Pathologie Biologie 60 (2012) 84–90

Article original

Inhibition de l’adherence de Staphylococcus epidermidis sur des surfacesen titane par des polymeres hydrosolubles bioactifs comportant desfonctions sulfonate, phosphate ou carboxylate

Inhibition of Staphylococcus epidermidis adhesion on titanium surface with bioactive

water-soluble copolymers bearing sulfonate, phosphate or carboxylate functions

L. Poussard a,*, C.P. Ouedraogo b, G. Pavon-Djavid c, V. Migonney b

a Departement de chimie, institut Galilee, universite Paris-13, 99, avenue Jean-Baptiste-Clement, 93430 Villetaneuse, Franceb CSPBAT, FRE 3043, institut Galilee, universite Paris-13, 99, avenue Jean-Baptiste-Clement, 93430 Villetaneuse, Francec BPC, Inserm U 698, institut Galilee, universite Paris-13, 99, avenue Jean-Baptiste-Clement, 93430 Villetaneuse, France

I N F O A R T I C L E

Historique de l’article :

Recu le 14 septembre 2009

Accepte le 1 juillet 2010

Mots cles :

Adherence

Staphylococcus epidermidis

Inhibition

Titane

Polymere bioactif

Sulfonate

Carboxylate

Phosphate

Keywords:

Adhesion

Staphylococcus epidermidis

Inhibition

Titane

Bioactive polymer

Sulfonate

Carboxylate

Phosphate

R E S U M E

Les protheses implantees chez l’homme sont parfois sujettes a des infections bacteriennes qui vont

jusqu’a menacer leur perennite. Differentes methodes sont en cours d’etude pour lutter contre ces

infections, parmi lesquelles le greffage sur la surface de la prothese, de polymeres bioactifs, se revele une

solution prometteuse. Ce travail presente l’influence de differents polymeres bioactifs hydrosolubles sur

l’inhibition de l’adherence de Staphylococcus epidermidis a la surface d’echantillons en titane initialement

preadsorbes de differentes proteines. Quelle que soit la proteine etudiee, il est montre que le polymere

bioactif comportant des fonctions sulfonate genere une inhibition de l’adherence de S. epidermidis. Lors

d’une preadsorption de plasma, l’inhibition est de l’ordre de 68 % lorsque la concentration en fonction

sulfonate est de 2,5 mmol/L. Des surfaces de titane greffees par le polymere bioactif ont egalement ete

testees. On retrouve une activite inhibitrice de l’adherence similaire a celle du cas precedent. Ces

resultats preliminaires sont de nature a susciter un interet clinique dans la lutte contre l’infection des

dispositifs medicaux, car ils mettent en evidence un net effet local d’inhibition de l’adherence de S.

epidermidis. Des copolymeres comportant d’autres groupements fonctionnels (phosphate ou carbo-

xylate) ont ete dissous dans une suspension bacterienne afin de determiner l’influence de la composition

sur l’inhibition de l’adherence bacterienne. Les taux d’inhibition obtenus pour ces copolymeres ne sont

pas significativement inferieurs a ceux de l’homopolymere comportant exclusivement des fonctions

sulfonate, tant que la proportion en fonction sulfonate reste superieure a 50 %. La fonction sulfonate est

donc la principale responsable de l’inhibition de l’adherence de S. epidermidis.

� 2010 Elsevier Masson SAS. Tous droits reserves.

A B S T R A C T

Implanted prostheses are sometimes subject to bacterial infections, which can threat their benefit rule

on a long-term basis. Various methods are studied to fight against these infections. Among them, the

grafting of bioactive polymers onto the prosthesis surface shows up as a promising way to the problem of

infections. This work presents the influence of various water-soluble bioactive polymers on the

inhibition of the Staphylococcus epidermidis adhesion on the titanium samples surfaces initially

preadsorbed with various proteins. Whatever the studied protein is, it is shown that the bioactive

polymer containing sulfonate functions generates an inhibition of the adhesion of Staphylococcus

epidermidis. For a plasma preadsorption, the inhibition rate rises up to 68% when the concentration of

sulfonate function is 2.5 mmol/L. Titanium surfaces grafted with the bioactive polymer were also tested.

We find an inhibitive activity of the adhesion close to that of the previous case. These preliminary results

can point up a clinical interest in the fight against the medical devices infection, because they highlight a

* Auteur correspondant.

Adresse e-mail : poussard@univ-paris13.fr (L. Poussard), Graciela@galilee.univ-paris13.fr (G. Pavon-Djavid).

0369-8114/$ – see front matter � 2010 Elsevier Masson SAS. Tous droits reserves.

doi:10.1016/j.patbio.2010.07.004

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clear local effect of S. epidermidis adhesion inhibition. Copolymers containing other functional groups

(phosphate or carboxylate) were dissolved in a bacterial suspension to monitor the influence of the

composition on the adhesion inhibition. Their inhibition rates are not significantly lower than those of

pNaSS homopolymers, as much as the sulfonate function proportion remains higher than 50%. Thus, the

sulfonate function is the main responsible for the inhibition of the S. epidermidis adhesion.

� 2010 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

1. Introduction

Les infections associees a l’utilisation des biomateriauxaboutissent frequemment a l’echec des implants medicaux. Desetudes portant sur des implants explantes ainsi que des etudes invitro ont montre que l’adhesion bacterienne sur les biomateriauxetait une etape importante dans le developpement de l’infection[1]. En effet, les bacteries peuvent s’attacher a la surface desbiomateriaux directement ou par l’intermediaire des proteinesd’adherence. Une fois adherees, leur comportement peut changer.Par exemple, elles peuvent evoluer vers une virulence accrue et/ouune resistance superieure aux mecanismes de defense de l’hote ouaux antibiotiques [2].

Plusieurs etudes sur l’adherence et la colonisation de Staphy-

loccocus epidermidis ont ete menees in vivo et in vitro sur desmateriaux polymeres destines a la fabrication d’implants. Lesconclusions ont revele que la propension de cette bacterie acoloniser ces materiaux est correlee avec sa pathogenicite [3–6].

Beaucoup de microorganismes et en particulier S. epidermidis,une fois adheres, creent des films protecteurs et complexes demucopolysaccharides, connus sous le nom de biofilms, quiaugmentent la stabilite des colonies et pour echapper a reactionimmune de l’hote [7]. Apres formation du biofilm, les bacteriespeuvent s’en extraire pour devenir des satellites libres qui emigrentet s’attachent a d’autres surfaces non colonisees. La structure dubiofilm facilite egalement la communication de cellule-a-cellule,promouvant des changements phenotypiques, l’adaptation contre lareaction immune, cela favorise les processus genetiques de transfertde la resistance aux antibiotiques [8]. Il est tres difficile d’eliminerdes bacteries dans une colonie adherente qui a forme un biofilm carelle devienne refractaire aux antimicrobiens. Parmi les solutionsproposees pour eviter la formation du biofilm, l’elaboration denouvelles surfaces inhibitrices de l’adherence des bacteries a faitl’objet de plusieurs recherches. Differentes approches ont etedeveloppees afin de reduire l’attachement des bacteries auxmateriaux polymeres. En particulier, les techniques d’impregnationdu materiau par des antiseptiques et/ou des antibiotiques ou lesmodifications de surface par greffage chimique ou par incorporationde molecules biologiques telles que l’heparine, permettent d’obtenirune diminution sensible de l’adherence bacterienne [9]. AinsiFrancois et al. montrent l’inhibition de l’adherence de S. epidermidis

par l’heparine et par des polysaccharides sulfates en solution sur dessurfaces de poly(methyle methacrylate) prealablement adsorbeesde fibronectine [10].

Nous avons montre qu’en fonction de leur composition chimique,certains polymeres fonctionnels peuvent avoir un effet d’inhibitionsur l’adherence et la proliferation bacterienne tout en favorisantl’adherence cellulaire [11–14]. Notre travail s’inscrit dans ce cadre, etl’objectif de cette etude est de developper de nouvelles formulationsa usage biomedical permettant de repondre a ces deux criteressuivants : (1) limiter l’adherence bacterienne, (2) conferer un rolebioactif aux biomateriaux implantes vis-a-vis des tissus environ-nants, et notamment les tissus osseux. C’est ainsi que nous avons eteconduit a synthetiser des polymeres porteurs de groupementssulfonate, carboxylate et phosphate et a evaluer leurs proprietes. Parailleurs, le role des proteines plasmatiques a ete mis en evidence parFrancois et al. qui ont demontre l’influence des proteines sur lespremieres etapes de la colonisation bacterienne [15].

Des homopolymeres et copolymeres solubles comportant desgroupements sulfonate, carboxylate ou phosphate ont ete synthe-tises puis purifies et caracterises. La capacite de ces nouveauxpolymeres a inhiber l’adherence de S. epidermidis a ete evaluee surdes surfaces en titane preadsobees de proteines dans l’objectif dese rapprocher de l’environnement physiologique du materiau unefois implante.

2. Materiels et methodes

2.1. Le support en titane

Le titane utilise (purete : 99,7 %, Alfa Aesar GmbH & Co.KG) se presente sous

forme d’une plaque de 200 mm � 200 mm et d’epaisseur 0,5 mm obtenue par

laminage. Des echantillons sont decoupes dans cette plaque, sous forme de pastilles

carrees de 1 cm2 de surface.

Avant toute utilisation, ces pastilles de titane sont soumises a un decapage a

l’acetone afin d’eliminer toute impurete. On procede ensuite a un nettoyage sous

agitation magnetique avec differentes solutions. Le protocole opere est le suivant :

trois fois trois heures dans une solution de NaCl a 1,5 M, trois fois trois heures dans

une solution de NaCl a 0,15 M, trois fois trois heures dans de l’eau distillee, et enfin

trois fois trois heures dans du sulfure de plomb (II) (PbS) sans Ca2+–Mg2+. Les

pastilles sont ensuite sterilisees sous UV pendant 15 minutes par face et conservees

dans du PbS sans Ca2+–Mg2+ sterile a 4 8C.

2.2. Les polymeres

2.2.1. Purification des reactifs

Le styrene sulfonate de sodium NaSS (ACROS ORGANICS), de masse molaire

M = 206 g/mol est purifie par recristallisation dans un melange eau/ethanol 10/

90 en volume. Apres filtration et sechage sous vide, on obtient un solide sous forme

de paillettes blanches. L’acide methacrylique MA (Aldrich) (M = 86 g/mol) est

purifie par distillation a 30 8C. Le methacryloyloxyethyl phosphate (MOEP)

(Aldrich) (M = 210 g/mol) est dissous dans du tetrahydrofurane a une concentration

de 1 mol/L et purifie par passage sur resine afin d’eliminer les inhibiteurs de

polymerisation. Le monomere MOEP n’etant pas soluble dans l’eau sous sa forme

acide, il est neutralise par un exces d’hydroxyde de sodium en solution aqueuse

puis precipite dans l’acetone. La poudre blanche obtenue, de MOEP de sodium

(M = 254 g/mol) est sechee dans une etuve sous vide. Tous ces monomeres sont

finalement conserves a basse temperature (4 8C) avant utilisation.

L’amorceur de polymerisation radicalaire, le 2,2’ azobis[2-(2-imidazolin-2-

yl)propane] dihydrochloride AIPH (WACO), est utilise sans purification prealable.

2.2.2. Synthese du polymere pNaSS et des copolymeres p(MA/NaSS)

et p(MOEP/NaSS)

Le polymere pNaSS, et les copolymeres (PMA/NaSS) et p(MOEP/NaSS) sont

obtenus par polymerisation radicalaire des monomeres introduits en proportion

variable a une concentration totale de 0,7 mol/L dans l’eau bidistillee en presence

d’AIPH selon la methode decrite dans la litterature par Berlot et al. [12]. Apres

16 heures de reaction a 50 8C sous atmosphere d’argon, le milieu reactionnel est

precipite dans l’ethanol. Les polymeres sont recuperes sont forme de poudre blanche

et seches dans une etuve sous vide.

L’utilisation de ces polymeres pour une experimentation biologique requiert une

purification prealable effectuee par dialyse avec des membranes a un seuil de

coupure 1000 g/mol (Spectropor MWCO 1000), qui permettent d’eliminer les

impuretes (monomere residuel et oligomeres). Pour chaque composition de

polymere, une solution a 10 mg/mL est preparee avec du PBS sans Ca2+–Mg2+. Cette

solution est dialysee contre le PBS pendant 9 heures en changeant regulierement le

PBS de dialyse, d’amener le pH de la solution a un pH physiologique de 7,40. La

solution purifiee est finalement passee sur microfiltre (2 mm) pour eliminer tout

residu.

Les compositions retenues sont les suivantes :

� homopolymere pNaSS ;

� copolymere p(MA/NaSS) de composition molaire : 100/0, 50/50 et 20/80 ;

� copolymere p(MOEP/NaSS) de composition molaire : 100/0, 70/30, 50/50 et 30/70

(Fig. 1).

Fig. 1. Structure chimique des polymeres. a : pNaSS, b : p(MA/NaSS), c : p(MOEP/NaSS)

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2.2.3. Determination de la concentration en groupements sulfonate en solution et de la

composition des copolymeres

Afin de determiner avec precision les pertes occasionnees par la dialyse, la

concentration molaire en groupements sulfonate des polymeres mis en solution

dans le PBS est analysee quantitativement par spectrophotometrie UV (Spectro-

metre Lambda 25, Perkin Elmer) a partir de l’absorbance a 261 nm de la fonction

styrene sulfonate en utilisant la loi de Beer-Lambert (equation 1).

A ¼ e:l:C (1)

avec :

� e : coefficient d’extinction molaire (L/mol/cm) ;

� l : trajet optique de la cellule (cm) ;

� C : concentration molaire (mol/L) (Fig. 2).

La mesure de l’absorbance de la fonction styrene sulfonate des copolymeres

permet donc d’en deduire leur composition molaire par rapport aux concentrations

initiales en monomeres introduits. La concentration finale des solutions est ajustee

a une valeur de 5 � 10�5 mol/L de motifs par dilution dans du PBS. Ces solutions sont

ensuite diluees afin d’obtenir les concentrations necessaires aux differents

protocoles operatoires. A titre d’exemple, 50 mL d’une composition sont ajoutes

a 950 mL de suspension bacterienne pour obtenir une concentration finale de

2,5 � 10�6 mol/L de motifs dans la suspension bacterienne (soit une concentration

massique de 0,515 mg/mL).

2.2.4. Greffage de pNaSS sur le titane

Une modification de la surface des echantillons de titane est effectuee par la

methode grafting from (greffage a partir de la surface). Des radicaux peroxyde sont

crees a la surface du titane par un melange acide sulfurique / eau oxygenee selon des

travaux decrits precedemment [16,17]. On ajoute ensuite du monomere NaSS dont

la polymerisation s’effectue a partir des radicaux presents a la surface de

l’echantillon. Les pastilles modifiees sont ensuite rincees avec de l’eau distillee

pour eliminer le monomere residuel et sechees a l’etuve.

Fig. 2. Coefficients d’extinction molaire a 261 nm des copolymeres p(MOEP/NaSS)

en fonction de leur composition.

2.3. Le materiel biologique

2.3.1. Les bacteries

La souche employee est la souche S. epidermidis RP 62 (ATCC 35984), maintenue

en culture sur gelose Mueller Hinton (AES Laboratoire). Un repiquage est effectue

toutes les trois semaines.

Des cultures sont preparees en bouillon de culture frais (Mueller Hinton MH : AES

Laboratoire) et incubees en suspension a 37 8C pendant une nuit. La suspension

bacterienne est centrifugee puis remise en suspension dans un milieu frais. Ainsi,

160 mL de cette suspension sont preleves et ajoutes a 1 mL de bouillon MH puis

incubes a 37 8C pendant trois heures. La suspension bacterienne obtenue est

centrifugee, et les bacteries reprises dans du tampon phosphate (PBS, Invitrogen) avec

Ca2+ et Mg2+ a la concentration de 5 � 106 UFC/mL.

2.3.2. Adherence bacterienne sur le titane

Les echantillons de titane prealablement nettoyes sont places dans des puits

d’une plaque de 24 puits et preadsorbes de proteines. 1 mL d’une solution

d’albumine bovine BSA (Sigma) dans du PBS (0,4 g/L) est ajoute. Les disques de

titane sont incubes 30 minutes a 37 8C sous agitation. Apres trois lavages au PBS,

1 mL d’une des solutions proteiques suivantes : fibrinogene (Fg) bio-transfusion,

300 mg/mL de PBS ; fibronectine (Fn) euromedex, 20 mg/mL de PBS, ou plasma

humain CT hopital Avicenne, est ajoute. Apres une heure d’agitation a 37 8C, l’exces

de proteines est elimine par des lavages au PBS.

Apres l’adsorption de proteines, 1 mL de suspension bacterienne (106 UFC/mL)

est ajoute dans chaque puits en presence ou non de polymeres bioactifs. Les

suspensions etudiees sans polymere servent de reference pour chaque condition

proteique. L’adherence bacterienne est realisee pendant une heure a 37 8C sous

agitation. Chaque experience est effectuee en triplicata.

Le nombre des bacteries adherees sur la surface est evalue par microscopie

(Microscope Axiolab, Zeiss). Les bacteries sont fixees avec une solution de

formaldehyde (4 % en PBS) pendant 30 minutes a 4 8C puis marquees a l’iodure

de propidium (Sigma) pendant cinq minutes.

Les pastilles de titane sont placees entre lame et lamelle et observees a un

grossissement X 100. Quinze photographies sont prises pour chaque condition

experimentale afin de calculer le nombre moyen des bacteries adherees par

centimetre carre de titane.

3. Resultats

3.1. Adherence de Staphylococcus epidermidis sur le titane en

presence de pNaSS

Des proprietes inhibitrices de l’adherence bacterienne ontete rapportees pour des surfaces recouvertes de pNaSS [12,13].L’adherence des S. epidermidis sur les pastilles de titanepreadsorbees de proteines a ete etudiee en absence et enpresence de pNaSS solubles introduits en meme temps que lesinoculum de suspensions bacteriennes. Differentes concentra-tions en fonction sulfonate ont ete etudiees : 0,75 ; 1,5 et2,5 mmol/L. En l’absence de polymere bioactif, l’adherence de S.

epidermidis est la plus elevee lors d’une preadsorption defibrinogene. La presence de polymere pNaSS dans le milieuconduit a une inhibition de l’adherence. En effet, quelle que soit laproteine preadsorbee, une diminution du nombre de bacteriesadherees est constatee lorsque la concentration en pNaSS augmente(Fig. 3). Cependant, cette courbe de dose–reponse se stabilise en unplateau d’inhibition lorsque la concentration en motif styrenesulfonate excede 1,5 mmol/L.

Fig. 3. Adherence de S. epidermidis sur le titane preadsorbe de differentes proteines a

differentes concentrations de pNaSS contenu dans la suspension bacterienne. & :

plasma, � : fibrinogene, D : fibronectine.

Tableau 1Determination de la concentration en pNaSS permettant l’inhibition de 50 % de

l’adherence bacterienne selon la proteine preadsorbee.

Proteines preadsorbees

Plasma Fibrinogene Fibronectine

CI50 de pNaSS (mmol/L de

fonctions sulfonate)

0,62 0,71 1,7

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L’inhibition de l’adherence de S. epidermidis sur la surface dutitane en presence de pNaSS est calculee en effectuant le rapportdes bacteries adherentes pour chaque concentration de polymeresur les bacteries adherentes en absence de polymere. Ladetermination de la concentration du polymere necessaire pourinhiber 50 % des bacteries, CI50, est presentee dans le Tableau 1.

Les resultats montrent que la CI50 du pNaSS en presence de lafibronectine est trois fois plus importante que celles calculeeslorsque le titane est preadsorbe de fibrinogene ou de plasma. L’effetinhibiteur du pNaSS est tres interessant, en particulier dans le casde l’adherence due au fibrinogene, car la litterature a rapporte lapresence de nombreux recepteurs du fibrinogene sur la membraneexterne de plusieurs souches de S. epidermidis [1,18]. Dans la suitede l’etude, nous nous sommes interesses au plasma, qui est unensemble proteique davantage representatif des conditions in vivolors de l’implantation d’une prothese.

Fig. 4. Illustration de l’adherence de S. epidermidis selon la relation entre le polymere bio

(iii) : pNaSS greffe.

3.2. Adherence bacterienne sur le titane non modifie et le titane

greffe par du pNaSS

Le but de cette etude est d’evaluer l’influence de l’activiteinhibitrice du pNaSS en presence de proteines plasmatiques, selonqu’il soit en solution physiologique au contact d’un implant, ougreffe par liaison covalente a la surface de cet implant (Fig. 4).L’adherence de S. epidermidis est evaluee sur des pastilles de titane :(1) non modifiees ; (2) non modifiees en presence de pNaSS dissousdans le milieu d’adherence a une concentration de 2,5 � 10�6 mol/Lde fonctions sulfonate (concentration correspondant au plateaud’inhibition) ; (3) greffees par du pNaSS. Les resultats presentes enFig. 5 montrent que sur le titane fonctionnalise, l’adherence est bienmoindre que sur le titane non modifie. En revanche, l’activiteinhibitrice du pNaSS est similaire que le polymere soit en solution ougreffe a la surface du materiau (Fig. 5).

3.3. Adherence de Staphylococcus epidermidis sur le titane en

presence des copolymeres p(Ma/NaSS) et p(MOEP/NaSS)

Bien que les fonctions sulfonate soient reconnues efficaces pourlimiter l’adhesion bacterienne, elles ne sont pas suffisantes pourjouer plusieurs roles bioactifs. La presence d’autres groupementsfonctionnels dans la composition du polymere est necessaire pourdiversifier les proprietes biologiques et les applications biomedi-cales telle que, par exemple, l’application en orthopedie. A ce titre,des copolymeres p(MA/NaSS) et p(MOEP/NaSS) ont ete testes carles fonctions carboxylate ou phosphate sont susceptibles d’avoirdes interactions avec les tissus vivants, conduisant a ameliorerl’osteointegration d’implants orthopediques. L’impact de la for-mulation des copolymeres sur l’inhibition de l’adherence bacteri-enne a ete etudie. La Fig. 5 presente le pourcentage d’inhibition del’adherence de S. epidermidis en fonction des compositions descopolymeres p(MA/NaSS) et p(MOEP/NaSS) explicites respective-ment par les rapports R et R’ definis en equation 2.

R ¼ ½CO�2 �½CO�2 � þ ½SO�3 �

et R0 ¼ ½PO2�3 �

½PO2�3 � þ ½SO�3 �

(2)

L’adhesion sur des pastilles de titane preadsorbees de plasma aete realisee en presence de differentes formulations de copoly-meres a une concentration molaire en motifs de 2,5 � 10�6 mol/L etcomparee a celle obtenue lors de la presence de l’homopolymerepNaSS servant de reference (pourcentage d’inhibition de l’adhe-rence bacterienne : 68 � 3 %). Les resultats montrent une memetendance generale qui est une faible diminution de l’inhibition del’adherence lorsque la teneur en fonctions phosphate ou carboxylate

actif pNaSS et l’echantillon en titane. (i) : absence de pNaSS, (ii) : pNaSS en solution,

Fig. 6. Inhibition de l’adherence de S. epidermidis sur le titane preadsorbe de plasma

a une concentration de 2,5 � 10-6 mol/L de motifs de differentes compositions de

copolymeres. D : p(MA/NaSS), * : p(MOEP/NaSS).

Fig. 5. Nombre moyen de bacteries adherentes (� deviation standard, n = 15), en

presence de plasma, sur le support en titane selon la nature de la liaison avec le pNaSS.

Etude statistique par test Anova, * : p < 0,01.

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augmente. Ce resultat incombe a la diminution de la teneur enfonction sulfonate et corrobore les resultats precedents avec unediminution de l’inhibition lorsque la concentration en fonctionsulfonate est moindre, tant que l’on n’atteint pas le plateaud’inhibition.

Quelle que soit la composition des copolymeres etudies, on peutconsiderer que l’inhibition de l’adherence bacterienne n’est passignificativement plus basse que celle du pNaSS, tant que laproportion molaire en fonction sulfonate reste superieure a 50 % (R

ou R’ inferieur a 0,5). Ainsi, les compositions de copolymerespresentant une proportion minimale de 50 % de fonctions sulfonatepresentent un interet therapeutique certain, car ils sont suscep-tibles d’exercer a la fois une activite antibacterienne similaire acelle du pNaSS, et de promouvoir une autre activite biologiquegrace aux autres groupements fonctionnels qu’ils possedent(Fig. 6).

4. Discussion

L’infection sur materiau implante represente actuellement unprobleme de sante publique. Differentes approches ont etedeveloppees afin de reduire l’attachement des bacteries aux

materiaux, premiere etape de la colonisation de l’implant.L’inhibition de l’adherence bacterienne par des techniquestraditionnelles d’impregnation de materiaux a ete largementreportee dans la litterature [19,20]. L’approche effectuee lors dece travail est differente et consiste a introduire une chaınemacromoleculaire comportant des groupements fonctionnelsbioactifs, tels les fonctions sulfonate. En effet, ces fonctions ontmontre leur efficacite dans l’inhibition de l’adherence bacterienne[11,14].

L’objectif de ce travail a ete d’etudier l’activite de polymeres,comportant en sus des groupements sulfonates (SO3

�), desfonctions carboxylate (COO�) et/ou phosphate (PO4

2�), vis-a-visde l’inhibition de l’adherence de S. epidermidis sur le titane enpresence de proteines plasmatiques. Le titane constitue unmateriau de choix utilise dans la confection de nombreuxdispositifs medicaux, comme les implants biomateriaux metal-liques orthopediques et dentaires.

Le choix de pre-absorber nos pastilles de titane par desproteines plasmatiques permet de se rapprocher de la situation invivo. Il est admis que ces proteines participent a l’interactioncellules/biomateriaux, comme l’ont demontre Jarvis et Bryersconcernant la fibronectine [21]. En effet, tres rapidement apresl’implantation, les proteines presentes dans le plasma et lesliquides inflammatoires s’adsorbent a la surface de l’implant. Lesgroupes chimiques presents a la surface de l’implant interagissentavec les proteines du milieu environnant et ces interactionspeuvent s’averer irreversibles et conduire a une perte de l’activitebiologique des proteines adsorbees. Parmi ces proteines, lefibrinogene est present dans le plasma a une concentration de3 mg/mL et son adsorption a ete largement documentee [22]. Lesrecepteurs du fibrinogene, appeles clumping factor (Clf) A et Bjouent un role central dans la colonisation de l’implant par S.

epidermidis pouvant generer des infections prejudiciables aupatient [2,18,23]. Un traitement de la surface de l’implant pardu pNaSS serait alors pertinent pour limiter le risque d’adherence,dans l’hypothese ou son interaction rapide avec les proteineslimiterait la disponibilite des sites de reconnaissance par lesadhesines des bacteries.

Le test d’adherence en incubant du pNaSS en solution en memetemps que les bacteries sur les pastilles de titane a presente desresultats tres interessants. En effet, quelle que soit la nature desproteines preadsorbees, une baisse du nombre de bacteriesadherees est observee lorsque la concentration en polymere,introduit simultanement aux bacteries, augmente. Ainsi, le pNaSSest tres actif vis-a-vis de S. epidermidis en presence de plasma : saconcentration inhibitrice (CI50) est de l’ordre de 0,62 mmol/L demotifs (soit une concentration massique de 0,130 mg/mL, sig-nificativement moindre que celles des autres proteines testees,notamment la fibronectine. L’activite inhibitrice de l’adherencebacterienne de ces copolymeres anioniques peut etre comparee acelle de polymeres comportant des fonctions ammonium quater-naire, couramment utilises pour leur activite biocide. Le moded’action de ces materiaux cationiques est cependant different, carl’activite biocide est due a l’adsorption des fonctions ammoniumquaternaire sur la surface anionique de la bacterie. Les groupe-ments ammonium migrent ensuite a l’interieur des membranescytoplasmiques et provoque sa lyse, ce qui engendre la mort de labacterie [24]. La longueur de chaıne des groupements alkyle portespar l’ammonium quaternaire exerce un role important surl’activite biocide. Comme l’ont rapporte Eren et al. concernantl’activite antibacterienne de polynorbornenes hydrosolublescomportant des ammoniums quaternaires avec des chaınes alkylesde differente longueur, l’inhibition de la proliferation bacterienneest la plus importante lorsque les chaınes alkyles possedent plus desix carbones [25]. Les auteurs ont alors releve une inhibition de90 % de la proliferation bacterienne pour des concentrations en

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polymeres de l’ordre de 10 mg/mL. Dans le cas de notre etude, uneinhibition de 50 % de l’adherence est obtenue pour uneconcentration 20 fois inferieure. Ainsi, bien que les parametresetudies ne soient pas les memes, cette comparaison souligne uneactivite antibacterienne des copolymeres que nous avons synthe-tises a tres faible concentration. En outre, on evite le manque deselectivite souligne par Eren dans le cas des ammoniumsquaternaires a longue chaıne alkyle qui s’averent egalement etrecytotoxiques [25].

Les copolymeres, p(MA/NaSS) et p(MOEP/NaSS), ont ete testesselon le meme protocole experimental que celui applique au pNaSSen solution quant a leur activite sur l’adherence de S. epidermidis enpresence de plasma. Les fonctions phosphate ont deja ete etudieespar Jung [26] qui a modifie du chitosane en lui greffant du MOEP. Ils’est avere que ces materiaux presentaient une activite anti-microbienne superieure a 95 %, significativement augmentee parrapport a celle du chitosane deacetyle. Ceci justifie la pertinencedes fonctions phosphate pour une eventuelle application anti-bacterienne. Les copolymeres comportant en partie des fonctionscarboxylate ou phosphate induisent une inhibition similaire maislegerement inferieure a celle calculee pour le pNaSS seul. Il suffitcependant de conserver un minium de 50 % de fonctions sulfonatedans la composition des copolymeres pour conserver uneinhibition du meme ordre de grandeur que la reference pNaSS.L’interet du couplage des groupements sulfonate avec lesgroupements carboxylate et/ou phosphate est d’avoir acces ad’autres proprietes bioactives comme l’osteointegration, et doncde cumuler plusieurs proprietes au sein d’un meme materiau.

L’objectif final en termes d’application biomedicale est defonctionnaliser la surface d’un implant par des polymeresbioactifs. Le greffage du polymere pNaSS sur le titane par lamethode de Mayingi et al. permet de generer une surfaceprovoquant une inhibition de l’adherence de S. epidermidis

sensiblement amelioree par rapport a celle obtenue lors de l’ajoutdu polymere en solution [17]. L’explication proposee releve du faitque les conformations proteiques sont modifiees par la presencedes groupements fonctionnels jouant un role sur les sites dereconnaissance des proteines. Dans le cas du greffage, le polymerepresentant des groupements ioniques est lie par une liaisoncovalente a la surface du titane, ce qui permet un bon controle del’adsorption des proteines, alors que dans l’autre cas, le polymereen solution n’est pas stabilise sur le titane. Comme la reponsebiologique depend de la conformation des proteines preadsor-bees, toute modification chimique sciemment choisie de lasurface peut generer une activite anti-adhesive et/ou anti-proliferative vis-a-vis des bacteries.

5. Conclusion

L’objectif de cette etude etait d’etablir et d’evaluer l’activiteinhibitrice de differents polymeres bioactifs vis-a-vis de l’adhe-rence de S. epidermidis sur une surface en titane modelisant unimplant. Les experiences in vitro ont principalement ete meneesavec le pNaSS, polymere de reference de l’etude, les fonctionssulfonate etant reconnues pour leur activite anti-bacterienne. Dece travail, il ressort que les fonctions ioniques bioactives sontsusceptibles de reagir avec les proteines en bloquant certains deleurs sites avec lesquels S. epidermidis interagit normalement.L’interaction bacteries – biomateriaux via les proteines peut ainsietre limitee, comme il est montre avec succes avec toutes lesproteines etudiees, et particulierement le fibrinogene, proteinereconnue pour posseder de nombreux recepteurs de fixation de S.

epidermidis.Des tests menes avec le plasma sanguin, representatif de

l’ensemble proteique in vivo, ont mis en evidence l’activiteinhibitrice du pNaSS que celui-ci soit dissous dans la suspension

bacterienne ou greffe a la surface de l’implant. Des etudes restentcependant a realiser afin d’evaluer l’activite inhibitrice despolymeres sur d’autres souches bacteriennes notamment cellesproductrices de slime impliquees dans les infections sur corpsetranger. La possibilite de fonctionnaliser la surface d’un implantpar un polymere bioactif ouvre une nouvelle voie prometteusepour un traitement local susceptible de limiter les infectionsnosocomiales.

Enfin, des etudes ont ete effectuees avec des copolymeresp(MOEP/NaSS) et p(MA/NaSS) comprenant respectivement desfonctions phosphate ou carboxylate en sus des fonctionssulfonate. Il a ete montre que l’activite inhibitrice de l’adherencebacterienne est proche de celle du pNaSS, tant que la proportionmolaire de fonctions sulfonate de ces copolymeres reste supe-rieure a 50 %. On peut ainsi envisager le greffage de nouveauxcopolymeres pouvant exercer plusieurs activites bioactivessimultanees, telle une amelioration de l’osteo-integration del’implant generee par les fonctions phosphate en outre del’activite inhibitrice de l’adherence bacterienne provoquee parles fonctions sulfonate.

Declaration d’interets

Les auteurs declarent ne pas avoir de conflits d’interets enrelation avec cet article.

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