Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

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Tesis de Posgrado

Intoxicación por cianuro : enzimasIntoxicación por cianuro : enzimasmarcadoras de su toxicidad ymarcadoras de su toxicidad y

desarrollo de posibles agentesdesarrollo de posibles agentesdetoxificantesdetoxificantes

Buzaleh, Ana María

1988

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Buzaleh, Ana María. (1988). Intoxicación por cianuro : enzimas marcadoras de su toxicidad ydesarrollo de posibles agentes detoxificantes. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2116_Buzaleh.pdf

Cita tipo Chicago:Buzaleh, Ana María. "Intoxicación por cianuro : enzimas marcadoras de su toxicidad y desarrollode posibles agentes detoxificantes". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.Universidad de Buenos Aires. 1988.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2116_Buzaleh.pdf

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

INTOXICACION POR CIANURO.

ENZIMAS MARCADORAS DE SU TOXICIDAD Y

DESARROLLO DE POSIBLES AGENTES DETOXIFICANTES

por:

ANA MARIA BUZALEH

DIRECTOR:Dra. Alcira M. de] C. BatJJe

CONSEJERO:Dra. Alcira M. de] C. Batlle

LUGARDE TRABAJO:Centro de Investigaciones sobrePorfirinas y Porfirias (CIPYP). Departamento deQuimica Biológica. Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires. ConsejoNacional de Investigaciones Científicas y Técnicas(CONICET)

Tesis presentada para optar a] título de:

DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICAS

1988¿3:3

A MI FAMILIA

A JORGE

INDICE GENERAL

AGRADECIMIENTOS

ABREVIATURAS

OBJETIVOS

INTRODUCCION

- CAPITULO I: CIANURO

1.5.1.6.1.7.

IntroducciónFuentes de intoxicaciónFisiopatología de Ja intoxicaciónArtificios acerca de Ja definición de Jatoxicidad de Jos cianuros y cianógenosCianuro como inhibidor metabólicoAntagonistasReferencias

- CAPITULO II: RÜDENASA

II.].II.2.11.3.11.4.11.5.11.6.II.7.II.8.

IntroducciónDistribución biológicaPropiedades cataJíticasPropiedades proteicasMecanismo de acciónFunciones biológicasRodenasa y cianuroReferencias

- CAPIÏULÜ III: S-ADENÜSIL-L-MEÏIÜNINA

III.].III.2.111.3.

Funciones biológicasAbsorción y excreción de la SAMReferencias

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12

27

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6]

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73

BÜ

83

89

89

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93

MAlERIALES Y METODOS

— CAPIÏULO I: MATERIALES

1.]. EquiposI.2. Reactivos1.3. Rodenasa1.4. Animales

- CAPITULO II:

II.l.11.2.11.3.II.II.II.II.

4.

NIONUW

METODOS

Preparación delos tejidos animales utilizadosDeterminación de aCtividades enzimáticasDeterminaciónde la concentración proteicaMedición de cianuroDeterminacióndeazufre lábilMedición de sulfocianuro directoReferencias

RESULTADOS Y DISCUSION

- CAPITULO I:

I.

I-l

I-l o

CAPITULO

II.l.II.2.11.3.II.4.

CAPITULO

III.l.

l.

.2.

INTDXICACIÜN ORAL CRONICA POR CIANURÜ

Determinación de los niveles tisulares decianuroActividad de citocromo oxidasActividad de rodenasaDeterminación de los niveles tisulares deazufre lábilDeterminación de los niveles tisulares desulfocianuroConclusionesReferencias

II: INTOXICACIDN PDR CIANURÜ VIA SUBCUÏANEA

Determinación de la dosis óptimaDeterminación del tiempo de recuperaciónEfecto de la administración periódica de cianuroReferencias

III: INTDXICACIÜN AGUDA POR CIANURÜ

Actividad de citocromo oxidasa

Página

94

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JÜO

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JD}

103

103

104lÜ6

lÜ7

JOB

JOB

lll

JJZ

JJZJZÜ

126

135

136

137

III.III.III.III.III.III.

CAPITULO IV:

\IO\\flJ-\\HN

Actividad de rodenasaNiveles sanguíneos de azufre lábilNiveles de sulfocianuroActividad de ALA-DConclusionesReferencias

ENCAPSULAMIENTÜ DE RODENASA EN FANTASMAS

DE ERIÏRÜCITOS

IV.l. Condiciones óptimas de encapsulamientoIV.2. Prooeso de encapsulamientoIV.3. Ensayos ¿n vitnoIV.4. Ensayos ¿n uÁvoIV.5. ConclusionesIV.6. Referencias

CAPITULO V: ESTUDIOS

V.l. RodenasaV.2. ALA-D

V.3. Citocromo oxidasaV.4. ConclusionesV.5. Referencias

CAPITULO VI:

V1.1.V1.2.V1.3.V1.4.V1.5.

CAPITULO VII:VII.l.

ESTUDIOS CINEIICOS DE RODENASA HEPATICA

Estudios preliminaresCurva de saturaciónEfecto del cianuro y del SAMConclusionesReferencias

CONCLUSIONES GENERALES

Referencias

Página

137l45149

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158159

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160l64167

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192l9219420]202

203206

AGRADECIMIENTOS

Agradezco sinceramente a mi Directora, Ja Dra. AlciraBatlle por haberme brindado su invaJorabJe experiencia y conocimientos.

También, agradezco a la Dra. Elba Vázquez, quien en tgdo momentome brindó Su valiosa colaboración en e] desarrollode Jas experiencias que componenesta Tesis y en Ja elaboraciónde] texto.

Agradezco a Ja Lic. Susana Afonso por Ja dedicaciónpuesta en Ja realización de Jos dibujos de esta Tesis y en Jacorrección de Jos originales.

A Jos Lic. César Polo, Susana Afonso, Ernesto Schoua yJas Dras. Nora Navone y Elba Vázquez por su constante compañe­rismo, ayudándome y aJentándome en todo momento.

A] Dr. Luis Espínola por su ayuda en e] aprendizaje delas técnicas con animales.

A] Centro Panamericano de Zoonosis y, en especia],a JaDra. Amoroso de] Instituto Malbrán por haberme donado Jos animaJes necesarios para realizar la mayorparte de Jas experiencias.

A] CONICET,Ja SUBCYÏ, Ja Secretaría de SaJud Pública

de] Ministerio de Bienestar Socia] y e] Banco de Ja Nación Argentina por Jos subsidios otorgados para Ja realización de este Trabajo.

A Laboratorios Promeco por suministrarme gentiJmentee] Trans-meti] (SAM).

Y, a todos Jos integrantes de] CIPYPque hicieron posible la concreción de este Trabajo, sinceramente gracias.

ABREVIATURAS

ALA-D

SAM

GSH

SNP

DMAP

TCA

Tris

GR

FGR

FGR(rodenasa+ tiosulfato)

DL50

SNC

Acido -aminolevúlico dehidrasa

S-adenosil-L-metionina

Glutatión

Nitroprusiato de sodio4-Dimetilaminofenol

Acido tricloroacéticu

TRI(hidroximetil>aminometano

Glóbulos rojos

Fantasmas de glóbulos rojos vacíos

Fantasmas de glóbulos rojos cargadoscon rodenasa y tiosulfatoDosis letal 50

Sistema Nervioso Central

IntraperitonealIntramuscular

Intravenosa

Subcutánea

OBJETIVOS

La discusión sobre la detoxificación delcianuro ¿n u¿­vo debe necesariamente comenzar considerando el pool de azufresulfano, su composición y sus análogos, incluyendo el sulfuro inorqánico. Teniendo en cuenta la estrecha relación existente entre Jos efectos tóxicos del cianuro y la actividad de la enzimadetoxificante rodenasa, fue objetivo de] presente trabajo de Tgsis investigar los niveles de esta enzimaen distintos tejidosde animales intoxicados concianuro en forma crónica y aguda ycompararlos con los niveles normales, y estudiar el efecto dela administración de un compuesto sulfurado, posible detoxifi­cante del cianuro la S-adenosil-L-metionina (SAM)sola o comoagente potenciador del antídoto tiosulfato.

A su vez, con el fin de conocer el grado de intoxica­ción, se consideró de interés determinar la actividad de la enzima citocromo oxidasa en los distintos casos y de una enzimasulfhidrílica y con un grupo amino en su sitio activo, como laó-aminolevúlico dehidrasa(ALA-D) cuya actividad pudiera modificarse por la disminución de] pool de S debido al exceso de cianuro presente en el tejido.

Ademásde los parámetros indicados, se midieron losniveles tisulares de sulfocianuro, producto de la detoxificaióndel cianuro, y se investigó su interrelación con el pool de azgfre sulfano mediante la determinaciónde azufre lábil en los te­jidos analizados.

Debido a que el tiosulfato penetra en las membranas muylentamente limitando así su distribución intracelular y que laenzima rodenasa se encuentra localizada predominantemente en lamitocondria, un posible antídoto para el cianuro podria desarrgllarse si el tiosulfato y la enzima actuaran encondiciones másóptimas, por ejemplo facilitando la localización tisular conjugta del donor de azufre y la sulfotransferasa. Entonces, el tigsulfato se ubicaria mejor en los sitios de distribución de laenzima y viceversa. Teniendo en cuenta estos conceptos, se en­capsuló rodenasa altamente purificada y tiosulfato de sodio eneritrocitos de ratones y, para evaluar su capacidad detoxificagte, estos fantasmas cargados con la enzima y su sustrato se in­yectaron a ratones intoxicados con cianuro de potasio en formaaguda.

Considerando Ja capacidad de transulfuración de Ja SAM,molécula fisiológica presente en los mamíferos, se decidió estgdiar su efecto ¿n uizno sobre Jas actividades de las enzimas r3denasa, ALA-Dy citocromo oxidasa hepáticas afectadas por e] tgxico en las condiciones de experimentación.

Se investigó también la cinética de Ja enzima rodenasaen hígado de ratones normales y e] efecto que produciría sobreJos parámetroscinéticosla administración de distintas concentrgciones de cianuro por vía intraperitonea] en presencia o ausegcia de SAM.

INTRODUCCION

CAPITULO I

CIANURÜ

Página

1.] Introducción J

1.2. Fuentes de intoxicación 2

1.2.]. Causas naturales 21.2.2. Causas relacionadas con e] hombre 3

1.3. Fisiopatología de Ja intoxicación 5

1.3.]. Intoxicación aguda 61.3.2. Intoxicación crónica 71.3.3. Absorción, destino y excreción 9

1.4. Artificios acerca de Ja definición de Ja toxicidadde Jos cianuros y cianógenos 12

1.4.]. Toxicidad de cianuro 131.4.1.]. Signos de toxicidad 131.4.1.2. Resultado de Ja autopsia 131.4.1.3. Determinación de la concentración

de cianuro la1.4.1.3]. Selección de Jos tejidos 141.4.1.32. Factores que influyen en Ja

medición de Ja concentraciónde cianuro J7

1.4.1.33. Detección y medición de Jaconcentración de cianuro 2]

1.4.] 4 Medición de Ja actividad decitocromo oxidasa 23

1.4.2 Toxicidad de Jos cianógenos 241.4.2.]. Signos de toxicidad 251.4.2.2. Comparación dedatos de DL50 261.4.2.3. Uso de antídotos de] cianuro 261.4.2.4. Medición de Ja concentración de

cianuro 26I 4.2.5 Estudios ¿n vátno sobre

cianogénesis 27

Página

1.4.2.6. Medición de la actividad decitocromo oxidasa 27

1.5. Cianuro como inhibidor metabólico 27

1.5.]. Respiración 301.5.2. Metabolismo de Ja glucosa 3]1.5.3. Función de Ja tiroides 321.5.4. Moiibdoenzimas 331.5.5. Otras metaloenzimas 341.5.6. Interacciones no-metálicas 35

1.6. Antagonistas 37

1.6.]. Por unión química 391.6.1.]. Nitritos 391.6.1.2. Compuestos de cobalto 40I.6.1.3. Formación de cianhidrinas 41

1.6.2. Por biotransformación 421.6.3. Por mecanismo desconocido 44

1.6.3.]. Cloropromazina 441.6.3.2 Oxígeno 45

1.7. Referencias 49

I. CIANURÜ

I.l. INTRODUCCION

El ácido cianhídrico (ácido prúsico o nitrilo fórmico)es un veneno de acción muy rápida. La inhalación de sus vaporesproduce efectos tóxicos graves y la muerte se desencadena en pgcosminutos yhasta las 3 horas siguientes, según la concentraciónrespirada (GoodmanyGilman, 1978). La acción del ácido cianhi­drico se debe al ión cianuro; por lo tanto. todos los cianurossolubles son igualmente tóxicos.

El ácido cianhídrico es un líquido incoloro, con olora almendras amargas, cuyo punto de ebullición es muy bajo(27 oC); sus vapores son más livianos que el aire, pudiendo en­tonces contaminar Fácilmente otros ambientes si se lo utiliza,por ejemplo, como plaguicida o se genera de algún modo.

Los cianuros de potasio y de sodio son las sales tóxi­cas más difundidas, una concentración de l mg/kg peso corporales suficiente para provocar la muerte en un adulto (Ermans ycol., l972).

Los cianuros seemplean muchoen metalurgia, galvaniza­ción, limpieza de metales, sintesis química e investigación. Enel hogar, están presentes en los pulimentos para la plata,en igsencticidas y raticidas, y en semillas de algunos Frutos.

Además, existen productos cuyo contenido de cianuro esimportante biológicamente: los cianógenos que pueden sintetiza;se o existir naturalmente. Los nitrilos sintéticos usados confines industriales, domésticos y terapéuticos incluyen: acetonitrilo, acrilonitrilo, fumaronitrilo, malononitrilo, propionitrilo, nitroprusiato de sodio y succinonitrilo (NIÜSH,l978;Hartnung, l982). La principal fuente de cianógenos naturales seencuentra en las plantas habiéndose identificado glucósidos cianogénicos en aproximadamente 200 especies (Montgomery, l969;Nestel y Mac Intyre, l973; lowill y col., l978; Nartey, l980;Vennesland y col., l982).

1.2. FUENTES DE INTÜXICACIÜN

El cianuro ha creado problemas complejos para la socigdad moderna y muchos de ellos están relacionados con la poluciónindustria] (Voorhoeve y co]., 1975). En muchoscasos su toxici­dad proviene de la ingestión de alimentos que contienen cianuroy ciertos riesgos ocupacionales se han desarrollado con e] in­cremento del uso industria] del cianuro. En medicina, existendrogas que liberan cianuro. Sin embargo, este tóxico no es ensu totalidad un producto de la civilización, su existencia datade tiempos prebióticos y fue un compuesto clave en la biogéne­sis (Way, 1984).

1.2.]. Causas naturales

Existe una gran variedadde fuentes naturales que libe­ran cianuro al medio ambiente cuya contribución a la toxicidadhumanaes dificil de evaluar.

El cianuro fue una de las primeras moléculas poliatómicas orgánicas detectada en el espacio interestelar (Üro, 1972;Oro y co]., 1982) y, basándose en la presencia de cianuro en laatmósfera del sol y las estrellas, se cree que, anteriormente ala existencia de] hombre en este planeta, la concentración deacido cianhidrico atmosférico era mayor que la actual (Way,1984). Además, el cianuro es uno de los precursores importantesde la síntesis abiótica de constituyentes biológicos esencialestales como aminoácidos, purinas y pirimidinas (Wolman, l972). gtras Fuentes naturales de cianuro son lo organismos biológicos:bacterias, algas, hongos y plantas que pueden formar y excretarcianuro (Way, 1984).

Los glucósidos cianogénicos, lípidos cianogénicos ycianohidrinas están ampliamente distribuidos en el reino vege­tal y la existencia de glucósidos cianogénicos en alimentos yForraje constituye un problema en muchas partes del mundo(Ermans y co]., 1972; Nartey,l982). Las raíces de mandioca (Ma­n¿hot eócuienta cnantz) resultan altamente tóxicas debido a sucontenido de linamarina y en menor cantidad lotoaustralina(Osuntokun y co]., 1969; Conn, 1973; Dsuntokun, l980). Este a­limento provee alrededor del 7D % de las calorias en las dietasde varias poblaciones del oeste de Africa y debido a ello, en198] se produjo una epidemia de neuropatia tropical en el norte

de Mozambique(Casadei y col., 1984; Cliff y col., 1984).

Otros alimentos con un alto contenido de glucósidoscianogénicos son: almendras amargas; Frutos con carozo: cerezas,duraznos, ciruelas; batata; maiz; brotes de bambú; linaza, porotos y mijo. Entre otros vegetales con similares propiedades, sepueden enunciar: hojas de laurel cerezo, a partir de las cualesse prepara el "agua de laurel cerezo" de la Farmacopea,que po­see pequeñas cantidades de cianuro; ciertas plantas forrajeras(sorgo, garbancillo, pata de perdiz) que en condiciones especiales pueden provocar intoxicación en el ganado; algunas variedades de porotos (PhOóQOZuó¿¿matu4) conocidos como porotos de Java o Birmania; la semilla del lino, etc. En Estados Unidos ocu­rrió una intoxicación aguda por cianuro luego de la ingestiónde batidos de leche con sabor a almendras preparada a partir dealmendras de damasco (Way, 1984).

El máximorendimiento de cianuro a partir de estas fuegtes puede llegar a los JOB-300 mg/lOO g de tejido (Montgomery,1969) por lo tanto la cantidad de cianuro ingerido puede serciertamente significativa, especialmente si se tiene en cuentaque la dosis letal enhumanosseencuentra dentro del rango deÜ,5-3,5 mg/kg peso corporal (Ermans y col., 1972). De todos mo­dos los procesos normales de preparación de los alimentos redu­cen el contenido de cianuro y precursores de cianuro a nivelestolerables, siempre que dichos alimentos no sean e] principalcomponente de la dieta (Solomonson, 1982). Lo descripto ex­plicaría por qué este tóxico puede predisponer a varias enfermgdades clínicas (Levine, 1967).

1.2.2. Causas relacionadas con el hombre

Los desechos que contienen cianuro, producidos por e­lectroplatinado, acero, aluminio e industrias de pintura y cie;tas operaciones mineras, contaminan rios y e] agua de bebida(Way, 1984). Durante el proceso de electroplatinado y de templado superficial se desprende gas cianhidrico y particulas de cianuro (Chandra y col., 1980). Otra de las fuentes de ácido cian­hídrico en el aire es la industria petroquímica (Way, 1984).

La contaminación del aire por cianhidrico se producedurante los incendios debido al alto contenido de materialesplásticos en los hogares. El ácido cianhídrico se libera duran

te la pirólisis de polímeros que contienen nitrógeno (Jellineky Takata, 1977; Tsuchiya y Sumi, 1977; Woolley y co]., 1979) yes, después del monóxido de carbono, probablemente el narcóticomas importante producido por el fuego. Anderson y Harland(l982)realizaron un estudio patológico de víctimas de un incendio enuna región de Escocia, los autores encontraron niveles elevadosde cianuro en sangre en el 78 % de las victimas Fatales y en un3] % los valores ya eran considerados tóxicos. En varios traba­jos se ha descripto un modelo animal para estudiar los efectosincapacitantes producidos por la exposición a gases simples presentes en el fuego y a productos de descomposición térmica demateriales poliméricos (Purser y Grimshaw, 1982; Purser yBuckley, 1983; Purser y Woolley, 1983). Purser y col. (1984)realizaron un estudio en monos sobre la toxicidad de atmósferasde gas cianhidrico y de atmósferas producidas por la pirólisisde poliacrilonitrilo (PAN), el cual es utilizado en forma de flbras para telas, cobertores de tapiceria, relleno de almohado­nes y ropa en general. Estos autores hallaron que los efectosfisiológicos de atmósferas de PANeran idénticos a los produci­dos por e] gas cianhidrico solo, sugiriendo que durante los in­cendios el cianhidrico podria producir una rápida incapacita­ción aún a bajos niveles de cianuro en sangre, y la muerte ocu­rriría más tarde debido a la intoxicación por monóxido de carbgno u otros factores.

El cianuro puede también formarse a partir de tiocianatos orgánicos que son comúnmente empleados como insecticidas(Ohkawa y Casida, 197]).

Finalmente, una de las principales fuentes de inhala­ción de cianhidrico que afecta al hombre es el humo de] tabaco,donde la concentración de este tóxico no se ve disminuida porel uso de cigarrillos con bajo contenido de alquitrán , nicotina o filtros (Way, 1984). Se han hallado altos niveles de ciangro y sulfocianuro en sangre de fumadores en comparación con losencontrados en no-fumadores (Wilson, 1965; Wilson y Matthews,1966; Pettigrew y Fell, 1973; Thomson y Anderson, 1980).

Existe un gran número de drogas que liberan cianurocomonitroprusiato de sodio, succinonitrilo, Jaetrilo.

El nitroprusiato de sodio (SNP) es un potente vasodilatador de corta acción usado comúnmente en casos de emergenciapara el tratamiento de hipertensiones y varias formas de disfug

ciones cardiacas y también para inducir hipotensión durante la anestesia (Page y co]., 1955; Taylor y co]., 1970; Siege] y col:1971; Styles y co]., 1973; Wildsmith y co]., 1973; Ivankovich yco]., 1978). La molécula de SNPcontiene 5 grupos cianuro

(Na Fe(CN)5N0)siendo la concentración de cianuro libre producida gn sangre dependiente de la cantidad de SNPsuministrada(Vesey y co]., 1976; Aitken y co]., 1977; Bogusz y co]., 1979;Pasch y co]., 1983). En pacientes que habian recibido esta dro­ga, se demostró un considerable aumento de los niveles de ciangro tanto en plasma como en glóbulos rojos (GR) (Vesey y co].,1976). El cianuro generado en animales como consecuencia deltratamiento con nitroprusiato, parece reaccionar principalmentecon la hemoglobina para Formar cianometahemoglobina (Smith yKruszyna, 1974; Vesey ycol., 1977). Nakamura y col. (1977) ob­servaron que el SNPinhibia la reSpiración mitocondrial (63,ü%en la captación de oxigeno) en higado de rata.

El laetrilo, una preparación que ha sido usada como a­gente antineoplásico (Morrone, 1962; Krebs, 1970), puede produ­Cir elevados niveles de cianuro, especialmente si se ingiere conjuntamente con alimentos que contienen enzimas que lo degradana cianuro (Schmidt y co]., 1978). La amigdalina, un glucósidocianogénico que es el principal componente del laetrilo, puededegradarse en el intestino a cianuro y benzaldehído. Se han-descripto varios casos de envenenamiento por cianuro luego de laingestión de laetrilo suministrado en forma oral o como enema(Humbert y co]., 1977; Smith y co]., 1977; Ortega y Creek, 1978;Braico y co]., 1979).

Otros compuestos que Forman cianuro son el succinonitrilo, empleado como antidepresivo y el sulFocianuro, un agente agtitiroideo. Este último, puede degradarse a cianuro por mediode peroxidasas, aunqueseha demostrado que e] significado bio­lógico de esta reacción es mínimo (Sylvester y co]., 1983).

1.3. FISIÜPATOLÜGIA DE LA INTÜXICACIÜN

Todas las acciones farmacológicas del ión cianuro sonel resultado de la anoxia histotóxica que produce este ión.

La penetración del ácido cianhídrico por vía inhalato­ria o la ingestión de cianuros con la inmediata liberación de

cianhidrico en e] estómago, en presencia del jugo gástrico, lleva rápidamente el veneno a la intimidad de los tejidos donde agtúa inhibiendo el sistema citocromo oxidasa, produciéndose asila muerte celular por alteración enzimática ¿n ¿ita (Calabresey Astolfi, 1972).

Es necesario enfatizar que e] envenenamiento por estetóxico es, muy frecuentemente,un envenenamiento másico, dondelacantidad de cianuro excede la concentración minima necesaria pgra inhibir la citocromo oxidasa y donde, probablemente tambiénse inhiben muchas otras enzimas y sistemas biológicos (Way,1984). Comoconsecuencia de la anoxia histotóxica producida enel envenenamiento agudo por cianuro, se produce un cambio delmetabolismo aeróbico al anaeróbico y por lo tanto, el desarro­llo de una acidosis láctica (Graham y col., 1977; YamamotoyYamamoto, 1977).

I.3.l. Intoxicación aquda

Los sintomas del envenenamiento con cianuro aparecenluego de unos pocos segundos o minutos de la ingestión de loscompuestos o de la respiración de vapores que lo contienen(Goodman y Gilman, 1978).

Los signos tipicos de una intoxicación aguda por cianuro, comúna los animales y el hombre, son: hiperpnea,incoordinación de los movimientos, arritmia cardiaca, convulsiones, coma,paro respiratorio y muerte.

Cuando se emplea una dosis letal minima, los efectosletales están principalemnte dirigidos al Sistema Nervioso Cen­tral (SNC). A altas dosis se producen signos cardiovasculares.El cerebro es más sensible al cianuro que el corazón, en casosen los que se habia administrado una dosis letal, frecuentemen­te se ha observado que mientras la actividad eléctrica del cergbro habia cesado, el corazón aún seguia latiendo (Way, 1984).

Desde hace más de 50 años, se han venido estudiandolosefectos fisiológicos del cianuro ¿n VÁUO(Bernthal y col., 1928;Dixon y Elliott, 1929; Barcroft, 193]). En cuanto al efecto deeste tóxico sobre los quimiorreceptores carotideos, el cianuropromueve una disminución en el ritmo de] corazón (Jacobs y col.,l97l) y también una estimulación de la respiración (Levine,l975)que pueden ser anulados por el oxigeno (Von Euler y col., 1939).

Algunos de los parámetros fisiológicos mas sensibles alteradospor el cianuro son los cambios eléctricos en el corazón (Cope yAbramowitz, 1960) y en el cerebro (Ivanov, 1959). Se han lleva­do a cabo estudios adicionales sobre el efecto del cianuro en elsistema cardiovascular enfocados hacia la acción de este tóxicosobre los reflejos de los quimiorreceptores y sobre el SNC(Paulet, 1960; Calvelo y co]., 1970; Üffterdinger, 1970; Krasney,l97l).

1.3.2. Intoxicación crónica

Probablemente los mayores efectos adversos del cianurose deban a su toxicidad crónica. Por exposición en forma crónica a bajos niveles de cianuro se produce .una serie de sintomasque suelen conocerse como el "síndrome crónico del cianuro" yque se manifiestan en una variedad de formas. Debido a que engran parte las evidencias son de carácter epidemiológico o pro­venientes de estudios de campo,sincondiciones experimentalescontroladas, es dificil precisar la contribución del cianuro alas enfermedades clínicas. No obstante, se presume que la into­xicación por cianuro es una de las principales causas de variasenfermedades humanas. Estas entidades pueden resultar de una elposición elevada de cianuro, una falla en los mecanismos dedetoxificación, factores nutricionales o alguna combinación deestos hechos. Las deficiencias en la detoxificación pueden serla causa de errores innatos del metabolismo o de un agotamientodel sustrato detoxificante del cianuro, todo ello secundario alestado nutricional (Way, 1984).

Wilson (1983) ha hecho un estudio acerca del papel delcianuro en relación a ciertas enfermedades humanas. Probablemegte la principal evidencia de una enfermedad humanadebido alcignuro es la ambliopía del tabaco. Ciertas anormalidades visualesestán asociadas con la historia de grandes fumadores y una dis­

minución en la cantidad de vitamina B12 (Wokes y Moore, 1958;Wilson y Matthews, 1966). Por tratamiento con hidroxicobalamina,un antagonista del cianuro, se observó una reversión de los disturbios visuales (Chisholm y co]., 1967) y un aumento en la concentración de cianocobalamina en plasma (Wilson y co]., l97l).

Otra entidad clinica debida en parte a la exposiciónal cianuro y a un error innato del metabolismo es la atrofia ógtica hereditaria de Leber (Leber, l87l; Wilson, 1963) en lacual

ocurre una falla visual en forma subaguda o insidiosamente y rgsulta en un escotoma central bilateral más o menos severo y palidez de los discos ópticos (Smith y co]., 1973; Nikoskelainen yco]., 1977). Esta falla puede desencadenarse por Factores extegnos y el cianuro presente en el cigarrillo puede ser uno de e­llos (Wilson, 1963). Por lo tanto, cuando individuos poseedoresde esta enfermedad, son expuestos a una atmósfera con cianuro cgmo por ejemplo el humode] cigarrillo, la concentración plasmatica y urinaria de sulfocianuro es menor que en los individuosnormales a pesar del hecho que en estos pacientes la actividadde rodenasa hepática es normal (Wilson, 1965). Por el contrario,Cagianut y col. (1984) encontraron que en biopsias hepáticas depacientes con atrofia óptica de Leber la actividad de rodenasaestaba muydisminuida respecto de los valores controles.

La patología más difundida atribuible a] cianuro es laneuropatia atóxica tropical que está asociada con e] consumo dela mandioca en forma crónica. Los signos y sintomas de esta en­fermedad (Money, 1958; Üsuntokun y co]., 1968) han sido relacignados con la ingestión de mandioca y la concentración de sulfo­cianuro en plasma (Clark, 1935; Monekosso y Wilson, 1966;Üsuntokun y co]., 1969; Üsuntokun, 1980). Los estudios patológicos han demostrado que, cuando la mandioca es e] principal ali­mento (Üsuntokun, 1972), la toxicidad se manifiesta por desmie­linización, una disminución en la velocidad de conducción de losnervios periféricos, y cambios en el nervio auditor.

Otra causa de toxicidad por cianuro es de tipo ocupa­cional y ocurre en algunas industrias en las cuales la exposi­ción al ácido cianhidrico es elevada (El Ghawabi y col.. 1975;Chandra y co].. 1980) El Congreso Americano de Control Indus­trial (1973) fijó la concentración atmosférica maximapermisiblepara 8 horas de exposición en 10 ppm (ll mg/m3) y en 5 mg/m3 entérminos de] cianuro. Durante el proceso de electroplatinado,formación de una capa metálica sobre una superficie por electrgdeposición y en e] de carbonado de aceros, introducción de car­bono en la superficie de aceros con bajo contenido de carbono a900 °C, se desprende gas cianhidrico y particulas de cianuro.Chandra y co]. (1980) efectuaron un estudio en trabajadores ex­puestos a estas atmósferas y hallaron que,si bien la concentra­ción de cianuro presente se encontraba entre 0,2 y 0,8 mg/m3,los trabajadores mostraban signos típicos de envenenamiento por

acido cianhídrico.El efecto del cianuro sobre las oxidaciones cerebrales

se refleja en la actividad eléctrica del cerebro (GoodmanyGilman, l978).Laadministraciónde cianuro de sodio puede produ­cir una rápida pérdida de la actividad eléctrica seguida de unperíodo prolongado de depresión anormal de la amplitud de onda(Burrows y col., 1973). Brodie (1959) observó que pequeñas dosisde cianuro producen un efecto directo sobre las neuronas respi­ratorias en el animal intacto.

Los cambios patológicos que ocurren durante el envene­namiento por cianuro varían con la dosis, la ruta y el tiempode exposición (Ballantyne, 1970). La lesión más especifica ob­servada es sobre el SNC. Estudios en monos indicaron predominantemente lesiones en la materia blanca y además, se observa másFrecuentemente necrosis que desmielinización (Hurst, 1940;Levine y Stypulkowski, 1959; Hirano y col., 1967; Levine, 1967).También se apreciaron cambios patológicos en e] corazón (Suzuki,1968), siendo la patología hallada en el miocardio consistentecon los estudios realizados en el hombre por Wexler y col.(1947).

Varios autores han tratado de probar que el cianuro esun agente etiológico en las neuropatias humanas (Lessell, 197];Lessell y Kuwabara, 1974). Si bien estos estudios demostraronen ratas que se producían lesiones nerviosas, similares a lasobservadas en humanos, la dosis requerida para producir el dañose encontraba dentro del rango letal.

Por último, una ingestión crónica de cianuro puede afegtar la tiroides debido a la elevada Formación de sulfocianuro,desencadenando mixedema, gota tiroidea y cretinismo (Ermans ycol., 1972).

1.3.3. Absorción, destino y excreción

El ión cianuro se absorbe con Facilidad luego de su ad­ministración bucal o por vía parenteral. Tambiénpor contactolgcal prolongado con una solución de cianuro o con ácido cianhi­drico, puede producirse absorción por la pie] (Goodmany Gilman,1978).

Parte del cianuro absorbido se excreta comotal porlospulmones. El mayor porcentaje se convierte en sulfocianuro, por

medio de Ja enzima rodenasa (Lang, 1933) y también por acciónde Ja 3-mercaptopiruvato:cianuro qufotransFerasa (Fiedler yWood, 1956) (Reacción 1.1.).

C00“ . ., COOH

H-é-NHZML to sulfggrgsrai-tgrgsn5205+ ggOHHzC-SHZ H2 -SH2 3 (:H3

Cistcínu

+CN- tráïlsffoerasa "CN' rodenasu

SCN'+ CHJ-CO-COOH 503:“;ch

Reacción 1.].

Esta conversión ocurre en Ja mucosa de] tracto alimentario, enhígado y riñón y también en otros tejidos (Clemedson y co].,1960).

Aunquee] sulfocianuro es e] principal metabolito detransformación de] ión cianuro, Boxer y Rickards (1952) han de­mostrado que e] cianuro también puede oxidarse a dióxido de carbono y Formiato; de esta forma, e] carbono de] cianuro partici­pa en e] metabolismo de Jos compuestos de un átomo de carbono.Se comprobó que, en ratas que habian recibido 5 dosis diariasde 215 ug de Na14CN, e] 1,7 % de] carbono aparecia en e] aireexpirado, correspondiendo 9/10 a dióxido de carbono y e] 1/10restante a cianhidrico. E] 14€ aparece también en Jos grupos metílicos de Ja colina y metionina, y en Jos carbonos ureidos deJa alantoina; y una pequeña proporción en e] carbono de] grupociano de 1a cianocobalamina (Mushett y co]., 1952; Wokes yRicard, 1955).

Aparentemente e] ión cianuro también'puede combinarsecon Ja cistina ¿n vitae para Formar e] ácido 2-iminotiazoJi­din,4-carboxí]ico (Woody Cooley, 1956) (Reacción 1.2.). Asimis

'mo se encontró, ¿n vao, que este compuesto estaba presente enuna proporción de] 15 % en Ja orina de ratas inyectadas con1,5 mgdiarios de cianuro de potasio s.c., correspondiendo e]80 % a sulfocianuro. Además, este ácido esta presente en la sa­liva de individuos que manipulan cianuros alcalinos y en Ja ori

na de sujetos expuestos a] ácido cianhidrico.

S-CHZCH(NH2)C00H GHz-CHCOOH CH2—CHCOOH. CN’—-NCSCH2CHC00H——I ' == I

S-CHZCH(NH2)COOH l s N s NH“Hz \ / /‘f fi

NH2 NH

Reacción 1.2.

El organismo anima] excreta normalmente sulfocianuro.La saliva humana contiene un promedio de 0,0] % y la sangre no;mal aproximadamente 1,3] mg de sulfocianuro de potasio/100 ml.Los Fumadores consuetudinarios tienen valores mucho más eleva­dos (Orten y Neuhaus, 1984).

'La transformación de los cianuros alcalinos, adminis­trados en dosis subletales, se representa en el siguiente esquema':

orinaCIANURO-—--principal metabolito-a-SCN'

salivametabolitos menores—*—cianocobalamina

HCÜÜ-—-orinaaire

ácido 2-imi CNÜ' espirado biosíntesis de compuestosnotiazoJi-_ * con un átomo de carbono (-CH3)din-4.oarbg C02 C02 HCNxílico

Y

NH3

La desaparición rápida del cianuro del plasma y e] he­cho de haberlo detectado en eritrocitos hace pensar en el rolprotector que estas células ejercerían en la detoxificación delcianuro (Vesey y Wilson, 1978). Los glóbulos rojos son deficieg

tes en los sistemas enzimáticos presentes en otras células paraconvertir cianuro en sulfocianuro (Himwich y Saunders, 1948;Sórbo, 1962). La toxicidad del sulfocianuro (Goldstein y Rieders,l95]; Smith y Kruszyna, 1976) y del nitroprusiato (Smith yKruszyna, 1974; Posner y co]., 1977) se relacionó con los nive­les de cianuro aumentados.detectados en eritrocitos. lambién seobservó que los eritrocitos generan cianuro a partir de sulfo­cianuro ¿n u¿tno (Pines y Crymble, 1952; Goldstein y Rieders,1953).

En un estudio reciente se adjudicó a la ingestión decianuro un posible ro] en la patogénesis de la diabetes tropi­cal por desnutrición; se encontró que la excreción de sulfocia­nuro estaba disminuida después de la ingestión de cianuro cuan­do las ratas habían recibido una dieta restringida en proteínas(Mc Millan y Geevarghese, 1979 a). Esta observación haría supo­ner que en mamíferos existiría un sistema de degradación, sinrequerimiento de azufre.

Mc Millan y Svoboda IV (1982) estudiaron el rol de loseritrocitos en la detoxificación del cianuro y en el metabolis­model sulfocianuro. Sus observaciones indicaron que los eritrgcitos cumplirían una función comosecuestrantes del cianuro enla intoxicación pero no habría conversión de sulfocianuro a cianuro, no detectaron carbamilación de la hemoglobina y comproba­ron una total inmunidad de la hemoglobina al ataque químicopor el cianuro debido a su falta de uniones disulfuro.

1.4. ARTIFICIÜS ACERCA DE LA DEFINICIÜN DE LA TÜXICIDAD DE LOS

CIANURÜS Y CIANÜGENÜS

Una intoxicación aguda por cianuro puede producirse directamente a partir de la exposición a cianuros simples comoelácido cianhídrico o sus sales alcalinas o a partir de la bio­transformación de cianógenos químicamente más complejos. La ngturaleza, magnitud y el comienzo de los efectos ocasionados por.la administración en forma aguda de un cianógeno pueden ser di­ferentes de los producidos por una única dosis de cianuro libresuministrado por la mismaruta. Por lo tantose describirán cie;tos problemas técnicos relacionados con la definición de la to­xicidad del cianuro teniendo en cuenta los detalles con respec­

to a] diseño, conducta e interpretación de los procedimientos experimentales y analíticos (Ballantyne, 1983).

1.4.]. Toxicidad del cianuro

Frecuentemente se deben considerar 4 áreas principalesen relación al diagnóstico o confirmación de un envenenamientoagudo por cianuro: signos de intoxicación, caracteres de la au­topsia, medición de la concentración de cianuro en fluidos cor­porales y en los tejidos y el grado de inhibición de la enzimacitocromo oxidasa (Ballantyne, 1983).

1.4.1.]. Signos de toxicidad

Una combinación de hiperpnea,convulsiones y acidosisláctica es fuertemente sugestiva de un envenenamiento agudo porcianuro.

1.4.1.2. Resultado de la autopsia

Los hallazgos post-mortem son pocos y no específicosde una intoxicación aguda por cianuro (Sunshine y Finkle, 1964;Ballantyne, 1973). Congestión traqueal y hemorragias, con hemo­rragias alveolares, edemas cerebral y pulmonar y petequias delcerebro, meninges y pericardio son comunes para la mayoria delas rutas de exposición (Ballantyne, 1970, 1973). lambién soncomunes las erosiones gástricas en un envenenamiento oral. A pgsar de la hipoxia citotóxica que resulta en una disminución dela utilización del oxígeno arterial, la coloración de la sangrevenosa es variable, siendo roja brillante en aproximadamente lamitad de los casos (Pryce y Ross, l963; Ballantyne, 1970) y porlo tanto no es una guia real de la causa de la intoxicación. Ensituaciones clínicas, no obstante, y cuando no es posible detegminar la concentración de cianuro en sangre, la medición de unapresión de oxigeno arterial normal y disminución de la diferen­cia arterio venosa de presión de oxígeno es útil comoevidenciapara el diagnóstico de un envenenamiento agudo.

A pesar de que el nivel umbral de detección de acidocianhídrico por medio del olfato en la atmósfera es de aproximadamente l ppm (Guatelli, l964), dicho olor puede perderse o enmascararse por la presencia de otros olores y por el hecho deque del 20-40 % de la población es incapaz de detectar dicho o­lor (Gwilt, 196]; Brown y Robinette, 1967).

1.4.1.3. Determinación de la concentración de cianuro

La determinación de la concentración de cianuro en Fluidos biológicos y tejidos es una de las principales consideracignes para definir la toxicidad letal de] cianuro. No obstante esnecesario tener en cuenta ciertas precauciones con respecto almuestreo de los tejidos, su estacionamiento y análisis y la in­terpretación de un significado biológicamente adverso de los rgsultados (Ballantyne, 1983; Way, 1984). Ademas, la distribuciónde cianuro en los órganos varía considerablemente con la ruta deadministración y las especies animales (Ballantyne, 1975, 1983).

I.ü.l.3l. Selección de los tejidos

La selección de los tejidos, tanto en e] envenenamien­to agudo experimental como en los casos humanos Fatales, depen­de en parte de la vía de exposición a] tóxico.

En la Fiqura 1.]. se muestra comovarió la concentra­ción de cianuro en varios tejidos luego de un envenenamiento lgtal por ácido cianhídrico por diferentes rutas (Ballantyne,1983). La concentración de cianuro en higado varió marcadamentecon la vía de intoxicación y es mayor cuando la administraciónes intraperitonea] y oral que cuando es por vía percutánea o ighalación. Comparandodistintas formas de exposición se encontróuna concentración de cianuro menor en los tejidos de animalesque recibieron dosis letales de ácido cianhidrico por inhala­ción. Esto es debido probablemente a la inmediata y continua captación de cianuro desde el aire alveolar dentro de la circula­ción pulmonar y a la ausencia de] primer paso de detoxificación,lo cual llevaría a una rápida acumulación de concentraciones tgxicas de cianuro en los tejidos. La menor variabilidad ocurrióen cerebro y miocardio. Las concentraciones en cerebro son similares en materia gris y blanca (Ballantyne, 1975).

La influencia de la especie sobre la concentración decianuro hallada en varios tejidos se muestra en la Fiqura 1.2.(Ballantyne, 1983). Existe marcada variabilidad de las concentraciones de cianuro en riñón y bazo. Las concentraciones halladasen el bazo de estas especies difieren de las halladas en casoshumanos Fatales de envenenamiento donde la cantidad de cianuroen el bazo puede ser varias veces superior a la medida en sangre(Sunshine y Finkle, 1964; Ansel] y Lewis, 1970). Las concentra­ciones de cianuro en cerebro y miocardio ventricular son simila

res para las diferentes especies y generalmente mayor quelOÜ Hg/JOÜ q tejido húmedo siendo estos tejidos de mucho valorpara el diagnóstico o confirmación de un envenenamiento letalagudo por cianuro. No obstante, y particularmente para el diag­nóstico es preferible analizar múltiples tejidos (Finck, l969).

son IHngodo

600

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200 I ln y [-1 1-1 Ü'61

830° RiñJn(0150.3 n l-I I I l l 1-1 m o

C)130 Geral-rc.

a m H4 |_| I I Ü¡3 o r] [-1

300 Corzza'n

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300 Pu l ¡n Jr.

‘ÏILHHnI-IfimIP IM ORAL PC T0 INH

FIGURA1.1.: Concentraciones de cianuro en varios tejidosde conejo luego de unenvenenamiento letalpor ácido cianhídricoadministrado por dife­rentes rutas de exposición. IP: intraperito­nea], IM: intramuscu­lar, PC: percutánea,10: transocular, INH:por inhalación.

300,. Hígado

¡fill-In3,200- Corazo'n

HHHH

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OO

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ClANURO(ug

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200Cerebro

H H H Ho, H

mol’ Bazao l'l _conejo cerdo mono rata oveja ESPECIES

FIGURA1.2.: Concentraciones decianuro en distigtos tejidos de varias especies animales luego de unenvenenamiento lgtal porcianuro depotasio administrado por vía intra­muscular.

En la Figura I.3. se grafican las concentraciones decianuro halladas en sangre entera de conejos que habianrecibidoácido cianhidrico por distintas rutas de exposición (Ballantyne,1983). Las cantidades sanguíneas de cianuro encontradas luego dela administración de cianuro de potasio intramuscular para difgrentes especies fueron similares, también elevadas y significa­tivas para el diagnóstico (Figura 1.4.) (Lgekeze y Üehme,1979:”Ballantyne, 1983). Los valores encontrados en plasma son delogden de los hallados en suero (Ballantyne, 1975). Entonces, conel Fin de diagnosticar o confirmar un envenenamiento agudo porcianuro, se elige a la sangre para la medición de la concentra­ción de este tóxico (Goenechea, l982). No obstante, con respectoa la toxicología experimental de] cianuro, es más significativo

determinar su concentración en plasma ya que el cianuroplasmatico es el primer determinante de la cantidad de cianuro presenteen fluidos tisulares y parénquima, obteniéndose asi un índicerazonable de la probable dosis tisular Funcional (Ballantyne,1975). En algunas ocasiones,por ejemplo cuando la concentraciónde sulfocianuro es elevada, es conveniente medir cianuro tantoen sangre entera como en plasma (Way, 1984). Como ya lo hemosmencionado, se ha demostrado que el cianuro en sangre se concegtra en los eritrocitos,lo que le ha conferido a los glóbulos r9jos un rol protector en e] envenenamiento por cianuro (Vesey yWilson, 1978; Mc Millan y SvobodaIV,l982) aunqueel mecanismopor el cual el cianuro se uniría a los eritrocitos aún no ha sido elucidado.

wmí

SM'

o HIP IM ORAL PC T0 INH

CIANURO(ug/100ml)

FIGURA1.3.: Concentraciones de cianuro en sangre entera­de conejos inmediatameflte después de su muertepor ácido cianhidricoadministrado por dife­rentes rutas de exposición. IP: intraperito­neal, IM: intramuscular,PC: percutánea, IÜ: transocular, INH: por inhalación.

I.4.l.32. Factores que influyen en la medición de la concentra­ción de cianuro

Varios Factores pueden afectar la medición de la con­centración de cianuro en fluidos biológicos y tejidos por lotanto influirán marcadamenteen la interpretación de los resul­tados. Dichos factores incluyen: Formación o transformación

post-mortem de cianuro y cambios en la sangre normal ocurridosluego de su recolección (Ballantyne, 1983).

500?

É T W T

3300­oo::3zSU

100­

SP SP SP SP SPn

conejo cerdo mono rota oveja

FIGURA1.4.: Concentraciones de cianuro en sangre entera(S) y suero (P) de varias especies a lasque se administró unainyección intramuscu­lar de una dosisletalde cianuro de potasio

Ballantyne (1983) no halló Formación de cianuro post­mortem en conejos controles que Fueron sacrificados y mantenidosdurante 3 semanas a temperatura ambiente ni tampoco cuando susórganos se mantuvieron a 20 0C ó a 4 °C durante 6 semanas. Sinembargo, cuando muestras de sangre de individuos normales se estacionaron durante varias semanas, se produjeron pequeños cam­bios a 4 0C, una disminución gradual en la concentración de cianuro a temperatura ambiente y un significativo aumento a -20 0C(tigura I.5.) (Ballantyne, 1977 a). Este aumento en la concentración es probablementedebidoa la conversión de sulfocianuro acianuro, reacción que es catalizada por la hemoglobina libre apH 4,5 (Chung y Wood, l97l; Vesey y Wilson, 1978) que se liberacomo consecuencia de la hemólisis producida por el proceso decongelamiento-descongelamiento. Vesey y Wilson (1978) hallaronque la cantidad de cianuro liberado en sangre entera acidifica­da es mayor que la concentración total determinada cuando se a­

nalizan separamente eritrocitos y plasma, siendo este último elensayo recomendado por estos autores.

-20°C.a U'll

CIANURO(ug/100ml)

ma

0 I l l I I

3 s 9 12ALMACENAMIENTO (DIAS)

FIGURA1.5.: Efecto del tiempo deestacionamiento y temperatura sobre las concentraciones de ciangro medidas en sangrenorma].

La transformación del cianuro en los fluidos corpora­les y los tejidos puede causar una disminución significativa ensu concentración luego de la muerte y esto resultaría en undiagnóstico falso negativo. Si la remoción de los tejidos a partirde animales envenenados se demora por varios días, no es posibledetectar cianuro en riñón, hígado, cerebro v pulmón. Cuando lostejidos se extraen inmediatamente luego de la muerte, pero semantienen a temperatura ambiente o refrigerados (4 oC) tampocoes posible detectar cianuro en dichos tejidos luego de unos po­cos dias. Sin embargo, en sangre la concentración de cianuro nodisminuye tan rapidamente comola de] contenido intraventricu­lar y concentraciones toxicológicamente significativas puedenser detectadas aún luego de 3 semanas (Ballantyne y col., 1974)(Figura 1.6.). La transformación de cianUro port-mortem ha sidoinvestigada en ovejas por Terblanche y col. (1964) quienes ha­llaron que e] cianuro medido desapareció luego de 12 y 28 horasen hígado y músculo esquelético respectivamente. Dicha transformación puede ser el resultado de varios mecanismos incluyendoconversión a sulfocianuro, hidrólisis a Formiato de amonio y

reacción con aldehídos y pOJiSUJFurosGuateJJi, 1964; Ballantyne,

(Ioanid y Bors, 196];1973) que se producen tanto en e]

20

3nima] intacto Juego de su sacrificio comoen Jos tejidos aisla­dos pero no en la sangreextraída inmediatamente luego'de Ja

50° Sangre

mo

20

250 PUlmo'n

1m

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200 Cerebro

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muerte.

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CIANURO(ug/1009ó100ml)

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8 12 16 20 24

DIAS HASTA EL ANALISIS

FIGURA 1.6.: Cambios en las concentraciones de CÏÉnuro en sangre y Qtros tejidos extraidos inmediatamente(O) o a distintostiempos (O) JuegodeJa muerte de Jos gnimaJes producidapor una inyección decianuro de potasiointramuscular(8 mg/kg).

La velocidad de transformación de cantidades de ciangro toxicológícamente significativas en suero y sangre entera hasido investigada por Ballantyne (1973, 1976) y hallaron los me­nores cambios en las muestras estacionadas en freezer. Cuandolas concentraciones de cianuro eran de menor significado toxicológico, se hallaron disminuciones menores en las muestras esta­cionadas en refrigerador con respecto a las mantenidas a tempe­ratura ambiente, hecho confirmado por Egekeze y Üehme (l979 b).

En muestras de suero y plasma a las que se les agregócianuro, se recuperó solamente del 3] al 34 % de la concentra­ción de cianuro inicial luego de l hora de estacionamiento yla pérdida mayor ocurrió durantelos primeros 20 minutos(Ballantyne y co]., 1973). En estudios farmacocinéticos con cianuro y sulfocianuro se encontró que en sangre la concentraciónde cianuro disminuye rapidamente en forma monoexponencial y eseliminada completamente de la misma a los 5 minutos luego de igyectado vía intravenosa (Sylvester y co]., 198], 1983).

Entonces de acuerdo con lo descripto, los tejidosdcbenextraerse inmediatamente luego de la muerte y analizarse rapidamente siendo cerebro y miocardio los mejores tejidos para el a­nalisis. La determinaciónen sangre entera es útil para el diag­nóstico o confirmación pero la concentración de cianuro en plagma puede aportar el mejor indice de los niveles funcionales ensituaciones experimentales.

1.a.1.33. Detección y medición de la concentración de cianuro

En cuanto a la metodología utilizada para medir cianu­ro en fluidos biológicos y tejidos, existen una variedad de mé­todos que son relativamente sensibles; en la mayoría el cianu­ro por difusión es atrapado en un medio alcalino antes de su a­nalisis. Probablemente el procedimiento mas utilizado es el queconsiste en la oxidación de cianuro a un cianógeno el cual inturractúa con la mezcla piridina-pirozolona (Epstein, 1947) cuyolimite de detección es aproximadamente 0,004 umoles/ml, habién­dose encontrado interferencia por tiosulfato (Epstein, 1947;feldstein y Klendshoj, 1954; Morgan y Way, 1979).

La determinación potenciométrica de cianuro usando elegtrodos selectivos de iones es un método de análisis rapido y sepsible (Frant y co]., 1972) detectandose concentraciones en elrango 10'3 —lO-6 M. En este método interfiere también el tio­

sulfato (Sylvester y co]., 1982).

Se han adoptado los métodos Fluorimétricos para la me­dición de cianuro en Fluidos biológicos. Uno involucra laconvegsión catalítica de piridoxal a 4-piridoxilactona (Takanashi yTamura, 1970; Morgan y Way, 1980). Este método es mucho más sensible y requiere menor cantidad de reactivos, que además sonmasestables, que el procedimiento colorimétrico aunque pueden in­terferir materiales fluorescentes extraños. Un segundo métodocon ventajas sobre el primero es el que utiliza p-benzoquinonaen vez de piridoxal no hallándose interferencia ni por sulfitoni por tiosulfato (Guilbault y Kramer, l965; Guilbault, 1976;Ganjeloo yco]., 1980). Por este procedimiento se pueden detec­tar desde aproximadamente 0,00] umoles de cianuro/ml.

El ácido cianhidrico puede medirse directamente porcrgmatografia gaseosa (Valentour y co]., 1974) aunque este métodoes poco sensible con la mayoría de los detectores. No obstantese puede aumentar su sensibilidad, oxidando el cianuro a cloru­ro de cianógeno con cloramina-T y posterior extracción con hexgno siendo la sensibilidad de 0,25 ug/ml. Esta técnica se empleacomúnmenteparamuestrasespecializadas donde se requiere la di­ferenciación de distintas especies de cianuro.

El cianuro puede también medirse por espectrometría deabsorción atómica indirecta para lo cual existen 2 métodos: unoinvolucra la formación de un compuesto metal-cianuro insolublemidiéndose el metal en el precipitado o el exceso de metal en elsobrenadante (Junqreis, 1969; Danchik y Boltz, 1970; Manahan yKunkel, 1973). En el otro método se forma un complejo metal-cianuro relativamente estable que luego se extrae con solvente or­gánico determinándose el contenido de metal del extracto. El ranqo de sensibilidad para este tipo de determinaciones es de aprgximadamente 0,3-3 ppm, no obstante estos métodos no son muy usados.

Pal y col. (1986) describieron unmétodopara determinarcianuro basándose en su reacción con plata coloidal en presenciade oxígeno. Entonces, el cianuro se puede determinar por expec­trofotometría, conductimetría o volumetría siendo la cantidadminima detectada de 0,05; 6,0 y 10,0 mg CN'/ml respectivamente.Egte procedimiento está libre de interferencias y es convenientepara la detección de cianuro en efluentes industriales y ademáslas muestras biológicas pueden ser fácilmente analizadas sin tra

tamiento previo.

1.4.1.4. Medición de la actividad de citocromo oxidasa

Por mediciones bioquímicas, generalmente se encuentrauna disminución en la actividad de citocromo oxidasa que es prgporcional al contenido de cianuro en los tejidos (Fiqura 1.7.)(Schubert y Brill, 1968). t] miocardio y cerebro son usualmentelos mejores tejidos para la confirmación de un envenenamientoy en ellos se ha podido observar una disminución significativaen la actividad enzimática y además, existen pequeñas variacio­nes en Función de la ruta de administración del tóxico y lasdigtintas especies.

0

CHÍCROMOONDASAQSGDhmvg)

—lPCPCPo

C P

Corazo’n Riño'n’ Cerebro Hígado “¿:0?

FIGURA1.7.: Actividad de citocromooxidasa en tejidos de co­nejos controles (C) e in­toxicados con una dosisletal de cianuro de potgsio vía intramuscu]ar(P).

Al igual que la determinación de cianuro en los teji­dos, la medición de esta enzima debe realizarse en muestras detejido fresco, ya que por estacionamiento se miden actividadessimilares a las encontradas en los tejidos controles (FiquraL¿Q¿) (Ballantyne, 1977 b).

La determinación bioquímica de la actividad de citocrgmo oxidasa brinda una información útil acerca del grado de inhi

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bición de esta enzima en homogenatos de tejidos. No obstante,sise tiene en cuenta que dichos homogenatos también contienen cianuro liberado de los vasos sanguíneos, la inhibición de la enzima puede no reflejar la situación ¿n U¿vo. Por lo tanto, es ú­til medir la actividad enzimática por un método histoquimicocuantitativo en el cual no se consideran los efectos del cianu­ro liberado de los vasos sanguíneos y que consiste en incubarsecciones de tejidos que Fueron congelados previamente con dió­xido de carbono, en un medio que contiene sustratos amino solu­bles que son convertidos a la azina insoluble coloreada y queprecipita en los sitios de actividad de la citocromo oxidasa(Burstone, l960). Si las secciones, preparadas a partir de tejidos de animales normales, se incuban en un medio histoquímicoal que se le agregaron distintas concentraciones de cianuro, sepuede observar claramente una relación entre el grado de inhibición de la citocromo oxidasa y la cantidad de cianuro. Sin em­bargo, si los tejidos provenían de animales muertos por intoxi­cación por cianuro, existia una actividad aparentemente normal.Esto puede deberse a que durante el tiempo de incubación reque­rido normalmente para la técnica histoquimica, el gran volumende incubación podria favorecer la disociación del complejo enzima-inhibidor (Ballantyne, l977 b).

Ballantyne y Bright (1979) describieron una técnica queinvolucra el uso de secciones de tejidos extendidos sobre pelí­culas de gel que contienen sustratos aminos. La producción delaazina coloreada comienza inmediatamente y su velocidad de aparición es proporcional a la actividad de citocromo oxidasa en di­chos tejidos durante el tiempo de medición y se determina micrgdensitométricamente observando los cambios de densidad óptica a550 nm. Asi, la actividad de la enzima se puede determinar antesde que ocurra la reactivación de la mismay representa una estimación razonable de la activación parenquimal ¿n U¿u0 en presegcia de inhibidor. Existe una buena correlación con las medicio­nes bioquimicas aunque los resultados a partir de los procedi­mientos microdensitométricos cinéticos pueden dar valores meno­res de inhibición dela enzima.

1.4.2. Toxicidad de los cianóqenos

’ara estudiar la contribución relativa del cianuro li­berado en relación a la toxicidad de los cianógenos se debe te­

25

ner en cuenta: signos de toxicidad, comparación de valores dedosis letal 50 (DLSÜ)molares, estudios sobre los efectos de losantídotos de] cianuro, medición de la concentración de cianuro,estudios ¿n v¿tao y determinación del grado de inhibición de lacitocromo oxidasa (Ballantyne, 1983).

.- 7L Corazo'nU)\

.EE S.

é9 3.<(D<e n><o 0C)z 1.5 CerebroÉ?L,L0.C)L: 0,5­U

0 l l l n

10 20 30 ¿0MAS HASTA EL ANNJSS

FIGURA1.8.: Cambios en la activi­dad de citocromo oxi­dasa en corazón y ce­rebro de conejos.Lostejidos se extrajeroninmediatamente despuésde la muerte de los animales ocasionadapor fractura cervical(.—-O) o por una in­yección de cianuro depotasio intramuscular(0-0) .

1.4.2.]. Signos de toxicidadNo obstante los signos de un envenenamiento agudo por

cianuro no son diagnósticos, pueden ser característicos y úti­les en el descubrimiento preliminar de un agente cianogénico pgtencia] (Ahmedy Farooqui, 1982; Ballantyne, 1983).

26

1.4.2.2. Comparación de datos de DLsg

La comparación de valores molares especificos de DL50para cianógenos y cianuros es una aproximación razonable para conocer la relativa contribución del cianuro en la toxicidad le­tal de los cianógenos. Los cianógenos pueden presentar un prolongado periodo de latencia antes de que se alcance una concentra­ción de cianuro toxicológicamentesignificativa y esto influiríaclaramente en el desarrollo de los signos de toxicidad y tambiénen la magnitud de la dosis de cianuro liberado requerida paraproducir letalidad. Entonces, las diferencias entre los valoresde DL5nitrilo asi comotambién a la contribución de la toxicidad in­

Ü pueden deberse a la influencia de la labilidad del grupo

trinseca de] cianógeno. Por esta razón, los datos de letalidaddeben ser examinados cuidadosamente y conjuntamente con otrasigformaciones toxicológicas que incluyen, en particular, signosde toxicidad y su tiempo de aparición (Ballantyne, 1983).

1.4.2.3. Uso de antidotos del cianuro

Willhite y Smith (198]) encontraron que,con una únicadosis de tiosulfato, los niveles plasmáticos de este antídotopueden reducirse significativamente durante el tiempo necesariopara que se acumule el cianuro proveniente de los cianógenos, alpunto que los efectos antagonistas de la droga resulten minimos.Ocurre algo similar cuando se utiliza nitrito de sodio, el cia­nuroes capturado transitoriamente comocianometahemoglobina, aldisociarse luego este complejo contribuye a la acumulación decianuro, que se libera en Formacontinua a partir de los cianó­genos. Por lo tanto, estos estudios deben efectuarse teniendoen cuenta la continua liberación decianuro a partir de los cia­nógenos y Ja lenta acumulación de cianuro biológicamente acti­vo.

Ademásen la investigación sobre la acción de antido­tos Frente a la toxicidad de los cianógenos es posible que alggno de ellos interfiera en la metodologia utilizada para la de­terminación cuantitativa de la concentración de cianuro (Morgany col., 1979; Sylvester y col., 1982).

1.4.2.4. Medición de la concentración de cianuro

La determinaión de la concentración de cianuro en fluidos biológicos y tejidos es importante para establecer la toxi­

cidad de los cianógenos, particularmente si se efectúan mediciones de la velocidad de aumento de cianuro en sangre o plasma r;lacionadas con la aparición y desarrollo de los signos de toxicidad. Al igual que en el envenenamiento con cianuro libre, lasconcentraciones del tóxico en sangre entera, plasma, cerebro ymiocardio son indicadoras de la toxicidad de los cianógenos de­bida al cianuro, hallándose valores de concentraciones de cia­nuro menores para la intoxicación por cianógenos (Ballantyne,1983) que en los casos de envenenamiento con cianuro libre, va­riando el rango de acuerdo a la labilidad de los grupos nitri­los (Willhite y Smith, l9Bl; Ahmedy Farooqui, 1982).

1.4.2.5. Estudios ¿n u¿tnosobre cianogénesis

La información a partir de estudios bioquímicos y metgbólicos ¿n UÁVOdeben ser controlados con investigaciones ¿n ví¿no que son útiles para confirmar potencialidad cianogénica y estudiar los mecanismos de cianogénesis. Ejemplo de ésto son losestudios de Willhite y Smith (198]) con diferentes nitrilos alifáticos y los de Gut y col. (l975), Abreu y Ahmed(l980),Appely col. (198]) y Farooqui y Ahmed(1982) con acrilonitrilo.

1.4.2.6. Medición de la actividad de citocromo oxidasa

La reducción de la actividad de citocromo oxidasa estárelacionada con la toxicidad del cianuro de los cianógenos siendo el cerebro (Figura 1.9.; Ahmedy farooqui, l982) y el miocardio los principales tejidos para estudiaresta relación. Noobs­tante, es necesario efectuar experiencias ¿n u¿zno para determinar si el cianógeno en estudio es por sí mismo un inhibidor dela enzima (Willhite y Smith, 198]).

1.5. CIANURO COMO INHIBIDÜR MLTABÜLICÜ

Los efectos del cianuro comoun inhibidor enzimáticoegtan frecuentemente asociados con su importancia como veneno respiratorio cuya letalidad se produce directamente por la inhibi­ción de la oxidasa termina] (citocromo oxidasa) de la cadenarespiratoria mitocondrial.

La sintomatología del envenenamiento con cianuro se cgnoce desde hace un siglo. Claude Bernard (1857) fue el primeroen resaltar el efecto inhibitorio del cianuro sobre la respira­

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ción de animales superiores. Los trabajos de Keilin (1928) y deStotz y col. (l938) han demostrado que el cianuro se combina ¿nU¿tn0 conla citocromo oxidasa interfiriendo así con la utiliza­ción del okigeno molecular por los sistemas de óxido-reduccióntisulares.

aoo

í OKCNi. OMalCN5600­

É, OPrCN¿00- BUtCNo OAcrilCNo

o:3z5200­U OAlilCN

oFurn CN0 OACCN l l i J

a 20 ¿o so ao 100

%lNHlBlCION de CITOCROMO OXIDASA

FIGURA1.9.: Relación entre la concentración de cianu:—ro en cerebro y lalighibición de la actividad de citocromo oxi­dasa por dosis leta­les de varios nitrilosalifáticos: KCN:cianuro de potasio,MalCN:malononitrilo,PrCN:propionitrilo;ButCN:butironitrilo,AcrilCN:acrilonitri­lo, AlilCN: cianurode alilo, FumCN: Fu­maronitrilo, AcCN:acetonitrilo.

Existe un gran número de otras enzimas (Tabla I.l.) quetambién son inhibidas por bajos niveles de cianuro, siendo alggnas de estas proteínas tanto o más sensibles al tóxico que lacitocromo oxidasa (Solomonson, 1982). En algunos casos, como para el sistema citocromo P-450 (Matsubara y Touchi, 1977), lasegsibilidad de la enzima es tan baja que carece prácticamente designificado biológico; en otros, la sensibilidad a] cianuro eslo suficientemente alta comopara producir una inhibición sus­tancial bajo condiciones de intoxicación subaguda y crónica

(Solomonson, 1982).reductasa (Lorimer y col., 1974),extremadamente alta y se propusoregulatorio en este sistema (Solomonson,otro ejemplo de una

En el caso de la enzima asimiladora nitratola sensibilidad al cianuro esque dicho ión cumpliría un rol

1982).proteína que es más sensible al cianuro que

la citocromo oxidasa (Ver Ploeg y col., l97l).

IABLAI.l.: Sensibilidad de distintas enzimas al cianuro

Kd*, 150H o

ENZIMA Ki*** REFERENCIAS

(moles/l)

Citocromo oxidasa (ox) l x 10-6 * Van Buuren y col. (1972 a, b),Wilson y col. (1972)

Citocromo oxidasa (red) l x lO'4 * Van Buuren y col. (1972 a, b),Wilson y col. (1972)

Peroxidasa derabanito x 10'6'* Ellis y Dunford (1968)Citocromo c peroxidasa de 4 x 10’6 * Erman (1974)levadura

Lactoperoxidasa 3 x lO'5 * Dolman y col. (l968)Catalasa 5 x 10"6 ** Galston (1955)

Mioglobina (ox) 8 x lO'7 * .Ver Ploeg (197])Citocromo P-450 5 x lO'3 ** Matsubara y Touchi (1977)

Superóxido dismutasa 2 x 10-5 ** Rotilio y col (1972AcilCoA desaturasa l x lÜ'a ** Kader (1977)

Ribulosa difosfato carbg 6 x 10"6 ** Marsho y Kung (1976)xilasaNitrito reductasa 5 x lÜ'6 *** Lafferty y Garrett (1974)Nitrogcnasa 2 x lÜ'5 *** Biggins y Kelly (l970)Nitrato reductasa (ox) 2 x lO'5 *** Garrett y Greenbaum(l973)Nitrato reductasa (red) 4 x 10-10 * Lorimer y col. (1974)

50 %

constante de inhibición

constante de disociaciónpara el complejo enzima-cianuroconcentración de cianuro que produce una inhibición del

La mioglobinaes

30

1.5.]. Respiración

El efecto del cianuro sobre la respiración se atribuyea la unión e inactivación por dicho tóxico de la enzima citocrgmo oxidasa que es el componente termina] de la cadena mitocon­drial de transporte de electrones (Keilin,l928; 1966). Los o­tros componentes de la cadena mitocondrial tienen una relativamente baja afinidad porel cianuro (Solomonson, 1982).

La reacción de transferencia de electrones catalizadapor la citocromo oxidasa se puede representar por la Reacción1.3. La velocidad de esta reacción puede determinarse ya sea porla medición del consumo de oxigeno o por la oxidación de ferrgcitocromo c (Yonetani y Ray, 1965).

citocromo oxidasaFerrocitocromoc + 1/2 02+ H ——-Ferricitocromo c + l/2 HZO

Reacción 1.3.

La citocromo oxidasa es un complejo enzimática multimÉrico que contiene 4 centros redox metálicos: 2 componentesa ngmo y 2 iones cobre (Hartzell y col., 1978; Freedman y Chan,1984).

El mecanismo de la interacción de] cianuro con la enzima ha sido extensamente estudiado por varios laboratorios(Yonetani y Ray, 1965; Antonini y col., 197]; Nicholls y col.,1972; Van Buuren y col., 1972 a, b; Wilson y col., 1972; Wilsony Erecinska, 1978; Jones y col., 1984; Hill y Robinson, 1986).Un mol de cianuro se une Fuertemente a un mo] de citocromo oxi­dasa mediante una reacción que involucra 2 etapas: la primera esla unión del cianuro a la proteina, la segunda implica la unióndel cianuro a] hierro hémico (Van Buuren y col., 1972 b). La vglocidad y la fuerza de la unión depende del estado de oxidaciónde la enzima. Aunque el cianuro se une tanto a la forma oxidadacomo a la reducida de la citocromo oxidasa, posee mayor afinidadpor la forma oxidada (Tabla I.l.) pero la reacción ocurre máslentamente. Antonini y col. (l97l) hallaron que la interacciónde la enzima puede ocurrir en 2 formas: una involucraría la re­ducción de la citocromo oxidasa por citocromo c y una reacción

3]

posterior entre a32+ y el inhibidor para Formar el complejoa32+-HCN.Este complejo oxidado es completamente estable peroenpresencia de equivalentes de reducción, el cianuro se disociaproduciéndose la reactivación de la citocromo oxidasa (Solomogson, 1982). La reacción entre el cianuro y la Forma oxidada dela citocromo oxidasa parece ser más compleja, esto involucraríala unión del cianuro a la oxidasa seguido por un lento procesointramolecular (Antonini y col., 197]). Estos autores tambiénhallaron que cuando la proteína se preincuba con cianuro, se obtiene inhibición a concentraciones muchomenores del tóxico, egto implicaría una unión del cianuro a los iones cobre. Jones yco]. (1984) mediante estudios cinéticos determinaron que la u­

nión del cianuro a la citocromo aa}3+ oxidasa ocurriría rápidgmente sólo cuando citocromo a y cobre están reducidos.

I.5.2. Metabolismo de la glucosa

Un gran número de procesos metabólicos se ven afecta­dos por el cianuro en los animales. Cuando el cianuro inhibe lacitocromo oxidasa, se produce la alteración de una serie dereacciones de óxido-reducción en la célula.

Isom y col. (1975) estudiaron el efecto de dosis sublgtales de cianuro sobre el catabolismo de la glucosa en ratonesmediante e] uso de técnicas radio-respirométricas yhallaron queel cianuro producía un aumento de aproximadamente lÜÜ % en elcatabolismo de la glucosa através del camino de la pentosa fos­Fato y una disminución de aproximadamente 50 % en el catabolis­mode la glucosa vía el camino glucolítico. Estos resultados igdican que la anoxia en los tejidos, inducida por inactivación dela citocromo oxidasa, resultó en un cambio del metabolismo aerghico a] anacróbico con el consecuente incremento de glucosa y Écido láctico en sangre y una disminución de compuestos Fosfora­dos de alta energía, o sea, disminución de la relación ATP/ADP(Handler, 1945; Albaum y col., 1946 a; Olson y Klein, 1947).

El aumento del catabolismo de la glucosa por la vía delas pentosas causa un incremento de] NADPH.Esto puede represegtar un mecanismo compensatorio para mantener el estado rédox bglanceado, ya que se produciría un aumento de la conversión de piruvato a lactato a expensas del NADHgenerado (Isom y col.,1975). Se ha asociado un tipo especial de diabetes a la inges­tión de cianuro (Mc Millan y Geevarghese, 1979 a).

32

Jacob y Diem (l974) encontraron que la producción deglucosa y la actividad de Fosforilasa de hígado de rata se in­crementaban por efecto del cianuro. Resultados similares halla­ron Conaglen y col. (l984). Por lo tanto, dosis de cianuro sub­letales pueden alterar el metabolismo de los carbohidratos, re­sultando en un aumento de la glucogenólisis y una desviación deglucosa al camino de las pentosas por disminución de la veloci­dad de glucólisis e inhibición del ciclo del ácido tricarboxílico (Way, l984).

Hoyer (l984) también encontró cambios en la glucólisisy el ciclo de los ácidos tricarboxilicos y su efecto sobre laproducción de energia,determinando que el daño inducido por elcianuro sobre el metabolismo cerebral en ratas se caracterizabapor un aumento de los intermediarios del ciclo del ácido tricarboxilico tales comosuccinato, Fumarato y malato, Esto indicaria disturbios en las reacciones rédox dependientes de NAD+yPAD+.Además, se encontró que la producción de lactato estabaaumentada y la de creatina fosfato disminuida.

1.5.3. Función de la tiroides

El cianuro afecta la funciónde la tiroides indirecta­mente a través de su principal producto de detoxificación: elsulfocianuro (Solomonson, 1982). Este compuesto es relativamen­te no tóxico a los niveles normalmente hallados en sangre. Elaumento que se produce como resultado de la administración decianuro en dosis subagudas, puede ser suficiente para disminuirmarcadamente la Función tiroidea, especialmente si está acompa­ñado por una deficiencia de ioduro (Solomonson, l982). El iodu­ro juega un rol esencial cn la apariciónde la gota endémica yel cretinismo. Kreutler y col. (l978) demostraron que el sulfgcianuro nuode afectar eJ crecimiento de la tiroides y su funciónen ratas nconatales. Ianto elcianuro comoel sulfocianuro prodgcen gota y aumento de la hormona estimuladora de la tiroides(TSHÏ en animales deficientes en ioduro, sugiriendo que el sul­Focianuro puede ser un factor en la etiología del cretinismo egdémico y la gota en áreas donde la ingestión de ioduro es bajay aparecen precursores de sulFocianuro en la dieta.

El sulFocianuro inhibe tanto la captación de ioduro porla tiroides como la unión organica (como residuos monoiodotiro­<

sina y diiodo tirosina de tiroglobulina) del ioduro que entra a

33

a la célula. Greer y col. (1966) demostraron que la concentra­ción de sulfocianuro que inhibe un 50 % la captación de ioduroera aproximadamente lÜ-aM, mientras que la necesaria para inhi­bir la unión orgánica era aproximadamente JÜ'3 M. Esto implicaque la captación de ioduro es más sensible al sulfocianuro quela unión orgánica. Michajlovskij y Langer (1974) observaron queel sulfocianuro también causa un desplazamiento competitivo dela tirosina sérica unida a proteínas, resultando un aumentotragsitorio de los niveles de tirosina en suero. Esto produciría tirosina más susceptible a la degradación. Entonces, el sulfocia­nuro parece afectar la función tiroidea a distintos niveles;sus efectos pueden prevenirse en su mayoría por la ingestión sgficiente de ioduro.

1.5.4. Molibdoenzimas

Las molibdoenzimas son una familia de enzimas que in­cluyen nitrogenasa, nitrato reductasa, xantina oxidasa y sulfi­to oxidasa. Ademásdel molibdeno, estas proteínas contienen o­tros grupos prostéticos (Solomonson, 1982).

El cianuro actúa comoun sustrato para la nitrogenasa(Biggins y Kelly, 1970) e inhibe todas las otras molibdoenzimas.

En el caso de la nitrato reductasa de organismos foto­sintéticos, la inhibición por cianuro es de importancia en e]control metabólico de la asimilación de nitrato (Gewitz y col.,1974; Solomonson, 1974; Pistorius y col., 1976; Solomonson ySpehar, 1977; 1979). El cianuro reacciona con esta enzima en presencia de NADHpara dar un producto inactivo que es similar aun precursor de la enzimainactiva hallado en extractos crudos(Vennesland y Jetschmann, 197]; Solomonson y Vennesland, 1972;Vennesland y Solomonson, 1972; Solomonson, 1974). La extremasegsibilidad de la nitrato reductasa al cianuro y la reversibili­dad de la inhibición hacen del cianuro un regulador fisiológicoideal de esta enzima (Solomonson, 1982).

Los criterios generales de la inactivación reversiblepor cianuro son similares para otras molibdoenzimas. Existen noobstante varias diferencias en la sensibilidad al tóxico, de manera que el cianuro solamente jugaría un papel regulatorio parala nitrato reductasa. Coughlan y col. (1980) demostraron que laforma reducida de las molibdoenzimas: sulfito oxidasa, xantina

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oxidasa, xantina deshidrogenasa y aldehído oxidasa son todas inhibidas reversiblemente por cianuro siendo las concentracionesnecesarias para producir un 50 % de inactivación en 30 minutosde 0,5 mMy 50 mMpara xantina y quFito oxidasa hepáticas res­pectivamente. Estas concentraciones son varios órdenes de magnitud mayores que las requeridas para la inactivación reversiblede la nitrato reductasa (Solomonson, 1974). Sin embargo, tal cgmoocurre con la nitrato reductasa, las Formas inactivas de es­tas molibdoenzimas, permanecen en estado inactivo Juego de la eJiminación de] exceso de reductor y cianuro por filtración enge] y la reactivación se logra por incubación con oxidantes a­propiados. Coughlan y col. (1980) demostraron que es necesariaJa unión estequiométrica de] cianuro para disparar la inactiva­ción aunque no se requiere su unión contínua para mantener di­cha inactivación.

Unicamente las hidroxilasas que contienen molibdeno:xantina oxidasa, xantina deshidrogenasa y aldehído oxidasa parecen inactivarse en e] estado oxidado. Esta inactivación, en contraste con Ja de Jas molibdoenzimas reducidas, es prácticamenteirreversible y va acompañada por la Formación de cantidades es­tequiométricas de sulfocianuro (Massey y Edmonson, 1970;Branzoli y Massey, 1974; Cleere y Coughlan, 1974; Coughlan,1977; Coughlan y co]., 1980).

Entonces, e] cianuro puede inhibir las molibdoenzimasya sea por reacción con la molibdoenzima reducida para formarel complejo enzima-cianuro inactivo, e] cua] puede reactivarsepor tratamiento con un oxidante (Ejemplo: Ferricianuro; Coughlany co]., 1980) o por reacción con las formas oxidadas de lasmolibdohidroxilasas para formar una enzima inactiva y sulfocia­nuro, que puede reactivarse parcialmente por tratamiento con sulfuro de sodio (Massey y tdmonson, 1970; Coughlan, 1977).

l.5.5. Otras metaloenzimas

Ademásde las enzimas que contienenhemo o mo]ibdeno,e]cianuro inhibe un número de metaloenzimas que contienen cinc ocobre, perturbando así los procesos metabólicos que invo]ucranestas proteinas (Solomonson, 1982). La cobre,cinc-superóxidodigmutasa citosólica se inhibe por cianuro (Rotilio y co]., 1972;Borders y Fridovich, 1985) y esta reacción puede utilizarse pa­ra distinguirla de la manganeso-superóxido dismutasa de la ma­

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triz mitocondrial, que es insensible al tóxico.

Las cinc-metaloenzimas: Fosfatasa alcalina (lhorling yNiazy, 1973) y anhidrasa carbónica (Feeney y Burgen, 1973) tam­bién son sensibles al cianuro.

El cianuro bloquea e] transporte de electrones fotosintético por interacción con la cobre-proteína, plastocianina, qmfunciona comocarrierde electrones entre los fotosistemas I yII (Berg y Krogmann, 1975), liberando el cobre de la proteína.Por un mecanismo similar, e] cianuro inhibe también a la enzimaascorbato oxidasa (Strothkamp y Dawson, 1977).

Las hierro-sulfoproteínas, comola ferredoxina de Ciaótn¿d¿um , pueden inactivarse bloqueadas por el cianuro produ:ciéndose liberación de sulfocianuro y sulfuro (Wallace yRabinowitz, 197]).

El cianuro puede también remover el selenio de las se­lenio-enzimas. El tratamiento de la glutatidn peroxidasa, alta­mente puriFicada de oveja, con una concentración de cianuro a­proximadamente 0,] mMresultó en la inactivación de la enzima yla consecuente liberación de selenio (Prohaska y co]., 1977). Lainteracción selenio-cianuro puede explicar la parcial prevenciónpor cianuro del envenenamiento por selenio (Palmer y Ülson, 1979)y la capacidad delos glucósidos cianogénicos de harina de lina­za para proteger a los animales de la toxicidad del selenio(Smith y co]., 1980).

1.5.6. Interacciones no-metálicas

Bajas concentraciones de cianuro pueden inhibir una sgrie de enzimas a través de interacciones que no involucran unmgtal. Estas interacciones, en algunos casos se producen por reagción entre el cianuro y un intermediario base de Schiff o entree] cianuro y un sustrato para formar un compuesto inhibidor(Solomonson, l982). Un ejemplo de este último caso es la inhibición indirecta de la carboxilasa/oxigenasa difosfato ribulosa,enzima clave del ciclo de Calvin en la Fijación Fotosintética dedióxido de carbono, por el derivado cianhidrina formado porreacción entre el cianuro y la ribulosa difosfato (Marsho y Kung,1976).

lodas las reacciones enzimáticas que involucran intermgdiarios base de Schiff son potencialmente susceptibles a la in­

36

hibición por cianuro . Un ejemplo es la enzima 2-ceto-4-hidroxiglutarato aldolasa que cataliza la etapa terminal en e] catabo­Jismo de la hidroxiprolina en mamíferos (Hansen y Dekker, 1976).La inactivación es debida, aparentemente a la adición del ciangro a la base de Schiff aldimina (Reacción 1.4.). En Forma simi­lar, el cianuro inhibe laacetoacetato decarboxilasa de Clostri­dios(Autory Fridovich, 1970).

con" COOH—+ _ — —

HCN + c-N H(CH2)4- E-———-NC o NH(CH2)4 ER R

Bsessién_liíi

E] cianuro puede también inhibir por combinación con

un sustrato o cofactor en el cual exista un grupo carbonilo, e­jemplo cetoácido, aldehído o derivado de piridoxa] (Dixon yWebb, 1958). Por lo tanto es de esperar que las enzimas que re­quieren comocofactor Fosfatode piridoxa] que Forman intermedigrios base de Schiff, sean también sensibles a la inhibición porcianuro. Es el caso de la glutamato decarboxilasa y ácido y-aminobutírico transaminasa(GABA-T)decerebro de rata que, a con­

‘4 M y 6,5 x 10‘3vamente se inhiben un 50 %(lursky y Sajter, 1962).centraciones de cianuro de 6,5 x JD Mrespecti

Aunque el cianuro generalmente actúa como un inhibidorenzimática, en algunos caeoe funciona aparentemente como activgdor. En concentraciones de 0,] a 3 mMestimula dos veces la ac­tividad de la guanilato ciclasa en unagranvariedad de tejidosque incluye hígado, pulmón, estómago, colon y riñón (Vesely yco]., 1979). El cianuro puede también simular e] efecto del etiJeno que es la hormona vegetal involucrada en la maduración delos Frutos (Solomos y Laties, 1974: 1975: 1976). Ambosagentesparecen actuar estimulando la respiración insensible al cianuroy son potenciados por un aumento de la velocidad de glucólisis.

De lo descripto anteriormente se deduce que el cianuropuede tener una multiplicidad de efectos sobre el metabolismo,ya que es un inhibidor potencial de varias metaloenzimas y deeg

37

zimas que involucran intermediarios del tipo base de Schiff.

Las respuestas metabólicas al cianuro dependen, no só­lo de la concentración del tóxico, sino también de otros facto­

res que incluyen los niveles de vitamina B12, ioduro, sulfoami­noácidos y los niveles y distribución de las enzimas detoxifi­cantes tales comola rodenasa. Además, la toxicidad del cianuropuede exhacerbarse por deficiencias en la dieta. No es posibleexplicar con certeza todos los efectos del cianuro en términosmetabólicos, pero el conocimiento de la relativa sensibilidadde varios sistemas enzimáticos facilitan un mejor entendimientotanto de sus efectos tóxicos comode sus posibles Funciones fi­siológicas y sus metabolitos.

1.6. ANTAGÜNISTAS

El desarrollo de antídotos para el tratamiento del en­venenamiento por cianuro data de SU a lSÜ años atras y se puedeconsiderar que ha tenido éxito ya que se conocen una serie de agentes altamente eficientes, que pueden antagonizar sus efectosletales. Blake (1839, 1840) observó que los efectos letales delcianuro pueden ser antagonizados por respiración artificial. En1888, ya se propuso que el nitrito de amilo era efectivo contradichos efectos (Pedigo, 1888) y por 1933, Lang describió el usodel tiosulfato de sodio como donor de azufre para la enzima ro­denasa. Sobre estas bases se orientaron los estudios de Chen ycol. (1933 a, b) quienes emplearon una combinación de nitritode nmilo, nitrito de sodio y tiosulfato comoantídoto. Algunosde los primeros antagonistas propuestos comopor ejemplo loscompuestos de cobalto (Antal, 1894) fueron luego descartados debido a su toxicidad, sin embargo actualmente han generado nuevointerés.

Ln las últimas dos décadas se han desarrollado una se­rie de nuevos antagonistas. Teniendo en cuenta que el cianuroactúa muyrápidamente, es importante diferenciar entre los efegtos protectores de estos agentes comoantídotos para una sobre­dosis aguda y comoprofilácticos en una sobredosis crónica(Way, 1984). Con pocas excepciones, la mayoría de los compues­tos con propiedades antagónicas ejercen sus efectos o bien u­niendo el cianuro a moléculas más grandes o biotransformándolo

a productos menos tóxicos (Way, 1983).

La clasificación de los antagonistas que pueden prote­ger contra Jos efectos letales de] cianuro se describe en Ja T3bla 1.2. (Way, 1933).

TABLA1.2.: Clases de antagonistas de]cianuro

I. UNEN CIANURO

A. Formadores de metahemoglobina:nitritos, dimetiJaminofeno]

B. Compuestos de cobalto: Co-EDÏA,hidroxocobalamina

C. Compuestos carbonilos: piruvato

II. DONORES DE AZUFRE

A. ÏiosulfatoB. TiosulfonatoC. Otros azufres sulfano

III. LIGANDOS Y DADORES DE AZUFRE

A. Mercaptopiruvato

IV. MECANISMO DESCONOCIDO

A. OxígenoB. Cloropromazina

En e] primer grupo están los antidotos clasificados enforma arbitraria como compuestos que se unen a] cianuro. Los másconocidos son Jos Formadores de metahemoglobina tales como ni­tritos, nitrito de amilo y nitrito de sodio y, más recientemen­te e] dimetiJaminofenoJ (DMAP).Los otros compuestos que puedencomplejar e] cianuro son Jos que contienen cobalto: Co-EDÏAehidroxocobalamina. Ademásse incluyen los compuestos carbonilos,

39

como el piruvato de sodio, que forman con el cianuro cianhidri­nas. En un segundo grupo, están los compuestos que metabolizane] cianuro a sulfocianuro que es menos tóxico y se incluyen losque pueden actuar como donores de azufre para la enzima rodena­sa: tiosulfato de sodio y tiosulfonato de sodio. Existe otraclgse de antídotos que tendrian un efecto combinado de unión y me­tabolización de] cianuro, por ejemplo el mercaptopiruvato queactúa comodonor de azufre de la mercaptopiruvato sulfotransfe­rasa. Finalmente, en una cuarta categoría se incluyen la cloro­promazina y el oxígeno cuyos mecanismos de acción aún no han si­do elucidados.

La combinación de la unión de cianuro a la metahemOglgbina y su conversión química a un producto menos tóxico proveelas bases para el antagonismo de la intoxicación por este tóxi­co cuyo mecanismode acción podría ajustarse al siguiente esqueI'I'líl:

CN‘ + citocromo oxidasa.¿=r-CN-citocromo oxidasa

NOE+ hemoglobina .==rmetahemoglobinaCN' + metahemoblobina .==-cianometahemoglobina

s o = + CN' -="SCN' + 503:

1.6.]. Por unión química

1.6.1.1. Nitritos

Los compuestos más conocidos dentro de aquellos que seunen a] cianuro son los formadores de metahemoglobina, los nitritos de amilo y de sodio y más recientemente el DMAP.

La eficacia del nitrito de amilo en la protección con­tra el envenenamiento por cianuro en perros se describió por primera vez en 1888 (Pedigo, 1888). Sin embargo, este compuesto secomenzó a emplear como antídoto a partir de 1933 (Chen y col.,1933 a,; Hug, 1933).

Los efectos antagónicos de los nitritos sobre el cianuro son de origen bioquímico (Wendel, 1932; Chen y Rose, 1952):el cianuro posee baja afinidad por la hemoglobina pero una gran

AU

afinidad por la metahemoglobina, por lo tanto los nitritos ge­neran metahemoglobina la cual se combina con e] cianuro paraformar cianometahemoglobina produciéndose así la reactivación delacitocromo oxidasa. Se comprobó que la metahemoglobina puede reagtivar la citocromo oxidasa ¿nvttn0(A]baum y co]., 1946 b).

E] primer compuestode nitrito utilizado fue e] nitri­to de amilo (Pedigo, 1888; Chen y co]., 1933 a), posteriormentese usó el nitrito de sodio (Chen y co]., 1933 b). La diferenciaentre estos compuestos es que el nitrito de amilo puede inhalagse mientras que el de sodio se debe administrar en forma intra­venosa.

La eficiencia de] nitrito de amilo fue cuestionada porvarios laboratorios (Jandorf y Bodansky, 1946; Weber y co].,1962; Offterdinger, 1970) debidozlla relativamentebaja velocidadcomo formador de metahemoglobina. Por esta razón, y debido a queel DMAPgenera rápidamente metahemoglobina, varios investigado­res propusieron su uso como antídoto (Jandorf y Bodansky, 1946;Weber y co]., 1962; Weger, 1968; Kiese y Weger, 1969). No obs­tante, otros grupos han señalado que e] nitrito de sodio es mu­cho más eficiente que otros formadores de metahemoglobina, dadoque produce una metahemoglobinemia más estable (Smith, 1967;Kruszyna y co]., 1982). Estudios posteriores han sugerido en cambio que la formación de metahemoglobina por nitrito de sodio notendría importancia desde el punto de vista terapéutico en relgción a] envenenamiento por cianuro, ya que cuando la metahemo­globinemia se previno por pretratamiento con azul de metileno,e] nitrito de sodio igualmente ejerció su efecto protector contra dicho tóxico (Holmes y Way, 1982; Way, 1983). Esto está in­dicando que la acción del nitrito de sodio es debida a otro me­canismo distinto de Ja formación de metahemoglobina (Way, 1984)lo cual habría de conducir al desarrollo de nuevos antídotos,teniendo en cuenta las propiedades farmacológicas de los nitri­tos.

1.6.1.2. Compuestos de cobalto

El ion cobalto forma un complejo estable con cianuro(HaJpern y co]., 1972) por lo cua] también ha sido usado en e]envenenamiento por este tóxico (Antal, 1894), no obstante su empleo comoantídoto es limitado debido a su toxicidad cardíaca(Naughton, 1974; Nagler y co]., 1978).

al

Se han estudiado varios compuestos de cobalto como antagonistas contra los efectos letales del cianuro: hidroxocobalamina (Mushett y co]., 1952; Evans, 1964; Eriedberg y co]., 1965;Rose y co]., 1965), cobalto-histidina (Mereker y Bastian, 1959;Schwarzkopf y Friedberg, l97l; friedberg y Shukla, 1975), clorgro de cobalto (Smith, 1969; Isom y Way, 1972; Burrows y Way,1979) y cobalto-EDTA (Paulet, 1957, 1958; irankenberg y Sórbo,1975). El uso del cobalto-EDÏA ha tenido éxito en el tratamien­to de la intoxicación por cianuro en situaciones experimentalesy clínicas (Bartelheimer y co]., 1962; Nagler y co]., 1978). Suelección frente a los otros compuestos de cobalto se basa en elhecho de que muchos de los efectos tóxicos del ión cobalto se minimizan cuando éste se administra en forma de quelato (Way,1984) y, en presencia de cianuro el EDÏAsería desplazado formágdose un complejo estable cianuro-cobalto (Halpern y co]., 1972)y reactivándose así la citocromo oxidasa inhibida por cianuro(larkowski, 1966).

Debenenfatizarse las diferencias de las distintas es­pecies con respecto a la sensibilidad al cobalto. En estudioscon ratones y cloruro de cobalto, el cobalto sólo es completa­mente efectivo comoantagonista del cianuro, obteniéndose un e­fecto aditivo cuando se lo combina con nitrito de sodio y unagran potenciación cuando se lo administra con tiosulfato de so­dio (Isom y Way, 1972). En cambio, estudios similares en ove­jas produjeron resultados diferentes: las ovejas no toleraronlas sales de cobalto en ladosisutilizada para ratones y cuandose trataron con dosis menores, el cobalto no fue efectivo comoantagonista. Por otro lado, cuando se lo combinó con tiosulfatode sodio no fue tan efectivo comola combinación nitrito-tiosulfato y bastante inferior a la combinaciónoxígeno-nitrito-tiosulfato (Burrows y Way, 1977). Análogamente, cuando se empleó enratones la misma dosis que en las ovejas, ni el cobalto sólo, nien varias de sus combinaciones resultó tan efectivo como la me;cla nitrito-tiosulfato (Burrows y Way, 1979).

1.6.1.3. formación de cianhidrinas

El cianuro es un nucleófilo que interactúa con variosgrupos carbonilos para formar intermediarios cianhidrinas.

Se encontró que el piruvato de sodio revierte rápidamegte la inhibición por cianuro de la respiración de ciertas célu­

las tumorales (células ascíticas de] tumor de Ehrlich)(Cittadini y co]., 197]) y antagoniza los efectos letales deltóxico en ratones (Cittadini y co]., 1972; Schwartz y co].,1979).

Además, se demostró que el piruvato se transporta in­tracelularmente en forma activa, distribuyéndose así en los si­tios de localización del cianuro (Halstrap, 1975; Schwartz yco]., 1979).

El piruvato solo, resultó ser completamente efectivocomo antagonista de] cianuro. Sin embargo aumentó muy poco el gfecto protector de] tiosulfato de sodio y no alteró la accióndel nitrito de sodio. Cuando e] piruvato se agregó a la mezclanitrito-tiosulfato se obtuvo un gran aumentoen la proteccióncontra el cianuro y esta combinación resultó tan efectiva comola mezcla nitrito-tiosulfato-oxígeno (Way,1984).

Los estudios con esta clase de compuestos continúanya que ellos abren la posibilidad de manipular las estructurasquímicas para variar la densidad electrónica del grupo carboni­lo. Esto favorecería la formación de cianhidrinas y por lo tan­to produciría antagonistas más efectivos (Way, l983).

1.6.2. Por biotransformación

La principal ruta biológica de detoxificación del cia­nuro es su conversión a sulfocianuro que es relativamente no téxico. Esta conversión requiere de una fuente de azufre sulfano,es decir un azufre divalente unido a otro azufre, que es la for­ma bajo la cual reacciona con el cianuro para producir sulfocignuro. Varias enzimas, de la familia de las sulfotransferasas,catalizan reacciones que usan o producen azufre sulfano (Figura1.10.) (Westley y co]., 1983).

Las sulfotransferasas que pueden transferir el azufresulfano al cianuro son: rodenasa y mercaptopiruvato sulfotrans­feraea. Aunque nmbaa enzimas pueden detoxificar el cianuro, elmecanismoenzimáticode las dos reacciones y su distribución subcelular y biológica son diferentes (Westley, l980).

La enzima rodenasa se describirá en e] Capítulo II ysu participación en la detoxificación del cianuro se detallaráen el ítem II.7. de ese Capítulo.

43

N

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POOL de SULFANO

FIGURAI.]Ü.: E] poo] de azufre sulfano. Los átomos deazufre sulfano se indican mediante e] simbolo (-). (1) rodenasa, (2) mercaptopirgvato suifotransferasa, (3) tiosulfato rgductasa, (4) seroanúmina

La 3-mercaptopiruvato sulfotransferasa cataliza JaReacción 1.5. donde el mercaptopiruvato actúa como donor de azgfre sulfano (Jarabak y WestJey, 1980). Esta enzima se encuen­tra localizada en citoso] y mitocondria haJJándose tanto en prgcariotas comoen eucariotas (WestJey y co]., 1983).

H _ _ H _ ­

HSCH2—C-CÜO + CN -——*—H3C—C-CÜD + SCN

mercaptopiruvato piruvato

Reacción 1.5.

A pesar de que existe mayor cantidad de 3-mercaptopirgvato sulfotransferasa que rodenasa en hígado y riñón, no se Jeasigna a esta enzima un ro] principal en cuanto a Ja detoxificgción de] cianuro (Westley, 1980). Una de las razones es que seencontró que elmercaptopiruvato es efectivo comoantídoto en algunos mamíferos pero no en otros (CJemedson y co]., 1958) y adgmás, en estudios cinéticos con Ja enzima altamente purificada,se encontró que e] cianuro tiene un pape] ambiguo ya que en Ja

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reacción catalizada por esta enzima se Forma más piruvato quesulfocianuro (Jarabak y Westley, 1980).

Ademas de actuar como donor de azufre, el mercaptopiruvato reacciona con el cianuro, a] igual que el piruvato, paraformar cianhidrinas; no obstante su acción primaria comoantaggnista , parece ser la descripta previamente (Way, 1983).

1.6.3. Por mecanismo desconocido

1.6.3.]. Cloropromazina

Ïeniendo en cuenta las propiedades vasodilatadoras delos nitritos, se estudió la posibilidad del uso de este tipo dedrogas con propiedades vasogénicas, comopotenciales antagonis­tas del cianuro.

Se observó que la cloropromazina actuaba como antago­nista de los efectos letales del cianuro en palomas (Guth ySpirtes,l958) y en ratas (Levine y Klein, 1959) y se atribuye­ron sus efectos a sus propiedadeshipotérmicas(Levine y Klein,l959).

Wayy Burrows (1976) hallaron que la cloropromazina suministrada sola no era efectiva contra el cianuro en ratones niaumentaba la acción protectora de] nitrito de sodio, sin embar­go potenciaba la acción del tiosulfato de sodio solo o de lacombinaciónnitrito-tiosulfato. Estos autores señalaron el he­cho de que la cloropromazina posee muchas propiedades farmacolggicas de manera que su actividad como antagonista de] cianuro pgdría deberse a otros mecanismos ademas del propuesto como agen­te hipotérmico. Por otro lado,cuando este compuesto se adminis­traba conjuntamente con tiosulfato de sodio, la hipotermia pro­ducida era mucho menor que cuando se lo aplicaba en combinacióncon nitrito de sodio. Ü sea, que el mecanismo de potenciacióndel antagonismo al cianuro por lacloropromazina no se correlacignaba con la hipotermia producida (Kong y col., 1983).

Kongy col. (1983) investigaron otros posibles mecanismos de acción además de la hipotermia tales como velocidad deformación de metahemoglobina, actividad enzimática de rodenasay citocromo oxidasa, y bloqueo -adrenérgico. Hallaron que lacloropromazina no Forma metahemoglobina ni un aducto con el cignuro. Previamente se había reportado que esta droga inhibía la

45

citocromo oxidasa ¿n vÁtno(Bernsohn y co]., 1956) y que la estilaba ¿n V¿V0 (Dodson y co]., l975). Kong y col. (1983) no pu­dieron confirmar este último hecho, hallaron en cambio unamayordisminución en la actividad de la enzima en animales intoxicadospor cianuro y tratados con cloropromazina-tiosulfato de sodio.Tampocose produjo un incremento en la actividad de rodenasapor lo que no actuaría como donor de azufre. Pettersen y Cohen,(1985) obtuvieron resultados similares y además demostraron quetampoco se producía alteración de las propiedades cinéticas deesta enzima. Es probable sin embarqo,que sus propiedades comobloqueante a-adrenérgico sean la base de su efecto antidotal, yaque dicho efecto protector frente al cianuro se pudo revertircon un a-agonista, como la metoxamina (Kong y co]., 1983).

1.6.3.2. Oxíqeno

Comoya se describió en el ítem 1.5. de este Capítulo,e] efecto tóxico del cianuro se atribuyezluna disminución en lautilización de] oxígeno por los tejidos, presumiblemente debidoa una inhibición de la citocromo oxidasa. Si este fuera el úni­co mecanismode acción del cianuro, no existirían bases raciongles para el empleo de] oxígeno en e] tratamiento de la intoxicgción por este tóxico. Además, la citocromo oxidasa requiere unatensión de oxígeno de sólo 70 mmHgpara expresar su máxima act;vidad (Stotz y co]., 1938) y, si se tieneen cuenta que durantela intoxicación e] transporte de oxígeno y la tensión generali­zada se consideran adecuados (antes del colapso respiratorio ycardiovascular), a priori la terapia con oxígeno tendría poco oningún valor para revertir la toxicidad del cianuro (Burrows yco]., 1973). Varios trabajos han indicado que el oxígeno solo,bajo condiciones atmosféricas (Karsten , l934; Gordh y Norberg,1947; ’aulet, 1955; Cope, 196]) o hiperbáricas (Ivanov, 1959;Carden , 1970; Yunqmeisler,l972) es beneficioso en el tratamiegto de] envenenamiento por cianuro. La mayoría de las recomenda­cionespara c] uso del oxígeno es como adjunto más que como par­te inteqral del tratamiento. El oxígeno solo tiene efectos minimos, aumenta muypoco el efecto protector del tiosulfato de so­dio y no afecta la acción de] nitrito de sodio pero potencia laefectividad de la combinaciónnitrito-tiosulfato (Wayy co].,1966; Burrows y co]., 1973). Estos resultados han sido confirmados en ovejas (Burrows y Way, 1977) y en ratas (Savateen y col.;1969). Se halló que la protección aumentaba cuando la concentra

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ción de oxigeno se incrementaba del 20 % al 100 % (Sheedy y Way,1968). Se observó que e] efecto protector de] oxigeno no era sólo profiláctico (Wayy co]., 1966, 1972; Burrows y co]., 1973),sino también terapéutico, luego que los signos y sintomas delenvenenamiento por cianuro se manifestaban completamente (Sheedyy co]., 1966; Sheedy y Way, 1968; Burrows y Way, 1977).

El oxigeno es capaz de revertir varios de los efectosprovocados por el cianuro. Se pueden revertir las anormalidadesde trazos del electrocardiograma (ECG)y/o electroencefalograma(EEG) producidas por el tóxico (Ivanov, 1959; Cope, 196];Yungmeister, 1972; Burrows y co]., 1973) y además se ha observado disminución en lesiones cerebrales (Levine, 1959). Burrowsy col. (1973) estudiaron los efectos del oxigeno sobre las altgraciones producidas por el cianuro y hallaron en perros que, detodos los parámetros fisiológicos medidos, solamente en el casode] ELGse apreciaron diferencias sensibles entre el uso de ai­re y oxígeno como antidotos; además observaron que el oxigenoproducía un acortamiento en el silencio eléctrico ocasionadopor cianuro, ya sea aplicado solo o en combinación con tiosulfatode sodio o con nitrito-tiosulfato pero no con nitrito de sodio.Sin embargo, a altas dosis de cianuro no se pudo confirmar laacción del oxigeno para prevenir o revertir los efectos sobreelECUy los cambios respiratorios (Burrows y co]., 1973). Tambiénse encontraron diferencias en los parámetros bioquímicos en surespuesta al empleo de aire u oxígeno ¿n vivo (Schubert y Brill,1968; Isom y Way, 1982). La inhibición de la citocromo oxidasase revirtió más rápidamente en higado que en cerebro (Isom yWay, 1976) y a su vez fue más efectiva con oxigeno que con aire(Isom y Way, 1982). Animales tratados con oxígeno y con aireexhibieron el mismogrado de inhibición de la citocromo oxidasadurante la respuesta inicial al cianuro, sin embargoaquellosque recibieron solamente aire mostraron signos de intoxicaciónpor cianuro (Isom y Way, l982). Cuando el oxígeno, y no así elaire, se adminiStrÓ en combinación con e] antídoto nitrito-tio­sulfato de sodio, pudo reactivar completamente el metabolismode la glucosa inhibido por cianuro (Burrows y co]., l982), aun­que aún no se ha dilucidado el mecanismo de acción. No se observaron diferencias en la excreción urinaria o retención total enel organismo de cianuro entre aire y oxigeno.

En resumen,a pesar de que el oxigeno puede considerarse

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comoantagonista de] cianuro en determinadas condiciones, toda­vía no se ha encontrado una aceptada aplicación para su modo deactuar (Way, 1984).

En 1a tabla 1.3. se resumen Jos estudios llevados a cabo con varios antagonistas de] cianuro utilizados so]os o encombinación con Jos clásicos nitrito de sodio y/o tiosulfato desodio (Way, 1983).

ÏABLA1.3.: Comparación de km coeficientes depotenciacióndenuevos antagonistas sobre 1a intoxicación porcianuro de potasio

NITRITÜ

ANtAGÜNISTA SOLO NIÏRITÜ TIOSULtATÜ +

TIÜSULFATÜ

Control 1,0 1,0 1,0 1,0

Cobalto 2,5 1,5 3,0 1,8

Piruvato 1,5 1,0 2,0 1,5

Mercaptoviruvato 2,8 2,3 1,2 1,0

Cloropromazina 1,0 1,0 2,3 1,3

Oxígeno 1,0 1,0 1,5 2,0

Coeficiente de potenciación: DLSÜde cianuro de potasiocon antagonista nuevo/DL50 sin eJ antagonista nuevo

Primeramente, en condiciones experimentales Jos com­puestos de cobalto o mercaptopiruvato administrados solos se encuentran entre Jos antagonistas más efectivos de] cianuro desa­rroJJados recientemente. E1 nitrito de sodio o tiosulfato de sgdio utilizados también solos son muyefectivos. Con respecto a1a combinación de estos antagonistas, 1a mejor es mercaptopiru­

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vato con nitrito de sodio y,por otro Jado, excepto e] cobalto,ninguno de Jos nuevos agentes discutidos provee protección adi­ciona] a] nitrito de sodio. En combinación con e] tiosulfato desodio, las sales de cobalto y la cloropromazina produjeron Jamgyor potenciación. Las sales de cobalto, e] oxígeno y,en menorgrado e] piruvato de sodio, potenciaron Ja acción conjunta de]nitrito de sodio y tioquFato de sodio. En conclusión, ningunode estos antagonistas es tan efectivo por sí solo en compargción a cuando es utilizado encombinación con otros antídotos.

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CAPITULO II

RODENASA

Página

II.l Introducción 6]

II.2. Distribución biológica 6211.2.l. tuentes animales 63[1.2.2. tuentes vegetales y microbiológicas 6411.2.3. Distribución subcclular 65

11.3. Propiedades catalíticas 66

11.3.]. Lspecificidad de sustrato 6611.3.2. Inhibición y activación 68

11.4. Propiedades proteicas 69

11.5. Mecanismo de acción 7]

11.6. Funciones biológicas 73II.6.l. Interpretación convencional 74II.6.2. Interpretación modificada. Ll pool de

azufre sulfano 75II.6.2.l. Produccióny utilización

de azufre sulfano 76II.6.2.2. Toxicidad por agotamiento

de azufre sulfano 79II.6.2.2l. El problema de la mandioca 79II.6.2.22. Interrelaciones nutricionales 80

II.7. Rodenasa y cianuro 80

83II .8. Referencias

II. RODENASA

11.]. INÏRÜQQCCIÜN

La enzima rodenasa (tiosulfatozcianuro sulfotranferasa,EC 2.8.1.1) primeramente descripta por Lang (1933 a, b) catali­za Ja transferencia de un átomo de azufre sulfano , a partir deun donor de azufre, a una variedad de aceptores nucleofÍJicosegtableciéndose así e] siguiente ciclo catalítico:

(RSOXS)_ Rodenasa YS­

(RSÜX)' Rodenasa-S Y

donde: (RSÜXS)_: anión con un grupo sulfanoY_: anión tiofíJicox: 0, 1 ó 2

R: radica] orgánico, átomo de hidrógeno o de oxígeno

Los sustratos que pueden actuar como donores de azufrepara Ja rodenasa son: tioqufonatos, persulfuros y polisulfurossiendo Jos aceptores: c1anuro, sulfito, sulfonatos orgánicos,tioles y ditioles, borohidruro y ditionito.

La reacción mejor estudiada, catalizada por esta enzi­ma es la conversión enzimática de] cianuro en sulfocianuro menostóxico (Reacción II.].).

0 = + CN'—-.so z + SCN‘S 3 32

Reacción II.].

t] sulfito puede también actuar comosustrato aceptor

62

de azufre usando un tiosulfonato de la Forma RSOZS_como donorde azufre (Sórbo, 1957 a) (Reacción II.2.).

RSÜZS + SU3 ..'::::'RSÜ2 + SSÜ3

Reacción 11.2.

Además, en presencia dc persulfuro como sustrato acep­tor, el sulfito actuaria evitando la formación de productos tó­xicos (Reacción 11.3.). Esta reacción se ha propuesto como labase para la detoxificación endógena de sulfuro (Szczepkowski,196]; Koj y lrendo, 1962).

rodenasaHS' RSS' RSH

' | : :RSSR R SH SO3 SSÜ3

Reacción 11.3.

Otro rol de la rodenasa seria la interconversión dedigtintas Formas de S sulfano (Westley, 1973) como por ejemplo:persulfuro + tiosulfato, persulfuro + polisulfuro.

II.2. DISTRIBUCION BIOLOGICA

A partir de los primeros hallazgos sobre la detoxificgción del cianuro ¿nvivo (Lang, 1894, 1895) y de los estudios i­niciales sobre rodenasa (Lang, 1933 a, b), esta enzima ha sidoinvestigada en una gran variedad de fuentes biológicas. Activi­dad de rodenasa ha sido observada en bacterias, hongos, plan­tas, peces, anfibios, reptiles, aves y organismos animales (la­bla II.].) (Westley, 1973; Sórbo, 1975; Dudek y col., 1980). Ladistribución en órganos difiere de una especie a otra, la info;mación que se da en esta Tabla corresponde a lo hallado en los

principales órganos de ratas (Koj y co]., 1977).

TABLA11.1.: Distribución de rodenasa

IlLÜGLNLÏICA ÜRGANÜ SUBCELULAR

Procariotas Híqado (a) Núcleo (c)

Bacterias heterotroficas Rinon (b) MitocrondriaActinomicetes Corazon (c) Membranaexterna (C)

uacterias qu1mioautotrof¿ Cerebro (c) Espacio entre membtïLas Intestino (c) nas (c)

tucariotas Testículo (b) Membranainterna (c)

Honqos (Hepatoma Morris) 0)) Matriz (a)) v y ,¡Jdntds Retículo endoplasmico (c)

AnimalesCitosol (c)

(a) fuentes ricas; (b) fuentes con 20-60 %de la actividad espgcífica hallada en (a); (c) fuentes con e] lO % o menos de la agtividad específica hallada en (a)

11.2.]. Fuentes animales

Lang (1933 a, b) realizó estudios sobre la actividad derodenasa en tejidos deummífcros,también en ranas y pájaros. Entodos los tejidos demamiferosexisteactividad enzimática siendo,en el caso de caninos, mayor en higado y adrenales que en san­gre y músculo. La actividad más alta se observó en ranas, seguida por conejos y ganado vacuno. En los seres humanos, gallinasy gatos los niveles eran menores.

Trabajos posteriores de Cosby y Summer (1945), Himwichy Saunders (1948); Bénard y col. (l948 a, 1949) y Saunders yHimwich(1950) hallaron diferencias en las actividades de diversas especies y órganos. En general, la mayor actividad se de­tectó en hígado,aunque en perros, a diferencia de otras espe­cies, las adrenales son especialmente activas. Los riñones demgmiferos son menos ricos en rodenasa que el hígado (Koj y co].,1977). La actividad en cerebro es aproximadamente un lO % de la

64

medida en higado. Villarejo y Westley (1963 a) estudiaron ladigtríbución de la enzima en órganosde bovinos hallando que los riñones poseían un 50 % y las adrenales sólo un 2,5 % respecto dela actividad hepática. Coltorti y Giusti (1956 a) midieron laactividad de la enzima en eritrocitos hallando valores que eranaproximadamente del 2,5 % de los obtenidos para higado.

Tambiénse encontraron niveles de actividad enzimáticabajos en larvas, ninfas y adultos de moscarda (’arsons yRothschild, 1962) siendo el contenido de rodenasa en estos ani­males enteros de] 12H 2 % del valor correspondiente a higado bgvino.

Posteriormente, Schievelbein y co]. (1969) midieron lacantidad de rodenasa en varios tejidos de un amplio espectro deespecies. La mayoria de los animales terrestres poseían mayoractividad en higado y riñón mientras que los animales marinospresentaban su máximode actividad en branquias. En general, laactividad de esta enzima varia de una clase a otra pero es relgtivamente constante en especies de la misma clase.

Felbeck (198]) detectó actividad de rodenasa en el in­testino de] gusano de mar R¿6t¿a pachyptila, que vive en cuevashidrotermales de alta mar.

Un estudio de Reinwein (196]) sobre la distribución derodenasa en tejidoshumanos mostró la mayor actividad en hígado,seguida por riñón, suprarrenales y glándula tiroidea. Jarabak yWestley (1974 a) purificaron la enzima dehigado humano y la compararon con la rodenasa purificada de hígado bovino. La enzimade eritrocitos humanos fue estudiada por Scott y Wright (1980)y Vázquez y co]. (1986)

11.2.2. Fuentes veqetales y microbiolóqicasLa formación enzimática de sulfocianuro en numerosas

plantas Fue primeramente detectada por Gemeinhardt (1938, 1939).En 1954, Castrella Bertran publicó una comunicación breve sobrerodenasa en plantas. Posteriormente, Chewy Boey (1972) midieronesta enzima en las hojas de una planta cianofórica: la tapiocaManihot ut¿t¿óó¿na y comprobaron que su actividad era lo sufi­cientemente elevada comopara permitir la metabolización delcianuro libre que podría formarse ¿n vtvo por hidrólisis intra­celular del glucósido cianoqénico linamarina, presente en todas

65

las partes de esta planta. también se detectó actividad significativa de rodenasa en extractos crudos de hojas de l2 especiesseleccionadas al azar, 9 de ellas no-cianofóricas y 3 cianofóricas , no hallándose correlación entre dicha actividad y la natoraleza cianofórica de la planta (Chew, l973). Anosike y Ugochukwu(l981) caracterizaron Ja enzima de hojas y tubérculos de mandigca.

Secfectuaronesludios acerca de Ja capacidad de rodengsa para transferir azufre cn cloroplastos de espinaca, perejil,repollo y nabo (Tomati y co]., 1972).

Vázquez y col. (1980) estudiaron lnzu‘tividad de rodena­sa en clones viejos y jóvenes de callos de soya en Función deJos días de crecimiento del tejido, hallándose mayor actividaden los primeros.

En bacterias, los primeros estudios corresponden aLang(1933 a) y Bénard y col. (1948 b). Se detectó actividad de rodgnasa en: E. coii (Lang, 1933 a; Villarejo y Westley, 1963 b);en diferentes especies deThiobac¿€€u5(MC Chesney, l958; Bowen yco]., 1965; Sargeant ycol., l966; Smith y Lascelles, l966; LeJohn y col., l967; labita y co]., l969);Chn0mat¿um sp. strain D(Smith y Lascelles, l966);Pseudomonaóacnugin04a (Hall y Berk,l968; Schook y Berk, 1978); bacterias fotosíntéticas de las f3milias lhiorhodaceae, Athiorhodaceae y Chlorobacteriaceae (Yoch,J97l); Bac¿ZZu¿¿ubt¿z¿¿ (Villarejo y Westley, 1966) y en todaslas cepas ensayadas de : E. coflá, Póaudomonaó aenugán04a ,Acdnctobacten, Bondeffia 5 Sh¿gc€8a y Cítnabacten (Vanderberghy co]., 1979; Vanderbergh y Berk, 1980),; Rhodopóeudamonab¿phcnoidcó (Wider de Xifra y 001-, 1976) y Rp. paluótn¿¿ (Vázquez,1984).

también se detectó actividad de rodenasa en el alga­protozoo E. gnac¿z¿¿ (Watanabe y co]., 1985).

11.2.3. Distribución subcelular

Varios investigadores estudiaron la localización intracelular de rodenasaenI1hfiuh)demamifero.Ludewig y Chanutin(l950)demostraron que menos del l % de esta enzima estaba asociado atejido conectivo mientras que la mayor parte de la actividad sehallaba en la Fracción mitocondrial. Sürbo (195] a) y De Duvey col. (l955) obtuvieron resultados similares.

66

Para vertebrados la distribución subcelular de rodena­sa depende del proceso de evolución,observándose que la enzimade hígado aumenta su actividad y sufre un proceso de trasloca­ción de] citoplasma a la mitocondria cuando se pasa de peces,anfibios y reptiles a pajaros y mamíferos (Dudek y co]., 1980).

Posteriormente, Agnisola y col. (198]) estudiaron ladistribución enzimática en homogenatoy hialoplasma de prepara­dos a partir de 3 tejidos (branquias, glándula digestiva y riñgnes) de 4 especies de cefalópodos y hallaron que la actividadera mayor en octópodos y su patrón de distribución diferente encada especie.

Watanabe y col. (1985) hallaron que la enzima de E.gnaciiió es citosoluble. Resultados similares Fueron obtenidospor Vázquez (1984) para la proteína de Rp. paluótnió.

11.3. PROPIEDADES CATALITICAS

La mayoría de los trabajos tendientes a dilucidar laspropiedades cataliticas y el mecanismode acción de la rodenasase realizaron con la enzima cristalina de hígado bovino (Sórbo,1953 a), no existiendo diferencias entre la enzima de esta fuegte y la de riñón bovino (Westley, 1959; Westley y Green, 1959).

11.3.]. Especificidad de sustrato

Durante mucho tiempo se creyó que esta enzima poseía afinidad por solamente dos sustratos: tiosulfato comodonor ycignuro comoaceptor. La formación irreversible de sulfocianuro apartir de esos sustratos fue confirmada por numerosos autores(Lang, 1933 a, b; Sórbo, 1953 a; Goldstein y Rieders, 1953;Davis, 1962). La generación de cianuro a partir de sulfocianuroes una reacción oxidativa que involucra peróxido de hidrógeno yes catalizada por la peroxidasa o hemoglobina (Chung y Wood,1970, 197]).

Posteriormente se comprobó que todos los donores de a­zufre que contienen un átomo de azufre sulfano (liqura II.l.)pueden actuar como sustratos donores para la rodenasa. Así sepostularon comosustratos para esta enzima los siguientes com­

puestos:

- Mercaptopiruvato (Woody liedler, 1953; Blumenthal yHeinrikson,197]) con el que se obtiene una actividad enzimática del l %delzlmedidacon tiosulfato comodonor de azufre (Sürbo, 1964)

Tiosulfonatos (Sürbo, 1953 a, b; Erikson y Sürbo, 1967) de Ja

Forma: HR-ï-S

Ü­

- Sulfito, donde e] producto formado es el tiosulfato (Sórbo,1957)

- Mezcla de polisulfuros inorgánicos, principalmente disulfurosque pueden actuar como donores de azufre para el cianuro(Sürbo, 1960) o para el sulfito,Formándose en este caso tio­sulfato (Szczepkowski, 196]), y también e] trisulfuro "tiocigtina"(Szczepkowski y Wood, 1967).

0 0 0 0¡2- 'I I' 's5 IS S\\ l

0"/\S 0"Í\S / \ ‘o o"/\SU Ü X Ü Ü

liosulfatu Politionatos Tiosulfunatos

S\ S_ /R-S-S ¡(-5.5 -S-R í 5 S)x S\S/

Persulfuros Pulisulfurus Azufre elemental

FIGURAII.].: Compuestos con átomos de azufre sulfano que existen en sistemas bioló­qicos

Todos los aceptores para rodenasa son aniones tioFí]i—cos. Ademásde] clásico cianuro (Langa 1933 a) también actúancgm0 tal:

- Sulfito (Szczepkowski, 196]; Eriksson ySÜrbo, 1967)

- Ditioleszlipoato, lipoamida y 2,3-dimercaptopropanol (BAL)(Villarejo y Westley, 1963 a, b)

68

—Borohidruro y ditionito (Villarejo y Westley, 1963 a, b)

11.3.2. Inhibición y activación

La rodenasa es inhibida por iones alcalina-terreos habiéndose obtenido un 35 %de la actividad inicial con clorurodecalcio 0,02 M (Lang, 1933 a).

lambién son inhibidores el cianuro y el sulfito (Lang,1949; Green y Westley, 196]; Sbrbo, 1962; Vázquez, 1984). Estu­dios cinéticos sobre la rodenasa de hígado bovino mostraron que

los complejos metálicos del cianuro: Na(Au(CN)2), K2(Pt(CN)4),K2(Ni(CN)a), K2(Zn(CN)4) actúan como inhibidores efectivos deesta enzima (Volini y col., 1978; Lijk y col., 1983).

La presencia dc tiosulfato o de su átomo sulfano transFerible, disminuye la sensibilidad de la rodenasa a una considgrable variedad de tratamientos inhibitorios o inactivantes(Davidson y Westley, 1965; Wang y Volini, 1968; De Toma yWestley, 1970).

Con el Fin de dilucidar el mecanismo de acción de larodenasa, numerosos investigadores estudiaron el efecto de losreactivos sulfhidrílicos sobre la actividad enzimática, y hallaron que estos compuestos son inhibidores de esta enzima(Saunders y Himwich, 1950; Sbrbo, 195] a, 1963; Sato y Hayashi,1952; De Ritis y col., 1954; Coltorti y Ciusti, 1956 b). Asi,sellegó a la conclusión de que existe un grupo sulfhidrilo esen­cial en la rodenasa (Sürbo, l963; Wangy Volini, 1968).

Otras dos clases de reactivos inhibidores son los anignes en general, a altas concentraciones (Sakai, 1960; Mintel yWestley, 1966 a; Rakitzis y Malliopoulou, 1985) y los compuestosaromáticos (Davidson y Westley, 1965; Wangy Volini, l968), queactúan comoinhibidores de tipo competitivo con el sustratotigsulfato. Esto llevó a suponer que el sitio activo de la rodena­sa debe contener un centro catiónico que se une al sustrato a­niónico para Formar el complejo enzima-tiosulfato. El hecho deque los compuestos aromáticos produjeran una inhibición competitiva de la actividad enzimática llevó a postular la existenciade un qrupo triptofano en el sitio activo (Davidson y Westley,1965) que no se uniría a los átomos de azufre sulfano sino queactuaría manteniendo la naturaleza apolar de dicho sitio

69

(Horowitz y Westley, 1970; Finazzi Agró y col., 1972). Estudios

posteriores (Cannella y col., l975) comprobaron que el 5-fosfatode piridoxal y otros aldehídos aromáticos inactivan la rodenasa,siendo más importante el grado de inhibición para la forma librede azufre y parcialmente revertidopor tiosulfato o valina.

Horowitz y lalksen (l986) estudiaron el efecto de NAD+y NADHsobre la rodenasa y hallaron que el NADH, pero no el NAD+,actuaba comoun inhibidor competitivo del tiosulfato siendo másrapidamente inactivada la enzima libre de azufre que la formaazufre sustituida.

lodos estosestudiosllevaron a postular la existenciade 3 componentes esenciales en el sitio activo de la rodenasa: ungrupo sulfhidrilo, unqrupo catiúnico y una regiónlmidrofúbicaque,aparentemente, deben de estar muy próximos desde el punto devista espacial ya que la reacción con uno de ellos modifica laacción de los demás.

11.4. PROPIEDADES PROTEICAS

Las propiedades bioquímicas y estructurales de la rodgnasa de higado bovino han sido descriptas por varios autores(Sürbo, 1975; Westley, l977, l98l) habiéndose determinado su secuencia completa de aminoácidos (Sürbo, l963; Davidson y Westley,l965; Volini y col., l967; Finazzi Aqró y col., 1972; Russel ycol., l978; Wangy col., 1978 a). La estructura tridimensionalfue determinada por difracción derayos X a una resolución de2,5 R lo que permitió determinar la arquitectura de la rodenasay conocer la naturaleza y localización de los átomos en su sitioactivo (Ploeqman y col., l978 a, b).

La molécula consiste en una cadena polipeptidica contgniendo 293 residuos con un peso molecular de aproximadamente32.000 (Russel y col., l978). Se postuló que la rodenasa estáformada por dos "domains" globulares de tamaño y configuracióncasi idénticos, conectados por un segmento que comprende los rgsiduos 143 a 158 (Ploegman y col., 1978 a, b; Russel y col., l978)pero con una secuencia de aminoácidos diferente (Hol y col., l983).El sitio activo de la enzima esta localizado en una depresión entre los 2 "domains" y la cisteína 247, esencial para la catálisis,se encuentra ubicada en el fondo de esta cavidad (Ploegman, l977),no obstante, virtualmente toda la cadena lateral esencial parasu

70

actividad calaJili(%¡está provistzlpor el segundo "domain" (Pluegmanycol.,J979).Porcsludiosrrislajográficosefectuadossobre la rodgnasa azufre sustituida, se confirmó que lacisteína 2#7 ese] sitioal cual se une en forma covalente e] azufre del sustrato donor(Ploegman y co]., 1979). lambién pudieron explicarse en estetrabajo las predicciones anteriores sobre la importancia de las regiones hidrofóbicas y catiónicas en el sitio activo (Mintel yWestley 1966 a; Horowitz y Westley, 1970). Pensa y col. (1980)postularon que tiene lugar una unión electrostática entre elcianuro y los grupos de la enzima cargados positivamente.

Entonces, existen cuatro elementos en el sitio activo(Hol y co]., 1983) que se encuentran cuidadosamente ubicados unocon respecto al otro con el fin de obtener una catálisis eficiegte:

l) el grupo sulfhidrilo de la cisteína-247,

2) un conjunto de péptidos donores de uniones nitrógeno-hidróggno,

3) 2 residuos cargados positivamente,

4) un entorno hidrofóbico en la superficie de] sitio activo.

La enzima existe en dos formas: una conteniendo azufre,en la cual dicho átomo está unido a la cisteína 247 como grupopersulfuro (E-S-SH), y la otra en forma libre (E-SH) donde el azufre transferible ha sido eliminado por aceptores nucleofíli­cos (Davidson y Westley, 1965; Finazzi Agró y co]., 1972). Sehan usado muchosreactivos específicos para determinar las pro­piedades de estas dos Formas y el rol de los grupos sulfhidrilosen la reacción catalítica.Estudiosrealizados por Wengy col.(1978 b) modificando químicamente la enzima de hígado bovino,permitieron establecer importantes diferencias entre la rodena­sa libre y el intermediario catalítico en el cual el átomo sulfgno del donor de azufre esta unido a la enzima covalentemente(rodenasa azufre sustituida). El tratamiento de la enzimalibrecon cantidades estequiométricas de iodoacetato o fenilglioxalproducía una rapida modificación de] grupo sulfhidrilo esencialde la cisteína-247 y la consiguiente inactivación de la enzima.Esta inactivación en presencia de cianuro era causada por formación de uniones disulfuro. La enzima azufre sustituida no se ivnactivaba por iodoacetato y sólo era lentamene afectada por trg

7J

tamiento con grandes excesos de fenilglioxal. La pérdida de laactividad enzimática en la rodenasa azufre sustituida no involucraba los residuos cisteinilos pero podría relacionarse con lamodificación de los grupos guanidinio principalmente el de laarginina-lBó, cuyas cadenas laterales podrían jugar un rol impogtante en la unión de] sustrato. Pensa y col. (1977) hallaron queel agregado de] ácido 5-5'-ditio-bis(2-nitrobenzoico) (DÏNB)ala rodenasa libre de azufre produce un disulfuro mixto entre elgrupo sulfhidrilo esencial de la enzima y el tionitrobenzoato,que puede ser atacado por ambossustratos, cianuro y tiosulfato,restaurando la actividad catalítica. Pecci y col. (1980) comprgbaron que se obtenían diferentes azufre-ciano derivados si la enzima azufre sustituida o la enzima libre se trataban con ácido2-nitro-S-tiocianobenzoico (NÏCB). La interacción con los gru­pos sulfhidrilos vecinos libera tiocianato del derivado rodena­sa azufre y cianuro del derivado rodenasa libre de azufre. Enambos casos se forma unaunión disulfuro . Por tratamiento contetrationato se observó también una modificación de los grupossulfhidrilos hallándose una pérdida de un JOÜ%de la actividadde la enzima libre de azufre y de un 70 % de la actividad de laforma azufre sustituida; la interacción entre este compuesto yla rodenasa parece involucrar grupos tioles vecinales y llevaríaa la formación deuniones disulfuro (Prasad y Horowitz, 1987).

11.5. MECANISMO DE ACCION

Numerososestudios realizados con el fin de dilucidare] mecanismo de acción de la rodenasa (Sórbo, 195] a, 1962, 1964;Green y Westley, 196]; Szczepkowski, 196]) llevaron a proponerque esta enzima cataliza la transferencia ¿n u¿tno de azufre, apartir de tiosulfato, a cianuro por un mecanismode doble des­plazamiento en el cua] la enzima libre de azufre (E) y la enzi­ma azufre sustituída (ES) son dos formas aislablcs (figuraLl¿g¿). Este mecanismo fue confirmado por las experiencias deWestley y Nakamoto (l962), Villarejo y Westley (1963 b), Voliniy Westley (l966),Westley y Heyse (197]), Westley (1972), yVázquez (1984).

Dado el interés por deducir el mecanismo para la catá­lisis de rodenasa que incluye cambios conformacionales de la en

zima, se realizaron investigaciones comparandolos dos interme­diarios aislables (Volini y Wang, 1973 a; Horowitz yCriscimagna,1983; Horowitz y falksen, 1983). Ll átomo de azufre de ES estácovalentemente unido al sitio activo sulfhidrílico por una uniónpersulfuro (iinazzi Aqró y col., 1972; Guido y Horowitz, 1975;

Cannclla y col., 1980). Ll complejo enzima tiosulfato (E.SZO3:)es un intermediario cinéticamcnte significativo y transitorioque no es accesible por estudios fisicos (Mintel y Westley,1966 b). L' es un confórmcro libre de azufre formado en ausen­cia de sustratos donores de azufre por eventos estructurales derelajación (Chowy col., 1985) y L" es un confórmero inerte(Volini y Wang, 1973 b) (quura II.2.). Se ha suqorido que laenzima en solución cicla entre los confórmeros L y LS durantelacatálisis (Volini y Wang, 1973 a).

Cambiosestructurales funcionalmente relevantes en larodenasa parecen estar involucrados en los estados secuencialesrelacionados a Ja unión de] tiosulfato, formación de persulfuroy liberación de sulfito (Wangy Volini, 1973).

= l _____. u5203 E—-——>L E

(E.SZÜ3=) SCN‘

ES CN­

so =3

FIGURA11.2.: Mecanismo de acción de larodenasa

Se demostró que existeinhibicióncompetitiva mutua porambos sustratos (Mintel y Westley, 1966 b; Volini y WestJey,1966; Weatley y Heyse, 197]; Vázquez, 1984). Mintcl y Westley(1966 b) hallaron evidencias que justificaban que la inhibiciónpor sustrato ocurría por formación de complejos dead-end contiosulfato, cianuro, dihidrolipoato y algunos tiosulfonatos.

Jarabak y Westley (1974 b) trataron de determinar sidistintos grupos de sustratos donores o aceptores actuaban en el

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mismositio activo de la rodenasa o en sitios diferentes y rea­lizaron experimentos analizando la cinética en el estado esta­cionario cuando se empleaban sustratos mixtos. Utilizaron enzi­ma purificada de hígado humano y bovino y comprobaron que la enzima azufre sustituida difiere en sureactividad dependiendo dela naturaleza del sustrato donor de azufre. En otras palabras,parece que la enzima "recuerda" la estructura del sustrato de]cual recibió el átomo de azufre transferible, durante un perío­do siqnificativo después que e] primer producto ha sido libera­do de la enzima. Este fenómeno se observó tanto para la rodengsa de hígado bovino como para la enzima de hígado humano y estáprobablemente relacionado con e] importante cambio conformacio­nal que ocurre en esta enzima durante la unión con el sustratodonor (Jarabak y Westley, 1974 c).

Entonces, considerando el mecanismo de doble desplaza­miento, surqido de los numerosos estudios cinéticos efectuados,juntamente con la especificidad de la rodenasa por sus sustra­tos, podemosrepresentar la reacción catalizada por esta enzimamediante la Reacción 11.4. En esta ecuación el proceso químicopara la formación de la enzima azufre sustituida involucra laruptura de una unión azufre-azufre (Kice, 1968, 197]). Esta e­tapa es el paso limitante de la velocidad máximaen este ciclocatalítico, con tiosulfato comodonor de azufre (Mintel yWestley, 1966 a, b).

rodenasa libre + anión conteniendo un grupo sulfano¿:::::r rodenasaazufre sustituida + anión tiofílico

Reacción 11.4.

II.6. FUNCIONES BIOLOGICAS

Generalmente se ha postulado que la función primaria dela rodenasa es la detoxificación del cianuro, sin embargo, éstano parece ser consistente con su amplia distribución y abundan­cia. Este podría ser posiblemente su rol en plantas cianofóri­cas, que contienen enzimas que liberan cianuro a partir de los

7Q

glucósídos cianogénicos. En mamíferos que consumen dichas plan­tas, no obstante, existen enzimas digestivas que convierten unapequeña parte de los materiales cianogénicos ingeridos a cianu­ro; algún efecto tóxico probablemente se produzca por absorcióndel cianuro liberado por acción de la flora intestinal. El híggdo recibe cianuro vía la circulaciónporlal disminuyendo así lacantidad de cianuro en sangre antes que e] tóxico tenga accesoalos otros tejidos. Si algo del cianuro llegara a la intimidad delos otros tejidos, no est! claro cómola rodenasa actuaría desdela mitocondria donde está principalmente localizada (Cerletti,1986).

Una segunda función detoxificante propuesta para la r2denasa es la distribución del sulfuro,altamente neurotóxico, producido a partir de cisteína persulfuro en la reacción cataliza­da por la enzima cistationasa (Szczepkowski y Wood, 1967).

Algunos autores consideran a la rodenasa como una "rgliquia bioquímica"de la época en la cual la atmósfera del planeta contenía grandes cantidades de ácido cianhídrico (Schievelbeiny col., 1969). Pero éste es un punto de vista bastante pesimis­ta para una enzima tan ubícua. Debido a que se produce liberación de azufre a partir de los sulfanos, proporcionando así az!fre libre para diferentes usos incluyendo la detoxificación delcianuro, parece más apropiado considerar a la rodenasa como unade las enzimas necesarias para mantener el "pool de azufre sul­fano". De acuerdo con este punto de vista, los ditioles persul­furados por rodenasa, producirían sulfuro lábil gue puede ser gsado para formar los grupos hierro-azufre en las hierrosulfoprgteínas (linazzi Agró y col., 197]; Volini y col., 1977;Cerletti, 1986).

11.6.]. Interpretación convencional

Durante muchos años se aceptó que en los animales elcianuro era detoxificado por conversión a sulfocianuro a travésde la reacción catalizada por rodenasa (Lang, 1933 a). El tio­sulfato, sustrato donor de azufre para esta enzima, es relativamente abundante fisiológicamente (Giast y col., 1952) y la administración de tiosulfato o tiosulfonatos, resultó un tratamien­to efectivo para esta intoxicación (Sürbo, 1972).

75

11.6.2. Interpretación modificada. El pool de azufre sulfano

Varias observaciones sugieren que la interpretación anterior del proceso Fisiológico normal, para la detoxiFicación decianuro y sulfuro inorgánico, es inadecuada.

Los efectos tóxicos producidos por exposición aguda ocróni‘a al cianuro ejercen su acción primaria sobre el SNC,prigcipalmente sobre el centro de control de la respiración. Sin embargo, el contenido de rodenasa del SNC, y del tejido nervioso engeneral, no guarda relación con e] contenido hepático y renal.Además, en una intoxicación aguda, puede presentarse una falladirecta círculatoria, sin embargoel contenido de rodenasa enmúsculo cardiaco es pobre. leóricamente se debería esperar queel agente protector estuviera concentrado en el órgano u órga­nos más sensibles al tóxico (Westley, 1980).

Observaciones posteriores (Sórbo, 1975) sugirieron quela rodenasa no estaría involucrada en este proceso de detoxifi­cación de una manera directa ya que solamente una muy pequeñaparte de la actividad enzimática se utilizaría para la detoxificación del cianuro administrado ¿n u¿uo. La gran discrepanciahallada por Sürbo (1975) entre sus experimentos ¿n vivo e,¿nv4tno mostraron una ineficiencia inusual de losmecanismos diregtos desarrollados en respuesta a un requerimiento de detoxificgción.

Estas diferencias podrían justifi‘arse en parte consi­derando que la incorporación natural de cianuro, para la cualse desarrolló teóricamente e] mecanismode detoxifi‘ación, seproduce principalmente a través de los alimentos. Ln esta si­tuación, la localización hepática de la mayor uctividad de rodgnasa tiene sentidoltfltnnthn(4)ylzneficiencia de la detoxifica­ción estaría vinculada con la entrada primaria del tóxico en lacirculación portal (Westley, 1973) en cuyo caso, el hígado ten­dría oportunidad de eliminar el tóxico de la sangre impidiendoque llegue a otros tejidos.

Además, la rodenasa está ubicada en la matriz mitocon­dria] (Sórbo, l95] a, b; De Duve y col., l955; Koj y col., l9ÏS),mientras que el tiosulfato como tal presenta una lenta e incom­pleta penetración a través de la membranainterna de la mitocogdria (Greville y Chapel], 1959).

Otra observaciónndel sistema de detoxificación del cia

76

nuro que no puede dejarse de lado, está relacionada con Jos pa­cientes con atrofia ópti‘a hereditaria. Examinandomuestras debiopsias de hígadotide autopsias de dichos pacientes, se encon­tró un contenido de rodenasa completamente norma] (Wilson,l965)y, a pesar de ello, estos individuos no podían detoxificar cia­nuro convirtiéndolo en sulfocianuro. Se postuló entonces que lafalla primaria no estaba a nivel de rodenasa sino en un pool deazufre en el estado de oxidación correcto para efectuar dichaconversión (Wilson, 1965).

Esta teoría se generalizó postulándose que en indivi­duos normales existe un pool fisiolóqico de azufre en el nivel deoxidación apropiado para reaccionar con el cianuro (Westley,1973). A pesar de las otras funciones de los componentes de es­te pool, ellos están siempre disponibles para reaccionar conel cianuro cuandoesnecesario. Ln realidad se demostró la exis­tencia de ta] pool de azufre sulfano por mediodeexperimentoscon marcación en ratas, comprobando quc dicho pool es muy reac­tivo con elcianuro (Schneider y Westlcy, 1969). Ademásde utilizarse para la detoxificación de cianuro, puede usarse tambiénen la sintesis de cisteína. Puede, asimismo, ser la fuente delazufre inorqánico requerido para la sintesis de hierro sulfoproteínas, tales comola ferredoxina. Por lo tanto el análisisde la detoxificación del cianuro ¿n vivo debe plantearse actualmente considerando el pool de azufre sulfano, su composición,los compuestos relacionados, incluyendo los sulfuros inorgáni­cos.

Todas las estructuras que contienen átomos de azufresulfano se sintetizan naturalmente en los sistemas biológicos.Sus átomos sulfanos son rápidamente intercambiables ¿n vivo, siinyectamos a mamíferos derivados conteniendo 35S-sulfano se ob­serva una rápidaaparición de radioactividad en tiosulfato, politionatos y proteínas asociadas a azufre. Esta experiencia apoyafirmemente la teoría del pool de azufre sulfano.

II.6.2.]. Producción y utilización de azufre sulfano

Hay cuatro enzimas que están involucradas en la forma­ción, interconversión y utilización deazufre sulfano: tiosulfa­to sulfotransferasa o rodenasa, mercaptopiruvato sulfotransferasa, tiosulfato reductasa y y-cistationasa.

Las dos primeras son capaces de utilizar cianuro comosustrato aceptor de azufre; las cuatro enzimas pueden producirpersulfuro que espontáneamente pasa a sulfuro inorgánico a me­nos que se acople a otros sistemas que lo transformen en compueítos no tóxicos (Westley, 1977).

Las enzimas rodenasa y tiosulfato reductasa utilizan azufre a partir del poolde azufre sulfano. La reacción cataliza­da por esta última enzima es muy similar a la :atalizada por r2denasa siendo los sustratos aceptores qlutatión y cisteina perono cianuro (Uhteg y Westley, 1979). Ademaspueden interconver­tir varias formas de azufre sulfano y participar en las reaccignes de óxido-reducción de dichos compuestos pero no pueden pro­ducir "nuevas" moléculas que contengan azufre sulfano.

En tejidos animales existen dos enzimas capaces de cl;var las uniones carbono-azufre para dar nuevo azufre sulfano:la 3-mercaptopiruvato sulfotransferasa y la Y-cistationasa. Am­bas enzimas producen persulfuros inestables y en consecuenciasulfuro. Las reacciones por las cuales producen azufre sulfanoSCD:

a) 3-Mercaptopiruvato sulfotransferasa (Reacción 11.5.)

0u _ _ H _ _ _

SH-CHZ-C-COO + R502 <__—-H3C{-CÜÜ + RSUZS

mercaptopiruvato piruvato tiosulfato

Reacción 11.5.

donde R puede ser el grupo -Ü- o un residuo orgánico. Se creeque esta reacción con sulfito inorgánico comoaceptor es laprincipal fuente fisiológica de tiosulfato. Además,conside­rando la velocidad con que el sulfito es producido ¿n U¿U0,es muy probable que ésta sea la principal fuente de novo delazufre sulfano.

b) Y-Cistationasa (Reacción 11.6.)

CiSSCi + H20=c¡ss' + piruvato + NH4+

cisteínacistina _persulfuro

Reacción II.6.

Se ha propuesto la existencia de un sistema acoplado cista­tionasa y rodenasa, que utiliza ¿H vttno cistina y sulfitopgra producir tiosulfato, el cual explicaría la función de larodenasa en la detoxificación del sulfuro endóqcno(Szczepkowski y Wood, 1967).

Es importante considerar otra fuente de azufre sulfanobialóqica, además de las ya mencionadas. Un gran número de est!dios realizados a mediados y fines de la década del 70 demostrgron que e] azufre del disulfuro de carbono y de los pesticidastiocarbonilos y fosforotionatos, es retenido en la forma azufresulfano cuando estos compuestos son oxidados metabólicamente(De Matteis, 1974; Catignani y Neal, 1975; Hunter y Neal, 1975;Kamataki y Neal, 1976; Neal y co]., 1976; Scawriqht y co].,1976; Jarvisalo y co]., 1978).

El sistema celular involucrado es el citocromo P-450del reticulo endoplasmático, el cual por desulfu‘ación oxidati­va de esos compuestos produce azufre unido a proteínas; dicho azufre está unido probablemente como grupo persulfuro de los re­siduos cisteinilos de la proteína. Unade las proteínas afecta­das por este proceso es la apoproteína del mismocitocromoP-úSÜ, con la consecuente disminución de la actividad de estesistema. No se sabe si este azufre sulfano proviene de la acciónde las enzimas 3-mercaptopiruvato Sulfotransferasa y Y-cistatignasa. lampoco se conoce si las enzimas capaces de utilizar el gzufre sulfano (rodenasa ytiosulfato rcductasa) favorecen la re­cuperación de la actividad del citocromo P-üSU ¿n vivo.

II.6.2.2. Toxicidad por agotamiento de azufre sulfano

Del análisis efectuado hasta aquí podemosconcluir:

a) Existen procesos para la detOxificación biológica de cianuroy sulfuro.

b Dichos procesos están directamente vinculados con las inte­V

racciones y niveles del pool de azufre sulfano y no son sim­ples detoxificaciones enzimáticas.

Esta posiciónsuqiereque algunos de los efectos tóxicosvistos en la intoxicación crónica por cianuro, son posiblementeefectos secundarios causados por el agotamiento del pool de azgfre sulfano debido a las reacciones en las cuales se forma tio­cianato. Se puede suponer que tales efectos contribuyen a laicomplejidad de las interrelaciones nutricionales existentes en ta­les intoxicaciones crónicas.

II.6.2.2]. El problema de la mandioca

Es probable que la mayoria de los daños neurológicosque se observan en la neuropatía atóxica y en los diversos gra­dos de fallas sensoriales que afectan a las poblaciones de Africa Occidental sean causados directamente por el cianuro libre.Las concentraciones de cianuro en el plasma, en ausencia de cianuro exóqeno, son muy pequeñas. El cianuro administrado tiendea ser secuestrado dentro de los eritrocitos, pero cuando la do­sis aumenta, se produce acumulación de cianuro en el plasma(Vesey y Wilson, 1978). Aunque el cianuro es detoxificado porconversión a tiocianato, es posible que se exceda la capacidadde detoxificación del sistema. A dosis suficientes,entonces, elpool de azufre sulfano se agota y las células del sistema ner­vioso, entre otras, son irriqadas conunfluido conteniendo con­centraciones significativas de acido cianhídrico. Esta pareceser la situación en los humanos que consumen cróni‘amente gran­des cantidades dematerialescianoqénicos. Para la mayoría delasotras personas la velocidad de re-aprovisionamiento del pool sulfano y el efecto regulador ejercido por la captura del cianuropor las células rojas, son adecuados para mantener la concentración de cianuro libre en los fluidos extracelulares a nivelessuficientemente bajos para evitar cualquier daño (Westley, 1980).

80

II.6.2.22. Interrelaciones nutricionales

Se sabe que el daño del cianuro es exacerbado por va­rias deficiencias nutricionales comunes. Unade ellas involucra

a la vitamina B12 (Wilson y Matthews, 1966). El cianuro mantigne a la vitamina B12 como cianocobalamina, que es la Forma inagtiva. Así el cianuro tiene la capacidad potencial para crearunaefectiva deficiencia de B12. Otra relación menos obvia tiene quever con la riboflavina. Las dietas de Africa Occidental puedenser precisamente deficientes en riboflavina; la Falta de estavitamina contribuye a la complejidad de las enfermedades caracte­risticas, en una manera que no es completamente razonable. Qui­zás la conexión más importante sea que la dieta de las personasque subsisten principalmente de mandioca, es típicamente defi­ciente en proteinas. Esto es Fundamental ya que si nuestro aná­lisis de la participación de] pool sulFano es correcto, la Fuegte primaria de la mayoría del azufre para la detoxificación delcianuro se logra inqiriendo cisteína y metionina. En realidad,el problema es doble ya que el poo] sulfano deficiente no sola­mente no podrá detoxificar todo el cianuro sino que tampoco po­drá cumplir con sus roles fisiológicos normales.

Otro problema relacionado con el cianuro que acosa alas poblaciones mandioca dependientes tiene que ver con la Fun­ción tiroidea: el bocio es Frecuente. Comolos componentes delpool sulfano son convertidos a sulfocianuro, éste se acumula, debido a que no es excretado bien por los riñones. Aunque el tio­cianato pasa bien a los glomérulos, es reabsorbido en los túbu­los comolo es e] cloruro. Desafortunadamente, este carácterpseudohalógeno también se extiende al comportamiento del tiocignato en el tejido tiroideo, donde compite con el ioduro, produ­ciendo una insuficiencia tiroidea. Además, aunque la peroxidasatiroidea (Malof y Soodak, 1964), comootras peroxidasas (SbrboyLjunqgren, 1958; 0ram y Reiter, 1966; Chung y Wood, 1970) es cgpaz de oxidar el sulFocianuro, los productos de la reacción sonsulfato y cianuro; ésto revierte la detoxifi‘ación quese habialogrado a expensas del pool sulfano.

11.7. RODENASA Y CIANURO

Como ya se ha mencionado, muchos farmacólogos y toxicg

8]

Jogos aceptan que la reacción entre tiosulfato y cianuro eatalizada por rodenasa, es el principal mecanismopara la detoxificgción de cianuro y que esta función constituye el rol primario dela enzima (Lang, 1933 a, b; Vennesland y col. 1982). Sórbo(1957) demostró que la citocromo oxidasa de mamíferos inhibidacon cianuro, podia reactivarse por tratamiento con rodenasa ytiosulfato. Sin embargo, los elevados niveles de esta enzimapresentes en hígado humano(Westley, 1973) no justificarían lafunción primaria asignada a esta enzima. Cagianut y col. (1984)hallaron que la rodenasa hepática de pacientes con atrofia óptica hereditaria estaba significativamente disminuida y sugirie­ron que la detoxificación del cianuro que es subóptima podria igcrementarse suministrando tiosulfato.

La rodenasa posee un número de turnover de 20.000 min-J(Sürbo, 1953 a; Westley, 1981) por le tante, en condiciones ideales ¿n v¿140,un mol de esta enzima puede detoxificar 20.000 mgles de cianuro/minuto. Debido a que su distribución intracelu­lar es mitocondria], la eficiencia de la enzima endógena para detoxifi‘ar el cianuro es limitada a pesar de encontrarse presen­te en grandes cantidades, debido a que el tiosulfato no penetralas membranas celulares (Way, 1984). Crompton y col. (1974) estudiaron la permeabilidad del tiosulfato y encontraron eviden­cias de que el transporte de este compuesto es catalizado por uncarrier dícarboxilado.

Actualmente, el análisis de la detoxificación del cia­nuro ¿H Vivo debe plantearse considerando el pool de azufre sulfano, su composición y los compuestos relacionados, incluyendolos sulfuros inorgánicos. Westley y col. (1983) propusieron lasiguiente hipótesis: el azufre sulfano se forma en el hígadoprincipalmente por la acción de la mercaptopiruvato sulfotrans­ferasa. Las distintas formas de azufre sulfano son interconver­tidas principalmente enel hígado, por la rodenasa. La reducciónde losazufressulfano a sulfuro es catalizada por la tiosulfatoreductasa presente en todos los tejidos. Cuandoel cianuro estápresente, este reaccionaria rápidamente con alguna o varias delas formas de azufre sulfano. Considerando esta hipótesis, es­tos autores se cuestionan, cuál es la enzima primaria en la de­toxificación del cianuro.

Parece existir un transportador que llevaría elazufredesde el hígado, donde se forma, a los otros órganos. Este trans

82

portador es 1a seroalbúmina que Forma complejos estequiométricosespecíficos con azufre elemental tanto ¿n vao como¿n V¿¿no(Westley y c0]., 1983) y que también se une a] azufre sulfanoderivado Fisiológicamente a partir de] tiosulfato (Szczepkowski,1963; Schneider y Westley, 1969). LJ efecto catalizador de Jaseroalbúmina sobre la cianólisis de] azufre elemental coJoida]a sulfocianuro ha sido descripto previamente (Sürbo, 1955; DeRitis y co]., 1956). Considerando las cantidades de seroalbúmi­na ¿n u¿uo y las constantes de velocidad para Ja cianólisis ca­talizada por seroanúmina (Jarabak y Westley, 1986), e] comple­jo azufre-albúmina podría ser e] principal compuesto natura] dedetoxificación de] cianuro en organismos que poseen pools de a­zufre sulfano deficientes (Sórbo, 1953 a; Westley y co]., 1983).

II.

83

8. REFERENCIAS

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S-ADENÜSIL-L-METIONINA

III.J.

III.2.

III.3.

Funciones biológicas

Absorción y excreción de Ja SAM

Referencias

CAPITULO III

Página

89

9]

93

89

III. S-ADENOSIL-L-METIONINA

La S-adenosil-L-metionina (SAM)es una molécula Fisio­Jógica, presente tanto en células procariotas comoen eucario­tas (Greenberg, 1963) cuya estructura química es la siguiente(Cantoni, 1952; Baddiley y Jameson, 1954):

N

N/z. 2 N l \> 1CH3 K

0:;t l N NC—CH—CH2—CH2-—-—s‘ —CH2

Ho/ ¡ oNHz 3

H H

H HOH OH

l: Grupo adenosi]; 2: grupo metilo;3: Radical sulfonio ; 4: grupo aminoprgpilico

La SAMse biosintetiza en el protoplasma de todos losseres vivos a partir de L-metionina y ATPpor acción de laSAM-sintetasa (Mudd, 1963).

111.]. FUNCIONES BIOLOGICAS

La molécula de SAMrepresenta el centro de tres proce­sos de primordial importancia biológica: transmetilación, trangsulfuración y transaminopropilación (Figura III.J.).

La transferencia del grupo metilo puede realizarse so­bre un átomo de nitrógeno, la N-metilación (Ej: noradrenalina­adrenalina, etanolamina-colina, etc. (Bremer y Greenberg,J961; Ciaranello, 1979). El oxigeno puede también actuar comoátomo aceptor, por ejemplo en el caso de las catecolaminas, inagtivación de estrógenos y diversas proteinas y ácidos nucleicos(Axelrod y col., 1958; Goldberg y Marsden, 1975). Existen reagciones en las que la metilación se lleva a cabo sobre un átomode carbono y son aquellas en las que participan antibióticos,

90

vitaminas, proteinas y ácidos ncheicos (Borek y Srinivasan,1966; Kim y ’aik, 197]; Morín y Liss, 1973; Furvichi, 1974). FinaJmente, se conocen Jas reacciones de S-metilación (Kim,1977).

[exoSAMdccnrhoxllnsn

"no.I: CÑ C

IRANSHI‘LLIACIUN \ ¿"ímïwïwz\mwMviilnrión du une­

lrnhm t-ndóqcnoa y TRANSAMKNOPRÜPILACIONCY”!""05I Mutirnlinn Síntesis de lns polinminun

fi-Adonuull-Homnuiuleínn (SAHU) ""¡¡_¡¡"_Ad"””"¡"n (M¡A)

///W\\\ \MMÍI (//A\\\. . l .Adennninn Homncxsteínn__.____i H. Adnno ¡nu Mcrcnptnno

'J”

lflANSllLl lIRAlI l UN

Síntesis de loacuerpos nulfurndnoeudóqonno

FIGURAIII.].: Funciones biológicas de Ja SAM

Luego de ceder su grupo metilo a las moléculas acepto­ras, Ja SAMse transforma en S-adenosi]—homocisteina (SAHO)quese convierte en homocisteína y Juego en cisteína que originaglutatión (GSH)y otros productos. Esta via se conoce comotran­sulfuración (Figura III.2.). La SAMdesempeña un papel Fundamefltal como transulfurante dado que en e] hombre Jos requerimien­tos de azufre sólo son satisfechos por Ja metionina o la homo­cisteína. Además, e] GSHjuega un ro] protector Fundamental fregte a diversos tóxicos exógenos y endógenos partiquarmente hepáticos (StramentinoJi y coJ., 1979; Jakoby y Habig, 1980). TantoJa cisteína comoe] ácido homocisteico pueden derivar en e] suifato activo (PAPS) que, además de poseer una acción detoxificagte, participa activamente en Ja sulfatación de gJucoproteinasconectivas (Mc Culjy, 1969).

La SAMparticipa también en Ja transferencia de] grupoaminopropiJo que es Fundamental para Ja síntesis de proteínas ypo]iaminas vinquadas con e] crecimiento y Ja diferenciación cgJuJar.

SAM

SAHO

Homocisteina

Cistationina

Cisteamina‘\\ Cisteínq. . / l llaurina \‘Glutation

SOA.._SH+

glucoproteínas \\\\\\\\conectivas N\\\\\

Coenzimas Apoenzimas Enzimas tiólicas

Sulfatación dediversas sustancias

FIGURAIII.2.: SAMy transulfuración

Ademásde intervenir en el metabolismo de diversos ne!rotransmisores y de otras sustancias de importancia biológica,la SAMdesempeña un papel esencia] en el mantenimiento de la egtructura y en la regulación de la actividad de las membranascglulares (Maeday col., l986).

III.2. ABSÜRCIÜN Y EXCRECIÜN DE LA SAM

De estudios autorradiográficos realizados con ratonesa Jos cuales se les inyectó 1“(Z-SAM(1,4 ug/g, i.v.; 0,2 uCi/g)se dedujo que el fármaco penetra lentamente en Jos tejidos ypegmanece en ellos largo tiempo a baja concentración, observándo­se altas cantidades en riñón, bazo, hígado, pulmón, sangre yglándulas salivales de l a 4 horas luego de su administración,mientras que en miocardio y cerebelo el máximo se observó entrelas 24 y 48 horas. E] principal órgano excretor de la SAMy susmetabolitos es el riñón y en segundo lugar el hígado. En cuanto

92

a Jos niveles plasmáticos, éstos alcanzaron un pico a Jos 30 y5 minutos cuando el compuesto se administró a ratas por sondagástrica o vía i.m. respectivamente.

La eliminación de Ja SAMse produce vía urinaria obsegvándose que Juego de la administración i.m. (JO mg/kg) a ratas,sólo una pequeña cantidad de SAM(0,34 %) se excreta sin sufrirmodificaciones, mientras que por vía oral (JÜÜ mg/kg) Ja eJimi­nación fue nún menor (0,0]2 % en 24 horas). En heces, se excre­tn un 2,4 % y un 52,4 % cuando Ja droga Se suministra via i.m.u ora] respectivamente (Strumentinoli, 1987).

En cuanto a Jn vida medin de Ja SAMen sangre, los re­sultados demostraron que es de 40 minutos para Ja rata y e] co­nejo y, de 80 minutos para el hombre (Stramentinoli y Catto,1976).

III.3. REFERENCIAS

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MATERIALES Y METODOS

MATERIALES

1.]. Equipos

1.2. Reactivos

1.3. Rodenasa

1.4. Animales

CAPITULO I

Página

94

94

94

94

I. MATERIALES

I.J. EQUIPOS

Las centrifugaciones se efectuaron en una centrífugaSorvall RC-SB y en una Rolco modelo CM-36.

Las determinaciones espectrofotométricas se llevaron acabo en espectrofotómetros Beckman modelo DB o Metrolab RC 325BD.

Las mediciones por fluorometría se efectuaron en un egpectrofluorómetro Shimadzu modelo RF-SJÜ.

Los homogenatos de los tejidos animales se prepararonusando un Potter Elvehjen con émbolo de Ïeflón.

1.2. REACÏIVÜS

Todos los reactivos utilizados fueron de grado analítico. La mayoría de ellos se obtuvieron de Merck o Sigma Chem. Co.

E] citocromo c provino de Fluka A.G. y se encontraba cgmo sal libre obtenido de corazón de caballo.

La S-adenosil-L.metionina (SAM)(de Sigma) utilizadapara las experiencias ¿n v¿tno se encontraba como sal (p-LO­luensulfonato).Para las experiencias ¿n v¿v0se utilizó la pre­paración farmacéutica Ïrans-metil suministrada por LaboratoriosPromeco (Buenos Aires - Argentina).

1.3. RODENASA

La enzima rodenasa (EC. 2.8.].l) purificada de hígadobovino procedía de Sigma.

1.4. ANIMALES

Se usaron ratones macho cepa Cfl de aproximadamente20-25 g, alimentados con dieta normal para animales de laboratgrio (Purina 3) y agua ad Eibitum.

CAPITULO II

METODOS

11.2.

11.5

11.6.

II.7

Preparación de Jos tejidos animales utilizados

11.1.]. Hígado, cerebro y corazón11.1.2. Sangre11.1.3. Fantasmas de eritrocitos

Determinacióndeactividades enzimáticas

11.2.]. Rodenasa11.2.2.11.2.3.11.2.4.

Acido 6-aminolevújico dehidrnsa (ALA-D)Citocromo oxidasaUnidades enzimáticas

Determinación de Ja concentración proteica

Medición de cianuro

Determinación de azufre JábiJ

Medición de qufocianuro directo

Referencias

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100

102

95

II. METODOS

II.l. PREPARACION DE LÜS ÏEJIDUS ANIMALES UTILIZADOS

En todas las experiencias, los animales se trataronvíai.p. con una solución de heparina (12,5 mg/ml) l0 minutos antes

ulde su sacrificio, en un volumen no mayor del J m del peso corpgral. Los animales se anestesiaron con éter y se sacrificaron eltrayéndoles la sangre mediante punción cardíaca. Posteriormente,se realizó una perfusión aórtica consolución fisiológica (clorgro de sodio 0,9 %) para eliminar la sangre de Jos tejidos.

Los tejidos se mantuvieron en frío hasta su proce­samiento el mismodía del sacrificio.

II.].J. Hígado, cerebro y corazón

Los órganos previamente perfundidos se homogeneizaronen sacarosa 0,25 M(l:l0 p/v). El homogenato obtenido se centriFugó de acuerdo al siguiente esquema:

HOMÜGENATÜ

600 x g, l0 min

PRECIPITADÜ SÜBRENADANTE

(se descarta) JS 000 x g, 5 min

MIÏÜCÜNDRIA FRACCION SÜLUBLE

II.].Z. SangreLa sangre obtenida por punción cardíaca se hemolizó

con tritón X-l00 5 % (lz5 v/v) y posteriormente se diluyó l:5(v/v) con buffer Tris-HCJ 0,05 M pH 7,4.

[1.1.3. Fantasmasde eritrocitos

El método de preparación de fantasmas de glóbulos r0­

96

jos a partir de sangre de ratones se describe en e] Capítulo IVde Resultados y Discusión. Los Fantasmas de eritrocitos se hemgJizaron con tritón X-JOÜ5 % (1:5, v/v) y se diluyeron 1:5 (v/v)con buffer Iris-HC] 0,05 M pH 7,4.

11.2. DETERMINACION DL ACÏIVIDADLS ENZIMATICAS

lodas Jas operaciones previas a Ja incubación se efec­tuaron a 4-6 °C.

11.2.]. Rodenasa

La actividad de rodenasa se determinó en Ja fracción s9JubJe de Jos homogenatos y en Jos hemoJizados de sangre enterade acuerdo con e] método descripto por Sürbo (1957).

La mezcla de reacción contenía en un volumen fina] de2 mJ: 100 umoJes de tioqufato de sodio; 100 umoJes de buffer1ris-HCJ pH 8,7; 100 umoJes de una solución que contiene 0,4 mgJes de HCJ por m0] de cianuro de sodio y Ja cantidad de enzimacorrespondiente en cada caso (0,] mJ de homogenato de hígado y0,2 mJ de Jos homogenatos de cerebro, corazón y sangre). Lareacción se inició por e] agregado de cianuro de sodio, incubágdose a 37 °C durante 30 minutos (excepto que se especifiquen o­tras condiciones). Cuandose midió Ja actividad enzimática enausencia de cianuro en e] sistema de incubación eJ volumen deJos homogenatos agregado fue 0,] m] para hígado y 0,5 mJ paraeJ resto. La reacción se detuvo por e] agregado de 0,2 m] de Fog

mo] 38 % y J mJ de reactivo Férrico (JO g de fe(N03)3.9 H20 +20 m] de HN03(C), JJevados a 100 mJ con agua destilada). Se centrifugó a J.000 x g durante 15 minutos y se Jeyó Ja absorbanciaen e] sobrenadante a 460 nm.

Los valores de quFocianuro formado se obtuvieron decurvas de calibración realizadas con qufocianuro de sodio J mM(¡itura II.J., Vázquez, 1984).

11.2.2. Acido ó-aminoJevúJico dehidrasa (ALA-D)

EJ ALA-Dse midió en Ja Fracción soJubJe de Jos homoggnatos y en hemoJizados de sangre entera según eJ método de

9/

BatJJe y co]. (1967).

A46009­

0,6­

0,3­

o . . . .o 0,1. qe 2 1,6 zo1

nmolos SCN’X 103

¡IGURAII.J.: Curva de calibración utilizadagnnvndetegminar Ja actividad de rodcnasa. La rectaobtenida relaciona Jos valores de absor­vancia obtenidos a 460 nm con Ja canti­dad de nmoJes de qufocianuro de sodio deJa solución standard preparada.(o) diJ 1:3, (o) dil 1:5, (A) (“11:10

EJ sistema de incubación contenía en un volumen Fina]de J mi: 2,5 pmoJes de ácido 6-aminoJevúJico (ALA); 50 “moles debuffer Fosfato de sodio pH 6,8 y extracto enzimático (0,5 ml delhomogenato de cerebro y 0,25 mJ de Jos otros tejidos). Luego deJ hora de incubación a 37 °C en aerobiosis, Ja reacción se detgvo por agregado de 0,] mJ de TCA50 %. La proteína precipitadase separó por centrifugación y se midió e] porfobiJinógeno(PBG) Formado en e] sobrenadante.

E] contenido de PBGse determinó mediante Ja reacciónde Ethich (Moore y Labbe, 1964) aplicando Ja siguiente expre­sión para su cáquJo:

555 . 6 .

nmoJes/mJ homogenato : A X voj'lnc' X JO X dl]voJ.enzima x c x PM

donde A555 : absorbancia a 555 nmVo}. inc. : volumen fina] de incubacióne : 113,6 (absorción de una solución de PBGde concentra

ción de J mg/mJ)

PM: 226

Vo].enzima: volumen de homogenato incubado

11.2.3. Citocromo oxidasa

Se determinó de acuerdo con eJ método descripto porYonetani y Ray (J965) con las modificaciones que se indican.

La Fracción mitocondrial de híqado se resuspendió en3 mJ de buffer fosfato de sodio 0,05 M pH 7,4 y Jas de cerebroy corazón en un volumen de J mJ de dicho buffer. Los tejidos rg

0'suspendidos se trataron con una solución de Tween80 JO m enbuffer Fosfato de sodio 0,05 MpH7,4 en una relación 0,] %(v/V).

EJ sistema de incubación contenía en un volumen Fina]de J m]: 0,048 umoJes de citocromo c reducido , 42,5 umoles debuffer fosfato de sodio pH 7,4 y 0,05 mJ de fracción enzimática.LJ buffer se incubó JO minutos a 37 °C, Juego se agregó e] citgcromo c y Ja reacción se inició por eJ agregado de Ja fracciónenzimática y se midió Ja disminución de Ja absorbancia a 550 nmen Función deJ tiempo.

EJ citocromo c reducido se preparó por agregado de di­tionito de sodio a una solución decitocromo c 2,4 mMy e] exce­so de ditionito se separó por pasaje por una columna de Sephadex0-25.

Las unidades enzimáticas se caquJaron seúun Ja siguiente expresión:

Joq (AtO/At1) voJ.inc. J 3nmoJes/mJ homogenato = x x — x 10

A t voJ.enz. e

donde Ato : absorbancia a 550 nm inicia]At1 : absorbancia a 550 nm aJ tiempo que comienza e]

plateauAt = variación en minutos entre t1 y t0VoJ.inc. = volumen final de incubaciónVoJ.enz. : voJumen de fracción enzimáticae = coeficiente de extinción miJimoJar deJ citocromo c

reducido: 29,5 mM

99

11.2.4. Unidades enzimáticas

Se define como la cantidad de enzima que cataliza laFormación de J nmol de producto o la desaparición de l nmol desustrato en las condiciones standard de incubación. La activi­dad específica se define como el número de unidades por mg deproteína.

11.3. DETERMINACION DE LA CONCLNÏRACION PRÜÏEICA

Para las determinaciones de proteínas se utilizó e] mátodo de Lowry y col. (l95l).

11.4. MEDICION DE CIANURO

La cantidad de cianuro presente en los distintos teji­dos se determinó en la fracción soluble de los homogenatos dehígado, cerebro y corazón y en el hemolizado de sangre enterade acuerdo con el método de Guilbault y Kramer (l965).

A 3 ml de una solución de p-benzoquinona 3,4 x lO-a Men dimetilsulfóxido se le agregaron 0,05 ml de buffer fosfatode sodio 0,05 M pH 7,4 y 0,05 ml de la solución a analizar. LaFluorescencia verde desarrollada se midió en un espectrofluoró­

metro (¡extinciónzúlü nm, Aemisión: 475 nm) usando como patrónuna solución standard de concentración conocida.

11.5. DETERMINACION DE AZUFRE LABIL

Se determinó de acuerdo a una modificación del métodode Koh (1965) en la Fracción soluble de los homogenatos de higgdo, cerebro y corazón y en el hemolizado de sangre entera.

A l00 ul de extrato se le agregó 100 ul de amoniacol M, 125 ul de cianuro de potasio 0,l M y l ml de agua destila­da. Se dejó 45 minutos a temperatura ambiente. Transcurrido estelapso se agregaron l25 ul de reactivo férrico y se leyó la ab­sorbancia a 460 nm. Se realizó un control al que se le añadió elcianuro de potasio después del reactivo férrico.

La cantidad de qufocianuro formado se obtuvo de unacurva de calibración (Fiqura 11.2.).

ALGO

OAS­

aosL

0 n l l lO 25 50 75 100

umoles SCN‘ x 103

FIGURA11.2.: Curva de calibra­ción utilizada pa­ra determinar azu­Fre Jábi]. La regta obtenida rela­ciona los valoresde absorbancia a460 nm con Ja cagtidad de umoJesde qufocianuro desodio de Ja soJu­ción standard prgparada.

II.6. MEDICION DE SULFOCIANURÜ DIRECTO

Para Ja determinación de] qufocianuro formado en la

JÜJ

fracción soluble de Jos homogenatos de hígado, cerebro y corazóny en Jos hemoJizados de sangre entera se utiJizó Ja metodologíadescripta para Ja cuantificación del quFocianuro formado en Jareacción cataJizada por Ja enzima rodenasa (ítem II.2.].).

Cuando se midió qufocianuro en pJasma y orina se pro­cedió de Ja siguiente manera: eJ plasma se separó por centrífu­gación a J.000 x q 5 minutos de Ja sanqre entera. A 0,3 m] deplasma u orina se Je agregó J mJ de aqua destilada; 0,5 mJ deFormoJ 38 % y 2,5 m] de reactivo férrico. La mecha se centrifggó a JÜ.ÜÜÜx g durante JU minutos e inmediatamente después seJeyó Ja absorbancia a 460 nm. La concentración de qufocianurose determinó a partir de una curvastandardpreparada con quFo—cianuro de potasio (Fiqura 11.3.).

¿60A

Q3'O

0,2'O

O

0,1'

0_ l lO 0,1 0.2 Q3

umoles SCN'

JIGURAII.3.: Curva de caJibración utiJizada para determinar qufocia­nuro en pJasma y orina.La recta obtenida relacionaJos vaJores de absorbancia a460 nm con Ja cantidad deumoJes de qufocianuro de pgtasio de Ja soJución standardpreparada.

JÜZ

II.7. REFERENCIAS

- Batlle, A.M. del C.; Ferramola, A.M.&Grinstein, M. (1967)Biochem. J. ¿93, 244.

- Guinath, G.6. á Kramer, D.N. (1965) Anal. Chem. 21, 1395.- Koh, 1. (1965) Bull. Chem. Soc. Japan gg, JSJÜ.- Lowry, 0.; Rosebrough, N.; Fnrr, L. & Randall, R. (195]) J.

Bio]. Chem. ¿22, 265.- Moore, M. & Labbe, R. (1964) Clin. Chem. ¿9, JJÜS- Sürbo, B.H. (1957) Acta Chem. Scand. l, 32.- Vázquez, E.S. (1984) Tesis Doctora], UBA—Yonetani, Ï. & Ray, G.5. (1965) J. Bio]. Chem. _¿g, 3392.

RESULTADOS Y DISCUSION

CAPITULO I

lNÏÜXICACION ORAL CRONICA PUR CIANURÜ

Página

l.l. Determinavión de los niveles lisulnres de cianuro l03

[.2. Arlividnd de viluvrumu uxidnsn 104

1.5. Avlividud de rudcnusn 106

1.4. Determinuvión de los niveles lisulnres de azufreIúhil l07

1.5. Determinuvión de los niveles lisulures de sulfa­vianuro JOB

1.6. Conclusiones JOB

1.7. Referencias lll

103

I. INTÜXICACION ORAL CRONICA PUR CIANURO

Teniendo en cuenta que una gran proporción de los pro­blemas toxicológicos ocasionados por el cianuro son debidos alaintoxicación crónica derivada de la dieta, Ja industria y losfactores ambientales (Way, 1984), se consideró de interés e impoglancia estudiar el comportamiento de ratones intoxicados enforma crónica administrando el cianuro por via oral.

’ara evaluar el grado de intoxi‘ación se midieron: Josniveles de cianuro y la actividad de la citocromo oxidasa, quecomo ya se ha señalado es la enzima sobre la cual este tóxico gjerce su acción primaria (Keilin, l928, l966).

Ïambién ya se ha descripto, que en los individuos nor­males existe un pool fisiológico de azufre en el estado correc­to de oxidación para reaccionar con el cianuro (Westley, l973),atribuyéndose a su agotamiento los efectos tóxicos del cianuro(Westley, l980). Ademasde los parámetros indicados se estudióel efecto del cianuro sobre la actividad de la enzima detoxifi­cante del mismo, la rodenasa; se midieron los niveles de sulfgcianuro, producto de detoxificación del cianuro y se investigóla interrelación con el pool de azufre sulfano mediante la de­terminación de azufre lábil en los tejidos analizados.

Los animales se intoxicaron durante 40 dias con cianu­ro de potasio suministrado en el agua de bebida en una concen­tración de l g/ml y se sacrificaron a distintos tiempos.

Las mediciones de los parámetros estudiados se efectuaron en tejido fresco procesado inmediatamente luego de su ex­tracción.

I.l. DETERMINACION DE LOS NIVELES ÏISULARES DE CIANURÜ

En todos los tejidos estudiados, se observó un incre­mento en los niveles de cianuro superiorzu 50 % tp < Ü,Ül) res­pecto de los valores controles (ligura 1.l.) comprobandoseensangre mayor acumulación de este tóxico para periodos prolonga­dos de intoxicación.

l04

300"

Ïo°\

É: jB

á 40‘

días deintoxicacidn

¡IGURAI.l.: Niveles tisulares de cianuro.(I) Hígado, () cerebro, (um) corazón, (El) san­qre.Los valores presentados son el promedio J SD delos datos obtenidos con 4 animales y se expresancomo porcentaje de los controles tomando los valo­res medios correspondientes como l00 %.Valores controles (ug/ml): Hígado: 7,54 i 2,23(n : 7); cerebro: 7,28 t 2,09 (n : 6); corazón5,56 i l,05 (n : 5) y sangre: 0,69 i 0,]2 n : 5)n : número de animales utilizados.Las condiciones experimentales se detallan en Ma­teriales y Métodos y en el texto.

1.2. AClIVIDAD DE CIÏÜCRÜMÜ OXIDASA

La tiqura 1.2. muestra lostectó en todos los casos inhibiciónobservándose

Estadeterminados en los tejidos estudiados.

controles.de cianuroservar queinhibición

Se dede la actividad enzimática,resultados obtenidos.

valores del 50 %hasta (p < 0,05) respecto de losdisminución, es coherente con los altos valores

Se puede ob­en algunos periodos de intoxicación se obtuvo unamenor de la actividad especifica, ésto se debe proba

lÜb

blemente a que la unión del cianuro a la proteína se produce enforma reversible, existiendo entonces disociación del complejocianuro-citocromo oxidasa en presencia de rodenasa y por lo tagto reactivación de la enzima (Isom y col.,l982). Esto está sugi­riendo que probablemente eJ qrado dc inhibición obtenido en loshomoqenatos de Jos tejidos no rcilejaría el real grado de intoxicación ¿H vivo (Ballantyne, l983).

Citocromooxidasa(°/o)

2 4 19 22 26 35di'as de intoxicacio’n

iIGURA1.2.: Actividad específica de citocromo oxidasa en higado (I), cerebro () y corazón ([11]).Los valores presentados son el promedio t SDde Jos datos obtenidos con 4 animales y se 85presan como porcentaje de los controles tomandolos valores medios correspondientes como JÜÜ%.Valores controles: Hígado: 5,58 i 0,57 (n : 6);cerebro: 1,05 1 0,l4 tn : ó) y corazón:65,26 i 6,94 (n : 6).n : número de animales utilizadosLas condiciones experimentales se detallan enMateriales y Métodos y en el texto.

106

Schubert y Brill (1968) también hallaron una disminu­ción de la actividad de citocromo oxidasa proporciona] al contgnido de cianuro en distintos tejidos de conejo, luego de una igyección letal intramuscular de cianuro.

1.3. ACTIVIDAD DE RDDENASA

Para estudiar la posible retención del cianuro en Jostejidos analizados ysu efecto sobre la rodenasa, en todos los cgsos se midió su actividad enzimática en presencia y ausencia deeste compuesto.

La Figura 1.3. A muestra los resultados obtenidos parala rodenasa de higado. Cuando la actividad se midió en presenciade cianuro se observó una disminución hasta alcanzar un minimoa los 24 días de intoxicación, mientras que la determinada en a!sencia de cianuro aumentó en un 50 % (p < 0,05). La diferenciade comportamiento ¿n v¿tno se deberia a la inhibición por sus­trato que exhibe la enzima por incubación en presencia de excesode cianuro (Capítulo VI., item VI.2.), ya detectada para la ro­denasa de otras Fuentes (Vázquez y col., l987).

En cerebro (Figura 1.3. B), la rodenasa medida en pre­sencia de cianuro presentó un aumento (50 %, p < 0,05) en losprimeros dias de intoxicación, alcanzándose Finalmente los valgres controles; la actividad medida en ausencia de cianuro no sufrió modificaciones.

En corazón (Figura I.3.C), la actividad de rodenasa nopresentó variaciones cuando se determinó en presencia de cianuro;las mediciones efectuadas sin cianuro mostraron un aumento del40 % (p < 0,05) en los primeros dias de intoxicación.

La actividad de rodenasa de sangre (iigura 1.3.D) medida en presencia y ausencia de cianuro no reveló cambios significativos.

El primer efecto tóxico del cianuro seria a nivel delaenzima hepática, inhibiéndola significativamente;probablementedebido a una reacción de bloqueo de sitios o a un agotamientodel pool de azufre. Esto no ocurriría en sangre donde la actividad no sufrió variaciones, funcionando a máximavelocidad y evitando, dentro de lo posible, la llegada del tóxico a los teji­dos donde ejercería su efecto letal.

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h/gadoA ’ cerebro “- é B 29 — Ó

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a Ó -2o g 2 aoz- -1. Z}z ; c A;< i < 3

0 l l I O 0 l l l D0 40 0 4020

dl'as de inioxicacio'n dl'as ae mioxicacio‘n

FIGURA1.3.: Actividad especifica de rodenasa medida en presen­cia (C)) y ausencia de cianuro (O ).Los datos graficados son el promedio t SD de Josvalores obtenidos con 4 animales.A: Hígado, valores controles: 2,822t0,88 (n = l2)

y 0,0]23 i 0,0043 (n = 12) en presencia y ausegcia de cianuro respectivamente

B: Cerebro, valores controles: 0,55 i 0,13 (n = 9)y 0,0053 i 0,00l3 (n = ll) en presencia y ausegcia de cianuro respectivamente

C: Corazón, valores controles: 0,52 i 0,l0 (n :l2)y 0,0209 i 0,0024 (n = l3) en presencia y ausegcia de cianuro respectivamente

D: Sangre, valores controles: 0,054 i 0,006 (n :]2)y (5,4 i 0,44) x lܑ (n = l3) en presencia yausencia de cianuro respectivamente

n : número de animales utilizadosLas condiciones experimentales se detallan en Matgriales y Métodos y en el texto.

1.4. DETERMINACION DE LOS NIVELES TISULARES DE AZUERL LABIL

La Figura 1.4.A muestra los valores determinados para

hígado y cerebro. En ambos tejidos se observó un minimo (50 %,

108

P < 0,05) entre Jos días Ja y 24 de intoxicación.

La figura 1.4.B describe Jos resultados hallados paracorazón y sangre . Se detectó una disminución del 60 %(P < 0,01) en eJ contenido de azufre labiJ para corazón, mien­tras que para sangre e] azulre JabiJ aumentó un 40 % (p < 0,01)y permaneció eJevado durante eJ tiempo de intoxi‘ación estudia­do.

I.S. DETERMINACION DE LÜS NIVELES ÏISULARES DE SULFÜCIANURÜ

En hígado, cerebro, corazón y sangre no se observaroncambios significativos en Jos niveJes de suifocianuro determinados. Estos resultados se justificarian en base a Ja rapida ex­creción urinaria de este compuesto, Jo cuaJ impide su acumula­ción en tejidos.

1.6. CONCLUSIONES

- Los altos niveJes de cianuro detectados y Ja disminución de Jaactividad de citocromo oxidasa confirman una intoxicación crgnica por cianuro.

En todos Jos tejidos analizados hubo actividad detectabie derodenasa por incubación en ausencia de cianuro, este hecho señaJa Ja presencia de] tóxico en higado, cerebro, corazón y sangre.

- Hígado: La disminución de Ja actividad de rodenasa se deberíaa] elevado contenido de cianuro en este tejido; este efecto seencontraría acentuado por Ja deficiencia en Jos niveJes de a­zufre JábiJ. La conversión de rodenasa en su forma azufre sustituida de máximaactividad requiereaitosniveles de azufre.AJ reducirse eJ contenido de azufre Jábii se produce una dis­minución en Ja actividad de rodenasa,invirtiéndose esta situación al aumentar Ja concentración de azufre JabiJ.

- Cerebro: Se observó un aumento (50 %) en Ja actividad de rodgnasa en Jos primeros días de intoxicación, indicando que estesistema enzimática funcionaria asi a máximavelocidad produciendoJa detoxificación de] cianuro en este tejido vital.

0,1G 06A

- o 6o L“o .0tu Ó E

<> Ó ¿sd 0,05- -093 —É Éé“ ‘c',’° ‘6E:1 A É

A

O.L I l 0

(Corazón)

Umoles/ml

FIGURA 1.4.:

umoles/ml(Sangre)

EJE]

l

20 40días de intoxi cacio'n

NiveJes tisulares de azufre JábiJ.(O ) Hígado, (¿5) cerebro (EJ) corazón,(<>) sangre.Vajores controJes (umoJes/ml):Hígado: 0,060 i 0,008 ( n = 153; cere­bro: 0,026 Ï 0,009 (n : 16); corazón:0,079 i 0,003 (n : 16); sangre:2,66 i 0,23 (n : JU).Otros detalles experimentales se indi­can en Ja Jeyenda de Ja Piqura 1.3.

109

llÜ

- Corazón: La actividad de rodenasa no sufrió modificacionescuando se la midió en presencia de cianuro, apreciándose encambio ligeras variaciones en los primeros dias de intoxica­ción cuando se midió en ausencia de cianuro. Si bien, Jos niveles de azufre lábil se encuentran apreciablemente disminui­dos, el sistema tiende a restablecer los valores normales deactividad en este órgano Fundamental.

- Sangre: Los altos valores de azufre labil observados seríancoherentes con la existencia en este tejido de rodenasa azu­Fre sustituida, cuya actividad no se ve afectada a pesar delexceso de cianuro detectadoen este tejido. Lsta forma de rodgnasa de máximaactividad seria la responsable del proceso dedetoxificación quese lleva a cabo en el sistema estudiado.

Los resultados obtenidos avalan el rol fundamental dela rodenasa en su forma de máxima actividad en los procesos dedetoxiFicación.

Cagianut y col. (l984) estudiaron los niveles de rodgnasa en biopsias de hígado de pacientes con atrofia óptica deLeber, reportando que esta enzima se hallaba marcadamente disminuida respecto de los controles. Además, midieron cianuro y sulFocianuro en plasma no encontrando variaciones significativascon respecto a los datos de los sujetos normales. Sin embargo,observaron una excreción urinaria disminuida de estos compues­tos, sugiriendo que en estos pacientes la detoxificación del cianuro es subóptima.

I

JJJ

.7. REFERENCIAS

Ballantyne, U. (1983) lund. App]. onico]. 2, 400.Cagianut, 8.; Svhnebli, H.P.; Rhyner, K. & furrer, J. (1984)KJin. Wovhensvhr. gg, 850.lsom, U.E.; Burrous, G.E. & Way, J.L. (¡982) 1oxicoJ. App].Pharmacoj. É2,250.Keilin, D. (1928) Prov. Roy. Soc.Ser. B. ¿93, 206.KeiJin, D. (1966) en Ïhe History of CeJJ Rcspiration andCytochrome, Cambridge: Cambridge Univ. Press. p. 204.Schubert, J. á BriJJ, W.A. (1968) J. Pharmacol. ExpLJ. Ïher.¿ÉZ, 352.Vázquez, E.; Buszeh, A.M.; Wider, E. & Batlle, A.M. de] C.(1987) Int. J. Biovhem. ¿_, 217.Way, J.L. (1984) Am. Rev. PharmncoJ. ÏoxicoJ. gg, 45].WestJey, J. (1973) Adv. EnzymoJ. 22, 327.WestJey, J. (1980) en Enzymatic Basis of Detoxivation. Bio­chemlva] Pharmacology and ToxicoJogy. A series of Monographs.(Ed. W.B. Jakoby). Academic Press. VoJ ll, cap. 13, p. 245.

INÏÜXICACIÜN PUR

II.l.

CAPITULO I I

CIANURÜ VIA SUBCUTANEA

Determinación de la dosis óptimaII.l.l.IIIIII.

II.

II.II.

Determinación del

II.2.l.II.2.2.

.3.2.4.

II.II.

II.

II.II.

.l.

.l.l.

l­ o

2

bum

Niveles tisulares de cianuroActividad de citocromo oxidasaActividad de rodenasaDeterminación de los niveles tisularesde azufre lábilDeterminación de los niveles tisularesde sulfocianuroActividad de ALA-DConclusiones

tiempo de recuperaciónNiveles tisulares de cianuroActividad de citocromo oxidasaActividad de rodenasaDeterminación de los niveles tisularesde azufre JóbilDeterminaciónde losniveles tisularesde sulfocianuroActividad de ALA-DConclusiones

Efecto de la administración periódica de cianuro11.3.].

[1.3.2.II.3.3.

II.3.4.

[1.3.5.11.3.6.

Determinación de los niveles tisularesde cianuroActividad de rodenasaDeterminacióndelos niveles tisularesde azufre lóbilDeterminación de los niveles tisularesde sulfocianuroActividad de ALA"DConclusiones

Referencias

PáginallZ

llZll}114

ll6

ll6ll6ll7

l20

120l2llZl

l22

l22l23l23

l26

l26l26

l28

130

l3013]

l35

II. INTÜXICACIÜN POR CIANURÜ VIA SUBCUTANEA

Con el Fin de estudiar el efecto del cianuro sobre elmetabolismo de los sulfocompuestos y de establecer un parámetroque permitiera, a posteriori, ensayar un antídoto contra estetóxico, se decidió inyertar el cianuro por vía subcutánea endistintas dosis para determinar la dosis optima para la cual seobservaran variaciones signifi‘ativas de los parámetros: actividad de rodenasa y oitocromo oxidasa, y niveles tisulares de cianuro, azufre Jabil y sulfovianuro. Tambiénse investigó el tiempo dc revuperavión necesario para que los parámetros afectados,a la dosis elegida, retornaran a Jos valores controles.

Ademas, considerando que existe un gran número de en­zimas aparte de la vitocromo oxidasa, que son inhibidas poreste tóxico (Solomonson, l982) como por ejemplo aquellas que igvoluvran la formación de intermediarios base de Schiff, resultóde interés medir enhígado y sangre la actividad de ALA-D,enzima sulfhidrilica que interviene en el camino biosintético delhemo(Batlle y col., l98l). Existe una estrecha interrelaciónentre este camino metabólico y el de los sulfocompuestos (Widerde Xifra y col., l976). Ll cianuro afecta directamente este úl­timo metabolismo ya sea a través de su reacción con rodenasa odebido al agotamiento delPUUJde azufre utilizado para su deto­xificavión. Por lo tanto, a través de una posible acción delcianuro sobre el ALA-D,se podria evaluar la acción de este tó­xico sobre la biosIntesis de los tetrapirroles.

II.l. DETERMINACION DL LA DOSIS OPTIMA

Con el objeto de seleccionar una concentración que produjera variaciones significativas sobre los parámetros estudia­dos, se inyectaron los animales con las siguientes dosis no le­tales de cianuro de potasio, l, 2, 3, a y 5 mg/kg vía s.c. y sesacrificaron después de 2 horas.

II.l.l. Niveles tisulares de cianuro

Ln hígado y cerebro no se encontraron variaciones sig­

ll}

niFicativas en los niveles de cianuro respecto de los animalescontroles. En corazón, los valores de cianuro estaban un 45 %(p < 0,05) aumentados respecto del valor control cuando Jos ra­tones se intoxicaron con dosis entre 2-4 mg/kq. Los niveles sagquineos se encontraban notablemente incrementados (mayor del50 %, p < 0,0l) para todas las dosis ensayadas ttiqura II.l.).

[CNÜBG)

[CN‘J (mg/kg)

¡IGURAII.l.: Niveles tisulares de cianu­ro.(I) Hígado,() cerebro,(HD) corazón, (EJ) sangreLos valores presentados sonel promedio 1 SD de los datos obtenidos con 4 ani­males y se expresan comoporcentaje de los controlestomando los valores medioscorrespondientes como l00 %.Valores controles (ug/ml):Hígado: 7,54 i 2,23 (n : 7);cerebro: 7,28 i 2,09 (n 'corazón: 5,56 i l,05 (nsangre: 0,69 i 0,l2 (n : 5)n : número de animales utilizadosLas condiciones experimentales se detallan en Materia­les y Métodos y en el texto.

II.l.2. Actividad de citocromo oxidasa

La actividad de citocromo oxidasa se encontró inhibidaen función de la concentración de cianuro en hígado y corazón,

JJ4

pero no se detectó ninguna variación en cerebro (labla 11.1.)

TABLAIl.l.: Actividad de citocromoOxidasa

DOSIS DL % lNHIHIClUN

CIANURÜ Hígado Cerebro Corazón

2 mg/kg 5l 1 5 2,0 1 0,3 39 t 4

4 mg/kg 66 i 6 2,0 i 0,3 42 i S

Los valores presentados son el prome­dio 1 SD de Jos datos obtenidos con4 animales v se expresan como por­centaje de disminución de la activi­dad especifica respecto de Jos controles tomando los valores medios corregpendientes como 0 % de inhibición.Valores controles: Hígado: 5,38 i 0,57(n : 6); cerebro: l,05 1 0,l4 (n : 6);corazón: 65,26 1 6,94 (n = 6)n : número de animales utilizados.Las condiciones experimentales se de­tallan en Materiales y Métodos y enel texto.

OILa actividad enzimática se encontró un 66 m (p < 0,0l)disminuida en higado y un 42 % (P < 0,05) en corazón cuando ladosis fue de 4 mq/kg.

II.J.3. Actividad de rodenasa

En higado (liqura ll.2.A) se observó una disminuciónsignificativa de la actividad de rodenasa (57 %, p < 0,01) para¡Mundosisde 4 mq/kg de cianuro , cuando se midió enpresencia decianuro. En cambio la actividad enzimática determinada en ausegcia de cianuro en el sistema de incubación aumentó un 67 %tp < 0,01) para bajas concentraciones del tóxico, mientras quepara una dosis de 4 mg/kg se observó una disminución similar a

115

1a obtenida cuando 1a actividad se midió adicionando cianuro(66 %, p < 0,01).

hígado 0,5 cerebroB

O b l l8O

Actividadespecífica(0) ActividadeSchI'fíca(O)

p NI;f/[

o.8

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Actividadespecifica(0)

..Nw

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Actmdadespecificax0’(l)

0 D O L l l l 1 1 0

l 0,100,5 wrazon sangre

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E g E Ó——-—t————t————o////*"'/. g.._ ,2 - ‘0 4- ..¿o Ó ¿ 45€ e 5 ET; 'S Ü ';< g: q .5

U U4 <

0 l l L i l n JO O l l l l l J 00 1 2 3 4 5 0 2 3 5

[CN'J (mg/ kg) [CN'] (mg/ kg!

FIGURA11.2.: Actividad especifica de rodenasa medida en presencia (O) y ausencia de cianuro (O ). _Los datos graficados son eJ promedio i SD de Josvaiores obtenidos con 4 animajes.A: Hígado, valores controies: 2,82 i 0,88 (n = 12)

y 0,0123 i 0,0043 (n : 12) en presencia y au­sencia de cianuro respectivamente.

B: Cerebro, vaJores controJes: 0,55 i 0,13 (n : 9)y 0,0053 1 0,0012 (n : 11) en presencia y au­sencia de cianuro respectivamente.

C: Corazón, vaiores controles: 0,52 i 0,10 (n :12)y 0,0209 i 0,0024 (n : 12) en presencia y au­sencia de cianuro.

D: Sangre, valores cont oJes: 0,054 i 0,006 (n : 12)y (5,4 t 0,44) x 10’ (n : 13 en presencia yausencia de cianuro

n : número de animaJes utilizadosLas condiciones experimentales se detaiian en Matgriaies y Métodos y en ei texto.

’ara cerebro (iiqura 11.2.8) se detectó una disminuciónde Ja actividad enzimática dei 50 % y 35 % (p < 0,05) (dosis :4 mg/kg) cuando se incubó en presencia o en ausencia de cianurorespectivamente.

116

En corazón (figura II.2.C) se obtuvo una disminucióndel 55 % (P < 0,05) y 75 % (p < 0,01) para una dosis de cianurode 5 mg/kg cuando la actividad se midió en presencia o ausenciade cianuro respectivamente.

ta actividad de la enzima cn tejido sanguíneo (liquraII.2.D)-medida en presencia de cianuro aumentó un 3] %(p < 0,05)en Jos animales intoxicados, pero cuando se determinó en ausen­cia de cianuro el incremento fue del 22 % (p < 0,05) para unadosis de 5 mg/kg).

El aumento de actividad de rodenasa en sangre explica­ria la acción primaria detoxificante gue ejerceria esta enzimaimpidiendo la llegada del tóxico a los tejidos en los cualesprovoca el daño. Sin embargo no todo el cianuro es detoxificadopor esta via, ya que se pudo observar que existe una notable digminución en la actividad de rodenasa de cerebro y corazón enFunción de la dosis y también en hígado, cuando se emplean al­tas dosis de cianuro.

II.l.4. Determinaciónde los niveles tisulares de azufre lábil

La ligura 11.3. muestra los niveles de azufre labil enlos tejidos estudiados. En higado (figura II.3.A) se observó unnotable aumento (llS % p <<0,Ül) para bajas dosis de cianuroy luego una rápida disminución a altas dosis (43 %, p < 0,05).En cerebro (liqura II.3.A) y corazón (liqura II.3.B) no se ob­servaron variaciones significativas. En sangre (Figura 11.3.8)se detectó un incremento del 33 % (p < 0,05) en el contenido deazufre lábil de los animales intoxicados.

[1.].5. Determinación de los niveles tisulares de sulfocianuro

Se observó una marcada disminución en el contenido desulfocianuro en higado (44 %, p < 0,05), ccrebro(77 %, p < 0,05)y corazón (92 %, p < 0,05) mientras que en sangre no se detectaron variaciones significativas en los valores de sulfocianuroen Función de la dosis de cianuro (ligura 11.4.).

II.l.6. Actividad de ALA-D

No se observaron cambios significacivos en la activi­dad de la enzima hepática (figura ll.5.A). En sangre

JJ7

(Fiqura 11.5.8) la actividad enzimática disminuyó un 30 %(p < 0,l) para todas las dosis ensayadas, debido a un efecto inhibitorio directo del cianuro sobre la reacción catalizada poresta enzima.

A B0,2 02- lo

'53, a

f Ó 8 9— —3_

gm- ;m- 3._. o 3O A Ü

g 4_ É Ü-*«—u—m«...m___n____ _2gc .... Ü ú “a0| 1 u 1 1 L O__l 1 1 l 1 ¡O

0 4 5 O 3 4 5 .2 3 2

[CNÚ (mg/kg [CNfl (mg/km

azufre Jábil.([]) corazón,

Niveles tisulares de(O ) Hígado, (Ax) cerebro,gre.Los valores graficados son el

FIGURA 11.3.:(<>) san

promedio 1 SD delos datos obtenidos con a animales.Valores controles (umol/ml): Higado:0,060 i 0,008(n : 15); cerebro: 0,026 i 0,009 (n : 16); cora­zón: 0,079 i 0,003 (n : l6); sangre: 2,66 i 0,23(n = JU)n : número de animales utilizadosLas condiciones experimentales se detallan en Materiales y Métodos y en el texto

II.l.7. Conclusiones

Hígado: Se observó una disminución significativa de la activilas cualesse

Endad de rodenasa para dosis altas de cianuro paradetectó una brusca caida en el contenido de azufre lábil.estas condiciones la detoxificación de cianuro se encontraríaimpedida lo que justificaria los bajos niveles hallados de suifocianuro en este tejido. La actividad de ALA-Dno varió enfunción de la dosis de cianuro respect0(hn valor control, és­to se explica en base a la ausencia de cianuro tisular en losanimales intoxicados.

- Cerebro y corazón: La actividad de rodenasa se encontró dismi

_______%

nuida alredeciones signicenso en elmenor activira transformFocianuro tibil ya que e

ll8

dor del 50

ficativas para% y 35 % respectivamente, sin modifica

y con un marcado des­La

azufre lábilcontenido de sulfocianuro para ambos tejidos.dad de rodenasa explicaría su baja eficiencia pa­ar el cianuro, disminuyendo asi los niveles de sulsulares y no variando el contenido de azufre lá­ste compuesto no es utilizado.

goce A 0,10 ams

Ó8" 3 Q“ '“'“Q”“"<>”'""”‘"Ó (7,5 “ —Q¡0‘“

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o 1 2 3 4 5 o 1 3 4 5[CN']

FIGURA 11.4.:

(mg/kg) [CN'J (mg/kg)

sulfocianuro.(EJ) corazón,

Niveles tisulares de(O ) Hígado, (¿5) cerebro,tire

(Ó) san

Los valores graficados son el promedio i SD delos datos obtenidos con 4 animales.Valores controles (“moles/ml): Hígado:0,047 i 0,008 (n : 10); cerebro: 0,035 i 0,0]0(n = ll); corazón: 0,05l i 0,0]9 (n : 9);sangre: 0,]12 o 0,009 (n : 12)

— Sangre: La aeste tejidocoherente cola enzima encrementadosda en este tlos niveles

n número de animales utilizadosLas condiciones experimentales se detallan en Ma­teriales y Métodos y en el texto.

de azufre lábilense encontraron aumentados en un 30ctividad de rodenasa y el nivel

%, lo cual esn la acción detoxiFicante primaria que ejerceriaeste tejido en donde se hallaron niveles muyin­

de cianuro. La actividad disminuida de ALA-Dhallaejido también está de acuerdo con el aumento detisulares de cianuro registrados.

ll9

‘NC40 .higado A sangre B

m m.8 g4 9 ¿[-4 \)_______ __ ,.320- 4) fito_ 4)ufi 5.2 E

2 É

(l _ l 1 l l l L O _ | 1 1 A 1 1

l 2 3 4 5 0 2 3 5

[CN'J (mg/kg) [CN'] (mg/kg)

FIGURA11.5.: Actividad especifica de ALA-Den híqado (A) y sangre (B).Los valores graficados son el promedio SD delos datos obtenidos von 4 animales.Valores controles: Hígado: 21,96 i 5,23 (n = l7);sangre: l,58 t 0,33 (n = l4)n : número de animales utilizadosLas condiciones experimentales se detallan en Ma­teriales y Métodos y en el texto.

En base a estos datos se seleccionó la dosis de 4 mgkgde cianuro como la óptima inyectable por via subcutanea, ya quepara esta concentración se encontraron lasvariaciones más impogtantes en los parámetros estudiados.

También, PetterSen y Cohen (1985) hallaron en ratonesuna máxima inhibiciónde la citocromo oxidasadc cerebro (40 %) ycorazón (60 %) para una dosis de 4 mq/kq administrada por viasubcutúnea.

120

II.2. DEJERMINACIÜN DEL TIEMPO DE RECUPERACION

Se realizó un estudio para determinar eJ tiempo que debía transcurrir para que Jos parámetros afectados, Juego de laadministración subcutánea de una única dosis de cianuro de4 mg/kg, llegaran nuevamente a Jos niveles controles. ’ara ellolos animales se inyectaron con cianuro de potasio a la dosismencionada y se sacrificaron a las 2, 24, 48, 72 y 96 horas subsiguientes.

II.2.J. Niveles tisulares de cianuro

Ln la Figura 11.6.puedcn observarse Jos porcentajes decianuro medidos en los distintos tejidos luego de transcurridosdiferentes intervalos después de la intoxicación. Dentro del pgriodo seleccionado, en higado y cerebro no se observaron variaciones significativas en los niveles de cianuro respecto del control. En corazón y sangre Jos niveles aumentados de cianuro de­tectados Juego de 2 horas de la intoxicación (45 %, p < 0,05 ymás del 50 %, p < 0,0], respectivamente) se mantuvieron duran­te todo el periodo estudiado.

200"­

N6)

[CN’]

__ y-_—­

96tiempo (horas)

JJGURAI[.6.: Niveles tisulares de cianuro.(I) Higado,t) cerebro,(En) corazón, ([3) sangreLos detalles experimentales yvalores controles se indicanen la leyenda de la Figura II.J.

121

11.2.2. Actividad de citocromo oxidasa

En Ja Figura II.7. se comprueba que Ja citocromo oxidasa hepática recupera e] vaJor de Ja actividad contro] a ias 24horas posteriores a 1a intoxicación mientras que Ja enzima de corazón Jo hace a Jas 72 horas.

(WH

200­

——--q

Actividadespecífica

2 ’ 22. 72

tiempo (horas)

tIGURA11.7.: Actividad decitocromo oxidasa.(I) Hígado,() cerebro,(ED) corazónLos detaJJes eiperimentaJes yvalores contrgies se indicanen Ja Jeyendade Ja iabJa 11.].

II.2.3. Actividad de rodenasa

En higado, cerebro y corazón (tiqura II.8.A, B y C) secomprobó que Juego de una taida inicia] en Ja actividad de Jíleflzima, los valores controles dc actividad de rodenasa medida enpresencia y ausencia de cianuro se recuperan transcurridos 4dias después de Ja intoxi‘ación.

’ara sangre (tiqura I[.8.D) Jos vaJores de actividadmedidos con cianuro se mantienen eJevados durante todo eJ perído estudiado (38 %,p < 0,05, aJ 4to. dia) mientras que Ja actividad sin cianuro no sufre modificaciones

122

qu , y

ñ ¿K n/gaao A cerebro Bo A r­; e 9 0,6 E.2 "¿a w "ó

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tiempo (horas) trompo (horas)

¡IGURA11.8.: Actividad específica de rodenasa en hígado (A),cerebro (B), corazón (C) y sangre (D), medidaen presencia y ausencia de cianuro.Los detaJJes experimentajes yvaiores controlesse indican en Ja Jeyenda de Ja Figura 11.2.

11.2.4. Determinación de Jos niveJes tiquares de azufre JábiJ

En higado (fiqura II.9.A) Juego de] marcado descenso enejcontenidode azufre iábiJ, éste recuperó su vaJor norma] a Jos4 días. V

En cerebro (Fiqura II.9.A) y corazón (fiqura 11.9.8) nose observaron variaciones significativas, mientras que en sangre(fiqura 11.9.8) Jos vaiores se mantuvieron elevados durante to­do eJ periodo analizado.

11.2.5. Determinación de Jos niveles tisulares de qufocianuro

Ln higado (fiqura II.JO.A) y corazón (figura II;JO.B)

123

se observó que Juego de la disminución ocurrida a las 2 horas deJa intoxicación se tiendo a restaurar eJ vaior control aJ 4to.dia. En cerebro (Liflyra ll.lU.A3 no parece haber recuperaciónmanteniéndose los valores disminuidos aún después de 96 horas deJa intoxicación. Ln sanqrc no ae dctcrtaran variaciones siqnifi:ativas ni a tiempos cortos tttcm ll.J.b.i ni para periodos prolonqados (liqura ll.lU.H).

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(l l l ' l 1 l 0_i ,. l l l i O2 ‘ 24 48 72 96 o 7' l 21. 1.a 72 96

hompo (horas) tiempo (hdrag

lIGURA11.9.: Niveles tisulares de azufre lábil.(O ) Hígado, (A.) cerebro, (EJ) corazón, (<>) sangre.os detalles experimentales y valores controles

se indican en Ja leyenda de Ja Fiqura 11.3.

ll.2.6. Actividad de ALA-D

La enzima de higado sufre una marcada disminución hastaalcanzar un 50 % (P < 0,05) del valor control a las 72 horas posteriores a la intoxicación, para luego recuperar su nivel nor­mal a los 4 dias (liqura II.JJ.A). La enzima de sangre presentaun comportamiento similar aunque la actividad minima se detectóa Jas 48 horas (58 %, p < 0,01) y a partir de ese momento se prgdujo su recuperación hasta llegar al valor control (liqura[[.JJ.B).

11.2.7. Conclusiones

—En todos los tejidos en los cuales se observaron variacionessiqnificativas de los parámetros estudiados se comprobóque

l24

cuando se aplica una dosis subcutánea de cianuro de potasio de4 mQ/qu lueqo de 4 dias tiene lunar una recuperación de losmismoshasta Jos valores controles.

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o ' 21. ¿e 72 96 o 2 " 21. ¿e 72 96üempo (horas) tiempo (heram

¡IGURAII.lÜ.: Niveles tisulares de sulfocianuro.(O) Hígado, (A)gre.Los detalles experimentales y valores controlesse indican en la leyenda de la liqura 11.4.

hr’gaao A sangre B30 2)­

I‘U

«o uE L:t . bU c, o520- 5% oo o oTJ U 1 _

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tiempo (horas) tiempo (horas)

¡IGURAII.ll.: Actividad especifica de ALA-Den higado (A) ysangre (B).Los detalles experimentales y valores controlesse indican en la leyenda de la iiqura [1.5.

(S)

umoMs/ml

cerebro, (CJ) corazón, (<>) san

125

En

rodenasa disminuyó notablemente como consecuencia de la into­higado, cerebro y corazón se comprobó que la actividad de

xicación, para luego recuperar sus niveles basales; en cambioen sangre tanto la actividad enzimática como los niveles de azufre lábil se mantuvieron elevados durante todo el período estudiado. Estos resultados está“ marcando que el incremen­to en la actividad de rodenasa y contenido de azufre lábil ensangre actuarian comoun metanismo detoxificante del cianuropara evitar o por lo menos retardar la llegada de este compuegto a los tejidos en los cuales su acción tóxica es más drástica o letal.

La actividad de AlA-D se inhibió un 50 % tanto en higado comoen sangre, lo cual podria atribuirse a una acción directa delcianuro sobre la reaccióngo indirecta comoconsecuencia delagotamiento del pool de azufre sulfano.

126

[1.3. EFECTO DE LA ADMINISTRACION PERIODICA DE CIANURÜ

Con el objeto de estudiar la acción queproduciría so­bre distintos metabolismos el cianuro mantenido en un determinado nivel por un periodo prolongado, se decidió aplicar la dosisóptima elegida (a mg/kq, via s.c.) suministrada cada 3 dias, osea antes de que se produjera la recuperación de los parámetrosestudiados a los valores controles.

Se conoce el rol fundamental ejercido por la SAMcomoagente transulfurante (Kim, l977). El proceso de transulfura­ción de esta molécula llevaria a Ja formación de cisteina y me­diante la acción de la mercaptopiruvato sulfotransferasa produ­ciria un aumento del pool de azufre sulfano. De esta forma, elaumento de azufre podria influir sobre la Función de rodenasacomodetoxificante del cianuro. En base a esta hipótesis se ad­ministró una dosis diaria de SAM(JS mq/kq, via s.c ) durante30 dias tanto a animales controles comoa los intoxicados.

11.3.]. Determinación de los niveles tisulares de cianuro

En higado, cerebro y corazón no se observaron variacignes significativas en los niveles de cianuro durante el períodoestudiado.

En sangre (tiqura II.l2.) puede observarse que los ni­veles de cianuro se encuentran muy incrementados en los anima­les intoxicados alcanzándose valores mayores del lOO %(p < 0,01). Es de destacar que no se trata de acumulación sinoque se logra mantener la concentraciónde cianuro en valores elgvados durante todo el periodo.

En los animales intoxicados y tratados con SAMel nivelde cianuro hallado en tejido sanguíneo coincidió con elde losanimales intoxicados.

[1.3.2. Actividad de rodenasa

La tiqura [1.13. muestra los resultados obtenidos paraJa rodenasa de higado. Cuando la actividad se midió en presenciade cianuro se observó una disminución del 60 % tp < 0,05) y del42 % (P < 0,05) tanto para los animales intoxicados y tratados

l27

con SAMcomo para Jos que recibieron solamente SAM(FiquraII.J3.A). La actividad determinada en ausencia de cianuro no suFrió modificación en ninguno de los casos (liqura II.l3.B).

200- FL

150­(9G)

[CNÜ

100--- - - - -.----1_.___

4 1o 1'6 23 30tiempo (dn‘as)

tIGURA11.12.: Niveles de cianuro en tejido saiguíneo.Los detalles expgrimentales y elvalor control seindican enla Fiqu­

En cerebro (liqura II.lü.), la actividad de rodenasa me­dida en presencia de cianuro disminuyó más del 55 % (P < 0,05)a los 30 dias de intoxicación para Jos 3 grupos estudiados. Cuagdo la enzima se midió en ausencia de cianuro no presentó dife­rencias respecto del control para Jos animales intoxicados miegtras que en los casos que recibieron SAMse obtuvo un aumentodel 60 % (p < 0,0l) a los 50 dias.

En corazón (tiqura I[.lb.), la actividad enzimática mgdida en presencia de cianuro no sufrió modificación en ningu­no de los casos analizados mientras que cuando se midió en au­sencia de cianuro se obtuvo siempre un aumento mayor del 50 %(p < 0,05).

J28

A B

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O l 1 l l 0 L7 l 1 lO 10 20 30 O 10 20 30

tiempo (días) tiempo (dl'as)

tIGURAII.J3.: Actividad especifica de rodenasa hepática en Función deJ tiempo de intoxicación, medida en pre:sencia (A) o ausencia (B) de cianuro.'Los animales se intoxicaron ‘ada 3 dias con cia­nuro de potasio (4 mg/kq, s.c.) (O ) y se trata­ron con una dosis diaria de SAM(JS mg/kg, 8.0.)(O ). Un Jotc de animaJes recibió soJamenteSAM (At).Los datos qraficados son eJ promedio de Jos vaJores obtenidos con 4 animaJes. Los SD no se iJusÏtran.VaJores controJes (CJ): 2,82 1 0,88 (n : J2) y0,0J23 i 0,0043 (n : JZ) en presencia y ausenciade cianuro respectivamente.n : número de animaJes utiJizadosLas condiciones experimentaies se detaJJan en MateriaJes y Métodos y en eJ texto. —

No se produjeron diferencias significativas con Ja en­zima sanguínea en ninguno de Jos casos estudiados (¡inura II.J6.).

11.3.3. Determinación de Jos niveJes tisulares dc azufre JabiJ

En higado (Ligura lJ.J7.A), tanto en Jos animaJes intgxirados con cianuro como en Jos que recibieron SAM,se detectóun pico en Jos niveJes de azufre JábiJ. Sin embargo en eJ casode Jos animaJes intoxicados y tratados con SAM,eJ aumento deJcontenido de azufre JábiJ (J32 %, p < 0,0J) se mantiene hastaJos 23 dias de intoxicación produciéndose Juego un descenso

Actividadespecífica

brusco

]29

hasta volver al valor control a Jos 30 dias.

12

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(UU e­UCJ

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0 l 1 n l 0 L l 1 l

o 1Q 20 30 o 1o 20 30tiempo (días) tiempo (días)

f IGLJRAII..14.:

en estudio presentaron niveles de(p < 0,01).80 %

sentarondel 80tender

tró undiado.

Actividad especifica de rodenasa en cerebro enfunción del tiempo de intoxicación, medida en presencia (A) o ausencia (B) de cianuro.Los animales se intoxicaron cada 3 dias con cia­nuro de potasio (4 mg/kg, s.c.) (O ) y se trata­ron con una dosis diaria de SAM(15 mg/kg, s.c{)(O ). Un lote de animales recibió solamenteSAM (Ax).Valores controles ([1): 0,55 Í 0,13 (n : 9) y0,0053 i 0,0013 (n = ll) en presencia y ausenciade cianuro respectivamente.Otros detalles experimentales seindican en la lgyenda de la ligura [1.13.

[.17.Ü), los 3azufre labil

Ln cerebro (Figura grupos de animalesaumentados en un

En corazón (ligura II.17.C), los 3 grupos tratados precontenido tisular de azufre lábil mayor

dia deun pico en el

% 09 < 0,01) hasta el 10m0. intoxicacióngnunaluegoa normajizarse.

Ln sangre (figura lI.l7.D), en todos los casos se enconaumento del 58 % (p < 0,01) durante todo el periodo estu­

130

A B

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O_l 1 l a O_| l l nO 10 20 30 O 10 20 30

tiempo (días) tiempo (días)

tIGURAI[.l5.: Actividad especifica derodenasa en corazón enfunción del tiempo de intoxicación, medida enpresencia (A) o ausencia (B) de cianuro.Los animales se intoxicaron cada 3 dias con cianuro de potasio (4 mg/kg, S.C.) (O ) y se tra­taron con una dosis diaria de SAM(l5 mg/kq,s.c.)(O ). Un lote de animales recibió solamenteSAM (A ).Valores controles (EJ): 0,52 t 0,l0 (n : 12) y0,0209 t 0,0024 (n : l3) en presencia y ausenciade cianuro respectivamente.Otros detalles experimentales se indican en laleyenda de la Fiqura 11.13.

11.3.4. Determinación de los niveles tisulares de sulfocianuro

Nohubo variaciones significativas en los niveles desulfocianuro en ninguno de los tejidos estudiados ni por efectodel cianuro ni del SAM.

[1.3.5. Actividad de ALA-D

La actividad enzimática disminuyó un 55 % (p < 0,05)onhigado (Figura II.l8.A) y un 42 % (p < 0,05) en sangre (FiuuraLI.l8.B) cuando los animales fueron intoxicados con cianuro. Lnlos animales que recibieron cianuro y SAM la actividad enzimá­tiva también disminuyó (aproximadamente 35%, p < 0.05) en ambos

tejidos. Los animales tratados sólo con SAM

131

no presentaron va­riaciones significativas enla actividad dc ALA-D.

¡AIGURAII.l6.:

Estos datos nuevamente

010 10l A M Bo

.8 4: g:: ruU A .5.) go o e. 9 OCL *- _____O__ _ O Ag [ze-¿“8" ———«"8 g [FAA 5 a" 0""­6 o 3U ono 5_30,05- gí; .9 ,< v .3 A

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OcL, l l n < O_L_, 1 1 lo 1o 20 30 o 1o zo 3o

tIempo (días) tiempo ('dl'as)

Actividad especifica de rodenasa en teiido san­uuineo en función del tiempo de intoxicación, medida en presencia (A) o ausencia (B) de cianuro.Los animales se intoxicaron cada 3 dias con cia­nuro de potasio (4 mg/kg. 8.o.) (O ) y se trata­ron con unadosisdiaria de SAM(15 mg/kga 8.o.)(O ). Un lote de animales recibió solamenteSAM(A).Valores controles SCJ): 0,054 Í 0,006 (n : l2) y(5.4 t 0.44) x |0- (n : ¡3) en presencia y au­sencia de cianuro.Otros detalles experimentales se indican en laleyenda de la liqura II.l3.

corroboran la acción inhibitoriadel cianuro sobre las enzimas cuyos mecanismos de reacción invoJucran intermediarios base de Schiff (Solomonson, l982). Ademásse ha confirmado que la administración s.c.actividad de ALA-D¿n vivo (Paredes,

11.3.6.

- Hígado: LJ cianuro,

de SAMno afecta lal986).

Conclusiones

SAMo ambos compueStos produjeron una marcada disminución en la actividad de rodenasa en este tejido apesar del90,ciones.cianuro en este tejido,cadamente disminuida por efecto del

aumento en el contenido de azufre lábil. Sin embar­los niveles tisulares de sulfocianuro no sufrieron varia­

Aunqueno se detectaron cantidades significativas dela actividad de ALA—Dse encontró mar

tóxico. La SAMno modifi­

modificó la

l52

acción del cianuro sobre la actividad de rodenanani de ALA-D, en consecuencia no se la puede emplear como antídoto.

h/yado A cerebro BQOBF

d -#QOB— .

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0 L l l 1 O L, l J 1O 10 20 30 0 10 70 30

hempo(düs) Uempo(dhs)

¡IGURAII.J7.: Niveles tisulares de azufre labil.(A) Hígado, (B) cerebro, (C) corazón, (D) sangreLos animales se intoxicaron cada 3 dias con cia—nuro de potasio (4 mg/kg, 8.o.) (O ) y se trataroncon una dosis diaria de SAM(JS mg/kg, 8.o.) ( ).Un lote de animales recibió solamente SAM(Al).Los datos grafieados son el promedio de Jos valgres obtenidos con 4 animales. Los SD no se ilustran.Valores controles (CJ): Hígado: 0,060 i 0,008(n : 15); cerebro: 0,026 i 0,009 (n : l6); cora­zón: 0,079 t 0,003 (n : ló); sangre: 2,66 t 0,23(n = JÜ). n : número de animales utilizados.Las oondiviones experimentales se detallan en Mgteriales y Métodos y en el texto.

133

w C) haOhígado A sangre B

Actnvndadespecífica

a I

Actividadespecífica

8l O

1 l l O_L44, l l lO _10 '20 30 O 10 20 30

tiempo (dias) tiempo (días)

LLGURA11.18.: Actividad específica de ALA-Den hígado (A) ysangre (B).Los animales se intoxicaron cada 3 dias con cia­nuro de potasio (4 mg/kg, s.c.) (O ) y se trataron con una dosis diaria de SAM(lb mq/kg, 5.o.)(O ). Un lote de animales recibió solamenteSAM(A).Los datos graficados son el promedio de los valgres obtenidos con 4 animales. Los SD no se ilus­tran.Valores controles (CJ): Hígado: 2l,96 3 5,23(n = l7); sangre: l,58 t 0,33 (n : la)n : número de animales utilizadosLas condiciones experimentales se detallan en Materiales y Métodos y en el texto.

- Cerebro: También en este tejido, la actividad de rodenasa seencontró muy disminuida a pesar del notable aumento en el contenido de azufre lábil.

—Corazón: La actividad de rodenasa no sufrió modificacionesni cuando se detectaron niveles elevados de azufre labil nicuando se mantuvo en el valor control.

—Sangre: Si bien la actividad de rodenasa no se encontró modi­Ficada en ningún caso, los niveles de azufre Jábil se mantu­vieron muy elevados durante todo el período estudiado. En es­te tejido,los niveles de cianuro se hallaron significativamente incrementados y, como era de esperar, la actividad de ALA-Dmuy disminuida.

13a

Es importante observar que la presencia de cianuro a­o indirectamente tanto el metabolismo de los sul­

Si bien, no siempretecta directafocompuestos comoel de Jos tetrapirroles.pudo medirse el cianuro tisular, la actividad de rodenasa podriaverse o no afectada, pero en última instancia el contenido de azuFre lábil siempre se encontró alterado. Un aumento significa­tivo del pool de azufre podria originarse comoconsecuencia deuna actividad de rodenasa disminuida para que el nivel de cianuro no aumente en el tejido donde produciría anoxia histotóxica.A pesar de noregistrarseniveles elevados de cianuro en higado,

hizo evidente sobre la actividad de ALA-D;en san­con su efecto sobre

su acción segre el incremento de cianuro se correlacionóel ALA-D.

La SAMno sólo no ha funcionado como antídoto, por cuanto no ha logrado contrarrestar Jos efectos del cianuro, sino queademás , ocasionó alteraciones importantes sobre los parámetrosestudiados. Lste hecho podría deberse a Ja acción de esta molÉcula sobre el pool de azufre o bien sobre las enzimas del meta­bolismo de sulfocompuestos, debido a los

acción transulfurante sobre los metabolitos que dichas enzi­cambios resultantes de

SU

mas usan como sustrato.

135

¡[.4. REFERENCIAS

Batlle, A.M. del C.; Magnin, P.H. & Wider, E. (198]) en Por­Firinas y Porfirias. Etiopatogenia, Clínica y Iratamiento(Ed. eudeba), cap. III, p. 3].Kim, S. (1977) en Ïhe Biochemistry of Adenosylmethionine (Eds.F. Salvatore, E. Borek, V. Zappin, H.G. William-Ashman y F.SchJenk), Columbia University Press.

- Paredes, S. (1986) 1esis Dovtorn], UBA.- Pettersen, J.C. ó Cohen, S.D. (1985) Ïoxicol. App]. Pharmaco].

g¿. 265.Solomonson, L.P. (1982) en Cyanide in Biology (tds. B.VennesJand, L.L. Conn, C.Y. Knowles, J. WestJey y F. Wissing)Academic Presu,London. p.JJ.

- Wider de Xifrn, L.A.; Sandy, J.D.; Davies, R. ü Neuberger, A.(1976) PhiJ.Ïrans. R. Soc. Lond. B. 212, 79.

INTÜXICACIÜN AGUDA

III.l.

III.2.

111.3.

111.4.

lll.5.

Ill.

III.

6.

CAPITULO III

POR CIANURÜ

Actividad de oitooromo oxidasa

III.J.J. Animales no intoxivadosIII.J.Z. Animales intoxivados

Actividad de rodenasa

[11.2.]. Animales no intoxiradosIII.2.2. Animalesintoxicados

III.2.2.l.III.2.2.2.

4 mq/kq

2t] un;/k(]

Dosis de cianuro:Dosis de cianuro:

Niveles sanquineos de azufre lábil[11.3.]. Animales no intoxicados111.3.2. Animales intoxicados

III.3.2.l.III.3.2.2.

Dosis decianuro: 4 mq/kqDosis de rianuro: 20 mq/ku

Niveles de sulfooianuro

[11.4.]. Ln plasmaIII.4.J.l. Animalesno intoxivadosIII.4.l.2. AnimalesintoxivadosIII.4.l.2l. Dosis de vianuro: a mq/kgIII.4.l.22. Dosis de vianuro: 20 mg/kg

III.4.2. En orinaIII.4.2.l. Animalesno intoxivadosIII.4.2.2.III.4.2.2J.III.4.2.22.

inloxivados4 mq/kg20 mg/kg

AnimalesDosis de cianuro:Dosis de vianuro:

Avtividad de ALA-DIII.S.l. Animales no intoxicadosIII.5.2. Animales inloxivados

Il[.5.2.l. Dosis de vianuru: ú/mg/kqIII.5.2.2. Dosis de vianuro: 20 mq/kq

Conolusiones

Referencias

Página

l37

l37l37

l37

l37l4llúlla}

l45

l45146l46l46

l49

149

149l50150l50l52l52l52l52153

155l55l55JSSl56

l58

l59

J36

III. INTÜXICACIÜN AGUDA POR CIANURO

Ln la mayoría de los trabajos publicados hasta el mo­mento sobre los efectos del cianuro, se suministra esta droga alos animales en una única dosis letal o subletal, de manera queconfiguran un modelo de intoxicación aguda (Burrows y coJ.,J973; Isom y col., l982; Pettcrsen y Cohen,J985).

Se decidió entonces estudiar el efecto de una intoxicación aguda por cianuro suministrado via intraperitoneal en 2 dosis diferentes: una no letal (4 mg/kg) y unn letal (20 mg/kg),y Ja acción de Ja SAMsuministrada sola o en combinación con elconocido antídoto del cianuro, el tiosulfato de sodio, sobre laactividad de las enzimas rodenasa, ALA-Dy citocromo oxidasa.Se seleccionó Ja dosis deú mg/kg en base a los resultados obte­nidos previamente (Capitulo II, Item II.J.>. La dosis de 20 mg/kg

se eligió ya que se encuentra por debajo de Ja Dtsn en ratonespretratados contiosulfato (Wayy Burrows, 1976).

Además, considerando que cuando se estudió el efectode una intoxicación crónica por cianuro, ya sea suministradovIa oral (Capitulo I) o subcutánea (Capítulo II), no se pudo detectar acumulación de sulfocianuro en los tejidos estudiados, resultó de interés medir los niveles de sulfocianuro plasmáticosy su excreción urinaria en función del tiempo de intoxicación.

A tal efecto, grupos de h animales intoxicados o nocon cianuro en las dosis indicadas vía i.p. se trataron con SAM(JS mg/kq, i.p.), tiosulfato de sodio (J g/ku, i.p.) o amboscompuestos. Se trabajó simultáneamentetwnwgrupos controles de4 ratones no intoxicados, que recibieron solución salina, SAM,tiosulfato o estos dos últimos compuestos simultáneamente. Eltiosulfato y la SAMse administraron JS minutos y J hora respegtivamente, antes de la inyección del cianuro. Cuando Jos anima­les se trataron con ambas drogas, el tiosulfato se suministró alos 45 minutos de inyectada la SAM.Los animales se sacrifica­ron a Jos 5, JÜ, 20 y 30 minutos de suministrado el cianuro. ('Ln los estudios controles que no recibieron el tóxico, las mediciones se efectuaron a los tiempos indicados determinandose és­tos Juego de haberse cumplido el tiempo estipulado para Ja metabolizaciónde la droga, mencionado anteriormente para cada

compuesto.

IIl.l. ACTIVIDAD DL CIÏUCRÜMÜ ÜXIDASA

III.l.l. Animalesno intoxi‘ados

La administrarión de SAM,tiosulfato o ambos compuestosa animales controles no produjo ninqún efecto sobre la activi­dad de citoeromo oxidasa.

III.l.2. Animalesintoxicados

Ln la Fiqura III.l. se muestran los resultados obteni­dos para la enzima hepátiia. lanto para los animales intoxica­dos von una dosis de cianuro de 4 mq/kq vomo los que recibieron20 mq/kn. la artividad de citocromo oxidasa se inhibió un 50 %a tiempos muy cortos (12 y 2 minutos respectivamente), sufriendo una rapida raida para restaurar el nivel control vuando losanimales intoxivados recibieron previamente SAMmís tiosulfato.Sin embargo, cuando los animales fueron tratados previamenteron tiosulfato solo, si bien se obtuvo un piro de inhibirión desimilar magnitud, éste se detectó muyretrasado (después de los20 minutos de la intoxicación).

Ln los otros tejidos estudiados, se obtuvieron resultados similares.

Lstos datos son voinvidentes con lo hallado porSvhubert y Brill (J968) quienes encontraron en ‘atas máxima in­hibioión de la ritorromo oxidasa hepática entre los 5 y lO minotos después de la administravión i.p. de cianuro de potasio yvon posterior restauración al valor Control. Ianto el tiosulfa­to como el nitrito, inyectados ¿n\MNo una hora antes de la in­toxiravión reavtivaban la artividad enzimátiva previniendo sín­tomas o letalidad.

[11.2. ACÏlVIDAD DL RÜDLNASA

III.2.l. Animalesno intoxirados

Ln primer luqar se deridió estudiar el eferto de los

posibles antídotos sobre la actividad de rodenasa. En las Fiqu­ras III.2,III.3¿III.4. y III.5. se detallan Jos resultados obtgnidos por acción ¿n vam dc SAM,tiosulfato y SAMmás tiosulfatosobre la actividad enzimática medhhncnpresencia o ausencia decianuro en los tejidos estudiados.

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tiempo (min) tiempo (min)

IIUURAIll.l.: Lfecto de la intoxicación aqudaconcianuro sobrela actividad específica de la citocromo oxidasahepática.A: dosis de cianuro no letal (a mq/kq, i.p.)B: dosis de cianuro letal (20 mg/kg, i.p.)Los animales fueron intoxicados con cianuro depotasio (O ) y tratados previamente con SAM(O ),tiosulfato (A) o SAMmás tiosulfato (A); sa­crificándose a los tiempos indicados luego deadministrado el tóxico.Los datos qraficados son el promedio de los va­lores obtenidos con a animales. Los SD no se i­lustran.Valor control: 5,38 i 0,57 (n : 8). n : númerode animales utilizadosLas condiciones experimentales se detallan en Materiales y Métodos y en el texto.

Ln hígado (tiqura lll.2.), la actividad enzimática me­dida en presencia de cianuro novarió por acción de la SAMmien­tras que por efecto del tiosulfato solo, se produjo un aumentodel 30 % (p < 0,05) u 33 minulou y aún mayor (47 %, p < 0,05) ymás rápido por acción de ambos compuestos.

Ln cerebro (tiqura III.3.), la actividad enzimática mgdida con cianuro solamente se alteró por acción del tiosulfato¿n vivo, observándose una inhibición del 50 % ya a tiempos muycortos.

159

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0 10 20 30 O 10 20 30Uempo múm üempo (mM)

¡[CURA IJI.2.: Efecto de SAM(O ), tioqufato (A.) y SAMmástiOSUJFUÍO (Á ) ¿n vivo sobre Ja actividad especifica de rodenasa hepátiïa, medida en pre­sencia (A) o ausencia (B) de cianuro.Los animaJes se sacrificaron a Jos tiempos igdicados determinándose éstos Juego de cumindoeJ tiempo estipuJado para Ja metaboJización decada compuesto.Los datos graficados son eJ promedio de Jos vgJores obtenidos con 4 animaJes. Los SD no seiJustran.VaJores controJes (EJ): 3,00 1 0,42 (n : J4) y0,0J65 i 0,0027 (n : J0) en presencia y ausen­cia de cianuro respectivamente.n : número de animaJes utiJizados.Las condiciones experimentaJes se detaJJan enMateriaJes y Métodos y en eJ texto.

La rodenasa de corazón (tiuura 111.4.) y sangre (¡iqu­ra 111.5.) no se vió afectada ni por efecto de Ja SAMni deJtioqufato.

Ln ninguno de Jos tejidos estudiados se detectaron va­riaciones significativas de Ja actividad de rodenasa medida enausencia decianuro respecto de Jos vaJores controJes.

tJ aumento de actividad detectado en higado por accióndeJ tioquFato se deberia a Ja conversión de rodenasa a Ja for­ma azufre sustituida de aJta actividad. No obstante, Ja enzimade cerebro seria sensibJe aJ exceso de sustrato y eJ tratamien­to con tioqufato provocaría un efecto inhibitorio adverso, yadetectado en otros tejidos (Vazquez y coJ., J986).

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Uempo mnm Hempo múm

¡IGURA III.3.: Efecto de SAM(O ), tíosujfnto (A.) y SAMmástiosujfato (A.)¿H UÍUU sobre Ju avtividad egpevífiva de rodcnasa en verebro, medida en prgsencia (A) o ausenviu (U) de cianuro.VaJores controles (EJ): 0,94 i 0,17 (n : 14) y0,006] T 0,00J2 (n : 10) en presunvia y ausen­via de cianuro respectivamente.Otros detaJJes evperimentales se indican en Jaleyenda de Ja fiqura 111.2.

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0 10 20 30 0 10 20 30hempo hmn) Uempo mnm

¡IGURA III.4.: LFevto de SAM(O ), tioquFato (Ax) y SAMmástiosujfato (A )¿n viva sobre Ja avtividad es­pecífica de rodenasa en corazón, medida en prgsencia (A) o ausenvia (B) de cianuro.VaJUres controles (EJ): 0,89 i 0,]6 (n : 13)0,0204 i 0,0027 (n : 8) en presenvia y ausenciade cianuro respectivamente.Otros detaJJes experimentajes se indican en JaJeyenda de Ja Liqura 111.2.

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0 L l 1 I 0 L 1 1 lO 10 20 30 0 10 20 X)

üompo ÜMn) Hompo (mnfl

thURA 111.5.: Ltecto de SAM(O ), tiosuifato (¿3) y SAMmástiosulfato (Át)(n Vivo sobre Ja actividad es­pecifica de rodcnasa en sangre, medida en prgsencia (A) o ausencia (U) de cianuro.VaJorcs controles (CJ): 0,067 i 0,009 (n : 16)y 0,0069 J 0,001} (n : 15) en presencia y au­sencia de cianuro respectivamente.Otros detaJJes experimentaies se indican en JaJeyenda de Ja tiqura 111.2.

111.2.2. Animales intoxicados

111.2.2.J. Dosis de cianurozü mg/kg

Nose observaron variaciones significativas en Ja actividad de rodenasahepáticapor efectodetnulintoxicación agudapor cianuro ni por ei tratamiento con SAM,tiosultato o amboscompuestos(tiqura III.6.).

Ln cerebro (tiqura IIÏ.7.), la intoxicación por cianu­ro no modificó Ja actividad enzimática. Cuando los animales setrataron previamente conSAM, se detectó un aumento de] 76 %(p < 0,01) en Ja actividad dc rodenasa medida en presencia decianuro durante todo e] periodo estudiado mientras que por tra­tamiento con tiosuifato Ja rodenasa requtó inhibida (35 %,p < 0,05) hecho que ya se habia observado cuando animaJes no igtoxicados recibieron sojamente este compuesto. LJ tratamientocon tioqufato y SAMrevirtió Jos efectos producidos por cadacompuesto individuaJmente, vkoiendo Jos vaJores aJ niveJ con­tro].

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lIGURA[11.6.2 Lfecto de la intoxicación auuda con unadosis noletal de cianuro sobre la actividad especificade rodenasa hepati‘a, medida en presencia (A) oausencia (H) de cianuro.Los animales fueron intoxicados con una dosisde cianuro de potasio de 4 mg/kq (i.p.) (O ) ytratados previamente con SAM(O ), tiosulfato(A.) o SAMmas tiosulfato (Á.); sacrificándosea los tiempos indi‘ados luego de administradoel tóxico.Los datos graficados son el promedio de los valores obtenidos con 4 animales. Los SD no se i­lustran.Los valores controles (El) se detallan en la lgyenda de la Fiqura 111.2.Las condiciones experimentales se detallan enMateriales y Métodos y en el texto.

rTambién para corazón se detecto un aumento del 38 %(p < 0,05) cuando Jos animales intoxicados se trataron con SAMno observándose variaciones en los otros casos estudiados (ti­qura Ill.8.\,

Nose hallaron variaciones significativas en tejido sanquineo en ninquno de los casos analizados (tiqura [11.9.).

[som y col. (l982) estudiaron el efecto de la adminis­tración de dosis bajas de cianuro (3, 4, 5 mg/kg, i.p.) sobrela actividad de rodenasa de higado y cerebro. Lstos autorestampoco encontraron diferencias signifirativas en la actividad en­zimática enfunción de esas dosis.

Si bien la SAMno actuó como antídoto, se ve que, encgrebro y corazón de los animales intoxicados con cianuro, la en­zima se encuentra activada, quizás podria deberse al hecho que

J43

en estos tejidos cJaves, donde eJ cianuro produciría su mayor gfecto tóxico, Ja actividad enzimática aumentaría considerabJe­mente acelerando de esta manera eJ proceso de detoxificación.CuandoJos animaJes recibieron tioqufato, principaJ donor de azufre para Ja enzima, ese incremento de actividad no seria necesario debido aJ aumento do la concentración de sustrato.

2

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0 20 30 40 O 10 20 30 40Hompo han) fiempo umn)

tIGURAIII.7.: Efecto de Ja intoxicación aguda con una dosis noJetaJ de cianuro sobre Ja actividad especificade rodenasa en cerebro, medida enpresencia (A) oausencia (B) de cianuro.Los animaJes fueron intoxicados con una dosis decianuro de potasio de 4 mg/kg (i.p.) (o ) y tratados previamente con SAM(O ), tioquFato (¿5)o SAMmas tioqufato (At); sacrificándose a Jostiempos indicados Juego de administrado eJ tóxi­co.Los vaJores controJes ([]) se detaJJan en Ja Je­yenda de Ja tiqura 111.3.Otros detaJJes experimentales se indican en JaJeyenda de Ja figura 111.6.

III.2.2.2. Dosis de cianuro: 20 mq/kg

La muerte de Jos animaJes intoxicados por cianuro tratados o no previamente con SAMse produjo aproximadamente Jue­qo de 2 minutos de suminist‘ado eJ tóxico. Cuando a Jos animaJestratados previamente con tioqufato soJo o en combinación conSAM se Jes inyectó eJ cianuro, inmediatamente presentaron bra­dipnca y depresión sicomotriz aJ igual que en el 'aso anteriorpero con totaJ recuperación chnica Juego de 5 minutos.

En ninguno de Jos tejidos estudiados se detectaron va­riaciones de Ja actividad de rodenasa en animaJcs intoxicados

laa

con cianuro tratados o no previamente con SAM(Figuras III.JO.,III.Jl, III.JZ y III.J3.).muerte se produce casi inmediatamente y la SAMes incapaz de re

Esto se debe probablemente a que su

vertir este hecho en tan corto plazo.

Actwidadespecñica

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tIGURAIII.8.: Lfecto de la intoxicación aguda con una dosis noletal de cianuro sobre la actividad especificade rodenasa en corazón, medida en presencia (A)o ausencia (B) de cianuro.Los animales fueron intoxicados con una dosis decianuro de potasio de 4 mg/kg (i.p.) (O ) y tratados previamente con SAM(O ), tiosulfato (A.)o SAMmás tiosulfato (A.).Los valores controles (EJ) se detallan en layenda de la tiqura 111.4.Otros detalles experimentales seindican en la leyenda de la tiqura 111.6.

JE

Ll tratamiento previo contiosultato de los animales inactividad enzimática.

Ln higado (tiqura III.JO.A.), cerebro (tigura III.JI.A) y cora­zón (Ligura III.J2.A.) se observó un pico do actividad (aproxi

p O,Ul)cianuro restituyéndose luego a los valores controles para el ca

Y

durante todo el periodo estudiado.

toxicados produjo un gran aumento de la

madamente JOÜ %, < a los l} minutos do suministrado el

so de higado y corazón, permaneciendo elevada para cerebroCuando la enzima se midió en

ausencia de cianuro, se detectó el mismo perfil aunque de menormagnitud (tigura III.JU.B., III.Jl.H y lll.lZ.U). Ln tejidosagguineo, el pico de actividad se detectó aún a tiempos más cor­

III.J3.).cianuro tan

tos (8 minutos) (tiqura Para este caso tan extremo deconcentraciones de altas, el efecto estimulante deltiosulfato sobre la actividad de rodenasa se observó aún en

145

presencia de SAM.

qm 14A "¿2 B

8 o A ><¿s ‘ .é’U CP- - - - --. —- —- --O - —- - --5---- x AC)

3 ’A Q A oo É ¿A í A A0095- m 7f} __________________ —- -—-—'Ü o O . .

2 o O o o.Z U O'23 E< -o­

U40_1 l l l 1 0_| l 1 J l

0 10 20 30 40 O 10 20 30 1.0Uempo ÜMn) hompo hún)

tIGURAIII.9¿: LFerto de Ja intoxicación aguda von una dosis noletal de rianuro sobre la avtividad espevifivade rodenasa en sangre, medida en presencia (A) oausencia (B) de cianuro.Los animales Fueron intoxicados PUHlMHldOSiSdecianuro de potasio de 4 mq/kq (i.p.) (O ) y tratados previamente ron SAM(O ),tiosultato (¿3) oSAMmás tiosulfato (A).Los valores controles ([]) se detallan en la le­yenda de la tiqura III.5.Ütros detalles experimentales se indivan en laleyenda de la tiqura 111.6.

Ln el

la avtivarión de rodenasa observada es de menor magnitudvaso en que ambos compuestos se inyertan combina

dos,pero se produce a tiempos más cortos, justifivando nuevamente elmevanismo de compromiso entre actividad y disponibilidad de azufre que se dispararía ante esta situarión de emergencia Frentea altas ronoentraciones del tóxico.

III.3. NIVLLLS SANGUINLÜS DL AZUtRL LAHIL

III.3.l. Animales no intoxivados

Ln la tiqura III.I4. se ilustran los datos de azufrelábil obtenidos cuando los animales se inyevtaron ron SAM,tio­sulfato o SAMmás tiosulfato.

Los niveles de azufre lábil se hallaron muyincrementados (33 %, p < Ü,Ul) resperto del valor rontrol tanto por

l46

efecto del tratamiento con tiosulfato como con SAMpero dicho gFecto se encontró más pronunciado cuando ambos compuestos se suministraron conjuntamente (bb %, p < Ü,Ul).

mI

oI

a)

O

AcuvrcacesoecficarO3

'ï

QQÉKo/;ÏÉ D

ag. \AActwidadespecífica

cp c 8t­ on 1 l L

. 20 _ 3 10 ‘ 20 4 30 ¿Otiempo (mm) tlempo (mm)

¡[CURAIII.lO.: Efecto de la intoxicación aquda con una dosisletal de cianuro sobre la actividad específicade rodenasa hepática, medida en presencia (A) oausencia (B) de cianuro.Los animales Fueron intoxicados conuna dosis decianuro de potasio de 20 mq/kq (i.p.) (O ) ytratados previamente con SAM(O ), tiosulfato(A) o SAMmás tiosulf'ato (A).Los valores controles (CJ) se detallan enla lgyenda de la tiqura 111.2.Otros detalles experimentales se indican en laleyenda de la tiqura 111.6.

111.3.2. Animales intoxicados

lIl.3.2.l. Qosis de cianuro: ú mq/kqSe detectó un aumento del 70 % (p < D,Ul) en los nive­

les sanguíneos de azufre labil en Jos animales intoxicados porcianuro siendo mayor aún (JOU %, p < 0,0l) en los que recibie­ron previo a la intoxicación SAMo tiosulfato. Sin embargo,cuando se suministraron ambos compuestos conjuntamente, el azu­Fre lábil fue del mismo orden de magnitud que para los animalesintoxicados no tratados (tiqura III.J5.A).

IIÏ.3.2.2. Dosis de cianuro: 20 mq/kq

Ln todos los casos estudiados se produjo un incremento

l47

de azufre lábil mayor del 37 % (P < Ü,ÜJ) (tiqura [II.l5.B).

A B

2 "53.

8 ><

5 mU Uo Co. "­m Uo C)

.0 std 1 c,

.É U

.2 m

< (ZUd

0 _g l l l 1 O L n 1 l l0 10 . 20 . 30 40 O 10 20 30 40

hompo ümn) fiompo «Mnt

LLGURAIII.ll.: Eferto de la intoxioación aguda von una dosisletal de vianuro sobre la avtividad especificade rodenasa en cerebro, medida enpresenvia (A)o ausencia (H) de vianuro.Log animales fueron intoxivados con una dosisde cianuro de potasio de 20 mq/kq (i.p.) (O ) ytratados previamentetwniSAM(O), tiosulfato(A )(JSAM mas tiosulfato (A).Los valores vontroles (C]) se detallan en laleyenda de la tiqura 111.5.Otros detalles experimentales se indican en laleyenda de la tiqura III.6.

Ls importante desta‘ar que se detectó un aumento de a­zufre lábil muchomayor para la intoxicación por vianuro a unadosis no letal. Esto se deberia a que cuando la dosis de cianu­ro es de 20 mq/kq, la enzima estaria utilizando todo el azufredisponible para detoxifioar el vianuro y por lo tanto aprove­chando su máxima tapaoidad 'atalíti‘a. Esto estaria de acuerdovon la actividad de rodenasa muy incrementada hallada en todoslos tejidos estudiados en los animales intoxi‘ados y tratadospreviamente con tiosulfato solo o tiosulfato más SAM.

La SAMsola no pudo evitar la muerte de los animalesque revibieron 20 mq/kq de vianuro. Sin embargo, si bien Fue ig‘apaz de revertir los efevtos tóxicos del cianuro, produjo unaumento del pool de azufre pero que seria solamente tapaz dereavvionar voneltóxioo en presenvia de tiosulfato.

la“

lIGURAlll.l2.:

A B

2 'ban3 x

.5 .2g tUU)

o g. A ¡U ‘ g; 20 ' 'm _v 'U A.; m1;: 'Uu 'ï(í

U4

0 _| l I 1 1 O _ 1 1 l 1 1

o 1o ' 20 _ 30 1.o o 10 20 3o ¿ohemm>(mm) flempo múm

Efecto de la intoxicación aguda con una dosisde cianuro sobre la actividad específica

de rodenasa en corazón, medidaenpresencia(A)o ausencia (B) de cianuro.Los animales fueron intoxicados con una dosisde cianuro de potasio de 20 mq/kg (i.p.) (O )y tratados previamente con SAM(O ), tiosulfato(A) o SAMmás tiosulfato (A).Los valores controles (El) se detallan en la leyenda de la liqura 111.4.Otros detalles experimentalesleyenda de la liqura 111.6.

letal

se indican en la

A B

1,0- '39 12

m XAS m.._ u

.83- a0 82 ° 6.9 E,2 g8 Ï_>.(Í ’9‘

U<

0_| I l l l 0__¡ n n n iO 10 20 30 40 O 10 20 30 40

tiempo (min) tiempo (min)

¡[CURAlll.J}.: Efecto de la intoxicación aquda con una dosisletal de cianuro sobre la actividad expecificade rodenasa en sangre, medida en presencia (A)o ausencia (H) de cianuro.Los animales fueron intoxicados con una dosisde cianuro de potasio de 20 mq/kg (i.p.) (O ) ytratados previamente con SAM(O ), tiosulfato(¿3) o SAMmás tiosulfato (A ).Los valores controles (CJ) se detallan enla_le—yenda de la liqura 111.2;Otros detalles experimentaleSSe indican en laleyenda de la liqura lII.6.

J49

5,0

Umoles/ml

NU1

04‘ 1 1 1 lO 10 20 30 40

tiempo (min)

¡IGURA 111.14.: Líot‘to (lo SAM(Ó ),tiosulfato (A )SAMmás (iosulfato (A )¿H vivo sobre Jos nivgJes sanquíneos do UI“­fre JábiJ.VaJor vontroJ (CJ):2,66 i 0,23 umoJes/mJ(n : IU)Utros detalles oxpor!montajes se indivan unJa leyenda de Ja Ling"ra 111.2.

[11.4. NIVLLLS DL SULFÜCIANURU

leniendo en cuenta que por dotoxiíivavióu o] vianurose convierte enquFooianuro, resultó de interés estudiar Jos n¿veJes oirvuJantes de este compuesto (sujfovianuro on plasma) ysu exvrevión urinaria.

[11.4.]. Ln glasma

IlI.4.J.J. Animales no lntoxivados

En Ja 1abJa lll.l. se muestran Jos datos obtenidosvuando Jos animales revibieron SAM,tiosulfato o ambos compues­tos. Nose observaron variaciones significativas respecto de

Jos controles no tratados.

cn o D‘ a]

pmoms/ml

wb l

umoles/ml

Nu

00 Q l l l l 0. 20 I 30 ,

tlempo (mln) hompo (mln)8

FIGURAIII.l5.: Efecto de la intoxicación aguda con cianuro so­bre Jos niveles sanquineos de azufre lábil.A: dosis de cianuro no letal (4 mg/kg, i.p.)B: dosis de cianuro letal (20 mq/kg, i.p.).Los animales fueron intoxicados con cianuro depotasio (O ) y tratados previamente con SAM(O ), tiosulfato (Ax) o SAMmás tiosulfato (A.)Ll valor control (EJ) sc indica en la leyendade la tiquga III.J4.Otros detalles experimentales se indican en laleyenda de la tiqura llI.t.

III.4.J.2. Animalesintoxicados

III.4.l.2l. Dosis de cianuro: 4 mg/kq

En la Fiqura III.J6 A se muestran los resultados obtgnidos. En los animales intoxicados concianuro se detectó un au­mento en la Formación desulFocianuro del a3 % (p < 0,05) restituyéndose al valor control después de los 30 minutos de la in­toxicación. Cuando los animales se trataron previamente con SAM,tiosulfato o ambos compuestos, los niveles de sultOcianuro seencontraban dentro de los valores controles.

[11.4.].22. Dosis de cianuro: ZUmq/kg

Ln los animales intoxicad08(wntcianuro se detectó unincremento del 40 % (p < 0,05) en Jos niveles de sulfocianuroplasmático, siendo aún mayor cuando recibieron previamente SAM.

151

Ln Jos vasos en que el tratamiento previo a la intoxicación serealizó con tiosulfato o tiosultato mas SAM,el aumento Fue no­tablemente mayor (aproximadamente 200 %, p < 0,01) hallándose gJevado aún lueqo de transvurridos 60 minutos de suministrado eltóxivo (tiqura lll.ló.H).

Resultados similares obtuvieron Pettersen y Cohen(1985) para esta dosis de cianuro pero administrado via subcu­tanea.

TABLAIII.1.: Efecto de SAM, tiosulfato y SAMmastiosulfato ¿n v¿v0 sobre los niveles plas­máticos de sulfocianuro

SCN‘ LN PLASMA(umoles/l)

TILMPÜ lratamiento(min)

SAM Tiosulfato Ïiáïfiflézto

5 329,93 i 80,00 388,73 1 77,80 287,47 1 70,00

10 222,13 i 55,53 288,67 t 72,00 218,87 i 54,00

20 302,00 t 75,00 354,07 1 88,00 299,00 1 75,00

30 235,20 i 59,00 238,47 t 60,00 225,40 t 56,00

60 287,00 t 71,80 352,80 t 88,00 261,35 c 65,00

Los animales se savritivaron a los tiempos indivados dele;minándose éstos lueoo de Cumplido el tiempo oslipulado pgra 1a metabolizavión de rada vompuesto.Los datos presentados son ol promedio 1 SD de los valoresobtenidos von 4 animales.Valor Control: 297,62 1 76,14 umoles/J (n : 9). n : númerode animales utilizados.Las oondiviones experimentales se detallan en Materiales yMétodos y en el texto.

A 1wo B

600

‘ A A ._-—ñfi——'—#AÑ!o o800w A uí E Am UV0 0

É É3» 1

¡1.00- aO

Ó

0 |_ 1 l l 1 l 1 o P 1 a 1 l l 1o 10 m Mami?) (mirá? 50 60 0 10 20 30 _¿O 50 60

tiempo (mm)

thURA III.J6.: Efecto de la intoxicación aguda con cianurosobre Jos niveles plasmáticos de sulfocianuro.A' dosis de cianuro no letal (4 mg/kg, i.p.)8' dosis de cianuro letal (20 mg/kg, i.p.Los animales fueron intoxicados con cianuro depotasio (O ) y tratados previamente con SAM(O ), tiosulfato (¿5) o SAMmás tiosulfato(‘t).LJ valor control (CJ) se indica en la leyegda de la Tabla III.J.Ütros detalles experimentales se indican enla leyenda de la tiqura III.J.

'III.4.2. Ln orina

lli.4.2.l. Animalesno intoxicados

Nose observaronvariacionessignificativas a las 48 horas del tratamiento entre los datos controles de excreción urina­ria de sulfocianuro y los que recibieron SAM,tiosultato o SAMmástiosulfato (Liqura III.l7.).

[11.4.2.2. Animales intoxicados

III.4.2.2l. Dosis de cianuro; 4 mq/kq

Ln la tiqura III.l8LA se muestran los resultados obte­nidos. Dorante las primeras l2horas de la intoxi‘ación no se ogservaron diferencias significativas entre el sulfocianuro excrg

xtado por Jos animales intoxicados y los controles. Sin embargo,a partir de ese momento se produjo un gran incremento en los

Jb3

niveJes de qufocianuro excretado (40 % . Los animaJes que previamente recibieron tioquFato excretaron cantidades aún mayoresde qufocianuro (JúU % . Sin embargo, Jos animaJes que Fuerontratados con SAMo con SAMmás tioquFato presentaron una excrgción urinaria de sultocinnuro de pattern simiJar aJ de Jos ani­males controles.

m12­oUm3E3Um

87:16­L5

w.9oEa

O- l 1O 24 48

tiempo (horas)

tIGURAIII.J7.: Efecto de SAM(O ), tio­quFato (At) y SAM+ tio­qufato (Ai) ¿n U¿v0 su­bre Ja excreción urinariade qufocianuro.Las determinaciones se reaJizaron sobre Ja orina receqida a Jos tiempos indica­dos (una vez transcurridoeJ tiempo necesario paraJa metaboJización de cadacompuesto) en cada jauJametabÓJica conteniendo 4animajes.(CJ) Animales controJes.Las condiciones experimegtaJes se detaJJan en MaigriaJes y Métodos y en eJtexto.

Jll.ú.2.22. Dosis de cianuro: 20 mq/kq

La excreción de qufocianuro aumentó considerabJemente(GUU%, tanto en Jos animaJes tratados previamente con

tiosulfoto comocon tiosuifato más SAM(Figura III.JB.B).

____________._4—————A

umolostotalesacumulados

6 I

umolostotalesacumulados

01 o I

O 1 l 0_ l l. 21. ¿6 o 24 1.8

tiempo (horas) tiempo (horas)

¡IGURAIII.JB.: Efecto de Ja intoxi‘ovión aquda von cianuro sobre Ja excreción urinario de qufovianuro.A: dosis de cianuro no Jota] (4 mq/kq, i.p.)B: dosis de rianuro loth (ZU mq/kus i.p.)Los animaies fueron intoxi‘odos von vianurode potasio (O ) y tratados previamente con SAM(o), tiosuifato (A) o SAMmás tiosuifato (A).(CJ) Animaies vontrojesOtros deteiies experimentales seJeyenda de Ja iiquro 111.17.

indivon en la

Ln base a Jos resuitados obtenidos sobre los niveles dequfovianuro virvuiante y de Ja exorevión urinaria de suifooia­nuro se vompruebo que en eJ caso de intoxivovión von dosis ba­jas de vianuro (4 mq/kg) Ja cantidad de suiforionuro no aumentaCuando Jos animaies recibieron SAMmás tiosulfoto vonjuntamente.sto indivaría que la SAMejervería un oferto inhihitorio so­¡"I­

oapacidad de Ja rodenase para nreplnr el u/ufre de] SUS­<h2l p(iul (h: zaziiilwz (iot e(‘tz¡do en

bre Jatrato donor e pesar de] aumentosanqre en animales no intoxi‘udos y tratados von ambos compues­tos. Sin embargo, nuundo lu uituuvión un vuelvo extremo (intuxivarión von vianuro 20 mq/kq), lu SAMno es ‘opuz de interferirvon Ja óptima urtividad del tiosulfato vomosustrato donor de gzufre para Ja rodenaso y tanto Jos niveles piasmátioos como Josurinarios aumentan vonsiderubiemente. U sea, que en este ‘aso y

SAMno podria ejerrer efecto inhibitgpara evitar Ja muerte, ei‘epaoidad ootaiitioa;rio sobre rodenasa, que despiieqa toda su

en este caso se eomprendería que su rol detoxificante Fuese suprincipal función.

1II.5. ACÏIVIDAD DE ALA-D

III.5.1. Animales no intoxicados

Ninguno de Jos tratamientos realizados produjo varia­ción alguna en los niveles de ALA.D.En la Tabla III.2. se muestran Jos valores obtenidos durante todo eJ periodo estudiado.

TABLAIII.2.: Efecto de SAM, tiosulfato y SAMmás tiosulfato ¿n vivo sobre Ja actividad de ALA-D

ACIIVIDAD LSPtCllICAlRAlAMILNÏÜ

HIgado Cerebro Corazón Sangre

TiosulFato 19,15 t 2,85 1,90 i 0,30 6,26 l 0,87 1,97 i 0,35

SAM 23,35 i 3,50 2,80 i 0,40 7,76 l 1,00 1,54 t 0,31

SAM+ tiosulfato 18,64 t 3,00 1,98 t 0,30 6,79 9 0,90 1,24 1 0,30

Los valores mostradoscorrespondena los niv01c5(h)ALA-Dmedidos a los 30 minutos Juego de transcurrido ol tiemponecesario para 1a metabolización de cada compuesto y sonel promedio i SD de los resultados obtenidos con 4 animales.Valores controles: Hígado: 22,68 t 3,37 (n : 13), cerebro:2,59 :l 0,42 (r1 : 13), (HJrazón: 6,16 1 0,03 (r1 : 14), san­gre: 1,50 i 0,31 (n = 11). n = número do animales utiliza­dos. las condiciones experimentales se detallan cn Materiales y Métodos y en el texto.

111.5.2. Animales intoxicados

111.5.2.1. Dosis de cianuro: 4 mg/kg

Ln ninguno de Jos tejidos estudiados se obtuvieron va­riaciones significativas en Jos niveles de ALA-Dni en Jos ani­males intoxicados ni en aquellos quc fueron previamente

l56

sometidos a algún tratamiento (Figura III.l9.).

III.5.2.2.

hibición (mayor del 60 %,Josanimales intoxicados concianuro,

Dosis de cianuro

hI' d 5 c r bro90 0A e e B3 .3

"3530*- rU Ua; . m o5} o S o oe, A o m3 . Q __.._­r, p ......... ---.A..... --Q--. u U-"a-"Á - - - - ----­820 Ao; A ¡A g A á 4:2 0 :2 ,3 ' 3< <

l l 1 L 01 1 1 1 l

corazo’nC 3 , sangre D9' .3

.3 . o 82'5L g A 3 á 3 [yu-8.-.. .._--_. ___. __.._-_­am..... "2.......... -- o a au g A 5 g O o“3 'DE .;1_

É T Eg <

O n 1 l I l n 1 1 1

o 10 i i ao 40 o 1o 20 30 4ohempo Umn) flempo «an

FIGURAIII.l9.: Efecto de la intoxicación aguda con una dosisno letal de cianuro sobre la actividad especifica de ALA-Den higado (A), cerebro (B), corazón(C) Y sangre (D).Los animales fueron intoxicados con una dosisde cianuro de potasio de 4 mg/kg (i.p.) (O ) ytratados previamente con SAM(O ),tiosulfato(A.) o SAMmás tiosulfato (At); sacrificandosea Jos tiempos indicados luego de administradoel tóxico. 'Los datos graficados son el promedio de Jos valores obtenidos conltanimales. Los SDno se i­lustran.Los valores controles (EJ) se detallan enláile—yenda de la Tabla 111.2.Las condiciones experimentales se detallan enMateriales y Métodos y en el texto.

20 mq/kq

En todos los tejidos se comprobóuna significativa in­p < 0,0l) en la actividad de ALA-Den

efecto que no se revirtió

en presenciapreviamcnlc tratados von

q.

p

S

de SAM.

157

animaJes Fueronmas SAM se

Sin ombarqo, vuando Joslionullalo o von tiosulfato

AlA-l) (litplrn l LLLZÍI.).

IGURA 111.202:

La

oradaobre o]

altainhibieión de Ja

mevanismo de

loqró roalaurur ol nivvl vnnlrol du

3 r - L0 higado A cereoro B

8 3e 3“ a¿20-M gH A A

c1 0- A ¿3

s ’ 2 .bEIO- . D

:2 "P :_'>.1- Quo'J o z< < o

0-; l l 0_l 1 1 1 1

S corazo’n C 3 sangre D8 m A

; A í ‘ .3 A ‘.a A G ..g6 °

0.VI A A U“)° 0 A AU o U A'° ru

É 3 o .E 1- o

.3 í .06 .3 c>oU U

< <I .80_| n l l 0_| g 1 1 1 L

0 10 20 30 ¿0 O 10 20 30 40hempo han) hempo múm

tfevto de Ja intoxivaoión aqudarun1una dosis Jede cianuro sobre Ja actividad específica detal

cerebro (B), corazón (C)ALA-D en hígado (A),y sanqre (D).Los animales fueron intoxivados con una dosisde cianuro de potasio de 20 mq/kg (i.P. ) ((3)y tratados previamente von SAM(O ), tiosuifato(A.)L)SAM mas tioquFato (A ).Los valores controles (EJ) se detaJJan en Jaleyenda de Ja 1abJa III.2.Otros detaJJos experimentales se indican en Jaleyenda de Ja liqura III.¿2.

dosis suministrada en este vaso, produjo Ja egactividad dc ALA-Ddebido a acciónSU

reavoión de esta enzima, ya disoutido.

III.6.

JSU

CONCLUSIONES

Se detectódad de

dependientemente de que

el mismoefecto inhibitorio (50 %) sobre la activicitocromo oxidasa cn todos los tejidos estudiados, in­

administren dosis altas o bajas deSO

cianuro.

La actividad de rodenasa no varió siqniticativamente en ninguno de Jos tejidos estudiados cuando se inyectó cianuro en unadosis de 4 mq/kg. Sin embarqo esta actividad aumentó cuandolaFueron previamente tratados contiosulfato oSAM.

palmente involucrada

dosis de cianuro utilizada Fue de 20 mq/kq y los animalestiosulfato más

Lsto sugeriría que la rodenasa no se encontraría princi­en la detoxificación del cianuro incluso

cuando se da tiosulfato exóqeno, excepto en el caso de una ighipótesis ya propuesta por otros autores

1985).toxicación letal,(Rutkwoski y col.,

La tantidad de azufre lábil se encontró muy incrementada en bgdos los casos estudiados. Evidentemente la intoxicación con

aumento della llegada del

cianuro ocasiona un azufre lábil disponible paralimitar de esta Forma tóxico a los tejidos.

LJ sulfocianuro circulante se hallólnuyincrementado por efec­to delproceso de detoxificación.

cianuro a bajas y altas dosis, comoconsecuencia de sutn el caso de los animales intoxi­

cados con altas dosis y previamente tratados contiosulfato,lacantidad de sulfocianuro en plasma se encontró aún más aumen­tada.mentaba 36,5 veces la velocidad de conversión de cianuro asui

Sylvester y col. (198]) observaron que el tiosulfato au

focianuro.

También en este trabajo se obtuvo un mar‘ado incremento enlosniveles de sulfocianuro excretado a partir de las l2 horaspog

latóxico.

teriores a intoxicación siendo aún más notable para dosisaltas del Lste parámetro también evidencia la diferegcia en la reacción del orqanismo frente a dosis subletales oletales de cianuro.

La actividad de ALA-Dse encontró marcadamente inhibida a al­las dosis de cianuro, para lueqo volver a los niveles contro­Jes.

159

III.7. RtFLRENCIAS

Burrows, G.L., Liu, D.H.W. & Way, J.L. (1973) J. Pharmacol.pr. Ïher. ¿_í, 739.Isom, G.I.; Burrows, G.t. ú Way, J.L. (1982) Ïoxico]. App].Pharmacol. 92, 250.Pettersen, J.C. á Cohen,S.D. (1985) loxicoj. App]. Pharmacol.EL, 265.Rutkuwski, J.V.; Roebuok, 8.0. á Smith, R.P. (1985) J. Nutr.¿¿2, 132.Schubert, J. ó BriJJ, W.A. (1968) J. Pharmaool. pr. 1her.Lía, 352.Sylvester, D.M.; Sander, C.; Hayton, W.L. & Way, J.L. (198])Proa. West. Pharmacol. Soc. gg, 135.Vázquez, E.; Buszeh, A.M.; Wider, t. & Batlle, A (1986) IRCSMed. Sci. ¿3, 999.Way, J.L. & Burrows, G. (1976) Toxico]. App]. Pharmucuj. lá,93.

CAPITULO IV

ENCAPSULAMIENÏO DE RODENASA EN FANTASMAS DE ERITRÜCITÜS

IV.].

IV.

IV.

2.

6.

Condiciones óptimas de encapsulamientoIV.l.l.

IV.].2.

IV.l.3.

Proceso

Ensayos

Ensayos

IV.4.l.

IV.4.2.

IV.4.3.

Condiciones del procedimiento para vaciarlos eritrocitosVariaciones con el tiempo y temperaturade encapsulamientoCondiciones de resellado

de encapsulamiento

¿n vitae

¿n vivo

Administración de Fantasmas cargados aanimales no intoxicadosAdministraciónde Fantasmas vacios aanimales intoxicadosAdministraciónde fantasmas cargados aanimales intoxicados

Conclusiones

Referencias

Página

160

16]

16]162

164

l67

167

l67

l68

172

l75

176

160

IV. ENCAPSULAMIENTD DE RODENASA EN FANTASMAS DE ERITRÜCITÜS

Los efectos tóxicos del cianuro se atribuyen a la inhibición de la citocromo oxidasa, oxidasa terminal de la cadenarespiratoria mitocondrial (Keilin, 1928; Warburq, 193]), produ­ciendo anoxia histotóxica.

Unode los antídotos utilizados para la intoxicaciónpor cianuro, el tiosulfato de sodio (Chen y col., l933), es elsustrato donor de azufre para la rodenasa, enzima mitocondrialresponsable de la biotransformación del cianuro a sulfocianuro(Lanq, l933; Himwich y Sanders, l948).

La eficacia de la rodenasa endógena para detoxifiearel cianuro se encuentra limitada, a pesar de hallarse en altasconcentraciones, debido a su distribución intracelular ya queel tiosulfato no puede penetrar completamente la membranade lacélula (Way, l984). Este compuesto es una molécula inorgánieazu_tamente ionizada que atraviesa muy lentamente las membranas ypor lo tanto su distribución intracelular está limitada (Wayycol., l985).

En los presentes estudios, se intentó resolver esteproblema de compartimentalización ubicando al donor de azufre ya la enzima en estrecha proximidad, en un entorno protegido, elcual es incluso facilmente accesible al tóxico, cianuro de potasio, para que ocurra el proceso de detoxificación. El objeto eraencapsular rodenasa con tiosulfato de sodio en eritrocitos, loscuales Funcionarian comotransportadores biodegradables de laenzima y su sustrato tiosulfato. El eritrocito es muypermea­ble al cianuro en condiciones fisiológicas (Wayy col., l985).

lV.l. CONDICIONES ÜPTIMAS DE LNCAPSULAMIENTÜ

Se estudiaron las condiciones óptimas de encapsulamiegto de la rodenasa en los eritrocitos. Está demostrado que com­puestos de alto peso molecular pueden entrar a los eritrocitosdurante la hemólisis (lhler y col., 1973). Bajo estas condicio­nes hipotónicas, la célula se hincha y se forman agujeros en lamembrana,permitiendo el equilibrio entre las soluciones intray extracelular. Lueqo de la hemólisis los poros se cierran y la

lól

membrananuevamente es competente para excluir las macromolécu­las.

IV.l.l. Condiciones del procedimiento para vaciar JoseritrocitosEl uso de los eritrocitos comotransportadores biológi

cos es relativamente reciente. Ihler (l979) demostró que en lasmembranasde los eritrocitos podian llegar a Formarse poros cuando se ponían en contacto con solución hipotónica (Baker, l967;Seeman, l967); estos poros tenian suficientes dimensiones comopara permitir que macromoléculas como la hemoglobina pudieran atravesarlos y salir del eritrocito (Baker, l967). Si los eritrocitos se diluyen en medio hipotónico, el aumento de presión es rápido, por lo tanto la membrana tiende a abrirse en un solo pun­to para permitir la descarga de hemoglobina y material celular(Heedman, l958; Danon, l96l; Baker y Gillis, l969). Si e] cam­bio en la presión osmóticz es gradual, como ocurre cuando los gritrocitos se dializan contra medio hipotónico, la hemoglobinase libera uniformemente alrededor de toda la membrana, aparentgmente a través de un gran número de poros (Danon, l96l). Gardos(l954) Fue el primero en usar la hemólisis hipotónica específi­camente para atrapar moleculas (ATP) dentro de los glóbulos ro­jos (GR) resellados

El tamaño de las macromoléculas a incorporar es obviamente de gran interés. Se encontró que se incorporaban preferegcialmente las proteínas de peso molecular menor con un máximopara aquellos cuyo tamaño estaba en la zona de lOs 90.000 dal­tons (Ihler y col., l973).

Ln base a estos antecedentes, los eritrocitos se resuspendieron en agua o se sometieron a una diálisis hipotónica (la­bla lV.l.). Evidentemente, debido al bajo peso molecular de larodenasa, 33.000, se obtuvieron mejores resultados de encapsulgmiento cuando el tambio de tonicidad ae hizo en forma gradual.

lV.l.2. Variaciones con el tiempo y tempe‘atura deencapsulamiento

Es importante señalar las diferencias obtenidas con digtintos tiempos (5, 15 y 30 minutos) y temperaturas (2 UCy tem­peratura ambiente) de contacto entre la enzima y los eritrocitos

162

abiertos. La mejor incorporación se logró cuando 1a enzima sedejó en contacto durante 30 minutos a temperatura ambiente (Ta­bla IV.2.).

TABLAIV.J.: Procedimiento de vaciado de loseritrocitos

RUDENASA INCORPORADA

EN ¡GR %)METÜDÜ

Diálisis hipotónica60 minutos a 2 “C 7,0

Dilución hipotónica 1,5

GRlavados con solución isotóniea completa yresuspendidos 7:3 (v/v).lGR: Fantasma de qlóbulo rojoTiempo de contacto de Ja enzima con el FGR:30 minutos a temperatura ambiente.Condiciones de resellado: 30 minutos a 37 °Ccon solución hipertónica completa.

IV.J.J. Condiciones de resellado

Para restaurar Ja isotonicidad se agrega sal y de estamanera se cierran los poros de la membrana. Ln estas condicionesno hay mis entrada o salida de macromoléculas, pero los fantas­mas no son necesariamente impermeables al pasaje de pequeñas mgIóculau o iones (Dale y col., l977). A pesar de la ruptura delqlóbulo rojo y la liberación de macromoléculas, metabolitosyiones solubles, las membranaspueden recuperar su impermeabili­dad oriqinal a estas moléculas.

Hodemann y ’assow (1972) han establecido que se puedenobtener 3 tipos de células reselladas o Fantasmas. LJ Tipo I rgsulta del resellado espontáneo bajo condiciones hipotónicas. Si

163

la hemólisis se lleva a cabo a 0 °C, la Formación de este tipode fantasmas es mínima. El Tipo III se resella luego de la adi­ción de sal, permaneciendo permeable a los iones, pero no a lasmacromoléculas. El Tipo II es un Fantasma totalmente resellado,probablemente derivado del Tipo III. El Tipo III puede conver­tirse en Tipo II por incubación a 37 OCdurante l hora.

TABLAIV.2.: Condiciones de encapsulamientode la rodenasa dentro de los FGR

RODENASA INCORPORADA EN rGR (%)

TEMPERATURATiempo de contacto (min)

DE CONTACTO

5 l5 30

2 UC 2,0 2,0 2,7

Temperaturaambiente 3,0 4,0 7,0

GRlavados con solución isotónica completa y re­suspendidos 7:3 (v/v) y dializados contra solu­ción hipotónica completa 60 minutos a 2 °C.Condiciones de resellado: 30 minutos a 37 °C consolución hipertónica completa.

ta relación entre los fantasmas reconstituidos y per­meables depende de las condiciones de hemólisis y del tratamiegto posterior de la membrana.

Se probaron las siquientes condiciones de resellado:tiempo (5, IB y 30 minutos) y temperatura (2 “C ó 37 oC). Máxi­mo atrapamicnto se obtuvo cuando el resellado con solución hi­pertónica se llevó a cabo a 37 “t durante 30 minutos (TablaIV.3.)

TABLAIV.3.: Condiviones de reseJJado

RODENASA INCORPORADA EN ¡GR (%)ÏEMPERAÏURA

'Tiempo de reseJJado (min)DE RESELLADÜ

(oc) 5 15 30

2 2 3 J

37 3 3 7

GRJavados con soJueión isotóniea completa y resuspendidos 7:3 (v/v), dializados contra soJurión hi:potóniea completa 60 minutos a 2 0C.Tiempo de contacto de Ja enzima con e] PGR: 30 mi­nutos a temperatura ambiente.

IV.2. PROCESO DE ENCAPSULAMIENTÜ

EJ procedimiento que se siguió para obtener Fantasmasde glóbulos rojos vacios (PGR) o con rodenasa y tiosuifato(¡GR (Rodenasa + tioqufato) ) se muestra en eJ esquema de Ja

liqura IV.J.

La sanqre entera, extraída de ratones por punción vardíaea, se ventrifuqó a J.ÜUÜ x q durante 5 minutos a 4 "C des­varióndosc el suero y Jos qlóbulos blancos. Los eritrocitos selavarnn 3 veraz; (‘on soluvión isotónit‘a bufrcrada ((‘JOI‘UI‘Odeaudio laa mM; vlururn de maqnenio 2 mM; dextruua ) mM; bufferinstalo de sodioIU mMpH 7,ú ). la relación entre buffer y GRsemantuvo en 3:7 ¡v/vi. Los eritroeitos prejavados se sometierona una diálisis hipotóniva seqún el método de Deloavh y col.(1980). La diálisis se llevó a rabo durante 60 minutos a 2 0Censolución hipotóniva bufferada (cloruro de magnesio ú mM;dextrgsa 5 mM,buffer fosfato de sodio JU mMpH 7,4). Los eritrocitosprediaJizados se mantuvieron Juego en contacto eon 0,] m] de

Jób

buffer Iris-HC] 0,05 MpH 8,7 o con solución enzimática (aproximadamente 1.600 U/mJ - JJ mg proteína/ml) sola o en presenciade tioquFato de sodio (J mM)durante 30 minutos a temperaturaambiente con agitación suave y constante. A continuación, Jos gritrocitos se reseJJaron por incubación a 37 oC durante 30 mi­nutos en solución saJinahipertónica bufferada (cloruro de sodio1.500 mM;cloruro de magnesio 2 mM; dextrosa 5 mM, buffer fosfgto de sodio JÜ mMpH 7,4). Los fantasmas de eritrocitos fueronJuego centrifugados y Javados 3 veces con solución isotónica bu­fferada, se resuspendieron en esta misma solución y se usaroninmediatamente. En Jos sobrenadantes y en las céJuJas resella­das siempre se determinó actividad de rodenasa.

SANGRE LNILRA

Centrifugar a J.ÜÜO x g 5 min

PLASMA CRGLÜBULOS BLANCOS _,Javar 3 veces con soJUCion(se descartan) isotónica bufferada

GR LAVADOS

resuspendcr cn solución isotónicabufferada 7:3 (v/v)

dializar contra solución hipotónicabuffcrada (1:20, v/v) 60 minutos a 2 °C

GR DIALIZADÜS

a) 0,] ml buffer iris-HC] 0,05 M30 minutos a temperatura pH 8,7ambiente con agitación b) 0,] mJ de rodenasaconstante c) 0,] mJ de rodenasa + 0,] mi de

tiosulfato de sodio J mM

0,15 mJ dc solución hincrtónicabuffcrada. 30 minutos a 37 "C conagitación constante

Ccntritugar a I.UUU x g 5 min

rcsuspendcr y lavar 5 vcces consolución tsotónjca butterada

¡IGURA[V.J.: Preparación de fantasmas de glóbulos rojos vacios(a) o cargados con rodenasa tb) o rodenasa mástioqufato de sodio (c)Las cantidades a agregar son Jas requeridas paraJ m1 de GR.

166

Las Tablas IV.4. y IV.5. muestran Jos resultados obtenidos. Mediante este proceso de encapsuiamiento se recuperó un7 %de Ja enzima iniciaimente agregada. La presencia de tioqu­Fato de sodio no mejoró el rendimiento.

TABLAIV.4.: Actividad de rodenasa en Fantasmas de eritroci­tos cargados

ACTIVIDAD DE RÜDENASA (U1)

IGR(rodenasa) FGR(rodenasa + 5203-)

Cantidad agregada 161,9 161,9

Cantidad recuperada 11,} 13,0

% de encapsulamiento 7,0 r 0,7 8,0 i 0,7

EJ proceso de encapsuiamiento es cJ descripto en Ja fiquraIV.l..

TABLAIV.5.: Actividad de rodenasa on GR y fantasmascargados en presencia y ausencia detioqufato de sodio

ÏIPÜ ACÏIVIDAD DE RÜDENASAUI)

GR 23,6 i 3,4ISR (rodenasa) 11,3 i 0,0

¡GR (rodenasa + 8203:) 13,0 1 0,9

167

Wayy col. (1985) tampoco encontraron diferencias en elproceso de encapsulamiento en presencia o ausencia de tiosulfa­to.

IV.3. ENSAYOS¿n vitae

Se investigó el efecto del agregado de lritón (5 % alsistema de incubación sobre Ja actividad especifica de la rode­nasa, empleando diferentes c0mbinaciones de sus sustratos. Enla Tabla IV.6. sólo se ilustran los datos obtenidos cuando se usó el sistema completo, es decir conteniendo tiosulfato y ciangro. Se hace notar que cuando las fuentes enzimáticas fueron JosGR o Jos FGR, la maxima actividad se midió en presencia de am­bos sustratos, la ausencia de uno de ellos o de ambos produjovalores menores, tanto mas cuando se omitió el tiosulfato. Deestos resultados puede concluirse que Ja actividad de los fantas­mas carqados con rodenaaa y su sustrato tiosulfato es práctica­mente la misma, en presencia o ausencia de Tritón, apenas unlÜ-JS %menor en estas últimas condiciones. Esto está indicandoque el bajo porcentaje de enzima contenida en los fantasmas sedebe encontrar unida bajo la forma de una unión no específica ala membranaexterna del eritrocito.

Iv.4. ENSAYOS¿n vivo

A pesar de los datos poco alentadores obtenidos en lasexperiencias de encapsulamiento y los ensayos ¿n vitae, se decidió de todas formas, llevar a caho los ensayos con el modelo a­nimal, en el ‘aso de una intoxicación aquda.

IV.4.I. Administración nn tanlaamaa cargadas a animales no¡nlnxi‘adoa

Ln primer Juqar, se investiqócfl efecto de administrarfantasmas con enzima y tioaultato cn‘apsulados a animales no igtoxi‘ados con cianuro.

A un lote de 6 animales se les aplicó una dosis de0,2 ml de fantasmas homóloqos ti.v.) conteniendo rodenasa y tigsulfato preparados según las condiciones óptimas ya descriptas.

l68

Luego de 20 minutos se sacrificaron estos animales y otro loteigual de controles que no habian recibido fantasmas, y se determinó la actividad de rodenasa en higado, cerebro, corazón y sangre.

TABLAIV.6.: Actividad de la rodenasa en glóbulosrojos, fantasmas vacios y eneapsulagdo enzima y tiosulfato en presenciay ausencia de tritón

ACÏIVIDAD ESPECIEICASISTEMA

+ Tritón - Tritón

GR U,l16 t 0,010 0,100 t 0,010

188 0,096 1 0,000 0,092 t 0,008

PGR(rodenasa-+5203:) 0,977 1 0,090 0,850 i 0,082

Las condiciones experimentales se dan en el texto.Se usó una concentración final de Ïritón del 5 %.Los datos son promedio de 3 experiencias.

Se puede observar en la Tabla IV.7., que el tratamien­to con fantasmas carqados no produce ‘ambios significativos enla actividad de la rodenasa. Se1nnnh>aqrcqar Cue tampoco hubovariaciones con la administración de fantasmas vacios a animalesno intoxicados, siempre respecto de controles no tratados (nose muest‘an los datos).

lV.ü.2. Administración de lantasmas vacíos a animalesintoxicados

[ambien resultó de interés determinar el efecto de laadministración de fantasmas vacios a animales intoxicados en fora aguda con una dosis de cianuro de 4 mq/g (i.p.).

Se intoxicaron tres lotes de animales con cianuro, uno

169

de ellos funcionó comocontrol de intoxicados sin tratar, a o­tro se le administró al mismo tiempo que el cianuro (tiempo ce­ro) una dosis de 0,2 ml de fantasmas vacios, al otro grupo, seJe aplicó igual dosis de Fantasmas pero 5 minutos después que elcianuro. Se sacrificaron Jos animales luego de 5 y 15 minutos derecibidos los fantasmas vacios y se midieron las actividades derodenasa y citocromo oxidasa en Jos distintos tejidos.

TABLAIV.7.: Efecto de la administración defantasmas cargados a animales nointoxicados sobre la actividadde rodenasa

ACTIVIDAD ESPECIFICA

1LJIDÜ .Controles Tratados

Hígado 3,000 i 0,420 3,680 t 0,390

Cerebro 0,940 i 0,170 1,110 i 0,190

Corazón 0,890 t 0,160 1,210 i 0,120

Sangre. 0,067 1 0,009 0,083 t 0,007

Las condiciones experimentales son lasdescriptas en el texto

Ln la labla 1V.8. sc muestran los resultados obtenidospara la rodenasa. Llamativamcnte en higado,ol tratamiento confantasmas vacíos parecería producir cierta activación de la en­zima. Ln cerebro, no hay variaciones respecto de los valoresnormales cuando el tóxico y los fantasmas se administraron si­multaneamente. Se observó un leve incremento de la actividada los 5 minutos de la aplicacióndel fantasma que a su vez se suministró 5 minutos después del tóxico. En corazón, en ambasmodalidades, los fantasmas vacios aumentaron un promedio de 2veces la actividad de rodenasa y en sangre pasó algo análogo.

1/0

TABLAIV.8.: Efecto de la administración de fantasmas vacíos aanimales intoxicados en forma aguda sobre 1a acti­vidad de rodenasa

ACTIVIDAD ESPECIFICATIEMPO DL INTOXICACI‘N

. . . . liempo transcurrido luego de[EJIDO ANÏLSDLL TRAÍAMILNIÜ 1a administración del FGR

(min)5 min 15 min

0 3,610 i 0,540 4,070 i 0,610Hígado

5 3,570 i 0,520 5,320 t 0,780

0 0,850 i 0,140 0,850 i 0,140Cerebro

5 1,360 t 0,240 0,770 i 0,100

0 1,820 t 0,350 1,840 i 0,350Corazón

5 1,940 i 0,360 1,540 i 0,290

U 0,082 i 0,011 0,094 i 0,012Sanqre

0,120 1 0,016 0,101 1 0,014

Los animales se intoxiraron con una dosis de cianuro de pota­sio de 4 mq/kg (i.p.) y oo savrifivaron a los tiempos indica­dos luego de 1a administravión del IGR. Paralelamente se midióactividad de rodenasa en animales intoxivados que no revibie­ron lGR y se savrifivaron a lun miumus tiempos que los anima­les que revibieron IUR. los valores de avlívidad enzimátivaen los tejidos estudiados no presentaron diroronvias signifi­cativas respevto de los datos rontroles.Los valores mostrados son el promedio ' SD de los resultadosobtenidos para 4 animales.Valores controles: Hiqado: 3,00 t 0,42 (n : 14); verebro:0,94 i 0,17 (n : 14); nora/ón: 0,09 1 0,16 (n : 13); sangre:0,067 i 0,009 (n : 16). n: número de animales utilizadoslas rondiviones experimentales son las desvriptas en el texto.

algunos cambios llamativos.

l7l

También con la eitocromo oxidasa (Tabla IV.9.) ocurrenCon Fantasmas vacios se observó una

leve disminución en la inhibición dela citocromo oxidasa hepátiC8.

TABLA IV. :

Ln corazón y cerebro no tuvo efecto.

Efecto de la administración de Fantasmas vacíosa animales intoxicados en forma aguda sobre la ac

9.

tividad de citocromo oxidasa

% INHIBICIONÏIEMPÜ DL INTÜXICACION

. — - . . Tiempo transcurrido Juego deTEJIDO ANTES DEL [RAÍAMILNÏO Ja administración de] FER

(min)5 min l5 min

Ü 6 (20) 20 (40)Hígado

5 23 (44) 13 (24)

U 3b (40) 20 (20)Cerebro

5 50 (55) 3 (Ü)

Ü 24(37) 56 (50)Corazón

5 34 (40) 56 (40)

LossiodosLoscentajes de inhibición de la actividad de citocromo oxidasaen losmismosIGN.losconde Ja actividad especificaValores1,05nLas condiciones experimentales son las descriptas en el

animales se intoxicaron con una dosis de cianuro de pota­de a mg/kg (i.p.) y se sacrificaron a los tiempos indica­lueqo de la administración deltGR.valores indicados entre paréntesis corresponden a los por

los(.‘OD

cianuro y sacrificados aal tratamiento

animales intoxicados contiempos que los animales sometidos

datos presentados son el promedio de los valores obtenidos4 animales y se expresan como porcentaje de disminución

respecto de los controles.controles: Hígado: 5,38 l 0,57 (n : 8); cerebro:

i 6,94 (n : 7); corazón: 65,26 i 6,94 (n : 7).número de animales utilizados

texto.

J72

Se ha encontrado entonces, cierta'acción antídotal delos fantasmas vacíos, que podria ser asimilada a la producidapor una inmediata transfusión, pero sin que ello llegue a explicar cómo actúan.

IV.4.3. Administración de fantasmas cargados a animalesintoxigggggA tres lotes de animales intoxicados con una dosis de

cianuro de 4 mg/kq, i.p., se les aplicó un tratamiento análogoal descripto en el ítem anterior. Ls decir, uno sirvió de con­trol, el otro simultáneamente recibió el cianuro y Jos fantas­mas cargados con enzima y tiosulfato y el tercero Jos recibió5 minutos después del cianuro. Inmediatamente de suministradosJos fantasmas (tiempo cero) y a intervalos siguientes de 5, lO,l5 y 20 minutos se sacrificaron animales de los distintos lo­tes, y se midieron las actividades de rodenasa y de citocromo gxidasa en las condiciones standard.

Ln la liqura IV.l. se ilustran los datos obtenidos conla rodenasa. Se aprecia que en higado y cerebro, resultó rela­tivamente más efectiva la administración simultanea del tóxicoy los fantasmas con una rapida y máxima respuesta a los 5 minu­tos, pero de'corta duración. En estos tejidos, la demora de só­lo 5 minutos en aplicar los fantasmas produjo muy leve o ningúnefecto. Ln corazón, la respuesta en tiempo e intensidad fue similar pero invertida,para lo cual no podemosofrecer una expli­cación. En sangre, en ninguna de las alternativas se obtuvo unaacción apreciable.

Para el caso de la citocromo oxidasa, se ilustran losdatos obtenidos en hígado, cerebro y corazón (Ligura IVLZ¿A. By_g). Ln todos los ‘asos sc logró una rápida recuperación de laactividad de citocromo oxidasa cuando se administraron fantas­mas argados b minutos después dc la intoxi‘ación. Dicho efectono sc ohscrva cuando los fantasmas y cl tóxico se administraronsimultáneamente.

Ln consecuencia. no se considera que ésta sea una al­ternativa terapéutica útil para antagonizar Jos efectos de unaintoxicación aguda por cianuro, aunque tal vez sea de interésinvestigar su efectividad en el caso de una intoxicación cróni­(‘El .

0|

Actividadespecífica

hígado A 2 cerebro B

Actividadespecífica

FIGURA IV.J.:

O n l 1 1 1 O l n n 1 1

3_ CGTCJZO')C 0’15 sangre D

s s

É2 2010-/o/°\g/ o va s __-- _9____________hn 'oE íz 1 "oaos'<Z <1:

O u 1 I o l I l 1 1

0 1 15 20 0 5 10 15 20tiempo (mln) tiempo (min)

Efecto de Ja administración de Fantasmascargados a animales intoxicados en Formaaguda sobre Ja actividad de rodenasa enhígado (A), verebro (B), corazón (C) ysangre (D).Los animales se intoxicaron con una dosisde cianuro de potasio de 4 mq/kq, i.p., yse trataron con 0,2 ml ti.v.) de fantasmasFGR(rodenasamás tiosulfato): simultánea­mente ( O ) yzllos 5 minutos ( O ) Juego deJa administración deltóxico; saurificándgse a los tiempos indivados luego de Jainyevvión del fantasma.(—-—)Animales intoxivados von vianuro.Los datos qrafivados son el promedio i SDde Jos valores obtenidos con 4 animaleslos valores vonlroles se detallan en Jaleyenda de la Tabla IV.8.Las vondiviones experimentales son lasdesvriptas en el texto.

173

_¡

CD C)

6‘!O

3‘O

NO%hfifibíddn

°/olnhibicio’n

%Inhibición

.__.

1 1 l

15 2010tiempo (min)

Lfovtu de Ja administraciónde fantasmas vnrquduu u unimulus jntuxivudus en formanqudu sobre lu uviividud de(‘it(n‘r(nnu (¡xi(h¡u¡| er» hígfindu(A), vurcbru (H) y vuruzón(l: ).lau rundiviunuu experimentglas y Jus símbolos se detgllun un lu luyundu de luf_uuuwnlv.l. Valures contrgJus y expresión de Jos resultudus se indican en J;leyenda de la Tabla IV.9.

l75

IV.5. CONCLUSIONES

Si bien el porcentaje de enzima atrapada dentro del e­ritrocito se encontraba dentro de Jos valores estimados (2-5 %de la enzima tota] agregada) ( Ihler y col., 1973, 1975), esterendimiento resultó muypobre para utilizarlo en la reacción dedetoxificación.

La unión de larodenasa(7 % a los glóbulos rojos norepresenta un verdadero encapsulamiento sino una unión no-espe­cífica a las membranas de Jos eritrocitos como ocurre con muchasotras proteínas. Se han obtenido datos similares para fantasmasde glóbulos rojos de ratones cargados vonrodenasa (Leung y col.,1986). Estos autores encontraron que la enzima unida a la mem­brana externa del eritrocito era del orden del 5 % y era tan agtiva en metabolizar elcianuro comolo era la enzima encapsuladadentro del Fantasma de glóbulo rojo. Sin embargo, consideraronque la enzima unida externamente no contribuiria al metabolismodel cianuro ya que representa un porcentaje muy inferior al co­rrespondiente a la encapsulada (30 %), y además el donor de azufre se hallaría ubicado intracelularmente.

En términos generales, nuestros resultados están de acuerdo con los obtenidos por Wayy col. (1985), sin embargo nocoincidimos con su idea de que la administración de enzima en­capsulada podría ser una alternativa terapéutica, con buenasposibilidades para antagonizar los efectos tóxicos letales delcianuro. Los datos aquí obtenidos con el modelo animal demues­tran lo contrario. El grupo de Wayno ha publicado aún resulta­dos de ensayos ¿n UÁUO.

IV.6. REFERENCIAS

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75.hnomnt. 5 ,

ESTUDIOS ¿n uLtno

V.J. Rodenasa

V.2. ALA-D

V.3. Citocromo oxidasa

V.4. Conclusiones

V.5. Referenvias

CAPITULO V

Página

177

182

186

190

19]

V. ESTUDIOS ¿n v¿tno

Se decidió estudiar el efecto ¿nuitno de la SAMsobrela actividad de los enzimas rodenasa, ALA-Dy citocromo oxidasade higado de ratones. Para ello las enzimas se incubaron en lascondiciones standard en presencia de distintas concentracionesde SAM(10‘4, 10'3, 10'2 y 10’J mM)y de cianuro de potasio ytiosulfato de sodio J mM,y se midieron las actividades correspondientes. Además, con el objeto de establecer si ocurría alggna alteración de las enzimas por la simple exposición a algunode los compuestos ensayados, se llevó a cabo un estudio compargtivo preincubando cada enzima con cada uno de los mencionadoscompuestos, solos o en conjunto. Los resultados se expresan considerando lÜÜ % al valor de actividad de la enzima incubada opreincubada seúun el caso, sin ninqún agreqado.

V.l. RUDENASA

En la Tabla V.l. se muestran los datos obtenidos cuan­do se agregaron SAM,cianuro y tiosulfato al sistema de incuba­ción. Ninguno de estos compuestos produjo cambios sobre la actividad de rodenasa.

En las experiencias con preincubación, cuando la rode­nasa se preincubó durante 30 minutos a 37 oC sin ningún agrega­do, su actividad disminuyó un 56 % con respecto al control nooreincubado (Tabla V¿g¿j,lo cual podría atribuirse a una desna­turalización pnrcíalde la proteína. Sin embargo, el valor asiobtenido se consideró como dato control (JÜÜ %) para los resul­tados que se muestran en la tiqura V.l.A

Por preincubación condistintas concentraciones de SAMIno se detecto ninqún efecto subrc la actividad enzimática.

La preincubación con cianuro (J mM)solo, produjo unaumento de la actividad del 35 %. LJ agregado de SAMdurante laincubación de la enzima preincubada con cianuro produjo una digminución de la actividad al nivel basal anulando así el efectodel cianuro antes mencionado. Los mismos resultados se obtuvie­ron cuando la enzima se preincubó simultáneamente con cianuro ySAM.Esto suqeriria un posible efecto bloqueante de la SAMsobre

Jos sitios catalíticos de la enzima.

TABLAV.l.: Efecto de SAM,cianuro y tiosulfato sobre laactividad de rodenasa ¿n vitno

ACTIVIDAD ESPECIFICA (%)

SAM (mM) s/aqregado CN‘ (J mM) 5203: (l mM) CN" + 5203=

0 100 lll 87 92

10'“ Joa 9a 93 es

10-3 39 87 86 87

10'2 97 86 86 80

10'J 96 a7 94 96

Las condiciones experimentales se detallan en Materiales yMétodos y en el texto.

TABLAV.Z.: Efecto de la preincubación y de laFiltración en gel de la rodenasapreincubada sobre la actividadenzimática

TRATAMIENTO ACTIVIDAD ESPECIIICA (%)

_ lÜO

Preinrubación30 minutos a 37 0C 44

Preincubación ypasaje por columna 28

Las condiciones experimentales se detallan enMateriales y Métodos y en el texto.

200 í—— A8 f­5150- r

:5 [­oaU'I

o'100---- -- - -—­UmE2¿so­

o H10‘ ¡0’ 104 1o4 KCN' KCN' KCN' = =n n =. -. u

lSAMl'lmM) - o s’o’ 5‘?’ 5‘.“ 5’?“ 5‘95 59’5m SAM' SAM SAM' KCN' KCN' KCN'

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B

a3150­ T9,100................ ——- ...... -- -- - ........... -- - -.D.U10v850..Eï

0SAW "34 ' KC."‘ KQN‘ 5201 5:?!“ 52?? 520? SnOl' SaO!‘

aun SAM' SAM SAM‘ KCN‘ «cho KcÑ'

sÁM sak'

LLGURAV.l.: Lfevto dc la preinvubavión von SAM, via­nuro y/o tiosulfato (A) y posterior Filtración en gelfica de la rodenasa hepátiva.La enzima se preinvubó 50 minutos a

aqreqado de los Compuestos indica(‘on (aldos (‘) y37 "C enagregado de

vaso.cn vada

(B) sobre la actividad especi37 “C

lucqo se invubó 30 minutos alas vondivioncs

los Compuestos espevifivadosstandard con el

Los resultados se expresan vomoporcentgJe de las avtividades espevífi‘as contrg

(———)los de: enzima preinvubada (A), enzima preinvubada y pasada por columna (B).LH lndnn lun vasos cn que sulas runrnntraviunus uliJi/adas¡0-4 10' 10'2 10'J mM,los resultados en una solafueronrimuntalcnMétodos

SO

y cn

(‘() i r|(' i (l(:r1 t (edetallantexto.el

S.

aqrnqó

harra

SAMfueron:

qraficándosevuando

Las vondiviuncs expgcn Materiales y

180

Cuando la enzima se preincubó con tiosulfato J mM hu­bo un aumento de la actividad del 70 %. El agregado de SAMdu­rante la incubación o su preincubación simultánea con el tiosuifate, mantuvieron o aún produjeron una estimulación adicionalalefecto de la preincubación con tiosulfato.

Cuandola rodenasa se preincubó enpresencia de tiosul­fato y cianuro J mMse obtuvo un 34 % de aumento de la activi­dad enzimática, pero el agregado de SAMdurante la incubación alsistema anterior resultó en una drástica inhibición (70 %), yJa preincubación simultánea con Jos tres compuestos inhibió completamente la actividad de esta enzima.

De acuerdo con estos resultados se verificó el efectoprotector ejercido por ambossustratos ya observado anteriormegte (Davidson y Westley, 1965; Wang y Volini, 1968; De Toma yWestley, J970; Vázquez, 1984). Dicho efecto fue mucho más pro­nunciado para el tiosulfato y, en este caso, no se modificó porel agregado de SAM,sugiriendo que no existiría interacción en­tre el tiosulfato y Ja SAM,una vez formado el complejo rodengsa azufre sustituida (Sórbo, 1962; Mintel y Westley, 1966) que

a forma enzimátira de alta actividad.como sc sabe es

Pero en cambiosninhscrvótnurleenzima preincubada con cianuro perdió actividad enprescncia de SAMdurante la preincuba­ción o la incubación. Lsto suqeriria que la SAMejercerIa unaacción bioqueante sobre los sitios cataliticos de la enzima pa­ra la unión del tiosulfato ya que su efecto no pudo manifestarse cuando la enzima fue preincuhada con tiosulfato.

Cuando la enzima se preincubó con ambos sustratos (cianuro y tiosulfato) la actividad aumentó al mismonivel obtenidocontfi:nnu1)solo. ln este caso, el aqreqado de SAMinhibió marcadamentc Ja actividad de rodenasa. Lsto contirmaría nuestra hipÉtesis sobre Ja ‘apacidad de rodenasa para unir primero el sus­t‘ato cianuro, formando una especie enzimática sumamente inestable y de relativa baja actividad (Vazquez, i984). Dicha especiesería muy susceptible a la presencia de SAM,el cual además, impediría Ja unión dei senundo sustrato (tiosuifato‘,y por endeno sólo anuJaría su efecto protector sino que ia reacción totalno tendria lunar, aparentemente Ja SAMtendria aún más afinidadpor los sitios de unión del tiosulfato que el sustrato mismo.

Para comprobar si los efectos de los distintos agrega­dos son de naturaleza reversible o irreversible, se decidió pa

l8l

sar las soluciones enzimáticas luego de la preincubación con cada reactivo o sus mezclas por una columna de Sephadex 6-25 e incubar el eluído obtenido en las mismas condiciones experimenta­les antes mencionadas en este mismocapítulo.

El pasaje por columna de la rodenasa preincubada sin aqregado alguno, produjo una disminución de la actividad aún ma­yor (72 %) (tabla V.2.), ésto podría atribuirse a la separaciónde alguna molécula de bajo peso molecular que Fuera esencial pgra su actividad. A efectos de comparar el comportamiento de laenzima sometida a filtración por gel luego de su preincubacióncon los compuestos indicados, el valor de actividad obtenido enlas condiciones antedichas, se consideró comodato control(lÜÜ %) para los resultados posteriores que se muestran en lai itpirii V.l .Ü.

LI eluído obtenido lueqo de la preincubación con SAMpresentó una actividad de rodenasa disminuida un 33 %; esto pareceria indicar que la SAMpodria star Facilitando la libera­ción y luego pérdida por filtración de algún componente esen­cial para la actividad catalítica.

Cuando la enzima se preincubó con cianuro o tiosulfato(l mM), la actividad enzimática del eluido estaba un 34 %porencima del valor control indicando que cada uno de los sustratos(en ausencia del otro) es capaz de proteger a la enzima, impi­diendo la pérdida.de ese supuesto factor de bajo peso moleculahque se produce durante el pasaje por la columna. Mediante esteensayo se comprobó que tanto la unión del cianuro como izideltiosulfato a la enzima durante la preincubación son irreversi­bles y además, que en su presencia es posible retener la actividad de la enzima preincubada y no sometida al proceso de filtración en qel.

Ln cambio, se obtuvieron resultados muydiferentescuando Ia enzima ae preincubó ya sea con cianuro y SAMo contiosulfato y SAM.Ln este último 'aso no oe detectaron variacionessiqnificativaa respecto de la actividad del eiuído provenientede la preincubación con tioeultato sólo. Sin embarqo, cuando sepreincubó con cianuro y SAM,la especie obtenida presentó unainhibición del 26 %; estos resultados indicarian que la SAMblo­quearia el sitio de unión del tiosulfato y por lo tanto estesustrato podría ocuparlo sólo parcialmente durante la incubación.Lsto no se observó cuando se preincubó con tiosulfato y SAM

182

debido a que ante esta situación de competencia, el sustrato(tiosulfato) ocuparía su sitio impidiendo el bloqueo de la SAM.

Por preincubación con ambos sustratos, la especie enzimática obtenida en el eluido presentó una inhibición del 4l %,lo cual estaria indicando que al Formarse el producto, la enzi­ma quedaria en condiciones similares a las de la enzima libre,en ausencia de agregados, produciéndose entonces la pérdida delcomponente de pequeño tamaño molecular por pasaje por columna.LJ posterior agregado de SAMno modificó esta situación.

Nuestra hipótesis sobre la ‘apacidad bloqueante de laSAMsobre el sitio de unión del tiosultato se corroboró cuandola rodenasa se preincuhó en presencia de este compuesto y ambossustratos. Ll eluido obtenido recuperó la actividad enzimáticabasal. U sea que la SAMal impedir la entrada de tiosulfato a suSitio, destavoreceria la tormación de producto y, de esta mane­ra, seria preponderante el efecto protector de los sustratos Fregte a la pérdida de] compuesto de bajo peso molecular.

V.2. ALA-D

Ln la iiqura V.2. se muestran los resultados obtenidoscuando SAM,cianuro y tioaultato se aureuaron al sistema de in­cubación. la SAMno tuvo ninuún eteclo sobre la actividad deALA-D.LJ cianuro produjo una inhibición del 37 % y el tiosulfato del 96 % sobre la actividad en/imatica. Cuando la enzima seincuhó en presencia de cianuro y tiosultato, la inhibición fuedel orden de la producida por el tiouultato solo. Ln ningún ca­so, la presencia de SAMdurante la incubación modificó la accióninhibitoria de ambos compuestos.

Cuando la en/ima se preincuho durante JD minutos a37 “C sin aureuados (Iahia V.5.l o en presencia de SAM(iiquraV.3.A)- la actividad tue la misma. la preincuhación con cianuroprodujo en cambio una inhibición del 79 %, con tiosulfato del96 % y del 98 % con ambos compuestos (iiqura V.3.A).

LJ simple pasaje por columna de Ja enzima preineubadaprodujo una activación del 82 % (Tabla V.}.): podemos especularque mediante este procedimiento se estaríaiilhninandoalguna mo­lécula inhibitoria presente en el extracto crudo utilizado comofuente enzimáti'a. Lste valor se consideró como JUÜ% para

JB}

expresar Jos resultados posteriores (tiqura V.3.BX

150gruUE8100*" --"'- "' ' ' —-' ' "' ‘ ‘ ' ‘ ' ’ ' - ‘ ‘ ' ' ' ' ‘ ’ ' ' ‘ ' ‘ ‘“"o.mo

Eg 50­.2gaU'<

o l j Í 110' 10- 10' 10' KCN KCN o= 5 o= s = o =[SAM] (li o 57 J 2‘ J 2‘01 sz"

SAM SAM KCN KCNÓ

SAM

tIGURAV.2.: Lfevto de SAM,vianuro y tiouulfato sobre laactividad du AlA-D (n UÍCWU.La enzima so invuhó un lau condiciones standardvon el agregado de los vompucstos especificadosen Wldü wnso.Los resultados no cxprusmn (‘omoporventaje dela avtividad ospcvííiva Control (--- .Ln todos los vanos nn que no aqreqó SAMlas 002ventravionon utili/adau fueron: lU' , JÜ' , JÜ'y IU' mM,qrativandoau los resultados en una ú­ni‘a barra PUHHÚUqurnn voinviduntcs.Las vondivionuu experimentales se detallan en Mgterialcs y Métodos y un cl texto.

La filtración on qcl no rcvirtió el efecto inhibitoriodel cianuro indi'ando quo la unión do esta vompuesto al ALA-D2PUPPCan Forma irrovorsihlv.

LJ cJuído obtenido Iunqn do la protnvubavión con oiang‘asos estudia­ro presentó una inhihivión dul 90 m un todos los

dos, nn ‘ambin la nupnvin uH/¡múli‘a ohtunida lunqo de la preigrubavión von linuultatn, mantuvo su avtividad un ul nivel basal.Lsto reafirma la ¡daa du qua la unión del vianuro von el ALA-D

su realiza un Inrma irrvvnruihlu, un tanto qua la unión del tigsulfato soria reversible.

LJ ALA-Dtiene las ‘aravteristivas de una enzima sul­Fhidriliva (Gibson y vol., 1955; Burnhamy Lasvelles, 1963. Ll

lflú

mecanismo de acción propuesto para esta enzima es a través dela Formación de intermediarios base de Sehiff con el sustrato(Shemin, l976).

Efecto de la preincubación y de laTABLA V.3.:

ALA-DpreincuFiltración en nel delbada sobre Ja actividad enzimática

TRATAMILNTÜ ACÏIVIDAD LSPLCItICA (%

JÜÜ

Preineubaeiónl5 minutos a 37 °C 99

Preineubaeión y182pasaje por columna

Las condiciones experimentales se detallan enMateriales y Métodos y en el texto.

Comose comentara en elCapitulo l de la Introducción(Item 1.5.6.) se sabe que el cianuro inhibe la Formación de complejos intermediarios base de Schiff (Autor y lridovioh, l970),esto justificaria plenamente su acción inhibitoria sobre la agtividad de ALA-D.

Los grupos sulfhidrilos del ALA-Dpueden bloquearse porreactivos especificos que actúan por alquiJación irreversible,unión con un compuesto órqano-metálico de mercurio o por oxida­ción a disulfuros (Batlle y col., 1967; Nandi y col., l968). Seha suqeridn que la enzima requeriría qrupos disulfuro para suzurtividnd manteniendo estos qrupos una estructura proteica espe­cifica y que se necesitaría cierto equilibrio entre los grupostiolen y disulfuro (Batlle y col., 1967).

De esta manera, el presencia de rodenasa,fuente enzimática proviene de un extracto crudo, po­

tioles y disulfuro

tiosulfato endado que ladria alterar el equilibrio entre los gruposprovocando asi una fuerte inhibición del ALA-D.

l85

8 AmEe51 - -- ----------------------------------------------- - ­o

5o650­ÉZyÉ 0 l lw_c—1iir-1 r:j ,_. ,_.

10" 10" 10" 10" KCN' KCN‘ KCN‘ 5,03‘ 5,0," 5,05' s,o;° 5,05' s10,"' O O O 0 Ó Ó O

¡SAW ""M’ SAM SAM' SAM SAM' KCN' KCN’ KCN'Ó ÓaM'

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aw- mN- Km- mu- sp? gq' spy eq' spy gq­. O O O O O ‘

SAM SAM' SAM SAM' KCN' KCN‘ KCN'

MM sw'

FIGURAV.3.: Efecto de la preincubación con SAM,cianuro y/otiosulfato (A) y posterior Filtración en gel (B)sobre la actividad especifica del ALA-Dhepáti­ca.La enzima se preincubó l5minutos a 37 °C von elagregado de los compuestos indicados (*) y lue­go se incubó J hora a 37 oC en las condicionesstandard con cl agregado de los compuestos especificadoscntwuhi‘aso.Los resultados se expresan comoporcentaje delas actividades específicas controles (---) de:en/ima preinvuhada (A), en/ima preinvuhada y panada por columna (H). _Ln todos lea cases en que se aqreqó SAM, lasconcentraciones utili/adas fueron: lU‘ , 10-3,IU'¿ y IU‘l M, qrativándnee loa resultados en“¡un úlltv:1 híH'Fíl vtnnn(h) t1u2rtnl (W)ÍÍH‘Í(ÍCDÍes. LzIScondiciones experimentales se detallan en Mate­riales y Métodos y en el texto.

Los resultados obtenidos en este trabajo no concuerdancon los de Summery Hcyeramann (l984) quienes no hallaron inhibición del ALA-Dni por cianuro nt por tiosulfato. La diferenciapodria deberse al hecho de que estos autores trabajaron con laenzima purificada de hiqado bovino y además, midieron el efecto

l86

de estos aniones luego de activar la enzima por preincubacióncon mercaptoetanol. Ln condiciones experimentales similares alas de los últimos autores, Batlle y col. (1967) obtuvieron unainhibicióndel 20 % del ALA-Den presencia de cianuro de potasiolO mM, y ninguna variación para una concentración J mMde estetóxico.

Paredes (l986) estudió el efecto ¿n uévo de. SAMsobreel ALA-Dinhibida por plomo obteniendo una significativa reactivación de la enzima de hiuado, riñón, bazo y cerebro, observan­do también una disminución de los niveles de plomo. De acuerdoa nuestros resultados la SAMno revirtió ¿n vitnola inhibicióndel ALA-Dproducida por el cianuro y/o tiosulfato, lo que indi­caría que su acción no cs a nivel de Jos sitios catalíticos dela proteina enzimática.

V.3. CÏÏÜCRUMU UXIDASA

En la tiqura V.ú. se muestran los datos obtenidos cuando SAM,cianuro y tiosulfato se agregaron al sistema de incuba­ción. La SAMno produjo ningún efecto sobre la actividad enzimática. Por incubación con cianuro, se detectó una inhibición deun 44 %mientras que el tiosulfato no afectó la actividad de lacitocromo oxidasa. Por incubación de Ja enzima en presencia decianuro y tiosultato oc obtuvo una inhibición del 40 %corres­pondiente a la producida por el cianuro solo. En ninguno de los‘asos el aqreqado dc SAMmodificó estos resultados.

Ls de notar quc quuu dc la preincuhación de la enzimadurantc 15 minutos a 57 “C sin aureqados, la actividad aumen­tó un 88 % (tabla v.a.). Uoopnrotcin y tazarow (1950) hallaronque se producía un aumento cn Ia velocidad de reacción del 45 %cuando se incrementaha la temperatura de 25 “U a 57 “C. Por lotanto, el valor dc actividad obtenido por preincubación se con­siderarí como dato control (JUU %, para los resultados que semuestran en la tiqura V.5.A.

Una vez mas, porpreincubación con SAMno se modificó laactividad enzimática.

El cianuro produjo una inhibición del 95 %, efecto queno fue revertido por el aqreuado de SAMya sea durante la preigcubación o la incubación de la enzima.

l87

_.

C)CDI I l I | l l l 1

'l l l l l l l l I l l l l l l l I I l l l l l l l l l n I l l I n I l l l l

Actividadespecffica(%)3 3

1o" 10" 10'2 10" KCN KCN 520; 520; 520; 5720;M) o o 0 O

[SAM] (m SAM SAM KCN KCN

SAM

LLGHRAV.4.: Lferto de SAM,vianuro y tiosulfato sobre la agtividad de vitooromo oxidasa ¿n u¿tno.La enzima se invubó en las condiciones standardcon el agregado de Jos compuestos especificadosen (Hldü HlSO.Los resultados se expresan como porcentaje dela avtividad especifiva control (---).Ln todos los vasos en que se agregó SAMlas concentraoiones utilizadasfueron: lO" , l0'3, lÜ'Zy lÜ’ mM,qrafieándose los resultados en unaúnica barra cuandofueron coincidentes.Las condiciones experimentales se detallan en Mgteriales y Métodos y en el texto.

La preinvubaeión con tiosulfalo disminuyó levemente laavtividad (20 % ; el aqreqado de SAM(JÜ-J mM)al sistema de igvuhavión produjo una avtivavión del 50 %. Resultados similaressu: (H)S()FV(IPUÍI PIHIH(H) |:I (HI/¡lun sin ¡)r(>ilu‘ulH3 (WJH ti()nliltïlto y

SAM (10", ¡(1' y Iu'l mw.

Cuando la ritorrnmo nxidana un pruinvuhú en presenciadu viunurn y liunullntu nu pruduJu una dinminuviún do Ju autividad del 9| m hevhu que no un ruvirtiú por el uqreqado de SAMdurante la preinvuhavión o Ia invuhaviún de la enzima.

De avuerdo von culuu resultados, ol vianuro produjo uninhibivión de la vituvromo uxidasa del Ab % vuando se agregó alsistema de invubavión y una iahibivión total vuando la enzimase preinvubó 15 minutos en presenvia del túxivo. La acción

188

inhibitoria del cianuro esta perfectamente de acuerdo con el hecho de que este tóxico ejerce su efecto primario sobre la cito­cromo oxidasa, lo cual ya fue demostrado por los estudios ¿n vá¿no sobre la enzima purificada de higado bovino (Antonini ycol., l97l) y de corazón bovino (Hill y Robinson. 1986).Schubert y BFiJJ(J968) encontraron una inhibición total de laenzima de higado de ratón con una concentración de cianuro depotasio de 4,2 x JÜ’2 M y del 50 % cuando la concentración fuede 1,5 x 10-6 M.

ÏAÜLAV.4.: Lfecto de la preincubación y de lafiltración en nel de la citocromooxithlua [)PUÍÍHWlhfldusufl)ro Jíl acti_vidad cn/imatica

IRATAMILNTU AUlthDAD LSPLCIIICA (%)

IÜÜ

Preincuhaciónl5 minutos a 57 UC 188

Preincuhación ypasaje por columna 57

Las condiciones uxpcrimnnlaluu se detallan enMateriales y Mótudaa y cn cl texto.

antídoto man comúnmenteutilixadoLJ tiosultatn ca cpara el tratamiento dc la intoxicación aquda por cianuro. LJ resultado noto sería prcaumihlcmcntc la reducción de la cantidadde cianuro capaz de reaccionar con la citocromo uxidasa y acelgrar la liberación del cianuro unido a la enzima (Schubert yBrill, J968). De los resultados obtenidos se puede observar que¿nuitnoel tiosulfato no es ‘apaz de revertir la inhibición dela actividad enzimática una voz producida por el cianuro.

Ll agregado dc SAMsolo o con ol tiosulfato tampoco“HUJÓ el efecto del cianuro sobre la citocromo oxidasa.

189

4 A

1b F­150"

¡U2É0)

3-1 __. . . . . . . ._. . _. ___ -_.--.-- --._-. . . . . . -­CJ

'Ufl!Es so­U<

0 r‘fi F—1 r-1 [-1 r‘1,ou ¡0-1 10-2104 ucw ucn- hCh' em' 5,0," sp,“ 5305- 5,0," 5,0‘;

¡&W.hm . . . . . . . . .SAM SAM' SAM 3‘. SMTSAM' ' KCN‘ KCN' KCN'1mmw' w o mim4 ° °

¡0-1 4 mM rnM mM mM SAM SAM'M4

fit?É Bfl!.2 __3100- -- - -- -- - ------------- -- -- ----- -- ————-- ----«0CLme;

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0 -. .,...-4 mw atom «Lin 52:5' 525;; S29? 5,0? S20? 5,0,”

sm Sm‘ sw saw KCN' ch xcw9M sw­

tIGURAV.5.: hferto de Ia preinrubavióntonSAM, cianuro y/o

LJ

una inhibivi

tiosulfato (A) y posterior filtrarión UÍIUUJ(U)sobre la avtividad específica de la ritovromo oxi­dasa hepática.La enzima se preinvubó JS minutos a 57 “C ron elagregado de Jos compuestos indicados (') y luegose inoubó lÜ minutos a 37 “C von el aqreqado delos compuestos espevifivados en rada vaso, midiégdose lueqo la artividad espevïtiva de avuerdo vonlo detallado en Materiales y Métodos.Los resultados se expresan roma porvuntaJe de lasavtividades espevítivas controles (—--) de: enzimapreinrubada (A), enzima preinvubada y pasada porvolumna (B).Ln todos los vasos en que se aqruqó SAM, las von­ventraviones utilizadas fueron: 10-4, lU”, JU-2y lÜ’ mM,qrafivandose los resultados en una (ni‘a barra Cuando Fueron voinvidentes.las vondiviones experimentales se detallan en Matoriales y Métodos y en el texto.

pasaje por volumna de lzlenzima preinvubada produjo6} % (tabla V.ü.), esto también podríaón del

l9Ü

deberse a la separación de alguna molécula pequeña esencial pa­ra la actividad de la citocromo oxidasa. Sin embargo, este va­lor se consideró como dato control (100 %) para Jos resultadosque se muestran en la liqura V.5.B.

El pasaje por columna de la enzima preineubada en pre­sencia de SAM,cianuro y tiosulfato solos o en distintas combi­naciones, produjo unaespeeie enzimáti‘a de actividad igual a ladel control. Lstos resultados indicarian que la unión del cianuro a la eitoeromo oxidasa es de carácter reversible, como yafuera reportado (van Buuren y col., l972) y por lo tanto la ac­tividad enzimática inhibida por preincubaeión con este compues­to se restaura debido a la separacióndel complejo cianuro-pro­teína por efecto de la filtración en gel.

V.4. CONCLUSIONES

- Se estudió el efecto ¿n u¿tno de la SAMsobre la actividad delas enzimas rodenasa, ALA-Dy eitoeromo oxidasa.

- LJ efecto protector ejercido por Jos sustratos sobre la acti­vidad de rodenasa se comprobó por preincubación con tiosulfatoo cianuro y Ja naturaleza irreversible de Ja unión de estasmgléculas a la proteina se demostró a través de la técnica defiltración en qel.

Se comprobóque no existía interacción entre el tiosulfato yla SAMuna vez formado el complejo rodenasa azufre sustituida.

- lambión sedemoslró quela SAMbloquearia los sitios de unióndel tiosulfato en Ja rodenasa.

Ll ALA-Dresultó inhibida por cianuro y tiooulfato tanto cuando dichos compuestos se hallaban presentes en el medio de in­cubación, comodurante Ja preincubación. Mediante FiltraciónentuH se comprobó que la unión del cianuro al AIA-D es irrevegsible, en tanto que Ja del tioouliato es reversible.

—la citocromo oxidaoa resultó fuertemente inhibida por incuba­ción o preiucubación por cianuro, efecto que se revirtiócuando dicho compuesto se eliminó a través del pasaje por co­lumna, indi‘ando Ja natU‘aleza reversible de la unión.

- la SAMno tuvo efecto sobre la actividad de] AlA-D ni de Jacilocromo UXidflSH.

V. 5. REFERENCIAS

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ESTUDIOS CINETICOS DL RÜDLNASA HLPATICA

VI.]. Estudios preliminares

V1.2. Curva de saturación

V1.3. Efecto de] cianuro y de] SAM

V1.4. Conclusiones

V1.5. Referenvins

CAPITULO VI

Página

192

192

194

201

202

192

VI. ESTUDIOS CINETICÜS DE RÜDENASA HEPATICA

Los estudios cinéticos realizados con la enzima de hí­gado bovino revelaron que la rodenasa actúa por un mecanismo dedoble desplazamiento, formando un intermediario enzimático azu­fre sustituido (Westley y Heyse, l97l). Mintel y Westley (1966)demostraron que la ruptura de la unión S-S del tiosulfato erael paso limitante de la velocidad total de la reacción de transferencia del azufre del tiosulfato al cianuro, indicando así laexistencia del complejoenzima-tiosulfato cinéticamente significativo. Se ha comprobado que se forman complejos dead-end conambossustratos, tiosulfato y cianuro (Vázquez y col., 1987 a).

Se decidió investigar el efecto ¿n vivo de la intoxicación aguda por cianuro y la posible alteración producida por SAMsobre los parámetros cinéticos de la rodenasa.

VI.l. ESTUDIOS PRELIMINARES

Para estudiar la cinética de la enzima rodenasa en hí­gado se determinó la actividad de dicha enzima en función deltiempo de incubación ([igura V1.1.) . Debido a la linealidad observada en dicho gráfico, se consideró que la velocidad dereacción es directamente proporcional a la formación de produc­to en el tiempo standard de incubación (30 minutos).

Se decidió investigar si existía linealidad entre lzlagtividad de la rodenasa y la concentración de proteína agregadaal sistema de incubación. En la Figura V1.2. se comprueba quelarelación entre dichos parámetros es completamente lineal.

V1.2. CURVA DE SATURACIÜN

Se estudió la variación de la velocidad de Formacióndel producto sulfocianuro en función de la concentración delsustrato variable, manteniendo constante a nivel de saturaciónla concentración del sustrato fijo (50 mML

La figura VI.3. muestra que, tanto para tiosulfato (Li­gura V1.3. A) como para cianuro (Figura V1.3. B), la enzima pre

193

senta un comportamiento michaeliano corroborado por Ja JineaJi­dad de Jos gráficos correspondientes de dob]es recíprocas (Fiqu­ra V1.4. A y B).

16­

12­

ÉU)CJ

"O

8 e­'E3

4­o

0 l l lo zo 40 eo

tiempo (min)

tIGURAVI.J.: Curva dc tiempo.Sc utilizó homogenatodc híqudo dc ratón normal t6,92 mq prot/mJ).La medición de Ja act;vidad se realizó segúnJo detuJJado en Mate­riaJes y Métodos.

También se había uhuvrvudoun comportamiento michaelia­no para Ja enzima de otras fuentes: Eugiena gnacáttó (WatanabeycoJ., 1985), Rp. paüuótfi(5 (Vázquez y 001., 1987 b), riñon de cgnejiJJo de india y rata (Anosike y Jack, 1982), hígado de mono(van Rensburg y Schabort, 1984) y eritrocitos humanos (Vázquezy 001., 1986).

Se obtuvo inhibición para aJtas concentraciones de sustrato (mayores de 50 mM)para e] caso de cianuro variable (¡iqu­ra V1.3. B). Iguajes resultados Fueron reportados para Ja enzi­ma de eritrocitos humanos (Vázquez y coJ., J986).­

194

unidades/ml

0 1 l n l2 3

proteína (mg)

lIGURAVI.2.: Curva de proteína.Se tHiÓ honuulcnat() de hítfildo deratón normal t8,82 mn prot/ml).Las determinaciones experimen­tales se realizaron seqún Jodescripto en Materiales y Métgdos.

VI.3. LÍLCÏÜ DLL CIANURÜ Y DLL SAM

So estudió el efecto por la administración ¡n v¿uo de4 mq/kq ó 20 mq/kg (vía i.p.) de cianuro de potasio en ratonestratados o no previamente con SAM.Paralelamente se realizaronlos mismos estudios en animales normales y ratones tratados sglamento con SAM.Los ratones tratados con cianuro se sacrifica­ron entre JS y 20 minutos después de la inyección, los que rec;bieron SAMsolamente se sacrificaron a la hora y los que recibigron SAMmás cianuro, fueron intoxicados una hora después deJa inyección de SAMy se sacrificaron a los J5-20 minutos.

l l u lo 10 zo 3'0 ¿.0 5'0 " 160 1350 200

[52 O5] (mM)

V B

16­

12­o

8..

4­

0_ I 1 l v l l 1/ l _L lo 1o 20 30 40 50 " 100 150 200

¡IGURA VI.3.:

[CN']

Curva de sustrato: tiosulfato variabley cianuro fijo (50 mM)(A); cianuro varigbJe y tioqufato fijo k50 mM)(B).Se utilizó homogenato de hígado de ratónnorma] (5,65 mg prot/mJ). DetaJJes experlmentajes en MateriaJes y Métodos.

195

l l

-1o - 0,5 / o 0:5 1,0 1,5 2.o

1/ [ 52 031

1/v

Q2

Q1

l

' 10 L " 0,5 O O,5 1,0 1,5 2,0

1/ [CN']

(IGURAVI.ú.: Gráficos de Lincweaver-Uurk.A: concentración de tiosulfato variabJe y concentración de cianuro fijo(50 mM)y B: concentración de ciangro variabJe y de tioqufato fijo(50 mM).La ecuación de Ja recta se obtuvo mgdiante e] metodo de cuadrados mínimos(DA : 0,998, DB = 0,989)

196

l97

A tal efecto, se midió la velocidad de Formación de sulfocianuro variando la concentración de cianuro o tiosulfato ymanteniento la concentración del sustrato fijo en valores cons­tantes y saturantes.

Las Figuras V1.5. y VI.6. muestran los gráficos deLineaweaver-Burkpara tiosulfato y cianuro variables respectivamente. En la Tabla V1.1. se encuentran los valores de las cons­tantes cinéticas hallados.

Estos resultados indican que la rodenasa de hígado deratones tiene mayor afinidad por e] cianuro que por el tiosulfato. También en otros dos mamíferso, conejillo de india y rata,la enzima presentó un perfil similar (Anosike y Jack, 1982).Sin embargo, los datos no coinciden con los encontrados para egta enzima en Fuentes veoetales. Boey y col. (l976) hallaron va­lores dc Kmde JS y 66 mMpara tiosulfato y cianuro respectiva­mente para la enzima de hojas de tapioca, mientras que lomatiy col. (I974) hallaron nn único valor de Kmde 0,4 mMtanto para cianuro comopara tiosulfato para la rodenasa de hojas de rgpollo.

Nooc encontraron variaciones significativas en losKmSobtenidos en los distintos ‘asos estudiados cuando el tio­sulfato actuó comosust‘ato variable. Sin embarqo, se aprecióun relativo aumento cn el valor du este parametro cuando el cianuro se utilizó comosustrato variable, on los ‘asos en que losratones intoxicados o no con cianuro fueron tratados ¿n ULUOcon SAM.Este hallazgo indicaríatnniprobable disminución en laafinidad de esta enzima por el cianuro en presencia de SAM,compuesto que podría actuar como Fuente adicional de azufre.

-o,'5/ o

IlGURA VI.5.:

oÏ5 1,'o 1,5 2,0

1/ [S2o; J

Efecto de Ja intoxicación por cianuro(A: 4 mq/kq, U: 20 mq/kq, i.p.) cn ra­tones tratados (A )()Iu)t O) previa­mcnte con SAM, sobre la velocidad dcreacción de rudenasn dv híqadu utiJizando comosustrato variable tiusullatu y­Cianuro fijo (SU mM).(O ) Animales controles, (A ) ratonesinyectados con SAMsoJu (lb mq/kn, i.p.)Ïodos Jos datos son promedio dc Inn vnlures ubtenidus en A dutvrminuvinnvn,m(p<Ü,ÜJ). Las ecuaciones dc las rectasse obtuvieron mediante e] mótudn dc cuadrndos mínimos. Otros detallvs uxpvri­mentales se describen un c1 tuxtu e cnMateriales y Métodos.

J98

l

¡[CURA VI.6.:

¿y -1,b//-a:5 ol J l I

0,5 2,0

1/ [C N']

20l

Q5/- o1/[CN‘]

Efecto de Jn intoxicación por cianuro LA: ú mq/kq,U: ZU mq/kn, i.p.) en ratones trntznhn; (Á ) o no(O ) previamente con SAM, sobre lu velocidad dereacción de rodenasu de híqudo utiliInndo comosustrato variable cianuro y tioqufnto fijo(BU mM).(O ) Anianes controles, (¿3) ratones inyectadoscon SAMsolo (15 mq/ku, 1.o.)Utros detaJJes experimentales en quuru V1.5.

199

TABLAVL1.: Valores de Vmax y Kmobtenidos para 1a rodenasa de hígado de ratones intoxicados con cia­nuro tratados o no previamente con SAM

Ïioqufato variable CianurovariabJe

Tratamiento Cianuro fijo Ïiosujfato fijo

Vmax Km Vmax Km

ControJ 11,63 4,74 11,23 0,85

+ Cianuro 4 mq/kq 4,11 3,60 6,67 0,73

20 mq/kq 4,03 3,71 10,00 0,70

+ SAM(15 mq/kq) 0,52 3,81 12,35 1,94

+ SAM

+ Cianuro 4 mq/kq 8,23 4,00 12,34 1,57

20 mq/kq 14,29 6,70 11,38 1,59

La concentración de1 sustrato fijo se mantuvo en 50 mMVmax: nmoles SCN'/m1 homogenato x 30 minutos; Km: mMLos datos de Vmaxy Kmse obtuvieron de Jos gráficos deLineweaver-Burk (figuras V1.5. y V:.6.)

200

VI.4. CONCLUSIONES

- Se estudió Ja cinética de Ja enzima rodenasa de hígado de ra­tón.

- La enzima presentó un tipico comportamiento michaejiano obsegvándoss un efecto inhibitorio a altas concentraciones de cia­nuro.

- En eJ caso control, se obtuvo un valor de Kmde 4,74 mMparatioqufato y de 0,85 mMpara cianuro, indicando una mayor afinidad por este último sustrato.

- Por efecto de Ja intoxicación aguda con cianuro (4 mg/kg,20 mg/kg) no se observaron variaciones en Jos valores de Kmobtenidos.

- EJ tratamiento con SAMprodujo un aumento en e] valor de Kmpara cianuro de] 100 %, sin alteraciones en e] valor para tigsulfato.

VI .5. REFERENCIAS

Anosike, E.0. á Jack, A.S. (1982) Enzyme gl, 33.Boey, C.G.; Yeoh, H.H. á Chew, M. Y. (1976) PhytochemistryL2, 1343.Minte], R. á Westley, J. (1976) J. Bio]. Chem. asi, 3381.Ïomati, V;;Matarese, R. á Federici, G. (1974) Phytochemistry¿2, 1703.van Rensburg, L.J. & Schabort, J.C. (1984) Int. J. Biochem.¿g, 547.Vázquez, E.; BuzaJeh, A.M.; Wider, E. ü Batlle, A.M. del C.(1986) IRCS Med. Sci. ¿3, 999.Vázquez, E.; BuzaJeh, A.M.; Wider, E. & Batlle, A.M. de] C.(1987 a) Int. J. Biochem. ¿_, 1199.Vázquez, E.; Buzaleh, A.M.; Wider, E. & Batlle, A.M. de] C.(1987 b) Int. J. Biochem. _2, 1193.Watanabe, E.; Nakano, Y. ú Kitaoka, S. (1985) Agric. Bio].Chem. 52, 2203.WestJey, J. & Heyse, D. (197]) J. Bio]. Chem. 33g, 1468.

CAPITULO VII

CONCLUSIONES GENERALES

Página

VII.J. Referencias 206

VII. CONCLUSIONES GENERALES

La penetración de una droga en eJ organismo puede reaiizarse a través de los epitelios de Ja mucosa y de Ja pie] , sinruptura de Jos mismos, en cuyo caso se trata de vias de absor­ción indirectas 0 mediatas (Zunz, i930); o bien se puede intro­ducir por efracción de dichos epitelios para colocarla ene] si­tio de absorción en cuyo caso se trata de vias directas, inme­diatas (Zunz, 1930) o parenterajes (BonnycastJe, 1969). Por Jotanto, pueden clasificarse ias vias de absorción en:

a) Vias indirectas: mucosas(digestiva, respiratoria, genitourinaria, conjuntival) y pieJ.

b) Vias directas: subcutánea, intramuscujar, intraperitonea],intraósea o intramedular, intracutánea.

Las sustancias inyectadas por via intraperitonea] secncuonlran con una extensa superficie absorbente a través de]fino endotelio del peritoneo, que Forma una membranaJipidieaen contacto con una amplia red ‘apiJar. Se eprica asi, Ja ra­pidez dc la absorción por cata via, mayor que por Ja vIa subcutónca; absorhióndoac Ian miumnusustancia" en ambos casos(littcr, 1980).

Ln o] presunto trabajo nc utililaron las aiquicntesvias de administración dc] cianuro: oral, suhcutánea e intrapgritoneaJ.

Se Joqró inloxicar a loa ratonoo on formo crónica suministrando e] cianuro por via oraJ, confirmando este hecho Josaltos niveles tiquares detectados del tóxico y Ja disminuciónde Ja actividad de citocromo oxidana.

Se estudió Ja dosis óptima do cianuro via subcutóneapara Ja cua] se observaron variaciones sionificativas sobre Josparametros que son afccladou diroctamcnlo (actividad de rodena­sa ycitocromo oxidaoa, conlcnido lioular do cianuro , azufre JÉbil y quFocianuro) o indircctamcnto (actividad de ALA-D)poreste tóxico. Iamhión, ao ¡nvootinó cl licmpo necesario para quedichos parametros rotornaran a Joa vaJoroa controles. En estecaso, se aincó Ja dosis óptima eleqida (4 mq/kq) suministradacada } dias, o sea, antes de que se produjera Ja recuperaciónde los parámetros estudiados a Jos vaJores controles y se ana­

204

lizó la acción producida sobre distintos metabolismos por elcianuro manlenido en un determinado nivel por un período provlongado (30 días). Paralelamente, se investigó la acción de laSAMcomoantídoto, considerando sus propiedades transulfurantes.

Se estudió el efecto de una intoxicación aguda por cignuro via intraperitonea] en una única dosis no letal (4 mg/kg)o letal (20 mg/kg) y la acción.de la SAMsola o en combinacióncon el tiosulfato, sobre las enzimas rodenasa, ALA-Dy citocro­mo oxidasa. Para tener una referencia sobre e] grado de metabolización del tóxico también se midió sulfocianuro en plasma y o­rina.

Se comprobóque el cianuro afecta directa o indirecta­mente el metabolismo de los sulfocompuestos y el de los tetrapirroles; e incluso los resultados aqui obtenidos podrian hacerseextensivos a cualquier metabolismo que involucre mecanismos conintermediarios base de Schiff o bien niveles apropiados de óxi­do reduoción a fin de mantener constante el pool de azufre sul­fano.

Si bien, no siempre se detectó acumulaciónde cianurotisular, y la actividad de rodenasa podia estar o no modificada,en última instancia el contenido de azufre lábil siempre se en­contró alterado. En tejido sanguíneo donde generalmente se re­gistraron niveles altos de cianuro, la actividad de rodenasa nosufrió variaciones pero el pool de azufre sulfano se encontrómuyelevado. Un incremento significativo del azufre sulfano sedebería a un proceso necesario para impedir el aumento de cianuro enel tejido dondeocasionaría anoxia histotóxica, facilitando la conversiónde la enzima a la forma azufre sustituida dealta actividad.

También en este trabajo se comprobó la acción como an­tídoto del tiosulfato pero la SAMno pudo actuar como tal. Solamente cuando la situación es extrema (dosis letal de cianuro) laSAMno puede interferir en la capacidad máxima del tiosulfatocomosustrato donor de azufre para la rodenasa, evitándose deesta manera el efecto inhibitorio de la SAMsobre la actividadenzimática y por lo tanto, la muerte del animal.

Comoconsecuencia de los resultados obtenidos en estetrabajo vuelve a cuestionarse la función primordial de la rodenasa y solamente en los casos extremos de intoxicación se podría

considerar que su rol principal fuera el detoxificante.

LJ encapsulamiento de la enzima junto con su sustrato(tiosulfato) en fantasmas de glóbulos rojos fracasó comoalternativa terapéutica para antagonizar los efectos tóxicos del cignuro, ya que el porcentaje de enzima atrapada en los eritroci­tos fue bajo.

En base a los resultados obtenidos ¿n vivo se decidióinvestigar el efecto ¿n u¿tno de la SAMsobre la actividad derodenasa, ALA-Dy citocromo oxidasa hepáticas. Además, se realizaron estudios sobre el mecanismo de reacción de rodenasa y lasposibles interferencias ejercidas por otros compuestosdonoresde azufre. Se corroboró el efecto protector ejercido por lossustratos (cianuro y tiosulfato) sobre la actividad de rodenasay la naturaleza irreversible de la unión de estas moleculas aJa proteina. Una vez formado el complejo rodenasa azufre susti­tuida no extistia interacción con la SAM,sin embargo este com­puesto bloqueo Jos sitios de unión del tiosulfato sobre la enzima Jihrc. LJ AlA-Dsc inhibió irreversihlcmcntc por cianuro yrevorsiblemente por tiosulfato. Ln cambio, la inhibición de lacitOcromo oxidaaa pa! cianuro, fue de carácter reversible. LaSAMno tuvo cfccto sobre dichas actividades enzimáticas.

Los estudios cinéticos de la enzima rodenasa hepáticarevelaron un tipico comportamiento michaeliano con inhibición aaltas concentraciones de cianuro. La determinación del Kmindi­có que la enzima tenia mayor afinidad por el sustrato aceptor deazufre (cianuro) y la intoxicación aguda con dosis letales o node cianuro, no produjo variaciones sobre este parámetro.

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VII.J. REFERENCIAS

- BonnycastJe, D.D. (1969) en Farmacología Médica (Ed. V.A.DriJJ) 3ra. edición. 1rat.CasL. La Prensa Médica Mexicana,México. p. J7.

- Litter, M. (1980) en Farmacología Experimenta] y Clínica (Ed.EJ Ateneo) 6ta edición. Cap. 4, p. 8].

—Zunz, E. (1930) Eléments de Pharmacodynamic GénéraJe (Ed.Massonet cie.),París.