el ejemplo de tres pioneros de esta ciencia,que aparecen al principio del libro, van dedicados al amable lector.

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Es imperativo hacer mención del gran aporte que el invento del microscopiorepresentó para las ciencias biológicas. Antonio van Leeuwenhoek durante el sigloXVII fue el primer humano que observó las bacterias. Este personaje longevo, nosólo efectuó grandes descubrimientos con sus microscopios de “lente de gota”,sino también nos legó su ejemplo del valor de la palabra científica escrita. Elmicroscopio compuesto que usamos hoy en día fue inventado posteriormente porlos hermanos Hans y Zacarías Janssen, en Middleburg, Holanda. Luego fueperfeccionado por Galileo Galilei y Johannes Kepler.

Durante el siglo XVIII, estos refinados instrumentos fueron curiosaentretención para científicos y aficionados, incluyendo a las ilustradas damas delas cortes europeas. No fue sino hasta el siglo XIX, que los grandes titanes de labacteriología, Luis Pasteur en Francia y Roberto Koch en Alemania, efectuaron losdescubrimientos básicos que han permitido el desarrollo de la bacteriología médicamoderna. Los logros de estos dos pioneros fueron múltiples, por lo que es muydifícil sumarizarlos. Conviene recordar que el increíble avance de la bacteriologíaen las postrimerías del siglo XX, y el que vivirán nuestros descendientes en elpróximo milenio, se fundamentan en sus descubrimientos y los de sus discípulos.

La Primera Edición de este MANUAL PRÁCTICO DE BACTERIOLOGÍAMÉDICA, fue patrocinada por la compañía farmacéutica Pfizer, en septiembre de1996. Esta edición se agotó rápidamente entre profesionales y estudiantes delaboratorio clínico en Centroamérica. Hasta la fecha, este libro ha sido adoptadocomo referencia del trabajo rutinario en bacteriología clínica en múltipleslaboratorios y es libro de texto en varias universidades.

En 1999, el Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social de Guatemala, hareconocido la necesidad de patrocinar una Segunda Edición, la cual llegará a todoslos profesionales y técnicos de la Red Nacional de Laboratorios Clínicos, ahoracomo norma obligatoria a observar en bacteriología médica. El autor ha plasmadoen el presente libro, treinta años de experiencia en la materia, de manera simplistay expresando lo mínimo que es necesario efectuar en los laboratorios clínicos deMesoamérica.

Miguel F. Torres, Q.B., M.A.

Ciudad de Guatemala, 25 de octubre de 1999

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El ojo humano es incapaz de visualizar objetos menores de 30 micras. Por este motivo,antes de la invención del microscopio, el hombre desconoció la vida microscópica y la estructuracelular de los tejidos.

Antonio van Leeuwenhoek fue un comerciante de telas, nacido en 1632 en Delft, Holanda.Fabricó ingeniosos microscopios con pequeños lentes fundidos en placas de diversos metales.Con los cientos de microscopios que hizo personalmente a lo largo de su vida, fue el primer serhumano que observó las bacterias, los protozoos, los glóbulos rojos y los espermatozoides.

Durante 50 años, informó periódicamente sus maravillosos hallazgos en detalladas cartasdirigidas a la Real Sociedad de Londres. A partir de preparaciones de material interdental,dibujó y reportó por primera vez los tres tipos de formas bacterianas.

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Carta a sus hermanas:“La voluntad es algo grande, pues la acción y el trabajo

generalmente siguen a la voluntad y casi siempre el trabajo seacompaña del éxito.

Estas tres cosas, trabajo, voluntad y éxito, llenan la existenciahumana.

La voluntad abre la puerta al éxito, ambos brillantes y felices, eltrabajo pasa estas puertas y al final del viaje el éxito corona nuestrosesfuerzos”.

LOUIS PASTEUR, 1841 (Besançon, Francia)

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Roberto Koch fue un médico rural alemán, nacido en 1843. Sus aportes a la

bacteriología médica fueron enormes. Primero cultivó la bacteria causante del ántrax en

humor vítreo de buey. Luego desarrolló gradualmente técnicas bacteriológicas fundamentales,

como el uso del agar extraído de algas marinas para solidificar los medios de cultivo y

así poder observar colonias.

Con su discípulo Paul Ehrlich, aplicó los colorantes derivados de la anilina a la

coloración de microorganismos. Descubrió las bacterias causantes de el cólera, la tubercu-

losis (bacilo de Koch) y el protozoo causante de la enfermedad del sueño.

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CAPÍTULO 1

BREVE INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA

La microbiología es la ciencia que estudia a los seres vivos microscópicos, esdecir que sólo pueden observarse con ayuda del microscopio. Los pequeños orga-nismos microscópicos son llamados vulgarmente “microbios”, pero la palabra co-rrecta para designarlos es microorganismos. La microbiología se aplica no sólo a laciencia médica, sino también a la veterinaria, a la agronomía y a la industria, por loque forma parte del plan de estudios de varias carreras universitarias.

Existen muchas clases de microorganismos, los cuales se clasifican según suestructura, manera de reproducirse y muchas otras características. Los grupos másimportantes de microorganismos son: los virus, las bacterias, los protozoos y loshongos. Los virus son los microorganismos más pequeños, se reproducen única-mente dentro de las células y tienen forma similar a cristales. La palabramicroorganismo abarca grupos de seres vivos muy diferentes entre sí.

La microbiología se sub-divide en varias disciplinas que estudian cada grupotaxonómico de microorganismos. Algunos no son propiamente microorganismos,pero su estudio se basa en estructuras microscópicas.

Bacteriología (bacterias)Micología (hongos)Virología (virus)Parasitología

Protozoología (protozoos)Helmintología (helmintos)Entomología (insectos, ácaros, otros)

La mayoría de los microorganismos no son capaces de causar enfermedadesen el hombre y se les llama por esta razón “saprófitos” o “saprobios”. Sin embargo,algunos causan enfermedades en el hombre, llamadas infecciones. Cuando unmicroorganismo es capaz de producir infección, se dice que es “patógeno”; la“virulencia” es la cuantificación de la patogenicidad.

La inmunología nació ligada a la microbiología como el estudio de los meca-nismos de defensa contra los microorganismos. Ahora su campo de acción se haextendido mucho y es una ciencia biológica independiente.

Microbiología

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En todos los ambientes que rodean al hombre existen microorganismos. Lasbacterias y los hongos son los más abundantes; prácticamente todos los objetos quevemos y tocamos están cubiertos de ellos. El cuerpo humano, especialmente don-de hay membranas mucosas (intestino, vagina, boca, etc.), está cubierto debacterias. De los microorganismos que viven constantemente en el hombre, se diceque forman parte de alguna “microbiota”. Por microbiota se entiende aquel con-junto de diversos microorganismos que normalmente convive con el hombre sincausarle ningún daño. La palabra “flora” no es correcta, y por lo tanto no debeutilizarse. Se dice que los microorganismos de las microbiotas “colonizan”, noinfectan, aunque eventualmente pueden hacerlo y en este caso se les llama“oportunistas”.

EL NOMBRE CORRECTO DE LOS MICROORGANISMOS:

Todos los nombres científicos de los seres vivos, de acuerdo con el sistemabinario de Linneo, se componen de dos palabras: la primera que indica un grangrupo, es el género y siempre se escribe la primera letra con mayúscula. El segundonombre es la especie y siempre se escribe con letras minúsculas. Casi todos losnombres científicos de los microorganismos se derivan del griego o del latín, poresta razón:

a) Siempre se subrayan discontinuamente o se escriben con letra cursivab) Nunca se tildan

Ejemplos:

Staphylococcus aureus (bacteria)Escherichia coli (bacteria)Streptococcus pyogenes (bacteria)Pseudomonas aeruginosa (bacteria)Entamoeba histolytica (parásito, protozoo)Giardia lamblia (parásito, protozoo)Ascaris lumbricoides (parásito, helminto)Trichophyton rubrum (hongo)Microsporum canis (hongo)

Además del nombre científico, en algunos casos existe un nombre de uso co-mún o vulgar. El uso de este tipo de nombres debe evitarse.

Los nombres vulgares más conocidos son los siguientes:

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Nombre correcto: Nombre vulgar:

Escherichia coli colibacilo (bacteria)Streptococcus pneumoniae neumococo (bacteria)Neisseria gonorrhoeae gonococo (bacteria)Enterobius vermicularis oxiuro (parásito, helminto)Trichuris trichiura tricocéfalo (parásito, helminto)Entamoeba histolytica ameba histolítica (parásito, protozoo)Entamoeba coli ameba coli (parásito, protozoo)Hymenolepis nana tenia nana (parásito, helminto)Candida albicans monilia (hongo)

Si se desea hacer referencia a todas las especies de un género se usa la abre-viatura para especies: “spp.” y no se subraya. Si sólo se refiere a una especie nodeterminada de un género dado, se usa: “sp.” abreviatura de especie.

Ejemplos:

Streptococcus spp. = todos los estreptococos que existen.Shigella sp. = una especie no determinada del género Shigella.

RECOMENDACIONES DE BIOSEGURIDAD PARA ELLABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Dr. Miguel F. Torres y Dra. Margarita Paz de RamírezLaboratorio Microbiológico de Referencia (LAMIR) y Depto. de Citohistología.

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San Carlos.

Tomado de:

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MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

11. Lavarse las manos frecuentemente12. Usar gabacha13. Usar guantes de caucho en buen estado cuando es necesario14. Usar mascarilla cuando es necesario15. Rotular adecuadamente todo el material y los reactivos16. No comer en el área de trabajo17. No almacenar comida en el área de trabajo18. No fumar19. Usar adecuadamente los desinfectantes10. Usar detergentes y desinfectantes adecuados para cada tipo de material11. Clasificar los desechos12. Descontaminar el material biológico antes de descartarlo13. Esterilizar o incinerar el material contaminado14. Destruir el material descartable o no reusable15. No utilizar materiales inflamables cerca del mechero16. Conocer el uso y manejo de los extinguidores17. Neutralizar los desechos químicos18. Descontaminar el material radioactivo antes de su descarte

Equipo necesario:

1. Campana bacteriológica2. Campana de flujo laminar cuando es necesario3. Lámpara de pie4. Mechero o incinerador5. Incubadora bacteriológica6. Autoclave7. Horno esterilizador8. Agitador de tubos9. Centrífuga

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Equipo de seguridad necesario en un laboratorio de investigación:

1. Extinguidores en lugares accesibles2. Basureros cerrados3. Lava-ojos4. Extractor de vapores5. Incinerador6. Recipientes con desinfectantes y descontaminantes7. Campana de flujo laminar y/o de bioseguridad8. Equipo adecuado para descarte de material contaminado y de solventes9. Recipientes plomados

MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN O DESINFECCIÓN

Método Concentración o nivel Actividad

ESTERILIZACIÓN:Calor Húmedo (autoclave) 121° C a diferentes intervalos de tiempo

Seco (horno) 171° C por 1 hora; 160° C por 2 horas;121° C por 16 horas

Gas Oxido de etileno 450-500 mg/litro a 55-60° CLíquido Glutaraldehido variable

Peróxido de hidrógeno 6-30%Formaldehido 6-8%Dióxido de cloro variable

DESINFECCIÓNCalor Húmedo

(incluye pasteurización) 75-100° C altaLíquido glutaraldehido variable alta-media

peróxido de hidrógeno 3-6% alta-mediaformaldehido 1-8% alta-mediacompuestos clorinados 500-5,000 mg de cloro libre/litro intermediaalcoholes (etanol, isopropílico) 70% intermediacompuestos fenólicos 0.5-3% media-bajacompuestos yodados 0.1-0.2% media-baja

ANTISEPSIAalcoholes 70%yodóforos 1-2 mg de yodo libre/litrohexaclorofeno 1-3%

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DESINFECCIÓN:

Proceso generalmente menos letal que la esterilización.

Elimina virtualmente todos los microorganismos patógenos pero no ne-cesariamente todas las formas microbianas (esporas).

El procedimiento de desinfección carece del margen de seguridad quese logra por los procedimientos de esterilización.

Factores:

1. Naturaleza y número de microorganismos contaminantes.2. El tipo y configuración del material a desinfectar.3. Tipo y concentración del germicida químico usado.4. Tiempo y temperatura de exposición.

DESCONTAMINACIÓN:

Es un término usado para describir un proceso o tratamiento aplicado auna superficie ambiental o a un instrumento de trabajo. Este término abarcadesde lavado con agua y jabón hasta la desinfección o esterilización.

ANTISEPSIA:

Un antiséptico es definido como un germicida usado sobre piel o tejidovivo con el propósito de inhibir o destruir microorganismos.

USO EFECTIVO DE ANTISÉPTICOS, DESINFECTANTES YPROCEDIMIENTOS DE ESTERILIZACIÓN

Factores para la elección de desinfectantes y procedimientos deesterilización.

1. Grado de muerte microbiana requerida.2. Naturaleza del material o la superficie a ser tratada.3. Costo y disponibilidad de los agentes germicidas.

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ESTERILIZACIÓN:

Uso de procedimiento físico o químico para destruir toda la vidamicrobiana, incluyendo grandes cantidades de endosporas bacterianasaltamente resistentes.

Tipos de esterilización:Calor húmedo: autoclave de vaporCalor seco: horno esterilizadorGas de óxido de etilenoEsterilizantes químicos: germicidas basados en glutaraldehido.

RESISTENCIA DE MICROORGANISMOS A GERMICIDAS QUIMICOS(*)

ESPORAS BACTERIANASBacillus subtilis

Clostridium sporogenes

MICOBACTERIASMycobacterium tuberculosis var. bovis

VIRUS PEQUEÑOS O NO LIPÍDICOSPoliovirus - Coxsackievirus - Rhinovirus

HONGOSTrichophyton sp.-Cryptococcus sp.-Candida sp.

BACTERIAS VEGETATIVASPseudomonas aeruginosa

Staphylococcus aureusSalmonella choleraesuis

VIRUS DE MEDIANO TAMAÑO O LIPÍDICOSHerpes simplex - Cytomegalovirus

Virus sincitial respiratorioVirus de Hepatitis B

Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)

(*) En orden descendente de resistencia

RESISTENCIA DE MICROORGANISMOS A GERMICIDAS QUÍMICOS (*)

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CAPÍTULO 2

INTRODUCCIÓN A LA BACTERIOLOGÍA

Las bacterias son microorganismos formados por una sola célula muy sim-ple, que en condiciones ideales realiza funciones de alimentación y reproducción.Son uno de los grupos microbianos más frecuentes y abundantes en casi todos losambientes.

La reproducción de las bacterias ocurre por simple partición de una célula endos células hijas, y ocurre en un tiempo muy corto en comparación con la repro-ducción de otros seres vivientes. Algunas tienen la capacidad de producir esporasque son estructuras de resistencia. Las bacterias pueden ser móviles o inmóviles.Cuando tienen movimiento, lo hacen por medio de flagelos o filamentos largosque agitan en forma de látigo.

Para que las bacterias puedan reproducirse in vitro, es decir en las condicio-nes de laboratorio, debe proporcionárseles todas las sustancias nutritivas que re-quieren (proteínas, azúcares, vitaminas, etc.). Estos nutrientes se encuentran en losmedios de cultivo. El pH es muy importante y debe mantenerse estable y reguladosegún cada medio de cultivo.

Las bacterias se clasifican en base a diversas características. Según sus reque-rimientos de oxígeno, las bacterias pueden ser:

a. Aerobias: Crecen bien en la atmósfera que respiramos, es decir en pre-sencia de oxígeno, el cual requieren para su sobrevivencia.

b. Microaerofílicas: Crecen mejor en presencia de pocas cantidades de oxí-geno. Para disminuir la concentración de oxígeno en el microambienteen el cual se incuban cultivos de bacterias, se recomienda introducirlosen jarros de vidrio con una candela encendida, lo que enriquece con un5 al 10 % de anhídrido carbónico (CO2).

c. Anaerobias: Son incapaces de crecer en presencia de oxígeno, el cual leses sumamente tóxico e impide su crecimiento.

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d. Facultativas: Son capaces de crecern en ausencia de oxígeno y tienen lafacultad de también crecer en aerobiosis.

Según la temperatura óptima de crecimiento, las bacterias pueden ser:

a. Mesófilas: Crecen a temperaturas intermedias, semejantes a la tempe-ratura del cuerpo humano o a la temperatura del ambiente. En estegrupo se incluyen todas las bacterias patógenas, por esta razón la tem-peratura a la cual deben mantenerse constantemente las incubadorasbacteriológicas es de 36 grados centígrados.

b. Termófilas: Crecen a altas temperaturas (calor).

c. Criófilas: Crecen a bajas temperaturas (frío).

d. Psicrotróficas: Crecen a temperaturas de refrigeración.

Según su forma, las bacterias se clasifican en tres grupos:

a. Cocos: Son bacterias de forma esférica o redondeada. Ejemplo, Foto Apágina siguiente: Microfotografía de Staphylococcus aureus en división.

b. Bacilos: Son bacterias alargadas, de forma similar a una salchicha obastoncillo. Ejemplo, Foto B página siguiente: bacilos en división.

c. Espiroquetas: Son bacterias alargadas y retorcidas en forma de resorte oespiral. Ejemplo, Foto C página siguiente: Microfotografía de bacteriasde la microbiota oral; Treponema sp. (espiroquetas), bacilos y cocos.

Dependiendo de su forma de agrupación los cocos pueden clasificarse así:

a. Diplococos: Agrupación de bacterias esféricas en grupos de dos, oparejas (ejemplos: Streptococcus pneumoniae y Neisseria gonorrhoeae).

b. En cadenas. Ejemplo: estreptococos (Streptococcus spp.)

c. En racimos. Ejemplo: estafilococos (Staphylococcus spp.)

Este tipo de clasificación no se aplica a los bacilos ni a las espiroquetas.

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A B

C

32

CÓMO ORGANIZAR EL ÁREA DE TRABAJO DE BACTERIOLOGÍA

Para poder trabajar bacteriología médica, se requiere del siguiente material yequipo básico, según se ilustra en la figura 1 (pág. 34).

1. Una superficie lisa del alto de un escritorio de oficina (76 a 78 cm de alto),material liso, blanco o negro mate, lavable, tipo fórmica. El lugar de trabajo debeestar lejos de ventanas que permitan corrientes de aire, lavatrastos o basureros.Contar con una silla cómoda, giratoria, con respaldo, y ajustable al alto adecuado.

2. Un mechero quemador de gas propano tipo Meker, Bunsen o “Touch-O-Matic”. Ajustar la entrada de aire a manera de obtener una llama azul y translúcida(no amarilla). Debe tenerse presente que solamente es estéril el aire que está un pie(30 cm) alrededor del mechero encendido, por lo que se debe trabajar lo más cercaposible. Situarlo al frente ligeramente hacia la derecha. También puede usarseincinerador.

3. Una campana bacteriológica de madera o fibra de vidrio para aislar el áreade trabajo, la cual debe desinfectarse diariamente antes de iniciar el trabajo. Frotar-la por dentro con formol al 10 por ciento, fenol al 1 por ciento, o por lo menos conalcohol al 70 por ciento. La campana no es indispensable; puede trabajarse sin ella,si se hace con cuidado, es decir sobre una superficie desinfectada y cerca del me-chero.

4. Un autoclave para esterilizar con calor húmedo a presión, material y me-dios de cultivo, “matar” material contaminado y cultivos (esterilizar previo des-carte o limpieza). Puede ser pequeño, tipo olla de presión. Calibrarlo a manera deautoclavear siempre por 15-20 minutos a 121o C y 15 libras de presión por pulga-da cuadrada.

5. Un soporte de asas, que puede ser de madera forrada con fórmica, con lassiguientes asas de “nichrome” (aleación de níquel y cromo), según se ilustra en lafigura 2 (pág. 39): dos en anillo (no calibrada), dos en aguja, y una asa calibrada deplatino puro en anillo pequeño para tomar 0.001 ml (para inocular urocultivos).Para trabajar Micología (hongos) debe contarse también con asa espatulada, asa en“L” y dos agujas de disección. Las asas bacteriológicas deben ponerse rectas y lim-piarse diariamente. Esto se hace fácilmente haciéndolas rodar en el suelo deslizan-do el zapato a manera que rueden y luego hacer el anillo con el cabo de otra asa.Debe trabajarse siempre con dos asas en anillo, cuando una se forma, se usa la queya está fría.

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6. Una lámpara de mesa de pie corto (tipo escritorio) o de “cuello de ganso”;colocarla al frente, ligeramente hacia la izquierda, de manera que ilumine fuerte-mente el área sobre la mesa, pero que la luz no dé directamente a los ojos.

7. Microscopio óptico binocular de buena calidad, con condensador de cam-po oscuro.

8. Lupa o de preferencia microscopio estereoscópico para observar bienlas colonias.

9. Incubadora bacteriológica que debe mantenerse constantemente a 36o Cexactos (no a 37o C ó a 35o C). Debe mantenerse siempre cerrada y pegarle una hojade control diario de temperatura.

10. Balanza para pesar medios de cultivo.

11. Hornilla eléctrica de dos discos y temperatura graduable.

12. Refrigerador con congelador.

13. Frascos grandes de boca ancha, de los que se usan para dulces en las tien-das, con tapadera metálica de rosca que cierre bien. Tener suficientes veladoras(velas gruesas) de parafina. Alternativamente usar jarra Gas-Pak con sobresmicroaerofílicos.

14. Jarro Gas-Pak (BBL) o similar, sobres generadores de anaerobiosis,catalizadores e indicadores para incubar cultivos anaerobios.

15. Agitador de tubos tipo “vortex”.

16. Colorantes, soluciones y medios de cultivo según se describe en cadacapítulo.

17. Gradillas para colocar tubos con medios de cultivo o muestras.

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Fig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍAFig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍAFig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍAFig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍAFig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍA

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LA COLORACIÓN DE GRAM

Las bacterias son microorganismos incoloros, poreste motivo deben teñirse para poder observarlos con ayu-da del microscopio. Por esta razón, a continuación se des-cribe la técnica más importante que debe usarse para di-ferenciar bacterias: la coloración de Gram. Se recomiendausar la modificación de Hucker según Bartholomew, deacuerdo con la bibliografía que aparece al final de estemanual.

a) Preparación de frotes:

La coloración de Gram puede aplicarse a frotes extendidos sobre portaobjetosde vidrio (también llamados frotis) de todo tipo de muestras clínicas, o a frotes desuspensiones de cultivos. Frotar la muestra suavemente y sin revolver mucho so-bre la superficie de un portaobjetos limpio y seco. Esperar que seque sobre unasuperficie lisa o flamear muy levemente. Rotular adecuadamente con crayón grasopor detrás de la lámina. Una vez que el frote ya está seco, fijar pasando levementepor la llama del mechero dos veces, sin que se caliente excesivamente (que no que-me al ponerlo sobre la piel del dorso de la mano). Dejar que el frote se enfríe antesde colorearlo, pues si se colorea caliente precipitan los colorantes.

Si la muestra que se va a colorear contiene mucha sangre, el frote debehemolizarse con agua. Proceder así: dejarlo secar y fijar con calor, cubrir comple-tamente con agua del chorro un minuto, y luego proceder a colorearlo con Gram.Este tratamiento permite destruir los eritrocitos y poder observar las bacterias.

b) Técnica de la coloración de Gram:

1. Cubrir el frote ya fijado y frío con cristal violeta, dejar el colorante por unminuto (ver preparación de colorantes adelante). Enjuagar en un chorro suave deagua corriente. Escurrir muy bien.

2. Cubrir con lugol de Gram y dejar por un minuto. Enjuagar de nuevo sua-vemente con agua corriente, escurrir bien.

3. Aplicar gota a gota el decolorante alcohol-acetona por 4 ó 5 segundos,hasta que ya no salga más cristal violeta. Este paso es crucial y debe ser muy breveen frotes delgados y más prolongado en frotes gruesos.

Hans Gram

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4. Cubrir el frote con safranina sólo por 30 segundos. Enjuagar suavementecon agua, escurrir y dejar secar. El frote puede secarse dentro de la incubadora a36° C, o flamear muy levemente, si es urgente. Otra alternativa es secarlo con aireobtenido de una pera de hule o un secador para manos.

5. Examinar en el microscopio con el lente de inmersión, con aceite especialde viscosidad adecuada.

c) Resultados:

Bacterias gram-positivo: morado-azul obscuro.

Bacterias gram-negativo: rojo.

La diferencia de coloraciones se debe al grosor de la pared celular, que es más“delgada” en las bacterias gram-negativo. Esta coloración sólo es válida para cocosy casi todos los bacilos (excepto micobacterias), no es válida para espiroquetas. Siel frote es de material clínico, es decir de muestras de pacientes, debe quedar rojo asimple vista después de colorearlo. Si hay leucocitos presentes en la muestra éstosdeben ser rojos (gram-negativo) y si hay levaduras deben verse azul-morado (gram-negativo), lo que sirve para evaluar si el frote se decoloró adecuadamente.

d) Informe:

El reporte correcto de una bacterioscopía (observación de bacterias) con Gramdebe contener los siguientes elementos y en este orden:

1. Identificación del paciente (apellidos, nombres, número de registro oafiliación, servicio y fecha).

2. Título que indique el tipo de muestra examinada y el sitio anatómico dedonde proviene. Por ejemplo: Secreción de úlcera en miembro inferior derecho.Coloración de Gram:

3. Mencionar primero las bacterias observadas. Empezar por la clase másfreuente en la muestra, indicar agrupación y cantidad (muy escaso, escaso, regularcantidad, abundante o muy abundante ó +, ++, +++, ++++). Por ejemplo: cocosgram-positivo en cadenas cortas: abundantes; bacilos gram-negativo: regular can-tidad, diplococos gram-negativo: muy escasos. Usar siempre positivo y negativo

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en singular con respecto al Gram, nunca gram-positivos o gram-negativos enplural.

4. Luego es muy importante para el médico saber si hay glóbulos blancos enla muestra, su clase y cantidad. Por ejemplo: Leucocitos polimorfonucleares: abun-dantes. Este dato indica que hay verdadera infección y que la muestra era purulenta.Si se observan bacterias dentro del citoplasma de los leucocitos, mencionar“intracelular” en el reporte, lo que es de especial interés clínico en los frotes desecreciones uretrales masculinas. La presencia de linfocitos indica infección cróni-ca o viral (no purulenta).

5. Indicar siempre la presencia y cantidad de levaduras o micelio de hongos(gram-positivo); de células epiteliales, de especial interés en frotes de esputo (semiran gram-negativo aplanadas con citoplasma grande, transparente y núcleopequeño redondo u ovalado). Aunque no es crucial, indicar la presencia de fibrina,que se mira en forma de hebras gram-negativo alargadas e irregulares.

6. Cuando es necesario, con experiencia y cautela podrán incluirse al finalcomentarios sobre la calidad de la muestra, indicar que la morfología observada escompatible con una especie de bacterias o recomendaciones de tratamiento (conmucha prudencia).

Reactivos para la coloración de Gram:(Modificación de Hucker según Bartholomew)

1. CRISTAL VIOLETA:Solución “A”:Cristal violeta (certificado) ............................................... 2 gramosAlcohol etílico al 95 % ....................................................... 20 ml

Solución “B”:Oxalato de amonio ............................................................ 0.8 gramosAgua destilada ................................................................... 80 ml

Mezclar ambas soluciones, para preparar 100 ml. Guardar (en oscuridad) 24horas antes de usarse y filtrar con papel filtro directamente al frasco de coloración.

2. LUGOL DE GRAM:Cristales de yodo ............................................................... 1 gramoYoduro de potasio .............................................................. 2 gramos

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Agua destilada ................................................................... 300 ml

Moler en un mortero el yodo y el yoduro. Agregar el agua destilada (enprobeta) poco a poco. Continuar moliendo para disolver completamente; agregarel agua a manera de ir lavando el mortero, hacia una botella de vidrio oscuro(ámbar). Sólo dura una semana.

3. ALCOHOL-ACETONA (Decolorante):Mezclar volúmenes iguales de acetona pura (para análisis) y alcohol etílico

al 95 %.

4. SAFRANINA:Solución stock (concentrada):Safranina-0 (certificada) .................................................... 2.5 gramosAlcohol etílico al 95 %. ...................................................... 100 ml

Solución de trabajo:Diluir 1:10 la solución stock (concentrada), así:Solución stock .................................................................... 10 mlAgua destilada ................................................................... 90 ml

Solución anticorrosiva para desinfectar bisturíes:

Formaldehido (Formol) .................................................... 8 %Alcohol etílico .................................................................... 60-70 %Nitrito de sodio .................................................................. 0.2 %

Para preparar un litro:

En un balón aforado de 1,000 ml (1 litro), colocar 2 gramos de nitrito de sodio,luego agregar 700 ml de etanol absoluto y 200 ml de formaldehido al 40 %. Luegoaforar con 100 ml de agua destilada.

Los bisturíes con sus mangos deben mantenerse constantemente sumergidosen esta solución, dentro de un recipiente de acero inoxidable con tapadera.

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Fig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USOFig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USOFig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USOFig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USOFig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USO

ASAS PARA BACTERIOLOGÍA:ASAS PARA BACTERIOLOGÍA:ASAS PARA BACTERIOLOGÍA:ASAS PARA BACTERIOLOGÍA:ASAS PARA BACTERIOLOGÍA:

1. Asa en argolla o anillo, no calibrada. Generalmente de almbre denichrome. Sirve para siembra por estrías e inoculaciones en general.

2. Asa recta o en hilo. Sirve para trasladar una sola colonia a medios deidentificación, o subcultivo.

3. Asa de platino en anillo. Calibrada para tomar 0.001 ml, paraurocultivo.

4. Asa espatulada, para manipular colonias duras y tomar muestras.

ASAS PARA MICOLOGÍA Y MICOBACTERIAS:ASAS PARA MICOLOGÍA Y MICOBACTERIAS:ASAS PARA MICOLOGÍA Y MICOBACTERIAS:ASAS PARA MICOLOGÍA Y MICOBACTERIAS:ASAS PARA MICOLOGÍA Y MICOBACTERIAS:

5. Asa de almbre grueso en "L", para purificar colonias de hongos yprocedimientos especiales.

6. Aguja de disección con punta aguda, para purificar colonias pequeñasy distribuir las preparaciones de hongos en fresco.

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4. Flamear segunda vez, alterminar la segunda estría.

Fig . 3 INOCULACIÓN DE MEDIOSFig . 3 INOCULACIÓN DE MEDIOSFig . 3 INOCULACIÓN DE MEDIOSFig . 3 INOCULACIÓN DE MEDIOSFig . 3 INOCULACIÓN DE MEDIOSSÓLIDOS POR ESTRÍASSÓLIDOS POR ESTRÍASSÓLIDOS POR ESTRÍASSÓLIDOS POR ESTRÍASSÓLIDOS POR ESTRÍAS

5. Tercera estría. Debe tocarligeramente la segunda estría,y cubrir toda la superficie libredel medio sin tocar al final elinóculo original.

1. Con asa o hisopo estéril,estriar inóculo original deaproximadamente 0.5 cm,en el borde de la caja de Petri.

2. Flamear primera vez alterminar el inóculo original.

3. Segunda estría cruzada,debe tocar ligeramenteel inóculo original.

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CAPÍTULO 3

COPROCULTIVO

PROPÓSITO:

Demostrar por medio de cultivo, la presencia de bacterias enteropatógenas,es decir que infectan el intestino penetrando o no su mucosa. Esto causa diarrea,dolor abdominal, fiebre y a veces la muerte.

Las principales especies enteropatógenas que se buscan en el coprocultivo,en orden de importancia en Guatemala son:

- Shigella flexneri (Shigella grupo B)- Salmonella typhi (agente de fiebre tifoidea)- Shigella sonnei (Shigella grupo D)- Salmonella enteritidis- Shigella dysenteriae tipo 1 (Shigella A-1 o “Bacilo de Shiga”,

causa severa disentería epidémica)- Shigella boydii (Shigella grupo C, rara en Guatemala)- Salmonella choleraesuis- Arizona hinshawii (rara)- Edwardsiella tarda (muy rara)- Yersinia enterocolitica (muy rara)

Las bacterias de la familia Enterobacteriaceae, normalmente habitan en el in-testino humano, por lo que se conocen comúnmente como “enterobacterias”. For-man aproximadamente el uno por ciento de la microbiota fecal, el resto son bacte-rias anaerobias. Por esta razón es muy importante que el laboratorio esté en capaci-dad de aislar, diferenciar e identificar correctamente los enteropatógenos de la listaanterior.

MUESTRA:

Para efectuar un coprocultivo pueden inocularse las siguientes muestras:

- heces frescas (la mejor muestra)- hisopo rectal (cuando no se obtienen heces)

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- material obtenido por proctoscopía- biopsia de mucosa intestinal

Las muestras deben tomarse antes de iniciar tratamiento con antibióticos. Lasheces deberán procesarse lo más pronto posible, de preferencia antes de 2-3 horasde ser emitidas; no es necesario que el paciente esté en ayunas. El hisopo rectal esuna buena toma de muestra (en caso de no ser posible obtener muestra de hecesreciente) porque arranca las bacterias que se encuentran dentro de la mucosa.En los adultos, introducir con cuidado en el ano un hisopo estéril 4 centímetros,dar 3 vueltas a la derecha y 3 vueltas a la izquierda. En los niños, introducir elhisopo 2.5 centímetros y dar la misma cantidad de vueltas. En el adulto es más fáciltomar el hisopo rectal, con el paciente acostado de lado y él mismo separándose losglúteos. Los niños deben acostarse boca arriba y con la mano izquierda tomarambos pies, presionar a manera de flexionar las rodillas hacia abajo y luegointroducir el hisopo.

Cuando las heces, que se encuentran a 37° C dentro del intestino, son colecta-das y permanecen a temperatura ambiente (aproximadamente a 20° C), el pH bajaconsiderablemente (acidez) y hace que las bacterias especialmente Shigella spp. pier-dan su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por esta razón si la mues-tra de heces no se procesa con la velocidad ya indicada, debe colocarse en un me-dio de transporte bufferado que evite los cambios bruscos de pH. Para este propó-sito colocar con hisopo estéril una porción anormal de las heces (con moco, sangreo pus) aproximadamente del tamaño del hisopo bien cargado en tubos o viales con3 ml del siguiente medio de transporte: glicerol-salino bufferado, (especialmentepara Shigella), o caldo Hajna GN (Gram-negativo). Probablemente el mejor mediode transporte para enterobacterias sea Carry-Blair. El caldo GN es deenriquecimiento, por lo que debe incubarse a 36°C por aproximadamente 18 horasantes de sembrarse, pero puede usarse como transporte alternativo en ausencia deglicerol-salino bufferado.

Glicerol salino bufferado

Para transporte de coprocultivosCloruro de sodio ......................................................................4.2 gramosFosfato dipotásico (anhidro) ..................................................3.1 gramosFosfato monopotásico (anhidro) ...........................................1.0 gramosRojo fenol ..................................................................................0.003 gramosAgua destilada .........................................................................700 mlGlicerina ...................................................................................300 ml

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El pH final debe ser 7.2. Medir 3 ml en viales o tubos con tapón de rosca yluego autoclavear a 121°C por 10 a 15 minutos. Descartar si el medio se acidificay vira a color amarillo.

Otros caldos de enriquecimiento como Selenito-F o Tetrationato con yodo nodeben usarse excepto en encuestas especiales para buscar Salmonella spp., ya quesu uso retrasa 24 horas el resultado del coprocultivo, lo que disminuye considera-blemente su utilidad clínica.

La coloración de Gram de heces nunca debe practicarse por carecer de signi-ficado clínico, excepto en los siguientes casos: colitis pseudomembranosa causadapor Staphylococcus aureus donde predominan en el frote cocos gram-positivo, o encaso de candidosis intestinal, donde predominan en el Gram las levaduras(gram-positivo).

PROCEDIMIENTO:

Debe conocerse la edad del paciente, anotar si es niño menor de 6 meses.

Para efectuar el coprocultivo deben usarse medios que sean selectivos (con-tienen inhibidores, por lo que sólo permiten el crecimiento de bacilos gram-negativo)y diferenciales (contienen lactosa e indicadores de pH que viran cuando se produ-ce ácido, lo que hace cambiar el color de las colonias y así las diferencia).

Algunos de estos medios contienen sales de hierro que precipitan en formade sulfuro ferroso de color negro intenso si las bacterias producen ácido sulfhídrico.El coprocultivo debe efectuarse en dos medios selectivos/diferenciales diferentes,de preferencia uno más inhibidor que otro. Se recomienda usar rutinariamente agarMacConkey y agar XLD o agar SS (Salmonella y Shigella).

En caso de heces con moco y sangre (disentería) debe incluirse adicionalmenteel medio de Hektoen, lo mismo que para material obtenido por biopsia intestinal yproctoscopía.

El color original y los virajes producidos por el crecimiento bacteriano, enestos tres medios que contienen el azúcar lactosa (como agente diferencial) es elsiguiente:

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Efectúe el coprocultivo así:

1- Inocular una porción anormal de heces (con moco, sangre o pus) o de mues-tra similar, directamente en una caja de MacConkey y una caja de SS. El inóculose coloca con asa en anillo (flameada y fría) o con hisopo en las cajas de ambosmedios. Inocular sólo 1/2 cm en un extremo en el MacConkey y 1 cm en el SS.El Hektoen se inocula igual que el MacConkey.

2- Diseminar el inóculo utilizando dos asas en anillo. Flamear una de las asasmientras la otra se enfría (ver figura 3, pág. 40).

3- Ya diseminadas de esta manera las muestras en la superficie de las cajas,incubar a 36°C por 18 a 24 horas, en la incubadora, con esa temperatura con-trolada diariamente (ver figura 4, pág. 45).

COLORANTES DEINOCULAR

rosado

rosadoligeramenteamarillento

verde claro

rojo

MEDIO

MacConkey

SS

Hektoen

XLD

COLONIASCON ÁCIDO

SULFHÍDRICO

no cambian

negro

negro

negro

COLONIASLACTOSA-NEGATIVO

incoloras

incoloras

verdeazuladas

rojas

COLONIASLACTOSA-POSITIVO

rojo (rosado)

rojo

anaranjado-salmón

amarillas

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Fig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVOFig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVOFig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVOFig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVOFig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVO

Muestras:

I N O C U L A RRutina

HektoenXLD ó SSMacConkey

Diseminar por estrías, incubar a 36o C

Heces frescas

Medios:

Seleccionar colonias según el caso,trasladar a TSI/LIA/urea

Material deproctoscopía,biospia intestinal

Hisopo rectal Sedimento deenema salino

Opcional

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INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

1- Después de incubadas, observar cuidadosamente las dos o tres cajas de cadapaciente simultáneamente. Debe contarse con una luz de lámpara que ilumi-ne las cajas por detrás y observarlas utilizando una lupa corriente. Marcarpor detrás con un círculo de crayón graso cada tipo diferente de colonias sos-pechosas así: Primero escoger en el MacConkey una colonia por cada tipo decolonias lactosa-negativo (incoloras), empezando por las colonias más peque-ñas (más o menos 1 mm de diámetro). Si el paciente es un niño menor de unaño, se marcará adicionalmente en el MacConkey una colonia típica deEscherichia coli (roja, brillante y de bordes lisos pero no mucosa), de la partede la caja donde las colonias están más separadas y ponerle con crayón grasopor detrás “C” al lado. Examinar el SS de la misma forma. En este medio elcrecimiento será más escaso pues es más inhibidor. Marcar por detrás unacolonia por cada tipo de colonias lactosa-negativo (incoloras) empezando porlas más pequeñas, e incluyendo una colonia con centro negro (ácidosulfhídrico) si las hay. Si se inoculó Hektoen, marcar una colonia pequeñaverde azulado (lactosa-negativo).

Fig. 5 OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSASFig. 5 OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSASFig. 5 OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSASFig. 5 OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSASFig. 5 OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS

Marcar coloniassospechosas pordetrás de la caja de Petri

CRAYÓN GRASO

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2- El laboratorio debe contar con un microscopio estereoscópico para hacer lossub-cultivos con asa en aguja o recta así:

Colocar las cajas con las colonias previamente marcadas bajo el microscopioestereoscópico y enfocar. Usar un par de asas en hilo bien rectas, flameadas yfrías, acostúmbrese a usarlas según se indica a continuación: apoyándose enel borde del microscopio con los dedos meñique y anular de la mano derecha(izquierda si es zurdo), tome el asa recta a manera de lápiz y bájela lentamen-te hasta que aparezca en el campo del microscopio y sólo toque la superficiede la colonia seleccionada, con cuidado de no pincharla o pasar tocando otrascolonias cercanas. Con cuidado de no contaminar la punta del asa que yatocó la colonia sospechosa, destape un tubo (13X100) de TSI (medio rojo)con el dedo meñique de la mano derecha, flamee bien la boca del tubo yluego pinche el medio en el centro y hasta el fondo a manera de tocar exacta-mente el centro del fondo del tubo, retire el asa sin salir del tubo de TSI yluego haga un estriado rápido y parejo en la superficie inclinada. Sin flameary con la misma asa, inocule el medio LIA (morado) pinchando esta vez tresveces y luego estriar la superficie y con la misma asa sin flamear, haga unaestría en un tubo de agar urea de Christensen (mejor tomar una nueva colo-nia de igual morfología). Si no cuenta con microscopio estereoscópico proce-da así:

Tome la caja ya marcada de MacConkey, XLD o SS Hektoen entre los dedospulgar, índice y medio de la mano izquierda (retraiga los dedos anular y me-ñique). Colóquela verticalmente a manera que la luz pase por detrás a travésde la caja, tome su asa recta agarrada como un lápiz con la mano derecha,apoye firmemente los dedos anular y meñique en la palma de su mano iz-quierda que sostiene la caja. Acerque cuidadosamente el asa y toque con muchocuidado la colonia seleccionada sin pincharla ni tocar otras colonias cercanas.(ver figura 6, pág. 48). Inocule simultáneamente una pareja de TSI/LIA y ureaagar según ya se describió. Estos tres medios en tubo deben tener 2.5 cm defondo y 3.8 cm de superficie inclinada para que funcionen correctamente,Rotular ambos tubos y colocarlos por pareja en gradillas. Si el MacConkeysólo presenta colonias lactosa-positivo (rojas) descártelo. Lo mismo se harácon el Hektoen que sólo presenta colonias lactosa-positivo (anaranjado sal-món), o el XLD que sólo presenta colonias amarillas. Reincube la caja de SSotras 24 horas a temperatura ambiente para investigar la presencia de Yersiniaenterocolitica.

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Fig. 6 TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALESFig. 6 TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALESFig. 6 TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALESFig. 6 TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALESFig. 6 TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES

3- Incube a 36°C la gradilla con las parejas TSI/ LIA y urea, de manera que noquede duda de qué tubo de TSI corresponde a su LIA. Deben permanecer enincubación de 18 a 24 horas. Los tapones de rosca deben quedar ligeramenteflojos para permitir la entrada de oxígeno. Las colonias marcadas “g” (E. coli,niños menores de un año) pueden pasar sólo a TSI, para ahorrar LIA y urea.

4- Examine las reacciones coloreadas en el TSI/LIA simultáneamente; tomeambos tubos juntos hacia abajo con la mano derecha y obsérvelos contra laluz. Interprete resultados de acuerdo a la siguiente tabla.

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Reacción yaincubada

Medio sininocular

TSI(rojo)

LIA(morado)

ácidosulfhídrico(h) (-a+++)

negro

negro

A=ácido

Amarillo

Amarillo

K=alcalino

rojo

violeta

R=rojo

noaplicable

Superficieroja

N=neutro

noaplicable

antreamarillo

y morado

Gas (g)(-a+++)

burbujaso

rupturas

burbujaso

rupturas

Urea de Christensen: (amarillo ligeramente anaranjado), positivo = rosado fuerte;negativo = no hay cambio

Bacteria

Shigella spp.

Salmonella sp.

Yersinia enterocolitica

TSI

K/A,g-,h-

K/A,g+,h++

A/A,g-,h-

LIA

K/A (N),g-,h-

K/K,g+,h+

A (K)/A,g-,h-

UREA

-

-

+

Reacción yaincubada

Medio sininocular

Para expresar en clave y abreviadamente las reacciones en TSI o LIA use lasabreviaturas A, K, R, N, -, +, g, h, según la tabla anterior en este orden: superficie/fondo, gas, ácido sulfhídrico.

Por ejemplo las reacciones de Escherichia coli en TSI; LIA se expresan así:

TSI;LIA = A/A, g+; h-/ K/K, g+, h- oTSI;LIA = K/A, g-; h-/K/N, g-, h-

Las reacciones coloreadas en TSI/LIA, son muy útiles para la identificaciónde los enterobacterias, por lo que en el laboratorio debe contarse con una tablaactualizada de reacciones en TSI/LIA y pruebas bioquímicas en general.

Reacciones a las cuales debe ponerse especial atención:

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5- Los tubos de TSI, marcados “g” y que corresponden a coprocultivos deniños menores de un año deben aglutinarse para investigar Escherichiacoli enteropatógena (“pools” A, B y C) (Según Dr. Myron Levine, U. deMaryland VI Congreso C.A. de Microbiología, comunicacion personal). Elinforme final deberá reportarse así: “Se aisló Escherichia coli enteropatógenadel grupo ___ ” . Debe hacerse notar que aunque el valor cIínico de esta prue-ba ha sido puesto en duda, ya que también existen E. coli invasivas y produc-toras de toxinas que no se investigan, actualmente debe realizarse laaglutinación para demostrar la presencia de serotipos clásicos enteropatógenosen los niños pequeños. Inocule una asada pequeña en caldo tripticasa soya ocaldo BHI (infusión de cerebro y corazón de buey), proceda efectuar la prue-ba de susceptibilidad antimicrobiana según el método de Bauer-Kirby, des-crito más adelante. Si no se observa ninguna aglutinación, ni se aisla Shigella oSalmonella apunte en el libro de trabajo la clave N-SSE, y el informe final deberedactarse así: “Negativo para Shigella, Salmonella y Escherichia colienteropatógena”. (Sólo para niños menores de un año). Las claves sugeridaspara registro en los libros de trabajo evitan escritura innecesaria, facilitan yaceleran el trabajo.

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REACCIONES DE VARIAS ENTEROBACTERIAS EN TSI Y LIA

Enterobacteria

Escherichia coli

Shigella spp.*

Salmonella typhi*

Salmonella spp.*

Arizona hinshawii*

Yersinia enterocolitica*

Citrobacter sp.

Edwarsiella tarda

Klebsiella sp.

Enterobacter sp.

Serratia sp.

Proteus vulgaris

Proteus mirabilis

Morganella morganii(antes Proteus morganii)

Providencia sp.

LIA

K/KóN, g-ó+, h-

K/A, g-, h-

K/K, g-, h-(+)

K/KóN, g-, h+ (-)

K/KóN, g-, h+ (-)

A(K)/A, g-, h-

K/A, g-ó+, h+ó-

K/K, g-ó+, h+

KóN/KóN, g+ó, h-

KóN/KóN, g+(-), h-

KóN/KóN, g-, h-

R/A, g-, h-(+)

R/A, g-, h-(+)

KóR/A, g-, h-

R/A, g-, h-

UREA

-

-

-

-

-

+

+ ó -

-

+

-(+)

- ó +

+

+

+

-

TSI

A(K)/A, g+ (-), h-

K/A, g-, h-

K/A, g-, h+ (poco)

K/A, g-, h+++(-)

K(A)/A, g+, h+++

A/A, g-, h-

K(A)/A, g+, h+++(-)

K/A, g+, h+++(indol +)

A/A, g++, h-(mucosidad ++)

A/A, g++, h-

KóA/A, g-, h-

A(K)/A, g+, h+++

K(A)/A, g+, h+++

K/A, g-(+), h-

K/A, g+ ó-, h

Nota Importante:Solamente reportar como coprocultivo positivo las enterobacterias marcadas con * el restoes microbiota normal y no debe reportarse nunca. Reacciones menos probables entreparéntesis. Todas las reacciones con reacción roja (R) en la superficie de LIA, presuntivamenteson Proteus sp., Morganella sp. o Providencia sp., no tienen importancia clínica en coprocultivosy no deben tomarse en cuenta. Esta tabla es sólo una guía, que debe actualizarseconstantemente.

+-

52

DIFERENCIACIÓN DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO SHIGELLA:

TSI y LIA = K/A,g-,h-

Oler el medio de TSI sin tocarlo con nariz o boca, el olor a “semen” es caracte-rístico de Shigella spp., especialmente de Shigella grupo B (Shigella flexneri), la másfrecuente en Guatemala. El fondo de los tubos de TSI y LIA no presentan gas, niácido sulfhídrico y tienen un color “amarillo canario”. La reacción K (alcalino) dela superficie del TSI es roja de un tono fresa no muy intenso. Aglutinar el creci-miento del TSI sospechoso, o del LIA así:

Utilice la tapadera limpia y seca de una caja de Petri, ráyela con crayón grasopor detrás a manera de hacer rayas paralelas y perpendiculares que formen cuadritosde aproximadamente un centímetro cuadrado. Coloque todas sus parejas TSI/LIAcon reacción sospechosa de Shigella, en orden numérico en una gradilla. En la mis-ma gradilla pero en otro extremo ordene en pares los TSI/LIA con reacción sospe-chosa de Salmonella y los TSI marcados “C” (Escherichia coli) para proceder a aglutinar.Por cada pareja sospechosa de Shigella (K/A,g-,h-; K/A,g-,h-) coloque en el centrode un cuadrito una gotita de antisuero “Shigella grupo B” (Shigella flexneri). Aglutinetomando una porción pequeña del crecimiento en TSI (puede ser también del LIA)con asa en anillo estéril; coloque el crecimiento sobre la caja (mueva el asa en óvalopequeño sin tocar la gota), luego suspenda bien el crecimiento en la gota a manerade obtener una suspensión ligeramente lechosa. Observe inmediatamente despuésde inclinar la tapadera de la caja hacia adelante y hacia atrás la aparición deaglutinación franca y obvia.

Sólo tomar en cuenta aglutinaciones que ocurren antes de 1 minuto despuésde mezclar. Si aglutina reportar Shigella B en el libro de trabajo. Si no aglutina sigaaglutinando pero siempre en este orden para ahorrarse trabajo y anti-sueros, queson muy caros:

1- Shigella flexneri, grupo B - La más frecuente en Guatemala2- Shigella sonnei, grupo D - La segunda más frecuente en

Guatemala3- Shigella dysenteriae, grupo A - Rara pero grave y epidémica, debe

darse alerta al médico.4- Shigella boydii, grupo C - Muy rara vez se aisla en el país.

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DIFERENCIACIÓN DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO SALMONELLA:

La taxonomía moderna del género Salmonella ha cambiado, sin embargo para finesprácticos de diagnóstico y de investigación, se recomienda usar la clasificación an-tigua simplificada así:

- Salmonella typhi: causa fiebre tifoidea con diseminación genera-lizada de la bacteria (puede aislarse de heces,médula ósea, sangre, orina, etc).

- Salmonella enteritidis: causa infección intestinal y puede diseminarsea la sangre.

- Salmonella choleraesuis: rara, causa infección en animales y rara vezen el hombre.

Salmonella typhi presenta en TSI dos características muy importantes parasu identificación, las que se complementan con LIA, citrato de Simmons yaglutinación:

1- No produce gas.2- Produce poco ácido sulfhídrico (una pequeña mancha negra,

a veces difícil de apreciarse en el área del tubo donde empieza elinclinado).

3- Generalmente, el LIA es todo morado (K/K,g-,h-(+)4- Es citrato-negativo.5- Aglutina con el antisuero anti-antígeno Vi.

El agar inclinado de citrato de Simmons es un medio verde que se preparainclinado con las mismas medidas del TSI/LIA. Debe inocularse con una asada delcrecimiento de los tubos TSI o LIA sospechosos de Salmonella, luego se incuba a36°C de 18 a 24 horas y los cambios de color se interpretan así:

verde = negativoazul = positivo

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Diferencie presuntivamente las especies del género Salmonella con estas trespruebas sencillas:

(+) = positivo lento, más de 3 días de incubación.

En resumen, para diferenciar e identificar Salmonella siga estos pasos:

1- Identifique las reacciones sospechosas en TSI/LIA de Salmonella typhi ySalmonella spp. según la tabla. Es muy importante notar la reacción todamorado-violeta en el LIA (K/K), es decir el medio no cambia de color locual es típico del género Salmonella. Anote la cantidad de ácido sulfhídricoen el TSI.

2- Ordene sus TSI/LIA/urea en la gradilla de tubos para aglutinación y, segúnya se explicó, aglutine todos los TSI con una gota de antisuero comercialpolivalente de Salmonella.

3- Si la reacción es positiva, inocule un tubo de citrato de Simmons e incube,simultáneamente inocule la prueba de susceptibilidad antimicrobiana.

4- Si el laboratorio cuenta con el set de antisueros de grupo de Salmonella, aglutinesólo los tubos con aglutinación franca en el antisuero polivalente a Salmonellaen los antisueros de grupo. Algunos grupos frecuentes en Guatemala son B,G, y C1. Salmonella typhi pertenece al grupo D, por lo que aglutinación positi-va a este grupo, además de las otras pruebas sencillas confirma esta especie.Si se investiga el grupo, éste debe informarse, por ejemplo:

Se aisló Salmonella enteritidis del grupo B.

Idealmente el laboratorio podrá confirmar con más seguridad y mayor

Ácido sulhídrico(TSI)

+ débil

+++

+ (sólo 60%)

Gas(TSI)

-

+

+

Citrato

-

+

(+)

PruebaEspecie

Salmonella typhi

Salmonella enteritidis

Salmonella choleraesuis

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trabajo las especies de enterobacterias con sistemas de múltiples pruebasbioquímicas miniaturizadas, por ejemplo API, según las condiciones de trabajo.

INFORME:

El informe del coprocultivo debe constar de 3 partes:

1- Título: coprocultivo, cultivo de biopsia colónica, etc. De preferencia debe es-cribirse con mayúsculas y centrado.

2- Resultado: Para ahorrar tiempo y trabajo, debe apuntarse el resultado en cla-ve, en el libro de trabajo y luego la secretaria del laboratorio lo deberátranscribir con el texto correcto, según la próxima tabla. Incluir el grupo deSalmonella si se efectuó. En el caso de Shigella no es necesario poner el grupo,sólo la especie, par ejemplo: Se aisló Shigella flexneri.

3- Prueba de susceptibilidad antimicrobiana (S/A): con los antibióticos de utili-dad clínica para tratar infecciones por enterobacterias.

Utilice la siguiente tabla para registrar e informar el resultado del coprocultivo:

S/A = susceptibilidad antimicrobiana.

RESULTADO

Coprocultivo negativode adulto

Coprocultivo negativo deniño menor de un año

Coprocultivo positivo

TEXTO (Secretaria)

No se aislan enteropatógenos, desarrollanbacterias de la microbiota normal

Negativo para Shigella, Salmonella yEscherichia coli enteropatógena

Se aisló Shigella dysenteriae. S/A

Se aisló Shigella flexneri. S/A

Se aisló Shigella boydii. S/A

Se aisló Shigella sonnei. S/A

Se aisló Salmonella typhi. S/A

Se aisló Salmonella enteritidis del grupo ____. S/A

Se aisló Salmonella choleraesuis. S/A

Se aisló Arizona hinshawii. S/A

Se aisló Yersinia enterocolitica. S/A

CLAVEen libro de trabajo

(técnico)

NP

N-SSE

Shigella A

Shigella B

Shigella C

Shigella D

Salmonella typhi

Salmonella grupo ____

Salmonella choleraesuis

Arizona

Yersinia

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PROCEDIMIENTO PARA CULTIVO DE CUERDAS ENCAPSULADAS(ENTEROTEST)

PARA COLECCIÓN DE MUESTRAS DUODENALES

El objetivo de este procedimiento es obtener una muestra de la bilis del pa-ciente para cultivar específicamente Salmonella typhi; también puede usarse paraexaminar en fresco su contenido para trofozoitos de Giardia lamblia, huevos deClonorchis sinensis, o larvas de Strongyloides stercoralis. El pH de la parte distal de lacuerda debe ser alcalino, si llegó al duodeno. El procedimiento consiste en dar alpaciente (en ayunas) una cuerda de nylon absorbente (de 90 a 140 cm para adulto y67 cm para niños) dentro de una cápsula, la cual debe tragarse con agua. Un extre-mo de la cuerda se pega por fuera a la cara del paciente con cinta adhesiva y el otrodistal debe llegar hasta el duodeno, donde permanece cuatro horas para empapar-se de bilis. El paciente sólo debe beber agua, mínimo un vaso por hora.

Procedimiento:

1- El médico debe extraer (usar guantes) la cuerda de la boca mediante una trac-ción rápida pero suave. Luego cortar con tijeras estériles la punta de la cuerda(amarilla por la bilis), a manera de que caiga asépticamente en un tubo obotellita con caldo tetrationato.

2- El caldo tetrationato sirve para enriquecer la muestra para el aislamiento deSalmonella. Agitar e incubar 24 horas a 36° C.

3- Después de la incubación, inocular por estrías una asada del caldo tetra-tionato (agitado) en MacConkey y SS. Incubar 18 a 24 horas aeróbicamente a36° C.

4- Trasladar las colonias lactosa-negativo (incoloras) a TSI, LIA, urea y citrato,incubar 18 a 24 horas a 36° C.

5- Identificar Salmonella typhi por medio de sus reacciones en TSI, LIA, urea ycitrato. Aglutinar con anti-suero polivalente de Salmonella, antígeno Vi y gru-po D, según ya se explicó.

Medio de cultivo:

Preparar el caldo de tetrationato adicionado con yodo y verde brillante segúnlas instrucciones en el frasco de la base en polvo, así:

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Suspender 17.5 gramos de la base en polvo en 500 ml de agua destilada, ca-lentar hasta que hierva. Dejar enfriar a menos de 45° C y luego agregar: 10 ml desolución de yodo (yodo: 6 g, yoduro de potasio: 5 g, agua destilada: 20 ml.) y 5 mlde solución acuosa de verde brillante al 0.1 %.

Medir 10 ml en frasquitos estériles (de los que vienen con el medio ThayerMartin) o tubos estériles con tapón de rosca. El medio debe quedar verde con pre-cipitado blanco.

LA EPIDEMIOLOGÍA Y ETIOLOGÍA DE LA DIARREA

Adaptado de:

World Health Organization. 1992. Control of Diarrheal Diseases Program.Readings on Diarrhea, Student Manual, Unit I The Epidemiology and Etiologyof Diarrhea. Geneva.

Usualmente se define a la diarrea como la eliminación de tres o másevacuaciones intestinales líquidas o blandas en un período de 24 horas.

Existen tres tipos de diarrea:Diarrea aguda, líquidaDisenteríaDiarrea persistente

El problema que representan las enfermedades diarréicas

La diarrea es una de las causas principales de enfermedad y muerte enlos niños menores de 5 años de los países en desarrollo, en donde ocurrenaproximadamente 1.3 mil millones de episodios y 3.2 millones de muertes alaño por diarrea. En promedio, estos niños padecen 3.3 episodios de diarreapor año, pero en algunas áreas, el promedio pasa de nueve episodios por año.Es común que donde los episodios son frecuentes, los niños pasen el 15% desus vidas con diarrea. Dentro de este grupo de edad, los niños menores dedos años, son los que sufren la mayor morbilidad y mortalidad. Se estima queaproximadamente 80-90% de las muertes por diarrea ocurre en niños meno-res de dos años. La causa principal de muertes por diarrea aguda es ladeshidratación, la cual resulta por la pérdida de líquidos y electrolitos. Otrascausas importantes de muerte son disentería, desnutrición y otras infeccionesserias, como neumonía.

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Disentería

Esta forma de diarrea se caracteriza por la presencia de sangre visible enlas heces fecales y frecuentemente presencia de moco. Sus efectos importan-tes incluyen anorexia, pérdida de peso rápida y daños a la mucosa intestinalcausados por la bacteria invasora.

La mayoría de los casos de disentería aguda en niños, son causados porShigella spp. Otras causas son Campylobacter jejuni y menos frecuentementeEscherichia coli entero invasora (EIEC) y Salmonella. El protozoo Entamoebahistolytica, puede causar disentería seria en adultos jóvenes, pero es una causamuy rara en niños. En alrededor de 90% de los casos de infección intestinalpor Entamoeba histolytica, las cepas no son virulentas.

Los pacientes con disentería causada por Shigella dysenteriae tipo 1 (Ba-cilo de Shiga), están a menudo clínicamente muy enfermos. Este síndromeclínico casi siempre incluye fiebre alta, síntomas tóxicos y cólicos abdomina-les intensos y tenesmo. Ocasionalmente se registran convulsiones. A veces seacompaña de complicaciones graves, como el síndrome hemolítico urémico.

Pueden presentarse epidemias de gran magnitud causadas por esteenteropatógeno. Esto ocurrió en Centroamérica en los años 1969 y 1970. Laterapia antimicrobiana apropiada aminora significativamente la gravedad yduración de la disentería y de la fiebre, así como la excreción del patógeno.

EPIDEMIOLOGÍA

Transmisión de los agentes que causan diarrea

Los agentes infecciosos que causan diarrea generalmente se diseminanpor la ruta fecal-oral, lo cual incluye la ingestión de agua o alimentos conta-minados fecalmente, y el contacto directo con heces fecales.

Varios comportamientos específicos de las personas contribuyen a lapropagación de los enteropatógenos y por consiguiente incrementan el ries-go de sufrir diarrea. Estos incluyen:

- Falta de lactancia materna exclusiva durante los primeros 4-6meses de vida.

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- Usar biberones para alimentar a los niños.- Guardar alimentos a temperatura ambiente.- Beber agua contaminada con bacterias fecales.- No lavarse las manos después de defecar, después de desechar las

heces de los niños o de limpiar los pañales y antes de preparar oservir alimentos.

- No desechar higiénicamente las heces (incluyendo las de loslactantes).

Epidemias

En las áreas tropicales, la diarrea por rotavirus ocurre todo el año, au-menta su frecuencia durante los meses secos y más fríos, mientras que lasdiarreas bacterianas aumentan durante la estación lluviosa y más cálida. Laincidencia de diarrea persistente sigue el mismo patrón estacional de la dia-rrea aguda líquida.

Hay dos enteropatógenos Vibrio cholerae y Shigella dysenteriae tipo 1 queprovocan grandes epidemias en las que la morbilidad y mortalidad en todoslos grupos de edad son altas. Desde 1961, el cólera causado por el biotipoEltor de V. cholerae 01 se ha diseminado a países de Asia, el MediterráneoOriental, Africa, y a algunos países de Europa. Desde 1991, ha causado epide-mias en prácticamente todos los países de América Latina y casos sindiseminación secundaria en los Estados Unidos. Durante el mismo períodode tiempo Shigella dysenteriae tipo 1 ha ocasionado grandes epidemias dedisentería grave en Centro América (69-70) y, más recientemente, en AfricaCentral y Sur de Asia.

ETIOLOGÍAEnteropatógenos importantes:

Virus: RotavirusBacterias: Escherichia coli enterotoxigénica

Shigella spp.Campylobacter jejuniVibrio cholerae 01Salmonella spp.

Protozoos: Cryptosporidium parvum

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Patógenos frecuentemente identificados en niños con diarreaaguda, atendidos en centros de tratamiento, en países en desarrollo

Patógeno Porcentaje de Antimicrobianoscasos recomendados en

base clínica*

Virus Rotavirus 15-25 Ninguno***

Bacterias Escherichia coli 10-20 Ningunoenterotoxigénica

Shigella 5-15 Trimetoprim-sulfametoxazol,Ácido nalidíxico

Campylobacter jejuni 10-15 Ninguno

Vibrio cholerae 01 5-10** Tetraciclina,Doxiciclina,otros

Salmonella (no tifoidea) 1-5 Ninguno***

Escherichia coli 1-5 Ningunoenteropatógena

Protozoos Cryptosporidium parvum 5-15 Ninguno***

Ningún patógeno 20-30 Ninguno***aislado

* Para cepas sensibles** En áreas endémicas; puede ser más alto durante epidemias*** Ningún antimicrobiano efectivo

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Otros patógenos, cuya importancia como causa de diarrea aguda enniños en los países en desarrollo es mínima, o no está bien definida. Estosincluyen:

Virus: agente Norwalkadenovirus entéricos

Bacterias: Aeromonas hydrophilaEscherichia coli enteroagregativaEscherichia coli enteroinvasoraEscherichia coli enterohemorrágicaPlesiomonas shigelloidesVibrio cholerae que no es 01Vibrio parahaemolyticusYersinia enterocolitica

Protozoos: Giardia lambliaEntamoeba histolyticaIsospora belliCyclospora cayetanensis

Mecanismos Patogénicos de los Agentes Etiológicos de Diarrea

Los enteropatógenos causan diarrea por varios mecanismos, algunos delos cuales se revisan a continuación.

VirusLos rotavirus se replican dentro de las células epiteliales maduras que

cubren la porción superior de las vellosidades intestinales, causando destruc-ción celular y acortamiento de las vellosidades.

BacteriasAdherencia a la mucosaProducción de toxinas que causan secreción intestinalInvasión de la mucosa

ProtozoosAdherencia a la mucosaInvasión de la mucosa

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Shigella

Shigella es la causa más importante de disentería, encontrándose en al-rededor de 60% de todos los episodios y en prácticamente en todos los episo-dios graves de esta forma de diarrea; también pueden causar diarrea líquida.

S. flexneri es la especie más prevalente en países en desarrollo, sin em-bargo, S. dysenteriae tipo 1 que causa epidemias regionales es responsable dela disentería más grave. La destrucción tisular y posiblemente la diarrea lí-quida son producidas en parte por la extremadamente potente toxina deShiga, que es producida en cantidades relativamente grandes por S. dysenteriaetipo 1. Shigella se disemina principalmente por la transmisión de persona apersona. El tratamiento efectivo contra Shigella spp. se hace conantimicrobianos a los cuales son susceptibles, pero es común la resistenciaantimicrobiana. Puede haber resistencia a múltiples antimicrobianos especial-mente en las cepas de S. dysenteriae tipo 1. Los antimicrobianos más útiles sontrimetoprim-sulfametoxazol y ácido nalidíxico; en algunas áreas también esefectiva la ampicilina.

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CAPÍTULO 4

COPROCULTIVO PARA CÓLERA

PROPÓSITO:

Demostrar por medio de cultivo la presencia de Vibrio cholerae 01, la bacteriacausante del cólera. Esta bacteria se adquiere por ingestión de bebidas o alimentoscontaminados. Llega al intestino delgado, donde se adhiere a la mucosa y, debido ala producción de una potente toxina, causa la salida masiva de agua y electrolitos.En un bajo porcentaje de los pacientes infectados, se produce el colera gravis, laforma clínica del cólera agudo, con muy abundante diarrea acuosa (semejante a“agua de arroz”) y vómitos. Esto provoca en el paciente deshidratación severa quepuede causar la muerte, si no se instituye tratamiento de rehidratación y antibióticos.

El cólera ha sido endémico en la India y en otros países desde la más remotaantigüedad. En 1961 se inició la séptima pandemia en Indonesia. En enero de 1991apareció en Perú y a partir de allí se ha diseminado a varios países de Latinoamérica,donde ahora es una infección endémica, más frecuente durante la época lluviosa.

Vibrio cholerae 01 (01 indica que pertenece al serogrupo 1 según su antígenosomático), se subdivide en tres serotipos: Inaba, Ogawa, y el serotipo Hikojima queaún no se ha detectado en Latinoamérica. Generalmente si la epidemia se iniciacon el serotipo Inaba, después de algún tiempo se transforma en Ogawa, debido acambio de antígenos. Esta clasificación sólo tiene interés epidemiológico. Existendos biotipos de V. cholerae 01: eltor y clásico. En Latinoamérica, durante la presentepandemia, el biotipo presente es eltor, el cual se caracteriza por causar epidemiascon pocos casos graves (aproximadamente 2%) y muchos casos leves oasintomáticos; también sobrevive más tiempo en el medio ambiente, y es más re-sistente a los agentes químicos.

El tratamiento principal del cólera es evitar la muerte por deshidratación, pormedio del pronto reemplazo de agua y electrolitos. Debe hacerse por vía oral y sies necesario por vía intravenosa. El tratamiento con antibióticos ayuda a la recupe-ración, pues elimina los vibrios y acorta la diarrea, además evita portadores de labacteria. En adultos se recomienda la tetraciclina, y en niños el trimetoprim-sulfametoxazol (cotrimoxazol). En el caso de mujeres embarazadas se indica lafurazolidona.

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El diagnóstico definitivo de cólera se establece sólo por la demostración de V.cholerae 01 por medio de cultivo. El frote Gram directo de las heces puede ser indi-cativo de cólera, pero no se considera un procedimiento diagnóstico exacto.

MUESTRA:

Las muestras adecuadas para efectuar el diagnóstico bacteriológico de el có-lera son: heces diarréicas (principalmente con apariencia de “agua de arroz”), hisoporectal o vómitos. Deben recolectarse de preferencia dentro de las primeras 24 horasde la enfermedad y previo a la administración de antibióticos. Si las muestras deheces frescas van a ser procesadas en un tiempo adecuado (antes de dos horas),deben recolectarse en un recipiente de vidrio o plástico bien limpio, de preferenciaestéril, y enviarse inmediatamente al laboratorio. En caso contrario deben inocu-larse dos hisopos con material fecal en el medio de transporte Cary-Blair, quedebe enviarse al laboratorio de referencia sin necesidad de refrigeración. Enel medio hospitalario no es necesario usar inútilmente el medio de transporteCary-Blair, ya que la muestra de heces frescas debe remitirse al laboratorio para sucultivo directo inmediato.

PROCEDIMIENTO:

Existen muchas variantes en la marcha bacteriológica a seguir para el aisla-miento e identificación de Vibrio cholerae 01. La marcha simplificada propuesta es,en la experiencia del autor, efectiva y sencilla (ver figura 7, pág. 67). V. cholerae 01puede aislarse directamente de las heces, pero se logran resultados mucho mejoressi previamente se hace un enriquecimiento en el caldo selectivo alcalino llamadoagua pepto nada alcalina o APA. En este caldo el agente etiológico del cólera proli-fera en la superficie, pues resiste la alcalinidad extrema del medio (pH 9.0 a 9.2), yotras bacterias de la microbiota fecal se destruyen, por lo que se obtienen cultivoscasi puros.

1. Inocular masivamente un tubo con 5 ml de agua peptonada alcalina,con un hisopo estéril bien cargado de heces o vómito. Sacar el hisopo yagitar muy bien el tubo, luego incubar verticalmente y con el tapón lige-ramente suelto, solamente por 5 a 8 horas a 36° C.

2. Si se trata de heces, inocular directamente cajas de agar MacConkey,XLD o SS e idealmente Hektoen para el aislamiento de Shigella ySalmonella, ya que las infecciones intestinales causadas por estos dosgéneros, clínicamente pueden semejar cólera.

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3. Después del tiempo crítico de incubación del APA, retirar el tubo cuida-dosamente de la incubadora y colocarlo verticalmente en una gradilla osoporte. Destaparlo despacio, sin que se agite, y con el asa en anillo,tomar verticalmente una asada de la superficie del caldo (no más de 5mm de profundidad). Inocular una caja de agar TCBS y una de agarsangre de carnero al 5%. Incubar aeróbicamente 18 a 24 horas a 36° C.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

El agar TCBS (tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa) contiene elevadasconcentraciones de tiosulfato de sodio y citrato de sodio. La fuerte alcalinidad delmedio de cultivo TCBS, inhibe considerablemente las enterobacterias; la bilis debuey y el colato inhiben sobre todo a los enterococos. Los coliformes que eventual-mente puedan crecer, no fermentan la sacarosa (sinónimo: sucrosa). Contiene dosindicadores de pH: azul de timol y azul de bromotimol, que viran al color amarilloen presencia de acidez. Vibrio cholerae es sacarosa positivo, por lo que produce colo-nias amarillas. Vibrio fluvialis, V. furnissii y V. alginolyticus, también producencolonias amarillas en TCBS; estos vibrios son de muy poca importanciaepidemiológica. Algunas cepas de enterococos, Proteus y Klebsiella sacarosa-positi-vo, también pueden producir colonias amarillas, pero de morfología distinta a lasque produce V. cholerae 01.

1. Vibrio cholerae 01 produce en TCBS el crecimiento masivo y puro de co-lonias grandes (de 2 a 3 mm de diámetro), de color amarillo canario(sacarosa-positivo), aplanadas o de bordes delgados. Este tipo de colo-nias en TCBS, en grandes cantidades debido al enriquecimiento selecti-vo en APA, son muy indicativas de la presencia de la bacteria.

2. Si hay crecimiento típico en TCBS, en el agar sangre de carnero se desa-rrollará un crecimiento masivo y casi puro de colonias grandes incolo-ras, brillantes, de bordes aplanados y no hemolíticas. En el área de lacaja donde el crecimiento es confluente, generalmente aparece una zonade decoloración del medio que semeja hemólisis; probablemente se debeal metabolismo de la bacteria, reminiscencia de la hemólisis específica alos eritrocitos de carnero, que presentaba originalmente V. cholerae 01del biotipo eltor; en todo caso, es una característica adicional que ayudaa sospechar la presencia de la bacteria en este medio.

3. Aglutinar las colonias típicas y aisladas del agar sangre de carnero, conantisuero polivalente anti-V. cholerae 01. Al hacerlo, evitar tomar de las

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colonias pequeñas o blancas que pueden aparecer, ya que el medio no esinhibitorio. Nunca debe aglutinarse del TCBS, pues en este medio lascolonias son “chiclosas”, muy adherentes al medio, y no se pueden sus-pender bien en el antisuero, por lo que la aglutinación sólo es confiablea partir del crecimiento en agar sangre de carnero.

4. Si se obtiene una reacción de aglutinación positiva, franca e inmediata,generalmente con presencia de grumos grandes, se ha demostrado lapresencia de V. cholerae 01. Proceder a aglutinar el crecimiento típico delagar sangre de carnero en antisueros anti-serotipo Inaba y anti-serotipoOgawa; generalmente la aglutinación es más fina, pero evidente. Estoúltimo no es crucial, pero si deseable. La prueba de oxidasa es positiva;debe hacerse en caso de duda o confirmación.

5. Si el laboratorio no cuenta con antisuero polivalente anti-V. cholerae 01,se deberá seleccionar una colonia típica del TCBS, y subcultivar en TSI yLIA. En estos medios la reacción después de 18 a 24 horas de incubación,generalmente es TSI: K/A (A/A); LIA: K/K-N, sin gas ni ácidosulfhídrico en ambos tubos. El tubo de TSI debe remitirse al laboratoriode referencia donde se efectúa la confirmación.

6. Efectuar prueba de susceptibilidad a los antibióticos, según el métodode Bauer-Kirby. Sólo deben colocarse los siguientes discos: tetraciclina ytrimetoprim-sulfametoxazol, son indispensables; ampicilina o algún otroantibiótico, son optativos. Interpretar los diámetros de los halos de inhi-bición igual que para enterobacterias. Es deseable, pero no indispensa-ble, colocar en el centro de la caja de agar Mueller-Hinton, un disco con50 UI de polimixina-B. La resistencia con ausencia de zona de inhibicióna este antibiótico, indica que la cepa aislada de V. cholerae 01, perteneceal biotipo eltor. Esto es de esperarse en Latinoamérica, ya que el biotipoclásico no está actualmente presente. Si se detecta una cepa susceptiblea polimixina-B, debe remitirse al laboratorio nacional de referencia per-tinente, para que confirme este hallazgo de interés nacional. El biotipoeltor presenta una prueba de Voges-Proskauer positiva.

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Fig. 7 MARCHA BACTERIOLÓGICA ACORTADA PARAFig. 7 MARCHA BACTERIOLÓGICA ACORTADA PARAFig. 7 MARCHA BACTERIOLÓGICA ACORTADA PARAFig. 7 MARCHA BACTERIOLÓGICA ACORTADA PARAFig. 7 MARCHA BACTERIOLÓGICA ACORTADA PARAAISLAMIENTO DE AISLAMIENTO DE AISLAMIENTO DE AISLAMIENTO DE AISLAMIENTO DE Vibrio choleraeVibrio choleraeVibrio choleraeVibrio choleraeVibrio cholerae 01 01 01 01 01

Nota: Nota: Nota: Nota: Nota: El diagnóstico definitivo se puede obtener en 24 horas

ASC Colonias:- Grandes- No hemolíticas

Hacer froteGram: bacilos

gram-negativo, algunos curvos.Aglutinar, si positivo dar informeSTATSTATSTATSTATSTAT: Vibrio cholerae 01

Hisopo rectalHeces líquidas Vómitos

1. Inocular con hisopo estéril bien cargadobien cargadobien cargadobien cargadobien cargado un tubo con APA,descartar el hisopo y agitar

2. Incubar 5-6 horas 5-6 horas 5-6 horas 5-6 horas 5-6 horas a 36o C

No agitar

Vibro choleraeen la superficiesuperficiesuperficiesuperficiesuperficiedel APA

3. Tomar inóculo de lasuperficiesuperficiesuperficiesuperficiesuperficie del APA

4. Sembrar TCBS y agarsangre de carnero (ASC)

5. Incubar 18-24 horas18-24 horas18-24 horas18-24 horas18-24 horasa 36o C

Muestras:

APA

TCBS Colonias:- Amarillas- Grandes- Planas

Sembrar antibiograma

6. Interpretar simultáneamente

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INFORME:

En el caso de cólera el reporte debe ser inmediato, ya que en los casos gravesla vida del paciente puede depender de este resultado. Por este motivo se justificaplenamente usar una técnica simplificada y evitar pruebas innecesarias, para aho-rrar tiempo. Nunca debe esperarse el resultado del antibiograma para hacer el re-porte de un cultivo positivo. Se recomienda informar así, lo más pronto posible, yal lugar más indicado:

1. Inmediatamente después de una prueba de aglutinación franca a partirdel agar sangre de carnero:

Se aisló Vibrio cholerae O1.

2. Después de aglutinación positiva con antisuero polivalente anti-V.cholerae 01 y luego aglutinación positiva con antisuero de serotipo Ogawao Inaba:

Se aisló Vibrio cholerae 01, serotipo Inaba (u Ogawa).

3. Después de interpretar la prueba de susceptibilidad, pero posteriormentea haber enviado un reporte preliminar:

Se aisló Vibrio cholerae 01, serotipo Ogawa (o Inaba), biotipo eltor.Susceptible a: ... ; Resitente a: ...

FÓRMULAS:

1. AGUA PEPTONADA ALCALINA (APA):

Peptona ...................................................................... 10 gramosCloruro de sodio. ...................................................... 10 gramosAgua destilada .......................................................... 1,000 mlAjustar pH final a 9.0-9.2 con hidróxido de sodio 1N.

Distribuir 5 ml en tubos 13x100 o de mayor volumen con tapón de rosca.Autoclavear 15 minutos a 121° C (15 libras de presión por pulgada cuadrada).

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2. MEDIO DE TRANSPORTE CARY-BLAIR:

Tioglicolato de sodio ................................................ 1.5 gramosFosfato dibásico de sodio ........................................ 1.1 gramos(Na2HPO4)Cloruro de sodio ....................................................... 5.0 gramosAgar. ........................................................................... 5.0 gramosAgua destilada .......................................................... 991.0 ml

Disolver los ingredientes en el agua por calentamiento, y con agitación constante.Enfriar a 50 grados centígrados, y adicionar 9 ml de cloruro de calcio al 1%, recien-temente preparado (0.1 gramos de cloruro de calcio + 10 ml de agua). Ajustar pH a8.4 con hidróxido de sodio 1N, y distribuir 6 ml en tubos de 13x100 con tapón derosca, a manera de dejar un pequeño espacio de aire entre el tapón y el medio.Autoclavear a 100 grados centígrados en Baño de María hirviendo, por 15 minutos.Enroscar bien el tapón y almacenar en refrigeración y oscuridad.

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CAPÍTULO 5

COPROCULTIVO PARA Campylobacter jejuni

PROPÓSITO:

Demostrar por medio de cultivo, la presencia de Campylobacter jejuni. A partirde 1977, se considera a esta bacteria como un importante agente causal de diarreahumana. C. jejuni es más frecuente que Shigella y Salmonella en coprocultivos. Estu-dios efectuados por el autor en Guatemala, revelan que en heces de niños menoresde cinco años de edad con diarrea, esta bacteria se aisla aproximadamente en el 10por ciento. Estos resultados son comparables con otros estudios similares en Lati-no-américa; la frecuencia mundial de aislamiento a partir de coprocultivos varíadel 4 al 30 por ciento. Sin embargo, debido a que su aislamiento requiere de unmedio de cultivo y condiciones de incubación especiales, su búsqueda no se efec-túa rutinariamente, lo cual debería hacerse debido a su importancia epidemiológica.

Campylobacter jejuni es un bacilo gram-negativo, curvo, en espiral o enforma de “S”. Presenta dos flagelos, uno en cada extremo de la célula, lo que leproporciona un movimiento rápido y helicoidal, que lanza a la bacteria a manerade dardo. Es una bacteria estrictamente microaerofílica, oxidasa-positivo, que nofermenta ni oxida los carbohidratos. Crece a 36 grados centígrados, pero se utilizasu capacidad diferencial (termófila) de crecer mejor a 42 grados centígrados, parasu aislamiento.

La infección intestinal por este bacilo causa diarrea con dolor abdominal,fiebre y ocasionalmente vómitos. Puede haber sangre macroscópica en las heces,especialmente en las muestras pediátricas. La infección se adquiere por vía oral,al consumir agua o alimentos contaminados, especialmente carne mal cocinada yleche no pasteurizada. La infección puede adquirirse de otro humano, o ser unazoonosis, pues también puede adquirirse de los animales. C. jejuni es muy frecuen-te en animales domésticos y mascotas. Especialmente coloniza pollos y otrasaves; causa enteritis en ganado bovino, y aborto en ovejas. En el humano, ademásde enteritis, ocasionalmente causa septicemia, artritis séptica, meningitis y otrasinfecciones.

El diagnóstico de campilobacteriosis puede efectuarse presuntivamente porla observación directa de bacterias con “movimiento de dardo” en las heces con

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campo oscuro o contraste de fases. Un frote coloreado con Gram, muestra abun-dantes bacilos gram-negativo curvos. El diagnóstico definitivo se establece pormedio del aislamiento e identificación de C. jejuni.

MUESTRA:

En vista que para el aislamiento de C. jejuni se deben aplicar procedimientosespecializados, las muestras deben ser heces frescas, que deben procesarse antes dedos horas de haber sido emitidas. Las heces no deben estar contaminadas conorina. También puede utilizarse hisopo rectal, si la inoculación se efectúa inmedia-tamente.

CONDICIONES NECESARIAS:

El procedimiento para el aislamiento eficaz de esta bacteria, debe incluir lossiguientes aspectos:

1. Un agar sangre de carnero selectivo, recientemente preparado. Serecomienda el Agar Skirrow modificado, que contiene como inhibi-dores: vancomicina (10 mg/lt), polimixina-B (2,500 UI/lt) y trimeto-prim (5 mg/lt). Idealmente debe prepararse con la siguiente base:Blood Agar Base No. 2 (Oxoid), adicionada de 10% de sangre decarnero desfibrinada/estéril. La sangre de carnero remueve formastóxicas de oxígeno en el medio de cultivo. La mezcla de antibió-ticos que hacen al medio selectivo para C. jejuni puede obtenerse comer-cialmente.

2. Incubación en microaerofilia estricta. Idealmente: 5% de oxígeno, 10%de anhídrido carbónico y 85% de nitrógeno. La forma más fácil y efecti-va de lograr esta atmósfera, es usar el jarro Gas-Pak (BBL), sin catalíticoni indicador. Según las instrucciones del productor, usar el sobre rojogenerador de anaerobiosis (BBL). La incubación en jarro con candela noes adecuada, pues proporciona una atmósfera con demasiado oxígeno(12%-17%) para permitir el crecimiento de C. jejuni.

3. Incubación a 42° C por 48 horas. Inhibe la microbiota intestinal,y permite el crecimiento termófilo de Campylobacter jejuni, C. coli yC. laridis.

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PROCEDIMIENTO:

1. Analizar microscópicamente la muestra fecal, para buscar la presenciade leucocitos polimorfonucleares. Si no los hay, no vale la pena efectuarel cultivo para C. jejuni, pues las posibilidades de aislarlo son muy bajas.

2. Analizar macroscópicamente la muestra fecal, y tomar con asa o hisopoestéril, las porciones con moco, sangre o pus. Inocular por estrías doscajas de Agar Skirrow, y una de agar chocolate.

3. Inmediatamente colocar las tres cajas en atmósfera microaerofílica, pormedio del jarro Gas-Pak sin catalítico ni indicador, con sobre generadorde anaerobiosis (BBL). Es necesario quitar la canastilla con paladioiridiado (catalítico) del jarro.

4. Incubar a 42 grados centígrados exactos, por no menos de 48 horas.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

1. Retirar las cajas de la incubadora y del jarro Gas-Pak. Con microscopioestereoscópico, o al menos con lupa, examinar detenidamente las colo-nias aisladas. Buscar colonias con la siguiente morfología típica: húme-das o ligeramente mucosas, muy aplanadas, blanco-grisáceas o incolo-ras, no hemolíticas, rodeadas de un “velo” de crecimiento que se espar-ce sobre el agar circundante a la colonia, bordes irregulares y poco per-ceptibles. Menos frecuentemente las colonias son más secas, convexas yamarillentas; con incubación prolongada se transforman en rugosas. Sino se encuentran colonias típicas, incubar por otras 24 a 48 horas antesde descartar el cultivo como negativo.

2. De una colonia aislada con morfología típica, hacer inmediata y cuida-dosamente un frote (de preferencia del “velo” circundante), en una pe-queña gota de agua. Colorear con Gram (dejar la safranina por tres mi-nutos, pues la bacteria se tiñe pálidamente), o con fuchsina básica al 1%por 10 a 20 segundos, después de fijar al calor.

3. Si el frote presenta bacilos gram-negativo curvos, algunos en forma de“gaviota”, en forma de “S”, o en espiral (ondulante), presuntivamentese ha aislado Campylobacter jejuni. Reportar este hallazgo de inmediato.En los cultivos expuestos al aire predominan las formas cocoides.

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4. De otra colonia típica, subcultivar con el asa en hilo a otra caja de AgarSkirrow, y a una caja de agar sangre de carnero, e inocular un tubo deagar TSI. Estriar e incubar los tres medios en atmósfera microaerofílica a42° C, según ya fue descrito.

5. El cultivo puro que resulta del subcultivo en Skirrow o agar sangre decarnero generalmente es una “capa” blanquecina de crecimiento; sirvepara confirmar de nuevo la morfolofía bacteriana típica, y efectuar lassiguientes pruebas confirmativas:

- Oxidasa y catalasa: ambas deben ser positivas, y se consideran comosuficientes. Campylobacter jejuni, C. coli y C. laridis dan ambaspruebas positivas.

- El tubo de TSI debe ser K/K, sin gas, y sin ácido sulfídrico.

- No es indispensable, pero si existen facilidades, hacer la prueba dehidrólisis del hipurato. Es positiva para C. jejuni, y negativa paraC. coli.

- C. jejuni es susceptible a un disco de 30 microgramos de ácidonalidíxico, mientras que C. laridis es resistente; esta diferenciacióntampoco se considera indispensable.

- Eventualmente algunas cepas de Pseudomonas aeruginosa puedencrecer en el medio Skirrow microaerofílico/termófilo, sinembargo, éstas se diferencian por su pigmento verdoso y su olorcaracterístico.

INFORME:

Al detectar la morfología bacteriana típica en las colonias que desarrollan alas 48 horas de incubación, informar:

Se aisló Campylobacter jejuni, confirmación pendiente.

Al efectuar las pruebas confirmatorias, reportar:

Se aisló Campylobacter jejuni, se recomienda considerar el tratamientocon eritromicina.

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CAPÍTULO 6

INVESTIGACIÓN DE Helicobacter pylori

PROPÓSITO:

Demostrar por medio de observación, cultivo, o la técnica indirecta de ureasa,la presencia de Helicobacter pylori. Esta bacteria se ha reconocido recientemente comoagente causal de gastritis crónica activa tipo B, y predispone a la producción deúlceras pépticas. Anteriormente se clasificaba en el género Campylobacter, pero de-bido a varias diferencias en su estructura, composición y susceptibilidadantimicrobiana, a partir de 1989, se clasifica en el género Helicobacter.

Es un bacilo gram-negativo helicoidal o espiral, que presenta movilidad enforma de dardo debida a sus flagelos. Es una bacteria microaerofílica, cuyo creci-miento óptimo es a 36° C. Se observa o aisla a partir de biopsias de la mucosagástrica.

Su detección tiene actualmente mucha importancia clínica. El mecanismomás probable para explicar la patología gástrica que causa, es su gran actividadsobre las células parietales del estómago, lo que induce la producción de gran can-tidad de ácido clorhídrico. Además, la potente enzima ureasa que produce H. pylori,degrada la mucina del moco gástrico y libera gran cantidad de amonio. EnLatinoamérica en general, la gastritis es una enfermedad muy frecuente. Se sabeque el 70 por ciento la población guatemalteca sufre de infección gástrica asociadaa H. pylori, lo que indica la importancia de su búsqueda en nuestro medio. Estabacteria es susceptible a eritromicina, tetraciclina, penicilina, gentamicina, cefalotina,clindamicina, ciprofloxacina y otros antibióticos; también es susceptible a las salesde bismuto que contienen varios medicamentos contra la gastritis. Es resistente alas sulfonamidas, ácido nalidíxico y trimetoprim-sulfametoxazol.

MUESTRA:

La muestra siempre debe ser obtenida por el gastroenterólogo por medio degastroscopía. Las biopsias, cepillados o aspirados, se toman por el gastroscopio, deantro pilórico, de cuerpo y de fondo del estómago. Las biopsias producen los resul-tados más confiables. También puede usarse la técnica de la cuerda encapsulada oEnterotest para extraer moco gástrico.

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OBSERVACIÓN DIRECTA:

Puede efectuarse por medio de la observación de la bacteria en fresco (enpreparaciones con solución salina), con microscopía de contraste de fases (o campooscuro), o en frotes coloreados. En el caso de la observación en fresco y contraste defases, se buscan bacilos curvos muy móviles con el típico movimiento en forma dedardo. La coloración de Gram no se considera adecuada para teñir H. pylori. Lomás usado es la detección de la bacteria en el laboratorio de Patología, donde sepreparan cortes y frotes por aposición de la biopsia, y se tiñen con Giemsa modifi-cado, hematoxilina-eosina o la compleja impregnación con sales de plata segúnWarthin-Starry. Se buscan abundantes bacilos curvos o helicoidales directamentesobre la mucosa.

PRUEBA DE UREASA:

H. pylori produce abundante ureasa, enzima que actúa sobre el sustrato urea,con producción de abundante amoníaco, lo cual alcaliniza el medio. Es una pruebaindirecta de la presencia de H. pylori en la muestra, por lo tanto se considerapresuntiva. Proceder así:

1. Macerar asépticamente la biopsia, idealmente en macerador pequeñode vidrio, con 0.3 ml de solución estéril de glucosa al 20%.

2. Inocular masivamente un tubo de caldo urea, o agar urea de Christensen.

3. Incubar a 36 grados centígrados por pocas horas.

4. Se considera como una prueba positiva cuando el medio vira rápida-mente a color rosado fuerte, al alcalinizarse.

CULTIVO:

El aislamiento de H. pylori por medio de cultivo, constituye la confirmacióndefinitiva de este diagnóstico bacteriológico. Para efectuarlo, se recomienda proce-der así:

1. Macerar la biopsia con 0.3 ml de solución estéril de glucosa al 20%.

2. Inmediatamente inocular 0.03 ml del macerado en dos cajas de agarchocolate y dos cajas de Agar Skirrow. Diseminar por estrías.

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3. Introducir las cajas en un jarro Gas-Pak (BBL), sin catalítico en la tapadera,ni indicador de anaerobiosis. Introducir según las instrucciones del pro-ductor, un sobre rojo generador de anaerobiosis. Sin el catalítico presen-te, proporciona una atmósfera microaerofílica adecuada para el cultivode H. pylori.

4. Incubar a 36 grados centígrados por cinco días.

5. Después de la incubación prolongada, buscar con ayuda del microsco-pio estereoscópico o lupa, colonias con las siguientes características: muypequeñas (0.5 mm de diámetro, no mayores de 2 mm), circulares,translúcidas y no pigmentadas. Efectuar observación en fresco con con-traste de fases o campo oscuro y/o frote Gram modificado (fucsina bási-ca al 1% como contraste). Si se observan bacterias con el típico movi-miento en forma de dardo y bacilos gram-negativo curvos o espirales, elcultivo es compatible con H. pylori.

6. Las pruebas confirmatorias a partir del cultivo puro son las siguientes:

- Ureasa: positivo fuerte.- Catalasa: positivo- Oxidasa: positivo- Acido sulfhídrico en TSI: negativo (optativo)- Otra prueba muy específica pero no indispensable es la hidrólisis

del indoxil acetato.

INFORME:

1. Si la observación directa arroja los resultados esperados, informar:Se observan abundantes bacilos de morfología compatible conHelicobacter pylori.

2. Si la prueba de ureasa es positivo fuerte en pocas horas, informar:Prueba de ureasa rápida: positivo fuerte, muy indicativa de lapresencia de Helicobacter pylori.

3. Si el cultivo presenta los resultados de observación directa y pruebasconfirmatorias con los resultados esperados, informar:

Se aisló Helicobacter pylori.

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CAPÍTULO 7

UROCULTIVO

PROPÓSITO:

El cultivo de orina que ha sido colectada adecuadamente o urocultivo seefectúa para demostrar la presencia de un número significativo de bacterias. Encondiciones normales, la orina dentro del cuerpo es estéril, pero siempre se conta-mina con bacterias al obtener la muestra. Por esta razón, el criterio para interpretarel crecimiento es cuantitativo. De acuerdo con el llamado “criterio de Kass”, unnúmero de bacterias mayor o igual a 100,000 UFC/ml (unidades formadoras decolonia por mililitro de orina) se considera infección urinaria verdadera, es decir,es un recuento significativo.

A diferencia de otros cultivos bacteriológicos, las bacterias que causan lainfección urinaria, se limitan a unos pocos microorganismos de crecimiento rápi-do. Las principales bacterias que infectan el sistema urinario son las enterobacterias(bacilos gram-negativo). Escherichia coli es sin duda la bacteria que con másfrecuencia se aisla de urocultivos positivos, luego:

- Klebsiella spp.- Enterobacter spp.- Proteus spp.- Pseudomonas aeruginosa (no es enterobacteria)

De menor importancia son los cocos gram positivo:- Enterococcus spp.- Staphylococcus aureus- Streptococcus pyogenes y Streptococcus sp. (raros)- Staphylococcus epidermidis (puede ser contaminación)- Staphylococcus saprophyticus (puede ser contaminación)

Las infecciones mixtas causadas por dos o más especies bacterianas son raras,por lo que el crecimiento con varios tipos de colonias indica contaminación.

La demostración de la piuria (presencia de leucocitos polimorfonucleares enel sedimento urinario) y la bacteriuria (bacterias en la orina), son ambos de granimportancia para establecer el diagnóstico de infección urinaria.

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TOMA DE LA MUESTRA:

Si en algún examen bacteriológico la toma de la muestra es crucial, para obte-ner un resultado de cultivo con correlación clínica, es en el urocultivo. El meatourinario, o sea el agujero de salida de la uretra (tubo que desagua la vejiga), estásiempre colonizado por bacterias saprófitas, tanto en el hombre como en la mujer.Por esta razón, los genitales deben desinfectarse antes de tomar la muestra, segúnse explica a continuación. Tomar la muestra de orina para urocultivo después dedos horas sin que el paciente haya orinado. Si la muestra se toma antes, la orina noha pasado suficiente tiempo en la vejiga, para alcanzar cantidades significativas.

TOMA DE UROCULTIVO EN EL HOMBRE:

1. Desinfectar bien la punta del pene del paciente con una gasa estéril em-papada en jabón antiséptico no irritante. Remover el jabón con otragasa estéril, empapada en agua estéril.

2. Pedir al paciente que orine directamente en la taza del sanitario.

3. Después de transcurridos unos 3 a 5 segundos, destapar rápidamentepero con cuidado un frasco estéril de boca ancha y tomar “al vuelo” unamuestra de orina de la parte central de la micción. Se deja correr laprimera porción de orina para que remueva las bacterias de la parteanterior del meato urinario, que contaminaría el urocultivo. Tapar rápi-damente el frasco.

4. Si no es posible inocular el urocultivo antes de una hora de obtenida lamuestra, refrigerarla (no congelar). La muestra conservada en refrige-ración se mantiene en buenas condiciones para ser inoculada, por unmáximo de 48 horas.

TOMA DE UROCULTIVO EN LA MUJER:

En el caso de la mujer, debe observarse especial cuidado en la toma de lamuestra, ya que sus genitales no están expuestos y están abundantemente coloni-zados por bacterias. Proceder así:

1. Solicitar a la paciente que se coloque sobre la taza del inodoro con laspiernas abiertas. Con los dedos índice y medio de la mano izquierdadebe separarse los labios genitales mayores.

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2. Con una gasa empapada en jabón antiséptico no irritante limpiar bientoda el área y luego remover el jabón con otra gasa empapada en aguaestéril.

3. Obtener la muestra de orina “al vuelo” dejando al igual que en el casodel hombre, que corra el chorro de orina unos segundos y luego tomarde la porción central de la micción. Tapar rápidamente.

4. Sembrar antes de una hora o refrigerar la muestra.

TOMA DE UROCULTIVO EN NIÑOS PEQUEÑOS:

Con los niños que aún no saben hablar para comprender instrucciones yorinar a voluntad, debe procederse así:

1. En los niños varones desinfectar bien, con jabón antiséptico no irritante,todo el pene y el área genital. En las niñas desinfectar bien los labiosmayores y el área genital que los rodea. Quitar bien el jabón con gasa yagua estéril, luego secar finalmente con una gasa estéril seca.

2. Pegar una bolsita de plástico estéril y descartable, especial para tomarurocultivos infantiles. En los niños tener la precaución de introducir todoel pene en el orificio del llenado y en las niñas que el agujero de labolsita quede pegado al centro por donde saldrá la orina. Colocarlos pañales en su lugar y fijar la bolsita en su lugar con tiras de“masking-tape”.

3. Generalmente se le pide a la madre o a quien lleve al niño al laboratorio,que espere hasta que orine. Algunos procedimientos que aceleran lamicción son: dar bebidas (agua, leche, etc.), aplicar presión sobre la veji-ga. También se puede estimular al niño según el reflejo de Castañeda:cargar al niño boca abajo con la mano derecha y con el ángulo que formael dedo pulgar doblando de la mano izquierda hacer presión en formade rayas en la parte baja de la espalda del niño.

PUNCIÓN SUPRA-PÚBICA (PSP):

Es la obtención de la muestra de orina por medio de punción directa a lavejiga, con una aguja larga. Por ser un procedimiento delicado que conlleva algu-nos riesgos debe hacerse sólo por el pediatra. Se debe efectuar sólo en estos casos:

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- Malformación anatómica que evite la micción normal del niño, causan-do contaminaciones.

- Urocultivo aerobio negativo varias veces, continúan los síntomas, elsedimento urinario presenta leucocitos y se sospecha de una infecciónurinaria causada por bacterias anaerobios.

Nota importante: Jamás introduzca sonda para tomar el urocultivo. Hace variosaños que esta técnica cayó en desuso, pues introduce a la vejiga bacterias que estáncolonizando el meato urinario. Recuerde que de ser posible debe tomarse la prime-ra orina de la mañana, generalmente esto no es posible, por lo que debe esperarseun mínimo de dos horas sin que el paciente orine antes de obtener el urocultivopara que las bacterias tengan suficiente tiempo para reproducirse hasta númerossignificativos dentro del sistema urinario.

PROCEDIMIENTO:

1. Ya que la muestra ha sido colectada siguiendo estrictamente las instruc-ciones anteriores, sembrar la orina en dos medios de cultivo según latécnica del asa calibrada usada en la Clínica Mayo (Rochester, Minnesota,EUA). Los dos medios de cultivo a utilizar son:- Agar sangre de carnero al 5%: crecen la mayoría de bacterias.- MacConkey: crecen sólo bacilos gram-negativo aerobios (ente-

robacterias) pues es selectivo y diferencial.- Alternativamente usar solamente el medio CLED si el microbiólogo

a cargo conoce su interpretación, la cual puede ser confusa, por loque no se recomienda.

2. Para sembrar, usar una asa calibrada de platino (95% platino, 5% rodio)que tome 0.001 ml. Agitar el frasco de orina (de preferencia con agitador“vortex”, abrir delante del mechero y flamear la boca del mismo. Intro-ducir verticalmente el asa flameada y fríaen la orina, justamente por debajo de lasuperficie.

3. Inocular primero el agar sangre deslizan-do el asa una sola vez a lo largo de la cajay pasando por el centro. Flamear e ino-cular en igual forma el MacConkey. Al-ternativamente, sembrar una biplaca deagar sangre de carnero y MacConkey, con Biplaca para urocultivo

Agar sangre carneroAgar sangre carneroAgar sangre carneroAgar sangre carneroAgar sangre carnero

MacConkeyMacConkeyMacConkeyMacConkeyMacConkey

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3. En ambos medios, primero unaestría longitudinal con asa deplatino calibrada (0.001 ml)

Idealmente, incubar el agar sangreen jarro con candela a 36o C

4. Con asa corriente flameada yfría, estriar perpendicularmentetoda la caja

Incubar aeróbicamente a 36o C

Fig. 8 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA UROCULTIVOFig. 8 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA UROCULTIVOFig. 8 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA UROCULTIVOFig. 8 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA UROCULTIVOFig. 8 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA UROCULTIVO

Muestra Orina colectada“al vuelo”

1. Agitar

2. Tomar 0.001 mlcon asa calibradade platino,verticalmente yjustamente pordebajo de lasuperficie

Medios: 1o: Agar sangrede carnero (ASC) 2o. MacConkey

ASC

MacConkey

INOCULAR DE RUTINA BIPLACAÓ

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0.001 ml en cada mitad según la foto. Esto permite el ahorro de cajasde Petri.

4. Inmediatamente estriar con asa corriente en anillo el inóculo de orina,por ambas cajas, haciendo estrías tupidas y perpendiculares a la estríadejada por el asa calibrada.

5. Con el objeto de ahorrar cajas de Petri, alternativamente puede usarseuna caja dividida por la mitad o biplaca, con agar sangre de carnero enun lado y MacConkey en el otro; estriar de la misma manera.

5. Idealmente, incubar el agar sangre a 36° C en jarro de boca ancha con untrozo de papel absorbente húmedo y una veladora o candela encendida,cerrar bien.

6. Incubar el MacConkey sin jarro en la incubadora a 36° C.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

1. Después de incubar ambas cajas durante 18 a 24 horas, interpretarresultados de ambas cajas simultáneamente y con buena luz.

2. Teóricamente cada bacteria origina una colonia en la superficie del me-dio, pero esto no es estrictamente cierto, pues cadenas o grupos de bac-terias también pueden originar una sola colonia. Por esta razón se de-ben contar y reportar “unidades formadoras de colonias” o UFC. Lacantidad de colonias, en el agar sangre debe ser igual o muy similar enel MacConkey. Si en el MacConkey crece una enterobacteria, en el agarsangre también deberá aparecer, es decir, debe haber correlación entreambas cajas. De allí se deriva la importancia de interpretar el crecimien-to de ambas cajas simultáneamente y de usar un medio selectivo/dife-rencial y otro rico no inhibidor, cuando se trata de una bacteria gram-positivo, sólo crece en agar sangre.

3. Contar el número de colonias presentes y multiplicar por 1000, si se usóel asa calibrada de 0.001 ml. Multiplicar por 100 si se utilizó una asacalibrada de 0.01 ml. Ejemplos con asa de 0.001 ml:

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No. colonias contadas UFC/ml de orina25 25,00078 78,000100 en adelante más de 100,000

4. En la mayoría de urocultivos positivos, se observa el crecimiento de 100más o colonias rojas (lactosa-positivo), brillantes pero no mucosas en lasuperficie del MacConkey, con correlación en el agar sangre.

En este caso informar presuntivamente:

De una colonia típica, inocular un TSI, LIA, MIO y Citrato de Simmons paraconfirmar la identificación presuntiva de E. coli y al mismo tiempo inocular de lamisma colonia y otras idénticas, la prueba de susceptibilidad antimimicrobiana oantibiograma, según la técnica de Bauer-Kirby descrita. Pueden aislarse cepas deE. coli fermentadoras lentas de lactosa y deberán identificarse con TSI y LIA, nopresentan diseminación en cepas en el agar sangre.

Si las colonias en el MacConkey son rojas (lactosa positivo) pero mucosas,informar:

Inocular TSI y susceptibilidad. La diferenciación de estos dos géneros y de lasenterobacterias en general debe hacerse por medio de pruebas bioquímicas, de pre-ferencia con el sistema API-ATB/VITEK (Bio Merièux) o SENSIDENT (Merck).

6. Si las colonias en MacConkey son lactosa-negativo (incoloras), hay co-rrelación en el agar sangre (donde las colonias son grandes, beta

CLAVE :(en libro de registros)

E. coli más de 100,000UFC /ml. S/A (sus-ceptibilidad antimi-crobiana)

TEXTODEL INFORME:

Se aisló Escherichia coli, más de 100,000 UFC /ml. Infección uri-naria verdadera, según el criterio de Kass. S/A.

TEXTO:

Se aisló Klebsiella-Enterobacter más de 100,000 UFC ml. In-fección urinaria verdadera, según el criterio de Kass. S/A.

CLAVE:

Klebsiella-Enterobacter másde 100,000 UFC /ml. S/A.

87

hemolíticas y de color verdoso), y los cultivos huelen a perraje o güipilnuevo (telas típicas de Guatemala, olor semejante a uvas), inocular paraconfirmar TSI y LIA y susceptibilidad, informar:

Si las colonias son lactosa-negativo (incoloras) en MacConkey, no huelen aperraje o güipil nuevo, y en el agar sangre de carnero presentan diseminación encapas, inocular TSI, LIA y urea y susceptibilidad, informar:

Después de 18 a 24 horas de incubación a 36° C de las pruebas de identifica-ción interpretar para confirmar su reporte inicial con las reacciones en TSI, LIA yurea según el Capítulo del coprocultivo. Notar reacción roja (R) en la superficie deLIA y urea positivo para el género Proteus.

8. Los cocos gram-positivo no crecen en MacConkey, por lo que aparecenformando colonias sólo en el agar sangre. Para tomarlos en cuenta yreportarlos como agentes causantes de infección urinaria deben apare-cer en cultivos puros en el agar sangre. Identifique así:

Primero notar la presencia de hemólisis alrededor de cada colonia. Hemólisises la acción causada por algunas sustancias producidas por las bacterias que des-truyen total o parcialmente los eritrocitos del medio. Hay dos tipos de hemólisis,los cuales se discuten en detalle en el Capítulo 8:

CLAVE:

Pseudomonas aeruginosamás de 100,000 UFC /ml.S/A.

TEXTO:

Se aisló Pseudomonas aeruginosa, más de 100,000 UFC/ml. In-fección urinaria verdadera, según el criterio de Kass. S/A.

TEXTO:

Se aisló Proteus sp. más de 100,000 UFC ml. Infección urina-ria verdadera, según el criterio de Kass. S/A.

CLAVE:

Proteus sp. más de 100,000UFC ml. S/A.

SE OBSERVA

Un halo verde

Un halo claro, del color del medio

TIPO DE HEMÓLISIS

Alfa

Beta

88

Staphylococcus aureus: colonias grandes (1 a 2 mm de diámetro), pueden o noser hemolíticas (no importante), a veces presentan pigmento amarillo. Coloraciónde Gram: cocos gram-positivo, bien redondos, agrupados en racimos. Identificarcon dos pruebas específicas descritas en el Capítulo 8: coagulasa y manitol-sal.Inocular prueba de susceptibilidad con discos de antibióticos para gram-positivosegún la tabla del capítulo correspondiente. Staphylocccus epidermidis (coagualasa ymanitol-negativos). Generalmente es contaminante. Tomarlo en cuenta y reportarsólo si está presente en cantidad significativa y en cultivo puro.

Streptococcus pyogenes: colonias pequeñas (1 mm o menos), la hemólisis esbeta, ésta característica es muy importante. Coloración de Gram: cocos gram-posi-tivo ligeramente alargados y agrupados en cadenas cortas o parejas. Identificaciónespecífica: ver prueba de inhibición por disco de bacitracina en próximo capítulo.

Streptococcus sp. alfa hemolítico, sólo debe tomarse en cuenta si se presenta enconteos altos y en cultivo puro.

9. Si no se observa ningún crecimiento a las 24 horas de incubación, des-carte las cajas y reporte así los urocultivos negativos:

No se debe perder tiempo y esfuerzo en reincubar los urocultivos rutinarioshasta las 48 horas, porque las bacterias cuasantes de infección urinaria son aerobiosde crecimiento rápido. En casos especiales pueden efectuase urocultivos paraanaerobios, hongos o micobacterias.

INFORME:

Deben establecerse los siguientes criterios para reportar o no los crecimientosde los urocultivos así:

TEXTO:

Urocultivo negativo a las 24 horas de incubación a 36° C.

CLAVE:

N-24

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*30 a 50 por ciento de mujeres con infección vesical y/o uretral con disuria,urgencia y frecuencia (síndrome uretral agudo) no llenan el criterio de Kass.En estos casos, 100 UFC/ml de orina debe ser el límite para hacer diagnósticocorrecto, en asociación íntima con el médico tratante. (Según Jacobo Sabbaj K.,VI Congreso Centroamericano de Microbiología, Guatemala, 5-9 de diciembre de1983).

DETECCIÓN DE BACTERIURIA POR LA COLORACIÓNDE GRAM DE ORINA NO CENTRIFUGADA:

En aquellos laboratorios en donde no es posible efectuar urocultivo, este mé-todo fácil y barato lo sustituye. La coloración de Gram de orina puede detectartanto la presencia de bacterias como de leucocitos. Proceder así:

1. En un porta-objetos de vidrio (limpio) colocar 10 µl (una gota) de orinano centrifugada bien mezclada.

2. Dejar secar al aire, fijar con calor, marcar por detrás con un círculo decrayón graso y colorear cuidadosamente con Gran.

3. Observar con aceite de inmersión.

4. Informar la cantidad de bacterias por campo en inmersión.

5. La presencia de una o más bacterias por campo de inmersión correlacionabien con un urocultivo mayor o igual a 100,000 UFC/ml (criterio deKass).

CRITERIO PARA REPORTAR

Negativo a las 24 horas de incubación a 36° C

Sugerir repetir cultivo. Revisar condiciones de toma de muestra ycorrelación de leucocitos en el sedimento urinario.

Se aisló _________ , _____ ,000 UFC/ml. S/A (reportar el númerode UFC contado y la especie bacteriana con su S/A).

Se aisló_________ , más de 100,000 UFC/ml. Infección urinaria ver-dadera de acuerdo con el criterio de Kass. S/A.

UFC/ml

10,000 - 10,000 *

10,000 - 50,000

50,000 - 100,000

100,000 o más

90

6. La presencia de muchas células epiteliales (citoplasma grande y claro,núcleo pequeño) y diferentes tipos de bacterias indican contaminacióny el examen debe repetirse.

91

CAPÍTULO 8

CULTIVO DE GARGANTA

PROPÓSITO

El cultivo de garganta, se efectúa para demostrar la presencia de Streptococcuspyogenes (Streptococcus que pertenece al grupo “A” de Lancefield y es beta hemolítico).No debe llamarse “orocultivo”, pues este término significa literalmente cultivo deboca. Algunas otras bacterias mucho menos importantes en infecciones de la faringe,son:

- Streptococcus pneumoniae- Haemophilus influenzae- Staphylococcus aureus- Klebsiella pneumoniae- Otras enterobacterias- Pseudomonas aeruginosaEstos microorganismos sólo deben reportarse si predominan sobre la

microbiota normal de la garganta, que es abundante y muy variada.

Streptococcus agalactiae del grupo B y los estreptococos de los grupos C, F y Gde Lancefield también son beta hemolíticos (generalmente presenta poca hemólisisbeta). Pueden ser agentes etiológicos de faringitis, por lo que debe identificarseadecuadamente.

Los síntomas frecuentemente asociados a infecciones de la faringe porStreptococcus pyogenes son: dolor de garganta, ganglios linfáticos del cuello agran-dados, dolor de cabeza, náusea, vómitos y dolor abdominal. La infección de lafaringe causada por virus provoca tos, secreción nasal y nariz tapada. Sin embargo,con mucha frecuencia no es posible establecer diagnóstico sólo en base a observa-ciones clínicas.

MUESTRA:

No es necesario que el paciente esté en ayunas; sin embargo, conviene dejarpasar 1 a 2 horas para que se vuelva a formar la secreción que fue deglutida. Debetomarse siempre antes de iniciar el tratamiento con antibióticos. El cultivo degarganta debe tomarse con sumo cuidado. Es indispensable examinar bien las le-

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siones en la garganta del paciente en el laboratorio para tomar la muestra del lugarpreciso. Siga al pie de la letra las siguientes instrucciones:

1. Colocar al paciente sentado y pedirle que trague saliva fuertemente dosveces.

2. Pedir al paciente, viendo hacia arriba que abra la boca, saque la lengua ydiga aahh.

3. Con un bajalenguas, presionar fuertemente la lengua hacia abajo ysimultáneamente iluminar bien el fondo de la garganta (detrás de laúvula o campanilla), con una lámpara portátil de baterías o “flash light”.

4. Localizar en el fondo de la garganta y en las amígdalas (que se encuen-tran a los lados), las siguientes lesiones:- Inflamación (enrojecimiento)- Pus (secreción blanquecina o amarillenta)- Úlceras blanquecinas

5. Con un hisopo estéril frotar firmemente las lesiones con sumo cuidadode no tocar la lengua, la campanilla, la pared interna de los carrillos(cachetes) o los labios, al retirar el hisopo.

PROCEDIMIENTO:

1. Inocular inmediatamente una caja (o placa) de agar sangre de carneroal 5%; hacer dos cortadas en el agar durante la siembra. Las cortadasdeben ser aproximadamente de 1 cm de largo y el asa debe llegar alfondo de la caja; orientar las cortadas de la orilla de la caja al centro. Eneste caso no flamear el asa entre cada estría (ver figura 9, pág. 90). Elpropósito de las cortadas es introducir las bacterias dentro del agar paraalejarlos del oxígeno atmosférico y así incrementar la hemólisis tipo beta.Anteriormente se acostumbraba enriquecer previamente por 2 horas encaldo Todd-Hewitt, pero los resultados indican que no vale la pena.

2. Con el objeto de obtener cultivos evidentes de Streptococcous pyogenes,sin necesidad de hacer sub-cultivos, proceder así:

Con pinza flameada y fría, colocar en la zona de más fuerteinoculación en el agar sangre de carnero (primera estría), un discode 30 mcg de neomicina. A unos 8-10 mm de distancia, colocar un

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disco de 0.04 unidades de bacitracina. Streptococcus pyogenes yStreptococcus pneumoniae son resistentes al antibiótico neomicina,por lo que crecen en cultivo casi puro alrededor de este disco. Comoel disco de bacitracina (también llamado taxo A) se encuentra muycerca frecuentemente puede acelerarse la identificación presutiva.Las colonias que crecen alrededor del disco de neomicina (N-30)pueden usarse para hacer sub-cultivos y antibiogramas (según:Maxted, W. R.: J. Clin. Path. 6: 224, 1953).

Este método sencillo que clarifica la interpretación, puede aplicar-se para facilitar el aislamiento, y efectuar la identificaciónpresuntiva rápida de Streptococcus pneumoniae.

3. Introducir la caja en un frasco de vidrio de boca ancha, poner en el fon-do una toalla de papel húmeda, colocar la caja con el medio arriba yluego introducir sobre una tapa de caja de Petri una veladora o candelacorta encendida. Cerrar el frasco bien, sellarlo con “masking-tape”. Lavela se apagará sola. Es conveniente aplicar (una vez a la semana) unpoco de cera a la boca del frasco y a la rosca interna de la tapadera, paraque sellen bien.

4. Incubar por 18 a 24 horas a 36° C. Es indispensable el uso del jarro concandela y humedad, para obtener reacciones hemolíticas correctas. Sino se usa, la recuperación de Streptococcus pyogenes será mucho menor.

El propósito de usar sangre de carnero en el medio, es aumentar la betahemólisis característica e inhibir a Haemophilus haemolyticus que puede confundirsecon Streptococcus pyogenes. Con sangre de carnero se obtiene una excelente diferen-ciación entre alfa y beta hemólisis, entre otras ventajas (ver pág. 103).

Evitar el uso de sangre humana vencida de banco de sangre en todos los cul-tivos bacteriológicos ya que puede ser inhibitoria al crecimiento bacteriano porcontener anticoagulantes, anticuerpos o antibióticos, además del peligro potencialde la transmisión del virus del SIDA, hepatitis B, etc.

No hacer frotes Gram directos de faringe, pues su interpretación es muy difí-cil debido a lo abundante de la microbiota y no tiene significado clínico.

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Fig. 9 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA CULTIVOFig. 9 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA CULTIVOFig. 9 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA CULTIVOFig. 9 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA CULTIVOFig. 9 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA CULTIVODE GARGANTA/EXUDADO FARÍNGEODE GARGANTA/EXUDADO FARÍNGEODE GARGANTA/EXUDADO FARÍNGEODE GARGANTA/EXUDADO FARÍNGEODE GARGANTA/EXUDADO FARÍNGEO

5. Después de 18-24 horas de incubación, interpretar con buena luz. Buscare identificar colonias beta hemolíticas

1. Muestra: Tomar unhisopo faríngeo conbuena luz y baja-lenguas

2. Inocular una caja de agar sangre de carneroagar sangre de carneroagar sangre de carneroagar sangre de carneroagar sangre de carnero por estrías, con dos cortadasde 1 cm, sin flamear entre cada estría

3. Colocar sobre la primera estría, un disco de bacitracina de 0.04 unidadesy un disco de 30 mcg de neomicina, separados 8-10 mm entre sí

4. Incubar en jarro con candela y humedad a 36o C

Cortada 1

Cortada 2

N30

Disco de neomicina

ADisco de bacitracina

Úvula

Amígdala

Faríngeposterior

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INTERPRETACIÓN:

La microbiota de la faringe es sumamente variada; predominan Streptococcussp. alfa hemolíticos (hemólisis verde) llamados por esta razón “grupo viridans” yneisserias no patógenas. Estos grupos bacterianos nunca deben reportarse.

Con el objeto de no perderse en la interpretación de este cultivo, que siemprepresenta muchos tipos de colonias, utilice los siguientes criterios:

1. Tener presente que el patógeno más importante es Streptococcus pyogenesque es beta hemolítico. Tomar la caja de agar sangre de carnero con lamano izquierda entre los dedos pulgar y medio sosteniendo por detrásde la caja con el dedo índice.

2. Con una lupa en la mano derecha examinar cuidadosamente la caja conbuena luz transmitida (por detrás), según la foto. En primer lugar notarsi hay o no hemólisis beta (clara) en las cortadas (ver fotografía en laportada de este manual). Si la hay, buscar con cuidado colonias separa-das beta hemolíticas pequeñas y brillantes, sospechosas de Streptococcuspyogenes. Aunque sólo se observe una de estas colonias, debe tomarseen cuenta.

3. Con una asa recta estéril y siguiendo la técnica ilustrada en la figura 6,pág. 46, trasladar una sola colonia típica al centro de otra caja de agarsangre de carnero. Sólo tocar la superficie del medio rotando el asa (nopinchar el medio). Luego con una asa en argolla estriar en tres direc-ciones opuestas y luego colocar con pinzas estériles en el centro delinóculo un disco de bacitracina de 0.04 unidades (“taxo A”, o “disco B”según la marca). La bacitracina es un antibiótico originalmente aisladode Bacillus licheniformis. La prueba presuntiva de la inhibición selec-tiva por este antibiótico tiende a ser sustituida por otras pruebas. Sinembargo, se sigue usando debido a su facilidad y alto porcentaje deexactitud.

4. Si las colonias beta hemolíticas no están aisladas, hacer una purifica-ción así: con una asa recta o aguja de disección flameada, tomar las colo-nias beta hemolíticas con cuidado, aunque se tome de otras coloniasque estén muy cercanas o adyacentes. De preferencia hacer esto bajo elmicroscopio estereoscópico. Trasladar el inóculo dos o tres veces a unextremo de una caja de agar sangre de carnero y luego con dos asas en

96

anillo, estriar en toda la caja con dos cortadas, al igual que el cultivoinicial. Colocar con pinzas estériles un disco bacitracina en el inicio de lasegunda estría.

5. Para interpreter correctamente los crecimientos de cultivos de exudadosfaríngeos memorizar esta tabla:

6. Interpretar resultados sólo para Streptococcus beta hemolíticos así:

* La inhibición por el disco de bacitracina identifica a S. pyogenes con 95% de certeza. Cualquierdiámetro de halo de inhibición se considera significativo. Efectuar simultáneamente susceptibili-dad a un disco de trimetoprim-sulfametoxazol; S. pyogenes es resistente a este antibiótico, lo queaumenta la certeza de la identificación, junto con la prueba de CAMP negativa (técnica adelante).

Tipo de hemólisis

Alfa

Beta

Apariencia de halo

Verde (incompleta)

Claro, del color del medio (completa)

Inhibición por disco de bacitracina

+ (si produce halo),ver foto abajo

- (no inhibición)

Reportar

* Se aisló Streptococcus pyogenes betahemolítico del grupo “A” de Lancefield.

Streptococcus sp. beta hemolítico no delgrupo “A” de Lancefield (hacer prue-ba de CAMP).

Interpretación, con buenaluz transmitida por detrásdel sub-cultivo en agarsangre de carnero.Se observa el halo de in-hibición del crecimientoalrededor del disco debacitracina (halo oscurosin hemólisis).

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7. Aparte de las causadas por Streptococcus pyogenes, son raras las infeccio-nes de la garganta ocasionadas por otras bacterias. Reportar las bacte-rias que se citan a continuación solamente cuando predominan por en-cima de la microbiota normal. Examinar la última estría que presentacolonias separadas. Con mucho cuidado y con lupa, observar si hay máscolonias que Streptococcus sp. alfa hemolítico y Neisseria sp., de:

– Streptococcus pneumoniae (neumococo): coco gram-positivo ovala-do o lanceolado, agrupado en parejas. Colonias alfa hemolíticasaplanadas o ligeramente mucosas (debido a la presencia de cáp-sula). Al pasarlo a otro agar sangre de carnero es inhibido por eldisco de optoquina “Taxo P” o “Disco N”). Ver tabla adelante ennúmero 8. Esta bacteria es parte de la microbiota normal de la gar-ganta, en bajas concentraciones.

– Staphylococcus aureus: coco gram-positivo esférico, en racimos,coagulasa positivo; crecimiento amarillo en agar manitol-sal. Nocausa frecuentemente faringitis como erróneamente se cree.

– Enterobacterias: principalmente Klebsiella sp., Enterobacter sp. yEscherichia coli.

– Pseudomonas aeruginosa: bacilo gram-negativo aerobio, coloniasgrandes, generalmente beta hemolíticas con pigmento verdoso y olorcaracterístico. TSI/LIA no viran (no fermentador), y el pigmentoque se nota en la superficie del crecimiento fluorece bajo la luzultravioleta.

– Haemophilus influenzae: bacilo gram-negativo muy corto y fino,pleomórfico (es decir formas cocobacilares y formas largas juntas).Crece en agar chocolate con jarro con candela y en agar sangre decarnero colonias muy pequeñas sólo alrededor de colonias deStaphylococcus aureus, a lo que se llama ”satelitismo”.

8. Para diferenciar en cultivo de garganta o en cualquier otro cultivobacteriológico (L.C.R., hemocultivo, esputo, secreciones oculares, etc.)las colonias alfa hemolíticas planas que crecen en el agar sangre decarnero, memorizar esta tabla:

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Inhibición por disco de optoquina

+ (presencia de halo)*

- (no inhibe)

Informar

Se aisló Streptococcus pneumoniae

Streptococcus sp. alfa hemolítico **

* Si se usa un disco impregnado de optoquina de 6 mm de diámetro, se considera significativa unazona de inhibición sólo si es mayor de 14 mm de diámetro.

** En cultivo de garganta es microbiota normal, no informarlo.

9. El cultivo de garganta negativo es aquel que:- no presenta colonias beta hemolíticas- no presenta beta hemólisis en las cortadas- no predomina ninguna de las bacterias citadas- el crecimiento consiste principalmente de colonias alfa hemolíticas no

aplanadas y pequeñas colonias amarillentas que se desprenden fácil-mente del agar con el asa (Neisseria, Branhamella.)

Informar cultivos de garganta negativos así:

10. En la garganta pueden existir Streptococcus sp. beta hemolíticos no delgrupo “A” de Lancefield. A los Streptococcus pyogenes del grupo “A” deLancefield no se les debe hacer prueba de susceptibilidad, ya que por logeneral son muy susceptibles a la penicilina que es el antibiótico de elec-ción. Por el contrario, a los Streptococcus sp. beta hemolíticos no del gru-po “A” de Lancefield sí debe efectuarse prueba presuntiva de suscepti-bilidad a la penicilina, con un disco del antibiótico en agar sangre decarnero. Además, debe hacerse la prueba de CAMP para Streptococcussp. beta hemolíticos no del grupo “A” de Lancefield. Existen procedi-mientos de agrupamiento serológico, los cuales pueden usarse depen-diendo de los recursos del laboratorio.

Clave

NP(en libro de registro)

Informar

No se aislan patógenos, desarrollan bacterias dela microbiota normal.

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IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA DE Streptococcus agalactiae(GRUPO B). PRUEBA DE CAMP:

1. Esta bacteria es resistente al disco de 0.04 unidades de bacitracina. Esindispensable contar con agar sangre de carnero al 5% para hacer laprueba de CAMP. En una caja de este medio hacer con el asa en argollauna estría recta a lo largo de toda la caja con una cepa de Staphylococcusaureus productor de doble zona de beta hemólisis.

2. Luego con sumo cuidado, hacer una estría con el Streptococccus betahemolítico a identificar, perpendicular a la estría de S. aureus pero queno la toque (A). Generalmente S. agalactiae presenta un halo pequeño dehemólisis beta, el cual puede disminuir al sub-cultivar.

3. Incubar en jarro con candela y humedad de 18 a 24 horas a 36° C. Inter-pretar como Streptococcus agalactiae del grupo “B” de Lancefield si seproduce una “flecha” de intensa beta hemólisis que apunta hacia la es-tría de Staphylococcus aureus (B).

SIGNOS Y SÍNTOMAS

Sinusitis/Rinitis:

Cefalea

Dolor/eritema en región malar

Rayos-X: Consolidación, nivelde líquido, engrosamiento de lapared de los senos

Garganta y faringe:

Eritema y edema de mucosas

Pus en amígdalas

Pseudomembranas

Edema de la úvula

Lengua con cubierta grisácea

Linfadenitis cervical

BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pyogenes (grupo A)

Staphylococcus aureus

Haemophilus influenzae

Klebsiella spp. y otras enterobacterias

Bacteroides spp. y otros anaerobios (sinusitis)

Streptococcus pyogenes (grupo A)

Corynebacterium diphtheriae

Neisseria gonorrhoeae

Bordetella pertussis

ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE INFECCIONESRESPIRATORIAS SUPERIORES

100

4. Hacer la prueba con un control positivo (cepa conocida de S. agalactiae)y un control negativo (cepa conocida de S. pyogenes). Estas cepas controly la cepa de S. aureus de doble zona de beta hemólisis, deben conservar-se suspendiendo masivamente cultivos puros en aproximadamente 3ml de sangre de carnero pura, en tubos estériles y congelar.

5. Streptococcus agalactiae es un agente etiológico de vaginitis y meningitisneonatal, por lo que también debe buscarse cultivando en agar sangrede carnero al 5% las secreciones vaginales y líquidos cefalorraquídeos.

BBBBB. Flecha de beta hemólisis indicaB: B: B: B: B: prueba de CAMP positiva

A.A.A.A.A. Siembra prueba de CAMP

Staph.

Strepto. Strepto.

Flecha

Staph.

Fig. 10 SIEMBRA E INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE CAMPFig. 10 SIEMBRA E INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE CAMPFig. 10 SIEMBRA E INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE CAMPFig. 10 SIEMBRA E INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE CAMPFig. 10 SIEMBRA E INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE CAMP

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CARACTERÍSTICAS FÍSICAS, HEMATOLÓGICASY QUÍMICAS DE LA SANGRE DE CARNERO

Miguel F. Torres, Q.B., M.A.

La sangre desfibrinada y estéril de diversos animales, se ha utilizadodesde el siglo XIX como enriquecimiento para el cultivo de diversas bacteriaspatógenas. El agar sangre como se utiliza hoy en día, fue introducido porprimera vez en Francia en 1903, por Bezançon y Griffon. Posteriormente en1919, Brown demostró la exactitud de la sangre ovina para clasificar al géne-ro Streptococcus según el tipo de hemólisis.

En vista de la comprobada utilidad de la sangre de carnero en la bacte-riología del Laboratorio Clínico actualizado, es conveniente conocer las ca-racterísticas de la sangre en la especie Ovis aries (oveja/carnero). Para estepropósito, debe compararse con la sangre humana.

La revisión de literatura especializada, indica que el peso específico,viscosidad relativa, presión osmótica y punto de congelación son idénticos ala sangre humana.

Las principales características hematológicas de la sangre de carnerocompleta, son: hemoglobina 9-15 g/dl (promedio: 11.5); hematocrito 27-45%(promedio: 35); glóbulos rojos 9-l5 millones/mm3 (promedio: 12); leucocitos

Tomado de:

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Tomado de:

¿POR QUÉ SANGRE DE CARNERO¿POR QUÉ SANGRE DE CARNERO¿POR QUÉ SANGRE DE CARNERO¿POR QUÉ SANGRE DE CARNERO¿POR QUÉ SANGRE DE CARNEROEN EL LABORATORIO CLÍNICO?EN EL LABORATORIO CLÍNICO?EN EL LABORATORIO CLÍNICO?EN EL LABORATORIO CLÍNICO?EN EL LABORATORIO CLÍNICO?Por Miguel F. Torres, QB, MA. Guatemala, 1992.

4,000-12,000/mm3 (promedio: 8,000); linfocitos 62%; velocidad desedimentación 0.5 mm/hr. Los valores de hemoglobina y hematocrito dismi-nuyen con la edad y se elevan cuando el animal está excitado.

Los glóbulos rojos ovinos son más pequeños que los humanos. La mem-brana celular de los pequeños eritocitos de carnero es muy susceptible a laacción de las hemolisinas bacterianas. Esto es especialmente cierto en el casode las estreptolisinas O y S de Streptococcus pyogenes. Esta característica auna-da a su fragilidad ligeramente mayor en comparación a los eritrocitos huma-nos, hace que los eritrocitos ovinos sean excelentes indicadores de hemólisisin vitro.

La sangre de carnero presenta velocidad de sedimentación mucho me-nor en comparación con la sangre humana. Esta característica es deseable, yaque los eritrocitos de la sangre desfibrinada, suspendidos en su propio sueroy almacenados en refrigeración durante menos de 21 días, no se compactantanto como en el caso de la sangre humana. Esto permite que se preservenmejor.

Se sabe que el aumento de glucosa en el suero de la sangre desfibrinadautilizada para enriquecer medios de cultivo sólidos, es inversamente propor-cional al diámetro de los halos de hemólisis. Por este motivo su bajo conteni-do de glucosa es la característica bioquímica que hace a la sangre ovina idealpara demostrar los amplios y típicos halos de hemólisis alrededor de las colo-nias productoras de hemolisinas. Los valores normales se encuentran en elrango de 30 a 57 mg/dl.

El resto de los valores químicos es muy similar a la sangre humana,excepto en el caso del ácido úrico, que es muy bajo en los carneros. El rangonormal de esta sustancia oscila entre 0.05 y 1.9 mg/dl.

103

VENTAJAS DEL USO DE LA SANGRE DE CARNEROVENTAJAS DEL USO DE LA SANGRE DE CARNEROVENTAJAS DEL USO DE LA SANGRE DE CARNEROVENTAJAS DEL USO DE LA SANGRE DE CARNEROVENTAJAS DEL USO DE LA SANGRE DE CARNEROEN EL LABORATORIO CLÍNICOEN EL LABORATORIO CLÍNICOEN EL LABORATORIO CLÍNICOEN EL LABORATORIO CLÍNICOEN EL LABORATORIO CLÍNICO

La palabra hemólisis deriva del griego ηαιµα (haima=sangre) y λψσισ(lysis=disolver). Se refiere a la acción de ciertas bacterias sobre los glóbulosrojos. La ruptura eritrocítica la provocan toxinas protéicas llamadas por suefecto hemolisinas. Muchas bacterias producen hemolisinas, pero probable-mente la única que provoca hemólisis in vivo sea la toxina alfa de Clostridiumperfringens, la cual es una alfa lecitinasa que causa lisis de la lipoproteína de lamembrana celular del eritrocito humano (aparte de la hemólisis causada poranticuerpos o drogas en presencia de complemento).

En Streptococcus pyogenes, una citolisina thiol-activada, llamadaestreptolisina -O (oxígeno lábil), altera la permeabilidad de la membranaeritrocítica al unirse con el colesterol. Esto provoca destrucción completa delos eritrocitos, y su efecto macroscópico es llamado hemólisis beta. Laestreptolisina -S (oxígeno estable) también causa hemólisis beta en presenciade oxígeno en la superficie del agar sangre. Las reacciones hemolíticas, asícomo los crecimientos bacterianos típicos y exuberantes, son fundamentalesen el diagnóstico bacteriológico. Debe usarse sangre de carnero para prepararel agar al 5% y obtener las siguientes ventajas técnicas:

Debido a que los eritrocitos de la especie Ovis aries (carnero: ma-cho, oveja: hembra y cría: cordero) son sumamente susceptibles ala acción de las hemolisinas bacterianas, se incrementan conside-rablemente las hemólisis de tipo beta.

Se evitan reacciones hemolíticas dudosas, que dificultan la inter-pretación de los cultivos, pues en agar sangre de carnero se dife-rencian perfectamente las hemólisis verdosas de tipo alfa, de lasreacciones de hemólisis completa tipo beta.

En los cultivos de garganta es muy importante su uso, pues la san-gre de carnero por su bajo contenido de nucleótidos de piridina(factor V) es inhibitoria para Haemophilus haemolyticus, que produ-ce colonias idénticas a Streptococcus pyogenes, por lo que evitafalsos positivos.

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3

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La sangre de carnero desfibrinada asépticamente, no contieneanticoagulantes (como la sangre vencida de Banco), ni anticuerposcontra las bacterias patógenas del hombre o antibióticos, por loque en general permite mejores crecimientos.

Se evita manipular volúmenes considerables de sangre humana,por lo que se anula el riesgo de contraer SIDA, hepatitis B y otrasinfecciones humanas, durante la preparación del agar sangre.

Referencia:

Torres, M.F. 1986. Estandarización de la Bacteriología Médica en Guatemala(Conferencia magistral). En: Memorias, III Congreso Nacional deMicrobiología, página 20. Guatemala 2-6 diciembre.

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CAPÍTULO 9

CULTIVOS DE GARGANTA ESPECIALES

PROPÓSITO:

Demostrar por medio de cultivo la presencia de dos bacterias que solamentedeben investigarse en casos especiales y justificados:

1. Corynebacterium diphtheriae: es la bacteria causante de la difteria. Debeinvestigarse solamente en pacientes cuya sintomatología clínica es com-patible con esta infección. Los síntomas de la difteria laríngea son: for-mación de pseudo-membranas (pellejos) de color gris en la garganta,que sangran mucho al desprenderse, fiebre y el paciente se encuentraseveramente intoxicado (debido a la potente toxina que produce la bac-teria). Actualmente en Latinoamérica la difteria es muy rara, debidoa la efectividad de la vacuna llamada “triple” o DPT (difteria, pertusis,tétanos).

2. Neisseria meningitidis: es la bacteria causante de severa y muy contagio-sa meningitis (infección de las membranas que cubren el cerebro), y porlo tanto se investiga principalmente en líquido cefalorraquídeo. Su pre-sencia debe investigarse por cultivo de garganta en parientes, médicos,enfermeras, o técnicos de laboratorio que han estado en contacto directocon pacientes (generalmente niños) con meningitis meningocóccica. Aestas personas se les llama “contactos”. El propósito fundamental eserradicar la bacteria de la garganta de los contactos con tratamientoantibiótico adecuado, para evitar la diseminación de la infección quepuede llegar a ser epidémica.

INVESTIGACIÓN DE Corynebacterium diphtheriae:

MUESTRA Y PROCEDIMIENTO:

El diagnóstico de la difteria es primordialmente clínico. De ninguna maneraes aceptable que el médico delegue esta responsabilidad en el laboratorio demicrobiología, por medio de un frote de exudado faríngeo coloreado con Gram.C. diphtheriae es un bacilo gram-positivo en forma de “maza” (un extremo más

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ancho que otro). En el frote Gram de material tomado directamente de laspseudo-membranas de la garganta. No puede diferenciarse de otros “difteroides”de igual morfología.

Proceder a tomar la muestra así:

1. Debe contarse con buena iluminación (lámpara portátil de mano), parapoder examinar bien la garganta. Deprimir la lengua con bajalenguasde madera estéril, y buscar áreas necróticas o grisáceas (pseudo-mem-branas). Con un hisopo estéril, frotar firmemente las lesiones descritas.Retirar el hisopo de tal manera que no toque las paredes internas de loscarrillos, ni la lengua.

2. Inocular con el hisopo, un tubo de medio inclinado de Loeffler (sueroanimal más caldo glucosado, coagulado). Este medio debe ser color cre-ma pálido. Incubar aeróbicamente a 36° C durante 18 a 24 horas.

3. Tomar de nuevo muestra con otro hisopo, e inocular una caja de agarchocolate-telurito de potasio. Incubar aeróbicamente a 36° C por 18 a 24horas.

4. Tomar un tercer hisopo de las pseudo-membranas, e inocular directa-mente una caja de agar sangre de carnero al 5%, con cortadas, para in-vestigar la presencia de Streptococcus pyogenes. Incubar en jarro húmedocon candela a 36° C.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

El objeto del medio de Loeffler es permitir que C. diphtheriae crezca másabundantemente que la microbiota de la garganta, sólo durante las primerasocho horas de incubación, y sobre todo con su morfología típica.

Proceder así:

1. Después de incubar el tubo de Loeffler solamente de dos a ocho horas a36° C, preparar dos frotes del leve crecimiento. Al efectuar los frotes,tratar de remover lo menos posible el escaso crecimiento al suspenderloen una pequeña gota de agua, pues es necesario preservar la forma deagrupación típica de C. diphtheriae.

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2. Colorear un frote con Gram. Fijar el otro frote con calor leve a la llama, yteñirlo un minuto con azul de metileno de Ziehl-Neelsen.

3. Buscar en el frote Gram: bacilos gram-positivo pleomórficos y en formade maza. Se agrupan en forma de “letras chinas” o en ángulos en formade “V” o “Y”. No se agrupan en empalizadas (paralelos) como otrosdifteroides.

4. En el frote coloreado con azul de metileno, se observa el mismo tipo deagrupación y además coloración discontinua en forma de bandas azu-les causada por los corpúsculos metacromáticos de polimetafosfato, queson reservas alimenticias de la bacteria.

5. Después de 18 a 24 horas de incubación, C. diphtheriae forma en el medioagar chocolate-telurito colonias de color negro intenso. Un frote Gramde estas colonias revela bacilos gram-positivo pleomórficos. No descar-tar como negativo antes de 48 horas de incubación. Si la morfología delas colonias negras no es muy típica en el agar chocolate-telurito, pero silas hay en el Loeffler, hacer un pasaje de una asada del crecimiento enLoeffler a otra caja de chocolate-telurito para confirmar.

6. C. diphtheriae es catalasa y nitratos positivo. Para efectuar estas pruebas,subcultivar las colonias negras del chocolate-telurito, a agar sangre decarnero. Al obtener cultivo puro con morfología compatible en Gram,suspender sobre un porta objetos una asada del crecimiento en una gotade agua oxigenada, y observar la aparición de burbujas de oxígeno. Debetenerse la precaución de tomar solamente del crecimiento y no del me-dio de cultivo, pues sangre o suero dan reacciones positivas falsas decatalasa. La prueba de reducción de nitratos a nitritos, puede hacerse encaldo nitratado, si se cuenta con él y los reactivos necesarios, pero no esindispensable.

INFORME:

1. Si la morfología del crecimiento en Loeffler (incubado sólo de 2 a 8 ho-ras) es muy típica, y no se cultivó en chocolate-telurito, informar:

Se aisló un bacilo gram-positivo, de morfología compatible conCorynebacterium diphtheriae.

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2. Si la morfología microscópica del crecimiento en Loeffler es típica y haycolonias negras en chocolate-telurito, reportar:

Se aisló Corynebacterium diphtheriae. Identificación preliminar,pendiente de demostrar la producción de toxina in vitro o in vivo.

INVESTIGACIÓN DE Neisseria meningitidisEN CULTIVOS DE GARGANTA DE CONTACTOS:

MUESTRA Y PROCEDIMIENTO:

Neisseria meningitidis sobrevive pobremente en el medio ambiente y su únicohospedero es el hombre, por lo tanto los portadores humanos son el principalreservorio. La transmisión ocurre por contacto directo con secreciones respirato-rias, o por pequeñas gotas suspendidas en el aire, que acarrean la bacteria. El por-centaje promedio de portadores de N. meningitidis en la orofaringe y nasofaringe esde 5 a 15 por ciento, y usualmente sólo durante algunas semanas en cada indivi-duo. En un pequeño porcentaje de personas, la bacteria se disemina de la nasofaringehasta el torrente circulatorio, y produce meningococcemia, meningitis, o ambas.Además de los síntomas de meningitis, en el 75 por ciento de los casos, hay profun-dos efectos vasculares, que provocan petequias o exantema purpúrico, lo que ayu-da al diagnóstico clínico, que debe ser confirmado siempre por Bacteriología.

El cultivo de garganta/nasofaringe para el aislamiento de N. meningitidis, debeobtenerse exclusivamente de “contactos” (personas que han tenido contacto direc-to con algún paciente en el cual se ha demostrado la presencia de la bacteria en sulíquido cefalorraquídeo). Se logra mayor porcentaje de aislamientos si la muestrase obtiene de la nasofaringe en lugar de la garganta. De ninguna manera es unprocedimiento de rutina.

Proceder así:

1. Con hisopo estéril y buena iluminación, frotar firmemente el fondo dela garganta. Si es posible, usar un hisopo largo y curvo, que llegue lomás profundo posible. Con otro hisopo delgado y curvo, tomar muestrade la nasofaringe (por la nariz).

2. Con cada hisopo por separado, inocular un tubo del medio Thayer-Martin; estriar bien la superficie del medio con el mismo hisopo.

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3. Introducir los tubos, con el tapón de rosca ligeramente flojo, dentrode un jarro con candela encendida y humedad. Incubar por 18 a 24horas a 36° C.

INTERPRETACIÓN:

1. Después del período de incubación, observar el crecimiento de coloniaspequeñas, grises, brillantes y ligeramente mucosas.

2. Con el asa en hilo, y con mucho cuidado, hacer un pequeño frote Gramde las colonias sospechosas; deben observarse diplococos gram-negati-vo en forma de “granos de café”, agrupados en parejas.

3. Para obtener un cultivo puro, subcultivar las colonias que presentan estamorfología microscópica a una caja de agar chocolate (sin inhibidores),e incubar en jarro con candela por 18 a 24 horas.

4. Efectuar la prueba de oxidasa, ya sea agregando el reactivo directamen-te sobre la caja, o frotar las colonias con palillo de madera sobre discoshúmedos con el reactivo de oxidasa. La aparición de coloración moradooscuro-negro, indica una prueba positiva. Si este es el caso, proceder aefectuar la prueba de oxidación de maltosa y sacarosa, según se indicaen el capítulo de secreciones genitales. N. meningitidis oxida la maltosa,pero no la sacarosa (sucrosa). Neisseria lactomica que también crece en elmedio Thayer-Martin y tiene interés clínico, debe identificarse con laoxidación positiva de la lactosa.

5. Desde el punto de vista epidemiológico, es muy conveniente saber acual grupo pertenece el aislamiento (A,B,C,D,X,Y,Z, y otros). Por estemotivo, si el laboratorio no cuenta con los antisueros de tipificación,debe remitir el cultivo en agar chocolate (bien sellado) al laboratorionacional de referencia correspondiente.

INFORME:

Si todas las pruebas anteriores son positivas, y se está seguro que no se tratade una Neisseria sp. o Branhamella catarrhalis, tan frecuentes en la microbiota nor-mal de la garganta, informar: Se aisló Neisseria meningitidis.Si se cuenta con los antisueros de tipificación, realícela e informe:

Se aisló Neisseria meningitidis del grupo __. (según el que haya aglutinado)

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FOTOGRAFÍAS

Foto 1. Listeria monocytogenes, en contraste de fases. Los bacilos aparecen incoloros ybrillantes . No es una coloración, ésta técnica de observación en fresco proporcionaexcelente contraste. Foto: CDC, Atlanta, Georgia, EUA.

Foto 2. Listeria monocytogenes, coloración de Gram. Aislamiento de líquidocefalorraquídeo. Bacilos regulares de coloración sólida. Presentan el típico color moradonegruzco las bacterias gram-positivo. Foto: Walter Reed Institute, Washington, D.C.,E.U.A.

Foto 3. Staphylococcus aureus, coloración de Gram de cultivo puro obtenido de secreciónde herida infectada. Son cocos esféricos de una micra de diámetro, agrupados en formade racimos. Foto: Walter Reed Institute, Washington, D.C., E.U.A.

Foto 4. Streptococcus pyogenes, frote Gram de secreción de oreja necrótica. Presentaabundantes cocos gram-positivo pequeños y ligeramente ovalados, sueltos, en parejasy cadenas cortas. Infección infantil mortal, Laboratorio de Microbiología, HospitalGeneral del IGSS zona 9, agosto de 1982. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.

Foto 5. Streptococcus pneumoniae, frote Gram de esputo purulento de paciente conneumonía lobar. Imagen típica de esta bacteria: cocos gram-positivo agrupada enparejas. Foto: Institut Pasteur, París, Francia.

Foto 6. Streptococcus pneumoniae, frote de sedimento de líquido cefalorraquídeo (LCR)de paciente con meningitis grave. Presenta abundantes cocos gram-positivo ovalados;se insinúa la cápsula como un halo claro difuso alrededor de las células. Aparecen dosleucocitos polimorfonucleares (gram-negativo). Foto: Rubén Mayorga Peralta,Guatemala.

Foto 7. Escherichia coli, frote Gram de cultivo puro obtenido de urocultivo positivo.Bacilos gram-negativo, regulares, de coloración sólida y bordes redondeados. Estamorfología es típica en las enterobacterias. Foto: Walter Reed Institute, Washington,D.C., E.U.A.

Foto 8. Bacteroides fragilis, coloración de Gram de cultivo puro. Presenta coloración rojopálido (típica de los anaerobios gram-negativo) y pleomorfismo. Foto: AnaerobeLaboratory, Virginia Politechnic Institute, Blacksbourg, E.U.A.

Foto 9. Shigella flexneri, Salmonella enteritidis y Escherichia coli en Agar Hektoen Enterics.Este medio selectivo para bacilos gram-negativo, brinda buena diferenciación. Lascolonias de bacterias lactosa-positivo como E. coli presentan color salmón; las lactosa-

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negativo como Shigella spp. dan colonias puntiformes color verde pálido. Las coloniasproductoras de ácido sulfhídrico como Salmonella spp. manifiestan color negro en lacolonia. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.

Foto 10. Arizona hinshawii y Escherichia coli en MacConkey (izquierda) y Hektoen(derecha). Cultivo mixto de miositis necrotizante severa en un paciente pediátrico,Hospital General del IGSS zona 9, 1982. Este cultivo semeja un coprocultivo positivo aSalmonella enteritidis. En MacConkey las colonias lactosa-positivo son rojas y las lactosa-negativo incoloras. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.

Foto 11. Reacciones típicas de Salmonella enteritidis en TSI/LIA. TSI (abajo): superficiealcalina (rojo), fondo ácido (amarillo, oculto por el precipitado negro), presentaabundante gas (burbuja y fondo separado) y ácido sulfhídrico (negro). El LIA (arriba)es alcalino/alcalino (violeta), lo que indica descarboxilación del aminoácido lisina,también presenta precipitado negro debido al ácido sulfhídrico. Foto: CDC, Atlanta,E.U.A.

Foto 12. Reacciones típicas de Shigella flexneri en TSI/LIA. TSI (abajo): superficie alcalina(rojo), fondo ácido (amarillo), no presenta gas ni ácido sulfhídrico. El LIA (arriba) esalcalino/ácido (K/A), sin gas ni ácido sulfhídrico. En Shigella spp. frecuentemente elcolor del fondo de ambos tubos es amarillo canario y el TSI huele a semen. Foto: MiguelF. Torres, Guatemala.

Foto 13. Reacciones de tres enterobacterias en TSI. De izquierda a derecha: medio noinoculado (K/K), Escherichia coli (A/A,++,-), Salmonella enteritidis (K/A, +,+++) ySalmonella typhi (K/A,-,+poco). Foto: CDC, Atlanta, E.U.A.

Foto 14. Vibrio cholerae 01 en agar TCBS. Cultivo de heces de paciente guatemalteco concólera enriquecido en agua peptonada alcalina (APA), luego sembrada en TCBS.Colonias típicas: grandes, aplanadas y amarillas (sacarosa-positivo). Foto: Miguel F.Torres, Guatemala.

Foto 15. Efecto del enriquecimento de coprocultivo en APA para el aislamiento deVibrio cholerae 01. Izquierda: cultivo en TCBS de enriquecimiento en APA, muestracrecimiento puro y masivo. Derecha: cultivo de heces sembradas directamente en TCBS,sin enriquecimiento, presenta crecimiento más escaso de cultivo mixto. Foto: Miguel F.Torres, Guatemala.

Foto 16. Prueba de susceptibilidad según el método de Bauer-Kirby. El biotipo eltor deVibrio cholerae 01 es resistente al disco de 50 UI de Polimixina-B, que se observa en elcentro. Fotografía: Miguel F. Torres, previamente publicada en Torres, M. et al. 1991.Etiología y Diagnóstico de Laboratorio de el Cólera. OPS/OMS, Guatemala.

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Foto 17. Urocultivo positivo a Klebsiella pneumoniae, más de 100,000 UFC/ml, en agarMacConkey sembrado con de 0.001 ml de orina con asa calibrada de platino. Muestracolonias grandes y muy mucosas debido a la presencia de cápsula. Foto: Miguel F.Torres, Guatemala.

Foto 18. Urocultivo positivo a Escherichia coli, más de 100,000 UFC/ ml, en agarMacConkey. Esta imagen es la más frecuente en urocultivos positivos. Las incontablescolonias son rojas, brillantes y de bordes enteros. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.

Foto 19. Streptococcus pyogenes, sub-cultivo sobre agar sangre de carnero al 5%, con undisco de bacitracina. Este cultivo fué incubado en jarro húmedo con candela a 37 gradoscentígrados por 24 horas. Se observa claramente la inhibición del crecimiento provocadaselectivamente por este antibiótico, como un halo rojo (sin destrucción de los eritrocitosovinos) alrededor del disco. En el crecimento de esta bacteria se observa intensahemólisis de tipo beta. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.

Foto 20. Streptococcus pyogenes, prueba de CAMP negativa; siembra sobre agar sangrede carnero. Las estrías verticales de Staphylococcus aureus de doble zona de beta hemólisispresentan crecimiento blanco. Las estrías perpendiculares de varias cepas de S. pyogenesson beta hemolíticas, pero la hemólisis no se incrementa en forma de flecha donde elcrecimiento de ambas bacterias se acerca sin tocarse. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.

Foto 21. Crecimiento de Streptococcus pneumoniae, cultivo de LCR en agar sangre decarnero. Las colonias típicas son pequeñas, redondas, planas, de bordes enteros yfrancamente alfa hemolíticas. Las colonias jóvenes son elevadas; a medida que el cultivoenvejece, las colonias se aplastan y su centro se deprime debido a la acción de enzimasautolíticas; esto no ocurre con otros estreptococos viridans.La típica hemólis alfa seincrementa al incubar en microaerofilia con jarro húmedo con candela. Foto: Miguel F.Torres, Guatemala.

Foto 22. Sub-cultivo del crecimiento original de la foto anterior con disco de optoquina.El halo de inhibión mayor de 14 mm de diámetro, identifica presuntivamente aStreptococcus pneumoniae. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.

Foto 23. Cultivo de esputo en agar sangre de carnero, de paciente guatemalteco conneumonía lobar causada por Streptococcus pyogenes. Las cepas muy virulentas queposeen cápsula gruesa, presentan colonias mucosas como las de éste caso. Las coloniasconfluentes presentan la típica hemólisis tipo alfa. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.

Foto 24. Sub-cultivo del crecimiento mucoso de la foto anterior, con un disco deoptoquina. Se observa un amplio halo de inhibición del cultivo por el hidrocloruro de

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etil cupreína (optoquina, derivado de la quinina). Las cepas mucosas dan también lasreacciones típicas de inhibición y alfa hemólisis. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.

Foto 25. Haemophilus influenzae, prueba de satelitismo de sub-cultivo de aislamiento deLCR. Paciente guatemalteco de un año con meningitis mortal. H. influenzae crece sólomuy cerca de la estría de Staphylococcus aureus. En el agar sangre de carnero el factor V(nucleótidos de piridina o nicotinamida adenina dinucleótido) se encuentra dentro delos eritrocitos, el factor X (hemina) sí se encuentra libre en el medio. S. aureus liberafactor V, por lo que causa satelitismo de ciertos Haemophilus spp. Foto: Miguel F. Torres,Guatemala.

Foto 26. Shigella dysenteriae tipo 1 (Bacilo de Shiga). Prueba de susceptibilidad según elmétodo de Bauer-Kirby, de una cepa aislada en INCAP (Instituto de Nutrición deCentroamérica y Panamá, Guatemala) durante la epidemia de shigellosis 1969-70. Foto:Leonardo J. Mata, Costa Rica.

Foto 27. Demostración del método para preparación de frotes de esputo entre dos porta-objetos. M. Torres y sus estudiantes en el curso Bacteriología II, Laboratorio deMicrobiología, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, USAC, 1979. Foto: anónima.

Foto 28. Mycobacterium tuberculosis en frote de esputo coloreado con la técnica de Ziehl-Neelsen. Los bacilos alcohol-ácido resistentes aparecen teñidos de color rojo. Lacoloración de Kinyoun da los mismos resultados. Foto: Gillies R.R. y T.C. Dodds,Inglaterra.

Foto 29. Colonias de Mycobacterium tuberculosis, acercamiento con microscopioestereoscópico. Este tipo de colonias rugosas y de bordes irregulares, son llamadas“eugónicas”. No presentan pigmento. Foto: CDC, Atlanta, E.U.A.

Foto 30. Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, con factor cordón. Las cepas más virulentasde M. tuberculsis manifiestan esta característica. Se observa el crecimiento en forma decordones sinuosos. Foto: Rubén Mayorga Peralta.

Foto 31. Mycobacterium kansasii, crecimiento eugónico en el medio de Lowenstein-Jensen.Fué cultivado en la oscuridad por varias semanas, con el tubo cubierto por papel negrode manera que no tuviera contacto con la luz. No presenta pigmento. Foto: CDC, Atlanta,E.U.A.

Foto 32. Mycobacterium kansasii, cultivo en Lowenstein-Jensen después de exposición ala luz. Es fotocromógeno, es decir que presenta pigmento anaranjado fuerte sólo enpresencia de luz. Foto: CDC, Atlanta, E.U.A.

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CAPÍTULO 10

CULTIVO DE ESPUTO

PROPÓSITO:

Demostrar por medio de frote coloreado con Gram y cultivo, la presencia debacterias causantes de infección respiratoria inferior. La neumonía bacteriana, oinfección del pulmón causada por bacterias puede ser de dos tipos:

a. Neumocóccica: causada por Streptococcus pneumoniae.b. No neumocóccica: causada por Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus

aureus, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, y ocasionalmentepor otras bacterias.

MUESTRA:

La infección bacteriana de tráquea y bronquios produce abundante esputo.Debe obtenerse el primer esputo de la mañana, pues es más espeso y no está conta-minado por comida. Indicar al paciente que al despertar, se enjuague la boca conagua corriente (sin usar antisépticos ni pasta dental) y luego acostado en su cama(boca abajo) debe desgarrar esputo con fuerza, y depositarlo directamente en unrecipiente estéril de boca ancha proporcionado por el laboratorio. Para este propó-sito, el laboratorio debe contar con recipientes estériles de plástico, descartables. Sino se cuenta con este material, deben esterilizarse suficientes frascos de vidrio,pequeños y de boca ancha.

En el caso del cultivo de esputo, para obtener resultados confiables, es crucialla obtención de una buena muestra. Si el cultivo se efectúa de material inadecuadocomo saliva, el resultado confundirá al médico tratante porque no se detectó elverdadero patógeno, o se recuperó de la microbiota de la saliva un patógeno po-tencial que no es el agente etiológico primario de la neumonía. Por este motivo, ellaboratorio deberá rechazar sin vacilar las muestras que se consideren insatisfacto-rias, según los criterios que aparecen más adelante.

Aproximadamente 1 a 3 ml de esputo mucopurulento son suficientes paraefectuar el frote Gram y cultivo de rutina, pero son insuficientes para el cultivo de

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micobacterias (BK). Si la muestra no se va a procesar de inmediato, debe refrigerarsepor no más de tres horas.

Debe ponerse atención en el color, olor y consistencia del esputo. Las mues-tras hialinas y completamente líquidas deben rechazarse de inmediato pues no sonesputo, son saliva. Una muestra de esputo muy tenaz y adherente puede indicar lapresencia de Klebsiella pneumoniae. Mal olor indica la presencia de anaerobios, peroel esputo nunca debe cultivarse para anaerobios, pues siempre van a estar presen-tes por el paso de la muestra a través de la boca, donde son muy abundantes. Encaso de sospecharse infección pulmonar por anaerobios, debe obtenerse muestrapor punción trans-traqueal.

Al laboratorio pueden remitirse otras muestras que provienen del aparatorespiratorio inferior, las cuales se procesan de manera similar al esputo, en buscade las mismas bacterias y además anaerobios (en caldo tioglicolato). Estas mues-tras obtenidas por técnicas invasivas, siempre son obtenidas por el médiconeumólogo: aspirado traqueal, lavado bronquial, cepillado bronquial, biopsia bron-quial, lavado bronco-alveolar, aspirado trans-traqueal, aspirado pulmonar, y biopsiapulmonar. Al procesar estas muestras, que frecuentemente son pequeñas, debe to-marse en cuenta su importancia y la dificultad de su obtención, por lo que confrecuencia son imposibles de repetir.

EL FROTE GRAM DE ESPUTO:

En primer lugar debe procederse a evaluar la calidad de la muestra, es decirdeterminar si es adecuada y confiable para ser cultivada o no. Proceder así:

1. Vertir asépticamente el esputo en una caja de Petri estéril y colocarlasobre un fondo obscuro.

2. Quebrar los extremos de dos aplicadores de madera estériles. Con ayu-da de las puntas irregulares, seleccionar las partículas anormales: conpus (blanquecino), o sangre (rojizo).

3. Con cuidado, colocar la partícula anormal en el extremo de unporta-objetos. Con otro porta-objetos, presionar la muestra varias vecesa manera de “cortar” el esputo, y luego deslizar ambos porta-objetosuno sobre otro, para obtener dos frotes delgados.

4. Seleccionar el mejor de los dos frotes. Dejar secar, y luego fijar con calor

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sobre el mechero. Colorear el frote seleccionado con Gram y el otro conZiehl-Neelsen, si así fue solicitado por el médico.

5. Observar varios campos en el microscopio con un aumento de 100X (secodébil).Descartar el esputo si presenta:

a. Más de 10 células epiteliales/campo, yb. Menos de 25 leucocitos/campo (criterio de la Clínica Mayo, de

Murray y Washington, y de Van Scoy).

En el verdadero esputo, se observan en fresco abundantes leucocitos ymacrófagos alveolares.

6. Si el esputo es aceptable para ser cultivado, ponerle una gota de aceite yobservarlo con lente de inmersión, según los siguientes criterios.

INTERPRETACIÓN DEL FROTE GRAM DE ESPUTO:

1. Al interpretar un frote de esputo coloreado con Gram, debe tenerse encuenta que esta muestra siempre va a presentar bacterias de la microbiotade la boca. Sin embargo, deben reportarse cuantitativamente todas lasbacterias observadas, según los criterios que aparecen en este manual,en la técnica e informe de la coloración de Gram.

2. No debe sobre interpretarse la presencia de bacterias. Es muy importan-te detectar y reportar principalmente el tipo de bacterias que predomi-na. Los cocos gram-positivo usualmente se localizan alrededor de lascélulas epiteliales.

3. El predominio de un tipo de bacterias, permite distinguir simple coloni-zación de infección verdadera. El médico debe relacionar estos datoscon las observaciones clínicas.

4. La morfología bacteriana observada en el esputo nunca identifica laespecie (Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, etc.), el hacerlo cau-sa errores en el tratamiento del paciente. Sin embargo, la presencia deabundantes cocos gram-positivo lanceolados, solos, en pares o cadenascortas, cuya cápsula se insinúa pero no se tiñe con Gram, y abun-dantes leucocitos polimorfonucleares, permite sospechar la presencia

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de Streptococcus pneumoniae (neumococo) como agente causante de laneumonía.

5. Observar cuidadosamente la presencia de pequeños cocobacilos gram-negativo (Haemophilus influenzae), hongos filamentosos que son gram-positivo, y filamentos gram-positivo delgados y ramificados (Nocardiaasteroides o Actinomyces israelii). Los hongos intracelulares deben detec-tarse con la coloración de Giemsa.

6. Los cristales de Charcot-Leyden, que provienen de los gránulos de loseosinófilos, son alargados y terminados en punta. Deben reportarse sise observan.

CULTIVO DE ESPUTO:

El esputo vertido en una caja de Petri estéril (para poder seleccionar mejor lafracción de la muestra a analizar), debe procesarse así:

1. Seleccionar con las puntas irregulares de dos aplicadores estériles demadera, las partículas anormales (con pus y/o sangre). Pasar estas par-tículas y unirlas en un espacio seco de la caja de Petri.

2. Tomar la muestra seleccionada con el asa en argolla (flameada y fría) yestriar con cortadas en la superficie de una caja de agar sangre de carne-ro al 5%.

3. Si aún queda muestra de la partícula seleccionada, inocular una caja deMacConkey. Si esto no es posible, seleccionar otra partícula anormal.

4. Si el frote coloreado con Gram indica la posible presencia de Haemophilusinfluenzae, debe inocularse también agar chocolate.

5. Incubar el agar sangre de carnero y el agar chocolate en jarro húmedocon candela, y el MacConkey aeróbicamente, por 18 a 24 horas a 36° C.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS E INFORME:

1. Examinar las cajas simultáneamente, con lupa y buena luz o microsco-pio estereoscópico. En primer lugar, buscar en el agar sangre de carnerocolonias de Streptococcus pneumoniae, con las siguientes características:

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alfa hemolíticas (hemólisis verdosa), planas (deprimidas en el centro ycon los bordes ligeramente más elevados), brillantes, transparentes, ypequeñas (menos de un milímetro de diámetro). Algunas veces las colo-nias de S. pneumoniae no son típicas, y pueden ser grandes (hasta 4 mm),convexas y muy mucosas (debido a la cápsula). Siempre presentan lahemólisis verdosa (alfa) característica.

2. Con la técnica ya indicada para sub-cultivar Streptococcus beta hemolíticoen cultivos de garganta, trasladar con el asa en hilo, una o dos colonias auna caja de agar sangre de carnero. Estriar en varias direcciones, y conpinzas flameadas colocar en el centro un disco de optoquina (Taxo “P” odisco “O”). Incubar en jarro con candela a 36° C por 18 a 24 horas, einterpretar así:

a. Inhibición positiva (si hay halo); sólo se considera significativa unazona de inhibición mayor de 14 mm de diámetro. Reportar: Se ais-ló Streptococcus pneumoniae.

b. Inhibición negativa (no hay halo); se trata de un Streptococcus alfahemolítico (grupo viridans), no debe reportarse pues es microbiotanormal.

Se ha demostrado que aproximadamente en el 45 por ciento de pacientes conneumonía neumocóccica, no se aísla la bacteria responsable. Por este motivo, uncultivo de esputo negativo, no descarta definitivamente la presencia de esta infec-ción.

3. Buscar colonias beta hemolíticas en el agar sangre de carnero. Si las hay,proceder de acuerdo con las recomendaciones para la identificación deStreptococcus pyogenes en el capítulo de cultivo de garganta. No efectuarantibiograma a esta bacteria, por su susceptibilidad prácticamente uni-forme a la penicilina, que es el tratamiento de elección.

4. Haemophilus influenzae crece bien en agar chocolate, presenta coloniaspequeñas (frecuentemente menos de un milímetro de diámetro), bri-llantes y circulares. En agar sangre de carnero crece solamente alrede-dor de las colonias de otras bacterias (Staphylococcus aureus, etc.), a loque se conoce como satelitismo natural, el cual de preferencia, pero nonecesariamente, debe observarse con microscopio estereoscópico. Si hayduda, sub-cultivar en otra caja de agar sangre de carnero, con una estríade Staphylococcus aureus , para observar el satelitismo artificial (creci-

126

miento sólo muy cerca de la estría de S. aureus). El frote Gram del creci-miento de las pequeñas colonias satélites presenta predominio decocobacilos gram-negativo, con algunas formas filamentosas. Es oxidasa-positivo.

5. Buscar en el MacConkey colonias lactosa-positivo (rojo-rosado) mucosas(bacterias capsuladas), indicativas de la presencia de Klebsiellapneumoniae. Si el crecimiento predominante son este tipo de coloniasgrandes, francamente mucosas, trasladar con el asa en hilo a TSI, LIA,MIO, urea y citrato e interpretar según las indicaciones en el capítulo decoprocultivo. Si las pruebas son compatibles, reportar:Se aisló Klebsiella pneumoniae.

6. En el caso de Streptococcus pneumoniae: debe efectuarse prueba de sus-ceptibilidad antimicrobiana a la penicilina. Cada vez aparecen más re-portes en la literatura de cepas de S. pneumoniae resistentes a penicilinapor la producción de beta lactamasa. Hacer la prueba para determinarla susceptibilidad a la penicilina en agar Mueller-Hinton + 5% de sangrede carnero en jarro con candela, con un disco de 1 µg de oxacilina; seinterpreta como susceptible la presencia de un halo de inhibición mayoro igual a 20 mm (NCCLS, M100-56, 1995). Si es posible, detectar la pro-ducción de beta lactamasa por un método confiable. En el caso deKlebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, otrasenterobacterias o Haemophilus influenzae (en este caso en agar chocola-te), sí efectuar prueba de susceptibilidad.

7. Debe tomarse en cuenta que en los cultivos de esputo, rara vez se obtie-nen cultivos puros. Identificar otras bacterias que pueden causar neu-monía humana, solamente si su crecimiento predomina.

8. El cultivo de esputo para aislar Legionella pneumophila, debe efectuarsepor procedimientos especiales, y sólo en casos plenamente justificados.Para este propósito, deberá consultarse literatura especializada.

9. Si en la interpretación del cultivo de esputo no se toman en cuenta loscriterios anteriores, es un examen inútil que puede conducir a graveserrores en el tratamiento del paciente. Si no se aisla S. pneumoniae o S.pyogenes (aunque sea escaso), u otras bacterias predominantes sobre lamicrobiota, reportar:No se aislan patógenos, desarrollan bacterias de la microbiota normal.

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ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE NEUMONÍA Y BRONQUITIS

SIGNOS Y SÍNTOMAS

Tos

Dolor toráxico

Disnea

Consolidación pulmonar

Sonidos anormales

Disminución de sonido respiratorio

Infiltrado (Rayos-X)

Matidez a la percusión

Cavitación

Empiema

BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA

Streptococcus pneumoniae

Haemophilus influenzae

Staphylococcus aureus

Klebsiella pneumoniae y otras enterobacterias

Legionella spp.

Mycobacterium spp.

Fusobacterium nucleatum

Bacteroides melaninogenicus

y otros anaerobios

129

CAPÍTULO 11

HEMOCULTIVO / MIELOCULTIVO

PROPÓSITO:

El hemocultivo o cultivo de sangre, sirve para detectar las bacterias que seestán reproduciendo en la sangre, lo que provoca septicemia. El mielocultivo es elcultivo de médula ósea y sirve para detectar bacterias en esta muestra, especial-mente Salmonella typhi. La septicemia es una de las enfermedades infecciosasmás graves, por esta razón la detección efectiva y rápida de la bacteria causante,constituye una de las funciones más importantes del diagnóstico bacteriológico. Ladetección de bacterias en sangre o médula ósea tiene importancia diagnóstica ypronóstica. En el caso de fiebre tifoidea, causada por S. typhi, su hallazgo en lasangre, o más efectivamente en médula ósea, constituye el diagnóstico de ésta se-vera infección, y permite instituir tratamiento con el delicado antibiótico de elec-ción (cloranfenicol).

En condiciones normales no se detectan bacterias en la sangre. Las bacteriaspenetran hacia el torrente circulatorio desde sitios extravasculares, por los vasoslinfáticos. Cuando las bacterias se multiplican a una velocidad que excede la capa-cidad del sistema reticulo-endotelial para removerlas de la sangre, ocurre lasepticemia. Se diferencia de la bacteremia, que es la presencia transitoria de bacte-rias en el torrente circulatorio, la cual ocurre cotidianamente durante el cepilladodental, contacto sexual, etc. Actualmente existe la tendencia por usar estos dostérminos (septicemia y bacteremia) indistintamente

Usualmente causa septicemia una sola especie bacteriana. Sin embargo, lasepticemia polimicrobiana se presenta con una frecuencia no despreciable.

MUESTRA:

Los síntomas del paciente que indican la necesidad de obtener un hemocultivoson: aumento súbito del pulso y la temperatura, cambios sensoriales, calofríos,postración y presión baja. La recuperación de las bacterias de la sangre depende deestos factores:

130

1. La cantidad de sangre que se cultiva. En niños debe ser al menos 2.5 mly en adultos usualmente 5 ml, aunque sería preferible cultivar 10 ml.

2. La relación entre sangre y caldo de cultivo debe ser siempre 1:10, esdecir sangre al diez por ciento en caldo, con el objeto de evitar la coa-gulación de la sangre.

3. La presencia de inhibidores bacterianos en el suero, tales comoanticuerpos, complemento o antibióticos.

4. Los métodos de cultivo en el laboratorio de microbiología.

5. La característica de la bacteria de ser “fastidiosa”, es decir que requiereun medio de cultivo enriquecido y complejo.

El hemocultivo debe obtenerse siempre antes de iniciar el tratamiento conantibióticos. No es crucial obtener la muestra de sangre cuando sube la temperatu-ra del paciente; si es posible, deberá tomarse antes del alza esperada de temperatu-ra o inmediatamente después del calofrío. En algunos casos, se justifica obtenervarias muestras del paciente, en tiempos y de sitios diferentes, es decir “seriado”.Los hemocultivos seriados, obtenidos antes de la antibioticoterapia, son especial-mente útiles en el caso de sepsis aguda, meningitis, osteomielitis, neumoníabacteriana, pielonefritis y endocarditis.

Debido a que la piel humana normal está constantemente cubierta de abun-dante microbiota, es muy importante tomar la muestra con precauciones especia-les. Para obtener la muestra no es necesario utilizar “campo estéril”, pero sí obser-var todas las indicaciones necesarias para la toma aséptica de la muestra. Al obte-ner la sangre para hemocultivo, deben seguirse cuidadosamente las siguientes ins-trucciones:

1. Destapar el frasco con caldo de hemocultivo, para descubrir el tapón dehule perforable. Dejar la tapadera a un lado, y con un algodón empapa-do en solución de yodo al 3 por ciento en alcohol (tintura), limpiar bienel tapón perforable. Dejar secar mientras se atiende al paciente.

2. Colocar la ligadura en el brazo del paciente, luego palpar la vena y loca-lizar con precisión el sitio donde se va a puncionar.

3. Es una buena práctica rutinaria lavar con agua y jabón el brazo del

131

paciente, antes de aplicar desinfectantes. Limpiar el sitio exacto con unalgodón empapado en tintura de yodo al 3 por ciento. Dejar secar yluego limpiar el sitio de punción con un algodón empapado en alcohol,con movimientos circulares en forma de espiral que se inicia en el sitiode punción. Después de esta prepación no se debe volver a tocar la vena.

4. Con aguja y jeringa estériles, puncionar la vena y obtener asépticamente5 ml o más de sangre.

5. Nunca debe cambiarse aguja después de obtener la sangre, excepto cuan-do se falla en el intento de hacerlo, y se punciona en otro sitio. Inyectarexactamente 5 ml de sangre en el frasco que contiene 45 ml de caldo, o10 ml en un frasco con 90 ml de caldo. En los hemocultivos pediátricos,inyectar 2.5 ml de sangre en 25 ml de caldo.

6. El caldo preparado comercialmente que debe usarse, es el caldo thiol,especialmente diseñado para efectuar hemocultivos de pacientes quepudieran haber recibido penicilina, estreptomicina o sulfonamidas. Elcaldo debe contener de 0.025 por ciento a 0.05 por ciento de polianetolsulfonato de sodio (SPS). Esta sustancia actúa como anticoagulante, yademás inhibe la actividad bactericida del suero y la fagocitosis de losleucocitos, inactiva el complemento y neutraliza lisozimas y antibióticosaminoglucósidos. También debe tener vacío parcial y atmósfera enri-quecida con anhídrido carbónico. Los frascos comerciales deben mante-nerse en la oscuridad y a temperatura ambiente.

7. En caso de no contarse con frascos o botellitas comerciales parahemocultivo, éstas pueden prepararse en el laboratorio, en recipientesde vidrio esterilizables y con doble tapón, el interno perforable. Los cal-dos BHI (infusión de cerebro y corazón de buey) o Tripticasa-soya danbuenos resultados. Usualmente el hemocultivo para anaerobios no seefectúa, a menos que se cuente con botellitas anaerobias comerciales;sin embargo, algunos anaerobios aerotolerantes eventualmente puedencrecer.

8. Agitar suavemente las botellas ya inoculadas, e incubar a 36° C.

9. Las muestras de médula ósea para efectuar el mielocultivo siempre de-ben ser obtenidas por el médico, quien puncionará el esternón o la cresta

132

ilíaca. Esta muestra debe procesarse exactamente igual que elhemocultivo.

PROCEDIMIENTO:

1. Incubar los hemocultivos y mielocultivos a 36° C por siete días, exceptoen casos especiales en los cuales debe prolongarse la incubación, porejemplo para el aislamiento de Brucella spp.

2. Con mucho cuidado para que el caldo no se agite, examinar diariamen-te los frascos contra la luz, para buscar alguno de los siguientes signosvisibles que indican crecimiento bacteriano, los cuales orientan hacia eltipo de bacteria que está creciendo:

OBSERVACIONES EN HEMOCULTIVOS QUE ORIENTANEL DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO

Signo visible Posible bacteria

Turbidez Bacilos gram-negativo aerobiosStaphylococcus spp.Bacteroides spp.

Hemólisis Streptococcus spp.Staphylococcus spp.Listeria spp.Clostridium spp.Bacillus spp.

Formación de gas Bacilos gram-negativo aerobiosAnaerobios

Colonias visibles como “motas de algodón” Staphylococcus spp.Streptococcus spp.

Formación de película Pseudomonas spp.Bacillus spp.Levaduras

Formación de coágulo gelatinoso Staphylococcus aureus

Coloración verdosa (raro) Pseudomonas aeruginosa

133

3. En caso de observar cualquiera de estas características, agitar suave-mente, limpiar el tapón perforable con algodón y alcohol, puncionarcon jeringa y aguja estériles (puede ser de tuberculina) y aspirar unapequeña cantidad del caldo. Inocular una gota, y luego estriar con asasobre una caja de agar sangre de carnero y una caja de agar chocolate;incubar ambas cajas en jarro con candela. Es aconsejable sembrar tresgotas del hemocultivo, pero sólo estriar una. Si no se observa crecimien-to en las gotas no rayadas y lo hay en las estrías, posiblemente se tratade contaminación. Simultáneamente, dejar secar dos gotas del caldo so-bre un porta-objetos; colorear con Gram.

4. Observar cuidadosamente el frote Gram con lente de inmersión, pues laobservación de las bacterias es la base de su caracterización. Además,algunas bacterias como Haemophilus influenzae no producen signos visi-bles en el caldo. Si se observan bacilos o cocobacilos gram-negativo,inocular adicionalmente una caja de agar MacConkey; incubaraeróbicamente. Esto es especialmente importante para el aislamiento eidentificación de Salmonella typhi.

5. Si se observan cocos gram-positivo esféricos y con tendencia a agrupar-se en racimos, inocular una caja de agar manitol-sal, para facilitar elaislamiento e identificación de Staphylococcus aureus. Si se observandiplococos o cadenas cortas de cocos gram-positivo ovalados, aplicarlos discos de optoquina y bacitracina sobre la segunda estría del agarsangre de carnero, para acelerar la identificación presuntiva deStreptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes.

6. Rutinariamente, revisar los hemocultivos y mielocultivos aparentementenegativos. Proceder así: hacer asépticamente un frote Gram del caldo alas 48 horas, y también al séptimo día de incubación. La incubaciónprolongada puede producir una leve turbidez de fibrina.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS;

1. Con siete días de incubación a 36° C se recupera el 95 por ciento de lasbacterias clínicamente significativas. Identificar los crecimientosbacterianos según el caso, con las técnicas descritas. Si se observa enMacConkey el crecimiento de colonias lactosa-negativo sospechosas deSalmonella typhi, aglutinar inmediatamente el crecimiento en agar san-gre de carnero, con antisuero polivalente anti-Salmonella, anti-Salmonella

134

grupo D, y anti-antígeno Vi. Si hay aglutinación franca, reportar inme-diatamente la presencia de Salmonella typhi.

2. Algunas bacterias frecuentes en hemocultivos positivos, son lassiguientes:

- Salmonella typhi- Escherichia coli- Streptococcus pneumoniae- Staphylococcus aureus- Streptococcus pyogenes- Pseudomonas aeruginosa- Haemophilus influenzae

3. Algunas bacterias que frecuentemente crecen en hemocultivos, comocontaminantes provenientes de la microbiota de la piel, son los siguien-tes bacilos gram-positivo:

- Bacillus sp. (esporulado)- Corynebacterium sp. (no esporulado, difteroide)

ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE SEPTICEMIA

SIGNOS Y SÍNTOMAS

Fiebre en picos

Calofríos

Murmullo cardíaco (endocarditis)

Petequias en piel y mucosas

Hemorragia puntiforme en uñas

Malestar

BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA

Streptococcus pyogenes (grupo A) en todas las edades

Streptococcus alfa hemolítico (endocarditis)

Streptococcus grupos A, B y D neonatos

Staphylococcus aureus

Streptococcus pneumoniae

Salmonella typhi (fiebre tifoidea)

Escherichia coli

Bacteroides fragilis y otros anaerobios

Pseudomonas aeruginosa

Listeria monocytogenes

Haemophilus influenzae

135

INFORME:

1. Los hemocultivos deben reportarse como negativos si no se observanbacterias en el segundo control por coloración de Gram, a los siete díasde incubación, nunca antes. Reportar así:Negativo a los siete días de incubación a 36° C.

2. Si el hemocultivo presenta crecimiento a cualquier tiempo de incubación,reportar cuanto antes la bacteria aislada, identificada si es posible hastaespecie, aunque la identificación sea presuntiva. Reportar así:Se aisló ___________ , susceptibilidad pendiente.

3. En el caso del aislamiento e identificación de Streptococcus pneumoniae oStreptococcus pyogenes de hemocultivo, reportar así:Se aisló Streptococcus ___________ , se recomienda tratamiento con peni-cilina.Si se trata de S. pneumoniae si hacer la prueba de susceptibilidad a lapenicilina.

4. Después de interpretar los resultados de la prueba de susceptibilidadantimicrobiana, enviar otro reporte, así:Se aisló: ___________________Susceptible a: ______________Intermedio a: ______________Resistente a: _______________

Si el laboratorio tiene capacidad económica suficiente, es conveniente utilizarel sistema para detección de bacterias por lisis-centrifugación (ISOLATOR, Labora-torios Wampole), o algún sistema automatizado para efectuar hemocultivos (porejemplo BACTEC, Becton Dickinson).

137

CAPÍTULO 12

SECRECIONES DIVERSAS

PROPÓSITO:

Detectar por medio de frote Gram y cultivo aerobio, la presencia de bacteriasque causan infecciones con presencia de pus en la piel, ojos, oídos, tejido subcutá-neo, heridas infectadas y otros sitios anatómicos diversos. A las bacterias queprovocan la formación de pus se les llama piógenas. En este tipo de infecciones,son de especial interés los llamados “cocos piógenos gram-positivo”, que son lossiguientes:

- Staphylococcus aureus- Streptococcus pyogenes- Streptococcus pneumoniae

Menos frecuentemente pueden aislarse de este tipo de lesiones, otras bacte-rias tales como:

- Pseudomonas aeruginosa (de importancia en quemaduras infectadas)- Escherichia coli- Haemophilus influenzae- Haemophilus aegyptius (en infecciones oculares)- Neisseria gonorrhoeae- Salmonella typhi (raro)- Mycobacterium tuberculosis (raro)

MUESTRA:

La muestra deberá obtenerse según el sitio anatómico, siempre con materialestéril y antes de tratamiento con antibióticos. En la mayoría de los casos puedeusarse hisopo estéril (envuelto en papel individual, no dentro de frasco). Cuandola cantidad de pus es muy escasa, tomar la muestra con el extremo puntiagudo ydelgado de un aplicador de madera estéril que ha sido quebrado por los extremos.También puede usarse la punta de una asa espatulada flameada y fría, bisturí pe-queño (número 15), o una lanceta estéril.

138

Debe considerarse como regla general indispensable, hacer siempre un frotepara Gram, sobre un porta-objetos limpio. Es de vital importancia observar lasbacterias en el frote, especialmente cuando deben interpretarse cultivos con algunamicrobiota normal además de algún patógeno.

1. PIEL:

Si no hay apertura por donde salga el pus, escoger una lesión intacta y “ma-dura”, de preferencia con punta blanquecina. Limpiar el área de donde se tomarála muestra para frote Gram y cultivo, con algodón empapado en alcohol y exprimi-do. Limpiar bien pero con cuidado de no sacar el pus, luego con lanceta estéril obisturí pequeño, puncionar a manera de evitar que salga sangre. Si es necesario(usar guantes de hule estériles) presionar a los lados de la lesión, hacia el centro,para “exprimir” el pus hacia afuera. Tomar una pequeña gota de pus con el asaespatulada estéril, punta de aplicador de madera estéril (quebrado) o hisopo esté-ril, e inocular siempre los siguientes medios de cultivo, en este orden:

Primero: Agar sangre de carnero al 5%Segundo: Agar chocolateTercero: Agar manitol-sal (en caja de Petri)Cuarto: Agar MacConkey

Luego hacer un frote Gram delgado, sin frotar mucho sobre el porta-objetos.Los medios de cultivo deben inocularse con una asada de pus, en un extremo de lacaja. El objeto de hacerlo en el orden indicado, es evitar el acarreo de inhibidoresdel MacConkey y manitol-sal, hacia el agar sangre de carnero y el agar chocolate,que no son inhibitorios.

SIGNOS Y SÍNTOMAS

Secreción serosa o purulenta

Absceso: subcutáneo o submucoso

Eritema y edema

Crepitación (gas en tejidos)

Dolor

Ulceración y formación de fístulas

BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA

Staphylococcus aureus

Streptococcus pyogenes

Clostridium spp., Bacteroides spp. y otros anaerobios

Enterobacterias

Pseudomonas aeruginosa

Enterococos

ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE HERIDAS INFECTADAS

139

2. OJOS:

Tomar la muestra con hisopo estéril, así: bajar el párpado inferior, haciendopresión hacia abajo, a manera de exponer la conjuntiva enrojecida y purulenta (usarguantes de hule estériles). Frotar la conjuntiva al mismo tiempo que se rota el hisopohacia afuera, con mucho cuidado de no raspar el globo del ojo. Inocular agar san-gre de carnero, agar chocolate, agar manitol-sal y agar MacConkey, en ese orden.Descartar el hisopo, y con un segundo hisopo estéril, tomar más muestra. Hacer unfrote pequeño sobre un porta-objetos limpio, con cuidado de no frotar excesiva-mente.

En los cultivos oculares es muy importante incluir siempre agar chocolate,para lograr el crecimiento de las bacterias fastidiosas (difíciles de cultivar) que cau-san conjuntivitis. Si en el frote Gram se observan diplococos gram-negativo, inocu-lar un tubo de medio Thayer-Martin, selectivo para N. gonorrhoeae.

3. OÍDOS:

En los casos de otitis media, generalmente no es necesario que el médicootorrinolaringólogo puncione el tímpano (timpanocentesis). Este procedimientojamás debe practicarse por el personal del laboratorio. Proceder así: con un hisopoempapado en alcohol, y luego exprimido con papel absorbente, limpiar bien eloído externo. Introducir en el canal auditivo otro hisopo estéril, despacio y sin to-car el pabellón de la oreja, con cuidado de no llegar al tímpano. No debe habersangrado. Con el hisopo empapado en pus, inocular los siguientes medios: agarsangre de carnero, agar chocolate, agar manito-sal y agar MacConkey, en ese or-

SIGNOS Y SÍNTOMAS

Secreción conjuntival serosao purulenta

Hiperemia ocular

Dolor ocular

BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA

Haemophilus spp., especialmente H. aegyptius

Moraxella lacunata

Neisseria gonorrhoeae

Staphylococcus aureus

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pyogenes

Pseudomonas aeruginosa (reportar stat)

ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE INFECCIÓN OCULAR

140

den. Con un segundo hisopo estéril, tomar más muestra y sin frotar mucho, hacerun pequeño frote sobre porta-objetos limpio.

4. MISCELÁNEOS:

Antes de obtener la muestra, debe ponerse especial cuidado en desinfectarbien las áreas que se espera estén colonizadas por abundante microbiota. El objetode esta operación, es evitar contaminaciones innecesarias que dificultan la inter-pretación del frote Gram y el cultivo.

El material para tomar las muestras debe ser estéril. La toma de muestra debeser agresiva pero cuidadosa; un hisopo frotado descuidadamente sobre una lesiónseca y no de un sitio representativo, es completamente inútil. El sangrado debeevitarse en la medida de lo posible. Para la toma de muestras difíciles o invasivas,que representen peligro para el paciente, debe solicitarse la intervención delmicrobiólogo o del médico.

Los líquidos acuosos y de volumen grande, deben centrifugarse y luego ha-cer frote Gram y cultivo del sedimento. Inocular el medio de Thayer-Martin si sesospecha la presencia de Neisseria gonorrhoeae, y el medio de Lowenstein-Jensen sise sospecha la presencia de Mycobacterium tuberculosis. En el capítulo 17 sobreAnaerobios, se explica que tipo de muestras deben sembrarse en anaerobiosis ycomo deben procesarse.

ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE OTITIS MEDIA

SIGNOS Y SÍNTOMAS

Secreción ótica purulenta

Dolor agudo en oído y mandíbula

Cefalea pulsátil

Tímpano rojo y abultado

BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA

Agudo:

Streptococcus pneumoniae

Haemophilus influenzae

Crónico:

Pseudomonas aeruginosa

Proteus spp.

Anaerobios

141

PROCEDIMIENTO:

Teñir el frote con la coloración de Gram, según el capítulo correspondiente.Las muestras obtenidas siguiendo las instrucciones anteriores, y que fueron inocu-ladas directamente en un extremo de cada caja, deben diseminarse asépticamenteen la superficie de los medios de cultivo. Para este propósito, usar dos asas enargolla (bien rectas y con la argolla circular y cerrada). Mientras una asa se flamea,la otra se enfría en el soporte que la mantiene vertical. Según se indicó, trabajarcerca del mechero encendido y con buena luz.

Si en el frote Gram de una secreción purulenta (especialmente de piel), seobservan abundantes cocos gram-positivo, ligeramente ovalados, con tendencia aagruparse en pares o cadenas cortas y acompañados de abundantes leucocitospolimorfonucleares, inocular el agar sangre de carnero con cortadas (igual que elcultivo de garganta). Luego colocar con pinzas flameadas un disco de bacitracinade 0.04 unidades en la segunda estría, para acelerar y facilitar el aislamiento e iden-tificación de Streptococcus pyogenes.

Incubar el agar sangre de carnero y el agar chocolate a 36° C en jarro concandela encendida y humedad (papel absorbente húmedo en el fondo del jarro). Laboca del jarro, donde enrosca la tapadera, debe frotarse esporádicamente con lamisma candela, para que la cera o parafina forme un sello. Cerrar bien el jarro, yluego sellar con “masking tape”. Incubar el agar manitol-sal y MacConkeyaeróbicamente.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS E INFORME:

Es importante observar el frote lo más pronto posible, ya que en base a esteresultado se puede iniciar tratamiento preliminar. Observar los frotes Gram conaceite y el lente objetivo de inmersión. Es de gran importancia observar cual es labacteria que predomina en el frote. Informar la cantidad de bactrias observadas, lacantidad de leucocitos y de qué tipo son. En el frote, los leucocitos deben observar-se gram-negativo (rojos); si aparecen gram-positivo (morados), falta decoloracióny debe aplicarse más alcohol-acetona.

Examinar los cultivos después de 18 a 24 horas de incubación, con microsco-pio estereoscópico o lupa y buena luz. En el agar sangre buscar colonias pequeñasbeta hemolíticas; si las hay, identificar un subcultivo en agar sangre de carnero condiscos de bacitracina y trimetoprim-sulfametoxazol y prueba de CAMP. Si hay co-

142

lonias planas alfa hemolíticas (hemólisis verdosa), identificar un sub-cultivo en agarsangre de carnero con disco de optoquina para Streptococcus pneumoniae.

De diversas secreciones, pueden aislarse Enterococcus spp. alfa hemolíticos ono hemolíticos, que pertenecen al grupo D de Lancefield. Son llamados“enterococos” por su probable origen fecal, y los más importantes son: E. faecalis, E.faecium, E. durans y E. avium. Sub-cultivar a agar bilis-esculina; un color negro a las24 horas de incubación a 36° C indica hidrólisis de la esculina positiva. Debe to-marse en cuenta que esta reacción también la dan positiva E. bovis y E. equinus, queno son enterococos. Para identificar correctamente a los enterococos, debe sem-brarse en un caldo con 6.5% de cloruro de sodio y observar el crecimiento halófilo(soporta la sal), antes de 48 horas de incubación, con viraje del púrpura al amarilloy turbidez. El caldo con cloruro de sodio al 6.5%, se prepara fácilmente así:

Caldo tripticasa soya ......................................15 gramosCloruro de sodio ..............................................32.5 gramosAgua destilada .................................................50 ml

Servir 6 ml en tubos con tapón de rosca, esterilizar en autoclave a 121° C por15 minutos.

Enterococcus spp. son cocos gram positivo, catalasa-negativo, se agrupan enpares y cadenas (no en racimos o tétrodos), y son halófilos (turbidez en el caldo con6.5% de cloruro de sodio).

Si se observa crecimiento de colonias grandes (más de 1 mm de diámetro),blancas o amarillentas (tanto en el agar sangre de carnero como en el manitol-sal),identificar a Staphylococcus aureus por medio de la prueba de coagulasa. Colocar enporta-objetos o caja de Petri, una gota de plasma humano citratado (del que se usapara tiempo de protrombina). Suspender allí una asada pequeña del cultivo enagar sangre de carnero. Si se observa franca aglutinación, la prueba de coagulasa espositiva; reportar: Se aisló Staphylococcus aureus, y efectuar la prueba de susceptibi-lidad. Si la prueba de coagulasa en lámina es dudosa, pero hay coloración amarillaalrededor de las colonias en el agar manitol-sal (acidificado por la fermentación delmanitol), debe efectuarse la prueba en tubo. Proceder así: en un pequeño tubo dehemólisis, medir 0.5 ml de plasma citratado, suspender allí una asada del cultivoen agar sangre, incubar de 4 a 24 horas a 36° C. Un coágulo bien formado indicaprueba positiva de coagulasa en tubo. Observar la presencia de coágulo a las 4horas de incubación a 36° C; si no lo hay, reincubar a temperatura ambiente, paraevitar la lisis del coágulo por la enzima estreptokinasa. La prueba de coagulasa en

143

tubo es más sensible y confiable, pero si la reacción da positiva en lámina es sufi-ciente para identificar a Stapylococcus aureus, pues hay aproximadamente 96 porciento de correlación.

Si la prueba de coagulasa es negativa, y la fermenteción del manitol tambiénes negativa (colonias rosadas en manitol-sal), puede reportarse presuntivamenteStaphylococcus epidermidis o Staphylococcus coagulasa-negativo. Hacer el reporte deesta bacteria con prudencia, ya que en la gran mayoría de los casos no causa infec-ción, pero se aisla con frecuencia pues es miembro importante de la microbiota dela piel. Si la coagulasa es negativa y la fermentación del manitol positiva, puedetratarse de Staphylococcus saprophyticus, hacer susceptibilidad a un disco connovobiocina, que debe presentar inhibición. Si es necesario, hacer pruebas adicio-nales según la tabla a continuación. En caso de cocos gram-positivo con agrupa-ción en pares, paquetes o grupos de cuatro bacterias, descartar Micrococcus sp. porla prueba de OF-glucosa, es oxidativo.

Si hay duda entre los géneros Staphylococcus y Streptococcus, hacer la pruebade catalasa, que es positiva en el caso de los estafilococos y negativa en losestreptococos.

El género Haemophilus está formado por cocobacilos gram-negativopleomórficos, que requieren el enriquecimiento de los medios de cultivo con san-gre, para poder desarrollarse. Esto se debe a que como su nombre lo indica, requie-ren de varios factores sanguíneos para su nutrición y reproducción. La mayor partede los aislamientos clínicos de este género de bacterias, puede identificarse hasta

PRINCIPALES PRUEBAS PARA LA DIFERENCIACIÓN DE TRESESPECIES DEL GÉNERO Staphylococcus DE ORIGEN HUMANO*

S. aureus

+

+

+

-

+

+

S. saprophyticus

-

+/-

-

+

-

-

PRUEBA

Coagulasa

Fermentación del manitol(producción de ácido)

DNAsa

Resistencia a novobiocina

Crecimiento en anaerobiosis

Hemólisis

S. epidermidis

-

-

-

-

+

-

* Tomado de: Isada, C.M. et al.: Infectious Diseases Handbook, 1995-96.

144

género por medio de la prueba de satelitismo; la diferenciación hasta especie re-quiere de pruebas más complejas. El crecimiento de Haemophilus spp. se logra enagar chocolate incubado en jarro con candela, pues son microorganismosmicroaerofílicos. Crece solamente en agar chocolate, y no en agar sangre, pues en elprimero los factores de crecimiento se encuentran libres en el medio, y no dentro delos eritrocitos.

Hacer la identificación de Haemophilus sp. por medio de la prueba desatelitismo, así:

1. En agar chocolate se observan colonias muy pequeñas, puntiformes, demenos de un milímetro de diámetro, translúcidas y ligeramente mucosas.Hacer un frote Gram a estas pequeñas colonias, con cuidado de tomarsólo de ellas; predominan cocobacilos gram-negativo pequeños, casiesféricos y escasos bacilos largos y filamentosos (pleomorfismo).

2. Tomar una asada del crecimiento en agar chocolate y estriarla en el cen-tro de una caja de agar sangre de carnero al 5%, sólo en una dirección.

3. En sentido perpendicular a la estría efectuada, hacer una estría deStaphylococcus aureus, recta y a lo largo de toda la caja. Esta cepa purapuede provenir de otro cultivo, o de preferencia tener una cepa típicade S. aureus, en cualquier agar inclinado en tubo, conservada enrefrigeración.

4. Incubar el agar sangre de 24 a 48 horas a 36° C en jarro húmedo concandela. Una prueba positiva de satelitismo consiste en el crecimientode las pequeñas colonias del Haemophilus sólo muy cerca de la estría deS. aureus. Hacer frote Gram a este crecimiento satélite para confirmar lamorfología.

Si en el cultivo original también hay colonias de Staphylococcus sp.,enterobacterias o algunas otras bacterias, puede observarse el satelitismo natural.Este consiste en el crecimiento de las pequeñas colonias puntiformes de Haemophilusalrededor de colonias grandes. Este fenómeno se aprecia bien con el microscopioestereoscópico o lupa al efectuar la interpretación.

145

Con fines prácticos, es aceptable el reporte de los aislamientos con satelitismopositivo así:

- Cultivo de ojos, reportar: Se aisló Haemophilus aegyptius.- Cultivo de cualquier otra secreción: Se aisló Haemophilus influenzae.

Hacer susceptibilidad en agar chocolate. Diseminar sobre toda la superficiede la caja varias asadas del crecimiento en el agar chocolate original, o de coloniassatélites, con mucho cuidado de no tocar la estría de S. aureus.

Las enterobacterias aisladas de cualquier secreción en cantidad considerable,deben identificarse con medios diferenciales (TSI, LIA, MIO, urea y citrato), o depreferencia con el método API (Bio Merièux). Bacilos gram-negativo no fermen-tadores pueden eventualmente aislarse de secreciones; efectuarles antibiograma ysi es posible identificarlos.

147

CAPÍTULO 13

SECRECIONES GENITALES

PROPÓSITO:

Demostrar la presencia de microorganismos de varios tipos que infectan losórganos genitales femeninos y masculinos, en especial los siguientes:

- Neisseria gonorrhoeae Bacteria, causante de la gonorrea.- Treponema pallidum Bacteria, causante de la sífilis.- Gardnerella vaginalis Bacteria, bacilo gram-negativo causante de

vaginosis.- Candida albicans Hongo levaduriforme, causante de vulvo-

vaginitis.- Trichomonas vaginalis Protozoo, causante de tricomoniasis vaginal.

DIAGNÓSTICO DE GONORREA

Muestra:

La gonorrea es una enferme-dad de transmisión sexual que enel hombre generalmente causa elaparecimiento de pus cremoso,amarillento o verdoso que sale dela punta del pene. En la mujer,este síntoma puede no serevidente, lo que hace más difícilel diagnóstico.

El agente causal de lagonorrea es la bacteria Neisseriagonorrhoeae un diplococo gram-ne-gativo (rojo). Las neiserias presen-tan forma arriñonada y se agrupanen pares que semejan granos decafé. El diagnóstico de laboratoriode la gonorrea consiste en la obser-

Neisseria gonorrhoeae, froteGram de pus uretral masculino.

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vación de la morfología típica de la bacteria en frotes Gram de pus uretral (sólo enel hombre, no así en la mujer), y en el cultivo de la bacteria Neisseria gonorrhoeae.Puede aislarse de descargas uretrales, vaginales e hisopos rectales; rara vez se ais-lan de heces, sangre, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, etc. Los niños quenacen de madres con gonorrea, se infectan con la bacteria al pasar por el canalvaginal durante el parto y generalmente presentan conjuntivitis purulenta. En elpus de los ojos de estos niños puede observarse y cultivarse la bacteria.

La toma de la muestra es diferente en el hombre y en la mujer. Obtener lamuestra antes de tratamiento, así:

Hombres:

1- Tener listo el siguiente material: hisopos estériles, porta-objetos limpios,una caja de agar sangre y una caja o botellita de medio Thayer-Martin.

2- Pedir al paciente que se ponga de pie y con ambas manos “exprimir” elpene hacia adelante, a manera de forzar a salir el pus de la uretra.

3- Con hisopo estéril de madera (quebrado) o palillo de dientes, tomaruna gota del pus, tratando de no tocar la piel.

4- Preparar cuidadosamente un frote delgado sobre porta-objetos devidrio limpio, haciendo rodar el palillo o hisopo sobre la lámina,no frotar. El propósito de preparar el frote con estas precaucioneses no romper los leucocitos presentes ni alterar la posición de lasbacterias.

5- Tomar una gota de pus con la punta de algodón de un hisopo estéril.Inmediatamente inocular la caja o botellita de Thayer-Martin; en bote-llitas frotar el hisopo en la superficie del medio desde el fondo. Simultá-neamente sembrar una caja de agar sangre de carnero, para aislar otrospatógenos. Transportar las muestras rápidamente al laboratorio.

Mujeres:

1- Idealmente la muestra debe obtenerse por el ginecólogo, con la pacienteacostada en posición y en cama ginecológicas, usando espéculo paraseparar las paredes vaginales y observar el cuello uterino. Tener listo elmismo material que para la toma de muestra masculina.

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2- Con la punta de algodón de un hisopo estéril tomar pus de donde selocalice (usar buena luz), es decir del cuello uterino, vagina o uretra.Preparar un frote para Gram haciendo rodar el hisopo sobre un porta-objetos de vidrio.

3- Tomar más pus con otro hisopo estéril, e inocular una caja o botellita deThayer-Martin, y una caja de agar sangre de carnero.

Procedimiento:

1- Colorear los frotes con Gram según la técnica ya explicada.

2- Con asas flameadas y frías, diseminar por estrías el inóculo sobre todala superficie de cajas o botellitas.

3- Incubar tanto el agar sangre como el Thayer-Martin de 24 a 48 horas a36° C en jarro húmedo con candela encendida. Si el Thayer-Martin estáen botellitas, tomar la precaución de dejarlas semi-abiertas, nunca biencerradas.

Interpretación de resultados:

Gram: buscar diplococos adosados en forma de granos de café y gram-ne-gativo (rojos). Anotar si se encuentran adentro de los leucocitos polimorfonucleares(intracelulares), o libres fuera de estas células (extracelulares). En el pus uretralmasculino, la presencia de estas bacterias típicas indica gonorrea. Reportar la can-tidad y clase de leucocitos observados. En los frotes masculinos, los diplococosgram-negativo intracelulares se asocian a gonorrea aguda; extacelulares se asociana gonorrea crónica. El frote Gram endocervical es de diagnóstico limitado ycorrelaciona con el cultivo en Thayer-Martin en 65 por ciento de los casos.

En el caso de las mujeres por lo general la imagen microscópica no es típica yse observan muchas clases de bacterias, tanto gram-positivo como gram-negati-vo, de la abundante microbiota normal de la vagina. Algunas bacterias de estamicrobiota pueden ser idénticas a Neisseria gonorrhoeae . Por estas razones el diag-nóstico de gonorrea femenina se basa en el cultivo y no en el frote Gram.

Cultivo:

Después de 24 a 48 horas de incubación a 36° C en jarro con candela, exami-

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nar el Thayer-Martin con buena luz. Debido a que el Thayer-Martin contiene sus-tancias enriquecedoras que favorecen el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae, y sus-tancias inhibidoras de otras bacterias, por lo general sólo crece este microorganismoen cultivo puro. N. gonorrhoeae presenta colonias pequeñas (menos de 1 mm dediámetro), translúcidas, brillantes y de bordes lisos.

Hacer una coloración de Gram de las pequeñas colonias en Thayer-Martin,suspenderlas en una pequeña gota de agua destilada o solución salina fijar concalor y luego colorear. Si se observan diplococos gram-negativo, el cultivo es muysospechoso de N. gonorrhoeae y debe efectuarse la prueba de oxidasa. Esta pruebademuestra la presencia de la enzima indofenol-oxidasa, que da al reactivo(dihidrocloruro de tetrametil-p-fenilendiamina al 1% en agua, 0.1 g en 10 ml deagua) un color morado o negro.

La prueba de oxidasa puede efectuarse aplicando directamente el reactivolíquido al cultivo o sobre discos de papel filtro ya impregnados con el reactivo.Para efectuar la prueba en discos de papel, proceder así: con pinzas flameadas,colocar un disco de oxidasa en una caja de Petri vacía. Humedecerlo con una gotade solución salina. Con el asa calibrada de platino o palillo de dientes de maderatomar una o dos colonias típicas frotar este crecimiento sobre el disco húmedo. Siaparece una coloración morado-negruzco antes de 10 segundos en la parte del dis-co donde se frotaron las colonias, la prueba es positiva. Esta prueba debeinterpretarse antes de 10 segundos, pues el oxígeno del aire puede ocasionar falsospositivos. Nunca usar el asa corriente en esta prueba, pues el alambre con hierro onichrome causa por sí solo una reacción positiva.

Efectuar la prueba con el reactivo líquido así: aplicar unas gotas del reactivorecién preparado directamente sobre la caja de Thayer-Martin, si las colonias to-man rápidamente un color rosado, luego morado y luego negro, la prueba es posi-tiva. Si se observa este viraje en el color de las colonias, o la prueba en disco espositiva, sub-cultivar inmediatamente una colonia típica sin reactivo, o una colo-nia al empezar a cambiar de color a una caja de agar chocolate. Incubar 24 horasa 36°C en jarro húmedo con candela. Después de incubar, hacer frote Gram alcrecimiento en agar chocolate, que debe presentar diplococos arriñonados gram-negativo.

Identificar la especie N. gonorrhoeae por medio de la prueba de oxidación delos tres azúcares: maltosa, glucosa y sacarosa (sucrosa) en el medio base de CTA(cistina-tripticasa agar). El medio CTA es un medio semi-sólido; al medio base es-téril se le adiciona el carbohidrato en solución acuosa (esterilizado por filtración)

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hasta una concentración de 1%. Debe prepararse en tubos 13 X 100 con tapón derosca, inocular los tres tubos de maltosa, glucosa y sacarosa con dos asadas biencargadas por tubo. Depositar el crecimiento masivo sólo unos pocos milímetrospor debajo de la superficie del medio. Cerrar bien apretado el tapón de rosca eincubar de 48 a 72 horas a 37° C. Una coloración amarilla en la superficie del medioindica reacción positiva. Interpretar resultados según esta tabla:

Diferenciación de dos especies de Neisseriade importancia clínica

Especie Glucosa Maltosa Sacarosa

Neisseria gonorrhoeae + - -

Neisseria meningitidis* + + -

* Ver capítulo 14

Las pruebas de CTA frecuentemente dan resultados dudosos, tienen la des-ventaja que para preparar los medios en tubo se requiere esterilizar por filtración lasolución del carbohidrato que debe ser muy puro. Es adecuado usar por lo menossólo el tubo con maltosa, que diferencia bien las dos especies.

En términos generales y según las características del trabajo bacteriológico ennuestro medio, se considera adecuado reportar (aunque sea presuntivamente) comoNeisseria gonorrhoeae a aquellos aislamientos de secreciones genitales con morfologíatípica de Neisseria, oxidasa positivo y un frote Gram de la secreción que indique lapresencia de esta bacteria. Efectuar la prueba de susceptibilidad inoculando masi-vamente la bacteria en cultivo puro, en la superficie de una caja de agar chocolate(base Mueller-Hinton caliente + 5% sangre de carnero).

Informe:

Tomando en cuenta los procedimientos y comentarios anteriores, si se está se-guro aunque sea presuntivamente, reportar la presencia de N. gonorrhoeae. Debe to-marse en cuenta que un reporte de este tipo implica que el o la paciente contrajeronuna infección por contacto sexual. Un error del laboratorio puede por lo tanto cau-sar serios problemas conyugales o dejar a un paciente infectado sin tratamiento.

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DIAGNÓSTICO DE CHANCRO BLANDO (CHANCROIDE)

Muestra y Procedimiento:

El chancro blando o chancroide es una infección de transmisión sexual causa-da por una bacteria fastidiosa (difícil de cultivar) llamada Haemophilus ducreyi. Esun bacilo pequeño gram-negativo, que en frotes de lesiones genitales o cultivos sepresenta formando cadenas de 5 a 20 bacilos, paralelas entre sí o entrelazadas,por lo que se ha descrito esta agrupación característica como “cardúmenes depeces” o “huella digital”.

Las lesiones en los genitales son generalmente úlceras bien circunscritas do-lorosas con base necrótica y bordes socavados y blandos. De estas características sederiva el nombre de chancro blando o chancroide (similar al chancro sifilítico típi-co). Las lesiones rara vez son más grandes de 2 cm de diámetro, pueden haberlesiones múltiples por autoinoculación y en más de la mitad de los casos, los gangliosde la ingle están endurecidos.

El diagnóstico del chancro blando se basa en las características clínicas y en elfrote Gram directo de la lesión .

Para efectuar el diagnóstico de laboratorio del chancro blando, proceder así:

Frotar un hisopo estéril en los bordes y el fondo de la lesión y luegorodarlo cuidadosamente sobre un porta-objetos bien limpio, sólo en unadirección para no destruir la agrupación característica de la bacteria.Dejar secar, fijar con calor y colorear con Gram.

Interpretación de Resultados e Informe:

Observar cuidadosamente el frote Gram del material de la lesión con ellente de inmersión y aceite. Buscar bacilos gram-negativo agrupados encadenas largas, paralelas o entrelazadas (“cardúmen de peces”), los cua-les deben predominar sobre otras formas de bacterias. Si se observa estamorfología típica reportar inmediatamente así: Se observan (escasos, re-gular cantidad o abundantes) bacilos gram-negativo, agrupados en ca-denas largas (o cortas según el caso) de morfología compatible conHaemophilus ducreyi. Esta morfología se considera presuntivamentediagnóstica de chancro blando.

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DIAGNÓSTICO DIRECTO DE LA SIFILIS

La sífilis es una enfermedad quese transmite por contacto sexual. Escausada por Treponema pallidum, unabacteria del grupo de las espiro-quetas, con forma alargada, enrolla-da a manera de “tirabuzón” y muymóvil. T. pallidum no se puede colo-rear con Gram ni cultivar in vitro, porestas razones es indispensable utili-zar técnicas especiales para demos-trar su presencia. Generalmente ladetección de anticuerpos ines-pecíficos o “reaginas”, por la pruebade V.D.R.L. (Venereal DiseasesResearch Laboratory) y la detecciónde anticuerpos específicos contra estabacteria por FTA-ABS (FluorescentTreponemal Antibodies-Absorbed),establecen el diagnóstico de sífilis. Sinembargo, debe transcurrir algúntiempo después del contagio para quelas pruebas serológicas se positivicen.

En la mayoría de los casos de sífilis primaria aparece una lesión típica en losórganos genitales, llamada “chancro”. El chancro se caracteriza por ser una úlcerano purulenta, generalmente de forma redondeada y de bordes duros. Es una le-sión muy infectiva que contiene muchas espiroquetas, por lo que debe manipularsecon guantes.

Debido a que T. pallidum es una bacteria muy delgada y que no toma los colo-rantes de Gram, su presencia debe demostrarse por observación microscópica enfresco con condensador de campo oscuro. Es muy importante que el paciente nohaya recibido tratamiento con antibióticos especialmente penicilina, que hace des-aparecer rápidamente los treponemas de las lesiones. Para el examen se procedeasí:

1- Tener listo el siguiente material: guantes de hule estériles, gotero consolución salina, tubos capilares no heparinizados, bulbo de hule peque-

Treponema pallidum,campo oscuro de chancro.

154

ño para tubos capilares (de los que vienen en kits de serología), porta-objetos, cubre-objetos, solución salina estéril en frasco, gasa estéril y al-godón con alcohol.

2- Es imprescindible examinar bien al paciente en un cubículo privado conbuena luz para localizar bien el chancro más típico. Usar los guantespuestos para este procedimiento, limpiar suavemente la superficie delchancro con gasa estéril seca para causar ligera abrasión. Si hay costralevantarla con cuidado.

3- Llenar un tubo capilar, aproximadamente un centímetro con soluciónsalina estéril, dejarle puesto el bulbito de hule y tomarlo con la manoderecha.

4- Con la mano izquierda, tomar la lesión entre los dedos pulgar e índice ypresionar fuertemente hasta que brote del fondo de la lesión un líquidotranslúcido. Este procedimiento es doloroso para el paciente, pero debesoportar el dolor sin anestesia.

5- Causar leve abrasión con el tubo capilar sin causar sangramiento, rápi-damente dejar caer en el centro de la lesión una gota de solución salinadel tubo capilar, succionarla. Gotearla de nuevo en la lesión, dos o tresveces más. Debe usarse lo menos posible de solución salina para no di-luir la muestra, que debe ser un líquido lechoso ligeramente hemorrágicoque queda dentro del tubo capilar. Puede usarse pipeta Pasteur o asaestéril si se considera más fácil de manejar.

6- Colocar con cuidado una gota de la muestra así obtenida en un porta-objetos limpio, cubrir con cubre-objetos a manera de no dejar burbujasen la preparación en fresco.

7- Descartar el tubo capilar en un lugar adecuado, tomando en cuenta quees material muy infectivo. Limpiar el bulbito de hule con algodón y al-cohol, lo mismo que los guantes antes de quitárselos.

8- Transportar la muestra con su respectiva solicitud de laboratorio lo máspronto posible, y examinarla inmediatamente con campo oscuro. Nodebe retrasarse la observación porque las espiroquetas pierden su mo-vilidad típica.

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9- Cambiar el condensador de campo claro corriente que se usa en el mi-croscopio, por un condensador especial para campo oscuro. Bajar elcondensador de campo oscuro y colocarle dos gotas de aceite deinmersión de buena calidad, de manera que no queden burbujas de aire.Colocar la muestra en la platina con el cubre-objetos hacia arriba. Subirlentamente el condensador hasta que el lente pegue con el aceite por de-bajo de la lámina (que no queden burbujas). Aumentar la intensidad dela luz del microscopio al máximo, luego enfocar la muestra con secodébil; subir y bajar lentamente el condensador hasta que se obtenga elmáximo de contraste, es decir los objetos más brillantes y el campo másoscuro.

10- Cambiar al lente seco fuerte (de preferencia con diafragma) y enfocar denuevo con el tornillo micrométrico y la altura del condensador. Una vezclaramente enfocado, buscar detenidamente bacterias (ver foto y figura12) con las siguientes características:

a) Tamaño ligeramente mayor al diámetro promedio de un eritrocito(8 micras).

b) Muy finas alargadas y en forma de espiroquetas (como saca-cor-chos).

c) Espiras regulares que no desaparecen al moverse.d) De 8 a 14 espiras en cada bacteria.e) Movimiento rápido de flexión en el centro y rotación sobre su eje

mayor (en la mayoría de las muestras).f) Movimiento activo hacia adelante y hacia atrás (especialmente en

muestras de chancros bien desarrollados con abundante materialmucoide y viscoso).

11- Dependiendo del estadío de la lesión, puede observarse de un sólomicroorganismo en 20 campos hasta 50 por campo.

12- El procedimiento de campo oscuro también sirve para observar T.pallidum de lesiones en piel de pacientes con sífilis secundaria. Para to-mar la muestra forrar ambas ramas de una pinza con tubo de hule. “Mor-der” la lesión firmemente a manera de forzar la salida de líquido trans-parente el cual se observa en campo obscuro según el procedimientodescrito.

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Interpretación de resultados e informe:

Debe tomarse en cuenta que espiroquetas de idéntica morfología forman par-te de la microbiota de los genitales y la boca, por lo que son indiferenciables ypueden causar falsos positivos. Este factor debe ser tomado en cuenta por el médi-co e interpretarse según la sintomatología del paciente, no es responsabilidad dellaboratorio que debe reportar lo observado.

Si la observación en campo obscuro coincide con la mayoría de las caracterís-ticas descritas en el punto 10 anterior, reportar así:

Campo oscuro: POSITIVO, se observan (escasas, regulares, abundantes)espiroquetas de morfología compatible con Treponema pallidum.

En caso que sólo se observen leucocitos y eritrocitos escasos, pero noespiroquetas, reportar así:

Campo oscuro: NEGATIVO, no se observan espiroquetas.

Los treponemas son bacterias muy delgadas y por lo tanto difíciles de colo-rear. Antiguamente se utilizaban coloraciones por impregnación con sales de platapara observarlos, con malos resultados. Ninguno de los tratados modernos revisa-dos para la preparación del presente manual menciona este tipo de coloraciones,que han caído en desuso. Puede utilizarse el condensador de contraste de fases,pero los treponemas se observan menos obvios que con campo oscuro. Si no secuenta con microscopio con campo oscuro, remitir al paciente a una unidad que sícuente con esta facilidad.

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AGENTES INFECCIOSOS DEL TRACTO GENITAL FEMENINO

Gerardo Arroyo, QB, CMIAC, MSc.Director de la Escuela de Química BiológicaFacultad de Ciencias Químicas y Farmacia

Universidad de San Carlos de Guatemala

INTRODUCCION

Los procesos infecciosos del tracto genital femenino (TGF) son el moti-vo de consulta más frecuente en las clínicas de Ginecología. Se manifiestanclínicamente por la presencia de flujo vaginal, prurito, eritema, dispareunia osangrado anormal (menorragia o metrorragia). Las infecciones del TGF sonimportantes además de las molestias que causan a la paciente, por las poten-ciales complicaciones al diseminarse a otros órganos como el útero o las trom-pas de Falopio y porque representan también un riesgo para el feto en lamujer embarazada.

Según el área anatómica afectada por los procesos infecciosos, éstos pue-den clasificarse como vaginitis, vulvovaginitis, cervicitis, endometritis,salpingitis, enfermedad pélvica inflamatoria (EPI) o abcesos tubo-ováricos.Esta clasificación brinda las bases para el manejo clínico y también orientasobre la etiología, epidemiología y tratamiento de los mismos. Es tambiénimportante mencionar, que durante las diferentes etapas fisiológicas de lavida de la mujer (niñez, edad reproductiva, postparto o postmenopausia), sepresentan con mayor o menor frecuencia algún tipo de microorganismos enparticular.

VAGINITIS

La etiología de la vaginitis depende de la edad y de la etapa fisiológicade la paciente, por lo que debe dividirse en vaginitis en niñas premenárquicas,vaginitis en la mujer en edad reproductiva y vaginitis en la mujerpostmenopáusica. Los síntomas y signos clínicos de la vaginitis incluyenflujo vaginal, prurito, eritema de la mucosa vaginal y exocervical y sangradoanormal. Estas manifestaciones son interpretadas de diversas maneras porlas pacientes que pueden aceptar condiciones patológicas como normales, o

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viceversa. Por este motivo, es importante establecer criterios objetivos quepermiten determinar cuando se encuentra presente un proceso infeccioso ycuando son situaciones fisiológicas. La vaginitis es definida objetivamentecuando se encuentran trastornos cualitativos o cuantitativos en el flujo vaginaly/o síntomas asociados a la presencia de microorganismos patógenos. Loscambios cualitativos incluyen aumento del pH por arriba de 4.5, prueba deamina positiva y presencia de células clave.

1. Vaginitis en niñas premenárquicas

La vagina de las niñas después de 30 días de nacidas, es susceptible deinfectarse con Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis, así como por otrosmicroorganismos como Streptococcus spp. y enterobacterias. Las infeccionespor Candida spp. son sumamente raras en niñas antes de la pubertad. Elorigen de las infecciones gonocócicas y clamidiales en niñas, es el abuso sexual;y por el contrario, las infecciones por estreptococos y enterobacterias son porcontaminación ano-vaginal.

Existen procesos inflamatorios no infecciosos que se diagnostican conmayor frecuencia en niñas e incluyen vaginitis a cuerpo extraño, vaginitisatrófica, (asociada muchas veces a mala higiene perianal), así como ciertonúmero de casos de vaginitis por Enterobius vermicularis.

2. Vaginitis en la mujer de edad reproductiva

Durante los años de la vida reproductiva de la mujer, la vaginitis sepresenta con una frecuencia de hasta 40% en embarazadas, 25% en mujeresde clínicas de planificación familiar y 18% en adolescentes. Más del 80% delos casos de vaginitis infecciosa son causadas por Trichomonas vaginalis(protozoo), Candida spp. (hongo) y la llamada vaginosis bacteriana (VB). Ade-más de estos microorganismos, también pueden aislarse estreptococos,estafilococos y enterobacterias. Otras etiologías incluyen la vaginitis ulcerativaque acompaña al Síndrome de Choque Tóxico, vaginitis asociada al uso detampones, vaginitis por cuerpos extraños, vaginitis alergica al Nonoxinol-9(espermicida) y otros tipos de vaginitis idiopática.

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3. Vaginitis en mujeres postmenopáusicas

Durante la etapa postmenopáusica, el epitelio atrófico es susceptible deinflamaciones que tienen su origen principalmente en la falta de maduraciónepitelial por ausencia de estímulo estrogénico. La más común e importanteen este grupo de pacientes es la vaginitis atrófica, la cual es en la mayoría delos casos no infecciosa y responde satisfactoriamente al tratamiento local osistémico con estrógenos.

A. Tricomoniasis

La tricomoniasis es una enfermedad de transmisión sexual, que se pre-senta clínicamente con flujo vaginal profuso, de color amarillo-verdoso, a vecesespumoso, de mal olor, acompañado de prurito, y eritema de la vagina yexocérvix. El eritema del exocérvix ha sido descrito como “cuello en fresa”.El pH del flujo vaginal es arriba de 5.0, la prueba de amina es generalmentepositiva y al examen en fresco es posible observar Tropozoitos móviles deTrichomonas vaginalis, con un alto grado de sensibilidad y especificidad.

La tricomoniasis ha sido identificada en 10.3% de mujeres embaraza-das, 7.3% de mujeres en clínicas de planificación familiar y en 8.5% de muje-res adolescentes (12 a 18 años).

B. Candidosis vulvovaginal

La candidiasis vulvovaginal, generalmente causada por Candida albicans,puede transmitirse sexualmente, la mayoría de los casos se deben a contami-nación ano-vaginal. Clínicamente se presenta con prurito, irritación vulvar yun flujo espeso de color blanco espeso que semeja leche cortada y que se ad-hiere a las paredes vaginales. El pH es muy parecido al normal o menor y lareacción de amina es negativa. El examen en fresco revela la presencia delevaduras, micelio y pseudomicelio asociado a variable cantidad de leucocitospolimorfonucleares.

En diferentes grupos de mujeres guatemaltecas se ha reportado una fre-cuencia de 12.6% en embarazadas, 5.3% en pacientes de planificación familiary 6.8% en adolescentes.

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C. Vaginosis bacteriana

La VB es el tipo más frecuente de vaginitis infecciosa. Se ha reportadoen 20.1% de mujeres embarazadas, 13.5% de pacientes en planificación fami-liar y en 1.7% de adolescentes. Esta enfermedad ha recibido diversos nom-bres, entre ellos vaginitis inespecífica, vaginitis por Gardnerella y vaginosisinespecífica entre otros, de los cuales el término VB es quizás el más apropia-do en vista de que el epitelio escamoso no muestra generalmente infiltraciónleucocitaria. La VB se define como el sobrecrecimiento de otras bacterias so-bre la microbiota normal de bacilos de Döderlein. Entre las bacterias que hansido aisladas de casos de VB se encuentran Gardnerella vaginalis, Bacteroidesspp., Eubacterium lentum, Peptococcus spp., Peptostreptococcus spp., Mycoplasmahominis, Mobiluncus curtisii y Mobiluncus mulieri.

La presentación clínica incluye secreción vaginal acuosa homogénea, decolor blanco grisáceo que se adhiere a las paredes vaginales, con mal olor. ElpH del flujo vaginal es generalmente mayor de 5.0, la reacción de amina espositiva y es característica la presencia de células clave. El frote Gram revelala ausencia de bacilos de Döderlein (gram-positivo) y abundantes bacilospleomórficos gram-negativo. Los frotes Gram son de utilidad cuando se in-terpretan como presencia de microbiota normal, microbiota mixta o com-patibles con VB. El diagnóstico de esta condición se establece cuando se en-cuentran presentes tres criterios de los antes mencionados, incluyendo entreellos la presentación clínica característica. Los cultivos in vitro no son útilespara el diagnóstico, en vista de que es posible aislar la mayoría de losmicroorganismos mencionados en pacientes sanas.

CERVICITIS

La cervicitis es la inflamación del canal endocervical y las glándulasendocervicales y en la mayoría de los casos, los síntomas son vagos einespecíficos. Los agentes infecciosos más importantes son Neisseria gonorrhoeaey Chlamydia trachomatis. Además de estos microorganismos son importantesel virus Herpes simplex y por extensión de los procesos infecciosos vaginales,Trichomonas vaginalis y Candida albicans.

En nuestro medio se ha reportado cervicitis en un 10.6% de mujeres em-barazadas (gonorrea=0.7% y clamidia=5.3%), 9.2% de pacientes en clínicas

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de planificación familiar (gonorrea=0.3% y clamidia=7.0%) y en 9.0% de lasadolescentes (gonorrea=1.7% y clamidia=6.8%).

El diagnóstico clínico de cervicitis no es posible en muchos casos puesademás de que los síntomas no son siempre característicos, los signos pue-den confundirse con otras condiciones. Por esta razón es importante hacerénfasis en los aspectos objetivos que correlacionan mejor con el diagnósticode cervicitis. Entre ellos se encuentra la observación de muco-pus proceden-te del canal endocervical. Esto se efectúa por medio de la prueba del hisopoendocervical, la cual se basa en que al retirarlo del canal muestra coloraciónamarilla, verde o roja que indica muco-pus o friabilidad de la mucosa, y lapresencia de más de 10 leucocitos polimorfonucleares por campo de 40X.

El diagnóstico etiológico debe buscar la presencia de N. gonorrhoeae y C.trachomatis. El diagnóstico microbiológico de clamidia se basa en la detecciónde antígenos del microorganismo mediante técnicas de ELISA o pruebas rá-pidas. Las técnicas citológicas que utilizan Papanicolaou o Giemsa para iden-tificar células con inclusiones, han demostrado muy baja sensibilidad aunqueuna especificidad aceptable, por lo que no deben utilizarse para diagnóstico.

OTROS AGENTES ETIOLÓGICOS

Mycobacterium tuberculosis endometritis, salpingitis

Actinomyces spp. y Arachnia sp. colonización uterina en pacientes

Entamoeba gingivalis (protozoo) con dispositivos intrauterinos

Entamoeba histolytica (protozoo) vaginitis, cervicitis

Enterebius vermicularis (helminto) vaginitis en niñas

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CAPÍTULO 14

LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO YFLUIDOS CORPORALES

PROPÓSITO:

Demostrar por medio de bacterioscopía con Gram y cultivo, la presencia debacterias en estas muestras, que normalmente deben ser estériles. Las bacterias quetienen mayor importancia en el líquido cefalorraquídeo son:

Gram negativo:- Neisseria meningitidis (causa meningitis meningocócica severa)- Haemophilus influenzae (especialmente en niños de 6 meses a 4 años de

edad)- Escherichia coli y otras enterobacterias (en pacientes debilitados, neonatos

y post-craneotomía)- Pseudomonas aeruginosa

Gram-positivo:- Streptococcus pneumoniae (muy importante)- Staphylococcus aureus- Streptococcus sp. (grupos B y D en neonatos)- Streptococcus pyogenes- Listeria monocytogenes (raro)

Otros microorganismos importantes:- Mycobacterium tuberculosis, Leptospira interrogans y Treponema pallidum

(bacterias).- Cryptococcus neoformans y Candida albicans (hongos levaduriformes)- V arios virus (enterovirus, paperas y otros).

MUESTRA:

Las muestras incluidas en los fluidos corporales son:

Líquido cefalorraquídeo (conocido también como fluido espinal o LCR)

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Líquido ventricular (líquido cisternal, líquido craneal)Fluido abdominal (líquido peritoneal o aseíbico, líquido de parasentesis, lí-quido de diálisis, bilis)Líquido pleural, torasentesis y empiema (obtenido del tórax)Líquido pericárdicoLíquido sinovialMédula ósea, sangre (ver capítulo de hemocultivo y mielocultivo)

Por lo general estas muestras son obtenidas por el médico que solicita su aná-lisis. Deben obtenerse antes de iniciar tratamiento con antibióticos y las debe colec-tar en recipientes estériles proporcionados por el laboratorio.

Las muestras deben transportarse inmediatamente al laboratorio y ser proce-sadas inmediatamente no después de 30 minutos de recolectadas. Rotular con elnombre del paciente, número de registro, fecha y naturaleza de la muestra. Si elmédico sospecha que la muestra puede contener bacilos alcohol-ácido resistentesdebe hacerlo saber en su solicitud al laboratorio.

Los síntomas de irritación de las meninges (membranas que cubren el cerebroy la médula espinal), que puede ser causada por microorganismos son: fiebre, do-lor de cabeza, vómitos, rigidez y dolor de nuca, reflejos aumentados, estupor acoma y petequias en la piel. En los niños estos síntomas son vagos e inespecíficos,por esta razón sólo los resultados del laboratorio pueden establecer el diagnóstico.En caso de meningitis bacteriana, el líquido cefalorraquídeo (LCR) generalmentees purulento (turbio), con abundantes leucocitos (generalmente más de 1,000 pormilímetro cúbico), con predominio de neutrófilos polimorfonucleares y glucosadisminuida (consumida por las bacterias). En la meningitis tuberculosa, general-mente el LCR es límpido y su glucosa normal.

ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE INFECCIÓN ÓSEA Y ARTICULACIONES

SIGNOS Y SÍNTOMAS

Edema articular

Eritema y calor

Dolor al movimiento

Dolor a la palpación

Rayos X: sinovitis u osteomielitis

BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA

Staphylococcus aureus

Haemophilus influenzae

Streptococcus pyogenes

Neisseria gonorrhoeae

Streptococcus pneumoniae

Enterobacterias

Micobacterias

165

PROCEDIMIENTO:

1. El médico debe obtener la muestra (LCR o cualquier otro fluido corpo-ral del cual desee examen completo) en dos tubos estériles 13 x 100 contapón de rosca o frasquitos estériles que cierren bien. Enviarlos inme-diatamente al laboratorio. Mantener la muestra dentro de la incubado-ra a 36°C mientras se procesa. En caso de recibirse un solo frasquitoseparar asépticamente en dos porciones.

2. Uno de los tubos no se centrifuga, enviarlo a donde correspondapara citología (recuento total de células), recuento diferencial(fórmula) y análisis químico. El otro tubo sirve para el análisismicrobiológico.

3. Centrifugar la muestra 15 minutos a alta velocidad (2500-3000 rpm). De-cantar asépticamente, tapar agitar y procesar sólo el sedimento.

4. Sembrar una asada del sedimiento en cada uno de estos medios:- Agar sangre de carnero al 5%- Agar chocolate- MacConkey- Sabouraud (hongos), no Micosel- Tioglicolato- Lowenstein-Jensen (sólo si se solicita)

5. Diseminar por estrías en toda la superficie de los medios sólidos. Intro-ducir el agar sangre de carnero y el agar chocolate en jarro húmedo concandela encendida. Incubar todos los medios a 36°C, excepto elSabouraud que se incuba a 27°C (o a temperatura ambiente para aisla-miento de hongos patógenos especialmente Cryptococcus neoformans).

6. En porta-objetos nuevos o bien limpios con alcohol, hacer dos frotespequeños (de aproximadamente un centímetro de diámetro) en elcentro de la lámina. Si el material es muy escaso poner una gotadel sedimiento, dejar secar, luego colocar otra gota encima y dejar secarde nuevo.

7. Colorear un frote con Gram y otro con Ziehl-Neelsen.

166

Fig. 11 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARAFig. 11 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARAFig. 11 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARAFig. 11 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARAFig. 11 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARALÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR)LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR)LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR)LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR)LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR)

5. Incubar aeróbicamente a 36o C,Sabouraud a 27o C

4. Incubar en jarrocon candela

6. Aislamiento e identificación de bacterias, micobacterias u hongos

Muestra: LCR obtenido siempre por el médico, endos recipientes estériles, ya sea tubos ofrasquitos preparados por el laboratorio.

1. Enviar un recipiente sin centrifugar a Citología yQuímica

2. Centrifugar 15 minutos, decantar asép-ticamente y procesar sedimento

GRAM

3. RUTINARIAMENTE SEMBRAR EN

MacConkeyTioglicolatoNO INCLINARagar

chocolateagar sangrede carnero

Lowenstein-Jensen

OPCIONAL

Sabouraud

ZIEHL-NEELSENsedimento

167

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

Lo más pronto posible, observar los frotes de sedimento de LCR con lente deinmersión. En vista que del resultado de los frotes depende el tratamiento inme-diato de pacientes con infección grave de las meninges, su observación debe hacer-se con todo cuidado. Poner especial cuidado en observar las siguientes morfologías:

1. Diplococos gram-negativo (rojos), arriñonados, dispuestos en parejascomo granos de café, idénticos a N. gonorrhoeae de pus uretral: morfologíacompatible con N. meningitidis. Dar alerta al médico inmediatamente.

2. Cocobacilos gram-negativo (rojo pálido) pleomórficos, con escasas for-mas bacilares: morfología compatible con H. influenzae, agente demeningitis en niños de 6 meses a 4 años; raro en adultos.

3. Cocos gram-positivo (morados), lanceolados, ovalados, dispuestos enparejas o cadenas cortas, la cápsula se insinúa como un halo claroalrededor de las bacterias: En LCR morfología compatible conS. pneumoniae. En otros fluidos puede ser S. pyogenes con mayorfrecuencia.

4. Bacilos gram-negativo (rojos) de coloración sólida, no pleomórficos,bacilos alargados: morfología compatible con enterobacterias opseudomonas (E. coli, Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa, etc.)

5. Levaduras redondeadas, algunas con gemaciones laterales, gram-posi-tivo, se insinúa cápsula, hacer “tinta china” para demostrar la presenciade la levadura capsulada C. neoformans.

6. En el Ziehl-Neelsen: bacilos alcohol-ácido resistente (rojos), cortos, al-gunos con coloración dispareja en forma de gránulos: morfología com-patible con M. tuberculosis.

Si hay bacterias en los frotes, el laboratorio está en la obligación de alertar almédico de inmediato. Reportar el Gram según se indicó. Es muy importante seña-lar la cantidad y clase de leucocitos presentes. Si la morfología es típica, informarcon que bacteria es compatible según las explicaciones anteriores. Si no hay segu-ridad, reportar sólo el tipo y cantidad de bacterias observadas.

168

Los cultivos deben observarse a las 24 horas de incubación a 36°C. Si no seobserva crecimiento, reincubar todas las cajas. Si a las 48 horas de incubación tam-poco hay crecimiento, apuntar en el libro de control: N-48, y reportar “Negativo alas 48 horas de incubación a 36°C en aero-anaerobiosis”. Si se observa algún creci-miento a las 24 ó 48 horas, comparar con la siguiente tabla:

Hacer frote Gram de las colonias para confirmar morfología e identificarsegún los capítulos anteriores, así:

* Aglutinar con antisueros específicos, los grupos más frecuentes son A, B y C. Hacer antibiogramaen agar Mueller-Hinton con 5% de sangre, achocolatdo.

** Prueba de “satelitismo” para H. influenzae (de LCR, secreciones) y H. aegyptis (de ojos).

PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN

Oxidasa*, azúcares en CTA (vertabla en capítulo 13)

Prueba de satelitismo con Staphylo-coccus aureus**

Inhibición por disco de optoquina(ver capítulo 8)

TSI/LIA/MIO/urea/citrato; o API.Aglutina-ción con antisueros

COLONIAS

Pequeñas (1 mm de diámetro o menos)brillantes, bordes enteros, no hemolí-ticas)

Muy pequeñas (puntiformes) brillantes,bordes enteros, no hemolíticas)

Pequeñas (1 mm de diámetro o más)aplanadas, alfa hemolíticas

Grandes, brillantes, bordes lisos crecenen todos los medios. Notar enMacConkey si son lactosa positivo(rojas) o negativo (incoloras)

BACTERIA

N. meningitidis

H. influenzae

S. pneumoniae

Enterobacterias

Sabouraud

-

-

+

+

+

-

MacConkey

-

-

-

+

-

-

Tioglicolato

-

-

+/-

+

-

+

Agar Sangre

-/+

-

+

+

-

-

Crecimiento en

Agar Chocolate

+

+

+

+

-

-

BACTERIA

N. meningitidis

H. influenzae

S. pneumoniae

Enterobacteriasy pseudomonas

Cryptococcusneoformans

Anaerobios

169

Efectuar la prueba de satelitismo así:

1. Obtener un cultivo puro en agar chocolate en jarro húmedo con cande-la, a 36° C.

2. Tomar una asada y estriar en la superficie de una caja de agar sangre,sólo en una dirección.

3. Tomar una asada de un cultivo de Staphylococcus aureus (de otro cultivocualquiera o de preferencia una cepa pura mantenida en refrigeración).Hacer con el asa en argolla una sola estría recta, perpendicular a lasestrías del Haemophilus.

4. Incubar en jarro con candela 24 horas a 36° C y luego examinar con lupay buena luz.

5. Una reacción positiva se manifiesta por el crecimiento de pequeñas co-lonias puntiformes y translúcidas que crecen sólo muy cerca de la estríade S. aureus.

INFORME:

El informe del frote Gram de LCR debe haberse enviado previamente, el díaen que se recibió la muestra. Después informar lo más pronto posible el resultadodel cultivo con el nombre correcto de la bacteria, y la cantidad de colonias observa-das (escaso, regular, abundante cantidad) en las cajas originales, por ejemplo:

Primer informe, entregar el mismo día de obtención de la muestra:

Frote Gram: Se observan escasos diplococos gram-positivo, lanceoladosy capsulados, de morfología compatible con S. pneumoniae. Leucocitospolimorfonucleares: regular cantidad. Cultivo: Pendiente

Segundo informe, entregar el día que termina la identificación:

Cultivo: Se aisló S. pneumoniae. Antibiograma.

171

CAPÍTULO 15

TEJIDOS Y BIOPSIAS

PROPÓSITO:

Demostrar por frote y cultivo la presencia de bacterias en piezas de tejidos desala de operaciones, o piezas aún más pequeñas obtenidas por biopsia. Las bacte-rias que pueden estar presentes son muy variadas. Anteriormente sólo se efectua-ba histopatología de estas muestras, en la actualidad el examen microbiológico estambién de gran ayuda diagnóstica. Además, la microbiología post-mortem contri-buye a elucidar las infecciones mortales.

MUESTRA:

Este tipo de muestras son exclusivamente obtenidas por el médico en condi-ciones asépticas, y depositadas en recipientes estériles de boca ancha con un pocode solución salina estéril, proporcionados por el laboratorio.

Debe obtenerse suficiente cantidad y no debe adicionarse ninguna sustanciafijadora como formol. Después de procesarse, la muestra debe almacenarse en re-frigeración o congelación, en solución salina estéril para que no se deseque, con elpropósito de preservarla para nuevos estudios, ya que generalmente hay riesgopara el paciente al tomar nueva muestra.

De úlcera o tractos fistulosos debe efectuarse curetaje profundo tomando par-te del tejido de la pared del tracto fistuloso. Debe desinfectarse la piel circundantee introducir un catéter venoso de plástico estéril, y luego aspirar con jeringa estéril.De las úlceras obtener material de la base. Si se justifica, el material de estas mues-tras debe obtenerse en algún medio de transporte anaeróbico adecuado (ver capí-tulo 17). En el caso de material de fístulas, debe hacerse una preparación en frescopara buscar gránulos de Actinomyces, Nocardia u hongos.

Para obtener cultivos de material de autopsia, la piel debe ser desinfectadaaplicando una espátula caliente para quemar la piel. Si se trata de un órgano, debesumergirse en agua hirviendo por 5 a 10 segundos, y luego debe disecarse coninstrumentos estériles y tomar para cultivo material del centro. La mitad de la

172

muestra debe fijarse en formol, y la otra enviarse en recipiente estéril con un pocode solución salina estéril al laboratorio de microbiología.

PROCEDIMIENTO:

No es adecuado inocular los medios sólo tocando o frotando la pieza con unaasa. Debe hacerse de la siguiente manera:

1- Colocar la pieza con pinzas estériles en una caja de Petri estéril. Contijeras estériles, picarla finamente y luego pasarla a un macerador detejido estéril o, si no lo hay, a un pequeño mortero estéril.

2- Usar arena esteril para triturar bien la muestra. Si se hace en un morte-ro, adicionar una pequeña cantidad de solución salina estéril. Dejar se-dimentar para cultivar el sobrenadante. Si se sospecha la presencia dehongos, no triturar, sólo picar finamente con tijeras estériles.

3- Con aguja y jeringa estériles, aspirar asépticamente una porción delsobrenadante. Inyectar aproximadamente un mililitro en un frasco decaldo para hemocultivo.

4- Seleccionar los otros medios de cultivo a inocularse con base en el o losmicroorganismos sospechados, u observados en una coloración de Gram.Si se desconoce la historia del paciente inocular con una gota del restode la muestra en la jeringa los siguientes medios: agar sangre de carneroal 5%, agar chocolate, MacConkey, manitol-sal, tioglicolato, Sabouraud,mycosel y Lowenstein-Jensen.

5- Incubar a 36°C el agar sangre y el agar chocolate en jarro húmedo concandela; MacConkey, manitol-sal, tioglicolato y Lowenstein-Jensen,aeróbicamente a 36°C, y los tubos de Sabouraud y mycosel a 27°C o atemperatura ambiente.

6- Preparar dos frotes, colorear uno con Gram y el otro con Ziehl-Neelsen.

7- Las muestras de sangre de autopsia deben procesarse como hemocultivo,sin importar la presencia de coágulos.

173

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS E INFORME

Si se observa crecimiento en los medios después de 24 a 48 horas de incubación,hacer las coloraciones y sub-cultivos adecuados para efectuar la identificación se-gún el caso. Pueden encontrarse los siguientes microorganismos con interés clíni-co: anaerobios como Actinomyces sp., bacterias aerobias comunes, Nocardia sp.,hongos sistémicos y Mycobacterium sp. Descartar cultivos para bacterias a las 48horas de incubación, cultivos para hongos después de dos semanas y el Lowenstein-Jensen después de 6 semanas de incubación. Reportar según las normas de loscapítulos anteriores.

175

ANUNCIOZITHROMAX

176

DOCUMENTOZITHROMAX

177

CAPÍTULO 16

PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD(ANTIBIOGRAMA)

PROPÓSITO

La prueba de susceptibilidad sirve para determinar in vitro a qué antibióticoses susceptible o resistente una determinada cepa bacteriana aislada del paciente.Este método permite al médico escoger el antibiótico más adecuado con base cien-tífica proporcionada por el laboratorio, y evita dar tratamientos útiles.

Susceptible: Cuando los microorganismos responsables de una infección soninhibidos por concentraciones de antibiótico obtenidas con un régimen usual dedosificación.

Moderadamente susceptible: Cuando los microorganismos son inhibidos porconcentraciones altas de antibiótico.

Resistente: Si los microorganismos que causan la infección, toleran concen-traciones de antibiótico superiores a las que pueden obtenerse en la sangre pormedio de un régimen usual de dosificación.

Intermedio (Indeterminado): Hoy en día se considera como prueba erráticaque por lo tanto debe repetirse, ya que realmente se trata de una población bacterianaresistente.

El nombre “Antibiograma” es adecuado para designar esta prueba, pero nolo es “Prueba de sensibilidad”, pues las bacterias no “sienten” la acción de losantibióticos, son susceptibles a estos medicamentos. La técnica que debe usarse esla de Bauer-Kirby, ligeramente modificada por el Comité Nacional de Estándarespara Laboratorios Clínicos de Estados Unidos (NCCLS).

MEDIO DE CULTIVO

Por medio de la técnica de Bauer-Kirby modificada se obtienen resultadosconfiables, reproducibles y de gran utilidad clínica siempre y cuando se sigan alpie de la letra las instrucciones de este capítulo. Es una técnica relativamente sen-

178

cilla que siempre debe efectuarse con el agar de Mueller-Hinton; el grosor de lacaja, concentración del inóculo, humedad, temperatura y otros factores deben estarperfectamente estandarizados para que los resultados puedan ser comparables entrelos diversos laboratorios. Es muy importante tomar en cuenta que esta técnica sólosirve para efectuar el antibiograma de las siguientes bacterias aeróbicas o facultati-vas de crecimiento rápido:

- Staphylococcus aureus- Enterobacterias- Pseudomonas

El antibiograma para Haemophilus spp. y Neisseria spp. debe hacerse en Mueller-Hinton con 5% de sangre, “achocolatado”.

Preparar el agar Mueller-Hinton según las indicaciones del productor y conlas siguientes características:

1- Las cajas de Petri de tamaño estándar (100 mm de diámetro), debenllenarse con aproximadamente 25 ml del agar líquido ya autoclaveado,a manera de dar un medio de 4 mm de grueso.

Idealmente deben usarse cajas de Petri descartables de plástico, de 150mm de diámetro con la misma profundidad, para poder colocar los dis-cos más separados

2- Deben guardarse en la refrigeradora dentro de bolsas plásticas selladas,(de 2 a 8° C), por no más de 7 días.

3- El pH del medio debe ser de 7.2 a 7.4. Medir el pH del medio conpotenciómetro. Dejar solidificar un poco del medio dentro de un peque-ño beaker alrededor del electrodo del aparato. Ajustar si es necesario,antes de autoclavear, con NaOH 1N, o HCl 1N.

4- De cada lote de medio, incubar dos cajas por 24 horas a 36° C para com-probar su esterilidad. Descartar estas cajas ya que no son adecuadaspara efectuar antibiograma después de ser incubadas.

5- Inmediatamente antes de usar el medio Mueller-Hinton, secarlo a 36° C.Colocar las cajas en la incubadora por 20 minutos con el medio arriba yla tapadera ligeramente abierta.

179

Almacenaje de discos con antibióticos

Para que el procedimiento proporcione datos con verdadera correlación clíni-ca, en primer lugar debe tomarse la siguiente precaución para el almacenaje de losdiscos de papel impregnados con los diferentes antibióticos, que se obtienen co-mercialmente. Almacenar los discos de acuerdo con las siguientes instrucciones,para que no pierdan su potencia:

1- Congelar (idealmente a -20° C) los discos de penicilina, ampicilina,carbenicilina y cefalosporinas. Descongelar periódicamente sólo los dis-cos que serán usados durante la semana. Descongelarlos por lo menosdos horas antes de usarse.

2- Los discos del resto de antibióticos pueden almacenarse refrigeradossin congelación. De preferencia con una pastilla desecante.

3- Si se usan los cartuchos de discos montados en dispensador, introducirdos pastillas desecantes de las que vienen con los discos y cerrar biendespués de usar.

PROCEDIMIENTO:

Efectuar el antibiograma así:

1- Con el asa flameada y fría tomar 4 a 5 colonias bien aisladas y de igualmorfología del cultivo original en cualquier medio sólido. Debe trasla-darse siempre un cultivo puro.

2- Inocular un tubo con 4 ml de caldo tripticasa soya o caldo infusión decerebro y corazón (BHI).

3- Incubar el caldo de 2 a 5 horas a 36° C, hasta que aparezca una ligeratubidez.

4- Ajustar la turbidez del caldo a la turbidez del estándar de MacFarland0.5. Si el caldo es más turbio que el estándar agregarle más caldo o solu-ción salina estéril. Comparar ambos tubos (muestra y estándar) con buenaluz y frente a un fondo blanco con una línea negra para evaluarvisualmente la turbidez.

180

Preparar el estándar 0.5 de MacFarland así: mezclar 0.5 ml de cloruro debario 0.048 M (1.175 g BaCl2

. 2H2O en balón de 100 ml, aforar con aguadestilada), más 99.5 ml de ácido sulfúrico 0.36 N (1 ml de H2SO4 enbalón de 100 ml, aforar con agua destilada). Llenar tubos que cierrenbien, sellarlos, guardarlos en la oscuridad con fecha. Hacer nuevoestándar cada 6 meses.

5- Antes de quince minutos de diluídos los caldos, inocular la caja pre-secada de agar Mueller-Hinton así: introducir un hisopo estéril en elcaldo de turbidez igual al estándar; exprimir bien el hisopo presionán-dolo firmemente contra las paredes del tubo, arriba del nivel del caldo.

6- Con el hisopo exprimido sembrar la caja en tres direcciones opuestassobre toda la superficie, cerca del mechero encendido. En caso de ur-gencia puede sembrarse la prueba con la muestra directa, sólo si el froteGram revela una sola clase de bacteria (LCR o secreciones varias), peroesto debe evitarse y considerarse preliminar.

7- Dejar secar la caja de 3 a 5 minutos, pero no más de 15 minutos, con latapadera cerrada.

8- Con pinzas estériles o dispersador especial, colocar los discos impreg-nados de antibióticos a manera de que queden lo más separados entre síque sea posible. Con las pinzas flameadas y frías presionar los discos yacolocados para adherirlos bien al medio de cultivo.Escoger los antibióticos a colocar dependiendo de la bacteria estudiada,según el listado básico actualizado de cada laboratorio y de acuerdocon los listados oficiales del NCCLS (1995), que aparecen en las páginas182 y 183 de este manual.Es preferible usar discos comerciales y no los obsequiados por el pro-ductor del antibiótico. Al recibir discos obsequiados por el productordel antibiótico, debe verificarse que éstos sean elaborados por una com-pañía especializada (por ejemplo: DIFCO o BBL), y no por la mismacompañía productora del antibiótico.

9- Invertir las cajas e incubarlas por 16 a 18 horas a 36° C, nunca usar jarrocon candela (excepto para Haemophilus spp. y Neisseria spp.)

181

Fig. 12 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA ANTIBIOGRAMAFig. 12 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA ANTIBIOGRAMAFig. 12 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA ANTIBIOGRAMAFig. 12 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA ANTIBIOGRAMAFig. 12 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA ANTIBIOGRAMA

Agar Mueller-Hinton

5. Sembrar cajapre-secada en tresdirecciones opuestas

6. Dejar secar de 3 a 5minutos (no más de 15)y colocar discos deantibióticos paragram-positivo ogram-negativo

Cualquiermedio sólido

1. Tomar 4 ó 5 coloniasde igual morfologíadel cultivo original

2. Inocular un tubo con4 ml de caldo

3. Incubar por 2 a 5 hrs a 36o C hasta alcanzar laturbidez del estándar 0.5 de MacFarland

7. Incubar por 16 a 18 hrs a36o C y medir diámetrosde halos de inhibición;interpretar según tablas

4. Empapar hisopo estéril, exprimirbien contra las paredes del tubo

182

ANTIBIÓTICOS APROBADOS (FDA-USA) QUE DEBENUSARSE RUTINARIAMENTE PARA PRUEBAS DE

SUSCEPTIBILIDAD EN VARIOS GRUPOS BACTERIANOS

Según: NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards), M7-A3(M100-56), 1995.

Enterobacterias:

Grupo A, prueba inicial, reportar siempre:11. Ampicilina*12. Cefazolina*13. Cefalotina*14. Gentamicina*

Grupo B, prueba inicial, reportar selectivamente:15. Mezlocilina o piperacilina16. Ticarcilina17. Ampicilina-sulbactam* o amoxicilina-ácido clavulánico18. Piperacilina-tazobactam19. Ticarcilina-ácido clavulánico10. Cefmetazol11. Cefoperazona12. Cefotetan13. Cefoxitina*14. Cefamandol/cefonicida/cefuroxima15. Cefotaxima*/ceftizoxima/ceftriaxona16. Imipenem17. Amikacina18. Ciprofloxacina*19. Trimetoprim-sulfametoxazol*

* De utilidad en infección urinaria, además de carbenicilina, cinoxacina,lamefloxacina/norfloxacina/ofloxacina, loracarbef y nitrofurantoína.

183

Pseudomonas aeruginosa y otros bacilos gram-negativo facultativos no de lafamilia Enterobacteriaceae:

Grupo A, prueba inicial, reportar siempre:11. Mezlocilina o ticarcilina12. Piperacilina13. Gentamicina14. Ceftazidima

Grupo B, prueba inicial, reportar selectivamente:15. Ticarcilina-ácido clavulánico16. Cefoperazona17. Aztreonam18. Imipenem19. Amikacina10. Tobramicina11. Ciprofloxacina12. Trimetoprim-sulfametoxazol

Staphylococcus spp.:

Grupo A, prueba inicial, reportar siempre:11. Penicilina12. Oxacilina o meticilina

Grupo B, prueba inicial, reportar selectivamente:13. Azitromicina14. Vancomicina15. Clindamicina16. Claritromicina17. Eritromicina18. Trimetoprim-sulfametoxazol

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

1- Después de 16 a 18 horas de incubación, examinar con buena luz lascajas ya crecidas.

2- Medir en milímetros el diámetro de los halos de inhibición completa

184

con una regla por detrás de la caja de Petri, o con patrones especiales.No tomar en cuenta escasas colonias separadas dentro del halo de inhi-bición o crecimiento muy débil (80% de inhibición). Sin embargo, si seobservan múltiples colonias dentro del halo de inhibición, éstas debensub-cultivarse para descartar contaminación. En caso de tratarse de lamisma bacteria que se analiza, repetir el antibiograma de las coloniasque crecen dentro del halo. El “velo” de crecimiento de Proteus sp. den-tro del halo, tampoco debe tomarse en cuenta. Medir siempre hasta elmárgen donde se inicia el crecimiento grueso.

3- En el caso de sulfonamidas, puede ocurrir crecimiento dentro del halo,el cual no debe tomarse en cuenta.

4- En caso de urgencia puede efectuarse una lectura preliminar despuésde 5 ó 6 horas de incubación, siempre y cuando la caja se reincube yposteriormente se envíe el informe definitivo.

5- Transformar las medidas de los diámetros de los halos de inhibición enmilímetros, a: resistente, intermedio, moderadamente susceptible o sus-ceptible por medio del uso de tablas actualizadas.Se deben utilizar las tablas de interpretación que son oficiales en Esta-dos Unidos: National Comittee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS). Para este propósito, utilice las tablas de las páginas 185, 186 y187 de este manual.

185

INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS DE LAS ZONAS DE INHIBICIÓN (mm)PARA MIEMBROS DE LA FAMILIA Enterobacteriaceae

Agenteantimicrobiano

Amikacina

Amoxicilina-ácido clavulánico

Ampicilina

Ampicilina-sulbactam

Aztreonam

Cefamandol

Cefazolina

Cefmetazol

Cefonicida

Cefoperazona

Cefotaxima

Cefotetan

Cefoxitina

Ceftazidima

Ceftizoxima

Ceftriaxona

Cefuroxima (oral)

Cefuroxima (parenteral)

Cefalotina

Cloranfenicol

Ciprofloxacina

Gentamicina

Imipenem

Kanamicina

Mezlocilina

Netilmicina

Piperacilina

Tetraciclina

Ticarcilina

Moderadamentesusceptible

14-17

14-16

12-14

16-21

15-17

15-17

13-15

15-17

16-20

15-22

13-15

15-17

15-17

15-19

14-20

15-22

15-17

15-17

16-20

14-15

18-20

18-20

15-19

Susceptible

≥17

≥18

≥17

≥15

≥22

≥18

≥18

≥16

≥18

≥21

≥23

≥16

≥18

≥18

≥20

≥21

≥23

≥18

≥18

≥18

≥21

≥15

≥16

≥18

≥21

≥15

≥21

≥19

≥20

Intermedio

15-16

13-17

13-14

14-17

13-14

15-18

Resistente

≤14

≤13

≤13

≤11

≤15

≤14

≤14

≤12

≤14

≤15

≤14

≤12

≤14

≤14

≤14

≤13

≤14

≤14

≤14

≤12

≤15

≤12

≤13

≤13

≤17

≤12

≤17

≤14

≤14

Contenidodel disco (mcg)

130

20/10

110

10/10

130

130

130

130

130

175

130

130

130

130

130

130

130

130

130

130

135

110

110

130

175

130

100

130

175

186

(Continuación)

INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS DE LAS ZONASDE INHIBICIÓN (mm) PARA Staphylococcus spp.

Moderadamentesusceptible

12-14

15-22

14-20

15-17

16-20

14-15

Susceptible

≥20

≥29

≥15

≥18

≥23

≥21

≥18

≥18

≥21

≥21

≥23

≥15

≥16

Intermedio

15-17

15-17

13-17

15-20

14-22

13-14

Resistente

≤19

≤28

≤11

≤14

≤14

≤13

≤14

≤12

≤15

≤14

≤13

≤12

≤13

Contenidodel disco

120/10 mcg

10 mcg/ml

10/10 mcg

30 mcg

30 mcg

30 mcg

30 mcg

30 mcg

35 mcg

32 mcg

15 mcg

10 mcg

10 mcg

Agenteantimicrobiano

Amoxicilina- ácidoclavulánico

Ampicilina

Ampicilina-sulbactam

Cefazolina

Cefotaxima

Ceftriaxona

Cefalotina

Cloranfenicol

Ciprofloxacina

Clindamicina

Eritromicina

Gentamicina

Imipenem

AgenteAntimicrobiano

Ticarcilina-ácidoclavulánico

Tobramicina

Trimetoprim-sulfametoxazol

Reportar sólo enurocultivos:

Carbenicilina

Cinoxacina

Nitrofurantoína

Norfloxacina

Ofloxacina

Sulfisoxazol

Trimetoprim

Moderadamentesusceptible

11-15

20-22

13-15

13-16

11-15

Intermedio

13-14

15-18

15-16

13-16

Resistente

≤14

≤12

≤10

≤19

≤14

≤14

≤12

≤12

≤12

≤10

Contenidodel disco (mcg)

75/10

310

1.25/23.75

100

100

300

310

315

250 ó 300

315

Susceptible

≥20

≥15

≥16

≥23

≥19

≥17

≥17

≥16

≥17

>16

15-19

187

(Continuación)

CONTROL DE CALIDAD

Para controlar la efectividad y reproducibilidad de la prueba, cada laboratoriodebe mantener refrigeradas en agar inclinado y sub-cultivar semanalmente lassiguientes dos cepas bacterianas estándar, que producen patrones de suscepti-bilidadconocidos:

a) Escherichia coli ATCC 25922 (gram-negativo)b) Staphylococcus aureus ATCC 25923 (gram-positivo)

La susceptibilidad de las dos cepas patrón debe probarse con cada lote nuevo

Tomado de: Munro, S. 1992. Disk Diffusion Susceptibility Testing. In: Isenberg, H.D. (Editorin Chief). CLINICAL MICROBIOLOGY PROCEDURES HANDBOOK. Twovolumes. American Society for Microbiology. Washington, D.C., U.S.A. Basadoen: NCCLS. 1991. Performance Standards for Antimicrobial SusceptibilityTesting. Third informational supplement. M100-S3. NCCLS, Villanova,Pennsylvania, U.S.A.

Agenteantimicrobiano

Meticilina

Ofloxacina

Oxacilina

Penicilina G

Rifampicina

Tetraciclina

Trimetoprim-sulfametoxazol

Vancomicina

Reportar sólo en uro:

Nitrofurantoína

Norfloxacina

Sulfisoxazol

Trimetoprim

Moderadamentesusceptible

≤9

13-15

≤10

≤28

≤16

3≤14

11-15

3≤9

≤14

≤1213-16

11-15

Susceptible

≥14

≥16

≥13

≥29

≥20

≥19

≥16

3≥12

≥17

≥17

≥17

≥16

Contenidodel disco

135 mcg

315 mcg

311 mcg

10 U

315 mcg

330 mcg

1.25/23.75 mcg

330 mcg

300 mcg

310 mcg

250 ó 300 mcg

315 mcg

Resistente

≤9

≤12

≤10

≤28

≤16

≤14

≤10

3≤9

≤14

≤12

≤12

≤10

Intermedio

10-13

≤12

11-12

≤28

17-19

15-18

≤10

10-11

15-16

13-16

Reportar sólo en urocultivos:

188

de medio Mueller-Hinton, o una vez a la semana. Nunca hacerlo de los cultivosrefrigerados, hacerlo de colonias previamente sub-cultivadas en agar sangre.

Las zonas de inhibición de los patrones conocidos sirven para evaluar la pre-cisión de la prueba. Los halos de inhibición de las dos cepas control deben estarentre los rangos de la siguiente tabla:

LÍMITES ACEPTABLES DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN (mm)QUE DEBEN OBTENERSE CON LAS CEPAS CONTROL Y ALGUNOS

ANTIBIÓTICOS

Antibiótico S. aureus ATCC 25923 E. coli ATCC 25922

Amikacina -------- 19 - 26

Ampicilina 27 - 35 16 - 22

Ampicilina-sulbactam 29 - 37 20 - 24

Aztreonam -------- 28 - 36

Ceftazidima -------- 25 - 32

Clindamicina 24 - 30 --------

Cloranfenicol 19 - 26 21 - 27

Eritromicina 22 - 30 --------

Gentamicina 19 - 27 19 - 26

Penicilina-G 26 - 37 --------

Tetraciclina 19 - 28 18 - 25

Tobramicina -------- 18 - 26

Trimetoprim-sulfametoxazol 24 - 32 24 - 32

FUENTES COMUNES DE ERROR:

1- Usar otro medio que no sea Mueller-Hinton.2- Mala estandarización de la turbidez del inóculo.3- Mala preparación del medio, no ajustar el pH entre 7.2 y 7.4.4- Usar medio vencido o cajas mal almacenadas.5- Mal almacenaje de los discos con antibióticos.

189

16- Mala preparación o almacenaje del estándar 0.5 de MacFarland.17- No exprimir el hisopo en las paredes del tubo.18- Retraso entre la preparación del inóculo y la siembra (aumenta la

concentración bacteriana).19- Retraso en la aplicación de los discos en las cajas ya inoculadas.10- Exceso de incubación de las cajas.11- Uso de jarro con candela o incubación a otra temperatura que no sea

36° C.12- Lectura prematura antes de 16 a 18 horas de incubación.13- Mala medición de los halos de inhibición.14- Cultivos mixto, no puros.15- Aplicación de la técnica a anaerobios o bacterias de crecimiento lento.16- No usar las cepas control.17- Errores de transcripción de resultados.

La prueba de susceptibilidad antimicrobiana de difusión sobre agar, propuestadesde 1966 por Bauer, Kirby, Sherris y Truck, continúa siendo aceptable y práctica.Es indispensable hacer notar el enorme avance que se ha logrado recientemente enla miniaturización y automatización del antibiograma. Si el laboratorio tiene posi-bilidades económicas y técnicas, debe utilizar alguno de los procedimientos mo-dernos de antibiograma por dilución, miniaturizado e idealmente automatizado.El autor tiene conocimiento de dos métodos de este tipo, disponibles en nuestromedio que dan buenos resultados: ATB/VITEK de Bio Merièux y SENSIDENT deMerck.

** Método de difusión en disco sobre agar según Bauer-Kirby.** Moderadamente susceptible.

Interpretación del diámetrodel halo (mm)

Susceptible

≥ 18

≥ 15

Intermedio

14-17

12-14**

Resistente

≤ 13

≤ 11

Contenidodel disco

15 mcg

10 mcg deampicilina +10 mcgsulbactam

Nombregenérico

Azitromicina(macrólido,azálido)

Ampicilina-sulbactam(Sultamicilina)

ESPECIFICACIONES PARA PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD*DE DOS ANTIBIÓTICOS DE PFIZER

(Para bacilos gram-negativo facultativos y Staphylococcus spp.)

Nombrecomercial

Zithromax

Unasyn

191

ANUNCIOUNASYN

(blanco y negro,cara de niño)

192

DOCUMENTOUNASYN

(blanco y negrocolumna vertical,

debe decirUNASYN al

principio)

193

CAPÍTULO 17

ANAEROBIOS

PROPÓSITO:

Demostrar por medio de cultivo con procedimientos especiales, la presenciade bacterias anaerobias, es decir aquellas que no crecen en presencia de oxígenodel aire. Estas bacterias son normales y predominan en las microbiotas de lasmucosas (boca, intestino, heces, vagina, etc.) En determinadas circunstancias lle-gan a sitios anatómicos diferentes y causan infección, generalmente en asociacióncon bacterias aerobias tales como enterobacterias, pseudomonas o cocos gram-po-sitivo. Por esta razón, siempre debe hacerse frote Gram del material clínico y culti-vo aerobio, además del cultivo en anaerobiosis (ausencia de oxígeno).

MUESTRA:

Si en algún tipo de análisis bacteriológico es de vital importancia la toma dela muestra y su transporte al laboratorio, es en el caso de los anaerobios. Esto sedebe principalmente a dos factores:

- La muestra debe tomarse con mucho cuidado a manera de no contami-narla con bacterias de los sitios colonizados normalmente por anaerobios.Por esta razón, el médico a veces debe tomar muestras de secrecionesdel pulmón por punción trans-traqueal (para evitar los anaerobios de laorofaringe), o punción suprapúbica de la vejiga (para evitar losanaerobios de la uretra).

- Las bacterias anaerobias son muy susceptibles al oxígeno del aire. Si losanaerobios en la muestra entran brevemente en contacto con aire, pier-den muy rápidamente su viabilidad (capacidad de reproducirse en cul-tivo). Por esta razón deben seguirse al pie de la letra instrucciones, tantopara toma de la muestra como para su transporte al laboratorio.

Hallazgos clínicos que sugieren infección causada por anaerobios:

1- Pus con mal olor.2- Infección cerca de membranas mucosas.

194

13- Tejido necrótico, gangrena o formación de pseudo-membranas.14- Gas en tejido o secreción.15- Endocarditis con hemocultivos rutinarios negativos.16- Infección asociada con cáncer u otros procesos que causan destrucción

de tejidos.17- Infección relacionada con uso de antibióticos aminoglucósidos.18- Tromboflebitis séptica.19- Bacteremia con ictericia.10- Infección causada por mordidas humanas o de animales (investigar

Pasteurella multocida, cocobacilo gram-negativo aerobio).11- Pus sanguinolento y negruzco que puede fluorecer de color rojo bajo

luz ultravioleta (Bacteroides melaninogenicus).12- Presencia de “gránulos de azufre” en pus de lesiones en mandíbula u

otro sitio (actinomicosis, buscar Actinomyces israelii).13- Signos y síntomas de gangrena gaseosa.14- Entidades clínicas que generalmente implican anaerobios como aborto

séptico, o cirugía gastrointestinal infectada.

TOMA DE MUESTRA PARA CULTIVO DE ANAEROBIOS:

Si se sospechan anaerobios en la muestra, ésta debe manejarse de maneraespecial. Los sitios anatómicos de donde se requiere tomar muestra son muy varia-dos, generalmente las muestras aceptables para cultivo de anaerobios son:

1- Pus aspirado.2- Tejidos varios (biopsia, cirugía, autopsia).3- Fluidos corporales (LCR, líquido pleural, paracentésis, pericárdico,

sinovial).4- Aspirado por punción trans-traqueal.5- Aspirado por punción pulmonar directa.6- Orina aspirada por punción supra-púbica.7- “Gránulos de azufre” de pacientes con sospecha de actinomicosis.

Las muestras no aceptables para cultivo de anaerobios, pues contienen nor-malmente estas bacterias y siempre deben ser rechazadas si se solicita este tipo decultivo, son:

1- Hisopos de garganta o boca.2- Esputo espectorado.3- Material de broncoscopía no colectado con catéter de doble lumen.

195

4- Heces, contenido intestinal, hisopo rectal.5- Hisopo de lesiones superficiales (úlceras de decúbito, etc.)6- Material contiguo a mucosas.7- Orina colectada al vuelo.8- Hisopos vaginales o cervicales.

En todo caso, evitar contaminaciones con microbiota anaerobia normal. Nodeben pasar más de 10 minutos para transportar este tipo de muestras al laborato-rio. Si no es posible transportarla con esta rapidez la muestra debe inocularse en unfrasco o dispositivo especial que la mantenga en anaerobiosis.

El laboratorio de microbiología debe ser alertado que se tomará una muestrapara anaerobios, para que tenga listo el material necesario y la muestra se siembrecuanto antes. El personal del laboratorio debe conocer bien los procedimientos es-peciales para toma de muestra y aislamiento de anaerobios. Tomar las muestrascon hisopo es menos satisfactorio que aspirar. Esto se debe a que el hisopo puedeexponer a los anaerobios al oxígeno del ambiente, tiende a secarse rápidamente ypermite colectar una muestra muy pequeña.

En resumen para lograr el cultivo de las bacterias anaerobias deben tomarselas siguientes precauciones.

1- Cultivar el material clínico inmediatamente después de obtenido.2- Emplear medios frescos.3- Obtener condiciones anaerobias adecuadas.4- Efectuar el sub-cultivo de colonias inmediatamente después de sacarlas

del medio anaerobio.

TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS AL LABORATORIO:

Si la muestra no va a ser inoculada antes de 10 minutos de obtenida, debecolocarse en ambiente anaerobio para su transporte. Para este propósito, usar reci-pientes especiales obtenidos comercialmente (de preferencia “culturettes”, paratransporte de anaerobios). En caso de no contarse con este material, por lo menoscolocar la muestra lo más pronto posible en caldo tioglicolato. Este medio líquidocontiene tioglicolato de sodio que reduce el medio y lo hace anaerobio en el fondo.Siempre debe usarse medio fresco, calentar el tubo por 10 minutos (tapón de roscaflojo) en baño de agua hirviendo, y luego enfriar en agua fría. El caldo debe que-dar amarillo con una capa rosada delgada en la superficie.

196

Si la muestra se aspiró con una jeringa, debe sacarse todo el aire (que no que-den burbujas), y sellar la punta de la aguja insertando un tapón de hule.

PROCEDIMIENTO:

La muestra recién tomada, o adecuadamen-te transportada al laboratorio, debe procesarse así:

1- En primer lugar, siempre hacer un fro-te y colorearlo con Gram.

2- Sembrar la muestra por estrías en unacaja de agar sangre de carnero al 5%fresca y en el fondo de un tubo de cal-do tioglicolato (hervido y enfriado).

3- Introducir rápidamente la caja con elmedio hacia arriba y el tioglicolato enun jarro Gas-Pak limpio y seco. Abrirun sobrecito indicador de anaerobiosisy colocarlo dentro del jarro a manerade que la almohadilla con azul de metileno se vea claramente. Inmedia-tamente cortar con tijera la esquina indicada del sobre generador de hi-drógeno y CO2 (sin apacharlo), y con pipeta de vidrio (no insertarla),agregarle 10 ml de agua destilada. Colocar el sobre con la abertura haciaarriba y cerrar fuertemente el jarro con la tapadera especial y la pinza detornillo. La tapadera tiene por dentro una canastilla metálica que puededesenroscarse. Adentro debe colocarse un sobrecito de trocitos de paladioiridiado que actúa como catalítico para combinar el oxígeno dentro deljarro con el hidrógeno producido por el sobre generador y formar agua.Con el uso, el catalítico se inactiva, por lo que una vez a la semana de-ben calentarse los trocitos a 100° C por treinta minutos (en cápsula deporcelana, dentro del horno de secar material), para reactivarlo y secar-lo periódicamente.

4- Adicionalmente, toda la muestra que llega al laboratorio para cultivo deanaerobios debe sembrarse por estrías en otro agar sangre de carnero,MacConkey y manitol-sal, los cuales se incuban aeróbicamente.

Jarro Gas-Pak

H 2+C

O2

197

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

Hallazgos bacteriológicos que sugieren la presencia de anaerobios:

1- Morfología sugestiva en el Gram directo de la muestra.

2- Ausencia de crecimiento aerobio de las bacterias observadas en el Gramdirecto.

3- Crecimiento en el fondo del tioglicolato hace sospechar anaerobios. Au-sencia de crecimiento en tioglicolato no descarta definitivamente la pre-sencia de anaerobios.

4- Gas o mal olor en la muestra o el cultivo.

5- Colonias características en el agar sangre incubado en Gas-Pak.

6- Colonias negras después de incubación prolongada indican Bacteriodesmelaninogenicus; las colonias jóvenes pueden dar fluorescencia roja bajoluz ultravioleta.

La identificación hasta especie de todas las bacterias anaerobias de interésclínico es una tarea compleja y altamente especializada. Se recomienda seguir lassiguientes claves para efectuar la identificación presuntiva. En primer lugar, unainterpretación correcta y acuciosa del frote de la muestra original coloreado conGram, permite sospechar qué bacterias anaerobias se deben aislar, y en algunoscasos permite la detección de anaerobios cuyo aislamiento no se logra por algunacausa. Observar y reportar el frote Gram según lo indicado y luego correlacionarcon las bacterias anaerobias y aerobias aisladas.

Observar y registrar en el frote Gram del material clínico, lo siguiente:

1- La reacción al Gram, el tamaño, la forma y la cantidad relativa de lasbacterias presentes.

2- La presencia de esporas, su forma y posición en la célula.

3- Cualquier característica morfológica especial como ramificación pseudo-ramificación, formación de cadenas, filamentos, cuerpos esféricos o di-minutas formas granulares.

198

4- Comparar con la siguiente tabla como guía, y correlacionar con el culti-vo anaerobio.

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE ALGUNOS BACILOS ANAEROBIOSGRAM-NEGATIVO DE IMPORTANCIA MÉDICA

* Ver figura 12: Diversas Morfologías Bacterianas

INTERPRETACIÓN DEL CULTIVO

1- Después de no menos de 48 horas de incubación, destapar el jarro: An-tes de abrirlo notar que el indicador debe estar blanco y la superficieinterior del jarro con gotas de agua. Si el indicador está celeste y no hayagua de condensación, significa que no se produjo anaerobiosis y debenrevisarse los procedimientos. Notar un fuerte olor pútrido característi-

ESPECIE

Bacteroidesfragilis

Bacteroidesmelaninogenicus

Bacteroidesvariabilis

Fusobacteriumnecrophorum(Sphaerophorusnecrophorus)

Fusobacteriumfusiforme

MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA

Bacilos regulares con extremos redon-deados*, pueden ser pleomórficos (agarsangre); comúnmente vacuolados (tio-glicolato); pueden presentar cuerposesféricos en su interior.

Cocobacilos* (agar sangre); pleomórficos,vacuolados, bacilos degenerados(tioglicolato).

Bacilos pequeños con extremos redon-deados*; vacuolados.

Bacilos pleomórficos con extremos redon-deados*; esférulas y cuerpos redondeados.

Bacilos delgados con extremos adelgazadosterminados en punta; algunos o la mayoríafilamentosos (agar sangre y tioglicolato).

COLONIA

En motas, circular, en-tera y brillante.

Colonias negras enagar sangre después de4-5 días de incubación.

Colonias circulares,enteras, brillantes uopacas con bordestranslúcidos.

Umbonada (con centromás alto que el restode la colonia), opaca,con borde translúcidocircular.

Circular, entera.

199

co de los anaerobios. Descartar el indicador y el sobre generador de hi-drógeno y CO2.

2- Examinar simultáneamente la caja de agar sangre y el tubo de tioglicolato.Debe tenerse a mano el resultado de los crecimientos aerobios, ya quemuchas bacterias facultativas crecen tanto en aerobiosis como enanaerobiosis. Es de esperarse que enterobacterias, pseudomonas,estafilococos y estreptococos también crezcan en el agar sangre anaerobio,pues son facultativos. Examinar las cajas con buena luz, con lupa y mi-croscopio estereoscópico.

3- Hacer inmediatamente frote Gram y sub-cultivo en agar sangre de car-nero al 5% y en tioglicolato (hervido y enfriado) de cada tipo de coloniasque no corresponda a aerobios ya previamente identificados. Tambiénsembrar un sub-cultivo en agar sangre aerobio donde los anaerobiosverdaderos no crecen. Es muy frecuente que se encuentran en la mismamuestra dos o más anaerobios además de varios aerobios.

4- Incubar aeróbicamente el agar sangre de carnero donde se efectuó elsub-cultivo y el tioglicolato original. Si no se observa crecimiento en elagar sangre aerobio a las 24 a 48 horas, se trata verdaderamente de unanaerobio. Hacer frote Gram del crecimiento en tioglicolato y referirse ala tabla para confirmar la identificación presuntiva de los anaerobios.

5- La presencia de colonias con doble zona de beta hemólisis. Y quemicroscópicamente son bacilos gram-positivo gruesos, generalmentepoco o no esporulados, indican la presencia de Clostridium perfringens.Esta bacteria se aisla de lesiones gangrenosas y heridas contaminadascon tierra (gangrena gaseosa). Debe reportarse inmediatamente.

6- La mayoría de anaerobios que causan infección verdadera en humanosson gram-negativo, en especial Bacteroides fragilis. Identificarpresuntivamente a los anaerobios gram-negativo según la tabla que apa-rece en la página siguiente.

200

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA DE VARIOSANAEROBIOS DE IMPORTANCIA MÉDiCA

MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA

Bacilos gram-negativo, pleomóficos; se colorean pálidamentealgunos presentan cuerpos esféricos o predo minio de coco-bacilos*.

Bacilos pálidamente gram-negativo, finos con los extremos enpunta*.

Pequeños diplococos* gram-negativo, semejantes a Neisseria peromucho más pequeños.

Bacilos gram-positivo gruesos o finos que presentan esporas lascuales no se tiñen con Gram.

Cocos gram-positivo ovalados o lanceolados* con tendencia aagruparse en cadenas; semejantes a Streptococcus sp., peroanaerobios.

Cocos gram-positivo redondos con tendencia a agruparse en ra-cimos*; semejantes a Staphylococcus sp., pero anaerobios

Bacilos gram-positivo no esporulados.

Bacilos gram-positivo no esporulados, ligeramente ramificados;colonias en forma de “muelas”.

REPORTAR

Bacteroides sp.

Fusobacterium sp.

Veillonella sp.

Clostridium sp.

Peptostreptococcus sp.

Peptococcus sp.

Se aisló un baciloanaerobio gram-ne-gativo no espo-rulado.

Actinomyces sp.

* Ver figura 13: Diversas Morfologías Bacterianas

201

Fig. 13 DIVERSAS MORFOLOGÍAS BACTERIANASFig. 13 DIVERSAS MORFOLOGÍAS BACTERIANASFig. 13 DIVERSAS MORFOLOGÍAS BACTERIANASFig. 13 DIVERSAS MORFOLOGÍAS BACTERIANASFig. 13 DIVERSAS MORFOLOGÍAS BACTERIANAS

Cocos sueltos Cocos en parejas(diplococos)

Cocos en cadenas(estreptococos)

Cocos en racimos(estafilococos)

Cocos entétradas

Cocobacilos Bacilos en formade maza

(difteroides)

Bacilos con bordesredondeados

Bacilos conbordes

cuadrados

Fusobacterium sp. Vibrio sp. Spirillum sp.

Leptospira sp.Treponema sp.Borrelia sp.

202

7- En el caso de bacilos anaerobios gram-negativo, hacer un sub-cultivo enagar sangre de carnero y colocar en las primeras estrías los siguientesdiscos:

- Kanamicina (1,000 mcg)- Vancomicina (5 mcg)- Colistina (10 mcg)

La presencia de halo de inhibición indica susceptible (S), no hay halo es resis-tente (R), V = variable. Interpretar los resultados junto con otras pruebasconfirmatorias, así:

Bacteria Kanamicina Vancomicina Colistin

Bacteroides fragilis R R R

Otros Bacteroides sp. R R V

B. melaninogenicus R R V

B. ureolyticus S R S

Fusobacterium nucleolatum S R S

F. necrophorum S R S

F. mortiferum S R S

F. varium S R S

Fusobacterium sp. S R S

Se sugiere que en los laboratorios clínicos, sea el profesional microbiólogoquien efectúe la identificación definitiva o presuntiva de los anaerobios.

INFORME:

Según los criterios anteriores y otros que pueden obtenerse en literatura espe-cializada, informar las bacterias anaerobias aisladas. No se efectúa prueba de sus-ceptibilidad para anaerobios mientras no se cuente con una técnica sencilla quepueda implementarse en los diversos laboratorios de nuestro medio.

203

CAPÍTULO 18

MICOBACTERIAS

PROPÓSITO:

Demostrar por medio de coloraciones y cultivos especiales la presencia debacterias pertenecientes al género Mycobacterium especialmente Mycobacterium tu-berculosis, llamado comúnmente “BK” (Bacilo de Koch).

Este grupo de bacterias en forma de bacilo, se tiñen con dificultad por el altocontenido de grasas en su pared celular. Para lograr teñirlas deben usarse coloran-tes con fenol y/o calor. Una vez teñidas con fuchsina carbólica (fenolada) no sedecoloran con alcohol acidificado. Por esta característica muy particular se les lla-ma “bacilos alcohol-ácido resistentes” (abreviado BAAR). No usar el término “áci-do-alcohol resistentes”.

Las micobacterias son aerobios estrictos, no móviles, no poseen cápsula niproducen esporas. Su crecimiento es sumamente lento; la mayoría de las especiespatógenas crecen después de 2 a 6 semanas de incubación a 36° C en el medio deLowenstein-Jensen. Aproximadamente 12 especies de Mycobacterium se asocian ainfección humana. En nuestro medio, sin lugar a duda, M. tuberculosis es la especiemás importante. Las micobacterias en general producen granulomas destructivosde crecimiento lento, que pueden sufrir necrosis o cavitación. La detección demicobacterias es una gran responsabilidad para el laboratorio de microbiología, yaque un resultado positivo de frote o cultivo implica serias consecuencias para elpaciente y afecta su vida con un tratamiento específico por varios meses, o inclusoaños.

MUESTRAS

1. Esputo: La tuberculosis es en nuestro medio la infección humana más impor-tante causada por micobacterias. Esta infección crónica generalmente ocurreen los pulmones por la inhalación del agente causal, el cual por lo general esM. tuberculosis (muy rara vez M. bovis o M. kansasii). Por esta razón, el esputoes la muestra que con mayor frecuencia se remite al laboratorio para la inves-tigación de tuberculosis.

204

El esputo debe colectarse temprano en la mañana, inmediatamente aldespertar. De preferencia tres a cuatro muestras (seriadas) en díasalternos.

El primer esputo de la mañana es la muestra más adecuada para el análisis,pues es concentrada y menos contaminada, ya que el paciente no ha comidoo bebido durante la noche. Un sólo esputo es más adecuado que un “pool” omezcla de varias muestras.

Colectar la muestra de esputo así: el esputo, al igual que cualquier otra mues-tra para micobacterias, debe colectarse antes de iniciar tratamiento, que pue-de inhibir el crecimiento.

Indicar al paciente que al despertar se enjuague la boca dos veces con aguacorriente; no usar pasta dental o cualquier otro antiséptico.

Acostado boca abajo en su cama, el paciente debe desgarrar esputo lo másprofundamente posible; así como estar consciente de que descargasnasofaríngeas o saliva no son esputo. El esputo se produce después de unacceso de tos que expulsa material exudativo de los pulmones; 5 a 10 ml deesputo es la cantidad adecuada para análisis, pero cualquier volumen debeprocesarse.

El paciente debe depositar la muestra en un recipiente estéril de boca anchaproporcionado por el laboratorio. De preferencia deberán usarse recipientesespeciales de plástico descartables, del tipo que incluye adentro un tubo gruesopara efectuar el proceso.

El buen esputo para análisis de micobacterias es caseoso (apariencia de que-so), puede ser verdoso o amarillento. Si no se remite o procesa rápidamente,adicionar aproximadamente 0.5 g de carbonato de sodio (Na2CO3), para dis-minuir el crecimiento de contaminantes y luego debe refrigerarse o congelar-se. Se debe identificar bien la muestra con una etiqueta que tenga el nombre ynúmero de registro del paciente, la fecha y tipo de muestra.

Debido a que el exterior del recipiente puede contaminarse durante laobtención de la muestra, debe colocarse en una bolsa plástica y luego llevarseal laboratorio. Si el paciente produce muy poca cantidad de esputo, puedeexaminarse un “pool” de 24 a 48 horas de colección continua, aunque no es lodeseable.

205

En pacientes que tienen dificultad para producir esputo puede usarse variosmétodos:

a) Nebulización de solución salina hipertónica (cloruro de sodio al 10%,sin propilenglicol), es excelente para inducir la producción de esputo,generalmente diluído.

b) Los hisopos faríngeos pueden ser usados en estos pacientes para ex-traer el esputo. Especialmente este procedimiento es aconsejable paraniños pequeños a los cuales no se les puede pedir una muestra adecua-da.

c) Broncoscopía: puede ser usada para obtener las muestras directamentedel sitio infectado. Se obtienen muy buenas muestras.

2. Lavado gástrico: Frecuentemente se solicita lavado gástrico para análisis demicobacterias. No se usa para detectar tuberculosis del estómago, sirve parademostrar micobacterias del esputo que el paciente involuntariamente se hatragado.

Este procedimiento está indicado en los siguientes pacientes:

a) Con evidencia radiológica de tuberculosis pulmonar y en quienes losexámenes de esputo son negativos.

b) En pacientes que no cooperan, diciendo que no producen esputo o se lotragan.

c) Los que no pueden expectorar porque padecen de otros trastornos: es-tados de coma, enfermedad neurológica, etc.

d) En los niños en los que normalmente se hace difícil obtener la muestrade esputo.

La investigación microscópica de BAAR en lavado gástrico no es recomenda-ble como un procedimiento diagnóstico único y definitivo, pues BAAR comoM. gastri forman parte de la microbiota gástrica y no se pueden diferenciar deM. tuberculosis. Sin embargo, múltiples BAAR en contenido gástrico general-mente se correlacionan con cultivos positivos de M. tuberculosis y constituyeinformación valiosa inmediata con utilidad clínica.

206

El lavado gástrico debe ser efectuado en la mañana, cuando el estómago estávacío (por lo menos 8 horas después que el paciente ha comido o tomadomedicamentos orales), es mejor que el paciente se levante de su cama y que lamuestra se obtenga 30 minutos después de inducir esputo por nebulización.

Deben usarse sondas de Levin, jeringas estériles de 50 ml y 20 a 30 ml de aguadestilada estéril. Introducir la sonda al estómago por la nariz, inyectar el agua,succionar e inyectar de nuevo varias veces.

La muestra obtenida debe colocarse en recipiente estéril de boca ancha. Debi-do a que las micobacterias pueden destruirse rápidamente en los lavadosgástricos por la acción del ácido clorhídrico del estómago, la muestra debe serprocesada en un período de tiempo que no exceda de 20 minutos.Si por cualquier circunstancia no es posible procesarla rápidamente, es nece-sario neutralizarla, agregando carbonato de sodio al 10%, solución de fosfatotrisódico anhidro al 10%, solución de fosfato trisódico con 12 moléculas deagua al 23% o bien cristales de fosfato disódico. En todos los casos es aconse-jable usar rojo fenol como indicador para saber si el pH está entre 7 y 8. Noneutralizar las muestras que son procesadas antes de 4 horas después de ob-tenidas y mantenidas en refrigeración.

3. Orina: Se debe examinar un mínimo de tres muestras de la primera orina dela mañana colectada “al vuelo” en recipiente estéril de boca ancha (ver capí-tulo 7), o muestras obtenidas por catéter. Se debe colectar toda la orina posi-ble cada vez, algunas veces se utiliza orina colectada durante 12 a 24 horas, lacual es menos adecuada porque generalmente está muy contaminada y con-tiene menos micobacterias viables que la primera orina de la mañana. Lasmuestras deben mantenerse refrigeradas mientras se procesan lo antes posi-ble; no utilizar recipientes con preservativos.

4. Otro tipo de muestras: La tuberculosis es una infección que puede localizarseen casi cualquier parte del cuerpo, por esta razón pueden analizarse las si-guientes muestras de líquidos, exudados o tejidos:- Lavado bronquial- Fragmentos de pulmón- Hisopo faríngeo- Líquido cefalorraquídeo- Líquido pleural- Líquido articular- Pus

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- Raspado endometrial/sangre menstrual- Médula ósea- Líquido pericárdico- Trozos de varios tejidos obtenidos en autopsia- Heces (en ocasiones muy especiales)

Por lo general este tipo de muestras son obtenidas por el médico en recipien-tes estériles proporcionados por el laboratorio. Si es necesario se puede adi-cionar heparina o citrato de sodio como anticoagulantes; no usar preservati-vos o fijadores.

Es conveniente obtener un volumen grande de muestra; si la cantidad es pe-queña adicionar solución salina para evitar desecación. Si la muestra no seexamina inmediatamente debe refrigerarse.

PROCEDIMIENTO:

Baciloscopía: El diagnóstico de micobacteriosis se basa en la observación delos bacilos alcohol-ácido resistente en la muestra y su cultivo in vitro. Los bacilosalcohol-ácido resistentes deben teñirse con las coloraciones de Ziehl-Neelsen oKinyoun; ambas tinciones dan buenos resultados. La diferencia fundamental con-siste en lo siguiente: Ziehl-Neelsen sí utiliza calentamiento de la lámina y Kinyounno, además la fuchsina de Kinyoun es más concentrada.

Coloración de Ziehl-Neelsen: Preparar frotes delgados de la muestra a exa-minar. Si se trata de esputo trasladar la muestra a una caja de Petri estéril y exami-narla con buena luz sobre fondo oscuro. Con aplicadores de madera quebrados,seleccionar los fragmentos anormales (con pus verdoso, blanquesino o amarillen-to; sangre rojiza o herrumbrosa). Colocar un pequeño fragmento entre dosportaobjetos de vidrio, aplastar varias veces el esputo y luego deslizar una láminasobre otra para obtener dos frotes parejos y delgados. Escoger el mejor, dejar secary luego fijar moderadamente con calor sobre la llama del mechero (igual que parala coloración de Gram). Puede colorearse sedimento del esputo digerido/descontaminado, u otras muestras clínicas.

Procedimiento de la coloración de Ziehl-Neelsen:

1- Poner el frote ya fijado y frío en el soporte de coloración cerca del lavatrastos,colocarle encima un trozo de papel filtro para que mantenga el colorante so-bre el frote.

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12- Cubrir el papel filtro con fuchsina carbónica de Ziehl-Neelsen; debe quedarbien empapado.

13- Calentar cuidadosamente la lámina por debajo, ya sea con un mechero dealcohol o con un hisopo grande empapado en alcohol. Calentar suavementehasta el aparecimiento de humos blancos. No debe hervir. Dejar colorear elfrote por 5 minutos sin calentar más. Si la lámina se seca agregar más fuchsinasin volver a calentar.

14- Remover el papel filtro y lavar con agua corriente (usar poca presión).

15- Decolorar el frote con alcohol-ácido hasta que ya no salga más colorante rojo(aproximadamente 2 minutos). Debe insistirse en la decoloración ya que es elpaso diferencial. Los frotes gruesos requieren mayor tiempo de decoloración,pero tampoco se debe decolorar excesivamente.

16- Lavar brevemente con agua corriente.

17- Cubrir el frote con azul de metileno por 1 ó 2 minutos.

18- Lavar con agua corriente.

19- Dejar secar al aire o flamear muy brevemente, pero no secar con papel absor-bente.

10- Examinar el frote con el lente de inmersión, con cuidado de limpiar el aceitedel lente entre cada frote para no acarrear micobacterias de una muestra aotra.

11- No efectuar coloraciones simultáneas de varias muestras en recipientes deCoplin, porque también puede haber transferencia de micobacterias entre lasmuestras.

REACTIVOS PARA ZIEHL-NEELSEN

1- Fuchsina carbólica de Ziehl-Neelsen (colorante principal)Solución saturada de fuchsina básica .............................. 10 mlPreparar solución saturada de fuchsina básica así:Disolver 3 gramos de fuchsina básica en 100 ml de alcohol etílico al 95%.

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Solución acuosa de fenol al 5% ........................................ 90 mlPreparar solución de fenol al 5%, así: (Fundir los cristales de fenol en baño deMaría, medir 5 ml con probeta, (no con pipeta), y luego llevar a volumen de100 ml con agua destilada estéril.

2- Alcohol-ácido (decolorante):Acido clorhídrico concentrado ......................................... 93 mlAlcohol etílico al 95% ........................................................ 95 ml

3- Azul de metileno (colorante de contraste):Cloruro de azul de metileno ........................................... 0.3 gramosAgua destilada .................................................................. 100 ml

Según F. Ziehl (1882), y Neelsen (1885), Alemania.

COLORACIÓN DE KINYOUN:

Esta coloración da buenos resultados, comparables al Ziehl-Neelsen, si se efec-túa según la técnica exacta. Tiene la ventaja que no necesita calentamiento. Proce-der así:

1- Preparar el frote igual que para Ziehl-Neelsen y fijarlo con calor.

2- Colocar la lámina en la gradilla de coloración y dejar que enfríe. Cubrir elfrote con fuchsina de Kinyoun y dejar que se coloree por 4 minutos. No esnecesario calentar.

3- Lavar con agua corriente.

4- Decolorar el frote con alcohol-ácido hasta que ya no salga más colorante rojo.Insistir en este paso pues es el que diferencia a las bacterias.

5- Lavar con agua corriente.

6- Cubrir el frote con azul de metileno por 1 ó 2 minutos.

7- Lavar con agua corriente.

8- Dejar secar y examinar con el lente de inmersión. En general tomar las míni-mas precauciones que para la coloración de Ziehl-Neelsen.

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REACTIVOS PARA KINYOUN

1- Fuchsina carbólica de Kinyoun:Fuchsina básica .................................................................... 4 gramosFenol fundido ................................................................... 128 mlAlcohol etílico al 95% ...................................................... 120 mlAgua destilada .................................................................. 100 ml

Disolver la fuchsina en el alcohol y luego adicionar el agua lentamente conagitación. Fundir cristales de fenol en baño de agua caliente a 56° C, medircon pipeta 8 ml y adicionar a la fuchsina.

2- Alcohol ácido: igual al de Ziehl-Neelsen (ácido clorhírico concentrado: 3 ml,más alcohol etílico al 95%: 97 ml)

3- Azul de metileno: igual al de Ziehl-Neelsen (0.3 gramos de cloruro de azulde metileno, disolver en 100 ml de agua destilada).Según Kinyoun: Am. J. Pub. Health, 5: 867, 1915.

INTERPRETACIÓN E INFORME DE BACILOSCOPIAS:

La característica de “alcohol-ácido resistencia” típica de las micobacterias haceque la baciloscopía tenga una importancia fundamental. Se usa para seguir el cursodel tratamiento y para dar de alta al paciente en el hospital, para continuar su tra-tamiento ambulatorio.

Tomar muy en cuenta las siguientes consideraciones:

1- Sin excepción alguna, utilice la siguiente clave para reportar todos los fro-tes para micobacterias. Esta forma de reportar ha sido estandarizada por laAsociación Nacional de Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias de Esta-dos Unidos, con el objeto de poder comparar resultados de distintos labora-torios y orientar adecuadamente al médico.

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REPORTE DE FROTES PARA MICOBACTERIAS

2- Un frote para diagnóstico de tuberculosis o cualquiera otra micobacteriosisdebe examinarse de 10 a 15 minutos antes de darse por negativo. Si se tratade L.C.R. debe observarse aún por más tiempo.

3- La especie del microorganismo alcohol-ácido resistente no puede determi-narse sólo por la morfología microscópica, debe hacerce por cultivo. Sin em-bargo, algunas características pueden orientar, por ejemplo:

Nocardia spp. frecuentemente produce ramificaciones y Mycobacterium kansasiipuede formar células largas y anchas, con coloración en bandas.

4- La característica alcohol-ácido resistente de un microorganismo puede variarcon la edad del cultivo o exposición a drogas.

5- Con el lente de inmersión, Mycobacterium tuberculosis aparece típicamente comobacilos bien definidos, ligeramente curvos, de color rojo brillante (se apreciamejor con luz intensa). Pueden aparecer con coloración discontinua en formade varios gránulos de color rojo más intenso, observar con atención gránulosrojos en la preparación ya que pueden ser parte de un BAAR.

6- En el frote pueden aparecer artefactos alcohol-ácido resistentes, especialmen-te si el frote es grueso o no fue suficientemente decolorado. Sólo bacilos biendefinidos deben considerarse BAAR.

7- En caso que se observen muy escasos BAAR debe repetirse el frote. Si el frote

NÚMERO DE BACILOSALCOHOL-ÁCIDO RESISTENTE

0

1 a 2 en todo el frote

3 a 9 en todo el frote

10 ó más en todo el frote

1 ó más por campo

REPORTE

No se observan bacilos alcohol-ácido resistentes

Informar el número de BAAR encontrados y pedirnueva muestra

+ o escasos

++ o regular cantidad

+++ o abundantes

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es muy grueso es probable que se desprenda de la lámina durante la coloración,por esto debe evitarse la transferencia de BAAR de una preparación a otrapor medio de aceite de inmersión, lentes sucios o colorantes.

18- Ocasionalmente, la buena selección de las partes anormales de la muestrapara preparar el frote puede dar resultados mucho mejores que el uso de con-centraciones.

19- Puede ocurrir que la misma muestra sea negativa por frote, pero positiva porcultivo, ya que la baciloscopía es menos sensible para detectar micobacteriasque el cultivo.

10- Nunca dejar el azul de metileno por más tiempo del indicado: 1 ó 2 minutos.

11- A veces es difícil distinguir los artefactos acidófilos (rojos) de verdaderos ba-cilos alcohol-ácido resistentes. La observación de “cuerpos esféricos alcohol-ácido resistentes” debe mencionarse como “sospechosa”. Los “gránulos deMuch” son micobacterias, sin pared celular (esferoplastos), son gram-positi-vo y no alcohol-ácido resistentes.

12- La liberación irregular de micobacterias de los focos endotraquiales puededar frotes positivos y negativos en el mismo paciente.

13- Los BAAR observados no presentes originalmente en la muestra, pueden pro-venir del agua del chorro, colorantes contaminados, recipientes o deportaobjetos sucios.

CULTIVO PARA MICOBACTERIAS

Los procedimientos para obtener el crecimiento in vitro de las microbacteriasson especializados; deben seguirse estrictamente las instrucciones para tener éxitoen su recuperación. Por lo general, las muestras para cultivo de micobacterias con-tienen muchas bacterias de las microbiotas, especialmente el esputo que siempre secontamina con microbiota de la boca. Además el esputo es una muestra difícil demanipular por su mucosidad, tenacidad y adherencia. Por estas razones para sucultivo, el esputo debe digerirse para hacerlo líquido y descontaminarse; es decir,darle algún tratamiento químico para destruir las bacterias contaminantes que cre-cen rápido, pero sin destruir a las micobacterias.

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DIGESTIÓN Y DESCONTAMINACIÓN DE ESPUTOS

Para efectuar la digestión/descontaminación de esputos pueden usarse dosmétodos:

a- Método convencional de hidróxido de sodiob- Método de N-acetil-levo-cisteína (NALC)

El método de hidróxido de sodio es muy fuerte y destruye un porcentaje con-siderable de micobacterias. Por esa razón, debe hacerse todo lo posible paraimplementar la técnica de NALC. El método de la acetil-cisteína proporciona ma-yor porcentaje de aislamiento de micobacterias pero su desventaja consiste en ladificultad de conseguir esta sustancia química en nuestro medio. La N-acetil levo-cistenía (NALC), puede obtenerse de las siguientes compañías:

a- BBL, Cockeysville, Maryland, USA.b- Mead Johnson Research Center, Evansville, Indiana, USA.c- Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA.

La NALC digiere el moco del esputo por ruptura de las uniones disalfuro dela mucina y además destruye las bacterias comunes sin dañar a las micobacterias.

Al procesar esputos u otras muestras para cultivo, debe hacerse con sumocuidado y dentro de una campana bacteriológica. Descartar todo el material conta-minado en recipientes con fenol al 5 por ciento. Evitar los aerosoles que se produ-cen al flamear las asas; introducirlas antes de flamear dentro de un recipiente conalcohol y arena en el fondo (el alcohol debe quedar 2.5 cms por encima de la arena).

Método de digestión/descontaminación con N-acetil-levo-cisteína (NALC).(Según Kubica et al. Am. Rev. Respir. Dis. 89:284, 1964)

1- El reactivo para digerir/descontaminar es inestable pues es inactivado poroxígeno, iones de metales pesados y hemoglobina. Por esta razón, el reactivodebe prepararse diariamente y sólo dura un día. Si sobra solución NALC,puede guardarse en frasco bien cerrado y usarse al día siguiente, pero nuncaal tercer día después de preparada. El polvo de NALC debe mantenerse refri-gerado. Debe prepararse sólo la cantidad de solución que se usará en un díamezclando los tres componentes así:

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Cantidad a NaOH al 4% Citrato de sodio Polvo de NALCpreparar estéril al 2.9% estéril (refrigerado)

125 ml 12.4 ml 12.5 ml 0.125 g

150 ml 25 ml 25 ml 0.25 g

100 ml 50 ml 50 ml 0.5 g

Las soluciones individuales deben prepararse así:

- Hidróxido de sodio Na0H al 4% (1N): Disolver 40 g de hidróxido desodio para análisis en 1 litro de agua destilada. Autoclavear y guardar atemperatura ambiente. Si precipita descartar.

- Citrato de sodio al 2.9% (0.1M): Disolver 29.4 g de citrato de sodioanhidro en 1 litro de agua destilada. Autoclavear y guardar a tempera-tura ambiente. Si precipita descartar.

2- Colectar la muestra de esputo según lo indicado. Transferir aproximadamen-te 10 ml a un tubo plástico, descartable de 50 ml. Esto debe hacerse bajo unacampana bacteriológica. Limpiar la superficie de trabajo periódicamente, condesinfectante.

3- Agregar un volumen igual del reactivo de acetil-cisteína, pero no más que elvolumen de esputo. Si el esputo es muy escaso o mucoso agregar el NALCdirectamente al recipiente de colección y luego pasar al tubo.

4- Tapar bien el tubo, y agitar bien en agitador “vortex” de 5 a 20 segundos ohasta que el esputo se digiera. La agitación demasiado violenta puede desna-turalizar el reactivo NALC.

5- Dejar en reposo exactamente 15 minutos a temperatura ambiente, para que lamuestra se descontamine.

6- Llenar el tubo con agua destilada estéril, hasta que el nivel del líquido quede12 mm por debajo del borde. Tapar el tubo y agitar por inclinación para mez-clar bien.

7- Centrifugar a 3,000 rpm (1800 a 2400 g) por 15 minutos.

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18- Decantar el tubo a manera de guardar el sedimento (sobre un recipiente condesinfectante, formol al 10%). Flamear la boca de los tubos para evitar conta-minación.

19- Con una pipeta serológica estéril, adicionar al sedimento 1.0 ml de albúminabovina al 0.2% (aproximadamente 20 gotas), mezclar bien a mano. Efectuarasépticamente un frote si este no se ha hecho de esputo original, colorear conZiehl-Neelsen o Kinyoun.

10- Con pipeta capilar estéril, inocular dos gotas del sedimento con albúmina enla superficie de un tubo (dos de preferencia según disponibilidad), de mediode cultivo Lowenstein-Jensen.

11- Colocar los tubos dentro de la incubadora a 36° C, inclinados de manera quela superficie del medio quede totalmente horizontal por 1 a 2 días para distri-buir bien el inóculo; luego incubar verticalmente en gradilla.

12- De preferencia colocar a cada tubo un capuchón de cartulina negra para evi-tar que al cultivo le de la luz. Dejar el tapón de rosca ligeramente flojo.

DIGESTIÓN/DESCONTAMINACIÓN DE ESPUTOS POR EL MÉTODOCONVENCIONAL DE HIDRÓXIDO DE SODIO

Este procedimiento es muy utilizado, pero el porcentaje de recuperación demicobacterias es menor que el que se obtiene con el método de la acetil-cisteína.Utilizar este método sólo si no se consigue el polvo de NALC.

1- Trasladar asépticamente el esputo a una caja de Petri, sobre fondo oscuro.Con dos aplicadores con las puntas quebradas, seleccionar las porciones anor-males del esputo (pus, sangre, etc.).

2- En un tubo de centrífuga grande, colocar una fracción anormal del esputo.Adicionar igual volumen de hidróxido de sodio al 3.5% con 0.004% de rojofenol. Agitar vigorosamente por 10 minutos, de preferencia en máquinahomogenizadora.

3- Centrifugar el tubo a 3,000 rpm por 20 minutos.

4- Decantar cuidadosamente el sobrenadante sobre un recipiente con desin-fectante.

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5- Con pipeta Pasteur estéril, adicionar lentamente ácido clorhídrico 2N, hastaobtener un color amarillo definitivo.

6- Neutralizar el sedimento con unas pocas gotas de hidróxido de sodio al 3.5%hasta un punto final con un color rosado débil.

7- Inocular un tubo del medio de Lowenstein-Jensen con dos asadas del sedi-mento.

8- Incubar a 36° C según lo indicado.

Reactivos para la técnica de digestión/descontaminación con Na0H:

1- Hidróxido de sodio al 3.5% con 0.004% rojo fenol:

Pesar 35 gramos de hidróxido de sodio para análisis, colocar las lentejas yapesadas dentro de un balón aforado de 1 litro. Poner el balón en baño de aguafría, y adicionar lentamente agua destilada con agitación constante hasta casillegar a la marca. Dejar enfriar y luego aforar exactamente a la marca de unlitro. Pesar 0.04 g (40 mg) de rojo fenol en polvo. Adicionarlo al hidróxido ymezclar bien hasta obtener una solución rosado fuerte.

2- Acido clorhídrico 2N:

Medir 16 ml de ácido clorhídrico concentrado en el fondo de un balón aforadode 1 litro. Adicionar lentamente agua destilada hasta aforar a la marca de 1litro.

Procedimiento de digestión/descontaminación para esputos de pacientes cuyasmuestras están constantemente contaminadas con Pseudomonas sp. o Proteus sp:

1- Agregar al esputo un volumen igual de ácido oxálico al 5% (si no se cuentacon este reactivo usar ácido sulfúrico al 4%).

2- Mezclar en agitador vortex y dejar en reposo 30 minutos a temperatura am-biente, con agitación ocasional.

3- Agregar solución salina estéril para bajar el peso específico y diluir el ácido.

4- Centrifugar a 3,000 rpm (1800 a 2400 g) por 15 minutos.

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5- Decantar el líquido sobrenadante y neutralizar el sedimento con NaOH al3.5% con 0.004% de rojo fenol.

6- Inocular dos asadas del sedimento en Lowenstein-Jensen.

Procedimiento para lavados gástricos

Si el material es mucoide:

1- Agregar una pizca (50 a 100 mg) de polvo NALC a 20-50 ml del lavado gástrico.

2- Mezclar manualmente en agitador vortex.

3- Centrifugar a 3,000 rpm por 30 minutos.

4- Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 2 a 5 ml de aguadestilada estéril.

5- Agregar un volumen igual de la solución NALC-NaOH y proceder igual queesputo.

Si el material es fluido:

1- Centrifugar toda la muestra por 30 minutos a 3,000 rpm.

2- Decantar el líquido sobrenadante y resuspender el sedimento en 2 a 5 ml deagua destilada estéril. Unir todos los sedimentos si se centrifugan varios tu-bos.

3- Agregar igual volumen de la solución NALC-NaOH y proceder igual queesputo.

Procedimiento para orina:

1- Centrifugar toda la muestra de la primera orina de la mañana por 30 minutosa 3,000 rpm. Puede ser necesario utilizar varios tubos estériles.

2- Decantar los sobrenadantes, y unir los sedimentos.

3- Agregar al sedimento igual volumen de ácido sulfúrico al 4%.

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4- Mezclar y dejar en reposo por exactamente 15 minutos.

5- Llenar el tubo con agua destilada estéril.

6- Centrifugar a 3,000 rpm por 15 minutos.

7- Decantar el sobrenadante y agregar al sedimento unas gotas de albúminabovina al 0.2%.

Procedimiento para hisopo faríngeo:

1- Trasladar el hisopo con pinzas flameadas a un tubo de centrífuga estéril (sólola punta).

2- Agregar 2 ml de agua destilada estéril o solución salina estéril.

3- Agregar 2 ml de la solución digestora NALC-NaOH.

4- Agitar en agitador vortex.

5- Dejar en reposo 15 minutos.

6- Remover el hisopo del tubo con pinzas flameadas.

7- Llenar el tubo con agua destilada estéril hasta 12 mm del borde.

8- Centrifugar 15 minutos a 3,000 rpm y continuar el procedimiento como esputo.

Procedimiento para tejido o piel:

1- Utilizar macerador de tejidos o mortero estéril para triturar la muestra asép-ticamente en solución salina estéril. Si el tejido es mucoso (por ejemplo pul-món), adicionar una pizca de polvo NALC. Si se desea investigar hongos pató-genos es mejor no triturar, mejor cortar en pedazos finos con tijeras estériles.

2- Si la muestra fue colectada asépticamente, inocular directamente un pequeñotrozo en Lowenstein-Jensen.

3- Si el tejido no ha sido colectado asépticamente, colocar el macerado en untubo estéril y procesar como esputo.

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Procedimiento para otros fluidos corporales:

Si el material es muco-purulento:

1- Procesar igual que esputo si el volumen es de 10 ml o menos.

2- Si el volumen es mayor de 10 ml, proceder como lavado gástrico mucoso.

Si el material es fluido:

1- Si el material se obtuvo asépticamente, centrifugar o inocular el sedimentodirectamente en Lowenstein-Jensen.

2- Si el material no se obtuvo asépticamente, proceder como esputo si el volu-men es menor de 10 ml, si es mayor procesar como lavado gástrico fluido.

3- Efectuar procedimientos especiales para aislamiento de micobacterias de san-gre o heces fecales, debe justificarse plenamente y por lo general no se efec-túa. Médula ósea: sembrar directamente en Lowenstein-Jensen.

INTERPRETACIÓN DEL CULTIVO

Examinar los tubos con lupa o microscopio estereoscópico y buena luz, a los 5días después de inoculados, y luego una vez por semana, los días lunes, para ob-servar crecimiento. Los tubos negativos deben incubarse hasta 6 a 8 semanas, a36° C, antes de ser descartados como negativos. Debe reportarse como negativo alas 6 semanas; si hay crecimiento posterior debe modificarse el reporte.

Las micobacterias pueden producir en el medio de Lowenstein-Jensen dostipos de colonias:

- Eugónicas: Colonias secas, superficie rugosa, bordes irregulares colorcrema amarillento. Son típicas de la mayoría de micobacterias especial-mente M. tuberculosis. M. kansasii es menos rugoso.

- Disgónicas: Colonias brillantes de superficie lisa y bordes enteros típi-cas de Mycobacterium bovis y Mycobacterium avium-intracelulare. Al ob-servarse estos tipos de crecimiento en el tubo de Lowenstein-Jensen depreferencia observados con microscopio estereoscópico, hacer frote enuna gota de solución salina o colorear con Ziehl-Neelsen.

220

Si se observan colonias eugónicas de color crema formadas por bacilosalcohol-ácido resistentes (las cepas más virulentas con “factor cordón”:forman cordones sinuosos de bacilos agrupados paralelamente), y noproduce pigmento, presuntivamente se trata de Mycobacterium tubercu-losis.

Reportar el crecimiento observado cuantitativamente según esta tabla:

Número de colonias Reporte de cantidad

No se observan colonias Negativo para Mycobacterium tuberculosis

Menos de 50 colonias Mencionar el número de colonias

50-100 colonias + ( 1 + )

100-200 colonias ++ ( 2 + )

Casi confluente (200-500) +++ ( 3 + )

Confluente (más de 500) ++++ ( 4 + )

Por ejemplo si el tubo de Lowenstein-Jensen presenta el crecimiento de 70colonias eugónicas de BAAR, identificadas como M. tuberculosis por niacina, e in-formar:

Se aisló Mycobacterium tuberculosis +.

Identificar M. tuberculosis por las siguientes características:

1- Crecimiento lento de colonias eugónicas no pigmentadas en Lowenstein-Jensen que crecen entre 4 y 7 semanas.

2- El Ziehl-Neelsen de estas colonias revela BAAR cortos, ligeramentecurvos de coloración sólida, a veces agrupados en cordones.

3- Confirmar con la reacción de producción de niacina positiva.

Prueba de niacina:

La producción de la vitamina niacina (ácido nicotínico) en el medioLowenstein-Jensen es típica de M. tuberculosis. Las otras micobacterias son niacinanegativo, por lo que con esta única prueba se logra una diferenciación adecuada.Esta diferenciación se conoce desde 1955 según Konno et al. (Science, 124: 985, 1956y Am. Rev. Resp. Dis. 75: 529, 1957).

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Las colonias eugónicas no pigmentadas sobre el medio, producen niacina lacual se difunde hacia el medio. La niacina se produce lentamente al igual que sedesarrollan las colonias. Por esta razón, la prueba sólo puede hacerse en cultivospuros que tengan de 50 a 100 colonias (1 +), y de 3 a 4 semanas de incubación.

Se utiliza un procedimiento sencillo de extracción de la niacina que se en-cuentra en el medio (no en las colonias), la cual luego se identifica por la produc-ción de un color amarillo en las tiras que contienen los reactivos químicos adecua-dos. Proceder así si el cultivo llena los requisitos mencionados:

1- Al tubo de Lowenstein-Jensen, con un cultivo puro de colonias eugónicas(50 a 100) no pigmentadas y 3 a 4 semanas de incubación, agregar 1.5 mlde agua destilada estéril o solución salina estéril. No usar cultivos con-taminados que presentan coloración azul en el Lowenstein-Jensen.

2- Con el asa espatulada o pipeta capilar, cortar profundamente varias ve-ces el medio de cultivo dentro del tubo, para que el agua o soluciónsalina penetre y extraiga la niacina.

3- Inclinar el tubo sobre algún soporte, de manera que la superficie delmedio quede horizontal y cubierta de líquido.

4- Dejar el tubo en reposo en esta posición por 30 minutos.

5- Colocar el tubo verticalmente en una gradilla con mucho cuidado,succionar aproximadamente 0.6 ml de extracto con pipeta Pasteur ybulbo. Pasarlo al fondo de un tubo 13 X 75 mm con tapón de rosca.Marcar el tubo con el número de muestra.

6- Como control negativo, pipetear 0.6 ml del agua o solución salina utili-zada para hacer el extracto en otro tubo 13 X 75 mm. Marcar el tubo“control negativo”.

7- Con pinzas flameadas, dejar caer en ambos tubos una tira reactiva deniacina (DIFCO 3182-30-8, Bacto-TB Niacina Test Strips), de manera quela flecha indicadora quede apuntando al fondo del tubo; tapar los tubosinmediatamente. Mantener las tiras en refrigeración.

8- Agitar los tubos suavemente; repetir esta agitación suave de 5 a 10 mi-nutos.

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9- Después de 12 a 15 minutos, pero no después de 30 minutos, compararel color de los extractos.

10- Interpretación: la prueba de niacina es positiva si aparece color amari-llo en el extracto de la muestra, y el control negativo no presenta color.Autoclavear los tubos con extractos de muestras.

Si el cultivo en Lowenstein-Jensen presenta crecimiento de coloniaspigmentadas (amarillo-anaranjado), o de crecimiento rápido (antes de 5 días), oniacina negativo, se debe sospechar de otras especies “atípicas” del géneroMycobacterium o más correctamente de los grupos de Runyon.

En Guatemala son mucho menos frecuentes que Mycobacterium tuberculosis.En este caso el personal técnico deberá entregar el cultivo al microbiólogo a cargodel laboratorio, quien clasificará el BAAR aislado en alguno de los cuatro gruposde Runyon por medio de pruebas especiales.

Grupos de Runyon (micobacterias “atípicas”):

Grupo I:Fotocromógenos: producen pigmento sólo cuando el cultivo se expone a la luz. Enla obscuridad producen colonias sin pigmentación, son de crecimiento lento. Ejem-plos: Mycobacterium kansasii y Mycobacterium marinum (crece a 30°C).

Grupo II:Escotocromógenos: producen pigmento tanto en la oscuridad como en la luz y sonde crecimiento lento. Ejemplo: Mycobacterium scrofulacem, que causa adenopatíacervical en niños.

Grupo III:No fotocromógenos: no producen pigmento y son de crecimiento lento. Ejemplo:Mycobacterium avium-intracelulare.

Grupo IV:Crecedores rápidos: se caracterizan por crecer antes de 7 días de incubación. Ejem-plo: Mycobacterium fortuitum, puede causar tuberculosis resistente a varias drogas.

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Esta publicación fue impresa en los talleresgráficos de Editorial Serviprensa C.A. deGuatemala, C.A. en el mes de septiembrede 1996. Esta edición consta de 1,000ejemplares en papel bond 80 gramos.