Manual Práctico - de Parasitología Veterinaria - Dehesa - UEx

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Manual Prácticode Parasitología Veterinaria

Colección manuales uex - 69

Unidad de Parasitología. Dpto. de Sanidad AnimalFac. de Veterinaria. Universidad de Extremadura

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(E.E.E.S.)

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MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA

PORTADA ÍNDICE

69MANUALES UEX

(E.E.E.S.)EspacioEuropeoEducaciónSuperior

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FRANCISCO J. SERRANO AGUILERA (COORD.)

2010

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MANUAL práctico de parasitología veterinaria / Francisco Javier Serrano Aguilera (Coord.). — Cáceres : Universidad de Extremadura, Ser-vicio de Publicaciones, 2010120 pp. ; 17 x 24 cm. – (Manuales UEX, ISSN 1135-870-X ; 69)ISBN 978-84-7723-910-91. Parasitología veterinaria. I. Serrano Aguilera, Francisco Javier. II. Tít. III. Universidad de Extremadura, Servicio de Publicaciones, ed.576.89

Edita:

Universidad de Extremadura. Servicio de Publicaciones C/ Caldereros, 2 - Planta 2ª. 10071 Cáceres (España) Tel. 927 257 041 ; Fax 927 257 046 E-mail: [email protected] http://www.unex.es/publicaciones

ISSN 1135-870-XISBN 978-84-7723-910-9Depósito Legal M-16.788-2010

Impreso en España - Printed in Spain Maquetación, fotomecánica e impresión: Dosgraphic, s.l. – 914 786 125

© Los autores.© Universidad de Extremadura, para esta 1ª edición.

Cualquier forma de reproducción, distribución, comunicación pública o transformación de esta obra sólo puede ser realizada con la autorización de sus titulares, salvo excepción prevista por la ley. Diríjase a CEDRO (Centro Español de Derechos Reprográficos, www.cedro.org) si necesita fotocopiar o escanear algún fragmento de esta obra.

La publicación del presente manual forma parte de las “Acciones para el Desarrollo del Espacio Europeo de Educación Superior en la Universidad de Extremadura Curso 2008/09” en el marco de la VI Convocatoria de Acciones para la Adaptación de la UEX al Espacio Europeo de Educación Superior (Proyectos Pilotos: modalidad A1) del Vicerrectorado de Docencia e Integración Europea y financiada por la Junta de Extrema-dura, el Ministerio de Educación y Ciencia y la Universidad de Extremadura.

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Dr. Francisco Javier Serrano Aguilera

Dra. Eva María Frontera Carrión

Dr. Luis Carlos Gómez Nieto

Dr. Miguel Ángel Habela Martínez-Estéllez

Dr. Juan Enrique Pérez Martín

Dr. David Reina Esojo

Ldo. Rafael Calero Bernal

Dr. Jesualdo Carcelén Rodríguez

Ldo. Javier Fernández Cotrina

Ldo. José Antonio Gamito Santos

Dra. Virginia Iniesta Orozco

Ldo. Francisco Javier Pariente Palomino

Ldo. Isidro Suárez López

Técnico. Esp. Lab. Manuel Gómez Blázquez

Técnico Lab. Isabel Monroy Pérez

Técnico Lab. Victoria Baz Agudo

Técnico Lab. Pablo Pajares del Sol

AUTORES

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La asignaturas que actualmente imparte nuestro grupo docente tienen un marcado carácter experimental y práctico, en el que son imprescindibles la adquisición de diversas competencias y destrezas prácticas por parte del alumno, que después deberán aplicar en su quehacer profesional.

Sin embargo, estas competencias se basan con frecuencia en un conocimiento, que debido a las limitaciones de tiempo, no es posible adquirir previamente a la práctica que lo requiere. Esta dificultad, se dificultan aún más nuestra adaptación al Proceso de Bolonia, y su filosofía tendente a primar más la adquisición de habilidades que los conocimientos exhaustivos, lo que sin duda puede tener efectos positivos, pero también plantea retos docen-tes importantes.

La dificultad para conjuntar conocimiento y práctica, requiere que los alumnos puedan acceder en tiempo real y de forma efectiva, a fuentes de información que puedan que facili-ten la adquisición de las habilidades y destrezas que en ese momento están desarrollando, y que esta misma información le permita valorar la utilidad y alcance de la competencia que está adquiriendo. Por ejemplo, adquirir destreza para encontrar un parásito microscópico es difícil si no se dispone de una información básica sobre la morfología del parásito que va a identificar, y si esto es posible, será una competencia falta de interés y utilidad para el alumno, si carece de la información necesaria para comprender la relevancia y repercusiones de ese diagnóstico en su practica profesional.

Una forma de proporcionar esta información adicional a las clases magistrales, cada vez más necesaria, la ofrecen sin dudas las llamadas nuevas tecnologías, pero en entornos como el laboratorio de prácticas, la consulta veterinaria o las prácticas de campo, no es la mejor opción. Una guía o manual de prácticas sigue siendo una fuente de información imprescindible e insustituible para el desarrollo de las mismas, especialmente, en asignaturas como la Parasitología y las Enfermedades Parasitarias, que requieren un abundante material iconográfico.

El manual está diseñado para que sea una fuente de consulta útil para los alumnos de las dos asignaturas troncales, antes citadas, así como para la asignatura optativa de Diagnóstico y Clínica de las Enfermedades Parasitarias, por la ventaja que supone tener la información unificada en materias tan relacionadas, así como por la economía de medios que lleva im- plícita. El manual se divide en tres partes principales. La primera está dedicada a la Para-sitología, de mayor interés para los alumnos de la asignatura del mismo nombre, donde se describen los principales grupos taxonómicos de los parásitos y especies más representati- vas, con así abundantes fotografías y dibujos esquemáticos que revelen sus características morfológicas y biológicas principales. El objetivo principal de este capítulo es que el alumno sea capaz de identificar y reconocer la morfología de los principales parásitos, así como

PRÓLOGO

F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA…MA

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asociarlos a unos hospedadores y vías de contagio concretos. La segunda parte, dedicada a las Enfermedades Parasitarias, recoge especialmente la metodología de tomas de muestras y técnicas diagnósticas que permitirán al alumno que éste sea capaz diagnosticar correcta-mente las enfermedades parasitarias. La parte final recoge material iconográfico y anexos de interés común para todos los alumnos.

Por último, queremos agradecer al Vicerrectorado de Calidad y Formación Continua por su Plan de Adaptación de la UEx al Espacio Europeo de Educación Superior, que ha hecho posible la edición de este libro.

Junio de 2009

Unidad de ParasitologíaDepartamento de Sanidad Animal

Facultad de VeterinariaUniversidad de Extremadura

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ÍNDICE

ÍNDICE GENERAL

PRÓLOGO 9

I. PARASITOLOGÍA 13

Reino protozoa 14

Reino animalia 21Phylum Plathyhelmintes 21Phylum Nematoda 31Phylum Arthropoda 40

II. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO 45

1. Toma de muestras y envío al laboratorio 46

2. Examen coprológico 47

3. Examen de sangre 56

4. Examen de tejido muscular 61

5. Examen de piel 64

6. Examen de vísceras 65

7. Examen de orina y secreciones 67

8. Realización y examen de biopsias 68

9. Diagnóstico inmunológico 70

III. LÁMINAS DE IDENTIFICACIÓN 75

IV. LÁMINAS DE LESIONES 81

ANEXO 1. TAXONOMÍA 89

ANEXO 2. PRINCIPALES GÉNEROS PARÁSITOS SEGÚN HOSPEDADORES Y LOCALIZACIONES ORGÁNICAS 103

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I. PARASITOLOGÍA


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REINO PROTOZOA

SUBREINO BICILIATA Phylum Euglenozoa Clase Kinetoplastea Orden Trypanosomatida Familia Trypanosomatidae Géneros Trypanosoma y Leishmania

Morfología en Trypanosomatidae 1) Nucleo; 2) Kinetoplasto; 3) Flagelo; 4) Membrana ondulante.

Trypanosoma brucei (tripomastigote). Leishmania infantum (amastigote).

Amastigote

Promastigote

Epimastigote Tripomastigote

1

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4


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REINO PROTOZOA

SUBREINO BICILIATA Phylum Myzozoa Clase Conoidasida Orden Eucoccidiorida Suborden Eimeriorina Familia Eimeriidae Géneros Eimeria, Isospora y Cystoisospora

Dibujo esquemático de los oquistes de Eimeria (A) e Isospora (B) y ciclo evolutivo del género Eimeria.

Dibujo e imagen microscópica de oquistes esporulados de Eimeria sp. y Cystoisospora sp. esporulando.

Opérculo Micropilo

Esporozoito Merozoito

MEROGONIA

GAMETOGONIA

ESPOROGONIA

Ooquiste

Microgameto

Macrogameto

A B

esporocistoesporozoito

gránulo polar

residuo ooquísticoresiduo esporocístico

Cuerpo de Stieda

Glóbulo refractil


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REINO PROTOZOA

SUBREINO BICILIATA Phylum Myzozoa Clase Conoidasida Orden Eucoccidiorida Suborden Eimeriorina Familia Cryptosporidiidae Género Cryptosporidium

Ciclo de Cryptosporidium sp.

Ooquistes de Cryptosporidium sp. (Heine). Ooquistes de Cryptosporidium sp. (Ziehl-Neelsen).

esporozoitomerozoitos I

macrogameto

merozoitos II

meronte IItrofozoito meronte I ooquiste

medio ambiente

microgamentos

microgametocito ooquiste esporulado

Infección endógena (autoinfección)


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REINO PROTOZOA

SUBREINO BICILIATA Phylum Myzozoa Clase Conoidasida Orden Eucoccidiorida Suborden Eimeriorina Familia Sarcocystidae Géneros Sarcocystis y Toxoplasma Suborden Adeleorina Familia Hepatozoidae Géneros Hepatozoon

Ciclo evolutivo de Sarcocystis miescheriana.

Quiste de Sarcocystis miescheriana (corte histológico teñido con hematoxilina-eosina).

Hepatozoon canis (gametocitos).

Hospedador definitivo

Hospedador intermediario

Esporocistos libres


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REINO PROTOZOA

SUBREINO BICILIATA Phylum Myzozoa Clase Aconoidasida Orden Haemospororida Familia Plasmodiidae Géneros Plasmodium y Haemoproteus

1 2 3 4

5 6 7 8

Dibujo esquemático de algunas de las formas evolutivas del género Plasmodium en frotis sanguíneos:• Plasmodium malarie: trofozoito (1), esquizonte (2), esquizoitos y cuerpo residual dentro del eritrocito (3)

y libres (4), gametocito ♀ (5) y ♂ (6).• Plasmodium falciparum: gametocito ♀ (7) y ♂ (8).

Haemoproteus columbae (gametocito). Plasmodium sp. (varias formas evolutivas).

1

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REINO PROTOZOA

SUBREINO BICILIATA Phylum Myzozoa Clase Aconoidasida Orden Piroplasmorida Superfamilia Babesioidea Familia Babesiidae Género Babesia

Ciclo biológico de Babesia caballi.

Babesia caballi (piroplasmas).

Gametogonia

intestino

Hospedador invertebrado (garrapata)

Zigoto

Gametos

Gametocitos

Esporocineto

Esporozoito

Esporogonia

Merogonia

Merozoito

Huevo

Larva

Ninfa

Adulto

IntestinoMusculaturaEpidermisT. Malpigi

Glándulas salivares

Hemolinfa


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REINO PROTOZOA

SUBREINO BICILIATA Phylum Myzozoa Clase Aconoidasida Orden Piroplasmorida Superfamilia Babesioidea Familia Theileriidae Género Theileria

Ciclo biológico de Theileria annulata.

Theileria annulata (piroplasmas).

Glándulas salivares

Gametogonia

esporocineto

Merogonia

Esporogonia

linfocito

cigoto

eritrocito

merozoito

intestino


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REINO ANIMALIA

SUBREINO BILATERIA Phylum Plathyhelminthes Infraphylum Trematoda Clase Digenea Género Fasciola

Fasciola hepatica. Tinción con carmín acético y dibujo esquemático:

• Aparato de fijación: ventosa oral (vo) ventosa ventral o acetábulo (ac). Aparato digestivo: Boca (rodeada por la vo), faringe muscular (no representada), esófago e intestinos ciegos ramificados (líneas negras).

• Aparato reproductor masculino: 2 testículos (te) ramificados, conductos eferentes (ce), conducto defe-rente (cd), bolsa del cirro con vesícula seminal interna y cirro rodeado de glándulas prostáticas (ci) y poro genital (pg).

• Aparato genital femenino: ovario (ov) ramificado, unido mediante un oviducto al ootipo (oo), rodeado de glándulas de Mehlis (gm) al que también desembocan las glándulas vitelógenas (vi) mediante conductos vitelógenos o viteloductos (vd) transversales, longitudinales y medios. Del ootipo parte el útero y metra-termo (ut), repleto de huevos (h) que desemboca en el poro genital (pg) antes citado.

vo

ac pg

ov

oo ut

h

vd

vi

gm

ce

te

ci

cd

in


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REINO ANIMALIA

SUBREINO BILATERIA Phylum Plathyhelminthes Infraphylum Trematoda Clase Digenea Género Dicrocoelium

Dicrocoelium dendriticum. Dibujo esquemático y tinción con carmín acético:

Se identifican fácilmente ventosa oral (vo), ventosa ventral o acetábulo (ac), testículos (te) ramificados, bolsa del cirro y cirro (ci), poro genital (pg), ovario (ov), ootipo (oo), glándulas vitelógenas (vi) y útero y repleto de huevos embrionados en su parte final (detalle). El aparato digestivo consta de boca, rodeada por la ventosa oral (vo), faringe muscular (engrosamiento visible bajo la vo), esófago y dos intestinos ciegos simples laterales que llegan hasta el tercio posterior (líneas verde azuladas).

vo

ac

pg

ov

oo

ut

vi

te

ci


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REINO ANIMALIA

SUBREINO BILATERIA Phylum Plathyhelminthes Infraphylum Trematoda Clase Digenea Géneros Paramphistomum y Schistosoma

Paramphistomum cervi (dibujo esquemático y tinción con carmín acético).

Schistosoma bovis (macho).


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REINO ANIMALIA

SUBREINO BILATERIA Phylum Plathyhelminthes Infraphylum Cercomeromorpha Clase Cestoidea Orden Ciclophyllidea Familia Taeniidae Subfamilia Taeniinae Género Taenia (= Taeniarhynchus, Multiceps, Hydatigera)

A

B

C

Ciclo biológico de Taenia multiceps.

1. Ganchos.2. Rostelo.3. Ventosa.4. Proglotis inmaduros.5. Canales excretores.6. Vagina.7. Ootipo.8. Ovario.9. Glándulas vitelógenas.

10. Útero.11. Cirro.12. Conducto deferente.13. Testículos.14. Poro genital.15. Huevos.

Dibujo esquemático de Taenia sp.(A = escólex; B = proglotis maduro; C = proglotis grávido).

Coenuro cerebralis (metacestodo)


Anillo grávido


12

3

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67

14B

98

1312

15

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14

C

Huevo


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Dibujo esquemático del extremo anterior de Taenia sp.

Esquema de las formas larvarias de Taenia (sensu lato):A) Cisticerco. B) Estrobilocerco. C) Coenuro.

A

Doble corona de ganchosForma de puñal árabe

Cuello

Estróbilo (proglótides inmaduros)

Rostelo

GanchosEscólex

Ventosas

mango

guardahoja

B C

{


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Proglotis grávido de Taenia sp. repleto de huevos.

Escólex de Taenia sp. Proglotis maduros y grávidos de Taenia sp.

Cisticerco Taenia hydatígena (evaginado). Cenuro de Taenia multiceps (detalle).


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REINO ANIMALIA

SUBREINO BILATERIA Phylum Plathyhelminthes Infraphylum Cercomeromorpha Clase Cestoidea Orden Cyclophyllidea Familia Taeniidae Subfamilia Echinococcinae Género Echinococcus

Echinococcus granulosus. Dibujo esquemático y tinción con carmín acético. El último anillo es grávido, con un útero sacciforme, a diferencia de otros ténidos.

�F. serrano © 2008

A

B

Dibujo esquemático de un metacestodo de Echinococcus granulosus (quiste hidatídico o Echinococcus hydatidosus) con dos vesículas hijas, cápsulas prolígeras (A) con protoescólices inviables y viables (B) y protoescólices libres, en los que se aprecia una corona, de ganchos con forma de puñal árabe.

A

B


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REINO ANIMALIA

SUBREINO BILATERIA Phylum Plathyhelminthes Infraphylum Cercomeromorpha Clase Cestoidea Orden Cyclophyllidea Familia Anoplocephalidae Género Moniezia

A = Moniezia expansa; B = Moniezia benedeni. Ciclo biológico de Moniezia sp.


Hospedador intermediario(ácaro oribátido)

glándulasinterproglotídeas

A

B

Huevo


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REINO ANIMALIA

SUBREINO BILATERIA Phylum Plathyhelminthes Infraphylum Cercomeromorpha Clase Cestoidea Orden Cyclophyllidea Familia Davaineidae Género Davainea Género Railletina

Dibujo esquemático de Davainea proglottina.

Railletina tetragona (proglotis maduros).


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REINO ANIMALIA

SUBREINO BILATERIA Phylum Plathyhelminthes Infraphylum Cercomeromorpha Clase Cestoidea Orden Cyclophyllidea Familia Dipylidiidae Género Dipylidium

Ciclo biológico de Dipylidium caninum.

D. caninum (anillos maduros). D. caninum (anillo grávido).


Ctenocephalides canis(Hospedador intermediario)

Cápsula ovígera

Larva

Adulto Huevo


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REINO ANIMALIA

SUBREINO BILATERIA Phylum Nematoda Clase Chromadorea (~ Secernentea) Orden Rhabditida Suborden Strongylida Superfamilia Strongyloidea Familia Strongylidae Género Strongylus

Strongylus vulgaris (A); S. equinus (B); S. edentatus (C) (vista lateral).

Esquema del extremo posterior de los machos del Suborden Strongylida.

A B C

c. ventroventralc. lateroventral

c. anterolateral

c. mediolateralc. posterolateral

c. externodorsal

c. dorsal

espícula

gubernáculo

bolsa copuladora

télamon

cloaca

costillas

corona radiada

cápsula bucal

festones

dientes

surco dorsal de la glándula esofágica

esófago


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REINO ANIMALIA

SUBREINO BILATERIA Phylum Nematoda Clase Chromadorea (~ Secernentea) Orden Rhabditida Suborden Strongylida Superfamilia Strongyloidea Familia Chabertiidae Géneros Oesophagostomum y Chabertia

Oesophagostomum dentatum (extremo anterior).

Chabertia ovina (extremo anterior).


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SUBREINO BILATERIA Phylum Nematoda Clase Chromadorea (~ Secernentea) Suborden Strongylida Superfamilia Ancylostomatoidea Familia Ancylostomatidae Géneros Ancylostoma, Uncinaria y Bunostomum

Ancylostoma sp. (extremo anterior). Uncinaria stenocephala (extremo anterior).

Bunostomum trigonocephalum (extremo anterior).


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REINO ANIMALIA

SUBREINO BILATERIA Phylum Nematoda Suborden Strongylida Infraorden Trichostrongylina Géneros Trichostrongylus, Teladorsagia, Haemonchus y Nematodirus

Ciclo biológico general de los nematodos gastrointestinales del Suborden Strongylida.

Trichostrongylus retortaeformis (bolsa copuladora ♂). Ostertagia circumcincta (bolsa copuladora ♂).

Haemonchus contortus (bolsa copuladora ♂). Nematodirus spathiger (bolsa copuladora ♂).

L3 (filariforme)

L2 (rabditiforme)L1 (rabditiforme)cutícula

de la L2

cutícula de la L1 muda

mórula

huevoHospedador

eclosión

muda


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REINO ANIMALIA

SUBREINO BILATERIA Phylum Nematoda Clase Chromadorea (= Secernentea) Suborden Strongylida Superfamilia Trichostrongyloidea Familia Dictyocaulidae: Género Dictyocaulus

Ciclo biológico de Dictyocaulus viviparus. Dictyocaulus viviparus (bolsa copuladora ♂).

Ciclo biológico Metastrongylus apri.

Superfamilia Metastrongyloidea Familia Metastrongylidae Género Metastrongylus

Familia Protostrongylidae Géneros Protostrongylus, Muellerius, Neostrongylus y Cystocaulus Ciclo biológico Muellerius capillaris.

Metastrongylus apri (extremo posterior).

L1

L2

L3





Huevo larvado

L1


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REINO ANIMALIA

SUBREINO BILATERIA Phylum Nematoda Orden Ascaridida (= Ascaridomorpha)

Superfamilia Ascaridoidea Familia Ascarididae Géneros Ascaris, Parascaris, Toxocara y Toxascaris

Toxocara mystax (extremo anterior). Ascaris suum en intestino delgado de cerdo.

Superfamilia Heterakoidea Familia Heterakidae Género Heterakis Familia Ascaridiidae Género Ascaridia

Heterakis sp. (extremo posterior).


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REINO ANIMALIA

SUBREINO BILATERIA Phylum Nematoda Orden Oxyurida (= Oxyuridomorpha) Familia Oxyuridae Géneros Oxyuris, Enterobius, Passalurus y Skrjabinema Familia Heteroxynematidae Género Aspiculuris

Aspiculuris tetraptera (extremo posterior ♀). Passarulus ambiguus (extremo anterior).

Passarulus ambiguus (zona uterina ♀ Passarulus ambiguus (huevo). y extremo posterior ♂).


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REINO ANIMALIA

SUBREINO BILATERIA Phylum Nematoda Orden Spirurida (= Spiruromorpha) Superfamilia Habronematoidea Géneros Habronema y Draschia Superfamilia Filarioidea Géneros Dirofilaria y Onchocerca Superfamilia Spiruroidea Géneros Gongylonema, Spirocerca y Ascarops

Dirofilaria immitis (Microfilarias, L1). Gongylonema pulchrum (extremo anterior).

Ascarops strongylina (extremo anterior). Ascarops strongylina (extremo posterior ♂).


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REINO ANIMALIA

SUBREINO BILATERIA Phylum Nematoda Clase Enoplea (~ Adenophorea) Orden Trichinellida Superfamilia Trichinelloidea Géneros Trichuris, Capillaria y Trichinella

Trichuris skrjabini (Esófago glandular). Capillaria aerophila (detalle útero ♀).

Ciclo biológico de Trichinella sp.

músculo esquelético

Larvas emigrantes

epiteliointestinal

L1 maduraquiste


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REINO ANIMALIA

SUBREINO BILATERIA Phylum Arthropoda Clase Arachnida Subclase Acari Superorden Parasitiformes Orden Mesostigmata (= Gamasida). Género Dermanyssus Orden Metastigmata (= Ixodida) Familia Argasidae (Garrapatas blandas) Familia Ixodidae (Garrapatas duras)

Hyalomma lusitanicum ♀ y ♂ (Ixodidae) (vista dorsal).

Ornithodoros erraticus (Argasidae) (vistas dorsal y ventral).


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SUBREINO BILATERIA Phylum Arthropoda Clase Arachnida Subclase Acari Superorden Acariformes Orden Astigmata (~ Sarcoptiformes) (Ácaros de la sarna) Orden Trombidiformes. Género Demodex (sarna demodécica)

Sarcoptes scabiei suis. Psoroptes equi cunicui.

Huevo de Sarcoptes scabiei suis. Demodex canis.


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REINO ANIMALIA

SUBREINO BILATERIA Phylum Arthropoda Clase Insecta Orden Phthiraptera Subórdenes Anoplura, Amblycera, Ischnocera Orden Hemiptera Orden Siphonaptera

Bovicola (~ Damalinia) caprae (Ischnocera). Haematopinus suis (Anoplura).

Triatoma infestans (Hemiptera). Ctenocephalides canis (Siphonaptera).


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REINO ANIMALIA

SUBREINO BILATERIA Phylum Arthropoda Clase Insecta Orden Diptera Suborden Nematocera Suborden Brachycera (Tabanomorpha y Muscomorpha)

Gasterophilus sp. (L3 en estómago de équido). Oestrus ovis (diferentes estadios larvarios).

1. Imago. 2. Larvas 1 en esófago.

3. Larvas 3 en dorso de vacuno. 4. Pupas.

Fases del ciclo biológico de Hypoderma lineatum.

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II. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO


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1. TOMA DE MUESTRAS Y ENVÍO AL LABORATORIO

1.1. Heces

Se debe intentar siempre que la recogida de heces se realice directamente del recto del animal, para evitar así posibles contaminaciones por nematodos de vida libre que se encuen-tran en el medio ambiente, dificultando a veces el diagnóstico coprológico.

Las heces se depositan en un frasco limpio con un algodón húmedo, o bien en bolsas her-méticamente cerradas y en un ambiente de humedad. Si las heces están secas, no se pueden utilizar para diagnóstico, ya que los elementos de diseminación pueden estar deteriorados. Una vez realizada esta operación, se recomienda el envío rápido al laboratorio para su procesado.

Es muy importante que los botes o bolsas estén debidamente etiquetados, completamente limpios, herméticamente cerrados y se les incorpore una anamnesis completa de la explota-ción y/o del animal objeto de estudio.

1.2. sangre

La sangre debe enviarse entera y/o con anticoagulante, conservándose refrigerada a 4 °C hasta su remisión al laboratorio. Al igual que las heces, debe mandarse debidamente identi-ficada añadiéndose la correspondiente anamnesis.

En la extracción se debe evitar por todos los medios que los eritrocitos se hemolicen, ya que en estos casos se dificulta en gran medida el diagnóstico de algunos parásitos intraeritrocitarios.

También se puede enviar al laboratorio frotis sanguíneos fijados previamente con metanol u otro medio.

Para diagnósticos serológicos se toma sangre entera y se espera hasta que se forme un coá- gulo, extrayéndose el suero sanguíneo y se procede a su congelación. También en los casos de sangre con anticoagulante se realiza una centrifugación, extrayéndose el plasma y conge-lándose hasta el momento de su uso.

1.3. Vísceras y tejido muscular

Las vísceras deben remitirse debidamente identificadas al laboratorio, refrigeradas y en el menor tiempo posible, o bien en frascos con glicerina, creando un ambiente anaerobio que evite la putrefacción. En el caso del tejido muscular, la remisión debe hacerse debidamente identificada y con la muestra refrigerada.

1.4. Piel

Primeramente se procede al raspado con bisturí en los bordes de las depilaciones hasta que brote un poquito de sangre. El material recogido, incluida la cuchilla de raspado, se


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manda al laboratorio en bolsa de plástico, placa de Petri o frasco herméticamente cerrado e identificado. Sería conveniente el envío de dos raspados por animal para remitir muestra del mismo también al laboratorio de patología infecciosa.

2. EXAMEN COPROLÓGICO

2.1. examen directo de Heces frescas

– En un portaobjetos, sobre una gota de suero fisiológico templado (38-40 °C), se coloca una pequeña cantidad de heces, a ser posible tomada del centro de la masa fecal.

– Se mezclan perfectamente hasta conseguir una capa fina. La extensión debe tener un grado de transparencia suficiente para que un texto, colocado debajo del portaobjetos, se pueda leer sin dificultad.

– Se coloca un cubreobjetos y se observa al microscopio.

– Para una mejor visualización de protozoos móviles (trofozoitos de Giardia, Chilomastix, etc.) o sus quistes, alternativamente se puede poner una gota de lugol en el portaobjetos para hacer la extensión con las heces, así como otras técnicas de tinción (hematoxilina-cristal violeta, etcétera).

Indicaciones

Esta técnica permite reconocer cualquier elemento de diseminación de los parásitos, pero en caso de no observar ninguna forma parasitaria por este método, no debe descartarse la posibilidad de una parasitosis, ya que el tamaño de la muestra es tan pequeño que el resul-tado negativo no es excluyente. Sin embargo, no es sustituible por su sencillez, rapidez y fundamentalmente porque algunos parásitos no son evidenciables por otras técnicas, que en general son mucho más sensibles, siendo de especial utilidad para la detección de pro-tozoos móviles.

2.2. métodos de enriquecimiento (cualitatiVos)

2.2.1. Flotación

Este sistema se basa en lograr la concentración de los elementos de diseminación (huevos, larvas y quistes) por flotación en un líquido de mayor densidad que ellos.

La densidad de los elementos de diseminación de los parásitos oscila generalmente entre 1,05 y 1,10. La densidad de las soluciones empleadas, no debe ser excesivamente alta para que no deformen los elementos parasitarios y para que no floten otras partículas sólidas pre-sentes en las heces.


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a) Flotación en solución saturada de NaCl

Probablemente sea la solución más empleada y la que ofrece más ventajas. Tiene una densidad de 1,18 y se prepara hirviendo una solución en exceso de sal común durante unos minutos. Se deja enfriar, se filtra y se ajusta a la densidad indicada.

Técnica

– Se mezcla una pequeña cantidad de heces con solución saturada de NaCl en un vial de paredes rectas (Fig. 1, dibujo 1, 2 y 3).

– Con unas pinzas se disgregan perfectamente las heces (Fig. 1, dibujo 4).

– A continuación se agrega suficiente solución para que se forme un menisco convexo en la superficie del vial (Fig. 1, dibujo 5).

– Sobre este menisco convexo, se coloca un cubreobjetos con una superficie mínima de 18 × 18 mm, teniendo la precaución de evitar que se formen burbujas de aire en la superficie del líquido de flotación, o que floten porciones de heces sin disgregar (Fig. 1, dibujo 6). Si esto último resulta difícil de evitar, la suspensión de heces se puede realizar en otro recipiente y tras filtrarla mediante una doble gasa, se coloca en el vial mediante una pipeta Pasteur.

Figura 1. Secuencia para la realización de la técnica coprológica de flotación.

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– Se esperan 45 minutos y se recoge el cubreobjetos, manteniéndolo en posición horizontal para que no se desprenda la gota de solución salina que queda adherida al mismo. Con un movimiento suave se coloca sobre un portaobjetos (Fig. 2) y se examina a 40x y 100x con el diafragma cerrado. Debe examinarse sin dilación, ya que la solución salina de la preparación se cristaliza por completo en pocos minutos.

– Cuando se dispone de una centrífuga, la suspensión se puede centrifugar a 1.500 rpm durante 3 minutos. En los tubos de centrífuga se coloca un cubreobjetos de la misma manera que se ha descrito anteriormente. Se recoge el cubreobjetos, se deposita sobre un porta y se observa al microscopio. Para la investigación de Giardia, Chilomastix, etc., se colorea la preparación con lugol. Este procedimiento, si bien es más rápido, es menos preciso que el anterior.


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Indicaciones

Es la técnica más empleada en cualquier laboratorio de parasitología. Con ella se pueden observar la mayoría de los huevos y larvas de nematodos, los ooquistes de coccidios y algu-nos huevos de cestodos.

Sin embargo, no flotan los huevos de trematodos, los cestodos seudofilideos, ni las larvas de nematodos pulmonares, para los que habría que utilizar soluciones de mayor densidad.

b) Otras soluciones empleadas para métodos de flotación

Solución al 33% de Sulfato de Zinc (densidad de 1,33), solución al 35% de Sulfato Mag-nésico (densidad de 1,28), solución de N2O3Na (densidad de 1,360), solución de sacarosa (densidad 1,2). Estas soluciones están recomendadas para el diagnóstico de las formas de diseminación de mayor densidad, como Fasciola hepática en rumiantes, Metastrongylus en cerdos, de Spirocerca lupi en el perro, etcétera.

2.2.2. Sedimentación

Se trata de concentrar los posibles elementos de diseminación existentes en las heces por simple gravedad.

Técnica

– Se mezclan varios gramos de heces con agua hasta que la disgregación sea completa.

– Se pasa la suspensión a través de un tamiz (doble gasa) en una copa de 500 cc y se llena seguidamente de agua hasta aproximadamente 2,5 cm del borde.

– Añadir 2-3 gotas de Azul de Metileno o Verde Malaquita (opcional). Esto teñirá los restos vegetales, pero no los elementos de diseminación parasitarios, facilitando en gran medida su búsqueda al microscopio óptico.

– Se deja reposar 30-40 minutos.

Figura 2. Colocación del cubre sobre el portaobjetos.


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– Quitar el sobrenadante hasta la marca de 100 cc y volver a llenar con agua hasta el mismo nivel.

– Se repite el procedimiento hasta que el sobrenadante permanezca más o menos transpa-rente (lo ideal es repetirlo 3 ó 4 veces).

– Para terminar este procedimiento, se elimina el sobrenadante y se examina el sedimento al microscopio. Para ello, se recogen al menos 9 gotas del sedimento con una pipeta Pasteur, las cuales se depositan en un portaobjetos y se les coloca un cubreobjetos, visualizándose al microscopio con el diafragma cerrado. También puede examinarse todo el sedimento restante a pocos aumentos en una placa de Petri, buscando en el esteromicroscopio (o un trichinelloscopio de pantalla) los huevos de Fasciola u otros elementos de diseminación de tamaño considerable.

Indicaciones

Se recomienda el método de sedimentación para el diagnóstico de quistes de amebas y ciliados, huevos de trematodos y de cestodos seudofilídeos, ya que por su elevado peso no se detectan por las técnicas usuales de flotación, anteriormente mencionadas.

Esta técnica tiene la ventaja de recuperar todos los huevos de helmintos, larvas de nema-todos, y quistes de protozoos en condiciones de viabilidad y sin distorsión; no obstante tiene el inconveniente de consumir excesivo tiempo y concentrar muy poco las formas parasitarias; de tal forma, que es más difícil visualizarlas.

Los métodos de flotación y sedimentación son técnicas cualitativas de concentración que se complementan y se utilizan sistemáticamente ambas para el diagnóstico coprológico.

2.3. coProcultiVos o incubación de Heces

Se trata de mantener las heces en condiciones adecuadas de humedad, temperatura y oxigenación para que los elementos parasitarios evolucionen y alcancen estadios en que la identificación resulte más fácil y exacta, simulando las condiciones que se producen en el medio ambiente.

2.3.1. Esporulación de ooquistes de coccidios

Para la identificación correcta de coccidios son necesarios ooquistes esporulados. Para que dicho proceso se desarrolle (esporulación-esporogonia) se procede como sigue:

– En una placa de Petri, se mezclan las heces que contienen los ooquistes con una solución de dicromato potásico al 2%, el cual, además de dar humedad al medio, posee acción bactericida y fungicida.

– La placa se introduce en una estufa a temperatura adecuada (20-25 °C). – Se ventilará a diario para proporcionar a los ooquistes el oxígeno necesario.


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– Diariamente se podrán examinar por flotación los ooquistes para controlar el desarrollo de los esporozoitos.

2.3.2. Incubación de huevos de Strongylida

En muchas parasitosis producidas por agentes pertenecientes al Orden Strongylida, el estudio de los huevos encontrados en las heces no es suficiente para determinar la familia y/o el género de los parásitos implicados, por falta de peculiaridades morfológicas y morfomé-tricas diferenciadoras. En tales casos, las heces positivas se depositan en un medio que imite las condiciones medioambientales naturales, en las que los huevos embrionan (embriogéne-sis), eclosionan y experimentan una doble muda hasta alcanzar la fase o estadio de larva 3. Éstas tienen unas características morfológicas y morfométricas diferenciadoras entre géneros y especies.

Técnica

– La muestra de heces de introduce en una placa de Petri y se le adiciona agua templada para proporcionarle humedad suficiente.

– Se lleva a una estufa (20-25 °C) durante 7-10 días. Si no se dispone de estufa, la embrio-génesis también se producirá, pero dependiendo de la temperatura ambiental. A mayor temperatura, menor tiempo y viceversa.

– Cada día se controlará la humedad y se ventilará el coprocultivo durante unos minutos. – Una vez transcurrido este tiempo, las heces se colocan en el aparato de Baermann para el aislamiento de las larvas y su posterior identificación (ver a continuación).

2.4. método de Baermann Para el aislamiento de larVas de nematodos en Heces

Se monta el aparato de Baermann. El embudo se llena de agua templada y sobre ésta es depositada la muestra (sobre gasas y tamiz), de manera que se produzca un contacto suave entre las heces y agua.

– Las larvas son muy activas y presentan hidrotropismo positivo, migrando de las heces y sedimentándose en el fondo del tubo de goma conectado al embudo.

– A partir de 3-6 horas (tiempo máximo necesario 12-24 horas) se depositan sobre un vidrio de reloj las primeras gotas del sedimento, examinándose al estereomicroscopio.

– Con una pipeta se recogen algunas larvas y se depositan entre porta y cubre, examinándose a microscopía óptica.

– La muestra objeto de análisis se puede mezclar con una o dos gotas de lugol para fijar y colorear las larvas y hacer así más fácil su identificación.

Si no disponemos de aparato Baermann, el aislamiento de las larvas se puede realizar en una copa de sedimentación llena de agua templada sobre la que depositaremos un colador


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y una gasa. Sobre ésta se deposita la muestra, de tal forma que las larvas migren hasta el fondo de la copa. Finalmente, con cuidado se retira el sobrenadante y se recogen las larvas del sedimento.

2.5. examen cuantitatiVo (método de mcmaster)

Sirve para realizar una estimación aproximada de la carga parasitaria, y por tanto se su posible significación clínica, a través del número de ooquistes, huevos o larvas por gramo de heces.

La cámara de McMaster consta de dos compartimentos independientes y abiertos lateral-mente que están cubiertos por un cubreobjetos.

Cada compartimento tiene una altura de 0,15 cm y en el cubreobjetos tiene trazado un cuadrado de 1 cm de lado, dividido en calles para facilitar el contaje. Por tanto, el volumen que se examina de cada cámara es de 0,15 cc (volumen total de 0,3 cc).

Su procedimiento es como sigue:

– Suspender cuidadosamente 2 gramos de heces en solución saturada de NaCl hasta un volumen final de 60 ml (aproximadamente 58 ml).

– Filtrar la suspensión por una doble gasa, presionando finalmente sobre la malla. De esta forma, son eliminadas las partículas más groseras.

– Agitar suavemente la suspensión, para homogeneizarla perfectamente, con el objeto de distribuir uniformemente los elementos de diseminación.

– Inmediatamente, llenar con una pipeta los compartimentos de la cámara de McMaster, evitando que se formen burbujas de aire (Fig. 3).

– Colocar la cámara de McMaster en el microscopio, y dejarla reposar unos 5 minutos para que los elementos parasitarios floten y acumulen en la parte superior de la cámara.

– Enfocar a 40 aumentos (objetivo 4x) las líneas dibujadas en la parte superior de la cámara y centrar el campo en el extremo de la primera calle. Sin mover la cámara, cambiar el objetivo de 4x a 10x (100 aumentos) y ajustar el enfoque. No debe intentar enfocar la cámara a mayores aumentos, ni intentar enfocar su parte inferior, ya que podría romperla con el objetivo del microscopio. Sólo debe realizar ligeras correcciones de enfoque durante el recuento, tomando únicamente como referencia las líneas de la cámara. No in- tente enfocar partículas que vea borrosas cuando las líneas están bien enfocadas, ya que eso implica que están en un plano inferior de enfoque (y que por tanto no están en el parte superior de la cámara).

– Realizar el contaje siguiendo las calles o columnas marcadas en ambas cámaras. Como la suspensión de heces está en la relación 1 g en 30 cc (2 g en 60 cc), y se examina un volumen total de 0,3 cc, este contaje equivale al examen de 0,01 g de heces. Por tanto, la cantidad de elementos de diseminación por gramo de heces es la suma del contaje de ambos compartimentos multiplicado por 100.


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– Si el número de huevos u ooquistes en cada calle es muy bajo, es conveniente repetir el contaje varias veces y obtener la media. Por el contrario si es muy alto y difícil de contar, se pueden contar una sola cámara, o sólo algunas calles, extrapolando el resultado a las calles restantes, o bien repetir el contaje diluyendo parte de la suspensión sobrante a un volumen apropiado según la intensidad de la infestación, y multiplicar el contaje final por ese factor de dilución (por ejemplo si diluimos la suspensión a examinar al 1/10, en contaje final se deberá multiplicar por 10).

Con este método, por tanto, el recuento mínimo es de 100 elementos de diseminación por gramo de heces. Esta sensibilidad suele ser suficiente en la práctica, dado que los contajes inferiores se corresponden a cargas parasitarias muy leves que no suelen tener significación clínica.

Si se requiere una mayor sensibilidad, un simple modificación consiste en duplicar el tamaño de la muestra de heces sin modificar el volumen final (4 g de heces en 56 ml de solu-ción salina) por lo que el contaje de ambas cámaras se debe multiplicar por 50. Una ventaja adicional de esta modificación es que la suspensión de heces sobrante se puede emplear para rellenar unos viales con una pipeta Pasteur y realizar la técnica de flotación a partir del punto indicado en el dibujo 5 de la figura 1. Esto permite simplificar la rutina en el laborato-rio, al aunar los primeros pasos de ambos métodos y poder realizar simultáneamente ambas

Figura 3. Cámara McMaster.


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técnicas, con el consiguiente ahorro de tiempo. Además, la flotación realizada de esta forma es preferible, ya que se parte siempre de la misma cantidad de heces, y gracias al filtrado se evita que algunas heces no se disgregan fácilmente en el vial o queden partículas gruesas que floten y dificulten el examen del cubreobjetos.

Para una mayor sensibilidad se ha descrito (FAO Animal Health Manual) otra modifica-ción de este método cuantitativo con una sensibilidad de hasta 20 huevos/g heces, con la ventaja adicional de que tras la recogida y un procesamiento inicial, las muestras se pueden mantener refrigeradas a 4 °C hasta 1 semana sin que se altere el número de huevos en la muestra, lo que puede resultar conveniente cuando el número de muestras a procesar es muy alto. El procedimiento es como sigue:

– Pesar 4 g de heces y añadirle 56 ml de agua. – Mezclar adecuadamente con una espátula y dejar reposar 30 minutos para su correcta homogeneización.

– Filtrar la mezcla a través de una gasa a un segundo vaso de precipitado e inmediatamente después verter 10 ml de esta solución a un tubo de centrifuga.

– Centrifugar 7 minutos a 1.200 rpm. – Retirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no remover el sedimento (en este paso se puede interrumpir el proceso, conservando estos tubos con el sedimento en el refrigerador, hasta 7 días).

– Añadir al sedimento 4 ml de una solución de flotación (solución salina sobresatura-da + glucosa) mezclando cuidadosamente usando una pipeta Pasteur.

– Finalmente, rellenar la cámara McMaster evitando la formación de burbujas y dejar 3-5 minutos para permitir la flotación de todos los huevos. Se cuentan el total de huevos y el resultado se multiplica por 20.

2.6. identificación de ooquistes de cryptosporidium sP.

Los ooquistes de Cryptosporidium son difíciles de identificar por su pequeño tamaño (próximo a 5 µm), falta de estructuras claramente visibles y su similitud con otros elementos normales de las heces, en especial las levaduras.

Existen varios métodos de tinción aceptables, pero es conveniente que vayan precedidos de un método de concentración, dado que pueden eliminarse en concentraciones muy bajas en enfermos leves o portadores. No obstante, por su rapidez, la tinción directa de las heces puede utilizarse como cuando se trata de comprobar si están implicados en las diarreas neo-natales o diarreas de animales inmunodeprimidos.

2.6.1. Tinción por el Método de Heine

– Depositar una pequeña porción de heces sobre un porta y extender un poco. – Teñir con fuchsina básica fenicada durante unos segundos.


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– Eliminar el colorante sobrante y dejar secar. – Observar a microscopía con objetivo de 40x o de inmersión (100x).

2.6.2. Tinción por el Método de Kinyoun modificado

– Realizar una extensión fina de heces en un portaobjetos. – Dejar secar. – Fijar a la llama durante unos 6 segundos. – Fijar con metanol durante 5 minutos. Dejar secar. – Teñir con fuchsina básica fenicada durante 10 minutos. – Lavar con agua. – Decolorar el exceso de fuchsina con alcohol-clorhídrico hasta que la parte más fina de la extensión sea transparente (aproximadamente 10 segundos).

– Lavar con agua para arrastrar el exceso de colorante. – Teñir con una solución de verde malaquita al 5% durante 20-30 segundos. – Lavar de nuevo con agua. – Dejar secar y observar al microscopio óptico con el objetivo de inmersión.

2.6.3. Tinción por el Método de Ziehl-Neelsen modificado

– Extensión muy fina de heces en un portaobjetos. Dejar secar. – Fijación con metanol o alcohol absoluto durante 5 minutos. Dejar secar. – Teñir con fuchsina básica fenicada durante 60 minutos. – Lavar con agua. – Decolorar con ácido sulfúrico al 2% durante 10-15 segundos con el porta en agitación, o con alcohol clorhídrico hasta alcanzar una coloración pálida (de 5 a 10 segundos).

– Lavar con agua. – Tinción de contraste con Verde Malaquita o Azul de Metileno al 5% durante 30 segundos. – Lavar, secar y observar al microscopio.

2.6.4. Tinción con Giemsa

– Extensión muy fina de heces en un portaobjetos. – Dejar secar. – Fijación con metanol o alcohol absoluto durante 5 minutos. – Dejar secar. – Teñir con Giemsa (3 gotas/litro de H2O) durante 25 a 30 minutos. – Lavar con agua. – Dejar secar.


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Preparación de colorantes

– Fuchsina básica fenicada

Fuchsina básica ............................................................................. 1 gAlcohol etílico al 95% .................................................................. 10 ml

Mezclar con 5 ml de fenol (fundir los cristales previamente al “baño maría”) en 95 ml de agua destilada.

– Verde malaquita

Verde malaquita ............................................................................ 5 gAgua destilada ............................................................................... 100 ml

3. EXAMEN DE SANGRE

3.1. técnicas Para el diagnóstico de microfilarias

3.1.1. Examen en fresco

Se deposita una gota de sangre fresca (con anticoagulante) entre porta y cubre, examinán-dose a microscopía con luz poco intensa. La existencia de microfilarias (larvas 1) es observa-da por los activos movimientos de éstas entre los elementos formes.

Es una técnica fácil y que no requiere prácticamente material. Es importante observar varias preparaciones debido a la poca cantidad de sangre que es observada. La no obser-vación de microfilarias no es excluyente, habiendo de recurrir a otros métodos más fiables (métodos de concentración).

3.1.2. Método del tubo microhematocrito

Este método consiste en realizar un hematocrito con la muestra de sangre. Posteriormente se observa al microscopio óptico la zona del tubo microhematocrito situada entre los glóbu-los blancos y plasma, localización donde se sitúan las microfilarias (Fig. 4).

3.1.3. Método de Knott

Se trata de un método de concentración de microfilarias.

– Se mezcla 1 ml de sangre con 9 ml de formalina al 2%. – Centrifugación durante 8 minutos a 1.500 rpm. Posteriormente, se desecha el sobrenadante y se examina el sedimento al microscopio (adicionar una gota de colorante).


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3.1.4. Método de filtración

Es también un método de concentración de microfilarias, que consiste en:

– Se mezcla, agitando, 1 ml de sangre con 9 ml de formalina al 2% en una jeringa de 10-12 ml para lisar los eritrocitos.

– Se prepara la cámara de filtración, colocando sobre la rejilla metálica del portamem- branas una membrana de policarbonato de 5 µm de diámetro de poro (Fig. 5). Sobre esta se coloca una arandela y la parte superior de la cámara, que se enrosca sobre el porta-membranas.

Figura 4. Localización de las microfilarias en el tubo microhematocrito.

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Figura 5. Cámara de filtración y membrana de policarbonato.


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– Se introduce el cono de la jeringa en la parte superior de la cámara de filtración y se inyecta despacio la solución lisada a través del filtro (si se atasca no se debe forzar la inyección de líquido, sino aspirar un poco, mezclar el lisado restante en un tubo apropiado con 10 ml de formalina, agitar nuevamente, y filtrarlo nuevamente, o en una segunda membrana).

– Enjuagar el filtro lentamente con 10-15 ml de agua para eliminar el exceso de células y detritus.

– Posteriormente, se desenrosca la cámara de filtración y se retira el filtro, colocándolo en un portaobjetos manteniendo el material filtrado hacia arriba.

– Teñir con una o dos gotas de colorante en el centro de la membrana y se coloca un cubre-objetos de tamaño apropiado sobre el filtro. Es conveniente esperar 30 segundos para obtener la máxima tinción.

– Finalmente, para visualizar las microfilarias teñidas, se observa la membrana al microsco-pio óptico a 100 aumentos.

– Si se observan microfilarias, deben diferenciarse por las características morfológicas y morfométricas que no se aprecian bien por este método, por lo que deben estudiarse mediante tinción en Giemsa o similar, previa concentración por el método de Knott si es necesario. Dado que algunas de estas características no son fáciles determinar, y varios autores señalan cierto solapamiento de tamaños entre las distintas especies de microfilarias, es interesante la tinción diferencial mediante el método de la fosfatasa ácida, ya que éste permite obtener una tinción diferencial de esta enzima en cada una de las microfilarias comunes en los cánidos.

3.1.5. Método de la fosfatasa ácida

Reactivos

Reactivo I

Tampón acetato veronal de Michaelis o solución de Glicina-NaOH 50 mM pH = 10.

Reactivo II (guardar a 4 °C, pues se mantiene estable algunas semanas)

Naphtol AS-TR-phosphato ............................................................. 0,05 g N,N-dimetilformamida .................................................................. 5 ml

Reactivo III (Disolver en agua, calentándolo. Añadir HCl y enfriar. Guardar a 4 °C)

Pararosanilina ................................................................................ 1 g Agua destilada ............................................................................... 20 ml HCl ............................................................................................... 5 ml

Reactivo IV (A 4 °C o temperatura ambiente)

NaNO2 .......................................................................................... 4 g Agua destilada ............................................................................... 100 ml


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Reactivo V (Verde Metilo 1%; se mantiene a temperatura ambiente)

Sol. a) Na2HPO4 ........................................................................... 28,396 gAgua destilada ............................................................................... 1.000 ml Sol. b) ácido cítrico. H2O ............................................................. 21,011 g Agua destilada ............................................................................... 1.000 ml Sol. de trabajo: a) .......................................................................... 77,1 ml b) .......................................................................... 122,9 ml Verde metilo .................................................................................. 2 g

Sustrato

20 ml de sol I 50 ml de agua destilada 4 ml de sol II

Mezclar 3,2 ml de sol III y IV y añadir a lo anterior (estables a 4 °C más de 6 meses) y ajustar a pH 5 con sosa 0,1 N. Hacer justo antes de su uso.

Metodología

– Se incuban las muestras utilizando el sustrato 1 h a 37 °C o 2 h a 25 °C. – Lavar con agua destilada. – Contratinción con sol V 2 ó 3 minutos (opcional). – Deshidratar con alcohol etílico de 95°. – Lavar en xileno y montar.

Diferenciación de microfilarias

• Dirofilaria immitis tiene un tamaño medio de 308 × 7 µm (299 × 5-6,5), de movimientos no progresivos, que una vez fijadas y teñidas (hematoxilina) aparecen con el cuerpo extendido, con un estrecho extremo cefálico de 11,5 µm y un recto extremo caudal de 28 µm de media. Además, posee estriaciones cuticulares, evidenciables una vez teñidas con hematoxilina. Por la técnica histoquímica antes descrita se detecta la presencia de actividad de la fosfatasa ácida de forma concreta y marcada en poro anal y poro excretor (Fig. 6, dibujo 1).

• Dirofilaria repens aparece en el método de la fosfatasa ácida con una zona con colora-ción roja en el poro anal, si bien puede aparecer alguna coloración rojiza en el centro del cuerpo y otras zonas (Fig. 6, dibujo 2).

• Dipetalonema dracunculoides aparece con este método con una tinción intensa el poro anal y una zona superior del cuerpo, así como coloraciones de menor intensidad en otras zonas, como el poro excretor, espacio cefálico (Fig. 6, dibujo 3) y es de menor tamaño que las microfilarias de D. immitis.


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• Las microfilarias de Dipetalonema reconditum son también más pequeñas y con movi-mientos de progresión rápida a intervalos, con un prominente gancho cefálico y un extre-mo anterior obtuso. Varios autores señalan solapamiento de tamaño con las de D. immitis, lo que hace interesante su tinción con esta técnica para demostrar la actividad de fosfatasa ácida prácticamente por todo el cuerpo (Fig. 6, dibujo 4), en tres o cuatro áreas extensas, o sólo en los dos tercios distales, con mayor intensidad en los poros anales y excretores.

3.2. técnicas Para el diagnóstico de Protozoos Hemáticos: frotis de sangre teñidos con Giemsa

– Para realizar el frotis sanguíneo, se deposita una gota de ésta aproximadamente a 2 mm del extremo del porta.

– Se contacta con la gota el extremo de otro porta, dejando que se extienda la sangre a lo largo de la superficie de contacto.

– A continuación, se desliza rápidamente el porta formando un ángulo de 30-45°; con lo cual, se logra una extensión fina de sangre.

– Dejar secar y, a continuación, proceder a la fijación con metanol (durante aproximadamen-te 5 minutos) y tinción con Giemsa mediante técnicas de tinción hematológicas rápidas (Panóptico rápido, Diff-Quick, etcétera).

Figura 6. Tinciones histoquímica

de distintas especies de microfilarias por método

fosfatasa ácida.

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4. EXAMEN DE TEJIDO MUSCULAR

4.1. triquineloscoPia o tricHinelloscoPia

Esta técnica diagnóstica consiste en una inspección microscópica de tejido muscular para la búsqueda de larvas 1 de Trichinella spp. enquistadas.

El Reglamento 2075/2005 de la Comisión Europea obliga a tomar muestras en cerdos domésticos de los pilares del diafragma, concretamente de la zona de transición muscular y tendinosa del mismo, debiendo tomar 28 muestras del tamaño de un grano de avena por cada pilar del diafragma. Cuando no se disponga de los dos pilares, se pueden tomar 56 muestras de diferentes zonas de ese único pilar. Para el caso de jabalíes, las muestras se tomarán de cada uno de los pilares del diafragma, en la zona de transición entre la parte muscular y la tendinosa y, además, de los maseteros, de los músculos de la parte inferior de la pierna, de los músculos intercostales y de los músculos de la lengua, hasta un total de 6 muestras por individuo. En estos animales, además del número de trozos de carne de diafragma a examinar comentado anteriormente, se analizarán 7 trozos de cada uno de los 4 músculos restantes, lo que hacen un total de 84 trozos a examinar. Se debe procurar que los cortes, en todos los casos, vayan dirigidos en el sentido de las fibras musculares. Posteriormente, se comprimen los trozos de tejido muscular entre las dos placas compresoras y se observa detenidamente en el estereomicroscopio, que permita un aumento mínimo de 30 a 40 veces. El examen de las muestras deberá ser cuidadoso y durará un mínimo de 6 minutos por trichinelloscopia. Además, un veterinario no deberá examinar en el trichinelloscopio más de 840 trozos por día. En este Reglamento, se expone que este método debe ser sustituido por otro más fiable antes del 31 de diciembre de 2009.

4.2. digestión artificial (PéPsica) Para el diagnóstico de trichinella sPP.

En la actualidad, el método oficial es la digestión de muestras colectivas con utilización de agitador magnético (digestión artificial pépsica). La digestión artificial es, sin duda, un método de mayor sensibilidad que la trichinelloscopia.

La legislación actual en España, según el Reglamento 2075/2005 de la Comisión Europea, establece que se deben emplear de 1 a 5 gramos de tejido muscular por cerdo sacrificado, según su sistema de producción. En jabalíes, se deben digerir 5 g por animal. Al igual que la trichinelloscopia, el músculo de elección son los pilares del diafragma.

El fundamento de la digestión pépsica es simular el proceso fisiológico al que es some-tida la carne en el estómago de un animal, y su objetivo es liberar las larvas musculares de Trichinella spp. enquistadas en el tejido muscular. Como resultado se obtiene un líquido de digestión en el que se encuentran las larvas en suspensión. Este método, acorde con el Regla-mento 2075/2005, se basa fundamentalmente en una digestión en el agitador magnético, en el cuál se coloca un vaso de precipitado con las siguientes proporciones de reactivos (para 100 g de carne):


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– Agua a 46-48 °C ......................................................................... 2 l– Pepsina de 2000 U/g. FIP (1:10.000 NF) .................................... 10 g– Ácido clorhídrico al 25% ........................................................... 16 ml

Este vaso de precipitado debe permanecer en el agitador magnético unos 30 minutos. Posteriormente, se filtra el líquido de digestión a través de un tamiz colocado sobre un embudo de decantación. Este tamiz debe tener una malla de 180 micrómetros de diámetro de poro y un diámetro exterior de 11 cm. Tras otros 30 minutos, se pasan 40 mililitros a un nuevo embudo de decantación, de menor tamaño, dejando precipitar 10 minutos. Tras este tiempo se retiran 30 mililitros de sobrenadante y los 10 mililitros restantes de sedimento se vierten en una placa de Petri junto con 10 mililitros de agua que se utilizan para enjuagar la pared de este segundo embudo de decantación. Este filtrado se observa al estereomicroscopio con un aumento de 15 a 20 veces. En caso de observar algo sospechoso de confundirse con parásitos, deberán aplicarse aumentos superiores, de entre 60 y 100 veces.

El Reglamento CE 2075/2005 establece unos métodos equivalentes de detección de Trichinella spp. que son:

1. Método de digestión de muestras colectivas con asistencia mecánica/técnica de sedimen-tación.

2. Método de digestión de muestras colectivas con asistencia mecánica técnica de aislamien-to por filtración.

3. Método de digestión automática para muestras colectivas de hasta 35 g.

No obstante, no será necesario investigar la presencia de este nematodo en la carne de cerdos domésticos que hayan sido sometidas a un tratamiento de congelación regulado en el Reglamento 2075/2005, ni que procedan de explotación o región declarada libre de Trichinella spp.

4.3. digestión artificial (tríPsica) Para el diagnóstico de sarcocystis sPP.

En el diagnóstico de Sarcocystis spp. se sigue el método de Erber (1977) modificado a posteriori por nosotros a raíz de la experiencia adquirida a través de un gran número de digestiones de musculatura esquelética, corazón e incluso cerebro; ya que, en todas estas estructuras pueden albergarse los quistes producidos por este protozoo parásito.

La técnica se basa en una digestión trípsica muy suave, simulando la digestión que se produce en el duodeno de los hospedadores, ya que la tripsina producida en el páncreas se vierte al duodeno y no al estómago. De esta forma, los quistes de Sarcocystis spp. quedan libres de las fibras musculares o tejidos en los que se alojen, para que puedan ser observados al microscopio.

El material necesario para llevar a cabo la técnica es el siguiente:

• Picadora eléctrica. • Báscula digital.


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• Recipiente de al menos 500 ml de capacidad con tapadera. • 10 gramos de muestra problema. • 0,13 gramos de tripsina. • 50 ml de PBS. Esta solución tampón debe tener un pH básico o neutro, con lo que debe

oscilar entre un pH de 7 a 7,2 (ajustar si el pH resultante es diferente). Los componentes necesarios son:

NaCl .............................................................................................. 8,77 gNa2HPO4.2H2O ............................................................................. 1,37 gNaH2PO4.H2O ............................................................................... 0,318 gH2O destilada ................................................................................ 1.000 ml

• Agitador orbital. • Embudo. • Gasa o filtro de 600-700 micrómetros. • Tubo de centrífuga de 50 ml con tapadera. • Centrífuga. • Pipetas Pasteur. • Portas y cubres. • Microscopio óptico.

Los pasos a seguir son los siguientes:

1. El primer paso consiste en preparar la muestra que vamos a digerir, para lo cual, procede-mos a triturar aproximadamente 10 gramos (pesados con anterioridad en la báscula) del tejido muscular o nervioso que queremos someter a estudio. A estos 10 gramos de mues-tra, le añadimos 0,13 gramos de tripsina y 50 ml de PBS en el recipiente con tapadera, y lo homogeneizamos adecuadamente.

2. Una vez hecho todo lo anterior, en los casos de musculatura esquelética y corazón, se procede a incubar la mezcla a 22 °C en agitación suave (100 rpm) durante 8 minutos en el agitador orbital (simulando las condiciones de la digestión en el hospedador). En el caso del cerebro, se procede a simple agitación manual durante sólo 4 minutos. En caso de no disponer de incubador o centrífuga refrigerada, la incubación puede realizarse a temperatura ambiente.

3. Pasados los 8 minutos de digestión, se filtra el contenido de la digestión través de una gasa de 600-700 micrómetros (aproximadamente doble gasa) y embudo, pasando el material filtrado al tubo de centrífuga de 50 ml con tapadera. Es conveniente presionar la gasa una vez filtrado el líquido, para exprimir el jugo e incrementar el número de los posibles quistes de Sarcocystis spp.

4. El líquido de digestión resultante del filtrado se centrifuga a 1.000 rpm durante 10 minutos a una temperatura baja (entre 1 y 3 °C) para detener la digestión de la muestra ya que los quistes son muy lábiles y se rompen con facilidad. Finalmente, se elimina el sobrenadante


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y se van tomando pequeñas gotas del sedimento con una pipeta Pasteur para observarlas (colocadas entre portaobjetos y cubreobjetos) al microscopio óptico. La observación al microscopio debemos realizarla con el diafragma cerrado en busca de quistes septados completos o zoítos libres.

5. EXAMEN DE PIEL

La identificación de los parásitos existentes en la piel, puede verificarse a simple vista tras su recogida con pinzas o simple cepillado (piojos, pulgas, garrapatas, etc.), o bien tener que recurrir a exámenes microscópicos después de un procesamiento en el laboratorio de la muestra obtenida por el raspado.

5.1. inVestigación microscóPica Para el diagnóstico de ácaros: rasPado de Piel

Toma de muestra

El raspado debe realizarse de las zonas enfermas o sospechosas de la piel, a ser posible de las regiones últimamente atacadas o bien de los límites entre zonas sanas y enfermas.

Después de cortar con las tijeras el pelo o la lana, conviene eliminar las costras o escaras más gruesas y superficiales antes de realizar el raspado. Se raspa con la ayuda de un bisturí, haciéndolo profundamente hasta que se produzca una leve hemorragia. Este material se recogerá en una placa de Petri u otro recipiente de boca ancha, para asegurarse que nada del material raspado se pierda. El material debe tomarse, a ser posible, de distintos lugares y en cantidad suficiente.

Remisión de la muestra

El raspado debe mandarse al laboratorio en la placa de Petri o el recipiente utilizado para la recolección, cerrado e identificado adecuadamente, junto con la hoja de bisturí empleada.

Tratamiento de la muestra: aclarado en KOH al 5-10%

El raspado se coloca en un vidrio de reloj y se añade potasa para ayudar a la disgrega-ción y aclarado de las costras y restos de la piel, y así poder visualizar más fácilmente los posibles ácaros (huevos, formas larvarias y/o adultas) al estereomicroscopio. Mediante una pipeta Pasteur, algunos ejemplares deben trasladarse a un portaobjetos para su observación microscópica e identificación morfológica.

En el caso de posible sarna por Octodectes cynotis (sarna auricular), la muestra se tomará con un bastoncillo de algodón de los pabellones auditivos afectados.

La mayoría de los ácaros de la sarna se diagnostican con la ayuda del estereomicrosco-pio. No obstante, ante la dificultad que entraña el diagnóstico de la sarna ocasionada por


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Demodex spp., el material del raspado se aclarará directamente sobre el portaobjetos y se observará también al microscopio óptico (con los objetivos de 4x o 10x) para la observación de estos ácaros.

Una vez realizada la mezcla, se calienta a la llama del mechero al mismo tiempo que se disgregan y rompen las escaras y costras con la hoja del bisturí. Posteriormente, se observa al estereomicroscopio y finalmente se recogen con una pipeta Pasteur una porción de la muestra conteniendo ácaros para identificarlos a mayores aumentos al microscopio.

5.2. miasis

Para conocer la especie causante de la miasis, se deben recoger las larvas III y enviarlas a un laboratorio especializado para su identificación. Para ello debemos extraer las larvas con unas pinzas de la herida y meterlas en un recipiente que permita la entrada de aire, ya que son aerobias, y enviarlas en condiciones de refrigeración si van a estar expuestas a altas temperaturas.

6. EXAMEN DE VÍSCERAS

Mediante ella pretendemos hallar formas parasitarias adultas, larvarias o elementos de diseminación de los parásitos en su localización orgánica.

6.1. inVestigación de Parásitos intestinales

– Se procede a la apertura de distintos tramos, tanto del intestino grueso como el delgado. Además de esto, se realiza un lavado de la mucosa intestinal filtrándose el contenido y recogiéndose en recipientes adecuados.

– El material anterior se visualiza al estereomicroscopio, y posteriormente se realiza la iden-tificación del parásito y contaje.

– Hay casos clínicos en los que es necesario realizar un raspado de la capa mucosa intesti-nal, e investigar la posible presencia de formas parasitarias al microscopio (Por ejemplo, los coccidios).

6.2. inVestigación de Parásitos en abomaso y estómago de monocaVitarios

– Se procede a la apertura de la víscera por su curvatura mayor y se observa sobre la mucosa la presencia de parásitos adultos o formas larvarias.

– Posteriormente, se realiza un lavado de dicha mucosa, procediéndose del mismo modo que en el apartado 6.1.


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6.3. inVestigación de Parásitos en Pulmón

– Se lleva a cabo la apertura del aparato respiratorio, comenzando por tráquea, posterior-mente bronquios grandes, medianos y bronquiolos, hasta llegar a la parte apical del pul-món, tratando de evidenciar nematodos broncopulmonares en ese recorrido.

– Así mismo, se realiza un raspado con un cubreobjetos sobre el parénquima pulmonar y luz bronquial, se coloca sobre un portaobjetos y se examina al microscopio para hallar larvas de nematodos, fáciles de evidenciar, en caso de positividad, por sus activos movimientos.

– Para aislar 3 ó 4 larvas de diferentes parásitos pulmonares puede procederse a la digestión pépsica del órgano (o parte proporcional del mismo) siguiendo el método descrito en el apartado 4.2.

6.4. inVestigación de Parásitos en Hígado

– Observación y palpación de la víscera. – Recoger con la ayuda de una jeringuilla el líquido biliar, previamente homogeneizado, para posteriormente examinar varias gotas de éste al microscopio óptico y poder visualizar elementos de diseminación de los parásitos hepáticos.

– Abrir los canalículos biliares y presionar para que salgan los distintos parásitos. – Recogida de los mismos e identificación al microscopio. – Al igual que en pulmón se pueden aislar larvas parasitarias en el hígado mediante digestión pépsica del órgano.

6.5. inVestigación de Parásitos en corazón

– Apertura de la víscera según necropsia reglada. – Visualización directa de las formas parasitarias adultas y jóvenes de Dirofilaria immitis en carnívoros. Además de lo anterior, se realiza una observación de la arteria pulmonar, donde también se localiza este nematodo.

6.6. inVestigación de formas larVarias de la familia taeniidae

Cisticerco

– Observación directa en su localización habitual (hepatoperitoneo o musculatura). Recogida del material sospechoso y visualización al estereomicroscopio.

Coenuro

– Apertura de la cavidad craneana y observación de la superficie encefálica. Posteriormente, se identifica la forma parásita del mismo modo que en el caso anterior.


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Estos dos parásitos pueden comprimirse e incluirse en un recipiente con formol al 10% con el fin de obtener preparaciones permanentes.

Posteriormente, se incluirían en una cadena de montaje de cestodos (adultos o este tipo de formas larvarias), la cual incluye:

1. Inclusión en alcohol de 70°.2. Tinción con Carmín acético durante 24 horas (fórmula magistral).3. Decoloración con alcohol-clorhídrico (hasta que se visualicen adecuadamente las estruc-

turas del parásito).4. Pases de 5 minutos por una cadena ascendente de alcoholes (70°, 80°, 90°, 90°, alcohol

absoluto y xileno).5. Montaje en portaobjetos con bálsamo de Canadá o “Eukitt”.

Quiste hidatídico

– Observación macroscópica del quiste en los distintos órganos donde es frecuente su pre-sencia (hígado, pulmón, riñón, corazón).

– Punción de la membrana quística con la ayuda de una jeringuilla para la extracción del líquido hidatídico.

– Rotura de la membrana quística y raspado de la arenilla hidatídica con un cubreobjetos. – Todo el material anteriormente recogido se lleva al microscopio donde:

• Si hay existencia de protoescólex es un quiste fértil. • Si no hay protoescólex es un quiste infértil.

Finalmente, en el caso de que sea FÉRTIL, la preparación se colorea con una gota de violeta de Genciana, y:

• Si los protoescólex se tiñen, son no viables. • Si los protoescólex no se tiñen, son viables.

Las formas larvarias de Taeniidae spp. pueden conservarse en formol al 10% o en alcohol-formol (10% de formalina al 35%-40% y 90% de alcohol de 70°). Por otra parte, los protoes-cólex procedentes del quiste hidatídico se conservan en formol al 5%.

7. EXAMEN DE ORINA Y SECRECIONES

7.1. orina

La vejiga urinaria de los carnívoros es asiento del nematodo Capillaria plica, aunque más raramente se puede encontrar en los riñones y pelvis renal otro nematodo denominado Dioctophyma renale.


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Los huevos de ambos nematodos parásitos son evidenciables en orina. Para ello, se deja sedimentar en una copa de base acuminada (o tubo de ensayo), o bien se realiza una centri-fugación rápida, observando en ambos casos el sedimento al microscopio óptico, tal y como se hace en las técnicas de coprología.

7.2. secreciones Vaginal, uterina y PrePucial

La obtención de este material biológico está justificado en orden a la búsqueda de distin-tas especies del género Trichomonas y Trypanosoma equiperdum.

Las secreciones son obtenidas mediante el lavado con solución fisiológica templada de cloruro sódico, o bien mediante cucharilla. El producto resultante conviene mantenerlo a refrigeración (no inferior a 5 °C), ya que si se produce la desecación, los protozoos se conser-van vivos poco tiempo (menos de 24 horas).

El estudio de las secreciones se lleva a cabo a través del microscopio óptico y mediante cultivos.

7.3. secreción nasal

El estudio de la secreción nasal está indicado en pequeños rumiantes y cánidos que presentan un abundante flujo nasal, para la búsqueda de larvas de Oestrus spp. en ovejas y cabras, y huevos de Linguatula serrata en perros (este último caso clínico es de muy escasa frecuencia).

El examen se realiza directamente al microscopio, teniendo en ocasiones que mezclar el exudado con ácido acético.

7.4. saliVa

Se toman muestras de saliva en el caso de la evidencia en la mucosa de la boca y faringe de palomas y pavos de Trichomonas gallinae. El diagnóstico debe realizarse lo más rápida-mente posible, ya que se deterioran con prontitud, haciéndose frotis a partir de buche, boca y faringe, siendo fácil la investigación por el movimiento vivaz del parásito.

8. REALIZACIÓN Y EXAMEN DE BIOPSIAS

En este apartado estudiamos diferentes técnicas de obtención de muestras sobre el animal vivo para el diagnóstico de posibles parasitosis. Va sobre todo encaminado al diagnóstico de leishmaniosis canina y de theileriosis (fase linfocítica), ambas de elevada presentación en nuestro entorno. Se fundamentan en la obtención de tejido procedente de ganglio linfático, médula ósea y piel.


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8.1. bioPsia ganglionar

En concreto, se trata de una biopsia de aspiración, ya que se obtienen muestras de un órgano de consistencia elevada, teniéndose que dislacerar el tejido para obtener una pequeña muestra celular. Va encaminada al diagnóstico de las formas viscerales de leishmaniosis y fase linfoide de la theileriosis.

Técnica

– Los dos posibles ganglios para la toma de muestras más importantes son el poplíteo (en el perro situado en la cara flexora de la articulación de la rodilla, muy superficial y sobre el músculo gastronemio) y el preescapular sobre la articulación del encuentro.

– Rasurar la zona de intervención y desinfectar. – Fijar el ganglio perfectamente con una mano, intentando que la piel quede bien tensa. – La aguja o trocar que se emplee podrá ser de diferentes calibres en función del volumen del ganglio, la cual se introduce mediante un acto rápido y se coloca aproximadamente en el centro de la masa ganglionar.

– Dislacerar el tejido mediante movimientos rotacionales y laterales. – Conectar la jeringa (estéril y de amplio volumen; de 5 a 10 ml) y aspirar con el émbolo al máximo.

– Por último, sólo queda extraer mediante un movimiento rápido el conjunto aguja-jeringa en la que quedará alojada las suficientes células para posteriormente realizar el frotis y tinción por métodos hematológicos usuales.

8.2. bioPsia medular

Se trata de otra biopsia de aspiración, que da mejores resultados para el diagnóstico de la leishmaniosis visceral. Las agujas a emplear (trocar) son de tipo Salah.

Es preciso elegir para la punción un hueso que contenga médula hematopoyética activa (roja). Si por error, la punción recae sobre médula grasa (amarilla), la muestra obtenida con-tará solamente de grasa y algunas gotas de sangre.

Técnica

– Colocar al animal en decúbito lateral derecho, con la extremidad izquierda sobre el costi-llar, para así poder evidenciar el esternón. También puede realizarse sobre la cresta ilíaca.

– Cortar el pelo, afeitar y desinfectar la zona a intervenir, que suele ser la 2ª-3ª esternebra o la cresta ilíaca, la cual se anestesia localmente por infiltración en zonas subcutáneas próximas del periostio, el cual es muy sensible.

– Desinfectar de nuevo la zona e insertar la aguja hasta alcanzar el hueso. – Retirar el fijador o mandril, conectar la jeringa y retirar el émbolo bruscamente. Brotará en pequeño chorro fragmentos de médula ósea con algo de sangre.


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8.3. bioPsia de Piel

Va encaminada a la detección de leishmaniosis cutánea, onchocercosis, etcétera.

Podrá realizarse con bisturí para obtener una pequeña porción de tejido (Onchocercosis) o con la punta de una aguja tomando la muestra de la base de la úlcera.

9. DIAGNÓSTICO INMUNOLÓGICO

En la actualidad muchas de las enfermedades parasitarias son diagnosticadas gracias a la utilización de técnicas que ponen de manifiesto la existencia de respuesta inmunológica (anticuerpos específicos) en sangre frente a los agentes extraños.

Los parásitos generan desde las primeras semanas una fuerte respuesta de anticuerpos que pueden ser puestas de manifiesto mediante estas técnicas de inmunodiagnóstico.

La detección precoz de las infecciones parasitarias a través de dichos métodos, se muestra como una de las medidas de control más efectivas, ya que posibilita una mayor efectividad terapéutica de los medicamentos empleados, al ser utilizados en fases precoces de la infec-ción. También se consigue una mejor monitorización del proceso parasitario a través del análisis de las respuestas inmunológicas, ya que la evidencia de la efectividad terapéutica se ve reflejada en un descenso de la cantidad de anticuerpos en sangre como consecuencia de la muerte de los parásitos.

Existen diferentes métodos de inmunodiagnóstico, entre los que se encuentra la técnica inmunoenzimática micro-ELISA indirecto de dobles anticuerpos, que ha demostrado ser una de las más eficaces y fiables en multitud de estudios seroepidemiológicos, permi- tiendo en diferentes países el conocimiento de la distribución de las parasitosis y de su pre-valencia.

Su realización sólo requiere de una pequeña muestra de sangre del animal sospechoso para su análisis en el laboratorio.

9.1. elisa indirecto

Mediante la técnica ELISA indirecto se determinan diferentes tipos y subtipos de inmuno-globulinas (anticuerpos) producidas frente a distintos antígenos del parásito (Fig. 7).

Así, el antígeno soluble empleado en dicha técnica puede ser la totalidad de las proteí-nas del parásito (proteína total del parásito), determinadas fracciones del mismo o diferentes proteínas recombinantes obtenidas por ingeniería genética.

Tras tapizar las placas con el antígeno parasitario a la concentración deseada, a cada pocillo se le añaden 100 µl del fluido problema, diluido a la concentración adecuada en buffer carbonato, PBS u otra solución de pH apropiado, según el tipo de antígeno. Dichas


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diluciones son seleccionadas durante la estandarización de la técnica, y tras la titulación del nivel de anticuerpos de distintos sueros positivos y negativos (controles) que permiten, en cada caso, la obtención de la mejor y mayor diferenciación entre valores de reactividad positivos y negativos.

Tras la incubación a 37 °C durante 30 minutos y posterior lavado, se añaden 100 µl del conjugado anti-especie de elección en cada caso (anti-inmunoglobulina marcada con peroxi-dasa); y a la concentración idónea previamente determinada. Se somete a una nueva incuba-ción de 30 minutos a 37 °C, y después a un nuevo lavado para eliminar las inmunoglobulinas que no hayan reaccionado con el complejo antígeno-anticuerpo.

Posteriormente, se añaden 100 µl de substrato cromógeno a cada pocillo. Dicho substra-to, en presencia de peroxidasa, tomará una coloración que variará según el substrato usado (TMB, OPD, ABTS, etcétera) con una intensidad proporcional a la cantidad de anticuerpos fijados al antígeno. Este substrato se elabora como máximo quince minutos antes de ser uti-lizado, debido a la poca estabilidad del preparado.

La reacción enzimática debe leerse cuando el control positivo alcanza una DO idónea, generalmente al cabo de unos 10-30 minutos de incubación a temperatura ambiente. La reacción puede pararse añadiendo a cada pocillo 50 µl de H2SO4 3N. La lectura se realiza en un espectrofotómetro a la longitud de onda determinada según el sustrato utilizado (A490, A450, etc.) en un lector de placas de ELISA después de haber observado a simple vista si existen errores o coloraciones anormales.

Para comprobar que todos los pasos de la técnica han sido realizados correctamente, es necesario reservar unos pocillos en cada placa para realizar los controles de conjugado, positivos y negativos (Fig. 7).

Figura 7. Placa de ELISA con pocillos de distinta coloración, en función de la seroreactividad frente a Leishmania infantum.


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Para el control del conjugado, se utilizan pocillos sin suero problema, siendo éste susti-tuido por PBS 1x con Tween-20 y continuando los demás pasos rutinariamente. Este control nos puede dar información sobre errores de procedimiento tales como procesos de lavado inadecuado o reactivos en mal estado. Como control positivo (introducido en cuatro pocillos) se utiliza un suero conocido obtenido de un animal infectado por el parásito. Como control negativo, se utiliza el suero de un animal sano y libre de la infección por el parásito, intro-duciéndose ambos en varios pocillos. Las muestras se realizan por duplicado o triplicado por el mismo motivo.

La correcta realización de la técnica queda garantizada por la repetitividad mostrada por estos controles tras la lectura de las placas.

Es importante señalar que la seropositividad de un animal sospechoso, implica que tiene anticuerpos específicos contra un parásito, y que por tanto ha tenido algún contacto con éste, pero no necesariamente refleja una infección actual, y en caso de existir, puede ser independiente de que se manifieste o no la enfermedad, o de gravedad de la misma. La interpre-tación correcta de la seropositividad y su intensidad depende en extremo del tipo de parásito, su prevalencia, su ciclo biológico y la interacción con el sistema inmune del hospedador que se deriva del mismo. Así, en enfermedades como la leishmaniosis, será además nece-sario el análisis en profundidad del paciente, para comprobar a qué estado de enfermedad se corresponde el diagnóstico serológico positivo, que puede variar desde el asintomático u oligosintomático al claramente patente, con daños orgánicos severos que imposibiliten su recuperación total.

9.2. inmunofluorescencia indirecta

La técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) es una prueba inmunológica de carác-ter diagnóstico que se utiliza para la detección de anticuerpos específicos frente a parásitos, bacterias, virus, etc. Estos anticuerpos son producidos por el individuo tras su contacto con un determinado microorganismo. Entre estos agentes podemos destacar algunos parásitos como Leishmania infantum y piroplásmidos, tales como Theileria spp. y Babesia spp. en los que esta técnica es muy útil.

Esta técnica es básicamente similar a la del ELISA indirecto, en la que el conjugado no está marcado con una enzima, sino con una sustancia fluorescente que detecta el inmuno-complejo resultante de la unión Antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac). Podremos constatar la existen-cia de esta reacción mediante un microscopio de epifluorescencia.

Los pasos a seguir para realizar esta prueba son:

– En primer lugar, debemos preparar una serie de diluciones, que varían normalmente entre 1/40 y 1/1.280, con la ayuda de una solución tampón fosfato (PBS) de pH neutro o ligera-mente básico (compuesta por agua bidestilada, NaCl, NaH2PO4.2H2O y Na2HPO4.2H2O) y añadiendo posteriormente el suero o plasma problema.


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– Enfrentaremos estas diluciones al antígeno correspondiente que tendremos fijado en un portaobjetos con acetona y conservado en congelación.

– Incubaremos durante 30 minutos a temperatura ambiente para favorecer así la unión entre el antígeno y el anticuerpo.

– Posteriormente, realizaremos tres lavados de los portaobjetos de cinco minutos cada uno a 37 °C con la solución PBS. De esta manera, se eliminarán restos de suero o plasma y antígeno sobrante.

– Después añadiremos el conjugado e incubaremos 30 minutos más a temperatura ambiente para que, de esta manera, se realice la fijación con el inmunocomplejo (si lo hubiera).

– Seguidamente, haremos otros tres lavados de cinco minutos cada uno con PBS a 37 °C, eliminándose así el exceso de conjugado que no se ha unido de forma específica al inmu-nocomplejo.

– Tras estos pasos, añadiremos sobre el portaobjetos una pequeña cantidad de Glicerina tamponada con PBS (pH = 7,2) y pondremos un cubreobjetos encima.

Por último, se observarán los portaobjetos en el microscopio de epifluorescencia para realizar la lectura de las muestras.

Para comprobar que la prueba ha sido realizada correctamente, se utilizan dos controles testados previamente. Uno de ellos negativo y el otro positivo. Además, estos sueros se utili-zan como referencia para la determinación del título del resto de las muestras.

Figura 8. Resultado positivo mediante IFI de un caballo frente a Theileria equi.


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En la Unidad de Parasitología de nuestra Facultad se aplica este tipo de diagnóstico principalmente para la detección de anticuerpos frente a Theileria equi y Babesia caballi en équidos, T. annulata y B. bigemina en bóvidos y B. ovis en pequeños rumiantes. También se utiliza para la detección de Leishmania infantum en cánidos.

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III. LÁMINAS DE IDENTIFICACIÓN


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Ooquistes de Cryptosporidium sp. (tinción de Heine).

Ooquistes de Cryptosporidium sp. (tinción de Ziehl-Neelsen).

Ooquistes de Eimeria sp. Quiste de Balantidium coli (1) y ooquiste de Eimeriidae sp. (2).

Huevos de Dicrocoelium dendriticum. Huevos de Fasciola hepatica y D. dendriticum.

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Cápsulas ovígeras de Dipylidium caninum. Huevos de Taeniidae sp.

Larva 1 de Dictyocaulus viviparus. Larva 1 de Muellerius capillaris.

Huevos de Moniezia benedeni (1), Strongylida sp. (2) y ooquistes de Eimeriidae sp. (3).

Huevos de Moniezia benedeni (1), Strongylida sp. (2) y Nematodirus sp. (3).

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Huevo de Passalurus ambiguus. Huevo de Trichuris vulpis.

Huevos de Toxascaris leonina (1) y Toxocara canis (2).

Huevo de Ascaridia galli.

Huevo de Capillaria plica (en orina). Huevo de Ascaris suum.

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Babesia canis (piroplasmas). Theileria annulata (piroplasmas).

Haemoproteus columbae (gametocitos). Hepatozoon canis (gametocitos).

Larva 1 de Dirofilaria immitis (microfilaria). Leishmania infantum (promastigotes y amastigotes).


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Sarcocystis miescheriana. Trichinella spiralis.

Sarcoptes scabiei suis. Ctenocephalides canis (Siphonaptera).

Psoroptes equi cuniculi.Demodex canis.

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IV. LÁMINAS DE LESIONES


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Perro afectado de Leishmaniosis. Cultivo celular de Leishmania sp.

Coccidiosis hepática en conejo. Coccidiosis intestinal en cordero (hiperplasia de placas de Peyer).

Lesiones dérmicas por Leishmaniosis.Bazo de un perro con Leishmaniosis.


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Diarrea en cordero y lesiones entéricas e hipertrofia de la cadena ganglionar causadas por Cryptosporidium spp.

Hígado de un cabrito de 3 meses con fasciolosis aguda (Fasciola hepatica). Hepatitis hemorrágica traumática.

Moniezia spp. (Cestoda) en intestino de cordero.

Quistes de Sarcocystis gigantea en esófago ovino.Pseudoquiste de Toxoplasma gondii.


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Adultos de Taenia sp. en intestino de perro. Nódulos en intestino de jabalí causados por Macracanthorhynchus hirudinaceus.

M. hirudinaceus en la mucosa del intestino de un porcino.

Quistes hidatídicos en pulmón de cerdo (Echinococcus granulosus).

Quiste hidatídico en hígado de cerdo. Cisticercosis hepatoperitoneal por Taenia pisiformis en una liebre.


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Coenuro de Taenia multiceps en cerebro de oveja (Coenuro cerebralis).

Adultos de Dirofilaria immitis en el corazón de un perro.

Lesiones hepáticas en un lechón, causadas por la migración larvaria de Ascaris suum (“Manchas de leche”).

Nódulos en pared gástrica de un perro con adultos de Spirocerca lupi.

Adultos de Ascaridia galli en el intestino de una gallina. Adultos de Ascarops strongylina en la mucosa gástrica de un cerdo.


NUAL

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X

86

ÍNDICEPORTADA

Adultos de Dictyocaulus filaria en vías respiratorias altas de ovino.

Lesiones pulmonares en cerdo causadas por Metastrongylus spp.

Hiperqueratosis generalizada en sarna sarcóptica porcina (Sarcoptes scabiei var. suis).

Sarna demodécica en perro: alopecia, descamación y ulceración de la dermis (Demodex canis).

Sarna psoróptica ovina (Psoroptes ovis). Sarna sarcóptica ovina (Sarcoptes scabiei var. ovis).


MANU

ALES

UEX

87

ÍNDICEPORTADA

Sarna demodécica generalizada (fase pustulosa). Hembras de Ixodes ricinus en una cabra montesa.

Descarga nasal en una oveja por oestrosis (Oestrus ovis).

Edema submandibular (“papo”) en un ovino causada por Haemonchus contortus.

Ictericia en la conjuntiva, edema subcutáneo, y hemoglobinuria intensa en un équido con piroplasmosis por Theileria equi.


NUAL

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ÍNDICEPORTADA

Miasis cutánea furuncular en perro. Miasis cutánea prepucial en ovino (Wohlfahrtia magnífica).

Miasis cavitaria por Oestrus ovis. Infestación por Rhipicephalus bursa en un toro.

Miasis cutánea vulvar en ovino (Wohlfahrtia mag- nífica).

Conejo con lesiones por Psoroptes sp.

MANU

ALES

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89

ÍNDICEPORTADA

ANEXO 1. TAXONOMÍA

INTRODUCCIÓN

La clasificación taxonómica de los parásitos está cambiando considerablemente en las últimos años gracias al desarrollo de la biología molecular y los estudios ultraestructurales, que han permitido conocer mucho mejor la filogenia de los eucariotas.

Los protozoos o protistas no se consideran ya una rama separada ni de organismos celulares autotróficos como las algas o los cromistas, ni de los clásicos reinos Animalia, Fungi y Plantae. No hay un consenso sobre la clasificación concreta de los grandes grupos taxonómicos, pero en cualquier caso se aceptan diversos grupos, de los que surgen formas de vida heterótrofa, autotrófica o mixta, y en algunos, ramas evolutivas multicelulares en diversos momentos.

Así por ejemplo, en los seis grupos princi-pales (equivalentes a reinos) de la clasificación de Adl et al. (2005) que se muestran en el cua-dro siguiente, hay protozoos en todos ellos, junto a seres multicelulares y protistas no con-siderados como protozoos. Así por ejemplo, el protozoo parásito Toxoplasma gondii tiene un ancestro común más cercano con un alcor-noque o una diatomea, que con otros protozoos parásitos como Entamoeba histolytica, o Leishmania infantum, a su vez más empa-rentada con las algas verdes unicelulares (Euglena spp.) que con todos los anteriores. En otras palabras, el reino Protozoa es parafilético, ya que se excluye a ciertos descendientes protozoos. No obstante, siguiendo a Cavalier-Smith seguiremos considerándolo un reino independiente, aunque sin olvidar que, en puridad, tal reino no existe, al menos desde un punto de vista filogenético.

Amoebozoa

Eukaryota

Archaeplastida

Chromalveolata

Excavata

Animalia

Plantae

Opisthokonta

Fungi

Rhizaria

Clasificación, según Adl et al. (2005), de los grandes grupos de eucariotas (en azul) mos-trando la ubicación en ellos de los clásicos reinos de seres multicelulares (en rojo).


NUAL

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90

ÍNDICEPORTADA


MANU

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NUAL

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NUAL

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NUAL

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NUAL

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ÍNDICEPORTADA

MANU

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103

ÍNDICEPORTADA

RUMIANTES

APARATO DIGESTIVO Protozoos Cryptosporidium Eimeria Trematodos Paramphistomum Cestodos Avitellina Moniezia Stilesia Thysaniezia Nematodos Bunostomun Capillaria Chabertia Cooperia Gongylonema Haemonchus Nematodirus Neoascaris Oesophagostomun

Teladorsagia Strongyloides Trichostrongylus Trichuris

HÍGADO Trematodos Dicrocoelium Fasciola Cestodos Echinococcus Cysticercus

APARATO RESPIRATORIO Cestodos Echinococcus Nematodos Cystocaulus Dictyocaulus Muellerius Neostongylus

ANEXO 2. PRINCIPALES GÉNEROS PARÁSITOS SEGÚN HOSPEDADORES Y LOCALIZACIONES ORGÁNICAS


NUAL

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104

ÍNDICEPORTADA

Protostrongylus Artrópodos Insectos Oestrus

APARATO UROGENITAL Protozoos Tritrichomonas

SANGRE Protozoos Babesia Theileria Trypanosoma

MÚSCULO Protozoos Sarcocystis Toxoplasma Cestodos Cysticercus

SISTEMA NERVIOSO Protozoos Sarcocystis Toxoplasma Neospora Cestodos Coenuro

SACO CONJUNTIVAL Nematodos Thelazia

PIEL Y TEJIDO SUBCUTÁNEO Nematodos Onchocerca Parafilaria

Artrópodos Arácnidos Ácaros de la sarna Chorioptes Demodex Psoroptes Sarcoptes Dermanyssus Ixódidos Boophilus Dermacentor Haemaphysalis Hyalomma Ixodes Rhipicephalus Insectos Anopluros Haematopinus Linognathus Ischnoceros Damalinia (Bovicola) Columbicola Goniodes Dípteros Calliphora Culex Haematobia Hyppobosca Hypoderma Lucillia Melophagus Sarcophaga Simulium Stomoxys Wohlfahrtia


MANU

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105

ÍNDICEPORTADA

ÉQUIDOS

APARATO DIGESTIVO Protozoos Cryptosporidium Eimeria Cestodos Anoplocephala Paranoplocephala Nematodos Cyathostomun Cylicocylus Draschia Habronema Oxyuris Parascaris Strongyloides Strongylus Trichostrongylus Triodontophorus Artrópodos Gasterophilus

HÍGADO Trematodos Dicrocoelium Fasciola Cestodos Echinococcus

APARATO RESPIRATORIO Cestodos Echinococcus Nematodos Dictyocaulus Artrópodos Insectos Rhinoestrus

APARATO UROGENITAL Protozoos Trypanosoma

SANGRE Protozoos Babesia Theileria Trypanosoma

MÚSCULO Protozoos Sarcocystis Nematodos Trichinella

SACO CONJUNTIVAL Nematodos Thelazia

CAVIDAD ABDOMINAL Nematodos Setaria

PIEL Y TEJIDO SUBCUTÁNEO Nematodos Habronema Onchocerca Artrópodos Arácnidos Ácaros de la sarna Chorioptes Demodex Psoroptes Sarcoptes


NUAL

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ÍNDICEPORTADA

Ixódidos Dermacentor Hyalomma Ixodes Rhipicephalus Haemaphysalis Insectos Anopluros Haematopinus Ischnoceros Damalinia Sifonápteros Ctenocephalides Pulex

Dípteros Culicoides Hypoderma Hyppobosca Musca Sarcophaga Stomoxys Wohlfahrtia


MANU

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ÍNDICEPORTADA

PORCINOS

APARATO DIGESTIVO Protozoos Balantidium Eimeria Cryptosporidium Isospora Cestodos Diphyllobothrium Nematodos Ascaris Ascarops Globocephalus Gongylonema Hyostrongylus Oesophagostomun Physocephalus Simondsia Strongyloides Trichuris Acantocéfalos Macracanthorhynchus

HÍGADO Trematodos Dicrocoelium Fasciola Cestodos Echinococcus Cysticercus

APARATO RESPIRATORIO Cestodos Echinococcus Nematodos Metastrongylus

APARATO UROGENITAL Nematodos Stephanurus

SANGRE Protozoos Babesia

MÚSCULO Protozoos Sarcocystis Cestodos Cysticercus Nematodos Trichinella

PIEL Y TEJIDO SUBCUTÁNEO Artrópodos Arácnidos Ácaros de la sarna Demodex Sarcoptes Argásidos Ornithodoros Ixódidos Boophilus Dermacentor Hyalomma Ixodes Rhipicephalus Insectos Anopluros Haematopinus Sifonápteros Pulex Ctenocephalides


NUAL

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ÍNDICEPORTADA

CARNÍVOROS

APARATO DIGESTIVO Protozoos Cystoisospora Giardia Sarcocystis Toxoplasma Neospora Entamoeba Trematodos Alaria Plagiorchis Cestodos Diphyllobothrium Diplopylidium Dipylidium Echinococcus Joyeuxiella Mesocestoides Multiceps Taenia Nematodos Ancylostoma Capillaria Physaloptera Spirocerca Strongyloides Toxascaris Toxocara Trichuris Uncinaria

APARATO RESPIRATORIO Nematodos Capillaria Aelustrongylus

APARATO UROGENITAL Nematodos Capillaria Dioctophyma

SANGRE Protozoos Babesia Nematodos Dirofilaria Dipetalonema

SISTEMA MONONUCLEAR FAGOCÍTICO Protozoos Hepatozoon Leishmania

MÚSCULO Nematodos Trichinella

PIEL Y TEJIDO SUBCUTÁNEO Nematodos Dipetalonema Dirofilaria Artrópodos Arácnidos Ácaros de la sarna Cheylletiella Demodex Notoedres Otodectes Sarcoptes Ixódidos Rhipicephalus


MANU

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ÍNDICEPORTADA

Insectos Anopluros Linognathus Ischnoceros Trichodectes Sifonápteros Ctenocephalides Pulex

Dípteros Calliphora Lucillia Sarcophaga Wohlfahrtia


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ÍNDICEPORTADA

AVES

APARATO DIGESTIVO Protozoos Cryptosporidium Eimeria Hexamita Histomonas Isospora Tetratrichomonas Trichomonas Cestodos Amoebotaenia Choanotaenia Davainea Railletina Nematodos Amidostomun Ascaridia Capillaria Epomidiostomun Heterakis Tetrameres Trichostrongylus

HÍGADO Protozoos Histomonas

APARATO RESPIRATORIO Protozoos Cryptosporidium Nematodos Cyathostoma Syngamus Artrópodos Arácnidos Ácaros de la sarna Cytodites Gamásidos Sternostoma

APARATO UROGENITAL Trematodos Prosthogonimus

SANGRE Protozoos Haemoproteus Leucocytozoon Plasmodium


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ÍNDICEPORTADA

PIEL Y TEJIDO SUBCUTÁNEO Artrópodos Arácnidos Ácaros de la sarna Knemidocoptes Laminosioptes Gamásidos Dermanyssus Ornithonyssus Argásidos Argas Ixódidos Haemaphysalis Hyalomma Ixodes

Insectos Ischnoceros Columbicola Menacanthus Gonicotes Gonioides Lipeurus Menopon Hemípteros Cimex Sifonápteros Ceratophylus Echidnophaga


NUAL

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ÍNDICEPORTADA

LAGOMORFOS

APARATO DIGESTIVO Protozoos Cryptosporidium Eimeria Encephalitozoon Giardia Cestodos Andrya Cyttotaenia Hymenolepis Mosgovoyia Nematodos Capillaria Graphidium Nematodirus Passarulus Strongyloides Trichostrongylus Trichuris

HÍGADO Protozoos Eimeria Trematodos Fasciola Dicrocoelium Cestodos Echinococcus Cysticercus Nematodos Capillaria

APARATO RESPIRATORIO Nematodos Protostrongylus

APARATO UROGENITAL Nematodos Capillaria

MÚSCULO Protozoos Sarcocystis Toxoplasma

PIEL Y TEJIDO SUBCUTÁNEO Artrópodos Arácnidos Ácaros de la sarna Notoedres Psoroptes Sarcoptes Cheyletiella Gamásidos Ornithonyssus Ixódidos Haemaphysalis Hyalomma Ixodes Rhipicephalus Insectos Anopluros Haemodipsus Sifonápteros Spilopsyllus Echidnophaga Xenopsylla


MANU

ALES

UEX

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ÍNDICEPORTADA

PECES

APARATO DIGESTIVO Protozoos Ceratomyxa Eimeria Entamoeba Glugea Hexamita Trematodos Diplostomun Cestodos Bothriocephalus Khawia Eubothrium Nematodos Capillaria Acantocéfalos Echinorhynchus Acanthocephalus

SISTEMA VASCULAR Y AGALLAS Protozoos Cryptobia Nosema Pleistophora Henneguya Haemogregarina Myxosoma Chilodonella Trichodina Tripanoplasma Trypanosoma Trematodos Sanguinicola Nematodos Philometra

MÚSCULO, TEJIDO CONECTIVO Y CARTÍLAGO Protozoos Ceratomyxa Glugea Henneguya Myxosoma Pleistophora Sphaerospora

CAVIDAD CORPORAL Cestodos Diphyllobotrium Ligula Nematodos Anisakidae Philometra


NUAL

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ÍNDICEPORTADA

PIEL Y TEJIDO SUBCUTÁNEO Protozoos Amyloodinium Ceratomyxa Chilodonella Costia (Ichtyobodo) Cryptocarion Dermocystidium Epistylis Glugea Henneguya Ichthyophtrius Kudoa (Cloromyxum) Oodinium Pleistophora Sphaerospora Trichodina

Monogeneos Benedenia Dactylogirus Gyrodactylus Trematodos Cryptocotyle Moluscos Unionidae Anélidos Piscicola Artrópodos Crustáceos Argulus Ergasilus Lernaea


MANU

ALES

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ÍNDICEPORTADA

ABEJAS

APARATO DIGESTIVO Protozoos Malpighamoeba

APARATO RESPIRATORIO Artrópodos Arácnidos Acarapis

ECTOPARÁSITOS Artrópodos Arácnidos Varroa Insectos Dípteros Braula Senotainia

Manual Práctico - de Parasitología Veterinaria - Dehesa - UEx

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