1434921(19)中華民國智慧財產局

f (12)發明說明書公告本 (11)證書號數：TW 1434921 B

Property (45)公告日：中華民國103 (2014)年04月21日Orhce

(21)申請案號：099119620 (22)申請日：中華民國99 (2010)年06月15日

(51)Int. C1. ： C10G50/00 (2006.01) C07C2/46 (2006.01)C07C11/18 (2006.01) C12N15/63 (2006.01)

(30)優先權：2009/06/17 美國 61/187,959

(71) 申請人：戴尼斯科美國公司(美國)DANISCO US INC. (US)美國

(72) 發明人：麥奧利菲 喬瑟夫C MCAULIFFE, JOSEPH C. (AU)；派拉莫諾夫 賽吉E

PARAMONOV, SERGEY E. (RU)；山佛 卡爾 J SANFORD, KARL J. (US)(74)代理人：陳長文

(56)參考文獻：

TW 200925264A審查人員：李嘉修

申請專利範圍項數：27項 圖式數：328 共0頁

(54)名稱

從生物異戊二烯組合物製造燃料成分之方法及系統

METHODS AND SYSTENS FOR PRODUCING FUEL CONSTITUENTS FROM BIOISOPRENECOMPOSITIONS(57)摘要

本發明提供使用源自可再生碳之生物異戊二烯製造多種煙燃料及燃料添加劑之方法、組合物及

系統。

The invention provides for methods, compositions and systems using bioisoprene derived from renewable carbon for production of a variety of hydrocarbon fuels and fuel additives.

1434921TW 1434921 Β

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六、發明說明：

本申請案主張2009年6月17 0申請之美國臨時專利申請

案第61/187,959號之優先權，該案之揭示內容以全文引用

的方式併入本文中。

【先前技術】

可再生運輸燃料之發展為21世紀之關鍵挑戰之一。當前

市場上主要為源自蔗糖及澱粉之酵母醱酵的乙醇，且較小

部分為源自三酸甘油酯之生物柴油（脂肪酸酯）。乙醇之限

制在於作為液體燃料，相對於煙具有較低能量密度。另

外，乙醇因其對水之親和力及腐蝕性質而不可在習知基礎

結構中運輸。使可再生碳源（生質、糖、油）轉化成蛭燃料

之製程提供具吸引力的生物乙醇替代物。

異戊二烯（2-甲基-1,3-T二烯）為主要用於製造合成橡膠

之關鍵的工業化學品。當前，異戊二烯係直接地藉由石腦

油及其他輕質石油餾份裂化或間接地經由化學合成而源自

石 化來源（參見，例如 H. Pommer 及 A. Nurrenbach, Industrial Synthesis of Terpene Compounds, Pure Appl. Chem., 1975, 43, 527-551 ； Η. M. Weitz及 E. Loser, Isoprene, Ullmann's

Encyclopedia of Industrial Chemistry，第 7版，Electronic Release, Wiley-VCH Verlag GMBH, Weinheim, 2005 ；及

H.M. Lybarger, Isoprene in Kirk-Othmer Encyclopedia of

Chemical Technology » 第 4版，Wiley, New York （1995）, 14,

934-952）。所得粗異戊二烯流通常經歷大量純化製程以移

除眾多化學上類似之雜質，其中許多雜質可干擾異戊二烯

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後續轉化成聚合物及其他化學品。

相比之下，源自生物來源之異戊二烯含有極少螟雜質，

且代之以含有許多氧化化合物，諸如乙醇、乙醛及丙酮。

許多此等化合物可藉由與水接觸或通過氧化鋁或其他吸附

劑而輕易地移除。

工業上依賴於石化原料來製造異戊二烯，且在異戊二烯

可轉化成聚合物及其他化學品之前需要大量純化組列。需

要具成本效益之方法，以利用生物異戊二烯之高純度及/

或獨特雜質概況將以生物方法製造之異戊二 烯轉化 成有價

值之化學產品。

本文中所引用之所有專利、專利申請案、文獻及論文皆

以全文引用的方式併入本文中。

【發明內容】

揭示自高純度異戊二烯製造燃料成分之方法及系統，及

自高純度異戊二烯製造之燃料組合物。

在一態樣中，本發明提供一種自生物異戊二烯組合物製

造燃料成分之方法5其包含使生物異戊二烯組合物中大部

分異戊二烯化學轉化成非異戊二烯化合物。在一實施例

中，藉由使生物異戊二烯組合物經受適於異戊二烯二聚化

之熱或催化條件以製造異戊二烯二聚體，接著催化氫化該

異戊二烯二聚體以形成飽和C10燃料成分而使該生物異戊

二烯組合物發生化學轉化。在另一實施例中，如下使生物

異戊二烯組合物發生化學轉化:(i)部分地氫化生物異戊二

烯組合物以製造異戊烯，(ii)使異戊烯與選自由異戊烯、

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丙烯及異丁烯組成之群的單烯煙二聚化以形成二聚烯

（dimate），及（iii）完全氫化二聚烯以製造燃料成分。在一些

實施例中，在化學轉化期間生物異戊二烯組合物中至少約

95%之異戊二烯轉化成非異戊二烯化合物。在一些實施例

中，將生物異戊二烯組合物加熱至約150°C至約250°C以製

造不飽和環狀異戊二烯二聚體且催化氫化該不飽和環狀異

戊二烯二聚體以製造飽和環狀異戊二烯二聚體燃料成分 。

在一些實施例中，該方法包含：（i）使生物異戊二烯組合物

與催化劑接觸以催化異戊二烯環二聚化，從而製造不飽和

環狀異戊二烯二聚體；及催化氫化該不飽和環狀異戊二烯

二聚體以製造飽和環狀異戊二烯二聚體燃料成分。在一些

實施例中，催化異戊二烯環二聚化之催化劑包含選自由鎳

催化劑、鐵催化劑及鎔催化劑組成之群的催化劑。在一些

實施例中，部分地氫化生物異戊二烯組合物之步驟包含使

該生物異戊二烯組合物與氫氣及催化異戊二烯部分氫化之

催化劑接觸。在一些實施例中，催化異戊二烯部分氫化之

催化劑包含鈕催化劑。在一些實施例中，使異戊烯與單烯

煙二聚化之步驟包含在催化單烯煙二聚化之催化劑存在下

使異戊烯與單烯煙接觸。在一些實施例中，催化單烯煙二

聚化之催化劑包含酸催化劑。在一些實施例中，該方法進

一步包含在使生物異戊二烯組合物化學轉化成燃料成分之

前自該生物異戊二烯組合物純化異戊二烯。

在一態樣中，本發明提供一種自生物異戊二烯組合物製

造燃料成分之系統，其中該生物異戊二烯組合物中大部分

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異戊二烯化學轉化成非異戊二烯化合物，該系統包含生物

異戊二烯組合物，及(a)(i) 一或多種能夠使生物異戊二烯組

合物中之異戊二烯二聚化之化學品，或能夠使生物異戊二

烯組合物中之異戊二烯二聚化之熱源，及(ϋ)能夠氫化異 .

戊二烯二聚體以形成飽和C10燃料成分之催化劑；或(b)(i): 能夠部分地氫化生物異戊二烯組合物中之異戊二烯以製造

異戊烯之化學品，(ii)能夠使異戊烯與選自由異戊烯、丙

烯及異丁烯組成之群的單烯煙二聚化以形成二聚烯之化學

品，及(iii)能夠完全氫化二聚烯以製造燃料成分之化學

品。

在該系統之一些實施例中，生物異戊二烯組合物包含大

於約2 mg之異戊二烯，且以組合物中所有C5煙之總重量

計，包含大於或約99.94重量％之異戊二烯。在該系統之一

些實施例中，一或多種能夠使異戊二烯二聚化之化學品包

含催化異戊二烯環二聚化之催化劑，該催化劑包含選自由

釘催化劑、鎳催化劑、鐵催化劑及鎔催化劑組成之群的催

化劑。在該系統之一些實施例中，氫化不飽和異戊二烯二

聚體之催化劑包含選自由鈕催化劑、鎳催化劑、釘催化劑

及錢催化劑組成之群的催化劑。在該系統之一些實施例

中，能夠部分地氫化異戊二烯之化學品包含鈕催化劑。在

該系統之一些實施例中，能夠使異戊烯與單烯煙二聚化之

化學品包含酸催化劑。

在一態樣中，本發明提供一種包含由本文所述之方法製

造之燃料成分的燃料組合物。在一些實施例中，燃料組合

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物實質上不含異戊二烯。在一些實施例中，燃料組合物之

嵌3。值大於-22%o或在-32%o至-24%。之範圍內。

在一些態樣中，本發明提供一種自異戊二烯製造燃料成

分之系統，其包含：（a）工業上有益量之高純度異戊二烯 ；

及（b）自高純度異戊二烯之至少一部分製造的燃料成分；其

中該工業上有益量之高純度異戊二烯之至少一部分經歷化

學轉化。

在該系統之一些實施例中，工業上有益量之高純度異戊

二烯包含大於約2 mg之異戊二烯，且以組合物中所有C5煙

之總重量計'包含大於或約99.94重量％之異戊二烯。在一

些實施例中，工業上有益量之高純度異戊二烯包含大於約

2 mg之異戊二烯，且包含一或多種選自由乙醇、丙酮、C5 異戊二烯醇及具有10個或10個以上碳原子之類異戊二烯化

合物組成之群的化合物。在一些實施例中，工業上有益量

之高純度異戊二烯包含大於約2 mg之異戊二烯'且包含一

或多種選自由以下組成之群的第二化合物：乙醇、丙酮、

甲醇、乙醛、甲基丙烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯

基環氧乙烷、順-3-甲基-1,3-戊二烯及反-3-甲基-1,3-戊二

烯、C5異戊二烯醇、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2,4,5- 三甲基。比咤、2,3,5-三甲基。比嗪、香茅醛（citronellal）、甲

硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、雙乙醯、2-丁酮、2-甲基-3-丁

烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3 -甲基-1-丁醛、3- 甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、異丁酸乙

酯、3 -甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3 -甲基丁酯、乙酸

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3 -甲基-3-丁烯T -基酯、乙酸3 -甲基-2 -丁烯T -基酯、3 -己

烯-1-醇、乙酸3 -己烯-1-基酯、檸檬烯（limonene）、香葉醇

（geraniol）（反-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇）、香茅醇

（citronellol）（3,7 -二甲 基-6-辛烯-1-醇）、（E）-3,7 -二甲 基-

1,3,6-辛三烯、（Z）-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯及2,3-環庚烯

醇毗咤；其中該第二化合物之量相對於該異戊二烯之量為

大於或約0.0 1 %（w/w）。在一些實施例中5工業上有益量之

高純度異戊二烯包含大於約2 mg之異戊二烯，且包含小於

或約0.5卩g/L之化合物（組合物中抑制異戊二烯聚合之任何

化合物）。在一些較佳實施例中，工業上有益量之高純度

異戊二烯係由生物過程製造。

在系統之一些實施例中，燃料成分包含一或多種選自由

以下組成之群的化合物：環狀異戊二烯二聚體及三聚體、

線性異戊二烯寡聚物、芳族及脂環族異戊二烯衍生物及氧

化異戊二烯衍生物。在一些實施例中，氧化異戊二烯衍生

物為選自由源自異戊二烯之醇、酮、酯及醍組成之群的化

合物。

在一些實施例中，燃料成分包含環狀異戊二烯二聚體，

且化學轉化包含異戊二烯二聚反應。在一些實施例中，藉

由加熱工業上有益量之高純度異戊二烯進行二聚反應。在

一些實施例中，異戊二烯二聚反應製造包含不飽和異戊二

烯二聚體之產物，且化學轉化進一步包含不飽和異戊二烯

二聚體之氫化反應。在一些實施例中，系統進一步包含催

化不飽和異戊二烯二聚體之氫化反應的催化劑。在一些實

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施例中-催化不飽和異戊二烯二聚體之氫化反應的催化劑

包含選自由鈕催化劑、鎳催化劑、釘催化劑及錢催化劑組

成之群的催化劑。

在一些實施例中，藉由使工業上有益量之高純度異戊二

烯與催化異戊二烯環二聚化之催化劑接觸來進行二聚反

應。在一些實施例中，催化異戊二烯環二聚化之催化劑包

含選自由釘催化劑、鎳催化劑、鐵催化劑及鎔催化劑組成

之群的催化劑。在一些實施例中，催化異戊二烯環二聚化

之催化劑為鎳催化劑，且燃料成分包含異戊二烯之一或多

種八員環二聚體。

在一些實施例中，燃料成分包含異戊二烯之線性及/或

環狀三聚體，且化學轉化包含異戊二烯之催化三聚。

在一態樣中，本發明提供一種自異戊二烯製造燃料成分

之方法，其包含：（a）獲得工業上有益量之高純度異戊二

烯；及（b）使該工業上有益量之高純度異戊二烯之至少一部

分化學轉化成燃料成分。在一些實施例中，工業上有益量

之高純度異戊二烯包含生物異戊二烯。

在一些實施例中，工業上有益量之高純度異戊二烯係由

包含以下之步驟獲得：（i）在適於製造異戊二烯之培養條件

下培養包含編碼異戊二烯合成酶多肽之異源核酸的細胞 ，

其中該等細胞（1）製造大於約400 nmol/gwcm/h之異戊二烯，

（2）使細胞自細胞培養基中消耗之碳有超過約0.002莫耳%

轉化成異戊二烯，或（3）使異戊二烯之平均體積生產力大於

約0.1 mg異戊二烯/L培m/h ；及（ii）製造異戊二烯。在一些

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實施例中，細胞進一步包含編碼異戊二烯合成酶多肽或

MVA途徑多肽之異源核酸。

在本文所述方法之一些實施例中，使工業上有益量之高

純度異戊二烯之至少一部分化學轉化成燃料成分包含：（D 將工業上有益量之高純度異戊二烯加熱至約1 50°C至約

250°C ； （ii）使工業上有益量之高純度異戊二烯之至少一部

分轉化成不飽和環狀異戊二烯二聚體；（带）氫化不飽和環

狀異戊二烯二般體以製造飽和環狀異戊二烯二聚體；及

（iv）製造燃料成分。在一些實施例中'工業上有益量之高

純度異戊二烯中至少約20%至約100%之異戊二烯轉化成不

飽和環狀異戊二烯二聚體。

在方法之一些實施例中，使工業上有益量之高純度異戊

二烯之至少一部分化學轉化成燃料成分包含：（i）使工業上

有益量之高純度異戊二烯與催化異戊二烯環二聚化之催化

劑接觸；（ii）使工業上有益量之高純度異戊二烯之至少一

部分轉化成環狀異戊二烯二聚體；及（iii）製造燃料成分°

在方法之一些實施例中，使工業上有益量之高純度異戊

二烯之至少一部分化學轉化成燃料成分包含：（i）使工業上

有益量之高純度異戊二烯與催化異戊二烯環二聚化之催化

劑接觸；（ii）使工業上有益量之高純度異戊二烯之至少一

部分轉化成不飽和環狀異戊二烯二聚體；。订）氫化不飽和

環狀異戊二烯二聚體以製造飽和環狀異戊二烯二聚體；及

（iv）製造燃料成分。在方法之一些實施例中5催化異戊二

烯環二聚化之催化劑包含選自由鎳催化劑、鐵催化劑及络

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催化劑組成之群的催化劑。

在方法之一些實施例中，使工業上有益量之高純度異戊

二烯之至少一部分化學轉化成燃料成分包含：⑴使高純度

異戊二烯組合物與催化劑系統接觸；（ii）使起始異戊二烯

組合物之至少一部分轉化成不飽和異戊二烯二聚體及/或

三聚體；及（iii）氫化不飽和二聚體及/或三聚體以製造飽和

C10及/或C15煙。

在一些實施例中，自異戊二烯製造燃料成分之方法包

含：（a）獲得工業上有益量之本文所述之任何高純度異戊二

烯起始組合物；（b）使起始異戊二烯組合物之至少一部分轉

化成氧化異戊二烯衍生物；及視情況，（c）氫化任何不飽和

氧化異戊二烯衍生物以製造飽和氧化物（oxygenate）。在一

些實施例中，氧化異戊二烯衍生物為選自由源自異戊二烯

之醇、酮、酯及醍組成之群的化合物。

在一些實施例中，本文所述之任何方法均進一步包含在

使工業上有益量之高純度異戊二烯之至少一部分化學轉化

成燃料成分之前，純化該工業上有益量之高純度異戊二

烯。

在一態樣中，提供一種自異戊二烯製造燃料成分之連續

製程，其包含：（a）連續製造工業上有益量之高純度異戊二

烯；及（b）連續使該工業上有益量之高純度異戊二烯之至少

一部分化學轉化成燃料成分。在一些實施例中，工業上有

益量之高純度異戊二烯包含含異戊二烯之氣相。在一些實

施例中，該方法進一步包含將包含異戊二烯之氣相通至使

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工業上有益量之高純度異戊二烯之至少一部分化學轉化成

燃料成分的反應器中。在一較佳實施例中-工業上有益量

之高純度異戊二烯包含生物異戊二烯。

亦提供一種包含由本文所述之任何方法製造之燃料成分

的燃料組合物。在一些實施例中，燃料成分包含小於或約

0.5卩g/L之在經歷根據本文所述方法之步驟之後來自非異

戊二烯之C5煙的產物。在一些實施例中，燃料成分包含一

或多種在經歷根據本文所述方法之步驟之後來自一或多種

化合物之產物，該一或多種化合物係選自由以下組成之

群：乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、甲基丙烯醛、甲基乙烯基

酮、2-甲基-2-乙烯基環氧乙烷、順-3 -甲基-1,3-戊二烯及

反一3-甲基-1,3-戊二烯、C5異戊二烯醇、2-庚酮、6-甲基-

5-庚烯-2-酮、2,4,5-三甲基毗咤、2,3,5-三甲基口比嗪、香茅

醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、雙乙醯、2-丁酮、2-甲

基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁

醛、3 -甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3 -甲基-1-丁醇、異

丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁

酯、乙酸3-甲基-3-丁烯-1-基酯、乙酸3-甲基-2-丁烯-1-基

酯、3-.己烯-1-醇、乙酸3-己烯-1-基酯、檸檬烯、香葉醇

（反-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇）、香茅醇（3,7-二甲基-6- 辛烯-1-醇）、（E）-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、（Z）-3,7-二甲

基-1,3,6-辛三烯及2,3-環庚烯醇。比咤。

在一些實施例中'燃料組合物包含史3c值大於-22%。之燃

料組成。在一些實施例中'燃料組合物之8"c值在-22%。

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至-10%o或- 34%o至-24%o之範圍內。在一些實施例 中，燃料

組合物之fM值大於0.9 °亦提供本文所述之任何燃料組合物

與基於石油之燃料之摻合物，以總燃料組合物之總重量或

總體積計'該基於石油之燃料之量為約1%至約95%（以重

量計或體積計）。

【實施方式】

本發明特別提供自異戊二烯製造燃料成分之組合物及方

法。本文中提供燃料成分或添加劑，例如環狀異戊二烯二

聚體及三聚體、線性異戊二烯寡聚物、芳族及脂環族異戊

二烯衍生物及氧化異戊二烯衍生物。可藉由化學轉化包含

工業上有益量之高純度異戊二烯之起始物質來製造燃料成

分。在一態樣中，工業上有益量之高純度異戊二烯包含生

物異戊二烯。在另一態樣中，工業上有益量之高純度異戊

二烯可為生物異戊二烯。在另一態樣中，工業上有益量之

高純度異戊二烯可為藉由培養表現異源異戊二烯合成酶之

細胞而製造之高純度異戊二烯組合物。在其他態樣中，高

純度異戊二烯進行寡聚以形成不飽和異戊二烯寡聚物，諸

如環狀二聚體或三聚體及線性寡聚物。可氫化不飽和寡聚

物以製造飽和煙燃料成分。在某一實施例中，在酸催化劑

存在下高純度異戊二烯與醇之反應製造燃料氧化物。在另

一態樣中，部分地氫化高純度異戊二烯以製造異戊烯。在

一些實施例中，源自高純度異戊二烯之異戊烯產物進行二

聚化以形成異癸烯。在一些實施例中，在酸催化劑存在下

源自高純度異戊二烯之異戊烯產物與醇反應以製造燃料氧

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化物。

源自可再生碳之生物異戊二烯可經由化學催化而轉化成

多種煙燃料。本文中提供自醱酵回收異戊二烯，隨後經由

化學催化成分子量較高之化合物而轉化成煙燃料之方法。

此等方法包括（但不 限於）自醱酵釋出氣體中回收並純化異

戊二烯，隨後進行氣相或液相催化以提供具有燃料價值之

化合物。連續與分批模式之製程均涵蓋於本發明 之範疇

內。

如本文進一步詳述，生物異戊二烯組合物與石油異戊二

烯組合物之區別在於生物異戊二烯組合物實質上不含石 油

異戊二烯組合物中通常存在之任何污染性不飽和C5煙，諸

如（但不限於）1,3-環戊二烯、反-1,3-戊二烯、順-1,3-戊二

烯、1,4-戊二烯、1-戊烘、2-戊缺、3-甲基-1-丁烘、戊-4- 烯-1-烘、反-戊-3-烯T -块及順-戊-3-烯-1-缺°若有任何污

染性不飽和C5煙存在於本文所述之生物異戊二烯起始物質

中，則其以低於石油異戊二烯組合物中之含量存在。因

此，本文所述之源自生物異戊二烯組合物之任何燃料產物

基本上不含，或以低於源自石油異戊二烯之燃料產物中之

含量含有任何 污染性不飽和C5煙或源自該等污染性 不飽和

C5煙之產物。另外，生物異戊二烯組合物中之硫含量低於

石油異戊二烯組合物中之硫含量。源自生物異戊二烯組合

物之燃料產物所含硫之含量低於源自石油異戊二烯之燃料

產物中。

生物異戊二烯與石油異戊二烯之區別在於生物異戊二烯

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係以石油異戊二烯組合物中不存在或以低得多的含量存在

之其他生物副產物（與生物異戊二烯一起獲得之源自生物

來源及/或相 關生物過程的化合物），諸如醇、醛、酮及其

類似物製造。生物副產物可包括（但不限於）乙醇、丙酮、

甲醇、乙醛、甲基丙烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯

基環氧乙烷、順-3-甲基-1,3-戊二烯及反-3-甲基-1,3-戊二

烯、C5異戊二烯醇（諸如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁

烯-1-醇）、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2,4,5-三 甲基毗

咤、2,3,5-三甲基毗嗪、香茅醛、甲硫醇、乙酸.甲酯、1- 丙醇、雙乙醯、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、

2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、

2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、異丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、

乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、乙酸3-甲基-3-丁烯-1-基酯、

乙酸3-甲基-2-丁烯-1-基酯、3-己烯-1-醇、乙酸3-己烯-1- 基酯、檸檬烯、香葉醇（反-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇）、

香茅醇（3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇）、（E）-3,7-二甲基-1,3,6-辛

三烯、（Z）-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、2,3-環庚烯醇毗咤或

線性異戊二烯聚合物（諸如源自多個異戊二烯單元的聚合

之線性異戊二烯二聚體或線性異戊二烯三聚體）。源自生

物異戊二烯之燃料產物含有一或多種生物副產物或源自任

何生物副產物之化合物。另外，源自生物異戊二烯之燃料

產物可含有在後續化學轉化期間自此等生物副產物形成之

化合物。該等化合物之實例包括源自親二烯物與異戊二烯

或其燃料衍生物之狄爾 斯-阿爾 德環化加成（Diels-Alder

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cycloaddition）、異戊二烯或燃料衍生物之氧化的化合物。

另外，生物異戊二烯與石油異戊二烯之區別在於碳指

紋。在一態樣中，生物異戊二烯相比石油異戊二烯具有較

高放射性碳-14（Mc）含量或較高14C/12C比率。生物異戊二

烯係自可再生碳源製造，因此生物異戊二烯中之“C含量

或14C/12 C比率與當前大氣中相同。另一方面，石油異戊二

烯係源自數千年至數百萬年前沈積之化石燃料，因此μ。

含量或14C/12 C比率由於放射性衰變而降低。如本文更詳細

論述，源自生物異戊二烯之燃料產品相比源自石油異戊二

烯之燃料產品具有較高“C含量或,4C/,2C比率。在一實施

例中，源自本文所述之生物異戊二烯之燃料產品具有類似

於大氣中之Me含量或,4c/12 c比率。在另一態樣中，生物

異戊二烯可以分析方法由穩定的碳同位素比率（13c/12c）與

石油異戊二烯相區分，該碳同位素比率可以符號尸3c所表

示之「8值」形式報導。舉例而言，對於源自石油精煉廠

之C5流之萃取蒸餾的異戊二烯'513C為約-22%。至

約-24%o。此範圍為源自石油之輕質不飽和煙之典型範

圍，且源自基於石油之異戊二烯之產物通常含有8"c相同

之異戊二烯單元。藉由使源於玉米之葡萄糖（013C 為-1 0.73%。）與最少量之其他含碳營養素（例如酵母提取物）

醱酵而製造之生物異戊二烯製得可聚合成5,3C為-14.66%。

至-14.85%。之聚異戊二烯的異戊二烯。預期自該生物異戊

二烯製造之產物相比源自基於石油之異戊二烯之產物具有

較小負值之8"c值。

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由此等方法製成之化合物包括環狀異戊二烯二聚體及三

聚體、線性寡聚物、芳族及脂環族衍生物。二異戊烯係由

包含部分氫化生物異戊二烯組合物之方法製成。異戊二烯

之此等化學衍生物適用作液體運輸燃料(IsoFuels™)且適用

作燃料添加劑。

本文中亦提供製造異戊二烯之氧化衍生物之方法，該等

衍生物包括醇、酮、酯及醍。亦可在液相或氣相中使用均

相及異相催化劑進行合成異戊二烯之氧化衍生物的方法。

此化學類別之化合物亦適用作液體運輸燃料，且可在燃料

摻合物中用作燃料氧化物以減少排放且用作燃料改質劑 ，

例如用作柴油之十六烷值增進劑。

儘管異戊二烯可藉由分餾石油而獲得，但此物質之純化

昂貴且耗時。C5煙流之石油裂化僅製造約15%異戊二烯。

異戊二烯亦天然地由多種微生物、植物及動物物種製造。

詳言之，已鑑別兩種生物合成異戊二烯之途徑：甲羚戊酸

(mevalonate，MVA)途徑及非甲 舞戊酸(non-mevalonate，

DXP)途徑。生物反應器中經遺傳工程改造之細胞培養物

已較有效地製造較大量、較高純度及/或具有獨特雜質概

況之異戊二烯，例如，如以下文獻中所述：2007年12月13 日申請之美國臨時專利申請案第61/013,386號及第

61/013,574號；WO 2009/076676 ； 2008 年 7 月 2 日申 請之美

國臨時專利申請案第61/134,094號、第61/134,947號、第

61/134,011 號及第 61/134,103 號；WO 2010/003007 ； 2008 年9月15日申請之美國臨時專利申請案第61/097,163號；

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WO 2010/031079 ； 2008年9月15日申 請之美 國臨時專利申

請案第 61/097,186 號；WO 2010/031062 ； 2008 年 9 月 15 日

申請之美國臨時專利申請案第61/097,189號；WO 2010/031077 ； 2008年9月15日申請之美國臨 時專利申請案

第 61/097,200 號；WO 2010/031068 ； 2008 年 9 月 15 日申請

之美國臨時專利申請案第61/097,204號；WO 2010/031076 ； 2008年12月30日申請之美國臨時專利申請

案第 61/141,652 號；PCT/US09/069862 ； 2008 年 12 月 15 日

申請之美國專利申請案第12/335,071號(US 2009/0203 102 A1)；及2009年4月23日申請之美國專利申請案第

12/429,143號(US 2010/0003716 A1)，該等文獻以全文引用

的方式併入。

定義

除非本文另有規定，否則本文中所用之所有技術及科學

術語均具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相

同之含義。儘管類似或等效於本文所述之任何方法及物質

均可用於實施本發明，但本文中描述較佳方法及物質。因

此，藉由參考通篇說明書更全面地描述下文緊接著定義之

術語。所引用之所有文獻均在相關部分以引用的方式併入

本文中。然而，對任何文獻之引用均不視為承認其為關於

本發明之先前技術。

除非本文另有明確指示，否則本文中所用之單數術語

「一」及「該」包括複數個提及物。

本說明書通篇所給出之每個最大數值限制欲包括每個較

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低數值限制，如同該 等較低數值限制明確 寫入本文中一

般。本說明書通篇所給出之每個最小數值限制將包括每個

較高數值限制，如同該等較高數值限制明確寫入本文中一

般。本說明書通篇所給出之每個數值範圍將包括處於該較

寬數值範圍內的每個較窄數值範圍，如同該等較窄數值範

圍皆明確寫入本文中一般。

術語「異戊二烯」係指2-甲基-1,3-T二烯(CAS編號78- 79-5)，其為自3,3-二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)消除焦磷

酸而得到之直接及最終揮發性C5煙產物，且並不涉及IPP 分子與DMAPP分子之鍵聯或聚合。除非本文另有指示，

否則術語「異戊二烯」一般不欲受其製造方法限制。

本文中所用之「以生物方法製造之異戊二烯」或「生物

異戊二烯」為由任何生物方式製造之異戊二烯，諸如由經

遺傳工程改造之細胞培養物、天然微生物、植物或動物製

造之異戊二烯。生物異戊二烯組合物通常比自石化來源製

造之異戊二烯含有較少煙雜質，且常常需要最少處理來達

到聚合級。生物異戊二烯組合物亦具有不同於以石化方法

製造之異戊二烯組合物的雜質概況。

本文中所用之IsoFuels™係指 包括源自異戊二烯之液體

運輸燃料之燃料。BioIsoFuelsTM係指 包括源自生物異戊二

烯之液體運輸燃料之燃料。

本文中所用之術語「寡聚」係指組合兩個或兩個以上單

體單元之化學過程。異戊二烯之「寡聚」製造源自兩個或

兩個以上異戊二烯分子之異戊二烯衍生物，諸如線性異戊

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二烯二聚體、環狀異戊二烯二聚體、線性異戊二烯三聚

體、環狀異戊二烯三聚體及其類似物。

「完全氫化」定義為通常在氫化催化劑存在下氫氣（h2）

與前驅化合物內所有不飽和官能基（諸如碳碳雙鍵）加成得

到完全飽和之產物化合物。舉例而言，異戊二烯之完全氫

化形成異戊烷，藉此每莫耳異戊二烯消耗2莫耳H2。

「部分氫化」定義為通常在氫化催化劑存在下氫氣（H2） 與前驅化合物內至少一個、但並非所有不飽和官能基（諸

如碳碳雙鍵）加成。部分氫化之產物可進一步完全氫化，

得到完全飽和之產物化合物。二烯之部分氫化形成一或多

種單烯煙。舉例而言，異戊二烯之部分氫化可得到3種異

構異戊烯（2-甲基丁 -1-烯、2-甲基丁 -2-烯及3-甲基丁 -1- 烯），藉此每莫耳異戊二烯消耗1莫耳也。

「選擇性氫化」定義為通常在氫化催化劑存在下氫氣

（田）與前驅化合物內至少一個、但並非所有不飽和官能基

（諸如碳碳雙鍵）加成，藉此在所選條件下某些不飽和官能

基相較其他不飽和基團優先氫化。舉例而言，異戊二烯之

選擇性氫化可優先形成2-甲基-2-丁烯、2-甲基-1-丁烯、3- 甲基-1-丁烯或其混合物。

本文中所用之術語「多肽」包括多肽、蛋白質、肽、多

肽片段及融合多肽。

本文中所用之「分離之多肽」並非多肽文庫，諸如2、

5 ' 10 ' 20 ' 50種或50種以上不同多肽之文庫的一部分，

且自與之一起天然存在之至少一種組分分離得到。分離之

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多肽可例如藉由表現編碼該多肽之重組核酸而獲得。

「異源多肽」意謂胺基酸序列與同一宿主細胞中天然表

現之另一多肽之胺基酸序列不一致的多肽。詳言之，異源

多肽與同一宿主細胞中天然所見之野生型多肽不一致。

「密碼子簡併」係指在不影響經編碼多肽之胺基酸序列

的情 況下允 許核昔 酸序列 變化之 遺傳密 碼趨異 性

(divergence)。熟練技術人員充分瞭解使用特定針對既定胺

基酸之核普酸密碼子的特定宿主細胞所展現之「密碼子偏

向性(codon-bias)」。因此，當合成使宿主細胞中之表現改

良之核酸時，在一些實施例中需要設計該核酸.，使得其密

碼子使用頻率接近於宿主細胞之較佳密碼子使用之頻率。

本文中所用之「核酸j係指兩種或兩種以上以單股或雙

股形式共價連接在一起之去氧核糖核昔酸及/或核糖核普

酸。

「重組核酸」意謂相關核酸不含一或多種核酸(例如基

因)，該一或多種核酸在產生相關核酸之生物體的天然存

在之基因組中側接相關核酸。因此，該術語包括例如併入

載體中、併入自主複製之質體或病毒中、或併入原核細胞

或真核細胞之基因組DNA中，或不依賴於其他序列以獨立

分子(例如cDNA、基因組DNA片段，或藉由PCR或限制性

核酸內切酶分解而製造之cDNA片段)之形式存在的重組

DNA。

「異源核酸」意謂核酸序列與同一宿主細胞中天然所見

之另一核酸之序列不一致的核酸。詳言之，異源核酸與同

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一宿主細胞中天然所見之野生型核酸不一致 。

本文中所用之「載體」意謂能夠傳遞一或多種相關核酸

且理想地於宿主細胞 中表現該一或多種相 關核酸之構築

體。載體之實例包括(但不限於)：質體、病毒載體、DNA 或RNA表現載體、黏質體及噬菌體載體。

本文中所用之「表現控制序列」意謂引導相關核酸轉錄

之核酸序列。表現控制序列可為啟動子，諸如組成性或誘

導性啟動子；或可為強化子。「誘導性啟動子」為在環境

或發育調控下具活性之啟動子。表現控制序列可操作地連

接於待轉錄之核酸區段。

術語「選擇性標記物」或「可選擇標記物」係指能夠於

宿主細胞中表現，使得易於選擇含有所引入之核酸或載體

之宿主細胞的核酸。可選擇標記物之實例包括(但不限於)

抗生素抗性核酸(例如康黴素(kanamycin)、胺节青黴素

(ampicillin)、發.节青黴素(carbenicillin)、慶大黴素

(gentamicin)、潮黴素(hygromycin)、腐草黴素

(phleomycin) ' 博萊黴素(bleomycin) ' 新黴素(neomycin)或

氯黴素(chloramphenicol))及/或賦予宿主細胞以代謝優勢

(諸如營養優勢)之核酸。例示性營養選擇性標記物包括此

項技術中已知之標記物'如amdS、argB及pyr4 °

組合物及系統

源自石化來源之異戊二烯通常為不純C5煙餾份，該物質

在適於聚合或其他化學轉化之前需要大量純化。若數種雜

質之結構類似於異戊二烯且可充當聚合催化劑毒物，則該

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等雜質尤其成問題。該等化合物包括（但不限於）1,3-環戊

二烯、順-1,3-戊二烯及反-1,3-戊二烯、1,4-戊二烯、1-戊

焕、2-戊烘、3-甲基-1-丁族、戊-4-烯-1-烘、反-戊-3-烯-

1-块及順-戊-3-烯-1-烘。如下文詳述，以生物方法製造之

異戊二烯在未經歷大量純化之情況下可實質上不含任何污

染性不飽和C5煙。一些以生物方法製造之異戊二烯組合物

含有乙醇、丙酮及C5異戊二烯醇。此等組分相比源自石化

來源之異戊二烯組合物中存在之異構C5煙餾份較容易自異

戊二烯流中移除。另外，此等雜質可在生物過程中加以管

理，例如經由製造菌株、碳原料之遺傳修飾，替代性醱酵

條件，回收過程改變，及其他或替代性純化方法加以管

理。

在一態樣中，本發明提供自異戊二烯製造燃料成分之組

合物及系統，其包含：（a）工業上有益量之高純度異戊二烯

起始組合物；及（b）自高純度異戊二烯起始物質之至少一部

分製造的燃料成分；其中該工業上有益量之高純度異戊二

烯起始組合物之至少一部分經歷化學轉化。使高純度異戊

二烯起始物質進行化學反應以製造工業上有益量之適用於

製造燃料之產物。在一態樣中，工業上有益量之高純度異

戊二烯包含生物異戊二烯。在一態樣中，工業上有益量之

高純度異戊二烯可為生物異戊二烯。

例示性起始異戊二烯組合物

在一些實施例中，工業上有益量之高純度異戊二烯起始

組合物包含大於或約2、5 ' 10 ' 20 ' 30 ' 40 ' 50、60 '

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70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、

800、900或1000 mg之異戊二烯。在一些實施例中，起始

異戊二烯組合物包含大於或約2、5 ' 10 ' 20 > 30 ' 40、

50 ' 60 ' 70 ' 80 ' 90、100 g之異戊二烯。在一些實施例

中，起始異戊二烯組合物包含大於或約0.2 ' 0.5 ' 1、2 ' 5 ' 10 ' 20 ' 50 ' 100 ' 200、5 00、1000 kg之異戊二烯。

在一些實施例中，起始組合物中異戊二烯之量為約2至約

5,000 mg，諸如約2至約100 mg、約100至約500 mg、約

500 至約 1,000 mg ' 約 1,000 至約 2,000 mg、或約 2,00 0至約

5,000 mg。在一些實施例中，起始組合物中異戊二烯之量

為約20至約5,000 mg、約100至約5,000 mg、約200至約

2,000 mg ' 約 200 至約 1,000 mg、約 300 至約 1,000 mg、或

約400至約1,000 mg。在一些實施例中，起始組合物中異

戊二烯之量為約2至約5,000 g，諸如約2至約100 g '約100 至約500 g '約500至約1,000 g '約1,000至約2,000 g、或

約2,000至約5,000 g。在一些實施例中'起始組合物中異

戊二烯之量為約2至約5,000 kg '約10至約2,000 kg、約20 至約1,000 kg、約20至約500 kg、約30至約200 kg、或約40 至約100 kg。在一些實施例中，異戌二烯超過或約為起始

組合物之揮發性有機部分的20 ' 25 ' 30 ' 40 ' 50、60、

70 ' 80 ' 90 或 95%(w/w)。

在一些實施例中，以起始組合物中所有C5煙之總重量

計，高純度異戊二烯起始組合物包含大於或約98.0 ' 98.5、99.0、99.5或100重量％之異戊二烯。在一些實施例

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中，以起始組合物中所有C5煙之總重量計，高純度異戊二

烯起始組合物 包含大於或約99.90 ' 99.92、99.94、99.96、

99.98或100重量％之異戊二烯。在一些實施例中，以起始

組合物中所有C5煙之偵測器回應值計，起始組合物中異戊

二烯之相 對偵測 器回應值大於或約為98.0、98.5、99.0、

99.5或100%。在一些實施例中，以起始組合物中所有C5煌

之偵測器回應值計，起始組合物中異戊二烯之相對偵測器

回應值大於或約為 99.90、99.91、99.92、99.93、99.94、

99.95、99.96、99.97、99.98、99.99 或 100%。在一些實施

例中，以起始組合物中所有C5煙之總重量計，起始異戊二

烯組合物包含約98.0至約98.5重量％、約98.5至約99.0重量

%、約99.0至約99.5重量％、約99.5至約99.8重量％、約

99.8至100重量％之異戊二烯。在一些實施例中，以起始組

合物中所有C 5煙之總重量計，起始異戊二烯組合物包含約

99.90至約99.92重量％、約99.9 2至約99.94重量％、約99.94 至約99.96重量％、約99.96至約99.98重量％、約99.98至100 重量％之異戊二烯。

在一些實施例中，以起始組合物中所有C5煙之總重量

計，高純度異戊二烯起始組合物包含小於或約2.0 ' 1.5、

1.0、0.5、0.2、0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、

0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005 或 0.00001 重量％之非異戊二烯之C5煙（諸如1,3-環戊二烯、順-1,3-戊

二烯、反-1,3-戊二烯、1,4-戊二烯、1-戊烘、2-戊块、1- 戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁缺、戊-4-烯-1-烘、反-

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戊-3-烯-1-烘或順-戊-3-烯-1-焕）。在一些實施例中，以起

始組合物中所有C5煙之偵測器回應值計，起始組合物中非

異戊二烯之C5煙的相對偵測器回應值小於或約為2.0、

1.5 、 1.0 、 0.5 、 0.2 、 0.12 、 0.10 、 0.08 、 0.06 、 0.04 、

0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005 或

0.00001%。在一些實施例中'以起始組合物中所有C5煙之

偵測器回應值計'起始組合物中1,3-環戊二烯、順-1,3-戊

二烯、反-1,3-戊二烯、1,4-戊二烯、1-戊块、2-戊烘、1- 戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烘、戊-4-烯-1-烘、反-

戊_3一烯-1-烘或順-戊-3-烯-1-块之相對偵測器回應值小於

或約為 2.0 、 1.5 、 1.0 、 0.5 、 0.2 、 0.12 、 0.10 、 0.08 、

0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、

0.0001 ' 0.00005或0.00001%。在一些實施例中，以起始組

合物中所有C5煙之總重量計，高純度異戊二烯起始組合物

包含約0.02至約0.04重量％、約0.04至約0.06重量％、約

0.06至0.08重量％、約0.08至0.10重量％或約0.10至約0.12 重量％之非異戊二烯之C5煙（諸如1,3-環戊二烯、順-1,3-戊

二烯、反-1,3-戊二烯' 1,4-戊二烯、1-戊烘、2-戊块、1 - 戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烘、戊-4-烯-1-烘、反-

戊-3-烯-1-焕或順-戊-3-烯-1-块）。

在一些實施例中，高純度異戊二烯起始組合物包含小於

或約 50 ' 40 ' 30 ' 20 ' 10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 或

0.005卩g/L抑制異戊二烯聚合之化合物（起始組合物中抑制

異戊二烯聚合之任何化合物）。在一些實施例中，起始異

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戊二烯組合物 包含約0.005至約50 μg/L，諸如約0.01至約

10 '約0.01至約5、約0.01至約1、約0.01至約0.5或約0.01 至約0.005卩g/L抑制異戊二烯聚合之化合物（起始組合物中

抑制異戊二烯聚合之任何化合物）。在一些實施例中，起

始異戊二烯組合物包含小於或約50 ' 40 ' 30 ' 20 ' 10 '5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 或 0.005 卩g/L之非異戊二烯之

煙（諸如1,3-環戊二烯、順-1,3-戊二烯、反-1,3-戊二烯、

1,4-戊二烯、1-戊块、2-戊焕、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3- 甲基-1-丁烘、戊-4-烯-1-烘、反-戊-3-烯-1-烘或順-戊-3- 烯-1-烘）。在一些實施例中，起始異戊二烯組合物包含約

0.005至約50卩g/L，諸如約0.01至約10、約0.01至約5、約

0.01至約1、約0.01至約0.5或約0.01至約0.005卩g/L之非異

戊二烯之煙。在一些實施例中，起始異戊二烯組合物包含

小於或約 50 ' 40 ' 30 ' 20 ' 10 ' 5 ' 1、0.5、0.1、0.05、

0.01或0.005卩g/L之蛋白質或脂肪酸（諸如與天然橡膠天然

相關之蛋白質或脂肪酸）。

在一些實施例中，高純度異戊二烯起始組合物包含小於

或約 10、5、1 ' 0.8 ' 0.5 ' 0.1、0.05、0.01 或 0.005 ppm之

α-块煙、間戊二烯、乙睛或1,3-環戊二烯。在一些實施例

中，起始異戊二烯組合物包含小於或約5、1、0.5、0.1、

0.05、0.01或0.005 ppm之硫或丙二烯。在一些實施例中，

起始異戊二烯組合物包含小於或約30 ' 20 ' 15 ' 10 ' 5 ' 1、0.5、0.1、0.05、0.01 或 0.005 ppm之所有烘煙（諸如 1- 戊块、2-戊烘、3-甲基-1_ 丁诀、戊-4-烯-1-块、反-戊-3-

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烯-1-烘及順-戊-3-烯-1-烘）。在一些實施例中，起始異戊

二烯組合物包含小於或約2000、1000 ' 500、200、100 ' 50 ' 40 ' 30 ' 20 ' 10 ' 5 ' 1 ' 0.5、0.1、0.05、0.01 或

0.005 ppm之異戊二烯二聚體，諸如環狀異戊二烯二聚體

（例如源自兩個異戊二烯單元的二聚化之環狀C10化合

物）。

在一些實施例中，高純度異戊二烯起始組合物包括乙

醇、丙酮、甲醇、乙醛、甲基丙烯醛、甲基乙烯基酮'2- 甲基-2-乙烯基環氧乙烷、順-3 -甲基-1,3-戊二烯及反-3 -甲

基-1,3-戊二烯、C5異戊二烯醇（諸如3-甲基-3-丁烯-1-醇或

3 -甲基-2-丁烯-1-醇），或前述任意兩者或兩者以上。在特

定實施例中，起始異戊二烯組合物包含大於或約0.005、

0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30 ' 4°、6°、8°、

100或120卩g/L之乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、甲基丙烯

醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基環氧乙烷 ' 順-3-甲

基-1,3-戊二烯及反-3-甲基-1,3-戊二烯、C5異戊二烯醇（諸

如3 -甲基-3-丁烯-1-醇或3 -甲基-2-丁烯-1-醇）‘或前述任意

兩者或兩者以上。在一些實施例中，異戊二烯組合物包含

約0.005至約120 μg/L，諸如約0.01至約80、約0.01至約

60、約0.01至約40、約0.01至約30、約0.01至約20、約0.01 至約10、約0.1至約80 '約0.1至約60 '約0.1至約40 '約5 至約80 '約5至約60或約5至約40卩g/L之乙醇、丙酮、甲

醇、乙醛、甲基丙烯醛、甲基乙烯基酮、2 -甲基-2-乙烯基

環氧乙烷、順-3-甲基-1,3-戊二烯及反-3-甲基-1,3-戊二

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烯、C5異戊二烯醇5或前述任意兩者或兩者以上。

在一些實施例中 > 高純度異戊二烯起始組合物包括以下

一或多種組分：2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2,4,5-三甲

基。比咤、2,3,5-三甲基。比嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙

酸甲酯、1-丙醇、雙乙醯、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、

乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁

酮、1-丁醇、2-戊酮、3 -甲基-1-丁醇、異丁酸乙酯、3 -甲

基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、乙酸3-甲基-3- 丁烯-1-基酯、乙酸3-甲基-2-丁烯-1-基酯、3-己烯-1-醇、

乙酸3-己烯-1-基酯、檸檬烯、香葉醇（反-3,7-二甲基-2,6- 辛二烯-1-醇）、香茅醇（3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇）、（E）-3,7- 二甲基-1,3,6-辛三烯、（Z）-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、2,3- 環庚烯醇毗。定或線性異戊二烯聚合物（諸如源自多個異戊

二烯單元的聚合之線性異戊二烯二聚體或線性異戊二烯三

聚體）。在多個實施例中，以重量百分比為單位，此等組

分之一之量相對於異戊二烯之量（亦即，組分重量除以異

戊二烯重量X100）為大於或約0.01、0.02、0.05、0.1、

0.5 、 1 ' 5 ' 10 、 20 、 30 、 40 、 50 、 60 、 70 、 80 、 90 、 100 或11 0%（w/w）。在一些實施例中，以異戊二烯之偵測器回

應值計，第二化合物之相對偵測器回應值大於或約為

0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、

50 ' 60 ' 70 ' 80 ' 90、100或110%。在多個實施例中，以

重量百分比為單位，此等組分之一之量相對於異戊二烯之

量（亦即，組分重量除以異戊二烯重量χΙΟΟ）為約0.01至約

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105%(w/w)，諸如約0.01至約90 '約0.01至約80 '約0.01至

約50、約0.01至約20 '約0.01至約10、約0.02至約50、約

0.05至約50、約0.1至約50或0.1至約20%(w/w)。

在一些實施例中，高純度異戊二烯起始組合物之至少一

部分處於氣相中。在一些實施例中5高純度異戊二烯起始

組合物之至少一部分處於液相(諸如冷凝物)中。在一些實

施例中'高純度異戊二烯起始組合物之至少一部分處於固

相中。在一些實施例中，高純度異戊二烯起始組合物之至

少一部分吸附於固體支撐物，諸如包括二氧化矽及/或活

性碳之支撐物。在一些實施例中,起始異戊二烯組合物與

一或多種溶劑混合。在一些實施例中5起始異戊二烯組合

物與一或多種氣體混合。

在其他實施例中，工業上有益量之高純度異戊二烯起始

組合物係由生物過程製造。在一些較佳實施例中，高純度

異戊二烯起始組合物為藉由培養製造大於約400奈莫耳異

戊二烯/公克細胞(細胞濕重)/小時(nmol/gwcm/h)之異戊二烯

的細胞而製造之生物異戊二烯組合物。在一實施例中5藉

由培養使細胞培養基中超過約0.002%之碳轉化成異戊二烯

之細胞來製造生物異戊二烯組合物。在其他實施例中，細

胞具有如下異源核酸：⑴編碼異戊二烯合成酶多肽，例如

來自諸如葛屬(Pueraria)之植物的天然存在之多肽；及(ii) 可操作地連接於啟動子，例如T7啟動子。來自例如楊屬之

其他異戊二烯合成酶多肽、及天然存在之異戊二烯合成酶

以及親本異戊二烯合成酶之變異體可用於製造生物異戊二

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烯。可使用之異戊二烯合成酶及其變異體之實例描述於美

國申請案第12/429,143號中，該案以全文併入本文中。

在一些實施例中，在包括碳源之培養基中培養細胞，該

碳源為諸如（但不限於）碳水化合物、甘油（glycerol）、丙三

醇（glycerine）、二無基丙酮、單碳源（one-carbon source）、

油、動物脂肪、動物油、脂肪酸、脂質、磷脂、甘油脂、

單酸甘油酯、二酸甘油酯、三酸甘油酯、可再生碳源、多

肽（例如微生物或植物蛋白質或肽）、酵母提取物、來自酵

母提取物之組分，或前述兩者或兩者以上之任何組合。在

一些實施例中，於限制性葡萄糖條件下培養細胞。在某一

實施例中，細胞進一步包含編碼IDI多肽之異源核酸。在

一些實施例中，細胞進一步包含編碼MDV途徑多肽之異源

核酸。在某一實施例中，起始異戊二烯組合物為所述異戊

二烯組合物或藉由培養以下文獻中所述之任何細胞來製

造：2008年7月2日申請之美國臨時專利申請案第

61/134,094號，W0 2010/003007，及 2008 年 12 月 15 日申請

之美國專利申請案第12/335,071號（US 2009/0203102 A1）， 其以全文引用的方式併入。

在一些實施例中，高純度異戊二烯起始組合物包含由製

造異戊二烯之培養中細胞產生之氣相（釋出氣體）。在一些

實施例中，氣相具有非可燃濃度之異戊二烯。在一些實施

例中，氣相包含小於約9.5%（體積）之氧氣。在一些實施例

中，氣相包含大於或約9.5%（體積）之氧氣，且氣相中異戊

二烯之濃度低於可燃下限或高於可燃上限。在一些實施例

149050.doc -31・

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中'氣相中非異戊二烯之部分包含約0%至約100%（體積）

之氧氣，諸如約10%至約100%（體積）之氧氣。在一些實施

例中，氣相中非異戊二烯之部分包含約0%至約99%（體積） 之氮氣。在一些實施例中，氣相中非異戊二烯之部分包含

約1%至約5 0%（體積）之CO?。

在一些實施例中，高純度異戊二烯起始組合物包括以下

一或多者：醇、醛、酮或酯（諸如本文所述之任何醇、

醛、酮或酯）。在一些實施例中5異戊二烯組合物包括⑴

醇及醛＞ （ii）醇及酮＞ （iii）醛及酮，或（iv）醇、醛及酮。在

一些實施例中，任何異戊二烯組合物均進一步包括酯。

在一些實施例中，源自生物來源（諸如細胞培養物）之高

純度異戊二烯起始組合物含有以下一或多者：甲醇、乙

醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3 -甲基T -丙醇 ' 丙酮 ' 乙

酸、2- 丁酮、2-甲基-1 - 丁醇或。引噪。在一些實施例中5起

始異戊二烯組合物含有1 ppm或1 ppm以上之下列一或多

者：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇' 1-丁醇、3 -甲基-1-丙

醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇或吗I噪。在一些

實施例中5起始異戊二烯組合物（諸如純化前之釋出氣體）

中以下一或多者之濃度為約1至約1 0,000 ppm :甲醇、乙

醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3 -甲基-1-丙醇、丙酮、乙

酸、2- 丁酮、2-甲基-1 - 丁醇或。引。朵。在一些實施例中，起

始異戊二烯組合物（諸如已經歷一或多個純化步驟之後的

釋出氣體）包括以下一或多者：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫

醇、1-丁醇、3 -甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲

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基-1-丁醇或。引噪，其濃度為約1至約100 ppm，諸如約1至

約1 Oppm、約10至約20 ppm、約20至約30 ppm、約30至約

40 ppm、約40至約50 ppm、約50至約60 ppm、約60至約70 ppm、約70至約80 ppm、約80至約90 ppm、或約90至約

100 ppm。在一些實施例中，起始異戊二烯組合物含有小

於1 ppm之甲硫醇（有效催化劑毒物，及最終燃料產物中硫

之來源）。可使用標準方法，諸如本文所述之彼等方法或

其他標準方法（諸如質子轉移反應-質譜法）分析來自細胞培

養物之揮發性有機化合物（諸如細胞培養物之頂部空間氣

體中之揮發性有機化合物）（參見，例如Bunge等人，

Applied and Environmental Microbiology, 74（7）:2 179-2 186, 2008，其藉此以全文引用的方式併入，尤其關於揮發性有

機化合物之分析）。

本發明亦涵蓋源自共同製造異戊二烯與氫氣之生物來源

（諸如細胞培養物）之高純度異戊二烯起始組合物的用途。

在一些實施例中，起始生物異戊二烯組合物包含異戊二炖

及氫氣，其比率範圍為每3莫耳％之氫氣至少1莫耳％之異

戊二烯至每4莫耳％之氫氣至少1莫耳％之異戊二烯。在一

些實施例中，起始生物異戊二烯組合物包含異戊二烯及氫

氣，其莫耳比為約 1:9、2:8 ' 3:7 ' 4:6、5:5、6:4、7:3、

8:2或9:1。在一些實施例中，組合物進一步包含1至11莫耳

%之異戊二烯及4至44莫耳％之氫氣。在一些實施例中，組

合物進一步包含氧氣、二氧化碳或氮氣。在一些實施例

中，組合物進一步包含0至21莫耳％之氧氣、18至44莫耳％

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之二氧化碳及。至78莫耳％之氮氣。在一些實施例中5組

合物進一步包含「Oxi。"莫耳％或1.0x10-4莫耳％以下之非

甲烷揮發性雜質。在一些實施例中5非甲烷揮發性雜質包

含以下一或多者：2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2,4,5-三

甲基。比。定、2,3,5-三甲基毗嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、

乙酸甲酯、1-丙醇、雙乙醯、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2- 醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-

2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、異丁酸乙酯、

3 -甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3 -甲基丁酯、乙酸3 -甲

基_3_ 丁烯-1-基酯、乙酸3-甲基-2-丁烯-1-基酯、3-己烯-1- 醇、乙酸3-己烯-1-基酯、檸檬烯、香葉醇（反-3,7-二甲基-

2.6- 辛二烯-1-醇）、香茅醇（3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇）、（E）-3.7- 二甲基-1,3,6-辛三烯、（Z）-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、

2,3-環庚烯醇毗咤或線性異戊二烯聚合物（諸如源自多個異

戊二烯單元的聚合之線性異戊二烯二聚體或線性異戊二烯

三聚體）。在一些實施例中，非甲烷揮發性雜質包含以下

一或多者：異戊二烯組合物包括以下一或多者：醇、醛或

酮（諸如本文所述之任何醇、醛或酮）。在一些實施例中＞

異戊二烯組合物包括⑴醇及醛，（ii）醇及酮，（iii）醛及酮， 或（iv）醇、醛及酮。在一些實施例中，非甲烷揮發性雜質

包含以下一或多者：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇' 1-T 醇、3 -甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇

或。引噪。

在製造異戊二烯之細胞之培養物中製造異戊二烯之技術

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描述於以下文獻中：2007年12月13日申請之美國臨時專利申

請案第 61/013,386號及第 61/013,574號；WO 2009/076676 ；

2008年7月2日申請之美國臨時專利申請案第61/134,094 號、第 61/134,947 號、第 61/134,011 號及第 61/134,103 號；

WO 2010/003007 ； 2008年9月15日申請之美國臨時專利申

請案第 61/097,163 號；WO 2010/03 1079 ； 2008 年 9 月 15 日

申請之美國臨時專利申請案第61/097,186號；WO 2010/031062 ； 2008年9月15日申請之美國臨時專利申請案

笫 61/097,189號；WO 2010/031077 ； 2008 年 9 月 15 日申請之

美國臨時專利申請案第61/097,200號；WO 2010/031068 ；

2008年9月15日申請之美國臨時專利申請案第61/097,204 號；WO 2010/031076 ； 2008年12月30日申請之美國臨時專

利申請案第 61/141,652 號；PCT/US09/069862 ； 2008 年 12 月15日申請之美國專利申請案第12/335,071號(US 2009/0203102 A1)；及2009年4月23日申請之美國專利申請

案第12/429,143號(US 2010/0003716 A1)，該等文獻之教示

內容以引用的方式併入本文中以達成教示由此類製程製造

並回收異戊二烯之技術的目的。在任何狀況下，2007年12 月13 a申請之美國臨時專利申請案第61/013,386號及第

61/013,574號；WO 2009/076676 ； 2008 年 7 月 2 日申 請之美

國臨時專利申請案第61/134,094號、第61/134,947號、第

61/134,011 號及第 61/134,103 號；WO 2010/003007 ； 2008 年9月15日申請之美國臨時專利申請案第61/097,163號；

WO 2010/031079 ； 2008年9月15日申請之美國臨時專利申

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請案第 61/097,186 號；WO 2010/031062 ； 2008 年 9 月 15 日

申請之美國臨時專利申請案第61/097,189號；WO 2010/031077 ； 2008年9月15日申請之美國臨時專利申請案

第 61/097,200 號；WO 2010/031068 ； 2008年 9月 15 日申請之

美國臨時專利申請案第61/097,204號；WO 2010/031076 ；

2008年12月30日申請之美國臨時專利申請案第61/141,652 號；PCT/US09/069862 ； 2008年12月15日申請之美國專利

申請案第 12/335,071 號(US 2009/0203102 A1):及 2009 年 4 月23日申請之美國專利申請案第12/429,143號(US 2010/0003716 A1)教示在細胞培養物中製造較高量之異戊

二烯的組合物及方法。2008年12月15日申請之美國專利申

請案第12/335,071號及US 2009/0203102 A1進一步教示自

已培養細胞共同製造異戊二烯與氫氣之組合物及方法°詳

言之，此等組合物及方法增加異戊二烯製造速率且增加所

製造之異戊二烯之總量。舉例而言'已製造出產生4.8x104 nmol/gWcm/h的異戊二烯之細胞培養系統(表1) °此等糸統之

效率係由細胞自細胞培養基中消耗之碳有約2.2%轉化成異

戊二烯來證實。如實例及表2中所示，每公升培養液產生

約3 g異戊二烯。必要時，可使用其他條件5諸如本文所

述之彼等條件獲得甚至更高量之異戊二烯°在一些實施例

中，使用可再生碳源製造異戊二烯。在一些實施例中’異

戊二烯製造與細胞生長相分離。在一些實施例中’異戊二

烯及任何氧化劑之濃度均處於非可燃範圍內以降低或消除

在製造或回收異戊二烯期間可能起火之風險°該等組合物

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及方法為理想的，因為其使每個細胞之異戊二烯產率較

高、碳產率較高、異戊二烯純度較高、生產力較高、能量

使用較少、製造成本及投資較低及副反應最少。異戊二烯

製造之此有效且大規模的生物合成過程向合成異戊二烯基

產品（諸如橡膠）提供異戊二烯來源且提供替代使用天然橡

膠之理想且低成本的方法。

如下文進一步論述，可藉由將編碼異戊二烯合成酶多肽

（例如植物異 戊二烯合成酶多肽）之異源核 酸引入細胞中來

大幅增加細胞所製造之異戊二烯之量。異戊二烯合成酶多

肽使二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）轉化成異戊二烯。如實

例中所示，使異源山葛{Pueraria Montana）（野葛（kudzu））異

戊二烯合成酶多肽於多種宿主細胞，諸如大腸桿菌

{Escherichia coli）、檸檬.泛菌（Panteoa citrea）、枯草桿菌

{Bacillus subtilis）、解脂耶 氏酵母（Yarrowia lipolytica）及

里 氏木黴{Trichoderma reesei）中表現。與不含異源異戊二

烯合成酶多肽之相應細胞相比，所有此等細胞皆製造較多

異戊二烯。如表1及表2中所說明，使用本文所述之方法製

造大量異戊二烯。舉例而言，與不含異源異戊二烯合成酶

核酸之相應對照枯草桿菌（E. subtilis）細胞相比，含有該異

源核酸之枯草桿菌細胞在14公升醱酵槽中製造約10倍多的

異戊二烯（表2）。在醱酵槽中大腸桿菌製造3 00毫克異戊二

烯/公升培養液（mg/L，其中培養液體積包括細胞培養基體

積與細胞體積）且枯草桿菌製造30 mg/L之異戊二烯，此指

示可產生大量異戊二烯（表2）。必要時，可在甚至更大規模

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下製造異戊二烯，或可使用本文所述之其他條件來進一步

增加異戊二烯之量。表1及表2中所列之載體、及實驗條件

在下文及實例章節中更詳細地描述。

表1：在震盪燒瓶中使用本文所述之細胞培養物及方法所

得到之異戊二烯之例示性產率。量測異戊二烯產量之檢驗

描述於實例I部分II中。對於此檢驗，在一或多個時間點自

震盪燒瓶中移出樣品且培養30分鐘。接著量測此樣品中所

製造之異戊二烯之量。異戊二烯製造之頂部空間濃度及比

速率列於表1中且於本文中進一步描述。

菌株 於頂部空間小瓶中製造異戊二烯*

頂部空間 濃度

*注jfe 卩 g/L 心/h/OD (nmol/gwcm/h)

大腸桿菌 B L21 /pTrcKudzu IS 1.40 53.2(781.2)

大腸桿菌BL21/pCL DXS yidi野葛IS 7.61 289.1(4.25 χΙΟ3)

具有野葛IS及整個MVA途徑之大腸桿菌BL21/MCM 127 23.0 874.1

(1.28 χΙΟ4)

大腸桿菌 BL21/pET N-HisKudzu IS 1.49 56.6(831.1)

檸檬泛菌/pTrcKudzu IS 0.66 25.1(368.6)

大腸桿菌W/楊屬IS[Miller (2001)] - 5.6

(82.2)地衣桿 菌(Bacillis licheniformis)Fall US5849970 - 4.2

(61.4)

具有野葛異戊二烯合成酶之解脂耶氏酵母 約 0.05 gg/L 約2 (約 30)

具有野葛異戊二烯合成酶之里氏木黴 約 0.05 gg/L 約2 (約 30)

具有野葛IS及下游MVA途徑之大腸桿菌BL21/pTrcKKDyIkIS 85.9 3.2χ103

(4.8χ104)

*在密封頂部空間小瓶中針對1 mL、1 OD600、培養1小時

進行校正，液體與頂部空間氣體體積比為1 ：19。

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表2：在醱酵槽中使用本文所述之細胞培養物及方法所得

到之異戊二烯之例示性產率。量測異戊二烯產量之檢驗描

述於實例I部分II中。對於此檢驗，獲取醱酵槽之釋出氣體

之樣品且分析異戊二烯之量。峰值頂部空間濃度（醱酵期

間之最高頂部空間濃度）、力價（每公升培養液所製造之異

戊二烯之累積總量）及異戊二烯製造之峰值比速率（醱酵期

間之最高比速率）列於表2中且於本文中進一步描述。

菌株 於醱酵槽中製造争ί戊二烯峰值頂部 空間濃度**

（Hg/L 两

力價 （mg/L 埼* 液）

峰值比速率 gg/Lj&*ia/h/OD (nmol/gwcm/h)

具有野葛IS之大腸桿菌BL21/pTrcKudzu 52 41.2 37

(543.3)大腸桿菌 FM5/pTrcKudzu IS 3 3.5 21.4

(308.1)大腸桿菌BL21/三合一菌株 （DXS、yidi、IS） 285 300 240

(3.52X103)大腸桿菌FM5/三合一菌株 （DXS、yidi、IS） 50.8 29 180.8

(2.65 χΙΟ3)具有野葛IS及整個MVA途徑之大腸桿 菌 /MCM127 3815 3044 992.5

(1.46Χ104)大腸桿菌 BL21/pCLPtrc UpperPathway gil.2整合下游途徑pTrcKudzu 2418 1640 1248

(1.83 χΙΟ4)具有4χ50 μΜ IPTG之大腸桿菌 BL21/MCM401 13991 23805 3733

(5.49χ104)具有2x1000 μΜ IPTG之大腸桿菌 BL21/MCM401 22375 19541 5839.5

(8.59χ104)大腸桿菌BL21/pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDyIkIS 3500 3300 1088

(Ι.όΟχΙΟ4)野生型枯草桿菌 1.5 2.5 0.8

(11.7)

桿菌屬〃必）pBS野葛IS 16.6約30

（經100小 時）

5(73.4)

馬堡桿菌(Bacillus Marburg)6Q51 [Wagner及Fall (1999)] 2.04 0.61 24.5

(359.8)馬堡桿菌6051 Fall US 5849970 0.7 0.15 6.8

(100)大腸桿菌 BL21 ZpCLPtrcUpperPathway 及 gil.2KKDyI 及 pTrcAlba・mMVK 2.03 χΙΟ4 3.22χ104 5.9x10'

(8.66Χ104)大腸桿菌 BL21/pCLPtrcUpper Pathway 及 gil.2KKDyI 及 pTrcAlba-mMVK 與 pBBRCMPGI1.5pgl

3.22X104 6.05 χΙΟ4 1,28χ104(1.88Χ105)

**針對1 vvm之釋出氣體流動速率（1體積釋出氣體/公升培*」

分鐘）進行校正。

149050.doc -39-

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另外，可藉由增加細胞所表現之1-去氧-D-木酮糖-5-磷

酸合成酶（DXS）多肽及/或異戊烯基二磷酸異構酶（IDI多肽

之量來增強含有異源異戊二烯合成酶核酸之細胞製造異戊

二烯。舉例而言，可將DXS核酸及/或IDI核酸引入細胞

中。DXS核酸可為異源核酸、或內源核酸之複本。類似

地，IDI核酸可為異源核酸、或內源核酸之複本。在一些

實施例中，藉由將內源DXS及/或IDI啟動子或調控區置換

為增強DXS及/或IDI核酸之轉錄之其他啟動子及/或調控區

來增加DXS及/或IDI多肽之量。在一些實施例中，細胞含

有編碼異戊二烯合成酶多肽之異源核酸（例如植物異戊二

烯合成酶核酸）、及編碼異戊二烯合成酶多肽之內源核酸

之複本。

經編碼之DXS及IDI多肽為生物合成異戊二烯之DXP途徑

之一部分（圖19A）。DXS多肽使丙酮酸及D-甘油醛-3-磷酸

轉化成1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸。在不欲受任何特定理論

約束下'咸信增加DXS多肽之量會增加通過DXP途徑之碳

流量，從而使得異戊二烯產量較高。IDI多肽催化異戊烯

基二磷酸（IPP）與二甲 基烯丙 基二磷酸（DMAPP）相 互轉化。

在不欲受任何特定理論約束下，咸信增加細胞中IDI多肽

之量會增加轉化成D MAPP（繼而轉化成異戊二烯）之IPP的

量（及轉化率）。

舉例而言，使用具有野葛異戊二烯合成酶、釀酒酵母（S. cerevisia） IDI及大腸桿菌DXS核酸之大腸桿菌細胞的醱酵

來製造異戊二烯。異戊二烯含量經15小時時期自50卩g/L變

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為300 μg/L（實例7部分VII）。

在一些實施例中，異源或額外內源異戊二烯合成酶、

IDI及DXS核酸之存在使得細胞與僅具有此等異源或額外

內源核酸中之一或兩者的相應細胞相比，生長更具再現性

或保持活力更長時間。舉例而言，含有異源異戊二烯合成

酶、IDI及DXS核酸之細胞與僅具有異源異戊二烯合成酶

及DXS核酸或僅具有異源異戊二烯合成酶核酸之細胞相

比'生長情況更好。又，異源異戊二烯合成酶、IDI及

DXS核酸成功地可操作地連接於由大腸桿菌細胞維持之高

複本質體上之強啟動子，表明大量此等多肽可於細胞中表

現，而對細胞不產生過量毒性。在不欲受特定理論約束

下，成信異源或額外內源異戊二烯合成酶及IDI核酸之存

在可降低一或多種具潛在毒性之中間物的量，否則若細胞

中僅存在異源或額外內源DXS核酸，則該一或多種中間物

會積累。

在一些實施例中，藉由增加細胞所表現之MVA多肽之量

來增強含有異源異戊二烯合成酶核酸之細胞製造異戊二烯

（圖19A及圖19B）。例示性MVA途徑多肽包括以下任何多

肽：乙醯基-CoA乙醯轉移酶（AA-CoA硫解酶）多肽、3-鶏

基-3-甲基戊二醯基-CoA合成酶（HMG-CoA合成酶）多肽、

3-無基-3-甲 基戊二醯基-CoA還原 酶（HMG-CoA還原 酶）多

肽、甲曇戊酸激酶（MVK）多肽、磷酸甲無戊酸激酶（PMK） 多肽、二磷酸甲将戊酸去梭酶（MVD）多肽、磷酸甲舞戊酸

去莪酶（PMDC）多肽、異戊烯基磷酸激酶（IPK）多肽、IDI多

149050.doc -41 -

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肽，及具有兩種或兩種以上MVA途徑多肽之活性的多肽

（例如融合多肽）。舉例而言,可將一或多種MVA途徑核酸.

引入細胞中。在一些實施例中'細胞含有上游MVA途徑， 其包括AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合成酶及HMG-CoA還原

酶核酸。在一些實施例中，細胞含有下游MVA途徑，其包

括MVK、PMK、MVD及IDI核酸。在一些實施例中，細胞

含有整個MVA途徑，其包括AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合

成酶、HMG-CoA還原酶、MVK、PMK、MVD及IDI核酸。

在一些實施例中，細胞含有整個MVA途徑，其包括AA- CoA硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA還原酶、

MVK、PMDC、IPK及IDI核酸。MVA途徑核酸.可為異源核

酸、或內源核酸之複本。在一些實施例中5藉由將MVA途

徑核酸之內源啟動子或調控區置換為增強MVA途徑核酸的

轉錄之其他啟動子及/或調控區來增加一或多種MVA途徑

多肽之量。在一些實施例中，細胞含有編碼異戊二烯合成

酶多肽之異源核酸（例如植物異戊二烯合成酶核酸）、及編

碼異戊二烯合成酶多肽之內源核酸之複本。

舉例而言，含有編碼野葛異戊二烯合成酶多肽之核酸及

編碼釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）MVK、PMK、

MVD及IDI多肽之核酸的大腸桿菌細胞以6.67x10-4 mol/L培養液/

OD600/h之速率產生異戊二烯（參見實例8）。另外，具有編

碼糞腸球菌｛Enterococcus /aecaZz5）AA-CoA硫解酶、HMG- CoA 合成酶及HMG-CoA還原酶多肽之核酸的大腸桿菌細胞

之14公升醱酵製造22公克甲舞戊酸（MVA途徑之中間物）。

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在震盪燒瓶中，此等細胞製造2-4 g/L之甲羟戊酸。此等結

果指示異源MVA途徑核酸在大腸桿菌中具活性。含有上游

MVA途徑與下游MVA途徑以及野葛異戊二烯合成酶之核酸

的大腸桿菌細胞（菌株MCM 127）與僅具有下游MVA途徑及

野葛異戊二烯合成酶之核酸的大腸桿菌細胞（菌株MCM 131）相比，製造顯著更多的異戊二烯（874卩g/L）（參見表3及

實例8部分VIII）。

在一些實施例中*至少一部分細胞於連續培養物（諸如

未經稀釋之連續培養物）中歷經至少約5、10 ' 20 ' 50 ' 75 ' 100、200、3 00次或3 00次以 上之細胞分裂，維持異源

異戊二烯合成酶、DXS、IDI及/或MVA途徑核酸。在本文

所述之任何態樣之一些實施例中，包含異源異戊二烯合成

酶、或內源異戊二烯合成酶之複本、DXS、IDI '及/或

MVA途徑核酸之核酸亦包含選擇性標記物，諸如康黴素、

胺苯青黴素、裁节青黴素、慶大黴素、潮黴素、腐草黴

素、博萊黴素、新黴素或氯黴素抗生素抗性核酸。

如實例7部分VI中所指示，可藉由將酵母提取物添加至

細胞培養基中來進一步增加所製造之異戊二烯的量。在此

實例中，所製造之異戊二烯之量與細胞培養基中酵母提取

物之量就測試濃度而言成線性比例關係（圖48C）。另外，

自含有酵母提取物及葡萄糖之細胞培養基製造約0.11公克

異戊二烯/公升培養液（實例7部分VIII）。此兩個實驗均使

用具有野葛異戊二烯合成酶 ' 釀酒酵母（S. cerevisia）IOl及

大腸桿菌DXS核酸之大腸桿菌細胞製造異戊二烯。在葡萄

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糖存在下增加酵母提取物之量與在酵母提取物存在下增加

葡萄糖之量相比可製造更多異戊二烯。又，增加酵母提取

物之量使得細胞歷經較長持續時間製造高含量之異戊二烯

且改良細胞之健康狀況。

亦使用三種類型之水解生質（甜菜渣、玉米乾草及軟木

漿）作為碳源來製造異戊二烯（圖46A-C） °具有野葛異戊二

烯合成酶、釀酒酵母IDI及大腸桿菌DXS核酸之大腸桿菌

細胞自此等水解生質碳源製造之異戊二烯與自等效量葡萄

糖（例如1 %葡萄糖'w/v）製造之異戊二烯一般多。必要

時，可在本文所述之組合物及方法中使用任何其他生質碳

源。生質碳源為理想的，因為其比許多習知細胞培養基便

宜，進而有助於經濟地製造異戊二烯。

另外，轉化糖顯示發揮碳源之功能以供產生異戊二烯

（圖47C及圖96-98）。舉例而言，自表現MVA途徑多肽及野

葛異戊二烯合成酶之細胞製造2.4 g/L之異戊二烯（實例8部

分XV）。亦使用甘油作為碳源以自表現野葛異戊二烯合成

酶之細胞產生2.2 mg/L之異戊二烯（實例8部分XIV）。除異

戊二烯合成酶核酸以外亦表現DXS核酸、IDI核酸及/或一

或多種MVA途徑核酸（諸如編碼整個MVA途徑之核酸）可增

強自甘油製造異戊二烯。

在一些實施例中*細胞培養基中包括油。舉例而言，含

有野葛異戊二烯合成酶核酸之枯草桿菌細胞當於含有油及

葡萄糖來源之細胞培養基中培養時製造異戊二烯（實例4部

分III）。在另一實例中，含有上游及下游MVA途徑與野葛

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異戊二烯合成酶之大腸桿菌fadR atoC突變型細胞當於含有

棕櫚油及葡萄糖來源之細胞培養基中培養時製造異戊二烯

（實例27部分II）。在一些實施例中，細胞培養基中包括一

種以上油（諸如2、3 ' 4 ' 5種或5種以上油）。在不欲受任何

特定理論約束下，咸信⑴油可增加細胞中可用於轉化成異

戊二烯之碳的量；（ii）油可增加細胞中乙醯基-CoA之量， 進而增加通過MVA途徑之碳流量；及/或（ii）油可向細胞提

供額外營養素，此為理想的，因為在此類細胞中許多碳轉

化成異戊二烯而非其他產物。在一些實施例中，在含有油

之細胞培養基中培養之細胞天然地使用MVA途徑製造異戊

二烯，或經遺傳修飾而含有整個MVA途徑之核酸。在一些

實施例中，油在添加至細胞培養基中之前部分或完全水解

以有助於供宿主細胞使用該油。

於細胞（例如細菌）中工業化製造小分子（諸如異戊二烯）

之主要障礙之一為使分子製造與細胞生長相分離。在工業

上可行地製造異戊二烯之一些實施例中，大量來自原料之

碳轉化成異戊二烯，而非用於細胞之生長及維持（「碳效

率」）。在多個實施例中，細胞使細胞培養基中大於或約

0.0015、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、

0.14 、 0.16 、 0.2 、 0.3 、 0.4 、 0.5 、 0.6 、 0.7 、 0.8 、 0.9 、

1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、

5.0 ' 6.0、7.0或8.0%之碳轉化成異戊二烯。在特定實施例

中，轉化成下游產物的大部分來自原料之碳轉化成異戊二

烯。如實例11中進一步描述'表現MVA途徑及野葛異戊二

149050.doc -45-

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烯合成酶核酸之大腸桿菌細胞展現異戊二烯或中間物甲理

戊酸之製造與生長相分離，從而使得碳效率較高。詳言

之，由表現來自糞腸球菌之上游MVA途徑之細胞形成甲短

戊酸。由表現來自糞腸球菌之上游MVA途徑、來自釀酒酵

母之下游MVA途徑及來自山葛（野葛）之異戊二烯合成酶的

細胞形成異戊二烯。此異戊二烯或甲楚戊酸製造與生長相

分離在以下四種不同的大腸桿菌菌株中得到證實：BL21 （LDE3）、BL21（LDE3） Tuner、FM5 及 MG1655。前 兩種大

腸桿菌菌株為B菌株，且後兩者為K12菌株。製造與生長

相分離亦在α笊及以α基因缺失之MG1655變異體中得到證

實。此變異體亦證實製造較少乙酸鹽。

例示性多肽與核酸

多種異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化

酶、氫化酶成熟或轉錄因子多肽與核酸可用於本文所述之

組合物及方法中。

在一些實施例中，融合多肽包括第一多肽（例如異戊二

烯合成酶、DXS、IDI ' MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟

或轉錄因子多肽，或其催化活性片段）之一部分或全部，

且可視情況包括第二多肽（例如有助於純化或偵測融合多

肽之肽，諸如His標籤）之一部分或全部。在一些實施例中，

融合多肽具有兩種或兩種以上MVA途徑多肽（諸如AA-CoA 硫解酶及HMG-CoA還原酶多肽）之活性。在一些實施例

中，多肽為天然存在之多肽（諸如由糞腸球菌mvaE核酸編

碼之多肽），其具有兩種或兩種以上MVA途徑多肽之活

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性。

在多個實施例中，多肽具有至少或約50 ' 100 ' 150、

175、200、25 0、3 00、3 50、400個或 400個以上胺基酸。

在一些實施例中，多肽片段含有至少或約25、50、75、

100、150 ' 200、300個或300個以上來自全長多肽之相鄰

胺基酸，且具有相應全長多肽之至少或約5% ' 10%、

20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或

100%的活性。在特定實施例中，多肽包括任何天然存在

之異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化酶、氫

化酶成熟或轉錄因子多肽之區段或整個胺基酸序列。在一

些實施例中，多肽與野生型異戊二烯合成酶、DXS、

IDI ' MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟或轉錄因子多肽之

序列（亦即，天然存在之序列）相比，具有一或多個突變。

在一些實施例中，多肽為分離之多肽。在一些實施例

中，多肽為異源多肽。

在一些實施例中，核酸為重組核酸。在一些實施例中，

異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化酶、氫化

酶成熟或轉錄因子核酸可操作地連接於編碼另一多肽之全

部或一部分的另一核酸，使得重組核酸編碼包括異戊二烯

合成酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟或

轉錄因子多肽、及另一多肽（例如有助於純化或偵測融合

多肽之肽，諸如His標籤）之全部或一部分的融合多肽。在

一些實施例中，重組核酸之一部分或全部係以化學方式合

成的。應瞭解，包括單一核昔酸突變之突變可在本文所定

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義之核酸內發生。

在一些實施例中，核酸為異源核酸。在特定實施例中，

核酸包括任何天然存在之異戊二烯合成酶、DXS、IDI、

MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟或轉錄因子核酸之區段或

整個核酸序列。在一些實施例中，核酸包括至少或約50、

100、150、200、300、400、500、600、700、800個或 800 個以上來自天然存在之異戊二烯合成酶核酸、DXS、

IDI、MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟或轉錄因子核酸之

相鄰核昔酸。在一些實施例中，核酸與野生型異戊二烯合

成酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟或轉

錄因子核酸之序列（亦即，天然存在之序列）相比，具有一

或多個突變。在一些實施例中，核酸具有一或多個增加異

戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化酶或轉錄因

子核酸之轉錄或轉譯的突變（例如沉默突變）。在一些實施

例中5核酸為編碼異戊二烯合成酶' DXS、IDI、MVA途

徑、氫化酶、氫化酶成熟或轉錄因子多肽之任何核酸的簡

併變異體。

例示性異戊二烯合成酶、DXS、IDI及/或MVA途徑多肽

與核酸之寄存編號列於附錄1中（附錄1及其相應序列之寄

存編號以全文引用的方式併入本文中，尤其關於異戊二烯

合成酶、DXS、IDI及/或MVA途徑多肽與核酸之胺基酸及

核酸序列）。Kegg資料庫亦含有眾多例示性異戊二烯合成

酶、DXS、IDI及/或MVA途徑多肽與核酸之胺基酸及核酸

序列（參見'例如全球資訊網「genome.jp/kegg/pathway/

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map/map00100.html j及其中 之序列，各藉此以全文引用

的方式併入，尤其關於異戊二烯合成酶、DXS、IDI及/或

MVA途徑多肽與核酸之胺基酸及核酸序列）。在一些實施

例中'異戊二烯合成酶、DXS、IDI及/或MVA途徑多肽及/

或核酸中之一或多者的序列與2007年12月12日或2008年9 月14日公開可用之序列，諸如對應於附錄1中之任何寄存

編號的任何序列或Kegg資料庫中存在之任何序列一致。其

他例示性異戊二烯合成酶、DXS、IDI及/或MVA途徑多肽

與核酸進一步描述於下文中。

例示性 異戊二烯合成 酶多肽 與核酸

如上所述，異戊二烯合成酶多肽使二甲基烯丙基二磷酸

（DMAPP）轉化成異戊二烯。例示性異戊二烯合成酶多肽包

括具有異戊二烯合成酶多肽之至少一種活性的多肽、多肽

片段、肽及融合多肽。可使用標準方法，藉由量測多肽於

活體外、細胞提取物中或活體內使DMAPP轉化成異戊二

烯之能力來判定該多肽是否具有異戊二烯合成酶多肽活

性。在例示性檢驗中5如實例1所述，藉由採用震盪燒瓶

方法使菌株（例如本文所述之大腸桿菌/pTrcKudzu菌株）生

長來製備細胞提取物。誘導完成後，藉由以7000xg離心10 分鐘使約10 mL細胞集結成粒，且再懸浮於5 ml不含甘油

之PEB中。採用標準程序，使用弗 氏細胞壓碎器（French Pressure cell）使細胞溶解。或者，在-80°C下冷凍/解凍

後'用 溶菌酶（Ready-Lyse溶 菌 酶溶液；EpiCentre）處理細

胞。

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細胞 提取物 中異 戊二烯 合成酶 多肽之 活性可 例如如

Silver等人，J. Biol. Chem. 270:13010-13016, 1995及其中

之參考文獻所述來量測 > 各文獻藉此以全文引用的方式併

入，尤其關於異戊二烯合成酶多肽活性之檢驗。將

DMAPP(Sigma)在氮氣流下蒸發至乾燥且於100 mM磷酸鉀

緩衝液(pH 8.2)中再水合至100 mM濃度，並儲存於-20°C 下。為進行檢驗 > 將 5 卩L 1 M MgCl2 ' 1 mM(250 |ig/ml) DMAPP ' 65 |iL 植物提取緩衝液(PEB)(50 mM Tris-HCl(pH 8.0)、20 mM MgCl2 ' 5%甘油及2 mM DTT)之溶液添加至

具有金屬螺旋蓋及經鐵氟龍(teflon)塗覆之矽隔板的20 ml 頂部空間小瓶(Agilent Technologies)中之25 μΧ細胞提取物

中，且在3 7°C、於震盪下培養15分鐘。藉由添加200卩L 250 mM EDTA中止反應，且如實例1部分II所述藉由

GC/MS定量。

例示性異戊二烯合成酶核酸包括編碼具有異戊二烯合成

酶多肽之至少一種活性之多肽、多肽片段、肽或融合多肽

的核酸。例示性異戊二烯合成酶多肽與核酸包括來自本文

所述之任何源生物體的天然存在之多肽與核酸，以及源自

本文所述之任何源生物體的突變型多肽與核酸。

在一些實施例中，異戊二烯合成酶多肽或核酸係來自豆

科，諸如豆科植物亞科。在一些實施例中，異戊二烯合成

酶多肽或核酸為來自山葛(野葛)(Sharkey等人，Plant Physiology 137: 700-712, 2005)、大葛藤｛Pueraria lobata)、

楊屬(諸如銀白楊｛Populus alba)、黑楊｛Populus nigra｝、毛

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果楊｛Populus trichocarpa）或銀白楊與歐洲 山楊雜交種

{Populus alba x /rewwZa)(CAC35696)，Miller 等人，Planta213: 483-487, 2001)、山楊屬(諸 如美 洲山楊{Populus

tremuloides)，Silver 等 人，JBC 270(22): 13 010-1316, 1995)或英國櫟(English Oak/Quercus ro0«r)(Zimmer 等人，

WO 98/02550）之多肽或核酸，各文獻藉此以全文引用的方

式併入，尤其關於異戊二烯合成酶核酸、及異戊二烯合成

酶多肽之表現。適合之異戊二烯合成酶包括（但不限於）根

據 Genbank 寄存編號 AY341431、AY316691、AY279379、

AJ457070及AY182241所鑑別者，各藉此以全文引用的方

式併入，尤其關於異戊二烯合成酶核酸與多肽之序列。在

一些實施例中，異戊二烯合成酶多肽或核酸並非來自英國

櫟之天然存在之多肽或核酸（亦即，異戊二烯合成酶多肽

或核酸為除了來自英國櫟之天然存在之多肽或核酸以外的

異戊二烯合成酶多肽或核酸）。在一些實施例中，異戊二

烯合成酶核酸或多肽為來自楊屬之天然存在之多肽或核

酸。在一些實施例中，異戊二烯合成酶核酸或多肽並非來

自楊屬之天然存在之多肽或核酸。

例示性DXS多肽與核酸

如上所述，1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）多肽使

丙 酮酸及D-甘油醛-3-磷酸轉化成1-去氧-D-木酮糖-5-磷

酸。例示性DXS多肽包括具有DXS多肽之至少一種活性的

多肽、多肽片段、肽及融合多肽。可使用標準方法（諸如

本文所述之彼等方法），藉由量測多肽於活體外、細胞提

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取物中或活體內使丙酮酸及D-甘油醛-3-磷酸轉化成1-去

氧-D-木酮糖-5-磷酸之能力來判定該多肽是否具有DXS多

肽活性。例示性DXS核酸包括編碼具有DXS多肽之至少一

種活性之多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。例示性

DXS多肽與核酸包括來自本文所述之任何源生物體的天然

存在之多肽與核酸，以及源自本文所述之任何源生物體的

突變型多肽與核酸。

例示性IDI多肽與核酸

異戊烯基二磷酸異構 酶多肽（異戊烯基-二磷酸5-異 構酶

或IDI）催化異戊烯基二磷酸（IPP）與二甲基烯丙基二磷酸

（DMAPP）相 互轉化（例如IPP轉化成DMAPP及/或DMAPP轉

化成IPP）。例 示性IDI多肽包括具有IDI多肽之至少一種活

性的多肽、多肽片段、肽及融合多肽。可使用標準方法

（諸如本文所述之彼等方法），藉由量測多肽於活體外、細

胞提取物中或活體內使IPP與DMAPP才目互轉化之能力來判

定該多肽是否具有IDI多肽活性。例示性IDI核酸包括編碼

具有IDI多肽之至少一種活性之多肽、多肽片段、肽或融

合多肽的核酸。例示性IDI多肽與核酸包括來自本文所述

之任何源生物體的天然存在之多肽與核酸，以及源自本文

所述之任何源生物體的突變型多肽與核酸。

例示性MVA途徑多肽與核酸

例示性MVA途徑多肽包括乙醯基-CoA乙醯轉移酶（AA- CoA硫解酶）多肽、3-整基-3-甲基戊二醯基-CoA合成酶

（HMG-CoA合成酶）多肽、3-無基-3-甲基戊二醯基-Co A還

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原 酶（HMG-CoA還原酶）多肽、甲羟戊酸激酶（MVK）多肽、

磷酸甲舞戊酸激酶（PMK）多肽、二磷酸甲舞戊酸去重酶

（MVD）多肽、磷酸甲篷戊酸去梭酶（PMDC）多肽、異戊烯

基磷酸激酶（IPK）多肽、IDI多肽，及具有兩種或兩種以上

MVA途徑多肽之活性的多肽（例如融合多肽）。詳言之，

MVA途徑多肽包括具有MVA途徑多肽之至少一種活性的多

肽、多肽片段、肽及融合多肽。例示性MVA途徑核酸包括

編碼具有MVA途徑多肽之至少一種活性之多肽、多肽片

段、肽或融合多肽的核酸。例示性MVA途徑多肽與核酸包

括來自本文所述之任何源生物體的天然存在之多肽與核

酸，以及源自本文所述之任何源生物體的突變型多肽與核

酸。

詳言之，乙醯基-CoA乙醯轉移酶多肽（AA-CoA硫解酶或

AACT）使兩個乙醯基-CoA分子轉化成乙醯乙醯基-CoA。

可使用標準方法（諸如本文所述之彼等方法），藉由量測多

肽於活體外、細胞提取物中或活體內使兩個乙醯基-CoA分

子轉化成乙醯乙醯基-CoA之能力來判定該多肽是否具有

AA-CoA硫解酶多肽活性。

3-無基-3-甲 基戊二醯基-CoA合成酶（HMG-CoA合成酶或

HMGS）多肽使乙醯乙醯基-CoA轉化成3-羟基-3-甲基戊二

醯基-CoA。可使用標準方法（諸如本文所述之彼等方法），

藉由量測多肽於活體外、細胞提取物中或活體內使乙醯乙

醯基-CoA轉化成3-短基-3-甲基戊二醯基-CoA之能力來判

定該多肽是否具有HMG-CoA合成酶多肽活性。

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3-無基-3-甲基戊二醯基-CoA還原酶（HMG-CoA還原酶或

HMGR）多肽使3-羟基-3-甲基戊二醯基-CoA轉化成甲無戊

酸。可使用標準方法（諸如本文所述之彼等方法），藉由量

測多肽於活體外、細胞提取物中或活體內使3-無基-3-甲基

戊二醯基-CoA轉化成甲羟戊酸之能力來判定該多肽是否具

有HMG-CoA還原酶多 肽活性。

甲铿戊酸激酶（MVK）多肽使甲翔戊酸磷酸化，形成甲羟

戊酸-5-磷酸。可使用標準方法（諸如本文所述之彼等方

法），藉由量測多肽於活體外、細胞提取物中或活體內使

甲铿戊酸轉化成甲無戊酸-5-磷酸之能力來判定該多肽是否

具有MVK多肽活性。

磷酸甲拷戊酸激酶（PMK）多肽使甲無戊酸-5-磷酸磷酸

化，形成甲無戊酸-5-二磷酸。可使用標準方法（諸如本文

所述之彼等方法），藉由量測多肽於活體外、細胞提取物

中或活體內使甲無戊酸-5-磷酸轉化成甲舞戊酸-5-二磷酸

之能力來判定該多肽是否具有PMK多肽活性。

二磷酸甲舞戊酸去裁酶（MVD或DPMDC）多肽使 甲無戊

酸-5-二磷酸轉化成異戊烯基二磷酸（IPP）。可使用標準方

法（諸如本文所述之彼等方法），藉曲量測多肽於活體外、

細胞提取物中或活體內使甲羟戊酸-5-二磷酸轉化成IPP之

能力來判定該多肽是否具有MVD多肽活性。

磷酸甲翔戊酸去梭酶（PMDC）多肽使甲舞戊酸-5-磷酸轉

化成異戊烯基磷酸（IP）。可使用標準方法（諸如本文所述之

彼等方法），藉由量測多肽於活體外、細胞提取物中或活

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體內使甲羟戊酸-5-磷酸轉化成IP之能力來判定該多肽是否

具有PMDC多肽活性。

異戊烯基磷酸激酶（IPK）多肽使異戊基磷酸（IP）磷酸化，

形成異戊烯基二磷酸（IPP）。可使用標準方法（諸如本文所

述之彼等方法），藉由量測多肽於活體外、細胞提取物中

或活體內使IP轉化成IPP之能力來判定該多肽是否具有IPK 多肽活性。

例示性IDI多肽與核酸描述於上文。

例示 性氫化 酶多肽 與核酸

氫化酶多肽催化以下反應：2ΙΓ + 2β θ Η2 °彼反應在活體

外可逆，但某些氫化酶在活體內僅可單向起作用，即氧化

Η2或還原Η+ °氫化酶多肽可為氧敏感性的，含有錯合金屬

輔因子作為其催化中心之一部分，且有時由多個次單位組

成，其中氫化酶基因表現有時涉及其他附屬多肽，諸如

『成熟』因子或轉錄調控因子（亦即，活化子或抑制子）。

氫化酶基於其催化中心中金屬輔因子之類型而分類為至少

三大族群：（i）鎳-鐵（「NiFe j ）氫化酶具有鎳/鐵輔因子；

（2）鐵-鐵氫化酶（「FeFe j ）具有鐵/鐵輔因子；及（3）缺乏族

群（1）及（2）中所見之4Fe4S簇的鐵/無硫（「Fe」）氫化酶具有

鐵輔因子及甲醯基-四氫甲烷蝶吟（methenyl- tetrahy drome th anopterin）電子載體。參見，例如 Chung- Jung Chou 等人，「Hydrogenesis in hyperthermophilic microorganisms: implications for biofuels j ' Metabol. Eng.

10:394-404 （2008） > 及 Goniil Vardar-Schara 等人，

149050.doc -55-

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「 Metabolically engineered bacteria for producing hydrogen via fermentation j，Microbial Biotechnol. 1 （2）: 107-125 （2008），兩者均以全文引用的方式併入本文中 ， 尤其關於各種類型及類別之氫化酶。儘管許多生物體含有

多種氫化酶，但極少生物體含有NiFe與FeFe氫化酶兩者之

基因。

NiFe氫化酶之催化中心由鎳原子及鐵原子組成，各原子

皆具有兩個一氧化碳（CO）及兩個氧離子（CN'）配位體。

NiFe氫化酶皆至少包含第二次單位，該次單位含有多個

鐵-硫（Fe-S）中心以將電子轉移至催化中心或自催化中心轉

移電子。NiFe氫化酶可細分為四個主要類別：（1）呼吸酶，

其為將H2氧化在厭氧條件下與最终電子受體（諸如SO,?-或

ΝΟ3·）還原相聯繫或在好氧微生物中與。2相聯繫之多酶系

統之一部分；（2）Η2感測器，其活化具代謝活性之NiFe氫化

酶之表現；（3）含有多個能夠利用NADP+之次單位的細胞質

氫化酶，其在活體外容易可逆，但在活體內僅可氧化H2 ；

及（4）膜結合儲能多酶複合物，其亦見於細菌及古生菌中。

Chung-Jung Chou 等人，r Hydrogenesis in hyperthermophilic microorganisms: implications for biofuels j，Metabol. Eng.

10:394-404 （2008）。

FeFe氫化酶之催化中心含有催化性「Η簇」，該「Η簇」

經由單一蛋白質（半胱胺酸）配位體與橋接於［4Fe-4S］中心

之雙核（FeFe）位點配位。雙核中心之兩個鐵原子各具有兩

個一氧化碳（CO）及兩個 氯離子（CN'）配位體'且亦由兩個

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作為小有機分子之一部分的硫原子橋接。大多數FeFe氫化酶

為約50千道爾頓(kilodalton，kDa)之單體酶，且似乎活體內

功能主要為處置質子還原成氫氣所產生之過量還原當量。

Chung-Jung Chou 等人 5 r Hydrogenesis in hyperthermophilic microorganisms: implications for biofuels j » Metabol. Eng.

10:394-404 (2008)。

最初認為Fe氫化酶之催化中心具有基於不涉及金屬之有

機輔因子的活性位點，但稍後顯示含有單核Fe原子。儘管

在三種類型之氫化酶之間存在系統發生差異，但除至少一

個鐵原子以外，全部三個族群之氫化酶均.在其活性位點中

亦含有鐵原子之至少一個一氧化碳(C Ο)配位體，該配位體

有助於田催化氧化及質子還原。Chung-Jung Chou等人，

「Hydrogenesis in hyperthermophilic microorganisms: implications for biofuels」，Metabol. Eng. 10:394-404 (2008)。

例示性氫化酶多肽包括(但不限於)大腸桿菌氫化酶-1 (Hyd-Ι)多肽、大腸桿菌 氫化酶-2(Hyd-2)多肽、大腸桿菌

氫化酶-3(Hyd-3)多肽、大腸桿菌氫化酶-4(Hyd-4)多 肽；

大腸桿菌甲酸氫解酶(FHL)複合物，其在厭氧條件下、於

酸性pH值下自甲酸及CO?製造氫氣(參見，例如Akihito Yoshida 等人，「Efficient induction of formate hydrogen lyase of aerobically grown Escherichia coll in a three-step biohydrogen production process 」， Appl. Microbiol.

Biotechnol. 74:754-760 (2007)，其以全文引用的方式併入

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本文中，尤其關於在大腸桿菌中誘導甲酸氫解酶表現)；

真 氧產 鹼桿 菌｛Ralstonia eutropha > R. eutropha)H 1 6 氫化酶

(真氧產鹼桿菌HoxH)、混濁紅球菌｛Rhodococcus opacus »

R. opacus)MRll氫化酶(混濁紅球菌HoxH)多肽、藍藻屬

(Synechosystis sp.，Syn .)PCC 6803 氫化酶(藍藻 PCC 6803 HoxH)多肽、巨大脫硫弧菌(Desulfovibrio gigas，D. gigas)

氫化酶多 肽及脫硫脫硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans，

D. desulfuricans) AT CC 7757氫化酶多肽(參見，例如 Gonul Vardar-Schara等人，「Metabolically engineered bacteria for producing hydrogen via fermentation 」 5 Microbial

Biotechnol. 1(2):107-125 (2008)，其以全文引用的方式併

入本文中，尤其關於各種類型及類別之氫化酶)；及具有

兩種或兩種以上氫化酶多肽之活性的多肽(例如融合多

肽)。詳言之，氫化酶多肽包括具有氫化酶多肽之至少一

種活性的多肽、多肽片段、肽及融合多肽。例示性氫化酶

核酸包括編碼具有氫化酶多肽之至少一種活性，或氫化酶

多肽表現、加工或成熟所必需之至少一種活性之多肽、多

肽片段、肽或融合多肽的核酸。例示性氫化酶多肽與核酸

包括來自本文所述之任何源生物體的天然存在之多肽與核

酸，以及源自本文所述之任何源生物體的突變型多肽與核

酸。

作為厭氧甲酸氫解酶(FHL)複合物之一部分的大腸桿菌

Hyd-3 係由砂c 操縱子(包含 hycA、hycB、hycC、hycD、

hycE、hycF、hycG、hycH及hycl基因)編碼。大腸桿菌

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Hyd-4 係由代χ/'操縱子（包含 hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、

hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfl、hyfJ及奴/7?基因）編碼。大

腸桿菌FHL係由來自Hyc操縱子之六個基因（hycB、hycC、

hycD、hycE、hycF & Zzj/cG）及fdhF基因（編碼甲酸去氫酶

H（Fdh-H））編碼。FHL複合物之表現可進一步涉及丙酮酸甲

酸裂解酶（p/7）FhlA（ —種活化〃力尸及幻/c操縱子的轉錄之轉

錄因子）的表現，或HycA（-種由負性調控FHL轉錄之

基因編碼之轉錄因子）的缺失/失活。可藉由與氫化酶及其

他酶之基因表現的調控有關之其他蛋白質（例如鐵-硫複合

轉錄調控子（ZscR））的表現或失活/缺失來改良異戊二烯與氫

氣之共同製造（Kalim-Akhtar 等人，「Deletion of iscR stimulates recombinant Clostridial Fe/Fe hydrogenase activity and H2-accumulation in Escherichia coli

BL21 （DE3） j ， Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:853-862 （2008），其以全文引用的方式併入本文中，尤其關於在大

腸桿菌中藉由使iscR基因缺失而刺激梭菌Fe/Fe氫化酶活性

及氫氣積累）。

例示性鐵氧化還原蛋白依賴性氫化酶多肽包括（但不限

於）乙醯肉毒梭菌（Clostridium aceto butulicum）氫化酶

A（HydA）（參 見，例 如 P.W. King 等 人，「Functional studies of [FeFe] hydrogenase maturation in an Escherichia coli

biosynthetic system」，J. Bacteriol. 188（6）: 163-172（2006），其以全文引用的方式併入本文中，尤其關於由

HydA及三種HydA相 關 成熟酶（HydE、HydG及HydF）製造

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氫氣)，該乙醯肉毒梭菌氫化酶A可單獨表現或與以下一或

多者聯合表現：(1)枯草桿菌NADPH鐵氧化還原蛋白氧化

還原酶(NFOR)(參見，例如Viet等人，(2008)，其以全文引

用的方式併入本文中，尤其關於由NF OR製造氫氣；亦參

見PCT公開案第WO/2007/089901號 > 其以全文引用的方式

併入本文中，尤其關於針對氫氣製造使大腸桿菌菌株最佳

化)、克魯 氏梭菌(Clostridium kluyveri^NAOH鐵氧化還原

蛋白氧化還原酶(RnfCDGEAB)(Henning Seedorf等人，

「The genome of Clostridium kluyveri, a strict anaerobe with unique metabolic features」，Proc. Nat'I Acad. Sci.

U.S.A. 105(6):2128-2133 (2008)，其以全文引用的方式併

入本文中，尤其關於NADH鐵氧化還原蛋白氧化還原酶，

且關於厭氧乙醇-乙酸鹽醱酵途徑之組分)，或巴斯德梭菌

{Clostridium pasteuranium)鐵氧化還原蛋白氧化還原酶

(Fdx) ； (2)甘油醛-6-磷酸鐵氧化還原蛋白氧化還原酶

(「GAPOR j )；或(3)丙酮酸鐵氧化還原蛋白氧化還原酶

(「POR j )，及具有兩種或兩種以上氫化酶多肽或一或多

種氫化酶多肽之活性及一或多種鐵氧化還原蛋白依賴性氧

化還原酶之活性的多肽(例如融合多肽)。詳言之，鐵氧化

還原蛋白依賴性氫化酶多肽包括具有鐵氧化還原蛋白依賴

性氫化酶多肽之至少一種活性的多肽、多肽片段、肽及融

合多肽。

例示性NADPH依賴性氫化酶多肽包括(但不限於)嗜熱氫

化酶多肽，諸如激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)氫化酶

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(參見，例如 J. Woodward 等人 » r Enzymatic production of biohydrogen j > Nature 405(6790):1014-1015 (2000))，及具

有兩 種或兩 種以上NADPH依賴性 氫化酶多肽之活性的多

肽(例如融合多肽)。詳言之，NADPH依賴性氫化酶多肽包

括具有NADPH依賴性氫化酶多肽之至少一種活性的多

肽、多肽片段、肽及融合多肽。

例示性耐氧性或氧不敏感性氫化酶包括(但不限於)膠狀

紅長命菌(Rubrivivax gelatinosus)氫化酶(參見，例如P.C. Maness 等人 » r Characterization of the oxygen tolerance of a hydrogenase linked to a carbon monoxide oxidation pathway in Rubrivivax gelatinosus 」，Appl. Environ.

Microbiol. 68(6):2633-2636 (2002)，其以全文引用 的方式

併入本文中，尤其關於膠狀紅長命菌(R. gelatinosus)氫化

酶)，及真氧產鹼桿 菌氫化酶多肽(參見，例如T. Burgdorf 等人，「[NiFe]-hydrogenases of Ralstonia eutropha Η16: modular enzymes for oxygen-tolerant biological hydrogen oxidation j > J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 10(2-4):181-196 (2005)，其以全文引用的方式併入本文中，尤其關於真氧

產鹼桿菌氫化酶多肽)。或者，可使用標準方法及檢驗對

編碼氫化酶多肽之異源核酸進行突變誘發且針對。2耐受性

或。2不敏感性進行篩選(參見，例如L.E. Nagy等人，

「Application of gene-shuffling for the rapid generation of novel [FeFe]-hydrogenase libraries」，Biotechnol. Letts.

29(3)421-430 (2007) ,其以引用的方式併入本文中，尤其

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關於耐氧性氫化酶多肽之突變誘發與篩選)。

可使用標準方法(諸如本文所述之彼等方法)，藉由量測

多肽於活體外、細胞提取物中或活體內製造氫氣之能力來

判定該多肽是否具有氫化酶活性。

與醱酵副產物製造相關之基因的例示性多肽 與核酸

除表現或過度表現大腸桿菌中之異源或天然氫化酶以

外，亦可藉由使厭氧生物合成途徑失活，進而阻斷通向限

氧或厭氧條件下製造之多種代謝物(亦即醱酵副產物)的碳

流量來改良異戊二烯與氫氣之共同製造，該等代謝物包括

(但不限於)乳酸鹽、乙酸鹽、丙酮酸鹽、乙醇、丁二酸鹽

及甘油。與醱酵副產物製造有關之例示性多肽包括甲酸去

氫酶Ν、α次單位(fdnG)、甲酸去氫酶Ο、大型次單位

(fdoG)、硝酸還原酶(narG)、甲酸轉運體A(focA)、甲 酸轉

運體B(focB)、丙酮酸氧化酶(poxB)、丙酮酸去氫酶El組分

ackA/pta(aceE)、醇去氫酶(adhE)、反丁烯二酸還原 酶膜蛋

白(JrdC)及乳酸去氫酶(IdhA) °參見，例如Toshinori Maeda 等人，「Enhanced hydrogen production from glucose by metabolically engineered Escherichia coll 」， Appl.

Microbiol. Biotechnol. 77(4):879-890 (2007) 5 其以全文引

用的方式併入，尤其關於葡萄糖代謝經修飾之大腸桿菌菌

株的製造。與醱酵副產物製造所涉及之基因的調控或表現

有關且亦可失活以改良異戊二烯與氫氣之共同製造的例示

性多肽包括(但不限於)：甲酸氫解酶之抑制子(hycA)；反

丁烯二酸還原酶調控子(fnr)；乙醯基-輔酶A合成酶(acs)；

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及甲酸去氫酶調控蛋白（hyc4），其調控轉錄調控子fhlA（甲

酸氫解酶轉錄活化子）之表現。

與氫氣再吸 收相關之基因的例示性多肽與核酸

與氫氣再吸收有關且亦可失活以改良異戊二烯與氫氣之

共同製造的例示性多肽包括（但不限於）大腸桿菌氫化酶-1 （Hyd-l）（/?*a 操縱子）及大腸桿菌氫化酶-2（Hyd-2）（/zg操縱

子）。大腸桿菌Hyd-Ι係由力卯操縱子（包含hyaA、hyaB、

hyaC、hyaD、hyaE及hyaF基因）編碼。大腸桿菌Hyd-2係由

力* b操縱子（包含 hybA、hybB、hybC、hybD、hybE、hybF、

hybG反hybO基因）編碼。

分離核酸之例示性方法

異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化酶、氫

化酶成熟及/或轉錄因子核酸可使用標準方法加以分離。

自相關源生物體（諸如細菌基因組）獲得所要核酸之方法為

常見的且在分子生物學領域中為熟知的（參見，例如WO 2004/033646及其中所引用之參考文獻，各文獻藉此以全

文引用的方式併入，尤其關於相關核酸之分離）。舉例而

言，若核酸序列為已知的（諸如本文所述之任何已知核

酸）1則可藉由限制性核酸內切酶分解而生成適合之基因

組文庫且可使用與所要核酸序列互補之探針進行篩選。一

旦分離出序列，即可使用標準引子引導之擴增方法，諸如

聚合酶鏈反應（PCR）（美國專利第4,683,202號，其以全文引

用的方式併入，尤其關於PCR方法）來擴增DNA，以獲得適

於使用適當載體進行轉型之DNA的量。

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或者，可使用標準方法以化學方式合成異戊二烯合成

酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉

錄因子核酸(諸如核酸序列已知之任何異戊二烯合成酶、

DXS、IDI、MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因

子核酸)。

可使用標準方法鑑別可適用於本文所述之組合物及方法

的其他異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化

酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子多肽與核酸。舉例而言，

可在諸如大腸桿菌之生物體中構築已知天然地製造異戊二

烯之生物體之染色體DNA的黏質體文庫，接著針對異戊二

烯產量進行篩選。詳言之'可生成基因組DNA之大區段

(35-45 kb)封裝於載體中且用於轉型適當宿主之黏質體文

庫。黏質體載體在能夠容納大量DNA方面獨一無二。一般

而言，黏質體載體具有封裝異源DNA、隨後使異源DNA成

環所需之cos DNA序列的至少一個複本。除cos序列以外，

此等載體亦含有複製起點，諸如ColEI ；及抗藥性標記

物，諸如對胺苯青黴素或新黴素具抗性之核酸。使用黏質

體載體轉型適合之細菌宿主之方法充分描 述於Sambrook等

人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 2 版，

Cold Spring Harbor, 1989中，該文獻藉此以全文引用的方

式併入，尤其關於轉型方法。

通常，為選殖黏質體，使用適當限制性核酸內切酶分離

異源DNA且使用適當接合酶接合於鄰近黏質體載體之cos 區之處。接著使含有線性化異源DNA之黏質體載體與DNA

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封裝運載體（諸如噬菌體）反應。在封裝過程中，cos位點裂

解且異源DNA封裝於細菌病毒粒子之頭部。此等粒子接著

用於轉染適合之宿主細胞，諸如大腸桿菌。一旦注射至細

胞中，異源DNA即在cos黏性末端影響下成環。以此方

式，可將異源DNA之大區段引入宿主細胞中且於其中表

現。

獲得異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化

酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸之其他方法包括藉由

檢驗·（諸如本文所述之頂部空間檢驗）或藉由使用針對編碼

一定長度之保守胺基酸（例如至少3個保守胺基酸）之核普酸

的引子進行PCR來篩選多源基因組文庫（metagenomic library）。保守胺基酸可藉由比對已知異戊二烯合成酶、

DXS、IDI ' MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因

子多肽之胺基酸序列來鑑別。異戊二烯合成酶多肽之保守

胺基酸可基於已知異戊二烯合成酶多肽之經比對序列來鑑

別。可對據發現天然地製造異戊二烯之生物體進行標準蛋

白質純化方法（在此項技術中為熟知的）且可使用標準方法

對所得經純化多肽進行定序。其他方法見於文獻中（參

見 5 仞］如 Julsing等人，Applied. Microbiol. Biotechnol. 75: 13 77-84, 2007 ； Wither s 等人，Appl Environ Mi c rob io I.

73（19）: 6277-83, 2007，各藉此以全文引用的方式併入 ，

尤其關於與異戊二烯合成有關之核酸的鑑別）。

另外，可使用標準序列比對及/或結構預測程式，基於

其他DXS、IDI ' MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉

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錄因子多肽與核酸之一級結構及/或預測多 肽二級結構與

已知DXS、IDI、MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉

錄因子多肽與核酸的相似性來鑑別其他DXS、IDI ' MVA 途徑、,氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子多肽與核酸0

亦可使用標準資料庫'諸如swissprot-trembl資料庫(全球

資訊網「expasy.org」，Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU-1 rue Michel Servet CH-1211 Geneva 4, Switzerland)來鑑別異戊二烯合成酶、DXS、

IDI ' MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄調控多肽

與核酸。可使用標準結構預測程式，諸如PredictProtein (630 West, 168 Street, BB217, New York, N.Y. 10032, USA) 之預設定值來預測異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途

徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子多肽之二級及/或

三級結構。或者，可使用標準方法確定異戊二烯合成酶、

DXS、IDI ' MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因

子多肽之實際二級及/或三級結構。亦可藉由與自已知異

戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化酶、氫化酶

成熟及/或轉錄因子核酸產生之探針雜交來鑑別其他異戊

二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化酶、氫化酶成

熟及/或轉錄因子核酸。

例示性啟動子與載體

本文所述之任何異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途

徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸均可包括於

一或多種載體中。因此，本文中亦描述具有一或多種編碼

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本文所述之任何異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途

徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子多肽之核酸的載

體。在一些實施例中，載體所含之核酸處於表現控制序列

之控制下。

在一些實施例中，載體含有選擇性標記物或可選擇標記

物。適用於供木黴屬（Trichoderma）轉型用之載體系統中之

標記物在此項技術中為 已知的（參見，例如Finkelstein，第

6章，Biotechnology of Filamentous Fungi, Finkelstein等人

編，Butt er worth-Heinemann, Boston, MA，第 6 章，1992 ； 及Kinghorn等人，Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, London, 1992，各藉此以全文引用的方式併入，尤其

關於選擇性標記物）。在一些實施例中，選擇性標記物為

amdS^ 酸，其編碼乙醯胺酶，使得經轉型之細胞於乙醯胺

氮源上生長。使用小巢狀麴菌（A. nidulans）amdS核酸作為

選擇性標記物描述於Kelley等 人，EMBO J. 4:475-479, 1985 及 Penttila 等人，Gene 61:155-164, 1987 中（各文獻藉

此以全文引用的方式併入，尤其關於選擇性標記物）。在

一些實施例中，異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途

徑、氫化酶、氫化酶成熟或轉錄調控核酸整合至不含選擇

性標記物之細胞的染色體中。

適合之載體為與所採用之宿主細胞相容之載體。適合之

載體可源自例如細菌、病毒（諸如噬菌體T7或源自M-13之

噬菌體）、黏質體、酵母或植物。獲得及使用該等載體之

149050.doc -67-

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方案在此項技術中為已知的（參見5例如Sambrook等人，

Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 2版 5 Cold Spring Harbor, 1989，其藉此以全文引用的方式併入，尤

其關於載體之使用）。

啟動子在此項技術中為熟知的。在宿主細胞中發揮功能

之任何啟動子皆可用於異戊二烯合成酶、DXS、IDI、

MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸於宿

主細胞中之表現。適用於驅動異戊二烯合成酶、DXS、

IDI ' MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸

於各種宿主細胞中表現之起始控制區或啟動子為數眾多且

為熟習此項技術者所熟知（參見'例如WO 2004/033646及

其中所引用之參考文獻，各藉此以全文引用的方式併入 ，

尤其關於供表現相關核酸用之載體）。實際上，可使用能

夠驅動此等核酸之任何啟動子，包括（但不限於）CYC1、

HIS3、GALI、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、

ADCI、TRP1、URA3、LEU2、ENO 及 TPI（適用於酵母

（Saccharomyces）中之表現）；AOX1 （適用於畢赤酵母

（Pichia）中之表現）；及 lac、trp、XPL、XPR、T7、tac及 trc （適用於大腸桿菌中之表現）。

在一些實施例中，使用葡萄糖異構酶啟動子（參見，例

如美國專利第7,132,527號及其中所引用之參考文獻，各藉

此以全文引用的方式併入，尤其關於供表現相關多肽用之

啟動子及質體系統）。所報導之葡萄糖異構酶啟動子突變

體可用於改變可操作地連接於該葡萄糖異構酶啟動子之核

149050.doc -68 -

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酸所編碼之多肽的表現量（美國專利第7,132,527號）。在多

個實施例中，葡萄糖異構酶啟動子含於低複本質體、中等

複本質體或高複本質體中（美國專利第7,132,527號）。

在多個實施例中，異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA 途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸含於低複

本質體（例如維持約1至約4個複本/細胞之質體）、中等複本

質體（例如維持約10至約15個複本/細胞之質體）或高複本質

體（例如維持約50個或50個以上複本/細胞之質體）中。在一

些實施例中，異源或額外內源異戊二烯合成酶、DXS、

IDI、MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸

可操作地連接於T7啟動子。在一些實施例中，可操作地連

接於T7啟動子之異源或額外內源異戊二烯合成酶、DXS、

IDI、MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸

含於中等複本質體或高複本質體中。在一些實施例中，異

源或額外內源異戊二烯合成酶、DXS、IDI ' MVA途徑、

氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸可操作地連接於

Trc啟動子。在一些實施例中，可操作地連接於Trc啟動子

之異源或額外內源異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途

徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸含於中等複

本質體或高複本質體中。在一些實施例中5異源或額外內

源異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化酶、氫

化酶成熟及/或轉錄因子核酸可操作地連接於Lac啟動子。

在一些實施例中，可操作地連接於Lac啟動子之異源或額

外內源異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化

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酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸含於低複本質體中。

在一些實施例中，異源或額外內源異戊二烯合成酶、

DXS、IDI、MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因

子核酸可操作地連接於內源啟動子'諸如內源大腸桿菌屬

｛Escherichia)、泛菌屬(Panteoa)、桿菌屬、耶氏酵母屬

(Yarrowia)、鏈黴菌屬｛Streptomyces｝或木黴屬啟動子'或

內源鹼性絲胺酸蛋白酶、異戊二烯合成酶、DXS、IDI ' MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子啟動子。

在一些實施例中，可操作地連接於內源啟動子之異源或額

外內源異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化

酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸含於高複本質體中。

在一些實施例中，載體為不整合至細胞中之染色體中的複

製質體。在一些實施例中，載體之一部分或全部整合至細

胞中之染色體中。

在一些實施例中，載體為當引入真菌宿主細胞中時整合

至宿主細胞基因組中且進行複製之任何載體。關於載體之

清單,參考 Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains(FGSC，全球資訊網「fgsc.net j及其中所引用之參

考文獻，各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於載

體)。適合之表現及/或整合,載體之其他實例提供於

Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 2 版，Cold Spring Harbor, 1989, Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel 等人(編)

1987，增刊 30 -章 節 7.7.18) ； van den Hondel 等 人，

149050.doc -70-

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Bennett 及 Lasure（編）More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press，第 396-428 頁，1991 ；及美國專利第

5,874,276號中，各文獻藉此以全文引用的方式併入，尤其

關於載體。尤其適用之載體包括pFB6、pBR322、

PUC18、pUClOO及 pENTR/D。

在一些實施例中'異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA 途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸可操作地

連接於在真菌宿主細胞中顯示轉錄活性之適合啟動子。該

啟動子可源自一或多種編碼宿主細胞之內源或異源多肽的

核酸。在一些實施例中，啟動子適用於木黴屬宿主。適合

啟動子之非限制性實例包括cbhl、cbh2、egl 1、egl2、

pep A、hfb 1、hfb2、xyn 1及a my。在一些實施例中，啟動子

為宿主細胞之天然啟動子。舉例而言，在一些實施例中，

當里氏木黴（T reesei）為宿主時，啟動子為天然里氏木黴

啟動子。在一些實施例中，啟動子為里氏木黴cb笊，該啟

動子為誘導性啟動子且以寄存編號D86235寄存於

GenBank（以全文引用的方 式併入 > 尤其關於啟動子）。在

一些實施例中，啟動子為真菌宿主細胞之異源啟動子。適

用啟動子之其他實例包括來自泡盛匏菌（A. awamori）及黑

麴菌（4 niger）葡 糖澱粉酶之基因（glaA）的啟動子（Nunberg 等人，Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 及 Boel 等人， EMBO J. 3:1 581-1585, 1984，各藉此以全文引用的方式併

入'尤其關於啟動子）；來自黑麴菌｛Aspergillus niger｝a澱·

粉酶、米麴菌｛Aspergillus ”yzae）TAKA澱粉酶、里氏木黴

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及里氏木黴纖維二糖水解酶1之基因的啟動子（ΕΡ 13 72 80，其以全文引用的方式併入，尤其關於啟動子）。

在一些實施例中，表現載體亦包括終止序列。終止控制

區亦可源自宿主細胞之各種天然基因。在一些實施例中，

終止序列及啟動子序列源自相同來源。在另一實施例中，

終止序列對宿主細胞而言為內源的。尤其適合之終止子序

列為源自木黴屬菌株（諸如里氏木黴）之cbhl °其他適用之

真菌終止子包括來自黑麴菌或泡盛麴菌葡糖澱粉酶核酸之

終止子（Nunberg 等人，Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 及

Boel 等人，EMBO J. 3:1581-1585, 1984，各藉此以全文引

用的方式併入，尤其關於真菌終止子）。視情況，可包括

終止位點。為有效表現多肽，編碼多肽之DNA經由起始密

碼子可操作地連接於所選表現控制區，使得表現會形成7適

當信使RNA。

在一些實施例中，啟動子、編碼區及終止子皆源於待表

現之異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化酶、

氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸。在一些實施例中，將異

戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化酶、氫化酶

成熟及/或轉錄因子核酸之編碼區插入通用表現載體中＞

使得該編碼區處於表現構築體啟動子及终止子序列之轉錄

控制下。在一些實施例中，於強犯们啟動子之下游插入基

因或其一部分。

可使用標準技術將異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA 途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸併入載體

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（諸如表現載體）中（Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982，其藉此以全

文引用的方式併入，尤其關於適當DNA.序列之篩選、及載

體之構築）。用於接合包含相關核酸（諸如異戊二烯合成

酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉

錄因子核酸）、啟動子、終止子及其他序列之DNA構築體

且將其插入適合載體中之方法在此項技術中為熟知的。舉

例而言，可使用限制性酶使異戊二烯合成酶、DXS、

IDI、MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸

及載體裂解。接著，可接合裂解之異戊二烯合成酶、

DXS ' IDI ' MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因

子核酸及裂解之載體的相容末端。一般藉由在適宜限制性

位點處接合而實現連接。若該等位點不存在，則根據習知

規範使用合成寡核昔酸連接子（參見Sambrook等人，

Molecular Cloning: A Laboratory Manual ） 第 2 版，Cold Spring Harbor, 1989，及 Bennett 與 Lasure, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego，第 70- 76頁，1991，各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於寡

核昔酸連接子）。另外，可使用已知重組技術（例如

Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology）構築載

體。

在一些實施例中，可能需要以遠遠高於天然存在之細胞

中當前所見之量，過度表現異戊二烯合成酶、DXS、

IDI、MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核

149050.doc -73-

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酸。可藉由將編碼彼等多肽之核酸選擇性選殖至多複本質

體中或將彼等核酸置於強誘導性或組成性啟動子之控制下

來達成此結果。過度表現所要多肽之方法為常見的且在分

子生物學領域中為熟知的'且實例可見於Sambrook等人5

Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 2 版 ‘ Cold Spring Harbor, 1989中，該文獻藉此以全文引用的方式併

入，尤其關於選殖技術。

在一些實施例中，可能需要以遠遠低於天然存在之細胞

中當前所見之量，過低表現編碼異戊二烯合成酶、DXS、

IDI、MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟或轉錄因子多肽之

核酸（例如使之突變、失活或缺失）。此結果可如下實現：

使異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化酶、氫

化酶成熟及/或轉錄因子核酸表現所需之轉錄調控蛋白突

變或失活，使異戊二烯合成酶、DXS、IDI ' MVA途徑、

氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸缺失，或將彼等

核酸置於強抑制性啟動子之控制下。使所要多肽突變、失

活或缺失之方法為常見的且在分子生物學領域中為熟知

的，且實例可見於 Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 2版，Cold Spring Harbor, 1989 中‘

該文獻藉此以全文引用的方式併入，尤其關於選殖與突變

誘發技術。

以下資源包括根據本文所述之組合物及方法適用 之其他

一般方法之描述：Kreigler, Gene Transfer and Expression; A Laboratory Manual, 1990 及 Ausubel 等人編，Current

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Protocols in Molecular Biology, 1994，各藉此以全文引用

的方式併入，尤其關於分子生物學及選殖技術。

例示性源生物體

異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化酶、氫

化酶成熟及/或轉錄因子核酸（及其所編碼之多肽）可獲自天

然含有異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途徑、氫化

酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸之任何生物體。如上

所述，異戊二烯天然地由多種生物體，諸如細菌、酵母、

植物及動物形成。生物體含有用於製造異戊二烯之MVA途

徑、DXP途徑、或MVA途徑與DXP途徑（圖19A及圖19B） ° 因此，DXS核酸可獲自例如含有DXP途徑或含有MVA途徑

與DXP途徑之任何生物體。IDI核酸及異戊二烯合成酶核

酸可獲自例如含有MVA途徑、DXP途徑、或MVA途徑與

DXP途徑之任何生物體。MVA途徑核酸可獲自例如含有

MVA途徑或含有MVA途徑與DXP途徑之任何生物體。氫化

酶核酸可獲自例如氧化氫氣或還原氫離子之任何生物體。

醱酵副產物基因可例如自進行限氧或厭氧呼吸（諸如糖酵

解）之任何生物體獲得或鑑別。

在一些實施例中，異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA 途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸之核酸序

列與由以下任何生物體天然地製造之核酸的序列一致。在

一些實施例中，異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA途

徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子多肽之胺基酸序

列與由以下任何生物體天然地製造之多肽的序列一致。在

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一些實施例中，異戊二烯合成酶、DXS、IDI ' MVA途

徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸或多肽為源

自本文所述之任何生物體之突變型核酸或多肽°本文中所

用之「源自」係指引入有一或多個突變之核酸或多肽的來

源。舉例而言，「源自植物多肽」之多肽係指藉由將一或

多個突變引入野生型植物多肽之序列(亦即5天然存在之

序列)中而產生之相關多肽。

在一些實施例中，源生物體為真菌，其實例為麴菌屬

^Aspergillus^) '諸如米麴菌及黑麴菌；酵母屬，諸如釀酒

酵母(S. cerevisiae)；裂殖酵母屬｛Schizosaccharomyces) >

諸如粟酒裂殖酵母(S. pombe)；及木黴屬，諸如里氏木

黴。在一些實施例中，源生物體為絲狀真菌細胞。術語

「絲狀真菌」係指真菌亞門(subdivision Eumycotina)之所

有絲狀形式(參見 Alexopoulos, C. J. (1962), Introductory Mycology, Wiley, New York) °此等真菌之特徵在於具有由

甲殼素、纖維素及其他複雜多醸構成之細胞壁的營養菌絲

體。絲狀真菌在形態上、生理學上及遺傳學上不同於酵

母。絲狀真菌藉由菌絲伸長實現營養生長，且碳分解代謝

為專性好氧的。絲狀真菌母細胞可為以下(但不限於以下)

屬之細胞：木黴屬(例如里氏木黴5紅褐肉座菌(Hypocrea

jecorina)之無性變種，先前分類為長梗木黴(T.

longibrachiatum)、綠色木黴(Trichoderma viride)、康寧木

黴(Trichoderma koningii)、哈茨木黴(Trichoderma

/ζα尸zia〃”秫))(Sheir-Neirs 等人，Appl. Microbiol. Biotechnol

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20: 46-53, 1984； ATCC 第 56765號及 ATCC 笫 2692 1 號)；青

黴菌屬｛Penicillium sp.)；腐質黴屬(Humicola sp.)(例如特

異腐質黴(H. insolens)、綿毛狀腐質黴(H. lanuginose)或灰

色腐質黴(H. grisea)):金抱子菌屬(Chrysosporium sp.)(例

如洛克維金施子菌(C. lucknow ens e｝)黏帚黴屬

｛Gliocladium sp.)；麴菌屬(例如米麴菌、黑麴菌、醬油麴

菌(A. sojae)、日本麴菌(4 japonicus)、小巢狀麴菌或泡盛

麴菌）（Ward 等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:7380743, 1993 及 Goedegebuur 等 人，Genet 41: 89-98, 2002)；鎌刀菌屬(Fusarium sp.)(例如粉紅鎌刀菌(F. roseum')、禾赤鎌刀菌(F. graminum)、禾穀鎌刀菌(歹.

cerealis)、尖抱鎌刀菌(E oxysporuim)或棉狀嗜 熱鎌刀菌

(F. venenatum))鏈抱黴屬(Neurospora sp.)(例如粗糙鏈抱

黴(N. crassa)｝:肉座菌屬｛Hypocrea sp.)；毛黴屬｛Mucor

sp.)(例如米黑毛黴(Μ miehei))；根黴屬｛Rhizopus sp.)；及

裸胞殼屬｛Emericella sp.）（亦參見 Innis 等人，Sci. 228: 21-26, 1985）。術語「木黴屬（Trie ho dermal Trie ho der ma

sp./Trichoderma spp.)」係指先前或當前歸類為木黴 之任何

真菌屬。

在一些實施例中，真菌為小巢狀麴菌、泡盛麴菌、米麴

菌、棘抱麴菌(A. aculeatus)、黑麴菌、日本麴菌、里氏木

黴 ' 綠色木黴(7. viride) '尖抱鎌刀菌(F. oxysporum)或茄

腐鎌刀菌(H solani)。麴菌屬菌株揭示於Ward等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. 3 9:73 8-743, 1 993 及 Goedegebuur 等

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人，Curr Gene 41:89-98, 2002中，各文獻藉此以全文引用

的方式併入，尤其關於真菌。在特定實施例中5真菌為木

黴屬菌株，諸如里氏木黴菌株。里氏木黴菌株為已知的’

且非限制性實例包括ATCC第1363 1號、ATCC第26921號、

ATCC 第 56764 號、ATCC 第 56765 號、ATCC 第 56767 號及

NRRL 15709，各藉此以全文引用的方式併入'尤其關於

里氏木黴菌株。在一些實施例中,宿主菌株為RL-P37之衍

生物。RL-P37 揭示於 Sheir-Neiss 等人，Appl. Microbiol. Biotechnology 20:46-53, 1984中»該文獻藉此以全文引用

的方式併入，尤其關於里氏木黴菌株。

在一些實施例中，源生物體為酵母，諸如酵母屬、裂殖

酵母屬、畢赤酵母屬或假絲酵母屬｛Candida sp.)。在一些

實施例中，酵母屬為釀酒酵母。

在一些實施例中，源生物體為細菌，諸如桿菌屬菌株5

諸如地衣桿菌｛B. lichenformis)或枯草桿菌；泛菌屬菌株，

諸如檸檬泛菌(F. citrea)；假單胞菌屬｛Pseudomonas)菌

株，諸如產鹼假單胞菌(F. alcaligenes)、惡臭假單胞菌(P.

putida)或螢光假單胞菌(P fluorescens｝；鏈黴菌屬菌株，

諸如青紫鏈黴菌(S· lividans)或鋪赤黴鏈黴菌(S. rubiginosus):棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.)菌株，諸

如蕊.胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum) 紅假單

胞菌屬｛Rhodopseudomonas sp.)菌株»諸如沼澤紅假單胞

菌｛Rhodopseudomonas palustris｝；或大腸桿菌屬菌株'諸

如大腸桿菌。

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本文中所用之「桿菌屬」包括如熟習此項技術者已知 ，

屬於「桿菌」屬之所有種類，包括(但不限於)枯草桿菌、

地衣桿菌、緩慢桿菌(B. lentus)、短桿菌(B. brevis)、嗜熱

脂肪桿菌(B. st ear o therm ophilus)、嗜鹼桿菌(Β.

alkalophilus｝、解澱粉桿菌(8. amyloliquefaciens)、克勞氏

桿菌(B. clausii)、耐鹽桿菌(B. halodurans)、巨大桿菌(B.

megaterium)、凝結桿菌(B. coagulans)、環狀桿菌(8. circulans)、燦爛桿菌(8. lautus)及蘇雲金桿菌(B.

thuringiensis)。應瞭解，桿菌屬繼續經歷分類改組。因

此，該屬意欲包括已重新分類之種類，包括(但不限於)諸

如嗜熱脂肪桿菌之生物體，現稱為「嗜熱脂肪土桿菌

｛Geobacillus st ear o thermophilus')」。在氧氣存在下產生抗

性內生抱子被視為桿菌屬之特定特徴，不過此特徵亦適用

於最新命名之脂環桿菌屬｛Alicy clob ac Ulus)、兩性桿菌屬

｛Amphibacillus)、嗜熱桿菌屬(Aneurinibacillus)、厭氧桿

菌屬(Anoxybacillus)、短桿菌屬｛Brevibacillus)、菲洛桿菌

屬｛Filobacillus)、薄壁桿菌屬(Gracilibacillus)、鹵桿菌屬

(Halobacillus)、類桿菌屬(Paenibacillus)、柳桿菌屬

｛Salibacillus｝、熱桿菌屬(Thermobacillus)、服桿菌屬

｛Ureibacillus)及維京桿菌屬(Virgibacillus)。

在一些實施例中，源生物體為革蘭氏陽性細菌。非限制

性實例包括鏈黴菌屬菌株(例如青紫鏈黴菌、天藍色鏈黴

菌(S. coelicolor)或灰色鏈黴菌(S. griseus))及桿菌屬菌

株。在一些實施例中，源生物體為革蘭氏陰性細菌，諸如

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大腸桿菌；紅假單胞菌屬，諸如沼澤紅假單胞菌；或假單

胞菌屬，諸如產鹼假單胞菌、惡臭假單胞菌或螢光假單胞

菌。

在一些實施例中，源生物體為植物，諸如豆科(諸如豆

科植物亞科)之植物。在一些實施例中，源生物體為野

葛、楊屬(諸如銀白楊與歐洲山楊雜交種CAC35696)、山楊

屬(諸如美洲山楊)或英國櫟。

在一些實施例中，源生物體為藻類，諸如綠藻 ' 紅藻、

灰綠藻(glaucophytes)、阿米 巴狀藻(chlorarachniophytes)、

類眼蟲鞭毛藻(euglenids)、原 藻(chromista)或渦鞭毛藻

(dinoflagellates) °在一些實施例中，源生物體為藍細菌5諸如基於形態歸

類為以下任一組之藍細菌：色球藻目｛Chroococcales｝、寬

球藻目(Pleurocapsales)、顫藻目(Oscillatoriales)、念珠藻

目(Nostocales)或真枝藻目(Stigonematales)。

在一些實施例中，源生物體為厭氧生物體。厭氧生物體

可包括(但不限於)專性厭氧菌、兼性厭氧菌及耐氧厭氧

菌。該等生物體可為上文所列之任何生物體、細菌、酵母

等。在一實施例中，專性厭氧菌可為選自由以下組成之群

之任一者或組合：揚氏梭菌(Clostridium ljungdahlii')、產

乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、黏液真桿菌

｛Eurobacterium limosum｝、食一氧化碳梭菌(Clostridium

carboxydivorans)、產生分解鏈球菌｛Peptostreptococcus

productus)及食甲基 丁 酸桿菌｛Butyribacterium methylotrophicum)。

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應瞭解-本文所述之任何源生物體之任何組合皆可用於本

發明之其他實施例。

例示性宿主細胞

多種宿主細胞可用於表現異戊二烯合成酶、DXS、

IDI、MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子多肽

且用於利用本文所述之方法共同製造異戊二烯與氫氣。例

示性宿主細胞包括來自標題為τ例示性源生物體」之先前

章節中所列之任何生物體的細胞。宿主細胞可為天然地製

造異戊二烯之細胞或不會天然地製造異戊二烯之細胞。在

一些實施例中，宿主細胞使用DXP途徑天然地製造異戊二

烯，且添加異戊二烯合成酶、DXS及/或IDI核酸以增強使

用此途徑製造異戊二烯。在一些實施例中，宿主細胞使用

MVA途徑天然地製造異戊二烯，且添加異戊二烯合成酶及/

或一或多種MVA途徑核酸以増強使用此途徑製造異戊二

烯。在一些實施例中，宿主細胞使用DXP途徑天然地製造

異戊二烯，且添加一或多種MVA途徑核酸以使用MVA途徑

以及DXP途徑之一部分或全部來製造異戊二烯。在一些實

施例中，宿主細胞使用DXP途徑與MVA途徑天然地製造異

戊二烯'且添加一或多種異戊二烯合成酶、DXS、IDI或

MVA途徑核酸以增強經由此等途徑中之一或兩者製造異戊

二烯。

在一些實施例中，宿主細胞使用DXP途徑與MVA途徑夭

然地製造異戊二烯，且添加一或多種異戊二烯合成酶、

DXS、IDI或MVA途徑核酸以増強經由此等途徑中之一或

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兩者製造異戊二烯，添加一或多種氫化酶核酸以增強氫氣

製造，且使一或多種製造醱酵副產物之基因失活或缺失以

限制醱酵副產物製造。在一些實施例中’宿主細胞使用

DXP途徑與MVA途徑天然地共同製造異戊二烯與氫氣’且

添加一或多種異戊二烯合成酶' DXS ' IDI或MVA途徑核

酸以增強經由此等途徑中之一或兩者製造異戊二烯'添加

一或多種氫化酶核酸以增強氫氣製造，使一或多種製造醱

酵副產物之基因失活或缺失以限制醱酵副產物製造'且使

一或多種氫氣再吸收基因失活或缺失以增加氫氣製造°在

一些實施例中，宿主細胞使用DXP途徑與MVA途徑及氫化

酶天然地共同製造異戊二烯與氫氣，且添加一或多種異戊

二烯合成酶、DXS、IDI或MVA途徑核酸以增強經由此等

途徑中之一或兩者製造異戊二烯，添加一或多種氫化酶核

酸以增強氫氣製造5添加一或多種氫化酶成熟核酸以增強

氫氣製造.，使一或多種製造醱酵副產物之基因失活或缺失

以限制醱酵副產物製造，且使一或多種氫氣再吸收基因失

活或缺失以增加氫氣製造。在一些實施例中’宿主細胞使

用DXP途徑與MVA途徑天然地共同製造異戊二烯與氫氣’

且添加一或多種異戊二烯合成酶、DXS、IDI或MVA途徑

核酸以增強經由此等途徑中之一或兩者製造異戊二烯'添

加一或多種氫化酶核酸以增強氫氣製造5添加一或多種氫

化酶成熟核酸以增強氫氣製造5添加一或多種轉錄因子核

酸或使之失活或缺失以增強氫化酶製造’使一或多種製造

醱酵副產物之基因失活或缺失以限制醱酵副產物製造'且

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使一或多種氫氣再吸收基因失活或缺失以增加氫氣製造 。

例示性轉型方法

可使用標準技術將異戊二烯合成酶、DXS、IDI、MVA 途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/或轉錄因子核酸或含其之

載體插入宿主細胞（例如本文所述之植物細胞、真菌細

胞、酵母細胞或細菌細胞）中以供表現所編碼之異戊二烯

合成酶、DXS ' IDI ' MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟及/

或轉錄因子多肽。可使用以下技術將DNA構築體或載體引

入宿主細胞中：諸如轉型、電穿孔、細胞核顯微注射、轉

導、轉染（例如脂質體轉染介導或DEAE-糊精介導之轉

染 > 或使用重組噬菌體病毒進行轉染）、與磷酸鈣DNA沈

澱物一起培育、用經DNA塗覆之微彈進行高速轟擊，及原

生質體融合。一般轉型技術在此項技術中為已知的（參

見 5 例如 Current Protocols in Molecular Biology（F. M. Ausubel 等人（編），第 9 章，1987） ； Sambrook 等 人，

Molecular Cloning: A Laboratory Manual，笫 2 版，Cold Spring Harbor, 1989 ；及 Campbell 等人，Curr. Genet.

16:53-56, 1989，各藉此以全文引用的方式併入，尤其關

於轉型方法）。異源多肽於木黴中之表現描述於以下文獻

中：美國專利笫6,022,725號；美國專利第6,268,328號；美

國專利第 7,262,041 號；WO 2005/001036 ； Harkki 等人，

Enzyme Microb. Technol. 13:227-233, 1991 ； Harkki 等人， Bio Technol. 7:596-603, 1989 ； EP 244,234 ； EP 215,594 ； 及 Nevalainen 等人，「The Molecular Biology of

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Trichoderma and its Application to the Expression of Both

Homologous and Heterologous Genes」'Molecular Industrial Mycology, Leong 及 Berka 編，Marcel Dekker Inc., NY，第129-148頁，1992，各藉此以全文引用的方式

併入，尤其關於轉型及表現方法°關於麴菌屬菌株之轉

型，亦參考 Cao 等人，Sci. 9:991-100 1, 2000 ； EP 23 8023 > 及 Yelton 等人 » Proceedings. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:1470- 1474, 1984（各藉此以全文引用的方式併入'尤其關於轉型

方法）。所引入之核酸可整合至染色體DNA中或維持染色

體外複製序列之形式。

此項技術中已知之任何方法皆可用於選擇轉型體°在一

非限制性實例中'包括α论HS標記物之穩定轉型體與不穩定

轉型體之區別在於其生長速率較快且在含有乙醯胺之固體

培養基上形成輪廓平滑而非粗糙之環形群落°另外’在一

些狀況下，由以下步驟對穩定性進行進一步測試:使轉型

體於固體非 選擇性培養基（例如缺乏乙醯胺之培養基）上生

長，自此培養基收集抱子1且測定隨後在含有乙醯胺之選

擇性培養基上發芽並生長之此等抱子的百分比0

在一些實施例中，藉由包含原生質體形成及原生質體轉

型、接著以已知方式再生細胞壁之過程來轉型真菌細胞°

在一特定實施例中，供轉型用之木黴屬之製備包含自真菌

菌絲體製備原生質體（參見Campbell等人'Curr. Genet.

16:53-56, 1989，其以全文引用的方式併入'尤其關於轉

型方法）。在一些實施例中，自發芽之營養抱子獲得菌絲

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體。用 分解細胞壁之酶處理菌絲體，從而得到原生質體。

接著在滲透壓穩定劑存在下於懸浮培養基中保護原生質

體。此等穩定劑包括山梨糖醇、甘露糖醇、氯化鉀、硫酸

鎂及其類似物。通常，此等穩定劑之濃度在0.8 Μ與1.2 Μ 之間變化。需要在懸浮培養基中使用約1.2 Μ山梨糖醇溶

液。

DNA吸收至宿主木黴屬菌株中取決於鈣離子濃度。一般

而言，吸收溶液中使用約10 mM CaCl2至50 mM CaCl2。吸

收溶液中除鈣離子以外，一般包括之其他化合物為緩衝系

統，諸如 TE緩衝液(10 Mm Tris, pH 7.4 ； 1 mM EDTA)或 10 mM MOPS(嗎嗽丙烷磺酸)緩衝液(pH 6.0)，及聚乙二醇

(PEG)。在不欲受任何特定理論約束下，咸信聚乙二醇起

作用而與細胞膜融合，由此使得培養基之內含物傳遞至木

黴屬菌株之細胞質中且質體DNA轉移至細胞核。此融合常

常留下質體DNA之多個複本整合至宿主染色體中。

通常，使用含有已經歷滲透處理且密度為lip至

107/mL(諸如2xlO6/mL)之木黴屬原生質體或細胞的懸浮液

進行轉型。將100卩L體積之含有此等原生質體或細胞之適

當溶液(例如1.2 Μ山梨糖醇及50 mM CaCl2)與所要DNA混

合。一般，將高濃度之PEG添加至吸收溶液中。可將0.1至

1體積之25% PEG 4000添加至原生質體懸浮液中。在一些

實施例中，將約0.25體積添加至原生質體懸浮液中。亦可

將諸如二甲亞碉、肝素、亞精胺(spermidine)、氯化鉀及

其類似物之添加劑添加至吸收溶液中且幫助轉型。類似程

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序可用於其他真菌宿主細胞（參見，例如美國專利第

6,022,725號及第6,268,328號，各藉此以全文引用的方式併

入，尤其關於轉型方法）。

一般而言'接著在約0°C下培養混合物10至30分鐘°接

著再將PEG添加至混合物中以進一步增強所要核酸序列之

吸收。一般添加體積為轉型混合物體積之5至15倍的25% PEG 4000 ；然而，可能需要較大及較小體積。25% PEG 4000理想地為轉型混合物體積之約10倍。添加PEG後'接

著在室溫下或於冰上培養轉型混合物5隨後添加山梨糖醇

及CaC12溶液。接著再將原生質體懸浮液添加至生長培養

基之熔融等分試樣中。當生長培養基包括生長選擇劑（例

如乙醯胺或抗生素）時，其僅允許轉型體生長。

可根據習知方法進行細菌細胞之轉型'例如'如

Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982中所述，該文獻藉此以全文引用

的方式併入，尤其關於轉型方法。

例示性細胞培養基

本文中亦描述一種共同製造異戊二烯與氫氣之培養中細

胞或細胞群體。「培養中細胞」意謂於允許細胞經歷一或

多次細胞分裂之溶液（例如細胞生長培養基）中之兩個或兩

個以上細胞。「培養中細胞」不包括如下植物細胞：其為

含有已分化成植物組織之細胞之活的多細胞植物之—部

分。在多個實施例中，細胞培養物包括至少或約1 ° ' 2°、

50、100、200、500、1,000、5,000、10,00°個或 1°,0°°個

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以上細胞。

「限氧培養物中之細胞」意謂於允許細胞經歷一或多次

細 胞分裂 之溶液（例 如細胞 生長培 養基）中之兩個或兩個以

上細胞，其中該溶液含有有限量之氧氣。術語「限氧培養

物」意謂該培養物缺氧或所含氧氣量低於支持經由還原當

量生物轉移至氧氣而呼吸所需之氧氣量，且亦涵蓋厭氧培

養物。在限氧培養條件下，一些源自碳代謝之電子因氧氣

濃度過低而不能被接收，此時若細胞包含用於氫氣製造之

適當代謝途徑，則使得細胞轉變成製造氫氣。當如培養基

中溶解氧濃度接近零所指示，氧轉移速率（「OTR j ）低於

氧吸收速率（「OUR」）時，產生限氧培養條件。

任何碳源皆可用於培養宿主細胞。術語「碳源」係指一

或多種能夠由宿主細胞或生物體代謝之含碳化合物。舉例

而言，用於培養宿主細胞之細胞培養基可包括適於維持生

存力或使宿主細胞生長之任何碳源。

在一些實施例中5碳源為碳水化合物（諸如單醺、雙

醺、寡醺或多醺）、轉化糖（例如酶促處理之蔗糖糖漿）、甘

油、丙三醇（例如生物柴油或製皂製程之丙三醇副產物）、

二舞·基丙酮、單碳源、油（例如植物油，諸如玉米油、棕

櫚油或大豆油）、動物脂肪、動物油、脂肪酸（例如飽和脂

肪酸、不飽和脂肪酸或多元不飽和脂肪酸）、脂質、磷

脂、甘油脂、單酸甘油酯、二酸甘油酯、三酸甘油酯、多

肽（例如微生物或植物蛋白質或肽）、可再生碳源（例如生質

碳源，諸如水解之生質碳源）、酵母提取物、來自酵母提

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取物之組分、聚合物、酸' 醇'醛、酮、胺基酸' 丁二酸

鹽、乳酸鹽、乙酸鹽、乙醇5或前述兩者或兩者以上之任

何組合。在一些實施例中，碳源為光合作用之產物，包括

（但不限於）葡萄糖。

例示性單醺包括葡萄糖及果糖；例示性寡醺包括乳糖及

蔗糖；且例示性多醺包括澱粉及纖維素。例示性碳水化合

物包括C6糖（例如果糖、甘露糖、半乳糖或葡萄糖）及C5糖

（例如木糖或阿拉伯糖）。在一些實施例中5細胞培養基包

括碳水化合物、以及非碳水化合物之碳源（例如甘油、丙

三醇、二發.基丙酮、單碳源、油、動物脂肪、動物油、脂

肪酸、脂質、磷脂、甘油脂 ' 單酸甘油酯、二酸甘油酯、

三酸甘油酯、可再生碳源，或來自酵母提取物之組分）。

在一些實施例中，細胞培養基包括碳水化合物以及多肽

（例如微生物或植物蛋白質或肽）。在一些實施例中，微生

物多肽為來自酵母或細菌之多肽。在一些實施例中，植物

多肽為來自大豆、玉米、芥花（canola）、麻風樹、棕櫚、

花生、向日葵、椰子、芥子、油菜籽、棉籽、棕櫚仁、橄

欖、紅花、芝麻或亞麻子之多肽。

在一些實施例中，碳水化合物之濃度為至少或約5公克/

公升培養液（g/L，其中培養液體積包括細胞培養基體積與

細胞體積），諸如至少或約10、15、20 ' 30 ' 40、50 ' 60 ' 80 ' 100、150、200、300、400 g/L 或 400 g/L 以上。

在一些實施例中，碳水化合物之濃度介於約50 g/L與約400 g/L之間，諸如約100 g/L與約360 g/L之間，約120 g/L與約

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360 g/L之間，或約200 g/L與約300 g/L之間。在一些實施

例中，此碳水化合物濃度包括在培養宿主細胞之前及/或

期間所添加之碳水化合物的總量。

在一些實施例中，於限制性葡萄糖條件下培養細胞。

「限制性葡萄糖條件」意謂所添加之葡萄糖的量小於或約

為細胞所消耗之葡萄糖之量的105%（諸如約100%）。在特

定實施例中，添加至培養基中之葡萄糖的量與在特定時段

期間細胞所消耗之葡萄糖之量大致相同。在一些實施例

中，藉由限制所添加之葡萄糖的量來控制細胞生長速率 ，

使得細胞以細胞培養基中葡萄糖之量可支持之速率生長 。

在一些實施例中，葡萄糖在細胞培養期間不會積累。在多

個實施例中，於限制性葡萄糖條件下培養細胞，超過或約

為1 、 2 、 3 、 5 、 10 ' 15 、 20 、 25 、 30 、 35 、 40 、 50 、 60或

70小時。在多個實施例中，於限制性葡萄糖條件下培養細

胞，超過或約為細胞培養總持續時間之5、10 > 1 5、20、

25 ' 30 ' 35 ' 40 、 50 、 60 、 70 、 80 、 90 、 95或100% 。在

不欲受任何特定理論約束下，咸信限制性葡萄糖條件可更

有利於調控細胞。

在一些實施例中，於過量葡萄糖存在下培養細胞。在特

定實施例中，所添加之葡萄糖的量大於在特定時段期間細

胞所消耗之葡萄糖之量的約105%或105%以上（諸如約為或

大於 110 ' 120 、 150 、 175 、 200 、 250 、 300 、 400 或

500%）。在一些實施例中，葡萄糖在細胞培養期間積累。

例示性脂質為任何含有一或多種飽和、不飽和或分支脂

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肪酸之物質，該一或多種脂肪酸為C4及C4以上脂肪酸。

例示性油為在室溫下呈液體之脂質。在一些實施例中，

脂質含有一或多種C4或C4以上脂肪酸（例如含有一或多種

具4個或4個以上碳之飽和、不飽和或分支脂肪酸）。在一

些實施例中5油獲自大豆、玉米、芥花 ' 麻風樹、棕櫚、

花生、向日葵、椰子、芥子、油菜籽、棉籽、棕櫚仁、橄

欖、紅花、芝麻、亞麻子、油質微生物細胞、烏柏5或前

述兩者或兩者以上之任何組合。

例示性脂肪酸包括式RCOOH之化合物，其中「R」為

煙。例示性不飽和脂肪酸包括如下化合物：其中「R」包

括至少一個碳碳雙鍵。例示性不飽和脂肪酸包括（但不限

於）油酸、十八碳烯酸、亞麻油酸、棕櫚烯酸及花生四烯

酸。例示性多元不飽和脂肪酸包括如下化合物：其中

「R」包括複數個碳碳雙鍵。例示性飽和脂肪酸包括如下

化合物：其中「R」為飽和脂族基團。在一些實施例中，

碳源包括一或多種C12-C22脂肪酸，諸如C12飽和脂肪酸、

C14飽和脂肪酸、C16飽和脂肪酸、C18飽和脂肪酸、C20飽

和脂肪酸或C22飽和脂肪酸。在一例示性實施例中，月旨肪

酸.為棕櫚酸。在一些實施例中5碳源為脂肪酸（例如不飽

和脂肪酸）之鹽、脂肪酸（例如不飽和脂肪酸）之衍生物'或

脂肪酸（例如不飽和脂肪酸）之衍生物之鹽。適合之鹽包括

（但不限於）錘鹽、鉀鹽、銅鹽及其類似鹽。二酸甘油酯及

三酸甘油酯為甘油之脂肪酸酯。

在一些實施例中，脂質、油、脂肪、脂肪酸、單酸甘油

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酯、二酸甘油酯或三酸甘油酯之濃度為至少或約ί公克/公

升培養液（g/L，其中培養液體積包括細胞培養基體積與細

胞體積），諸如至少或約5、10 ' 15 ' 20 ' 30 ' 40、50、

60 ' 80 ' 100、150、200、300、400 g/L 或 400 g/L 以上。

在一些實施例中，脂質、油、脂肪、脂肪酸、單酸甘油

酯、二酸甘油酯或三酸甘油酯之濃度介於約10 g/L與約400 g/L之間，諸如約25 g/L與約300 g/L之間，約60 g/L與約

180 g/L之間，或約75 g/L與約150 g/L之間。在一些實施例

中，該濃度包括在培養宿主細胞之前及/或期間所添加之

脂質、油、脂肪、脂肪酸、單酸甘油酯、二酸甘油酯或三

酸甘油酯的總量。在一些實施例中，碳源包括以下兩者：

（i）脂質、油、脂肪、脂肪酸、單酸甘油酯、二酸甘油酯或

三酸甘油酯；及（ii）碳水化合物，諸如葡萄糖。在一些實

施例中，脂質、油、脂肪、脂肪酸、單酸甘油酯、二酸甘

油酯或三酸甘油酯與碳水化合物之比率以碳計為約1 ： 1 （亦

即，碳水化合物中之每個碳對應於脂質、油、脂肪、脂肪

酸、單酸.甘油酯、二酸甘油酯或三酸甘油酯中之一個

碳）。在特定實施例中，脂質、油、脂肪、脂肪酸、單酸

甘油酯、二酸甘油酯或三酸甘油酯之量介於約60 g/L與180 g/L之間，且碳水化合物之量介於約120 g/L與360 g/L之

間。

例示性微生物多肽碳源包括一或多種來自酵母或細菌之

多肽。例示性植物多肽碳源包括一或多種來自大豆、玉

米、芥花、麻風樹、棕櫚、花生、向日葵、椰子、芥子、

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油菜籽、棉籽、棕櫚仁、橄欖、紅花、芝麻或亞麻子之多

肽。

例示性可再生碳源包括乾酪乳清滲透液、玉米漿、甜菜

糖蜜、大麥芽，及來自前述任一者之組分。例示性可再生

碳源亦包括諸如玉米、柳枝稷、甘蔗之生質中存在的葡萄

糖、己醺、戊醺及木糖，醱酵過程之細胞廢物，及研磨大

豆、玉米或小麥所產生之蛋白質副產物。在一些實施例

中，生質碳源為木質纖維素、半纖維素或纖維素材料，諸

如（但不限於）草、小麥、小麥稈、甜菜渣、甘蔗渣、軟木

漿、玉米、玉米穗軸或玉米殼、玉米粒、玉米粒纖維、玉

米乾草、柳枝稷、稻殼產品，或濕式或乾式研磨穀物（例

如玉米、高粱、黑麥、黑小麥、大麥、小麥及/或酒糟穀

物（distillers grains））所產生之副產物。例示性纖維素材料

包括木材、紙張及製漿廢液、草本植物，及果漿。在一些

實施例中，碳源包括任何植物部分，諸如莖幹、穀粒、根

或塊莖。在一些實施例中，使用以下任何植物之整體或一

部分作為碳源：玉米、小麥、黑麥、高粱、黑小麥、稻、

粟、大麥、木薯、豆類（諸如蠶豆及豌豆）、馬鈴薯、甘

薯、香蕉、甘蔗及/或樹薯。在一些實施例中 > 碳源為生

質水解產物，諸如包括木糖與葡萄糖或包括蔗糖與葡萄糖

之生質水解產物。

在一些實施例中，在將可再生碳源（諸如生質）添加至細

胞培養基中之前，對該可再生碳源進行預處理。在一些實

施例中，預處理包括酶促預處理、化學預處理、或酶促預

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處理與化學預處理之組合（參見，例如Farzaneh等人，

Bioresource Technology 96 （18）: 2014-2018, 2005 ；美國專

利第6,176,176號；美國專利第6,106,888號；各藉此以全文

引用的方式併入，尤其關於可再生碳源之預處理）。在一

些實施例中，在將可再生碳源添加至細胞培養基中之前 ，

使該可再生碳源部分或完全水解。

在一些實施例中，在將可再生碳源（諸如玉米乾草）添加

至細胞培養基中之前，對該可再生碳源進行氨纖維膨脹

（ammonia fiber expansion，AFEX）預處理（參見，例如

Farzaneh等人，Bioresource Technology 96 （18）: 20 14-201 8, 2005）。在AFEX預處理期間，在中等溫度（諸如約60°C至約

100°C ）及高壓（諸如約250 psi至約300 psi）下，用無水液態

氨處理可再生碳源約5分鐘。接著，快速釋放壓力。在此

過程中，木質素溶解、半纖維素水解、纖維素解晶及表面

積增加之化學作用與物理作用之組合能夠使纖維素及半纖

維素接近完全地酶促轉化成可醱酵糖。AFEX預處理之優

勢在於接近全部之氨可回收及再使用，而其餘氨充當下游

過程中微生物之氮源。又，AFEX預處理不需要洗滌流。

因此，AFEX處理後之乾物回收率基本上為100%。AFEX 本質上為乾式-乾式過程。經處理之可再生碳源長時間穩

定，且可以極高固體負載饋入酶促水解或醱酵過程中。纖.

維素及半纖維素在AFEX過程中保存完好，幾乎不降解。

在已經歷AFEX預處理之可再生碳源酶促水解之前，不需

要進行中和。經AFEX處理之碳源的酶促水解產生潔淨糖

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流供後續醱酵使用。

在一些實施例中，碳源（例如可再生碳源）之濃度等效於

至少或約 0.1、0.5、1 ' 1.5 ' 2 ' 3 ' 4、5、10、15、20 ' 30、40或50%葡萄 糖（w/v）。可使用標準HPLC方法，以葡

萄糖作為參考來量測碳源所產生之葡萄糖的量，藉此確定

葡萄糖當量數。在一些實施例中，碳源（例如可再生碳源）

之濃度等效於約0.1%至約20%葡萄糖，諸如約0.1%至約

10%葡萄糖、約0.5%至約10%葡萄糖、約1%至約10%葡萄

糖、約1 %至約5%葡萄糖，或約1%至約2%葡萄糖。

在一些實施例中，碳源包括酵母提取物、或酵母提取物

之一或多種組分。在一些實施例中，酵母提取物之濃度為

至少1公克酵母提取物/公升培養液（g/L，其中培養液體積

包括細胞培養基體積與細胞體積），諸如至少或約5、10 ' 15 、 20 、 30 、 40 、 50 、 60 、 80 、 100 、 150 、 200 、 300 g/L 或3 0 0 g/L以上。在一些實施例中，酵母提取物之濃度介於

約1 g/L與 約300 g/L之間，諸如約1 g/L與 約200 g/L之 間，

約5 g/L與 約200 g/L之間，約5 g/L與約100 g/L之 間，或約

5 g/L與約60 g/L之間。在一些實施例中，該濃度包括在培

養宿主細胞之前及/或期間所添加之酵母提取物的總量。

在一些實施例中，碳源包括酵母提取物（或其一或多種組

分）與另一碳源（諸如葡萄糖）。在一些實施例中，酵母提取

物與另一碳源之比率為約1：5、約1:10或約l:20（w/w）。

另外，碳源亦可為單碳受質，諸如二氧化碳或甲醇。關

於自單一碳源（例如甲醇、甲醛或甲酸酯）製造甘油，已報

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導甲基營養型酵母中之情形（Yamada等人，Agric. Biol.

Chem., 53（2） 541-543, 1989，其藉此以全文引用的 方式併

入，尤其關於碳源），及細菌中之情形（Hunter等人，

Biochemistry, 24, 4148-4155, 1985 , 其藉此以全文引用 的

方式併入，尤其關於碳源）。此等生物體可同化呈氧化態

介於甲烷至甲酸酯之範圍內的單碳化合物，且製造甘油。

碳同化途徑可經由單磷酸核酮糖、經由絲胺酸.或經由單磷

酸木酮糖達成（Gottschalk, Bacterial Metabolism，第 2版，

Springer-Verlag: New York, 1986 »其藉此以全文引用的方

式併入，尤其關於碳源）。單磷酸核酮糖途徑包含使甲酸

酯與核酮糖-5-磷酸縮合形成六碳糖，其變成果糖且最終變

成三碳產物甘油醛-3-磷酸。同樣，絲胺酸途徑經由亞甲基

四氫葉酸將單碳化合物同化至醺解途徑中。

除一種及兩種碳受質以外，亦已知甲基營養型生物體利

用許多其他含碳化合物，諸如甲胺、葡糖胺及多種胺基酸

來達成代謝活性。舉例而言，已知甲基營養型酵母利用甲

胺之碳形成海藻糖或甘油（Bellion等人＞ Microb. Growth Cl

Compd., [Int. Symp.]，第 7版，415-32。編輯：Murrell 等

人，出版者：Intercept, Andover, UK, 1993，其藉此以全

文引用的方式併入，尤其關於碳源）。類似地，各種假絲

酵母屬使丙胺酸或油酸發生代謝（Suiter等人＞ Arch.

Microbiol. 153（5）, 485-9, 1990，其藉此以全文引用 的方式

併入，尤其關於碳源）。

在一些實施例中，於含有生理鹽及營養素之標準培養基

149050.doc -95-

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中培養細胞（參見，例如Pourquie, J.等人，Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, Aubert 等人編，

Academic Press，第 71-86 頁，1988 及 Ilmen 等人，Appl.

Environ. Microbiol. 63:1298-1306, 1997 , 各藉此以 全文引

用的方式併入，尤其關於細胞培養基）。例示性生長培養

基為常見之商業製備之培養基，諸如魯利亞-貝爾塔尼

（Luria Bertani > LB）培養液、薩 蒲洛氏右旋糖（Sabouraud Dextrose，SD）培養液或酵母培養基（YM）培養液。亦可使

用其他限定或合成生長培養基，且供特定宿主細胞生長用

之適當培養基為熟習微生物學或醱酵科學技術者所知 。

除適當碳源以外，細胞培養基理想地含有適合之礦物、

鹽、輔因子、緩衝液，及熟習此項技術者已知適於培養物

生長或適於增強異戊二烯製造之其他組分（參見，例如WO 2004/033646與其中所引用之參考文獻、及 WO 96/35796與

其中所引用之參考文獻，各藉此以全文引用的方式併入，

尤其關於細胞培養基及細胞培養條件）。在一些實施例

中，若異戊二烯合成酶、DXS、IDI及/或MVA途徑核酸處

於誘導性啟動子之控制下，則需要以有效誘導異戊二烯合

成酶、DXS、IDI及/或MVA途徑多肽表現之濃度將誘導劑

（例如糖、金屬鹽或抗微生物劑）添加至培養基中。在一些

實施例中，細胞培養基具有對應於具有一或多種DXS、

IDI或MVA途徑核酸之載體上之抗生素抗性核酸（諸如康黴

素抗性核酸）的抗生素（諸如康黴素）。

例示性細胞培養條件

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適用於細菌培養物之維持與生長之材料及方法在此項技

術中為熟知的。例示性技術可見於Manual of Methods for

General Bacteriology, Gerhardt等人編，American Society for Microbiology, Washington, D.C. （1994）或 Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology » 第 2 版（1989） Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA 中 » 各

文獻藉此以全文引用的方式併入，尤其關於細胞培養技

術。在一些實施例中，在允許由插入宿主細胞中之核酸編

碼之一或多種異戊二烯合成酶、DXS、IDI或MVA途徑多

肽表現之條件下，於培養基中培養細胞。

可使用標準細胞培養條件培養細胞（參見5例如 W 0 2004/033646及其中所引用之參考文獻，各藉此以全文引

用的方式併入，尤其關於細胞培養與醱酵條件）。使細胞

生長並維持於適當溫度、氣相混合物及pH值（諸如約20°C 至約37°C、約6%至約84% CO2及約5至約9之pH值）下。在

一些實施例中，使細胞在35°C下於適當細胞培養基中生

長。在一些實施例中，舉例而言，在約28°C下於震盪培養

器或醱酵槽中之適當培養基中培養培養物，直至達成共同

製造所要量之異戊二烯與氫氣為止。在一些實施例中，醱

酵之pH值範圍為約pH 5.0至約pH 9.0（諸如約pH 6.0至約pH 8.0，或約6.5至約7.0）。可基於宿主細胞之需求，在好

氧、缺氧或厭氧條件下進行反應。在一些實施例中，於限

氧條件下培養細胞。在一些實施例中1在氧氣存在下，於

每莫耳所製造之異戊二烯吸收0.5莫耳氧氣之條件下培養

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細胞。在一些實施例中，於厭氧條件下培養細胞。既定絲

狀真菌之例示性培養條件在此項技術中為已知的，且可見

於科學文獻及/或來自真菌來源，諸如美國菌種保存中心

(American Type Culture Collection)及真菌遺傳保存中心

(Fungal Genetics Stock Center) °在多個實施例中，使用任何已知之醱酵模式，諸如分

批、批式補料(fed-batch)或連續製程使細胞生長。在一·些

實施例中，使用分批醱酵方法。經典分批醱酵為封閉系

統，其中培養基之組成在醱酵開始時進行設定且在醱酵期

間不會作出人工變更。因此，在醱酵開始時，用所要宿主

細胞接種細胞培養基且在未尙系統中添加任何物質下進行

醱酵。然而，「分批」醱酵就添加碳源而言通常為分批

的，且常常試圖控制諸如pH值及氧濃度之因素。在分批系

統中，系統之代謝物及生質組成恆定地發生變化直至停止

醱酵為止。在分批培養中，細胞平緩經過靜態遲滯期

(static lag phase)至高度生長對數期，且最終到達生長速率

減緩或停止之停滯期。在一些實施例中，對數期之細胞負

責製造大部分異戊二烯。在一些實施例中，停滯期之細胞

製造異戊二烯。

在一些實施例中，使用基於標準分批系統之變更，諸如

批式補料系統。批式補料醱酵過程包含典型分批系統，但

隨著醱酵之進行，遞增式添加碳源。當分解代謝物抑制作

用傾向於抑制細胞代謝時且當細胞培養基中需要具有有限

量之碳源時，批式補料系統為適用的。可以有限量或過量

149050.doc -98-

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之碳源（例如葡萄糖）進行批式補料醱酵。量測批式補料系

統中碳源之實際濃度較為困難，且因此基於諸如pH值、溶

解氧、及廢氣（諸如CO2）分壓之可量測因素的變化來估算

該實際濃度。分批及批式補料醱酵為常見的且在此項技術

中為熟知的'且實例可見於Brock, Biotechnology: A

Textbook of Industrial Microbiology ，第 2版（1989） Sinauer Associates, Inc. ＞該文獻藉此以全文引用的方 式併入，尤

其關於細胞培養與醱酵條件。

在一些實施例中，使用連續醱酵方法。連續醱酵為開放

系統，其中將限定醱酵培養基連續添加至生物反應器中，

且同時移除等量條件培養基以供處理。連續醱酵一般將培

養物維持在恆定的高密度下，其中細胞主要處於生長對數

期。

連續醱酵允許調節影響細胞生長或異戊二烯製造之一個

因素或多個因素。舉例而言，一種方法將諸如碳源或氮含

量之限制性營養素維持於固定速率下且允許減緩所有其他

參數。在其他系統中，可連續改變多個影響生長之因素，

同時使細胞濃度（例如由培養基濁度量度之濃度）保持恆

定。連續系統力求維持穩態生長條件。因此，因抽出培養

基所致之細胞損失針對醱酵中之細胞生長速率達成平衡。

調節連續醱酵過程之營養素及生長因素之方法以及使產物

形成速率最大化之技術在工業微生物學技術中為熟知的，

且多種方法係由 Brock, Biotechnology: A Textbook of

Industrial Microbiology，第 2版（1989） Sinauer Associates,

149050.doc -99-

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Inc.詳述，該文獻藉此以全文引用的方式併入，尤其關於

細胞培養與醱酵條件。

在一些實施例中，細胞固定於作為全細胞催化劑之受質

上且經受醱酵條件以供製造異戊二烯 。

在一些實施例中，將液體培養瓶置於震盪器中以將氧氣

引入液體中且維持培養物之均勻性。在一些實施例中，使

用培育箱控制培養物生長之溫度、濕度、震盪速度及/或

其他條件。最簡單之培育箱為具有可調式加熱器（通常至

多升至約65°C ）之保溫箱。更精緻之培育箱亦可具有降低

溫度（經由致冷）之能力或控制濕度或CO?含量之能力。最

精密之培育箱包括計時器；一些亦可經程式設計以循環通

過不同溫度、濕度水準等。培育箱之台面至單元之尺寸、

小室之尺寸可改變。

必要時，可更換細胞培養基之一部分或全部以補充營養

素及/或避免潛在有害之代謝副產物及死細胞積累。在懸

浮液培養之狀況下，可藉由離心或過濾懸浮液培養物且接

著將細胞再懸浮於新鮮培養基中而自培養基分離細胞。在

貼壁培養之狀況下，可藉由抽吸直接移除培養基且加以替

換。在一些實施例中，細胞培養基允許至少一部分細胞於

連續培養物（諸如未經稀釋之連續培養物）中分裂，達至少

或約5、10 ' 20 ' 40 ' 50 ' 60、65次或65次以上之細胞分

裂。

在一些實施例中，使用組成性啟動子或滲漏啟動子

（leaky promoter）（諸如Trc啟動子），且不添加 用以誘 導可操

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作地連接於該啟動子之異戊二烯合成酶、DXS、IDI或

MVA途徑核酸表現之化合物（諸如IPTG）。在一些實施例

中，添加用以誘導可操作地連接於啟動子之異戊二烯合成

酶、DXS、IDI或MVA途徑核酸表現之化合物（諸如

IPTG）。

使異戊二烯製造與細胞生長相分離之例示性方法

理想的是，原料中之碳轉化成異戊二烯，而非用於細胞

之生長及維持。在一些實施例中，使細胞生長至低OD6oo 至中等OD6oo，接著開始或增強異戊二烯製造。此策略使

得大部分碳轉化成異戊二烯。

在一些實施例中，細胞達到使之不再分裂或分裂極其緩

慢之光學密度，但繼續製造異戊二烯，持續數小時（諸如

約 2、4 ' 6 ' 8 ' 10 ' 15 ' 20、25、30 小時或 30 小時以

上）。舉例而言，圖60A-67C說明在細胞達到使之不再分裂

或分裂極其緩慢之光學密度之後，細胞可繼續製造大量甲

無戊酸或異戊二烯。在一些狀況下，550 nm下之光學密度

隨時間降低（諸如在細胞因細胞溶解而不再處於指數生長

期之後，光學密度降低），且細胞繼續製造大量甲無戊酸

或異戊二烯。在一些實施例中，550 nm下細胞之光學密度

經某一時段（諸如超過或約5、10 ' 15 ' 20 ' 25、30、40、

50或60小時）増加小於或約50%（諸如小於或約40、30、

20 ' 10 ' 5或0%），且在此時段期間細胞製造大於或約1、

10 ' 25 ' 50 ' 100、150、200、250、300、400、500、

600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、

149050.doc -101 -

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2,000、2,500、3,000、4,000、5,000 奈莫耳異戊二烯/公克

細胞（細胞濕重）/小時（nmol/gwcm/h）或 5,000 nmol/gwcm/h 以

上之異戊二烯。在一些實施例中，異戊二烯之量為約2至

約 5,000 nmol/gwcm/h，諸如約 2至約 100 nmol/gwcm/h、約

100 至約 500 nmol/gwcm/h、約 150 至約 500 nmol/gwcm/h、約

500 至約 1,000 nmol/gwcm/h 、約 1,000 至約 2,000 nmol/gWcm/h、或約 2,000至約 5,000 nmol/gwcin/h。在一些實

施例中，異戊二烯之量為約20至約5,000 nmol/gwcm/h、約

100至約 5,000 nmol/gwcm/h、約 200至約 2,000 nmol/gwcm/h、

約 200 至約 1,000 nmol/gwcm/h 、約 300 至約 1,000 nmol/gWcm/h、或約 400至約 1,000 nmol/gwcm/h。

在一些實施例中，550 nm下細胞之光學密度經某一時段

（諸如超過或約5、10 ' 15 > 20 ' 25、30、40 ' 50或60小日寺）

增加小於或約50%（諸如小於或約40 ' 30 ' 20 ' 10 ' 5或

0%），且在此時段期間細胞製造累積力價（總量）大於或約

為 1、10、25、50、100 ' 150、200、250、300、400、

500 、 600 、 700 、 800 、 900 、 1,000 、 1,250 、 1,500 、

1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、

50,000 ' 100,000毫克異戊二烯/公升培養液（mg/L培卷液，其

中培養液體積包括細胞及細胞培養基之體積）或100,000 mg/L培養液以上之異戊二烯。在一些實施例中，異戊二烯之

量為約2至約5,000 mg/L培普浪，諸如約2至約100 mg/L培養液、

約100至 約500 mg/L培養液、約500至 約1,000 mg/L培釜液、約

1,000至約2,000 mg/L培養液、或纟勺2,000至纟勺5,000 mg/L培養液。

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在一些實施例中，異戊二烯之量為約20至約5,000 mg/L培卷液、

約100至纟勺5,000 mg/L培善液、200至 約2,000 mg/L培养液、纟勺

200至約1,000 mg/L培養液、約300至約1,000 mg/L培養波、或約

400至 約1,000 mg/L培养液。

在一些實施例中，550 nm下細胞之光學密度經某一時段

（諸如超過或約5、10 ' 15 ' 20 ' 25、30、40 ' 50或60小時）

增加小於或約50%（諸如小於或約40 ' 30 ' 20 ' 10、5或

0%），且在此時段期間細胞使細胞培養基中大於或約

0.0015、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、

0.14 、 0.16 、 0.2 、 0.3 、 0.4 、 0.5 、 0.6 、 0.7 、 0.8 、 0.9 、

1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、

5.0、6.0、7.0或8.0%之碳轉化成異戊二烯。在一些實施例

中，碳轉化成異戊二烯之轉化百分率為諸如約。.002%至約

4.0%、約 0.002% 至約 3.0%、約 0.002% 至約 2.0%、約

0.002% 至約 1.6%、約 0.002% 至約 0.005%、約 0.005% 至約

0.01% ' 約 0.01% 至約 0.05% ' 約 0.05% 至約 0.15%、0.15% 至約0.2%、約0.2%至約0.3%、約0.3%至約0.5%、約0.5% 至約0.8%、約0.8%至約1.0%、或約1.0%至約1.6%。在一

些實施例中，碳轉化成異戊二烯之轉化百分率為約0.002% 至約 0.4%、0.002% 至約 0.16%、0.04% 至約 0.16%、約

0.005%至約0.3%、約0.01%至約0.3%、或約0.05%至約

0.3%。

在一些實施例中，僅在停滯期製造異戊二烯。在一些實

施例中，在生長期與停滯期皆製造異戊二烯。在多個實施

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例中，在停滯期期間所製造之異戊二烯之量（諸如所製造

之異戊二烯的總量，或1 OD6oo每小時每公升培養液所製造

之異戊二烯之量）大於或約為在生長期期間歷經相同持續

時間所製造之異戊二烯之量的2、3、4、5、10、20、30、

40、50倍或50倍以上。在多個實施例中，當細胞處於停滯

期時，製造大於或約為所製造總量（諸如在醱酵期間歷經

某一時間段（諸如20小時）製造之異戊二烯）之5、10、20 ' 30、40、50、60、70、80、90、95、99% 或 99% 以上之異

戊二烯。在多個實施例中，當細胞緩慢分裂或不分裂，使

得550 nm下細胞之光學密度増加小於或約50%（諸如小於或

約40、30、20、10 ' 5或0%）時，製造大於或約為所製造總

量（諸如在醱酵期間歷經某一時間段（諸如20小時）製造之異

戊二烯）之 5、10 ' 20 ' 30 ' 40 ' 50、60 ' 70 ' 80、90 ' 95、99%或99%以上之異戊二烯。在一些實施例中，僅在

生長期製造異戊二烯。

在一些實施例中'一或多種MVA途徑、IDI、DXP或異

戊 二烯合成酶核 酸置於在停滯期比在生長期 更具活性之啟

動子或因子的控制下。舉例而言，一或多種MVA途徑、

IDI、DXP或異戊二烯合成酶核酸可置於停滯期。因子（諸如

RpoS）之控制下。在一些實施例中，一或多種MVA途徑、

IDI、DXP或異戊二烯合成酶核酸置於在停滯期可誘導之

啟動子，諸如在停滯期可由反應調控子誘導呈活性之啟動

子的控制下。

在安全操作範圍內製造異戊二烯

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根據異戊二烯之可燃性特徵在安全操作水準下製造異戊

二烯簡化了工業化設施之設計與構建，大大改良安全操作

之能力，且限制起火之可能性。詳言之，異戊二烯製造之

最佳範圍處於安全區域內，亦即，異戊二烯濃度之非可燃

範圍內。在一此類態樣中，本文中描述一種在異戊二烯濃

度之非可燃範圍內（異戊二烯之可燃包絡範圍（flammability envelope）外）製造異戊二烯之方法。

因此，使用電腦模型化及實驗測試來測定異戊二烯（諸

如在。2、N2、CO2或兩種或兩種以上前述氣體之任何組合

存在下的異戊二烯）之可燃限度以確保製程安全性。可燃

包絡範圍 之特徵在於可燃下限（LFL）、可燃上限（UFL）、極

限氧濃度（LOC）及極限溫度。若系統欲可燃'則須在最少

量之氧化劑（通常為氧氣）存在下含有最少量之燃料（諸如異

戊二烯）。LFL為維持燃燒須存在之異戊二烯的最小量，而

UFL為可存在之異戊二烯的最大量。高於此限度時，混合

物富含燃料且氧氣分數過低而使混合物不可燃。LOC表示

亦須存在以使混合物可燃之氧氣的最小分數。極限溫度係

基於異戊二烯之閃點且為異戊二烯燃燒可傳播之最低溫

度。此等限度具體到異戊二烯濃度、氧化劑類型及濃度、

系統中存在之惰性物質、系統溫度及壓力。處於可燃包絡

範圍之限度內的組合物傳播燃燒且在製程設備之設計與操

作方面需要其他安全防範。

使用電腦模擬與數學分析以及實驗測試來測試以下條

件。必要時，可使用本文所述之方法來測試其他條件（諸

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如其他溫度、壓力及永久氣體組成)以測定LFL、UFL及

LOC濃度。

(1) 電腦模擬與數學分析

測試套件1 :

異戊二烯：0重量%-14重量％

O2 : 6重量％-21重量％

N2 : 79重量%-94重量%

測試套件2 :

異戊二烯：0重量%-14重量％

。2 ： 6重量％-21重量%

N2 : 79重量%-94重量％

以H2O達到飽和

測試套件3 :

異戊二烯：0重量%-14重量％

。2 ： 6重量％-21重量%

N2 : 79重量%-94重量％

CO2 : 5重量％-30重量％

(2) 最终測定可燃限度之實驗測試

測試套件1 :

異戊二烯：0重量%-14重量％

02 : 6重量％-21重量％

N2 : 79重量%-94重量％

測試套件2 :

異戊二烯：0重量%-14重量％

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02 : 6重量％-21重量％

N2 : 79重量%-94重量％

以H2O達到飽和

使用模擬軟體得到若干不同測試條件下系統之可燃特徵

的估算值。C02顯示對系統之可燃限度無顯著影響。藉由

實驗測試確認測試套件1及2。模型化結果與實驗測試結果

相一致。在添加水之情況下發現僅稍有變化。

40°C及1個大氣壓下，異戊二烯、。2、Μ及CO?混合物

之LOC據測定為9.5體積％。添加至多30% CO2不會顯著影

響異戊二烯、。2及Ν?混合物之可燃特徴。在無水與以水達

到飽和之異戊二烯、。2及N2系統之間顯示可燃特徵僅稍有

變化。極限溫度為約-54°c。低於約-54°c之溫度因過低而

不能傳播異戊二烯燃燒。

在一些實施例中，視系統中氧氣之量而定，異戊二烯之

LFL在約1.5體積％至約2.0體積％之範圍內，且異戊二烯之

UFL在約2.0體積％至約12.0體積％之範圍內。在一些實施

例中，LOC為約9.5體積％之氧氣。在一些實施例中，當溫

度為約25°C至約55°C （諸如約40°C ）且壓力為約1個大氣壓至

3個大氣壓時，異戊二烯之LFL為約1.5體積％至約2.0體積

%，異戊二烯之UFL為 約2.0體積％至約12.0體積％，且LOC 為約9.5體積％之氧氣。

在一些實施例中，在小於約9.5體積％（亦即，低於異戊

二烯混合物可燃所需之LOC）之氧氣存在下製造異戊二

烯。在大於或約9.5體積％之氧氣存在下製造異戊二烯之一

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些實施例中，異戊二烯濃度低於LFL（諸如低於約1.5體積

%）。舉例而言，可藉由用惰性氣體稀釋異戊二烯組合物

（例如，藉由連續或週期性地添加諸如氮氣之惰性氣體以

保持異戊二烯組合物低於LFL）來保 持異戊 二烯之量低於

LFL。在大於或約9.5體積％之氧氣存在下製造異戊二烯之

一些實施例中，異戊二烯濃度高於UFL（諸如高於約12體積

%）。舉例而言，可使用製造濃度高於UFL之異戊二烯的系

統（諸如本文所述之任何細胞培養系統）來保持異戊二烯之

量高於UFL。必要時，可使用相對較低含量之氧氣以使得

UFL亦相對較低。在此狀況下，需要較低異戊二烯濃度以

保持高於UFL。

在大於或約9.5體積％之氧氣存在下製造異戊二烯之一些

實施例中，異戊二烯濃度在可燃包絡範圍內（諸如介於LFL 與UFL之間）。在一些實施例中，當異戊二烯濃度可能處於

可燃包絡範圍內時，進行一或多個步驟以降低起火或爆炸

之可能性。舉例而言，可避開一或多個燃燒源（諸如可能

產生火花之任何材料）。在一些實施例中，進行一或多個

步驟以縮短異戊二烯濃度保持在可燃包絡範圍內之時間

段。在一些實施例中，使用感測器偵測異戊二烯濃度何時

接近或處於可燃包絡範圍內。必要時，可在細胞培養期間

於一或多個時間點量測異戊二烯濃度，且若異戊二烯濃度

接近或處於可燃包絡範圍內，則可使用標準方法調整細胞

培養條件及/或惰性氣體量。在特定實施例中，調整細胞

培養條件（諸如醱酵條件）以使異戊二烯濃度降至LFL以下

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或使異戊二烯濃度增至UFL以上。在一些實施例中，藉由

用惰性氣體稀釋異戊二烯組合物（諸如藉由連續或週期性

地添加惰 性氣體以保持 異戊二烯組合物低於LFL）來保持異

戊二烯之量低於LFL。

在一些實施例中，除異戊二烯以外之可燃性揮發物（諸

如一或多種糖）之量比所製造的異戊二烯之量至少約低2、

5、10、50、75或100倍。在一些實施例中，除異戊二烯氣

體以外之氣相部分包含約0%至約100%（體積）之氧氣'諸

如約0%至約10%、約10%至約20%、約20%至約30%、約

3 0%至約40%、約40%至約5 0%、約5 0%至約60%、約60% 至約70%、約70%至約80%、約80%至約90%、或約90%至

約100%（體積）之氧氣。在一些實施例中，除異戊二烯氣體

以外之氣相部分包含約0%至約99%（體積）之氮氣，諸如約

0%至約10% ＞約10%至約20%、約20%至約3 0%、約3 0%至

約40%、約40%至約5 0%、約5 0%至約60%、約60%至約

70%、約70%至約80%、約80%至約90%、或約90%至約

99%（體積）之氮氣。

在一些實施例中，除異戊二烯氣體以外之氣相部分包含

約1%至約50% （體積）之CO?，諸如約1%至約10%、約10%至

約20%、約20%至約3 0%、約30%至約40%、或約40%至約

50%（體積）之CO2。

在一些實施例中，異戊二烯組合物亦含有乙醇。舉例而

言，可使用乙醇對異戊二烯進行萃取蒸餾，從而得到包括

乙醇及異戊二烯之組合物（諸如中間產物流）。理想地，乙

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醇之量處於乙醇之可燃包絡範圍外。在標準條件 > 諸如約

1個大氣壓及約60°F下，乙醇之LOC為約8.7體積％，且乙

醇之 LFL 為約 3.3 體積 %（NFPA 69 Standard on Explosion Prevention Systems, 2008版5其藉此以全文引用的方式併

入，尤其關於LOC、LFL及UFL值）。在一些實施例中，在

低於乙醇混合物可燃所需之LOC（諸如小於約8.7體積％）下

製造包括異戊二烯及乙醇之組合物。在高於或約為乙醇混

合物可燃所需之LOC下製造包括異戊二烯及乙醇之組合物

的一些實施例中，乙醇濃度低於LFL（諸如小於約3.3體積

%）。

在多個實施例中，氧化劑（諸如氧氣）之量低於系統中任

何燃料（諸如異戊二烯或乙醇）之LOC。在多個實施例中，

氧化劑（諸如氧氣）之量比異戊二烯或乙醇之LOC約低60、

40、30、20、10或5%。在多個實施例中，氧化劑（諸如氧

氣）之量比異戊二烯或乙醇之LOC至少低2、4 > 5或5個以

上絕對百分點（體積％）。在特定實施例中，氧氣之量比異

戊二烯或乙醇之LOC至少低2個絕對百分點（體積％）（諸如

當異戊二烯之LOC為9.5體積％時，氧氣濃度小於7.5體積

%）。在多個實施例中，燃料（諸如異戊二烯或乙醇）之量小

於或約為彼燃料之LFL的25、20、15、10或5%。

以高效率製造並回收由醱酵而得之異戊二烯，一種揮發

性煙

本文中提供製造異戊二烯之方法，其包含a）在適於製造

異戊二烯之條件下培養細胞；及（b）製造異戊二烯，其中異

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戊二烯之液相濃度小於約200 mg/L。在一些實施例中 , 培

養物中異戊二 烯之液相濃度小於約以下任一值：175mg/L、150 mg/L、125 mg/L、100 mg/L、75 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、20 mg/L、15 mg/L、10 mg/L、5 mg/L或

2.5 mg/L。在一些實施例中，培養物中異戊二烯之液相濃

度為約 以下任一範圍：0.1 mg/L至200 mg/L、1 mg/L至200 mg/L、1 mg/L至 150 mg/L、1 mg/L至 100 mg/L、1 mg/L至

50 mg/L、1 mg/L 至 25 mg/L、1 mg/L 至 20 mg/L、或 10 mg/L至20 mg/L。在一些實施例中，所製造之異戊二烯為

題為「例示性製造異戊二烯」之章節中所揭示之任何濃度

或量。在一些實施例中，液相濃度低於異戊二烯之溶解限

度。

在方法之-■■些實施例中'細胞製造大於約400nmol/gwcm/h之異戊二烯。在一些實施例中，異戊二烯之量

為約以下任一範圍：400 nmol/gwcm/h至 1 mol/gwcm/h、400nmol/gwcm/h 至 1 mmol/gwcm/h、400 nmol/gwcm/h 至 40mmol/gwcm/h 、 400 nmol/gwcm/h 至 4 mmol/gwcm/h、1mmol/gwcm/h 至 1.5 mmol/gwcm/h、 1.5 mmol/gwcm/h 至 3mmol/gwcm/h 、 3 mmol/gwcm/h 至 5 mmol/gwcm/h 、 5mmol/gWcm/h 至 25 mmol/gWcm/h、25 mmol/gwcm/h 至 100mmol/gwcm/h、100 mmol/gwcm/h至 500 mmol/gwcm/h、或 500 mmol/gwcm/h至 1000 mmol/gwcm/h。在一些實施例中，異戊

二烯之量為約以下任一值：1 mmol/gwcm/h、1.5 mmol/gwcm/h 、 2 mmol/gwcm/h 、 3 mmol/gwcm/h 、 4

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mmol/gwcm/h或 5 mmol/gwcm/h °亨利係數（Henry's coefficient）（以M atm'1為 單位）之低值

意謂可藉由以低釋氣速率（例如0.01 vvm至2 vvm）進行氣提

而自醱酵培養液中回收異戊二烯。在一些實施例中，釋氣

速率為約以下任一範圍：0.1 vvm至1 vvm、0.01 vvm至0.5 vvm、0.2 vvm至 1 vvm、或 0.5 vvm至 1 vvm ° 在一些實施

例中，釋氣速率為約以下任一值：0.1 vvm、0.25 vvm、

0.5 vvm、0.75 vvm、1 vvm、1.25 vvm、1.5 vvm、1.75 vvm或2 vvm °在一些實施例中，在生長期期間或在停滯期

期間，在整個醱酵操作過程中維持低釋氣速率。在一些實

施例中，維持低釋氣速率達約以下任一時段：1小時至5小

時、5小時至10小時、10小時至20小時、20小時至30小

時、30小時至40小日寺、40小時至50小時、或50小時至60小

時。理想釋氣下限定義為水相以異戊二烯變得飽和且有機

液相形成之點。此僅可在低於異戊二烯沸點（1 atm下

34.1 °C）下發生，高於該沸點將決不會形成異戊二烯液相。

在低於異戊二烯沸點之溫度下，由異戊二烯之水溶度確定

液相形成，該水溶度在25°C下為約650 mg/L。儘管非常需

要避免異戊二烯液相形成，但倘若細胞可耐受無毒性作用

之液體異戊二烯的存在，則並不絕對需要避免其形成。

在一些實施例中，氧氣、CO?及異戊二烯為題為「在安

全操作範圍內製造異戊二烯」之章節中所論述之任何量或

濃度。在一些實施例中，細胞在維持完全需氧代謝時消耗

所有氧氣。在一些實施例中，使用過量氧氣滿足細胞之需

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氧量。釋出氣體中氧氣之理想範圍為小於20%、或小於

15% '或小於10%（v/v）。低於異戊二烯燃燒所需之極限氧

濃度（1 atm下9.5% v/v）的氧含量為尤其理想的。在一些實

施例中，為使氣體吹掃速率最小，同時滿足細胞需氧量，

利用富氧空氣。在一些實施例中，氣體吹掃之氣相部分包

含約0.1%至約10%、約10%至約20%、或約20%至約

30%（體積）之氧氣。在一些實施例中，在高壓下進行異戊

二烯醱酵以使維持液相中所需溶解氧含量所需要的過量氧

之量降至最低。

在一些實施例中，通過醱酵槽之氣體吹掃速率降低對於

整合異戊二烯製造過程之有利之處在於，該等條件使得釋

出氣體中之異戊二烯含量富集高達約30,000卩g/L（約1% v/v），而不會不利地影響細胞之生理機能。

在一些實施例中，較低釋氣速率不會顯著不利地影響細

胞之生理機能。在一些實施例中，釋氣速率較低之培養物

中細胞之二氧化碳析出速率為約以下任一範圍：1X10'18 mmol/L/h 至約 1 mol/L/h、1 mmol/L/h 至 1 mol/L/h、25 mmol/L/h至 750 mmol/L/h、25 mmol/L/h至 75 mmol/L/h、

250 mmol/L/h 至 75 0 mmol/L/h、或 45 0 mmol/L/h 至 5 50 mmol/L/h。在一些實施例中，二氧化碳析出速率為約以下

任一值：50 mmol/L/h、100 mmol/L/h、150 mmol/L/h、

200 mmol/L/h、250 mmol/L/h ' 3 00 mmol/L/h、3 50 mmol/L/h 、 400 mmol/L/h 、 45 0 mmol/L/h 或 500 mmol/L/h。在一些實施例中，釋氣速率較低之細胞的生存

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力降低程度小於約以下任一值：1.75倍、1.5倍、1.25倍、

1倍、0.75倍、0.5倍或0.25倍。在一些實施例中，釋氣速

率較低之細胞的生存力降低至約1 / 2。在一些實施例中»

將釋氣速率較低之表現MVA途徑及/或DXP途徑RNA及/或

來自異源MVA途徑及/或DXP途徑核酸及/或MVA途徑及/或

DXP途徑核酸之複本中之一或多者之蛋白質的細胞之細胞

生存力與釋氣速率較低之缺乏異源MVA途徑及/或DXP途

徑核酸及/或MVA途徑及/或DXP途徑核酸之複本中之一或

多者的對照細胞相比較。在一些實施例中，將釋氣速率較

低之在誘導性啟動子（其中該啟動子經誘導）控制下表現

MVA途徑及/或DXP途徑RNA及/或來自異源MVA途徑及/或

DXP途徑核酸及/或MVA途徑及/或DXP途徑核酸之複本中

之一或多者之蛋白質的細胞之細胞生存力與釋氣速率較低

之在誘導性啟動子（其中該啟動子未加以誘導（未經誘導））

控制下含有異源MVA途徑及/或DXP途徑核酸及/或MVA途

徑及/或DXP途徑核酸之複本中之一或多者的對照細胞相比

較。在一些實施例中，誘導性啟動子為。-半乳糖普酶啟動

子。

在一些實施例中，經遺傳修飾之宿主生物體之醱酵使生

物體所消耗之總碳的至少5%轉化成揮發性不飽和煙。在

一些實施例中，不飽和煙之製造速率使得醱酵釋出氣體中

存在之不飽和煙的含量為至少約100卩g/L、500卩g/L、

1000 卩g/L、2,500 卩g/L、5,000 卩g/L、7,500 卩g/L或 10,000 卩g/L中之任一值。

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在一些實施例中，以適於高製造速率之方式自釋出氣流

中回收不飽和煙，該等速率對應於釋出氣體中至少約100 卩g/L、500 卩g/L、1000 卩g/L、2,500 pg/L、5,000 gg/L、

7,500卩g/L或1 0,000卩g/L中之任一值的濃度。在一些實施

例中，尤其以低氣體吹掃速率自醱酵釋出氣體中連續萃取

並回收不飽和煙，使得所得釋出氣體中富集相關揮發性組

分。在一些實施例中，由依賴於較高揮發物濃度之方法回

收揮發性煙。舉例而言，經由使用壓縮/冷凝或萃取蒸餾

技術有效捕集醱酵釋出氣體中之異戊二烯。亦涵蓋使用活

性碳濾筒以及矽膠吸附劑，使異戊二烯自碳濾筒脫附並濃

縮，及/或構築可使約5%或5%以上之葡萄糖受質轉化成異

戊二烯且使得釋出氣體中異戊二烯之濃度大於約15,000 卩g/L之宿主生物體，諸如大腸桿菌菌株，並使該等生物體

醱酵。回收方法包括本文所述之任何方法。

本文中亦提供製造化合物之方法，其中該化合物具有一

或多種選自由以下組成之群的特徵：（a）亨利定律係數小於

約25 0 M/atm，及（b）水中溶解度小於約100 g/L。在一些實

施例中，該方法包含：a）在適於製造化合物之條件下培養

細胞,其中以約0.01 vvm至約2 vvm之釋氣速率添加氣體

（諸如添加氣體至系統中，諸如醱酵系統中）；及b）製造化

合物。

在一些實施例中，分配至細胞塊中之化合物的量不包括

於液相溶解度值中。在一些實施例中，液相濃度低於化合

物之溶解限度。

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在一些實施例中，可藉由以中等釋氣速率至低釋氣速率

進行氣提而自醱酵培養液中連續回收化合物5尤其亨利定

律係數為 約 小於 250 M/atm、200 M/atm、150 M/atm、1 00 M/atm、75 M/atm、50 M/atm、25 M/atm、10 M/atm、5 M/atm或1 M/atm中之任一值的彼等化合物。實例包括醛，

諸如乙醛(15 M/atm)；酮，諸如丙酮(30 M/atm)或2-丁酮

(20 M/atm)；或醇，包括甲醇(220 M/atm)、乙醇(200 M/atm)、1-丁醇(120 M/atm)，或 C5 醇，包括 3 -甲基-3-丁

烯-1-醇及3-甲基-2-丁烯-1-醇(50-100 M/atm)。醇酯之亨利

常數一般低於各別醇'例如乙酸乙酯(6-9 M/atm)或C5醇之

乙醯酯(<5 M/atm)。亨利 定律係數小於1 M/atm之化合物為

尤其理想的。實例包括半花、單葩或倍半葩，以及其他

煙，諸如C 1至C5煙(例如甲烷、乙烷、乙烯或丙烯)。在一

些實施例中'諸如C 1至C5煙之煙為飽和、不飽和或分支

的。

一般而言，亨利定律係數與水溶度之間的關聯在於具有

極低係數之化合物難溶於水(實質上不溶於水)。儘管可藉

由氣提移除水中溶解度無限大之揮發物(例如丙酮或乙

醇)，但理想溶解限度為小於約100 g/L > 75 g/L、50 g/L、

25 g/L、1 0 g/L、5 g/L或 1 g/L 中之任一值。

在製造上述任何化合物之任何方法的一些實施例中，釋

氣速率為約 以下任一範圍：0.1 vvm至1 vvm、0.2 vvm至1 vvm、或0.5 vvm至1 vvm。在一些實施例中，釋氣速率為

約以下任一值：0.1 vvm、0.25 vvm、0.5 vvm、0.75

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vvm、1 vvm、1.25 vvm、1.5 vvm、1.75 vvm或 2 vvm ° 在

一些實施例中，在生長期期間或在停滯期期間，在整個醱

酵操作過程中維持低釋氣速率。在一些實施例中，維持低

釋氣速率達約以下任一時段：1小時至5小時、5小時至10 小時、10小時至20小時、20小時至30小時、30小時至40小

時、40小時至50小時、或50小時至60小時。

本文所述之任何系統皆可用於製造上述化合物之方法

中。標準方法將用於純化，諸如題為「例示性純化方法」

之章節中所述之彼等方法。可在回收後進行分離，例如藉

由蒸餾或選擇性吸附技術進行分離。

例示性製造生物異戊二烯

在一些實施例中，在允許細胞製造異戊二烯之條件下於

培養基中培養細胞。

「峰值絕對生產力」意謂在歷經特定時段培養細胞（例

如在特定醱酵操作期間培養細胞）期間釋出氣體中異戊二

烯之最大絕對量。「峰值絕對生產力時間點」意謂在醱酵

操作期間，在歷經特定時段培養細胞（例如在特定醱酵操

作期間培養細胞）期間釋出氣體中異戊二烯之絕對量處於

最大值時的時間點。在一些實施例中，於峰值絕對生產力

時間點量測異戊二烯之量。在一些實施例中，細胞之峰值

絕對生產力約為本文中所揭示之任何異戊二烯的量。

「峰值比生產力」意謂在歷經特定時段培養細胞（例如

在特定醱酵操作期間培養細胞）期間每個細胞所製造之異

戊二烯的最大量。「峰值比生產力時間點」意謂在歷經特

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定時段培養細胞（例如在特定醱酵操作期間培養細胞）期

間，每個細胞所製造之異戊二烯之量處於最大值時的時間

點。如600 nm下之光學密度（OD600）所測定，藉由用 總生產

力除以細胞量來測定峰值比生產力。在一些實施例中，於

峰值比生產力時間點量測異戊二烯之量。在一些實施例

中，細胞之峰值比生產力約為本文中所揭示之任何異戊二

烯的量/細胞.°

「峰值體積生產力」意謂在歷經特定時段培養細胞（例

如在特定醱酵操作期間培養細胞）期間每體積培養液（包括

細胞及細胞培養基之體積）所製造之異戊二烯的最大量。

「峰值比體積生產力時間點」意謂在歷經特定時段培養細

胞（例如在特定醱酵操作期間培養細胞）期間，每體積培養

液所製造之異戊二烯之量處於最大值時的時間點。藉由用

總生產力除以培養液體積及時間量來測定峰值比體積生產

力。在一些實施例中，於峰值比體積生產力時間點量測異

戊二烯之量。在一些實施例中，細胞之峰值比體積生產力

約為本文中所揭示之每段時間每體積之任何異戊二烯的

量°

「峰值濃度」意謂在歷經特定時段培養細胞（例如在特

定醱酵操作期間培養細胞）期間所製造之異戊二烯的最大

量。「峰值濃度時間點」意謂在歷經特定時段培養細胞（例

如在特定醱酵操作期間培養細胞）期間，每個細胞所製造

之異戊二烯之量處於最大值時的時間點。在一些實施例

中，於峰值濃度時間點量測異戊二烯之量。在一些實施例

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中，細胞之峰值濃度約為本文中所揭示之任何異戊二烯的

量°

「平均體積生產力」意謂在歷經特定時段培養細胞（例

如在特定醱酵操作期間培養細胞）期間每體積培養液（包括

細胞及細胞培養基之體積）所製造之異戊二烯的平均量。

藉由用總生產力除以培養液體積及時間量來測定平均體積

生產力。在一些實施例中，細胞之平均比體積生產力約為

本文中所揭示之每段時間每體積之任何異戊二烯的量。

「累積總生產力」意謂在歷經特定時段培養細胞（例如

在特 定醱酵 操作期間培養細胞）期間所製造之異戊二烯的

累積總量。在一些實施例中，量測異戊二烯之累積總量。

在一些實施例中，細胞之累積總生產力約為本文中所揭示

之任何異戊二烯的量。

本文中所用之「相對偵測器回應值」係指一種化合物

（諸如異戊二烯）之偵測器回應值（諸如GC/MS面積）與一或

多種化合物（諸如所有C5煙）之偵測器回應值（諸如GC/MS面

積）之比率。可如本文所述量測偵測器回應值，諸如用配

備有 Agilent HP-5MS GC/M S 管柱（30 mx250 μιη ； 0.25 μιη 膜厚度）之Agilent 6890 GC/MS系 統進行GC/MS分析。必要

時，可使用各化合物之回應因子將相對偵測器回應值轉換

成重量百分比。此回應因子為針對既定量之特定化合物所

產生之信號強弱（亦即，偵測器對特定化合物之敏感程度）

的量度。當偵測器對相比較之化合物具有不同敏感度時 ，

此回應因子可用作將相對偵測器回應值轉換成重量百分比

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之修正因子。或者，可藉由假定相比較之化合物的回應因

子相同來近似估計重量百分比。因此，可假定重量百分比

與相對偵測器回應值近似相同。

在一些實施例中，培養中細胞製造大於或約1、10、

25 ' 50 ' 100、150、200、250、300、400、500、600、

700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、

2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、12,500、20,000、

30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、125,000、

150,000、188,000奈莫耳異戊二烯/公克細胞(細胞濕重)/小

時(nmol/gwcm/h)或 1 88,000 nmol/gwcm/h 以上之異戊二烯。

在一些實施例中，異戊二烯之量為約2至約200,000 nmol/gWcm/h，諸如約 2 至約 100 nmol/gwcm/h、約 100 至約

500 nmol/gwcm/h、約 150 至約 500 nmol/gwcm/h、約 500 至約

1,000 nmol/gwcm/h、約 1,000 至 約 2,000 nmol/gwcm/h、或 約

2,000 至約 5,000 nmol/gwcm/h 、約 5,000 至約 10,000 nmol/gwcm/h、約 10,000 至約 50,000 nmol/gwcm/h、約 50,000 至約 100,000 nmol/gwcm/h、約 100,000 至約 150,000 nmol/gwcm/h、或約 150,00 0至約 200,000 nmol/gwcm/h。在一

些實施例中，異戊二烯之量為約20至約5,000 nmol/gwcm/h、約 100 至約 5,000 nmol/gwcm/h、約 200 至約

2,000 nmol/gwcm/h、約 200至約 1,000 nmol/gwcm/h、約 300至

約 1,000 nmol/gwcm/h、或約 400 至約 1,000 nmol/gwcm/h、約

1,000 至約 5,000 nmol/gwcm/h 、約 2,000 至約 20,000 nmol/gwcm/h、約 5,000 至約 50,000 nmol/gwcm/h、約 1 0,00 0 至

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約 100,000 nmol/gwcm/h、約 20,000至約 150,000 nmol/gwcm/h ' 或約 20,000至約 200,000 nmol/gwcm/h。

以nmol/gWcm/h為單位之異戊二烯之量可如美國專利第

5,849,970號中所揭示來量測，該專利藉此以全文引用的方

式併入，尤其關於異戊二烯產量之量測。舉例而言，使用

標準氣相層析系統，諸如採用正辛烷/多孔矽膠珠C(porasil C)管柱(Alltech Associates, Inc., Deerfield, Ill.)以等溫方式

(85°C )操作且耦接至RGD2氧化汞還原氣體偵測器(Trace Analytical, Menlo Park, CA)之系統，分析2 mL頂部空間氣

體(headspace)(例如培養物之頂部空間氣體，諸如在密封

小瓶中於32°C、以200 rpm震盪下培養約3小時之2 mL培養

物之頂部空間氣體)中的異戊二烯(參見，例如Greenberg等

人 > Atmos. Environ. 27A: 2689-2692, 1993 ； Silver等人，

Plant Physiol. 97:1588-1591, 1991 ，各藉此以全文引用的

方式併入，尤其關於異戊二烯產量之量測)。經由標準異

戊二烯濃度校準曲線將氣相層析面積單位轉換成異戊二烯

奈莫耳數。在一些實施例中，藉由獲得細胞培養物樣品之

A600值，接著基於具有已知A600值之細胞培養物的濕重之

校準曲線將該A600值轉換成細胞公克數來計算細胞公克數

之值(細胞濕重)。在一些實施例中，藉由假定A600值為1之

1公升 培養液(包括 細胞培 養基及 細胞)的細胞 濕重為1公克

來估算細胞公克數。亦用該值除以培育培養物已歷經之小

時數，諸如3小時。

在一些實施例中，培養中細胞製造大於或約1、10、

149050.doc • 121 -

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25 ' 50 ' 100、150、200、250、300、400、500、600、

700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、

2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000 奈克異戊

二烯/公克細胞（細胞濕重）/小時（ng/gwcm/h）或100,000 ng/gwcm/h以上之異戊二烯。在一些實施例中，異戊二烯之

量為約2至約5,000 ng/gwcm/h，諸如約2至約100 ng/gwcm/h、約 100 至約 500 ng/gwcm/h、約 500 至約 1,000 ng/gwcm/h、約 1,000 至 約 2,000 ng/gwcm/h、或 約 2,000 至 約

5,000 ng/gwcm/h。在一些實施例中，異戊二烯之量為約20 至約 5,000 ng/gwcm/h、約 100至約 5,000 ng/gwcm/h、約 200至

約 2,000 ng/gwcm/h、約 200至約 1,000 ng/gwcm/h、約 300至約

1,000 ng/gwcm/h、或約 400 至約 1,000 ng/gwcm/h。以

ng/gwcm/h為單位之異戊二烯的量可藉由用上文所論述之單

位為nmol/g wcm/h之異戊二烯產量值乘以68.1（如以下等式5 所述）來計算。

在一些實施例中，培養中細胞製造累積力價（總量）大於

或約為 1、10、25、50、100 ' 150、200、250、300、

400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、

1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、

50,000 ' 100,000毫克異戊二烯/公升培養液（mg/L培養液，其

中培養液體積包括細胞及細胞培養基之體積）或100,000 mg/L培養液以上之異戊二烯。在一些實施例中，異戊二烯之

量為約2至約5,000 mg/L培卷液，諸如約2至約100 mg/L培釜波、

約100至約500 mg/L培養液、約500至 約1,000 mg/L培養液、約

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1,000至約2,000 mg/L培養液、或約2,000至約5,000 mg/L培着浪。

在一些實施例中，異戊二烯之量為約20至約5,000 mg/L培签渔、

約100至 約5,000 mg/L培養浪、約200至纟勺2,000 mg/L培養液、纟勺

200至 約1,000 mg/L培養液、約300至約1,000 mg/L培養渔、或 約

400至 約1,000 mg/L培养液°

來自震盪燒瓶或類似培養器之異戊二烯之比生產力（毫

克異戊二烯/公升頂部空間氣體）可藉由自OD6oo值為約1·0 之細胞培養物獲取1 ml樣品，將其置於20 mL小瓶中，培

育30分鐘，接著量測頂部空間氣體中異戊二烯之量來量測

（如例如實例1部分II所述）。若OD6oo值不為1.0，則可藉由

用量測值除以OD6oo值來針對1·。之OD600值進行校正。可藉

由用毫克異戊二烯/公升頂部空間氣體之值乘以38將其轉

換成mg/L培養浪/h/培養液之OD600。可將以mg/L培養液/h/OD60o 為單位之值乘以小 時數及OD600值來獲得以毫克異戊二烯/

公升培養液為單位之累積力價。

在一些實施例中，培養中細胞中異戊二烯之平均體積生

產力大於或約為 0.1、1.0 ' 10 ' 25 ' 50 ' 100、150、200、

250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、

1100、1200、1300、1,400、1,500、1,600、1,700、

1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、

2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、

3,200 ' 3,300 ' 3,400、3,500毫克異戊二烯/公升培養液/小

時（mg/L培善波/h，其中培養液體積包括細胞及細胞.培養基之

體積）或3,500 mg/L培養液/h以上。在一些實施例中，異戊二

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烯之平均體積生產力為約0·1至約3,500 mg/L培養液/h，諸如

約0.1至約100 mg/L培養波/h、約100至約500 mg/L培養液/h、約

500至約1,000 mg/L培卷液/h、約1,000至約1,500 mg/L培養液/h、

約1,500至約2,000 mg/L培養液/h、約2,000至約2,500 mg/L培卷液/h、

約2,500至約3,000 mg/L培養液/h、或約3,000至約3,500 mg/L培養液/h。

在一些實施例中，異戊二烯之平均體積生產力為約10至約

3,500 mg/L培養液/h、約100至約3,500 mg/L培茬液/h、約200至

約1,000 mg/L培養液/h、約200至約1,500 mg/L培養液/h、約

1,000至約3,000 mg/L培養浪/h、或約1,500至約3,000 mg/L培養液/h。

在一些實施例中，培養中細胞中異戊二烯之峰值體積生

產力大於或約為 0.5 ' 1.0 ' 10 ' 25 ' 50、100、150、200、

250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、

9,750 ' 10,000 ' 12,500、15,000毫克異戊二烯/公升培養液/

小時（mg/L培養液/h，其中培養液體積包括細胞及細胞培養基

之體積）或15,000 mg/L培养液/h以上。在一些實施例中，異戊

二烯之峰值體積生產力為約0.5至約15,000 mg/L培卷液/h，諸

如約0.5至約10 mg/L培茬液/h、約1.0至約100 mg/L培養液/h、約

1100、 1200、 1300、 1,400、 1,500、 1,600、 1,700、

1,800、 1,900 、 2,000 、2,100、 2,200 、 2,300、 2,400、

2,500、 2,600 、 2,700 、2,800 、 2,900、 3,000、 3,100、

3,200 、 3,300、 3,400 、3,500 、 3,750 、 4,000、 4,250、

4,500、 4,750 、 5,000 、5,250 、 5,500 、 5,750、 6,000、

6,250、 6,500、 6,750 、7,000、 7,250、 7,500、 7,750、

8,000、 8,250、 8,500 、8,750、 9,000、 9,250、 9,500、

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100至約500 mg/L培善液/h、約500至約1,000 mg/L培養液/h、約

1,000至纟勺1,500 mg/L培卷液/h、約1,500至約2,000 mg/L培春液/h、

約2,000至約2,500 mg/L培卷液/h、約2,500至約3,000 mg/L培養渔/h、

約3,000至約3,500 mg/L培養液/h、約3,500至約5,000 mg/L培養液/h、

約5,000至約7,500 mg/L培養波/h、約7,500至約10,000 mg/L培養液/h、

約 10,000 至約 12,500 mg/L 培養渔/h、或約 12,50 0 至約 15,000 mg/L培卷浪/h。在一些實施例中，異戊二烯之峰值體積生產

力為約10至約15,000 mg/L培養液/h、約100至約2,500 mg/L培養〃h、

約1,000至約5,000 mg/L培養液/h、約2,500至約7,500 mg/L培茬波/h、

約5,000至約10,000 mg/L培養波/h、約7,500至約12,500 mg/L培卷液/h、

或約10,000至 約15,000 mg/L培養液/h。

醱酵槽中以mg/L培養液/h為單位之瞬時異戊二烯製造速率

可藉由獲取醱酵槽釋出氣體之樣品，如例如實例1部分II所

述分析樣品中異戊二烯之量（以諸如毫克異戊二烯/公升氣

體為單位），且將此值乘以釋出氣體通過每公升培養液之

速率（例如1 vvm（空氣體積/培養液體積/分鐘），其為60公

升氣體/小時）來量測。因此，1 mg/La«之釋出氣體量對應

於在1 vvm之空氣流速下60 mg/L培養液/h之瞬時製造速率。

必要時，可將以mg/L培養液/h為 單位之值除以OD600值來獲得

以mg/L培養液/h/O D為單位之比速率。毫克異戊二烯/公升氣

體之平均值可如下轉換成總產物生產力（公克異戊二烯/公

升醱酵培養液，mg/L培養浪）：將此平均釋出氣體異戊二烯

濃度乘以在醱酵期間每公升酸酵培養液釋出之釋出氣體的

總量。因 此，在1 vvm下經10小時0.5 mg/L培養液/h之平均釋

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出氣體異戊二烯濃度對應於300 mg異戊二烯/L培養波之總產

物濃度。

在一些實施例中，培養中細胞使細胞培養基中大於或約

0.0015、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、

0.14 、 0.16 、 0.2 、 0.3 、 0.4 、 0.5 、 0.6 、 0.7 、0.8 、 0.9 、

1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 、2.4 、2.6 、 3.0 、

4.0、 5.0 、 6.0 、 7.0 、8.0 、 9.0 、 10.0、 11.0、 12.0 、 13.0 、

14.0 、15.0 、16.0、 17.0、18.0、 19.0、 20.0、 21.0、22.0、

23.0 、23.2 、23.4 、 23.6 、 23.8 、 24.0、 25.0、 30.0、31.0、

32.0 、33.0 、35.0、 37.5、40.0、 45.0、 47.5、 50.0、55.0、

60.0 、65.0 、70.0、 75.0 ' 80.0、8 5.0 或 90.0 莫耳 ％之碳轉

化成異戊二烯。在一些實施例中，碳轉化成異戊二烯之轉

化百分率為約0.002至約90.0莫耳％，諸如約0.002至約

0.005% ' 約 0.005 至約 0.01% ' 約 0.01 至約 0.05%、約 0.05 至

約0.15%、0.15至約0.2%、約0.2至約0.3%、約0.3至約

0.5%、約 0.5 至約 0.8% ' 約 0.8 至約 1.0%、約 1.0 至約 1.6%、

約1.6至約3.0%、約3.0至約5.0%、約5.0至約8.0%、約8.0 至約 10.0%、約 10.0至約 15.0%、約 15.0至約 20.0%、約 20.0至約 25.0%、約 25.0% 至 30.0%、約 30.0% 至 35.0%、約

35.0% 至 40.0%、約 45.0% 至 50.0%、約 50.0% 至 55.0%、約

55.0% 至 60.0%、約 60.0% 至 65.0%、約 65.0% 至 70.0%、約

75.0% 至 80.0%、約 80.0% 至 85.0%、或約 85.0% 至 90.0%。

在一些實施例中，碳轉化成異戊二烯之轉化百分率為約

0.002至約0.4莫耳％、0.002至約0.1 6莫耳％、0.04至約0.16

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莫耳％、約0.005至約0.3莫耳％、約0.01至約0.3莫耳％、約

0.05至約0.3莫耳％、約0.1至0.3莫耳％、約0.3至約1.0莫耳

%、約1.0至約5.0莫耳％、約2至約5.0莫耳％、約5.0至約

10.0莫耳％、約7至約10.0莫耳％、約10.0至約20.0莫耳％、

約12至約20.0莫耳％、約16至約20.0莫耳％、約18至約20.0 莫耳％、約18至23.2莫耳％、約18至23.6莫耳％、約18至約

23.8莫耳％、約18至約24.0莫耳％、約1 8至約25.0莫耳％、

約20至約30.0莫耳％、約30至約40.0莫耳％、約30至約50.0 莫耳％、約30至約60.0莫耳％、約30至約70.0莫耳％、約30 至約80.0莫耳％、或約30至約90.0莫耳％。

碳轉化成異戊二烯之轉化百分率（亦稱作碳產率%）可藉

由用所製造之異戊二烯中之碳莫耳數除以碳源中之碳莫耳

數（諸如批料及補料葡萄糖及酵母提取物中之碳莫耳數）來

量測。將此數值乘以100%以得到百分比值（如等式1所指

示）。

等式1

碳產率％=（所製造之異戊二烯中之碳莫耳數）/（碳源中之碳莫耳數）X100關於此計算，可假定酵母提取物含有50% w/w碳。舉例

而言，對於實例7部分VIII所述之500公升，可如等式2所

示計算碳轉化成異戊二烯之轉化百分率。

等式2碳產率 % = （39.1 g 異 戊二烯 X 1/68.1 mol/gx5 C/mol）/ ［（181221 g 葡萄糖 X 1/1 80 mol/gx6 C/mol） + （17780 g 酵母提

取物 χθ.5x1/12 mol/g）］xl00=0.042% .

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對於 本文中（實例7部 分VII及VIII）所 述 之兩個500公升 醱

酵，碳轉化成異戊二烯之轉化百分率為0.04-0.06% °已使

用如本文所述之14公升系統達成0.11-0.16%之碳產率。實

例11部分V描述使用本文所述之方法使得碳轉化成異戊二

烯之轉化率為1.53%。

熟習此項技術者可易於將異戊二烯製造速率或所製造之

異戊二烯的量轉換成任何其他單位。用於單位之間相互轉

換之例示性等式如下文所列。

異戊二烯製造速率（總速率及比速率）之單位

等式31 g異戊二烯/L培茬液/h=14.7 mmol異戊二烯/L培m/h（總體積

速率）

等式4

1 nmol 異戊二烯/gwcm/h=l nmol 異戊二烯/L 培養液 /h/OD60o（此

轉換假定OD6oo值為1之1公升培養液的細胞濕重為1公

克。）

等式5

1 nmol異戊二烯/gwcm/h=68.1 ng異戊二烯/gWCm/h（給出異戊

二烯之分子量）

等式6

1 nmol異 戊二烯/La « O2/h=90 nmol異 戊二烯/L培養液/h（對於

每公升培養液5。2流動速率為90 L/h）等式7

1卩g異戊二烯/Lz釋出氣體中之異戊二烯=60卩g異戊二烯/

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L培养波/h （流動速率為60Lg.«t/L培养波（1 vvm））力價（總力價及比力價）之單位

等式8

1 nmol異戊二烯/mg細胞蛋白質=150 nmol異戊二烯/L培養液/

OD600（此轉換假定OD600值為1之1公升培養液的總細胞蛋白

質為約150 mg）（比生產力）

等式9

1 g異戊二烯/L培養液= 14.7 mmol異戊二烯/L培養液（總力價）

必要時，可使用等式10將包括細胞濕重之任何單位轉換

成包括細胞乾重之相應單位。

等式10

細胞乾重=（細胞濕重）/3.3必要時，可使用等式11在單位ppm與卩g/L之間進行轉

換。詳言之，「ppm j意謂依μg/g（w/w）定義之百萬分率。

氣體濃度亦可以體積計使用依卩L/L（體積/體積）定義之

r ppmv j （體積百萬分率）來表示。可藉由測定每公升釋出

氣體之質量（亦即，氣體密度）將卩g/L轉換成ppm（例如微克

分析物/公克氣體）。舉例而言，在標準溫度及壓力（STP ； 101.3 kPa（ 1巴）及273.15K）下，1公升空 氣之密 度為約1.29 g/L。因此，在STP下，1 ppm（pgZg）之濃 度等於1.29 卩g/L（等式11）。ppm（μg/g）至卩g/L之轉換為壓力、溫度與釋

出氣體之總體組成的函數。

等式11在標準溫度及壓力（STP : 101.3 kPa（ 1巴）及2 73.15K）下，1

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ppm(pg/g)等於 1.29 pg/L。

可使用通用氣體定律(Universal Gas Law)(等式12)將

μg/L轉換成ppmv(例如微升分析物/公升氣體)。舉例而

言，1000卩g/L範體之釋出氣體濃度對應於14.7 pmol/Lft® ° 通用 氣體常數為0.082057 L.atm K^moT1 ，故使用等式

12，在STP下14.7卩mol HG所佔 據之體積等於0.329 mL。

因此，在STP下，1000卩g/L HG之濃度等於329 ppmv或

0.0329%(v/v)。

等式12

PV=nRT，其中「P」為壓力，「V」為體積，「n」為氣體莫

耳數，「R」為通用氣體常數，且「T」為克耳文(Kelvin)溫

度。

異戊二烯組合物中雜質之量在本文中通常以重量/體積

(w/v)計，以諸如卩g/L之單位加以量測。必要時，可使用等

式13將以μβ/L為單位之量測值轉換成單位mg/m3 ° 等式13

1 μg/L=l mg/m3在本文所述之一些實施例中，包含編碼異戊二烯合成酶

多肽之異源核酸的細胞所製造之異戊二烯之量至少或約為

在基本上相同條件下生長、但不含編碼異戊二烯合成酶多

肽之異源核酸的相應細胞所製造之異戊二烯之量的2倍、3 倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、

400倍或400倍以上。

在本文所述之一些實施例中，包含編碼異戊二烯合成酶

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多肽之異源核酸及一或多種編碼DXS、IDI及/或MVA途徑

多肽之異源核酸的細胞所製造之異戊二烯之量至少或約為

在基本上相同條件下生長、但不含異源核酸的相應細胞所

製造之異戊二烯之量的2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50 倍、100倍、150倍、200倍、400倍或400倍以上。

在一些實施例中，以組合物中所有C5煙之總重量計，異

戊二烯組合物 包含大於或約99.90 ' 99.92、99.94、99.96、

99.9 8或100重量％之異戊二烯。在一些實施例中，以組合

物中所有C5煙之偵測器回應值計，組合物中異戊二烯之相

對偵測器回應值大於或約為99.90、99.91、99.92、99.93、

99.94、99.95、99.96、99.97、99.98、99.99 或 100%。在一

些實施例中，以組合物中所有C5煙之總重量計，異戊二烯

組合物 包含約99.90至約99.92重量％、約99.92至約99.94重

量％、約99.94至約99.96重量％、約99.96至約99.98重量

% '約99.98至100重量％之異戊二烯。

在一些實施例中，以組合物中所有C5煙之總重量計 > 異

戊二烯組合物包含小於或約0.12、0.10、0.08、0.06、

0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、

0.00005或0.00001重量％之非異戊二烯之C 5煙（諸如1,3-環

戊二烯、順-1,3-戊二烯、反-1,3-戊二烯、1,4-戊二烯、1- 戊烘、2-戊烘、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烘、

戊-4 -烯-1 -烘、反-戊-3 -烯-1-块·或順-戊-3 -烯-1-焕）。在一

些實施例中，以組合物中所有C 5煙之偵測器回應值計，組

合物中非異戊二烯之C5煙的相對偵測器回應值小於或約為

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0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、

0.001、0.0005、0.0001、0.00005 或 0.00001%。在一些實

施例中，以組合物中所有C5煙之偵測器回應值計，組合物

中1,3-環戊二烯、順-1,3-戊二烯、反-1,3-戊二烯、1,4-戊

二烯、1-戊烘、2-戊烘、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3 -甲

基T -丁烘、戊-4 -烯T -烘、反-戊-3 -烯-1 -块或順-戊-3 - 烯-1 -烘之相對偵測器回應值小於或約為0.12、0.10、

0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、

0.0001、0.00005< 0.00001%。在一些實施例 中，以組合物

中所有C5煙之總重量計，異戊二烯組合物包含約0.02至約

0.04重量％、約0.04至約0.06重量％、約0.06至0.08重量

% '約0.08至0.10重量％或約0.10至約0.12重量％之非異戊

二烯之C5煙（諸如1,3-環戊二烯、順-1,3-戊二烯、反-1,3-戊

二烯、1,4-戊二烯、1-戊烘、2-戊烘、1-戊烯、2-甲基-1- 丁烯、3-甲基-1-丁烘、戊-4-烯-1-块、反-戊-3-烯-1-烘或

順-戊-3 -烯T -烘）°

在一些實施例中，異戊二烯組合物包含小於或約50 '40 ' 30 ' 20 ' 10 ' 5 ' 1、0.5、0.1、0.05、0.01 或 0.005卩g/L抑制異戊二烯聚合之化合物（組合物中抑制異戊二烯

聚合之任何化合物）。在一些實施例中，異戊二烯組合物

包含約0.005至約50卩g/L，諸如約0.01至約10、約0.01至約

5、約0.01至約1、約0.01至約0.5或約0.01至約0.005卩g/L 抑制異戊二烯聚合之化合物（組合物中抑制異戊二烯聚合

之任何化合物）。在一些實施例中，異戊二烯組合物包含

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1434921

小於或約 50 ' 40 ' 30 ' 20 ' 10 ' 5、1、0.5、0.1、0.05、

0.01或0.005 |ig/L之非異戊二烯之煙（諸如1,3-環戊二烯、

順-1,3-戊二烯、反-1,3-戊二烯、1,4-戊二烯、1-戊烘、2- 戊烘、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烘、戊-4- 烯-1-烘、反-戊-3-烯-1-烘或順-戊-3·•烯-1-块）。在一些實

施例中5異戊二烯組合物包含約0.005至約50卩g/L »諸如

約0.01至約10、約0.01至約5、約0.01至約1、約0.01至約

0.5或約0.01至約0.005卩g/L之非異戊二烯之煙。在一些實

施例中，異戊二烯組合物包含小於或約50、40、30、20、

10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 或 0.005 卩g/L之蛋白質或

脂肪酸（諸如與天然橡膠天然相關之蛋白質或脂肪酸）。

在一些實施例中，異戊二烯組合物包含小於或約1 ο、

5 ' 1 ' 0.8、0.5、0.1、0.05、0.01 或 0.005 ppm 之 α-缺煙、

間戊二烯、乙睛或1,3-環戊二烯。在一些實施例中，異戊

二烯組合物包含小於或約5、1、0.5、0.1、0.05、0.01或

0.005 ppm之硫或丙二烯。在一些實施例中，異戊二烯組

合物包含小於或約30 ' 20 ' 15 ' 10 ' 5 ' 1 ' 0.5 ' 0.1 ' 0.05、0.01或0.005 ppm之所有块煙（諸如1-戊换、2-戊烘、

3-甲 基T - 丁烘、戊-4 -烯T -缺、反-戊-3-烯T -烘及順-戊-3- 烯-1-缺）。在一些實施例中，異戊二烯組合物包含小於或

約 2000 、 1000 、 500 、 200 、 100 、 50 、 40 、 30 、 20 、 10 、

5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 或 0.005 ppm之異戊二烯二聚

體，諸如環狀異戊二烯二聚體（例如源自兩個異戊二烯單

元的 二聚化之環狀C10化合物）。

149050.doc -133 -

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在一些實施例中，異戊二烯組合物包括乙醇、丙酮、C5 異戊二烯醇（諸如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3 -甲基-2·■丁烯-1- 醇），或前述任意兩者或兩者以上。在特定實施例中，異

戊二烯組合物包含大於或約0.005、0.01、0.05、0.1、

0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100或 120 卩g/L之

乙醇、丙酮、C5異戊二烯醇（諸如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3- 甲基-2-丁烯-1-醇），或前述任意兩者或兩者以上。在一些

實施例中，異戊二烯組合物包含約0.005至約120卩g/L，諸

如約0.01至約80 '約0.01至約60 '約0.01至約40、約0.01至

約30 ＞約0.01至約20、約0.01至約10、約0.1至約80、約0.1 至約60 '約0.1至約40 '約5至約80 '約5至約60或約5至約

40卩g/L之乙醇、丙酮、C5異戊二烯醇，或前述任意兩者

或兩者以上。

在一些實施例中，異戊二烯組合物包括以下一或多種組

分：2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2,4,5-三甲基毗咤、

2,3,5-三甲基。比嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、

1-丙醇、雙乙醯、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙

酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-T 醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、異丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯

醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、乙酸3-甲基-3-丁烯-1-基

酯、乙酸3-甲基-2-丁烯-1-基酯、3-己烯-1-醇、乙酸3-己

烯-1-基酯、檸檬烯、香葉醇（反-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1- 醇）、香茅醇（3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇）、（E）-3,7-二甲

基-1,3,6-辛三烯、（Z）-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、2,3-環庚

149050.doc -134 ・

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烯醇。比咤或.線性異戊二烯聚合物（諸如源自多個異戊二烯

單元的聚合之線性異戊二烯二聚體或線性異戊二烯三聚

體）。在多個實施例中，以重量百分比為單位，此等組分

之一之量相對於異戊二烯之量（亦即，組分重量除以異戊

二烯重量 X100）為大於或約 0.01、0.02 ' 0.05、0.1、0.5、

1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 或

110%（w/w）。在一些實施例中，以異戊二烯之偵測器回應

值計，第二化合物之相對偵測器回應值大於或約為0.01 ' 0.02、0.05 ' 0.1 ' 0.5 ' 1、5、10、20、30、40、50、60、

70、80、90、100或110%。在多個實施例中，以重量百分

比為單位，此等組分之一之量相對於異戊二烯之量（亦

即，組分重量除以異戊二烯重量X100）為約0.01至約

105%（w/w），諸如約0.01至約90、約0.01至約80、約0.01至

約50、約0.01至約20、約0.01至約10、約0.02至約50、約

0.05至約50 '約0.1至約50或0.1至約20%（w/w）。

在一些實施例中，異戊二烯組合物包括以下一或多者：

醇、醛或酮（諸如本文所述之任何醇、醛或酮）。在一些實

施例中，異戊二烯組合物包括⑴醇及醛，（ii）醇及酮，（iii） 醛及酮，或（iv）醇、醛及酮。

在一些實施例中，異戊二烯組合物含有以下一或多者：

甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙

酮、乙酸、2- 丁酮、2-甲基-1 - 丁醇或。引噪。在一些實施例

中，異戊二烯組合物含有1 ppm或1 ppm以上之下列一或多

者：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3 -甲基-1-丙

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醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1 - 丁醇或。引噪。在一些

實施例中，異戊二烯組合物（諸如純化前之釋出氣體）中以

下一或多者之濃度為約1至約10,000 ppm :甲醇、乙醛、

乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3 -甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2- 丁酮、2-甲基-1 - 丁醇或。弓I噪。在一些實施例中，異戊二烯

組合物（諸如已經歷一或多個純化步驟之後的釋出氣體）包

括以下一或多者：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、

3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇或吗I 。朵'其濃度為約1至約100 ppm，諸如約1至約1。ppm、約

1 0至約20 ppm、約20至約30 ppm、約30至約40 ppm、約40 至約50 ppm、約50至約60 ppm、約60至約70 ppm、約70至

約80 ppm、約80至約90 ppm、或約90至約100 ppm。可使

用標準方法，諸如本文所述之彼等方法或其他標準方法

（諸如質子轉移反應-質譜法）分析來自細胞培養物之揮發性

有機化合物（諸如細胞培養物之頂部空間氣體中之揮發性

有機化合物）（參見，例如Bunge等人，Applied and

Environmental Microbiology, 74（7）:2179-2 186, 2008，其藉

此以全文引用的方式併入，尤其關於揮發性有機化合物之

分析）。

在一些實施例中，組合物包含大於約2 mg之異戊二烯，

諸如大於或約 5、10、20、30、40、50 ' 60 ' 70、80、

90 、 100 、 200 、 300 、 400 、 500 、 600 、 700 、 800 、 900或

1000 mg之異戊二烯。在一些實施例中，組合物包含大於

或約 2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100

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g之異戊二烯。在一些實施例中，組合物中異戊二烯之量

為約2至約5,000 mg，諸如約2至約100 mg、約100至約500mg、約 500 至約 1,000 mg、約 1,000 至約 2,000 mg、或約

2,000至約5,000 mg。在一些實施例中，組合物中異戊二烯

之量為約20至約5,000 mg '約100至約5,000 mg、約200至

約 2,000 mg ' 約 200 至約 1,000 mg、約 300 至約 1,000 mg、

或約400至約1,000 mg。在一些實施例 中，異戊二烯超過

或約為組合物之揮發性有機部分的20 ' 25 、 30 、 40 、 50 、

60、70、80、90 或 95 重量％。

在一些實施例中，組合物包括乙醇。在一些實施例中，

組合物包括約75至約90重量％之乙醇'諸如約75至約80重

量％、約80至約85重量％或約85至約90重量％之乙醇。在

組合物包括乙醇之一些實施例中 > 組合物亦包括約4至約

15重量％之異戊二烯，諸如約4至約8重量％、約8至約12重

量％或約12至約15重量％之異戊二烯。

在本文所述之一些實施例中，包含一或多種編碼異戊二

烯合成酶多肽、DXS多肽、IDI多肽及/或MVA途徑多肽之

異源核酸的細胞所製造之類異戊二烯化合物（諸如由一或

多個IPP分子與一或多個DMAPP分子反應所形成之具有10 個或10個以上碳原子之化合物）的量大於或約為在基本上

相同條件下生長、但不含一或多種異源核酸之相應細胞所

製造之類異戊二烯化合物之量的2倍、3倍、5倍、10倍、

25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍或400倍以

上。在本文所述之一些實施例中，包含一或多種編碼異戊

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二烯合成酶多肽、DXS多肽、IDI多肽及/或MVA途徑多肽

之異源核酸的細胞所製造之C5異戊二烯醇（諸如3-甲基-3- 丁烯-1-醇或3 -甲基-2-丁烯-1-醇）的量大於或約為在基本上

相同條件下生長、但不含一或多種異源核酸之相應細胞所

製造之C5異戊二烯醇之量的2倍、3倍、5倍、10倍、25 倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍或400倍以上。

例示性共同製造生物異戊二烯與氫氣

在一些實施例中，本文所述之任何包含一或多種編碼異

戊二烯合成酶多肽、DXS多肽、IDI多肽及/或MVA途徑多

肽且可操作地連接於啟動子之異源核酸的製造異戊二烯之

細胞均進一步包含亦可操作地連接於啟動子且編碼一或多

種氫化酶多肽或一或多種與氫化酶多肽之調控或表現有關

之多肽（例如氫化酶成熟蛋白或轉錄因子）的異源核酸。在

一些實施例中，本文所述之任何包含一或多種編碼異戊二

烯合成酶多肽、DXS多肽、IDI多肽、MVA途徑多肽、一

或多種氫化酶多肽或一或多種與氫化酶多肽之調控或表現

有關之多肽且可操作地連接於啟動子之異源核酸的製造異

戊二烯之細胞均進一步包含使一或多種與醱酵副產物製造

有關之多肽、一或多種與製造醱酵副產物之基因的調控或

表現有關之多肽'或一或多種與氫氣再吸收有關之多肽失

活的突變或缺失。該等細胞可共同製造異戊二烯與氫氣。

在本文所述之任何態樣之一些實施例中，細胞為細菌細

胞，諸如革蘭氏陽性細菌細胞（例如桿菌屬細胞，諸如枯

草桿菌細胞；或鏈黴菌屬細胞，諸如青紫鏈黴菌

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｛Streptomyces lividans｝、天藍色鏈黴菌（Streptomyces

coelicolor）或灰色鏈黴菌｛Streptomyces griseus｝細胞）。在

本文所述之任何態樣之一些實施例中，細胞為革蘭氏陰性

細菌細胞（例如大腸桿菌屬細胞，諸如大腸桿菌細胞；紅

假單胞菌屬，諸如沼澤紅假單胞菌細胞；假單胞菌屬，諸

如螢光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens｝細胞或惡臭假

單胞菌｛Pseudomonas putida）細胞；或泛菌屬細胞5諸如檸

檬泛菌細胞）。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，

細胞為真菌細胞，諸如絲狀真菌細胞（例如木黴屬細胞，

諸如里氏木黴細胞；或麴菌屬細胞，諸如米麴菌及黑麴

菌）；或酵母細胞（例如耶氏酵母屬細胞，諸如解脂耶氏酵

母細胞；或酵母屬細胞，諸如釀酒酵母）。

在本文所述之任何態樣之一些實施例中，異戊二烯合成

酶多肽為來自以下植物之多肽：諸如葛屬（例如山葛或大

葛藤）或楊屬｛Populus）｛例如美洲山楊、銀白楊、黑楊、毛

果楊、或銀白楊與歐洲山楊雜交種）。

在本文所述之任何態樣之一些實施例中，細胞進一步包

含編碼IDI多肽之異源核酸。在本文所述之任何態樣之一

些實施例中，細胞進一步包含編碼IDI多肽之內源核酸之

複本插入物。在本文所述之任何態樣之一些實施例中1細

胞進一步包含編碼DXS多肽之異源核酸。在本文所述之任

何態樣之一些實施例中，細胞進一步包含編碼DXS多肽之

內源核酸之複本插入物。在本文所述之任何態樣之一些實

施例中'細胞進一步包含一或多種編碼IDI多肽及DXS多

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肽之核酸。在本文所述之任何態樣之一些實施例中5 一種

核酸編碼異戊二烯合成酶多肽、IDI多肽及DXS多肽。在

本文所述之任何態樣之一些實施例中，一種載體編碼異戊

二烯合成酶多肽、IDI多肽及DXS多肽。在一些實施例

中，載體包含選擇性標記物或可選擇標記物，諸如抗生素

抗性核酸。

在本文所述之任何態樣之一些實施例中5細胞進一步包

含編碼MVA途徑多肽(諸如來自釀酒酵母或糞腸球菌之

MVA途徑多肽)之異源核酸。在本文所述之任何態樣之一

些實施例中'細胞進一步包含編碼MVA途徑多肽(諸如來

自釀酒酵母或糞腸球菌之MVA途徑多肽)之內源核酸之複

本插入物。在本文所述之任何態樣之一些實施例中5細胞

包含異戊二烯合成酶、DXS及MVA途徑核酸。在本文所述

之任何態樣之一些實施例中5細胞包含異戊二烯合成酶核

酸、DXS核酸、IDI核酸及MVA途徑核酸。

在一些實施例中，本文所述之製造異戊二烯之細胞進一

步包含編碼氫化酶多肽且可操作地連接於啟動子之異源核

酸。在一些實施例中，氫化酶多肽包含大腸桿菌氫化酶-1 (Hyd-Ι)；大腸桿菌氫化酶-2(Hyd-2)；大腸桿菌氫化酶-3 (Hyd-3)；大腸桿菌氫化酶-4(Hyd-4)；大腸桿菌甲酸氫解

酶(FHL)複合物，其在厭氧條件下、於酸性pH值下自甲酸

及CO?製造氫氣；混濁紅球菌MR11氫化酶(混濁紅球菌

HoxH):藍藻屬 PCC 6803 氫化酶(藍.藻 PCC 6803 HoxH)； 巨大脫硫弧菌氫化酶；及脫硫脫硫弧菌ATCC 7757氫化

149050.doc ・ 140-

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酶。在一些實施例中，進一步包含編碼氫化酶多肽且可操

作地連接於啟動子之異源核酸的製造異戊二烯之細胞進一

步包含大腸桿菌氫化酶-3（Hyd-3）、大腸桿菌丙酮酸甲酸裂

解酶（刀7）及大腸桿菌甲酸氫解酶（FHL）複合物。

在一些實施例中，氫化酶多肽編碼鐵氧化還原蛋白依賴

性氫化酶多肽。在一些實施例中，鐵氧化還原蛋白依賴性

氫化酶多肽包含乙醯肉毒梭菌氫化酶A（HydA），其可與以

下一或多者聯合表現：（1）枯草桿菌NADPH鐵氧化還原蛋

白氧化還原酶（NFOR），或克魯氏梭菌NADH鐵氧化還原蛋

白氧化還原酶（RnfCDGEAB）、巴斯德梭菌鐵氧化還原蛋白

氧化還原 酶（Fdx） ； （2）甘油醛-6-磷酸鐵氧化還原蛋白氧化

還原酶（「GAPORj ）:或（3）丙酮酸鐵氧化還原蛋白氧化還

原酶（「POR j ）。在一些實施例中，鐵氧化還原蛋白依賴

性氫化酶多肽乙醯肉毒梭菌氫化酶A（HydA）與三種HydA相

關成熟酶（HydE、HydG及HydF） —起表現，且另外與以下

一或多者聯合表現：（1）枯草桿菌NADPH鐵氧化還原蛋白

氧化還原酶（NFOR），或克魯氏梭菌NADH鐵氧化還原蛋白

氧化還原酶（RnfCDGEAB）、巴斯德梭菌鐵氧化還原蛋白氧

化還原 酶（Fdx） ； （2）甘油醛-6-磷酸鐵氧化還原蛋白氧化還

原酶（「GAPORj ）；或（3）丙酮酸鐵氧化還原蛋白氧化還原

酶（「PORj ）。

在一些實施例中，氫化酶多肽編碼NADPH依賴性氫化

酶多肽。在一些實施例中，NADPH依賴性氫化酶多肽包

含激烈火球菌氫化酶。在一些實施例中，氫化酶多肽編碼

149050.doc -141 -

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耐氧性氫化酶。在一些實施例中，耐氧性氫化酶包含膠狀

紅長命菌氫化酶及真氧產鹼桿菌氫化酶。

在一些實施例中，本文所述之製造異戊二烯之細胞進一

步包含使與氫化酶活性調控有關之基因(鐵-硫複合轉錄調

控子(iscR))失活之突變或缺失(Kalim-Akhtar等人，

「Deletion of iscR stimulates recombinant Clostridial Fe/Fe hydrogenase activity and H2-accumulation in Escherichia

coli BL21(DE3)」，Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:853-862 (2008)，其以全文引用的方式併入本文中，尤其關於在大

腸桿菌中藉由使姑彼基因缺失而刺激梭菌Fe/Fe氫化酶活性

及氫氣積累)。

在一些實施例中1本文所述之製造異戊二烯之細胞進一

步包含使編碼一或多種與醱酵副產物製造有關之細胞多肽

之基因失活的突變或缺失，該等醱酵副產物為諸如乳酸

鹽、乙酸鹽、丙酮酸鹽、乙醇、丁二酸鹽及甘油。在一些

實施例中，失活的與醱酵副產物製造有關之多肽包含一或

多種編碼以下之多肽：甲酸去氫酶Ν、α次單位(fdnG｝、甲

酸去氫酶0'大型次單位(fdoG｝、硝酸還原酶(narG)、甲酸

轉運體ZJocA、、甲酸轉運體、丙酮酸氧化酶

(poxB)、丙酮酸去氫酶El組分ackA/pta(aceE)、醇去氫酶

(adhE)、反丁烯二酸還原酶膜蛋白(frdC)或乳酸去氫酶

(皿A)。

在一些實施例中，本文所述之製造異戊二烯之細胞進一

步包含使編碼一或多種與醱酵副產物製造中所涉及之基因

149050.doc -142-

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的調控或表現有關之細胞多肽之基因失活的突變或缺失。

在一些實施例中，失活的與酸酵副產物製造中所涉及之基

因的調控或表現有關之多肽包含甲酸氫解酶之抑制子

(hycA)、反丁烯二酸還原酶調控子(fnr)、乙醯基-輔酶A合

成酶(acs)及甲酸去氫酶調控蛋白(hycA)。

在一些實施例中，本文所述之製造異戊二烯之細胞進一

步包含使編碼一或多種與氫氣再吸收有關之細胞多肽之基

因失活的突變或缺失。在一些實施例中，失活的與氫氣再

吸收有關之多肽包含大腸桿菌氫化酶-l(Hyd-l)(/2_ya操縱

子)及大腸桿菌氫化酶-2(Hyd-2)(幻^操縱子)。

在本文所述之任何態樣之一些實施例中，異源異戊二烯

合成酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途徑、氫化酶、氫化

酶成熟或轉錄因子多肽或核酸可操作地連接於T7啟動子，

諸如中等複本質體或高複本質體中所含之T7啟動子。在本

文所述之任何態樣之一些實施例中，異源異戊二烯合成

酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途徑、氫化酶、氫化酶成

熟或轉錄因子核酸可操作地連接於Trc啟動子，諸如中等

複本質體或高複本質體中所含之Trc啟動子。在本文所述

之任何態樣之一些實施例中，異源異戊二烯合成酶、DXS 多肽、IDI多肽、MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟或轉錄

因子核酸可操作地連接於Lac啟動子，諸如低複本質體中

所含之Lac啟動子。在本文所述之任何態樣之一些實施例

中，異源異戊二烯合成酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途

徑、氫化酶、氫化酶成熟或轉錄因子核酸可操作地連接於

149050.doc • 143-

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內源啟動子，諸如內 源鹼性絲胺酸蛋白酶啟動子。在一些

實施例中，異源異戊二烯合成酶、DXS多肽、IDI多肽、

MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟或轉錄因子核酸整合至不

含選擇性標記物或不含可選擇標記物之細胞的染色體中 。

在一些實施例中，一或多種MVA途徑、IDI、DXS、異

戊二烯合成酶、氫化酶、氫化酶成熟或轉錄因子核酸置於

在停滯期比在生長期更具活性之啟動子或因子的控制下 。

舉例而言，一或多種MVA途徑、IDI、DXS、異戊二烯合

成酶、氫化酶、氫化酶成熟或轉錄因子核酸可置於停滯期

cr因子（諸如RpoS）之控制下。在一些實施例中，一或多種

MVA途徑、IDI、DXS、異戊二烯合成酶、氫化酶、氫化

酶成熟或轉錄因子核酸置於在停滯期可誘導之啟動子，諸

如在停滯期可由反應調控子誘導呈活性之啟動子的控制

下。

在本文所述之任何態樣之一些實施例中，至少一部分細

胞於連續培養物（諸如未經稀釋之連續培養物）中歷經至少

或約5、10 ' 20 ' 40 ' 50 ' 60、65次或65次以上之細胞分

裂，維持異源異戊二烯合成酶、DXS多肽、IDI多肽、

MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟或轉錄因子核酸。在本文

所述之任何態樣之一些實施例中，包含異戊二烯合成酶、

DXS多肽、IDI多肽、MVA途徑、氫化酶、氫化酶成熟或

轉錄因子核酸之核酸亦包含選擇性標記物或可選擇標記

物，諸如抗生素抗性核酸。

在本文所述之任何態樣之一些實施例中，在有助於細胞

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共同製造異戊二烯與氫氣之限氧條件下，於本文所述之任

何培養基中培養共同製造異戊二烯與氫氣之細胞。在一些

實施例中，使細胞於限氧培養物中生長。在一些實施例

中，在每莫耳異戊二烯0.5莫耳氧氣存在下使細胞生長。

在一些實施例中，在不存在氧氣下使細胞以厭氧方式生

長。

在一些實施例中，本文所述之任何細胞均於限氧培養物

中生長且共同製造異戊二烯與氫氣。在一些實施例中，限

氧培養物中之細胞以 大於約400 nmol/gWcm/h之速率製造異

戊二烯，且以大於約125 nmol/gwcm/h之速率製造氫氣。在

一些實施例中，限氧培養物 中之細胞以約400 nmol/gwcm/h 至約2 .OxlO5 nmol/gwcm/h之速率製造異戊二烯，且以約125 nmol/gwcm/h至約 1.25χ 1 04 nmol/gwcm/h之速率製造氫氣。在

一些實施例中1限氧培養物中之細胞以約400 nmol/gwcm/h 與約 2.Οχ 105 nmol/gwcm/h 之間、約 500 nmol/gwcm/h 與約

1.5 χ 105 nmol/gWcm/h 之 間 、約 750 nmol/gwcm/h 與約 ΙχΙΟ5nmol/gwcm/h 之 間 、 約 1000 nmol/gwcm/h 與 約 ΙχΙΟ5nmol/gwcm/h 之 間 、 約 2500 nmol/gwcm/h 與 約 ΙχΙΟ5nmol/gwcm/h 之 間 、 約 5000 nmol/gwcm/h 與 約 ΙχΙΟ5nmol/gwcm/h 之 間 、 約 7500 nmol/gWcm/h 與 約 ΙχΙΟ5nmol/gWcm/h 之 間 、及約 ΙχΙΟ4 nmol/gwcm/h 與 約 ΙχΙΟ5nmol/gwcm/h之間的速率製造異戊二烯。在一些實施例中，

限氧培養物 中之細胞製造大於約400、500、600、700、

800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、

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3,000、4,000 ' 5,000 nmol/gwcm/h或 5,000 nmol/gwcm/h以上

之異戊二烯。在一些實施例中，限氧培養物中之細胞以約

125 nmol/gWcm/h 至 約 1.25χ 104 nmol/gwcm/h、 約 250 nmol/gWcm/h 至約 1.25 x 1 04 nmol/gwcm/h、約 500 nmol/gwcm/h至 約 1.25 χ 104 nmol/gWcm/h、約 750 nmol/gwcm/h 至 約

1.25 χ 1 04 nmol/gwcm/h、約 1000

nmol/gwcm/h

nmol/gwcm/h 、 約 1250nmol/gwcm/h 、 約 2500nmol/gwcm/h 、 約 5000nmol/gwcm/h 、 約 7500

nmol/gwcm/h 至 約 1.25χ1()4

nmol/gwcm/h 至 約 1.25X104nmol/gwcm/h 至 約 1.25x104nmol/gwcm/h 至 約 1.25X104nmol/gwcm/h 至 約 1.25X104

及 約 1.00x1(/ nmol/gwcm/h 至 約 1.25χ104nmol/gwcm/h之速率製造氫氣。在一些實施例中，限氧培養

物中之細胞製造大於約125、250、500、750、1000、

1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、

5,000 ' 7,500 ' 10,000 nmol/gwcm/h或 1 0,000 nmol/gwcm/h 以

上之氫氣。

在一些實施例中，本文所述之任何細胞均於限氧培養物

中生長且共同製造異戊二烯與氫氣。在一些實施例中，限

氧培養物中之細胞的異戊二烯平均體積生產力大於約0.1 mg/L培茬液/h，且氫氣平均體積生產力 大於約0.005 mg/L培養液/h。

在一些實施例中，限氧培養物中之細胞的異戊二烯峰值體

積生產力大於約1000 mg/L培釜液/h，且氫氣峰值體積生產力

大於約5 mg/L培養液/h。在一些實施例中，限氧培養物中之

細胞的異戊二烯峰值體積生產力大於約3000 mg/L培養液/h，

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且氫氣峰值體積生產力大於約5 mg/L培养浪/h。在一些實施

例中，限氧培養物中之細胞的異戊二烯峰值體積生產力大

於約5000 mg/L培养液/h，且氫氣峰值體積生產力大於約5 mg/L培卷液/h。在一些實施例中，限氧培養物中之細胞的異

戊二烯平均體積生產力在約0.1 mg/L培養液/h與約5000 mg/L培卷液/h 之間，且氫氣平均體積生產力在約0.005 mg/L培卷液/h與約5 mg/L培茬浪/h之間。在一些實施例中，限氧培養物中之細胞

的異戊二烯平均體積生產力在約1 mg/L培茬液/h與約5000 mg/L培養液/h之 間、約5 mg/L培卷浪/h與約5000 mg/L培卷浪/h之

間、約10 mg/L培卷液/h與 約5 000 mg/L培養液/h之 間、約25 mg/L培養液/h與纟勺5000 mg/L培養液/h之間、纟勺50 mg/L培養波/h與

約5000 mg/L培卷液/h之間、約100 mg/L培養液/h與約5000 mg/L培m/h 之間、約250 mg/L培卷波/h與約5000 mg/L培養液/h之間、約500 mg/L培卷液/h與纟勺5000 mg/L培養液/h之間、約1000 mg/L培養液/h 與終］5000 mg/L培養液/h之間、及終］2500 mg/L培養液/h與#勺5000 mg/L培養液/h之間，且氫氣平均體積生產力在約。.01 mg/L培養液/h 與纟勺5 mg/L培養波/h之間、纟勺0.025 mg/L珞卷液/h與纟勺5 mg/L垮卷浪/h 之間、約0.05 mg/L培善波/h與 約5 mg/L培養波/h之 間、約0.1 mg/L培養液/h與 約5 mg/L培養浪/h之間、約0.25 mg/L培卷液/h與約

5 mg/L培養液/h之間、約0.5 mg/L培養液/h與約5 mg/L培養浪/h之

間、約1 mg/L培* 浪/h與約5 mg/L培養波/h之間、及約2.5 mg/L培養液/h 與約5 mg/L培養液/h之間。

在一些實施例中，本文所述之任何細胞均於限氧培養物

中生長且共同製造異戊二烯與氫氣。在一些實施例中，限

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氧培養物中之細胞使細胞自細胞培養基中消耗之碳有超過

約0.002莫耳％轉化成異戊二烯，且製造之氫氣等效於超過

細胞自細胞培養基中消耗之碳的約0.024莫耳％。在一些實

施例中，限氧培養物中之細胞使細胞自細胞培養基中消耗

之碳有超過約0.002莫耳％轉化成異戊二烯，且製造之氫氣

等效於超過細胞自細胞培養基中消耗之碳的約400莫耳

%。

在一些實施例中，本文所述之共同製造異戊二烯與氫氣

之任何細胞均於限氧培養物中生長。在一些實施例中，限

氧培養物中之細胞共同製造異戊二烯與氫氣5其比率範圍

為每3莫耳％之氫氣至少1莫耳％之異戊二烯至每4莫耳％之

氫氣至少1莫耳％之異戊二烯。在一些實施例中，限氧培

養物中之細胞製造含有1至11莫耳％之異戊二烯及3至33莫

耳％之氫氣的釋出氣體。在一些實施例中，細胞製造1至11 莫耳％之異戊二烯及4至44莫耳％之氫氣。在一些實施例

中，限氧培養物中之細胞亦製造含有氧氣、二氧化碳或氮

氣之釋出氣體。在一些實施例中，限氧培養物中之細胞製

造含有0至21莫耳％之氧氣、18至44莫耳％之二氧化碳及。

至78莫耳％之氮氣的釋出氣體。

在另一態樣中，本文中提供於限氧培養物中共同製造異

戊二烯與氫氣之細胞，其包含編碼異戊二烯合成酶多肽之

異源核酸，其中該等細胞：⑴以大於約400 nmol/gwcm/h之

速率製造異戊二烯且以大於約125 nmol/gwcm/h之速率製造

氫氣；（ii）異戊二烯平均體積生產力大於約0.1 mg/L培养液/h

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且氫氣平均體積生產力大於約0.005 mg/L培卷液/h；或（iii）使細胞自細胞培養基中消耗之碳有超過約0.002莫耳％轉化成

異戊二烯，且製造之氫氣等效於超過細胞自細胞培養基中

消耗之碳的約0.024莫耳％ °

在一些實施例中'限氧培養物中之細胞包含編碼異戊二

烯合成酶多肽之異源核酸，其中該異源核酸可操作地連接

於啟動子，且其中該等細胞製造大於約400 nmol/gwcm/h之

異戊二烯及大於約125 nmol/gwcm/h之氫氣。在一些實施例

中，限氧培養物中之細胞包含編碼異戊二烯合成酶多肽之

異源核酸，其中該異源核酸可操作地連接於啟動子，且其

中該等細胞之異戊二烯平均體積生產力大於約0.1 mg/L培養液/h 且氫氣平均體積生產力大於約0.005 mg/L培卷液/h。在一些

實施例中，限氧培養物中之細胞包含編碼異戊二烯合成酶

多肽之異源核酸，其中該異源核酸可操作地連接於啟動

子，且其中該等細胞使細胞自細胞培養基中消耗之碳有超

過約0.002莫耳％轉化成異戊二烯，且使細胞自細胞培養基

中消耗之碳有超過約0.024莫耳％轉化成氫氣。在一些實施

例中，異戊二烯合成酶多肽為植物異戊二烯合成酶多肽。

在一些實施例中，限氧培養物中之包含編碼異戊二烯合

成酶多肽之異源核酸的細胞以約400 nmol/gwcm/h與約

2.Οχ 105 nmol/gwcm/h 之間、約 500 nmol/gwcm/h 與約 1.5 χ 1 05nmol/gwcm/h 之 間 、 約 750 nmol/gwcm/h 與 約 ΙχΙΟ5nmol/gWcm/h 之 間 、 約 1000 nmol/gwcm/h 與 約 ΙχΙΟ5nmol/gwcm/h 之 間 、 約 2500 nmol/gwcm/h 與 約 ΙχΙΟ5

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nmol/gwcm/h 之間、約 5000 nmol/gwcm/h 與約 1x10,nmol/gwcm/h 之間、約 7500 nmol/gwcm/h 與約 IxlO,nmol/gwcm/h 之間、及約 IxlO，nmol/gwcm/h 與 約 MIO, nmol/gwcm/h之間的速率製造異戊二烯5且以約125 nmol/gwcm/h 至約 1.25^104 nmol/gwcm/h、約 250 nmol/gwcm/h 至 約 1.25 X 104 nmol/gwcm/h、約 500 nmol/gwcm/h 至 約

1.25 X 1 04 nmol/gwcm/h、約 750 nmol/gwcm/h 至 約 1.25乂1。4

nmol/gwcm/h之速率製造氫氣。

在一些實施例中，本文中提供共同製造異戊二烯與氫氣

之方法，該等方法包含：（a）在適於共同製造異戊二烯與氫

氣之條件下培養細胞；及（b）共同製造異戊二烯與氫氣，其

中該等細胞製造大於約400 nmol/gWcm/h之異戊二烯，且其

中該等細胞製造大於約125 nmol/gwcm/h之氫氣。

在一些實施例中，限氧培養物中之包含編碼異戊二烯合

成酶多肽之異源核酸的細胞以約400 nmol/gwcm/h與約

2.0x 1 05 nmol/gwcm/h 之間、約 500 nmol/gwcm/h 與約 1.5 χ 1 05 nmol/gwcm/h 之間、約 750 nmol/gwcm/h 與約 1x10, nmol/gwcm/h 之間、約 1000 nmol/gwcm/h 與約 ΜΙ。'

nmol/gwcm/h 、 約 1000 nmol/gwcm/h 至 約 1.25X104nmol/gwcm/h 、 約 1250 nmol/gwcm/h 至 約 1.25X104nmol/gwcm/h 、 約 2500 nmol/gwcm/h 至 約 1.25X104nmol/gwcm/h 、 約 5000 nmol/gwcm/h 至 約 1.25X104nmol/gwcm/h 、 約 7500 nmol/gwcm/h 至 約 1.25X104nmol/gwcm/h 、及約 1.00χ 104 nmol/gwcm/h 至 約 1.25χ 104

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nmol/gwcm/h 之 間 、 約 2500 nmol/gwcm/h 與 約 ΙχΙΟ5nmol/gwcm/h 之 間 、 約 5000 nmol/gwcm/h 與 約 ΙχΙΟ5nmol/gwcm/h 之 間 、 約 7500 nmol/gwcm/h 與 約 ΙχΙΟ5nmol/gwcm/h 之 間、 及約 1x10 4 nmol/gwcm/h 與 約 ΙχΙΟ5nmol/gwcm/h 之 間的 速率 製造 異戊二烯， 且 以 約125nmol/gWcm/h 至約 1.25 x 1 04 nmol/gwcm/h、約 250 nmol/gwcm/h 至 約 1.25xl04 nmol/gwcm/h、約 500 nmol/gwcm/h 至 約

1.25χ104 nmol/gwcm/h、約 750 nmol/gwcm/h 至 約 1.25χ 1 Ο4

nmol/gwcm/h之速率製造氫氣。

在一些實施例中，本文中提供共同製造異戊二烯與氫氣

之方法，該等方法包含：（a）在適於共同製造異戊二烯與氫

氣之條件下培養細胞；及（b）共同製造異戊二烯與氫氣，其

中該等細胞之異戊二烯平均體積生產力大於約0.1 mg/L培養液/h，

且氫氣平均體積生產力大於約0-005 mg/L培養液/h。

在一些實施例中，本文中提供共同製造異戊二烯與氫氣

之方法，該等方法包含：（a）在適於共同製造異戊二烯與氫

氣之條件下培養細胞；及（b）共同製造異戊二烯與氫氣，其

中該等細胞使細胞自細胞培養基中消耗之碳有超過約

nmol/gwcm/h 、 約 1000 nmol/gwcm/h 至 約 1.25X104nmol/gwcm/h 、 約 1250 nmol/gwcm/h 至 約 1.25X104nmol/gWcm/h 、 約 2500 nmol/gwcm/h 至 約 1.25X104nmol/gwcm/h 、 約 5000 nmol/gwcm/h 至 約 1.25X104nmol/gwcm/h 、 約 7500 nmol/gwcm/h 至 約 1.25X104.nmol/gwcm/h 、及約 1 .OOx 1 04 nmol/gwcm/h 至 約 1.25X104

149050.doc -151 ・

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0.002莫耳％轉化成異戊二烯，且製造之氫氣等效於超過細

胞自細胞培養基中消耗之碳的約0.024莫耳％。

在一些實施例中，本文中提供包含以下之組合物：異戊

二烯及氫氣，其比率範圍為每3莫耳％之氫氣至少1莫耳％

之異戊二烯至每4莫耳％之氫氣至少1莫耳％之異戊二烯；

及0.1莫耳％或0.1莫耳％以下之揮發性雜質。在一些實施例

中，組合物進一步包含1至11莫耳％之異戊二烯及4至44莫

耳％之氫氣。在一些實施例中，組合物進一步包含氧氣、

二氧化碳或氮氣。在一些實施例中，組合物進一步包含0 至21莫耳％之氧氣、18至44莫耳％之二氧化碳及0至78莫耳

%之氮氣。在一些實施例中，組合物進一步包含「Οχι。-'莫

耳％或1.0x10-4莫耳％以下之非甲烷揮發性雜質。在一些實

施例中，非甲烷揮發性雜質包含以下一或多者：2-庚酮、

6-甲基-5-庚烯-2-酮、2,4,5-三甲基毗。定、2,3,5-三甲基毗

嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、雙乙

醯、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1- 丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、

3 -甲基-1-丁醇、異丁酸乙酯、3 -甲基-2-丁烯醛、乙酸丁

酯、乙酸3-甲基丁酯、乙酸3-甲基-3-丁烯-1-基酯、乙酸3- 甲基-2-丁烯-1-基酯、3-己烯-1-醇、乙酸3-己烯-1-基酯、

檸檬烯、香葉醇（反-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇）、香茅醇

（3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇）、（E）-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、

（Z）-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、2,3-環庚烯醇。比咤或線性異

戊二烯聚合物（諸如源自多個異戊二烯單元的聚合之線性

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異戊二烯二聚體或線性異戊二烯三聚體）。在一些實施例

中，非甲烷揮發性雜質包含以下一或多者：異戊二烯組合

物包括以下一或多者：醇、醛或酮（諸如本文所述之任何

醇、醛或酮）。在一些實施例中，異 戊二烯組合物 包括⑴

醇及醛，（ii）醇及酮，（iii）醛及酮，或（iv）醇、醛及酮。在

一些實施例中，非甲烷揮發性雜質包含以下一或多者：甲

醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3 -甲基-1-丙醇、丙

酮、乙酸、.2-丁酮、2-甲基-1-丁醇或。引噪。

本文中亦提供共同製造異戊二烯與氫氣之方法，該等方

法包含：a）在適於共同製造異戊二烯與氫氣之條件下培養

細胞；及b）共同製造異戊二烯與氫氣，其中由限氧培養物

中之細胞製造之異戊二烯的峰值濃度大於約10 ng/L培 < 液，

且細胞之氫氣析 出速率 大於約0.0025 mmol/L培養浪/h。在此

等方法中之任一者之一些實施例中，氫氣析出速率為約以

下任一範圍：0.0025 mmol/L培養波/h至約10 mmol/L培养液/h、

約0.0025 mmol/L培養液/h至約5 mmol/L培養液/h、約0.0025 mmol/L培养液/h至纟勺2.5 mmol/L培養液/h、纟勺0.0025 mmol/L培養液/h 至 約1 mmol/L培養海/h、約0.0025 mmol/L培卷液/h.至 約0.5 mmol/L培養液/h、纟勺0.0025 mmol/L培養液/h至纟勺0.25 mmol/L培養液/h、

約 0.0025 mmol/L 培養波/h至約 0.025 mmol/L 培茬波/h、約 0.025 mmol/L培養液/h至約0.5 mmol/L培養液/h、約0.025 mmol/L培養液/h 至約1 mmol/L培養液/h、約0.025 mmol/L培養浪/h至約2.5 mmol/L培茬液/h、 0.025 mmol/L培養液/h至紅）5 mmol/L培卷波/h、

約0.025 mmol/L培養液/h至 約10 mmol/L培卷浪/h、約0.25

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mmol/L培卷浪/h至1 mmol/L培養液/h、約0.25 mmol/L培养液/h至

2.5 mmol/L培養液/h、 0.25 mmol/L培養液/h至2.5 mmol/L培養浪/h、

及 約0.25 mmol/L培茬液/h至1 0 mmol/L培卷液/h。

本文中亦提供共同製造異戊二烯與氫氣之方法，其包含

a） 在適於共同製造異戊二烯與氫氣之條件下培養細胞；及

b） 共同製造異戊二烯與氫氣，其中異戊二烯之液相濃度小

於約200 mg/L，該等細胞製造大於約400 nmol/gwcm/h之異

戊二烯，且該等細胞之氫氣析出速率大於約0.0025 mmol/L/h。在一些實施例中，培養物中異戊二烯之液相濃

度小於約以下任一值：175 mg/L ' 150 mg/L、125 mg/L、

100 mg/L、75 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、20 mg/L、15 mg/L ' 1 0 mg/L、5 mg/L或 2.5 mg/L。在一些實施例中，培

養物中異戊二烯之液相濃度為約以下任一範圍：0·1 mg/L 至 200 mg/L ' 1 mg/L 至 200 mg/L、1 mg/L 至 150 mg/L、1 mg/L至 100 mg/L、1 mg/L至 50 mg/L、1 mg/L至 25 mg/L、

1 mg/L至20 mg/L或10 mg/L至20 mg/L。在此等方法中之任

一者之一些實施例中，氫氣析出速率為約以下任一範圍：

0.0025 mmol/L 培養液/h 至 約 10 mmol/L 培養液/h、約 0.0025 mmol/L培養液/h至約5 mmol/L培春液/h、約0.0025 mmol/L培養液/h 至 約2.5 mmol/L培養液/h、約0.0025 mmol/L培養液/h至 約1 mmol/L培釜液/h、約0.0025 mmol/L培養液/h至纟勺0.5 mmol/L培茬液/h、

約 0.0025 mmol/L 培養沒/h 至約 0.25 mmol/L 培養液/h、約 0.0025 mmol/L培養液/h至約0.025 mmol/L培養液/h、約0.025 mmol/L培養液/h 至 約0.5 mmol/L培卷液/h、約0.025 mmol/L培養液/h至 約1

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1434921

mmol/L培養浪/h、約0.025 mmol/L培卷液/h至纟勺2.5 mmol/L培養液/h、

約0.025 mmol/L培善波/h至 約5 mmol/L培着液/h、約0.025 mmol/L培養渔/h至約10 mmol/L培養沒/h、約0.25 mmol/L培养液/h 至1 mmol/L培養液/h、約0.25 mmol/L培養浪/h至2.5 mmol/L培茬液/h、

約0.25 mmol/L培卷液/h至2.5 mmol/L培養液/h、及約0.25 mmol/Lj® 養液/h 至 1 0 mmol/L 培養液/h °

在一態樣中，本文中提供於限氧培養物中共同製造異戊

二烯與氫氣之細胞。在一些實施例中，限氧培養物為厭氧

的。在一些實施例中，限氧培養物中之細胞製造大於約

400 nmol/gwcm/h之異戊二烯及大於約125 nmol/gwcm/h之亂

氣。在一些實施例中，細胞具有⑴編碼異戊二烯合成酶多

肽及（ii）可操作地連接於啟動子之異源核酸。在一些實施

例中，在包括碳源之培養基中培養細胞，該碳源為諸如

（但不限於）碳水化合物、甘油、丙三醇、二無基丙酮、單

碳源、油、動物脂肪、動物油、脂肪酸.、脂質、磷脂、甘

油脂、單酸甘油酯、二酸甘油酯、三酸甘油酯、可再生碳

源、多肽（例如微生物或植物蛋白質或肽）、酵母提取物、

來自酵母提取物之組分，或前述兩者或兩者以上之任何組

合。在一些實施例中，於限制性葡萄糖條件下培養細胞。

在一些實施例中，本文中提供之於限氧培養物中之細胞

使細胞培養基中超過約0.002%之碳轉化成異戊二烯且製造

的氫氣等效於細胞培養基中超過約0.024莫耳％之碳。在一

些實施例中，限氧培養物為厭氧的。在一些實施例中，細

胞具有⑴編碼異戊二烯合成酶多肽及（ii）可操作地連接於

149050.doc -155-

1434921

啟動子之異源核酸。在一些實施例中，在包括碳源之培養

基中培養細胞，該碳源為諸如（但不限於）碳水化合物、甘

油、丙三醇、二無基丙酮、單碳源、油、動物脂肪、動物

油、脂肪酸、脂質、磷脂、甘油脂、單酸甘油酯、二酸甘

油酯、三酸甘油酯、可再生碳源、多肽（例如微生物或植

物蛋白質或肽）、酵母提取物、來自酵母提取物之組分，

或前述兩者或兩者以上之任何組合。在一些實施例中，於

限制性葡萄糖條件下培養細胞。

在一些實施例中，本文中提供於限氧培養物中之包含編

碼異戊二烯合成酶多肽之異源核酸的細胞。在一些實施例

中，限氧培養物為厭氧的。在一些實施例中，細胞具有⑴

編碼異戊二烯合成酶多肽及（ii）可操作地連接於啟動子之

異源核酸。在一些實施例中，在包括碳源之培養基中培養

細胞，該碳源為諸如（但不限於）碳水化合物、甘油、丙三

醇、二無基丙酮、單碳源、油、動物脂肪、動物油、脂肪

酸、脂質、磷脂、甘油脂、單酸甘油酯、二酸甘油酯、三

酸甘油酯、可再生碳源、多肽（例如微生物或植物蛋白質

或肽）、酵母提取物、來自酵母提取物之組分，或前述兩

者或兩者以上之任何組合。在一些實施例中，於限制性葡

萄糖條件下培養細胞。

在一態樣中，本文中提供共同製造異戊二烯與另一化合

物之方法，諸如使用本文所述之任何細胞共同製造異戊二

烯與氫氣之方法。在一些實施例中，該方法包含在足以製

造大於約400 nmol/gwcm/h之異戊二烯及大於約125

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nmol/gWcm/h之氫氣的限氧條件下培養細胞。在一些實施例

中，限氧培養物為厭氧的。在一些實施例中*該方法亦包

括回收細胞所製造之異戊二烯及氫氣。在一些實施例中，

該方法進一步包括純化細胞所製造之異戊二烯及氫氣。在

一些實施例中，該方法包括使異戊二烯聚合。在一些實施

例中，細胞具有⑴編碼異戊二烯合成酶多肽及（ii）可操作

地連接於啟動子之異源核酸。在一些實施例中5在包括碳

源之培養基中培養細胞，該碳源為諸如（但不限於）碳水化

合物、甘油、丙三醇、二瓶基丙酮、單碳源、油、動物脂

肪、動物油、脂肪酸、脂質、磷脂、甘油脂、單酸甘油

酯、二酸甘油酯、三酸甘油酯、可再生碳源 ' 多肽（例如

微生物或植物蛋白質或肽）、酵母提取物、來自酵母提取

物之組分，或前述兩者或兩者以上之任何組合。在一些實

施例中，於限制性葡萄糖條件下培養細胞。在多個實施例

中，在停滯期期間所製造之異戊二烯之量（諸如所製造之

異戊二烯的總量，或1 OD6oo每小時每公升培養液所製造之

異戊二烯之量）大於或約為在生長期期間歷經相同持續時

間所製造之異戊二烯之量的兩倍或兩倍以上 。

在一些實施例中，該方法包括在足以使細胞培養基中超

過約0.002%之碳（mol/mol）轉化成異戊二烯且製造的氫氣等

效於細胞培養基中超過約0.024莫耳％之碳之限氧條件下培

養細胞。在一些實施例中，限氧培養物為厭氧的。在一些

實施例中，該方法亦包括回收細胞所製造之異戊二烯及氫

氣。在一些實施例中，該方法進一步包括純化細胞所製造

149050.doc -157-

1434921

之異戊二烯及氫氣。在一些實施例中，該方法包括使異戊

二烯聚合。在一些實施例中，細胞具有⑴編碼異戊二烯合

成酶多肽及（ii）可操作地連接於啟動子之異源核酸。在一

些實施例中，在包括碳源之培養基中培養細胞，該碳源為

諸如（但不限於）碳水化合物、甘油、丙三醇、二強基丙

酮、單碳源、油、動物脂肪、動物油、脂肪酸、脂質、磷

脂、甘油脂、單酸甘油酯、二酸甘油酯、三酸甘油酯 ' 可

再生碳源、多肽（例如微生物或植物蛋白質或肽）、酵母提

取物、來自酵母提取物之組分，或前述兩者或兩者以上之

任何組合。

在本文所述之任何態樣之一些實施例中5微生物多肽碳

源包括一或多種來自酵母或細菌之多肽。在本文所述之任

何態樣之一些實施例中，植物多肽碳源包括一或多種來自

大豆、玉米、芥花、麻風樹、棕櫚、花生、向日葵、椰

子、芥子 '油菜籽、棉籽、棕櫚仁、橄欖、紅花、芝麻或

亞麻子之多肽。

在一些實施例中，僅在停滯期共同製造異戊二烯與氫

氣。在一些實施例中，在生長期與停滯期皆共同製造異戊

二烯與氫氣。在多個實施例中，在停滯期期間所製造之異

戊二烯之量（諸如所製造之異戊二烯的總量，或1 OD600每

小時每公升培養液所製造之異戊二烯之量）大於或約為在

生長期期間歷經相同持續時間所製造之異戊二烯之量的

2 ' 3、4 ' 5 ' 10 ' 20 ' 30 ' 40、5 0倍或 5 0倍以上。在多個

實施例中，在停滯期期間所製造之氫氣之量（諸如所製造

149050.doc ・ 158-

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之氫氣的總量，或1 OD6oo每小時每公升培養液所製造之氫

氣之量）大於或約為在生長期期間歷經相同持續時間所製

造之氫氣之量的2、3、4 ' 5 ' 10 ' 20 > 30、40、5 0倍或50倍以上。

在一些實施例中，本文所提供之組合物包含氫氣，及以

組合物中所有C5煙之總重量計大於或約99.90、99.92、

99.94、99.96、99.98或100重量％之異戊二烯。在一些實施

例中，以組合物中所有C 5煙之總重量計，組合物包含小於

或約 0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、

0.001、0.0005、0.0001、0.00005 或 0.00001 重量 ％ 之非異

戊二烯之C5煙（諸如1,3-環戊二烯、順-1,3-戊二烯、反-1,3- 戊二烯、1,4-戊二烯、1-戊烘、2-戊烘、1-戊烯、2-甲基-

1-丁烯、3-甲基-1-丁块、戊-4-烯-1-缺、反-戊-3-烯-1-媒

或順-戊-3-烯-1-烘）。在一些實施例中，以組合物中所有

C5煙之總重量計，組合物具有小於或約0.12、0.10、

0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、

0.0001、0.00005 或 0.00001 重量 ％之1,3-環戊二烯、順-1,3- 戊二烯、反-1,3-戊二烯、1,4-戊二烯、1-戊烘、2-戊烘、

1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁缺、戊-4-烯-1-烘、

反-戊-3-烯-1-烘或順-戊-3-烯-1-换。在特定實施例中，組

合物具有大於約2 mg之異戊二烯，且以組合物中所有C5煙

之總重量計，具有大於或約99.90 ' 99.92、99.94、99.96、

99.98或100重量％之異戊二烯。在一些實施例中，組合物

具有小於或約 50、40、30、20、10 ' 5 ' 1、0.5、0.1、

149050.doc -159-

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0.05、0.01或0.005卩g/L抑制異戊二烯聚合之化合物（組合

物中抑制異戊二烯聚合之任何化合物）。在特定實施例

中，組合物亦包含大於約2 mg之異戊二烯及大於約0.48mg之氫氣。

在一些實施例中，氣相之揮發性有機部分具有小於或約

50、40、30、20、10 ' 5 ' 1、0.5、0.1、0.05、0.01 或0.005卩g/L抑制異戊二烯聚合之化合物（氣相之揮發性有機

部分中抑制異戊二烯聚合之任何化合物）。在特定實施例

中，氣相之揮發性有機部分亦具有大於約2 mg之異戊二烯

及大於約0.48 mg之氫氣。

在一些實施例中，系統包括本文所述之任何細胞及/或

組合物。在一些實施例中，系統包括反應器，其腔室包含

於限氧培養物 中製造大於約400、500、600、700、800、

900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、

3,000、4,000、5,000 nmol/gwcm/h或 5,000 nmol/gwcm/h以上

之異戊二烯及大於約125、250、500、750、1000、

1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、

5,000 ' 7,500 ' 10,000 nmol/gwcm/h或 1 0,000 nmol/gwcm/h以

上之氫氣的細胞。在一些實施例中，系統並非封閉系統。

在一些實施例中，自系統中移出至少一部分異戊二烯。在

一些實施例中，系統包括包含異戊二烯及氫氣之氣相。在

多個實施例中，氣相包含本文所述之任何組合物。

在一態樣中，本文中提供一種由本文所述之任何組合物

或方法製造之產品。

149050.doc -160-

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在高異戊二烯力價下之細胞生存力

異戊二烯為許多植物、動物及微生物所分泌之疏水性分

子。細菌（諸如桿菌屬）製造含量相當低的異戊二烯。儘管

某種跡象表明植物分泌異戊二烯以幫助進行熱保護，但已

假定異戊二烯可對藍細菌或真菌起拮抗作用，或充當抗微

生物劑。參見，例如Ladygina等人 , Process Biochemistry

41:1001-1014 （2006），其以全文引用的方式併入，尤其關

於起拮抗作用之異戊二烯。由於自然界中產生之極低產量

水準足以抗微生物，故極大關注於異戊二烯工業化所必需

之異戊二烯力價及生產力水準將殺死宿主微生物。

吾人已發現產生供異戊二烯工業化用之異戊二烯力價及

生產力水準，同時維持如二氧化碳析出速率或總二氧化碳

析出速率所指示之細胞生存力及/或代謝活性的方法。

本文中提供製造異戊二烯之方法，其包含：a）在適於製

造異戊二烯之條件下培養細胞；及b）製造異戊二烯，其中

細胞製造大於約400 nmol/gwcm/h之異戊二烯5且該等細胞

之二氧化碳析 出速率 大於約lxl0」8 mmol/L/h。在一些實

施例中，所製造之異戊二烯為題為「例示性製造異戊二

烯」之章節中所揭示之任何濃度或量。在一些實施例中，

異戊二烯之量為約以下任一範圍：400 nmol/gwcm/h至1 mol/gwcm/h、400 nmol/gwcm/h 至 1 mmol/gwcm/h、400 nmol/gwcm/h 至 40 mmol/gwcm/h、400 nmol/gwcm/h 至 4 mmol/gwcm/h 、 1 mmol/gwcm/h 至 1.5 mmol/gwcin/h、 1.5 mmol/gwcm/h 至 3 mmol/gwcm/h 、 3 mmol/gwcm/h 至 5

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mmol/gwcm/h、5 mmol/gwcm/h 至 25 mmol/gwcm/h、25 mmol/gwcm/h 至 100 mmol/gwcm/h、100 mmol/gwcm/h 至 500 mmol/gwcm/h、或 500 mmol/gwcm/h 至 1000 mmol/gwcm/h。在

一些實施例中，異戊二烯之量為約以下任一值：1 mmol/gwcm/h、1.5 mmol/gwcm/h、2 mmol/gwcm/h、3 mmol/gwcm/h、4 mmol/gwcm/h或 5 mmol/gwcm/h。在一些實施

例中，二氧化碳析出速率為約以下任一範圍：ixio-璀

mmol/L/h 至約 1 mol/L/h、1 mmol/L/h 至 1 mol/L/h、25 mmol/L/h至 750 mmol/L/h、25 mmol/L/h至 75 mmol/L/h、

250 mmol/L/h 至 750 mmol/L/h、或 450 mmol/L/h 至 550 mmol/L/h °在一些實施例中，二氧化碳析出速率為約以下

任一值：50 mmol/L/h、100 mmol/L/h、150 mmol/L/h、

200 mmol/L/h、25 0 mmol/L/h、3 00 mmol/L/h、3 5 0 mmol/L/h 、400 mmol/L/h 、450 mmol/L/h 或 500 mmol/L/h °

本文中亦提供製造異戊二烯之方法，其包含：a）在適於

製造異戊二烯之條件下培養細胞；及b）製造異戊二烯，其

中細胞製造大於約400 nmol/gwcm/h之異戊二烯，且細胞生

存力降低程度小於約2倍。在一些實施例中，所製造之異

戊二烯為題為「例示性製造異戊二烯」之章節中所揭示之

任何濃度或量。在一些實施例中，異戊二烯之量為約以下

任一範圍： 400 nmol/gwcm/h 至1 mol/gwcm/h、 400nmol/gWcm/h 至 1 mmol/gwcm/h ' 400 nmol/gwcm/h 至 40mmol/gWcm/h、 400 nmol/gwcm/h 至4 mmol/gwcm/h 、1

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mmol/gwcm/h 至 1.5 mmol/gwcm/h、1.5 mmol/gwcm/h 至 3 mmol/gwcm/h 、 3 mmol/gwcm/h 至 5 mmol/gwcm/h 、 5

mmol/gwcm/h 至 25 mmol/gwcm/h、25 mmol/gwcm/h 至 100 mmol/gwcm/h、100 mmol/gwcm/h 至 500 mmol/gwcm/h、或 500 mmol/gWcm/h至 1000 mmol/gwcm/h。在一些實施例中，異戊

二烯之量為約以下任一值：1 mmol/gwcm/h、1.5 mmol/gwcm/h 、 2 mmol/gwcm/h 、 3 mmol/gwcm/h 、 4mmol/gwcm/h或5 mmol/gwcm/h。在一些實施例中，細胞生存

力降低程度小於約以下任一值：1.75倍、1.5倍、1.25倍、

1倍、0.75倍、0.5倍或0.25倍。在一些實施例中，細胞生

存力降低至約1/2。

本文中另外提供製造異戊二烯之方法，其包含：a）在適

於製造異戊二烯之條件下培養細胞；及b）製造異戊二烯＞

其中培養中細胞所製造之異戊二烯之累積總生產力大於約

0.2 mg/L培養液/h，且該等細胞之二氧化碳析出速率大於約

1x10-18 mmol/L/h。在一些實施例中，異戊二烯之累積總

生產力為題為「例示性製造異戊二烯」之章節中所揭示之

任何濃度或量。在一些實施例中，異戊二烯之累積總生產

力為約 以下任一範圍：0.2 mg/L培養液/h至5 g/L培養浪/h、0.2 mg/L培養液/h至1 g/L培养波/h、 1 g/L培養液/h至2.5 g/L培卷液/h、

2.5 g/L培善浪/h至5 g/L培卷浪/h。在一些實施例中，二氧化碳

析出速率為約以下任一範圍：lxlO-技 mmol/L/h至約1 mol/L/h、1 mmol/L/h 至 1 mol/L/h、25 mmol/L/h 至 750 mmol/L/h、25 mmol/L/h至 75 mmol/L/h、25 0 mmol/L/h至

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750 mmol/L/h ' 或 45 0 mmol/L/h 至 550 mmol/L/h ° 在一些

實施例中 ，二氧化碳析出速率 為約以下任一值 :50mmol/L/h 、100 mmol/L/h 、 150 mmol/L/h 、 200mmol/L/h 、250 mmol/L/h 、 300 mmol/L/h 、 350mmol/L/h 、400 mmol/L/h 、 450 mmol/L/h 或 500mmol/L/h °

本文中提供製造異戊二烯之方法，其包含：a）在適於製

造異戊二烯之條件下培養細胞；及b）製造異戊二烯，其中

培養中細胞所製造之異戊二烯之累積總生產力 大於約0.2 mg/L培卷液/h，且細胞生存力降低程度小於約2倍。在一些

實施例中，異戊二烯之累積總生產力為題為「例示性製造

異戊二烯」之章節中所揭示之任何濃度或量。在一些實施

例中，異戊二烯之累積總生產力為約以下任一範圍：0.2 mg/L培善液/h至5 g/L培卷液/h、 0.2 mg/L培卷浪/h至1 g/L培养液/h、 1 g/L培卷液/h至2.5 g/L培養液/h、2.5 g/L培茬液/h至5 g/L培養液/h。在

一些實施例中，細胞生存力降低程度小於約以下任一值：

1.75 倍、1.5 倍、1.25 倍、1 倍、0.75 倍、0.5 倍或 0.25 倍。

本文中亦提供製造異戊二烯之方法，其包含：a）在適於製

造異戊二烯之條件下培養細胞；及b）製造異戊二烯，其中培

養中細胞所製造之異戊二烯之峰值濃度大於約10 ng/L培養液，

且該等細胞之二氧化碳析出速率大於約ΙχΙΟ”® mmol/L/h。在一些實施例中，異戊二烯之峰值濃度為題為

「例示性製造異戊二烯」之章節中所揭示之任何濃度或

量。在一些實施例中，異戊二烯之峰值濃度為約以下任一

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範圍：10 ng/L培養液至500 ng/L培養液、500 ng/L培养浪至1 |ig/L培春浪、

1卩g/L培養液至5卩g/L培着液、5卩g/L培养液至50卩g/L培卷液、5卩g/L培养液

至100卩g/L培茬液、5 gg/L培茬液至250卩g/L培卷液、250卩g/L培養波

至500 jig/L培卷浪、500 pg/L培養液至1 mg/L培養液、1 mg/L培卷液

至50 mg/L培卷液、1 mg/L培養液至1 00 mg/L培養液、1 mg/L培养液至

200 mg/L培茬波 、1 0 ng/L培巷液至200 mg/L培養波、5 gg/L培養液至

100 mg/L培茬液 、或5 μβ/L培茬液至200 mg/L培養液。在一些實方也

例中，峰值濃 度為約以下任一值：10 ng/L培养液、100 ng/L培卷浪、

1 pg/L培养液、5 卩g/L培卷液、1 mg/L培卷液、30 mg/L培養液、100 mg/L培卷液或200 mg/L培卷波。在一些實施例中，二氧化碳析

出速率為約以下任一範圍：1x10-18 mmol/L/h至約1 mol/L/h、1 mmol/L/h 至 1 mol/L/h、25 mmol/L/h 至 750 mmol/L/h、25 mmol/L/h至 75 mmol/L/h、250 mmol/L/h至

750 mmol/L/h ' 或 450 mmol/L/h 至 550 mmol/L/h ° 在一些

mmol/L/h °另外，本文中亦提供製造異戊二烯之方法，其包含：a)

在適於製造異戊二烯之條件下培養細胞；及b)製造異戊二

烯，其中培養中細胞所製造之異戊二烯之峰值濃度大於約

1 0 ng/L培養液，且細胞生存力降低程度小於約2倍。在一些

實施例中，異戊二烯之峰值濃度為題為「例示性製造異戊

實施例中， 二氧化碳析出速率為約以下任一值：50mmol/L/h 、 100 mmol/L/h 、 150 mmol/L/h 、200mmol/L/h 、 25 0 mmol/L/h 、300 mmol/L/h 、3 50mmol/L/h 、 400 mmol/L/h 、 45 0 mmol/L/h 或 5 00

149050.doc -165-

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二烯」之章節中所揭示之任何濃度或量。在一些實施例

中，異戊二烯之峰值濃度為約以下任一範圍：10 ng/L培養液

至500 ng/L培養波、500 ng/L培養浪至1 |ig/L培査液、1 μg/L培養液至

5卩g/L培卷流、5 |ig/L培養液至50卩g/L培養液、5卩g/L培卷液至100 pg/L培卷液、

5 pg/L培養液至250 pig/L培養液、25 0卩g/L培善液至500 pg/L培養波、

500 μg/L培善液至1 mg/L培養液、1 mg/L培養液至50 mg/L培卷液、1 mg/L培養液至100 mg/L培養液、1 mg/L培養液至200 mg/L培養液、10 ng/L培养液至200 mg/L培養液、5 pg/L培養液至100 mg/L培養液、或5 卩g/L培养液至200 mg/L培養液。在一些實施例中，峰值濃度為

約以下任一值：10 ng/L培養液、100 ng/L培養液、1 pg/L培養液、

5 μg/L培養波、1 mg/L培養浪、30 mg/L培卷液、100 mg/L培卷液或

200 mg/L培養渔。在一些實施例中，細胞生存力降低程度小

於約以下任一值：1.75倍、1.5倍、1.25倍、1倍、0.75倍、

0.5倍或0.25倍。在一些實施例中，細胞生存力降低至約

1/2。

本文中亦提供包含編碼異戊二烯合成酶多肽之核酸的培

養中細胞，其中該等細胞製造大於約400 nmol/gwcm/h之異

戊二烯，且該等細胞之二氧化碳析出速率大於約1 X 10'18 mmol/L/h。在一些實施例中，所製造之異戊二烯為題為

「例示性製造異戊二烯」之章節中所揭示之任何濃度或

量。在一些實施例中，異戊二烯之量為約以下任一範圍：

400 nmol/gwcm/h 至 1 mol/gwcm/h、400 nmol/gwcm/h 至 1 mmol/gWcm/h、400 nmol/gwcm/h 至 40 mmol/gwcm/h、400 nmol/gWcm/h 至 4 mmol/gwcm/h 、 1 mmol/gwcm/h 至 1.5

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mmol/gwcm/h 、 1.5 mmol/gwcm/h 至 3 mmol/gwcm/h ' 3 mmol/gwcm/h 至 5 mmol/gwcm/h 、 5 mmol/gwcm/h 至 25mmol/gwcm/h、25 mmol/gwcm/h 至 100 mmol/gwcm/h、100 mmol/gwcm/h至 500 mmol/gwcm/h、或 500 mmol/gwcm/h至 1000 mmol/gwcm/h 0在一些實施例中，異戊二烯之量為約以下任

一值：1 mmol/gwcm/h、1.5 mmol/gwcm/h、2 mmol/gwcm/h、

3 mmol/gwcm/h、4 mmol/gwcm/h 或 5 mmol/gwcm/h。在一些實

施例中，二氧化碳析出速率為約以下任一範圍：lxlO-仍

mmol/L/h 至約 1 mol/L/h、1 mmol/L/h 至 1 mol/L/h、25 mmol/L/h至 750 mmol/L/h、25 mmol/L/h至 75 mmol/L/h、

250 mmol/L/h 至 75 0 mmol/L/h、或 450 mmol/L/h 至 5 5 0 mmol/L/h。在一些實施例中，二氧化碳析出速率為約以下

任一值：50 mmol/L/h、100 mmol/L/h、150 mmol/L/h、

200 mmol/L/h、250 mmol/L/h、3 00 mmol/L/h、3 50mmol/L/h 、 400 mmol/L/h 、 45 0 mmol/L/h 或 500 mmol/L/h °

本文中亦提供包含編碼異戊二烯合成酶多肽之核酸的培

養中細胞，其中該等培養中細胞所製造之異戊二烯之累積

總生產力大於約0.2 mg/L培養液/h，且該等細胞之二氧化碳

析出速率大於約1 xlO"18 mmol/L/h。在一些實施例中，異

戊二烯之累積總生產力為題為「例示性製造異戊二烯」之

章節中所揭示之任何濃度或量。在一些實施例中，異戊二

烯之累積總生產力為約以下任一範圍：0.2 mg/L培m/h至5 g/L培卷液/h 、 0.2 mg/L培卷液/h至1 g/L培泰液/h 、 1 g/L培春液/h至

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1434921

2.5 g/L培養液/h、2.5 g/L培養液/h至5 g/L培養液/h。在一些實施例

中，二氧化碳析出速率為約以下任一範圍：ΐχΐο·18 mmol/L/h 至約 1 mol/L/h、1 mmol/L/h 至 1 mol/L/h、25 mmol/L/h至 750 mmol/L/h、25 mmol/L/h至 75 mmol/L/h、

250 mmol/L/h 至 750 mmol/L/h、或 450 mmol/L/h 至 550 mmol/L/h。在一些實施例中5二氧化碳析出速率為約以下

任一值：50 mmol/L/h、100 mmol/L/h、150 mmol/L/h、

200 mmol/L/h、250 mmol/L/h、300 mmol/L/h、3 50 mmol/L/h 、400 mmol/L/h 、 450 mmol/L/h 或 5 00mmol/L/h。

另外，本文中提供包含編碼異戊二烯合成酶多肽之核酸

的培養中細胞5其中該等培養中細胞所製造之異戊二烯之

峰值濃度大於約1 0 ng/L培養液，且該等細胞之二氧化碳析出

速率大於約1 X 1。-技mmol/L/h。在一些實施例中，異戊二

烯之峰值濃度為題為「例示性製造異戊二烯」之章節中所

揭示之任何濃度或量。在一些實施例中，異戊二烯之峰值

濃度為約以下任一範圍：10 ng/L培養浪至500 ng/L培養液、500 ng/L培卷浪至1 gg/L培養液、1卩g/L培養液至5卩g/L培养液、5卩g/L培養液

至50卩g/L培養液、5卩g/L培養液至100 μ g/L培養液、5卩g/L培養液至

250卩g/L培養液、250卩g/L培養液至500卩g/L培養液、500卩g/L培养液

至1 mg/L培卷液、1 mg/L培着液至50 mg/L培養液、1 mg/L培卷液至

100 mg/L培養液、1 mg/L培養液至200 mg/L培養液、1 0 ng/L培卷液至

200 mg/L培養波、5 pg/L培養液至100 mg/L培養波、或5卩g/L培卷液

至200 mg/L培養液。在一些實施例中，峰值濃度為約以下任

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一值：10 ng/L培養液、100 ng/L培卷液、1 jig/L培卷液、5 pg/L培奖液、

1 mg/L培養液、30 mg/L培養液、100 mg/L培茬液或200 mg/L培卷浪。

在一些實施例中，二氧化碳析出速率為約以下任一範圍 ：

1X10'18 mmol/L/h 至約 1 mol/L/h、1 mmol/L/h 至 1 mol/L/h ' 25 mmol/L/h至 750 mmol/L/h ' 25 mmol/L/h至 75 mmol/L/h、2 5 0 mmol/L/h 至 75 0 mmol/L/h、或 450 mmol/L/h至5 50 mmol/L/h。在一些實施例中，二氧化碳析

出速率為約以下任一值：50 mmol/L/h、100 mmol/L/h、

150 mmol/L/h、200 mmol/L/h、250 mmol/L/h、300 mmol/L/h、350 mmol/L/h、400 mmol/L/h、45 0 mmol/L/h 或 500 mmol/L/h °在本文所述之任何方法及細胞之一些實施例中 , 將表現

MVA途徑及/或DXP途徑RNA及/或來自異源MVA途徑及/或

DXP途徑核酸及/或MVA途徑及/或DXP途徑核酸之複本中

之一或多者的蛋白質之細胞的二氧化碳析出速率及/或細

胞生存力與缺乏異源MVA途徑及/或DXP途徑核酸及/或

MVA途徑及/或DXP途徑核酸之複本中之一或多者的對照

細胞相比較。在一些實施例中，將在誘導性啟動子（其中

該啟動子經誘導）控制下表現MVA途徑及/或DXP途徑RNA 及/或來自異源MVA途徑及/或DXP途徑核酸及/或MVA途徑

及/或DXP途徑核酸之複本中之一或多者的蛋白質之細胞的

二氧化碳析出速率及/或細胞生存力與在誘導性啟動子（其

中該啟動子未加以誘導（未經誘導））控制下含有異源MVA途

徑及/或DXP途徑核 酸及/或MVA途徑及/或DXP途徑核 酸之

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複本中之一或多者的對照細胞相比較。在一些實施例中，

誘導性啟動子為半乳糖普酶啟動子。

在一些實施例中，製造異戊二烯之方法包含：a）在適於

製造異戊二烯之條件下培養細胞；及b）製造異戊二烯，其

中細胞製造大於約400 nmol/gwcm/h之異戊二烯，且該等細

胞之二氧化碳析出速率大於約1 xlO'18 mmol/L/h。本文中另

外提供製造異戊二烯之方法，其包含：a）在適於製造異戊二

烯之條件下培養細胞；及b）製造異戊二烯，其中培養中細胞

所製造之異戊二烯之累積總生產力大於約0.2 mg/L培養液/h，

且該等細胞之二氧化碳析出速率大於約1χΐθ'18 mmol/L/h。本文中亦提供製造異戊二烯之方法，其包含：

a）在適於製造異戊二烯之條件下培養細胞；及b）製造異戊

二烯，其中培養中細胞所製造之異戊二烯之峰值濃度大於

約10 ng/L培養液，且該等細胞之二氧化碳析出速率大於約

1 X 1 O'18 mmol/L/h。在此等方法中之任一者之一些實施例

中，二氧化碳析出速率為約以下任一範圍：ixio-技

mmol/L/h 至約 1 mol/L/h、1 mmol/L/h 至 1 mol/L/h、25 mmol/L/h至 750 mmol/L/h、25, mmol/L/h至 75 mmol/L/h、

250 mmol/L/h 至 750 mmol/L/h、或 450 mmol/L/h 至 550 mmol/L/h。在一些實施例中，二氧化碳析出速率為約50 mmol/L/h或約 500 mmol/L/h °

本文中另外提供包含編碼異戊二烯合成酶多肽之核酸的

培養中細胞，其中該等細胞製造大於約400 nmol/gwcm/h之

異戊二烯，且該等細胞之二氧化碳析出速率大於約1 X 10'18

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mmol/L/h。本文中亦提供包含編碼異戊二烯合成酶多肽之

核酸的培養中細胞，其中該等培養中細胞所製造之異戊二

烯之累積總生產力大於約0.2 mg/L培養浪/h，且該等細胞之

二氧化碳析 出速率 大於約1X10·18 mmol/L/h。另外，本文

中提供包含編碼異戊二烯合成酶多肽之核酸的培養中細

胞，其中該等培養中細胞所製造之異戊二烯之峰值濃度大

於約10 ng/L培養液，且該等細胞之二氧化碳析出速率大於約

1 X 1 O'18 mmol/L/h °在此等培養中細胞中之任一者之一些

實施例中，二氧化碳析出速率為約以下任一範圍：IxlO'18 mmol/L/h 至約 1 mol/L/h、1 mmol/L/h 至 1 mol/L/h、25 mmol/L/h至 750 mmol/L/h ' 25 mmol/L/h至 75 mmol/L/h ' 250 mmol/L/h 至 750 mmol/L/h、或 450 mmol/L/h 至 5 50 mmol/L/h。在一些實施例中，二氧化碳析出速率為約50 mmol/L/h或約 500 mmol/L/h。

本文中亦提供製造異戊二烯之方法，其包含a）在適於製

造異戊二烯之條件下培養細胞；及（b）製造異戊二烯，其中

異戊二烯之液相濃度小於約200 mg/L，且該等細胞製造大

於約400 nmol/gwcm/h之異戊二烯。在一些實施例中，培養

物中異戊二烯之液相濃度小於約以下任一值：175 mg/L、

150 mg/L、125 mg/L、100 mg/L、75 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、20 mg/L、1 5 mg/L、10 mg/L、5 mg/L或 2.5 mg/L ° 在一些實施例中，培養物中異戊二烯之液相濃度為約以下

任一範圍：0.1 mg/L至 200 mg/L、1 mg/L至 200 mg/L、1 mg/L 至 150 mg/L、1 mg/L 至 100 mg/L、1 mg/L 至 50

149050.doc -171 ・

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mg/L、1 mg/L至 25 mg/L、1 mg/L至 20 mg/L ' 或 10 mg/L 至 20 mg/L °本文中亦提供製造化合物之方法，其中該化合物具有一

或多種選自由以下組成之群的特徵：（a）亨利定律係數小於

約250 M/atm，及（b）水 中 溶解度小於約100 g/L。在一些實

施例中，該方法包含：a）在適於製造化合物之條件下培養

細胞‘其中以約0.01 vvm至約2 vvm之釋氣速率添加氣體

（諸如添加氣體至系統中，諸如醱酵系統中）；及b）製造化

合物。在一些實施例中，化合物之亨利定律係數小於約以

下任一值：200 M/atm、150 M/atm、100 M/atm、75 M/atm、50 M/atm、25 M/atm、10 M/atm、5 M/atm 或 1 M/atm。在一些實施例中，化合物之水中溶解度小於約以

下任一值：75 g/L、50 g/L '■ 25 g/L、10 g/L、5 g/L 或 1 g/L。在一些實施例中，化合物係選自由以下組成之群：

異戊二烯、醛（例如乙醛）、酮（例如丙酮或2- 丁酮）、醇（例

如甲醇、乙醇、1-丁醇，或C5醇，諸如3 -甲基-3-丁烯-1- 醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇）、醇酯（例如乙酸乙酯或C5醇之乙

醯酯）、半花、單蒔、倍半花，及C1至C5煙（例如甲烷、乙

烷、乙烯或丙烯）。在一些實施例中，C1至C5煙為飽和、

不飽和或分支的。在特定實施例中，化合物為異戊二烯。

在製造上述任何化合物之方法的一些實施例中，釋氣速率

為約以下任一範圍：0.1 vvm至1 vvm、0.2 vvm至1 vvm、

或 0.5 vvm至 1 vvm。

在一態樣中，使用培養中細胞製造異戊二烯。在一些實

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施例中，培養中細胞製造大於約400奈莫耳異戊二烯/公克

細胞（細胞濕重）/小時（nmol/gwcm/h）之異戊二烯。在一些實

施例中，細胞具有⑴編碼異戊二烯合成酶多肽及（ii）可操

作地連接於啟動子之異源核酸。在一些實施例中，在包括

碳源之培養基中培養細胞，該碳源為諸如（但不限於）碳水

化合物、甘油、丙三醇、二舞.基丙酮、單碳源 ' 油、動物

脂肪、動物油、脂肪酸、脂質、磷脂、甘油脂、單酸甘油

酯、二酸甘油酯、三酸甘油酯、可再生碳源、多肽（例如

微生物或植物蛋白質或肽）、酵母提取物、來自酵母提取

物之組分，或前述兩者或兩者以上之任何組合。在一些實

施例中，於限制性葡萄糖條件下培養細胞。

在一些實施例中，培養中細胞使細胞培養基中超過約

0.002%之碳轉化成異戊二烯。在一些實施例中，細胞具有

⑴編碼異戊二烯合成酶多肽及（ii）可操作地連接於啟動子

之異源核酸。在一些實施例中，在包括碳源之培養基中培

養細胞，該碳源為諸如（但不限於）碳水化合物、甘油、丙

三醇、二羟基丙酮、單碳源、油、動物脂肪、動物油、脂

肪酸、脂質、磷脂、甘油脂 ' 單酸甘油酯、二酸甘油酯、

三酸甘油酯、可再生碳源、多肽（例如微生物或植物蛋白

質或肽）、酵母提取物、來自酵母提取物之組分，或前述

兩者或兩者以上之任何組合。在一些實施例中，於限制性

葡萄糖條件下培養細胞。

在一些實施例中5培養中細胞包含編碼異戊二烯合成酶

多肽之異源核酸。在一些實施例中，細胞具有⑴編碼異戊

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二烯合成酶多肽及（ii）可操作地連接於啟動子之異源核

酸。在一些實施例中，在包括碳源之培養基中培養細胞，

該碳源為諸如（但不限於）碳水化合物、甘油、丙三醇、二

理基丙酮、單碳源、油、動物脂肪、動物油、脂肪酸、脂

質、磷脂、甘油脂、單酸甘油酯、二酸甘油酯、三酸甘油

酯、可再生碳源、多肽（例如微生物或植物蛋白質或肽）、

酵母提取物、來自酵母提取物之組分5或前述兩者或兩者

以上之任何組合。在一些實施例中，於限制性葡萄糖條件

下培養細胞。

在一態樣中，本文中描述製造異戊二烯之方法，諸如使

用本文所述之任何細胞製造異戊二烯之方法。在一些實施＞

例中，該方法包含在足以製造大於約400 nmol/gwcm/h之異

戊二烯之條件下培養細胞。在一些實施例中，該方法亦包

括回收細胞所製造之異戊二烯。在一些實施例中，該方法

包括純化細胞所製造之異戊二烯。在一些實施例中，該方

法包括使異戊二烯聚合。在一些實施例中，細胞具有⑴編

碼異戊二烯合成酶多肽及（ii）可操作地連接於啟動子之異

源核酸。在一些實施例中，在包括碳源之培養基中培養細

胞，該碳源為諸如（但不限於）碳水化合物、甘油、丙三

醇、二羟基丙酮、單碳源、油、動物脂肪、動物油、脂肪

酸、脂質、磷脂、甘油脂、單酸甘油酯、二酸甘油酯、三

酸甘油酯、可再生碳源、多肽（例如微生物或植物蛋白質

或肽）、酵母提取物、來自酵母提取物之組分，或前述兩

者或兩者以上之任何組合。在一些實施例中，於限制性葡

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萄糖條件下培養細胞。在多個實施例中，在停滯期期間所

製造之異戊二烯之量（諸如所製造之異戊二烯的總量，或ί OD6oo每小時每公升培養液所製造之異戊二烯之量）大於或

約為在生長期期間歷經相同持續時間所製造之異戊二烯之

量的兩倍或兩倍以上。在一些實施例中1氣相包含大於或

約9.5%（體積）之氧氣，且氣相中異戊二烯之濃度低於可燃

下限或高於可燃上限。在特定實施例中，（i）氣相中異戊二

烯之濃度低於可燃下限或高於可燃上限，及（ii）細胞製造

大於約400 nmol/gwcm/h之 異戊 二烯。

在一些實施例中，該方法包括在足以使細胞培養基中超

過約0.002%（mol/mol）之碳轉化成異戊二烯的條件下培養細

胞。在一些實施例中，該方法亦包括回收細胞所製造之異

戊二烯。在一些實施例中，該方法包括純化細胞所製造之

異戊二烯。在一些實施例中，該方法包括使異戊二烯聚

合。在一些實施例中，細胞具有⑴編碼異戊二烯合成酶多

肽及（ii）可操作地連接於啟動子之異源核酸。在一些實施

例中，在包括碳源之培養基中培養細胞，該碳源為諸如

（但不限於）碳水化合物、甘油、丙三醇、二謬基丙酮、單

碳源、油、動物脂肪、動物油、脂肪酸、脂質、磷脂、甘

油脂、單酸甘油酯、二酸甘油酯、三酸甘油酯、可再生碳

源、多肽（例如微生物或植物蛋白質或肽）、酵母提取物、

來自酵母提取物之組分，或前述兩者或兩者以上之任何組

合。在一些實施例中，於限制性葡萄糖條件下培養細胞。

在一些實施例中，僅在停滯期製造異戊二烯。在一些實

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施例中，在生長期與停滯期皆製造異戊二烯。在多個實施

例中，在停滯期期間所製造之異戊二烯之量（諸如所製造

之異戊二烯的總量，或1 OD6oo每小時每公升培養液所製造

之異戊二烯之量）大於或約為在生長期期間歷經相同持續

時間所製造之異戊二烯之量的2、3、4、5 ' 10 ' 20 ' 30、

40、50倍或50倍以上。

在一態樣中，本文中描述包含異戊二烯之組合物及系

統。在一些實施例中，組合物包含大於或約2、5 ' 10 ' 20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、

400 ' 500 ' 600、700、800、900 或 1000 mg之異戊二烯。

在一些實施例中，組合物包含大於或約2、5、10 ' 20 ' 30 ' 40 ' 50 ' 60 ' 70、80、90 ' 100 g之異戊二烯（w/w）， 該組合物之揮發性有機部分為異戊二烯。

在一些實施例中，以組合物中所有C5煙之總重量計，組

合物包含大於或約 99.90、99.92、99.94、99.96、99.98 或

100重量％之異戊二烯。在一些實施例中，以組合物中所

有C5煙之總重量計，組合物包含小於或約0.12、0.10、

0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、

0.0001、0.00005或0.00001重量％之非異戊二烯之C5煙（諸

如1,3-環戊二烯、順-1,3-戊二烯、反-1,3-戊二烯、1,4-戊

二烯、1-戊块、2-戊烘、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-

1-丁烘、戊-4-烯-1-块、反-戊-3-烯-1-块或順-Λ -3-烯-1- 块）。在一些實施例中，以組合物中所有C5煙之總重量

計，組合物具有小於或約0.12 ' 0.10、0.08、0.06、0.04、

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0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005 或

0.0000 1重量％之1,3-環戊二烯、順-1,3-戊二烯、反-1,3-戊

二烯、1,4-戊二烯、1-戊块、2-戊烘、1-戊烯、2-甲基-1- 丁烯、3-甲基-1-丁块、戊-4-烯-1-烘、反-戊-3-烯-1-烘或

順-戊-3-烯-1 -烘。在特定實施例中1組合物具有大於約2 mg之異戊二烯，且以組合物中所有C5煙之總重量計 > 具

有大於或約 99.90、99.92、99.94、99.96、99.98 或 100 重量

%之異戊二烯。

在一些實施例中，組合物具有小於或約50 ' 40 ' 30 '20 ' 10 ' 5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 或 0.005 卩g/L抑制異

戊二烯聚合之化合物（組合物中抑制異戊二烯聚合之任何

化合物）。在特定實施例中，組合物亦具有大於約2 mg之

異戊二烯。

在一些實施例中，組合物具有一或多種選自由乙醇、丙

酮、C5異戊二烯醇及具有10個或10個以上碳原子之類異戊

二烯化合物組成之群的化合物。在一些實施例中，組合物

具有大於或約 0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10 ' 20 ' 30 ' 40 ' 60 ' 80 ' 100或120 卩g/L之乙醇、丙酮、C5 異戊二烯醇（諸如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3 -甲基-2-丁烯-1- 醇），或前述任意兩者或兩者以上。在特定實施例中，組

合物具有大於約2 mg之異戊二烯，且具有一或多種選自由

乙醇、丙酮、C5異戊二烯醇及具有10個或10個以上碳原子

之類異戊二烯化合物組成之群的化合物。

在一些實施例中*組合物包括異戊二烯及一或多種選自

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由以下組成之群的第二化合物：2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2- 酮、2,4,5-三甲基。比唳、2,3,5-三甲基毗嗪、香茅醛、乙

醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、雙乙醯、2-丁酮、2-甲

基-3-丁烯-'2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁

醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、異

丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁

酯、乙酸3-甲基-3-丁烯-1-基酯、乙酸3-甲基-2-丁烯-1-基

酯、3-己烯-1-醇、乙酸3-己烯-1-基酯、檸檬烯、香葉醇

（反-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇）、香茅醇（3,7-二甲基-6- 辛烯-1-醇）、（E）-3,7-二 甲基-1,3,6-辛三烯、（Z）-3,7-二 甲

基-1,3,6-辛三烯及2,3-環庚烯醇。比咤。在多個實施例中，

以重量百分比為單位，此等第二組分之一之量相對於異戊

二烯之量（亦即，組分重量除以異戊二烯重量χ100）為大於

或約 0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、

40、50、60、70、80、90、100或 110%（w/w）。

在一些實施例中，組合物包含⑴包含異戊二烯之氣相,

及（ii）製造大於約400 nmol/gwcm/h之異戊二烯之培養中細

胞。在一些實施例中，組合物包含封閉系統，且當針對1 mL、1 OD600、培養1小時進行校正時，氣相包含大於或約

5 ' 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 |ig/L之

異戊二烯。在一些實施例中，組合物包含開放系統，且當

以1 vvm之速率釋氣時，氣相包含大於或約5、10 ' 20、

30、40、50、60、70、80、90、100 |ig/L之異戊二烯。在

一些實施例中，以揮發性有機部分中所有C5煙之總重量

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計，氣相之揮發性有機部分 包含大於或約99.90、99.92、

99.94 ' 99.96、99.98或100重量％之異戊二烯。在一些實施

例中，以揮發性有機部分中所有C5煙之總重量計，氣相之

揮發性有機部分包含小於或約0.12 ' 0.10 ' 0.08、0.06、

0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、

0.00005或0.00001重量％之非異戊二烯之C 5煙（諸如1,3-環

戊二烯、順-1,3-戊二烯、反-1,3-戊二烯、1,4-戊二烯、1- 戊烘、2-戊烘、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁缺、

戊-4-烯-1-块、反-戊-3-烯-1-烘或順-戊-3-烯-1-烘）。在一

些實施例中，以揮發性有機部分中所有C5煙之總重量計，

氣相之揮發性有機部分具有小於或約0.12、0.10 ' 0.08、

0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、

0.0001、0.00005 或 0.00001 重量 ％之 1,3-環戊二烯、順-1,3- 戊二烯、反-1,3-戊二烯、1,4-戊二烯、1-戊烘、2-戊烘、

1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烘、戊-4-烯-1-块、

反-戊-3-烯-1-烘或順-戊-3-烯-1-烘。在特定實施例中，氣

相之揮發性有機部分具有大於約2 mg之異戊二烯，且以揮

發性有機部分中所有C5煙之總重量計，具有大於或約

99.90、99.92、99.94、99.96、99.98 或 100 重量 ％之異戊二

烯。

在一些實施例中，氣相之揮發性有機部分具有小於或約

50 ' 40 ' 30 ' 20 ' 10 ' 5 ' 1、0.5、0.1、0.05、0.01 或

0.005卩g/L抑制異戊二烯聚合之化合物（氣相之揮發性有機

部分中抑制異戊二烯聚合之任何化合物）。在特定實施例

149050.doc • 179-

1434921

中，氣相之揮發性有機部分亦具有大於約2 mg之異戊二

烯。

在一些實施例中，氣相之揮發性有機部分具有一或多種

選自由乙醇、丙酮、C5異戊二烯醇及具有10個或10個以上

碳原子之類異戊二烯化合物組成之群的化合物。在一些實

施例中，氣相之揮發性有機部分具有大於或約0.005、

0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、

100或120卩g/L之乙醇、丙酮、C5異戊二烯醇（諸如3-甲基-

3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇），或前述任意兩者或兩

者以上。在特定實施例中，氣相之揮發性有機部分具有大

於約2 mg之異戊二烯，且具有一或多種選自由乙醇、丙

酮、C5異戊二烯醇及具有10個或10個以上碳原子之類異戊

二烯化合物組成之群的化合物。

在一些實施例中，氣相之揮發性有機部分包括異戊二烯

及一或多種選自由以下組成之群的第二化合物：2-庚酮、

6-甲基-5-庚烯-2-酮、2,4,5-三 甲基毗。定、2,3,5-三 甲 基毗

嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、雙乙

醯、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1- 丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、

3 -甲基-1-丁醇、異丁酸乙酯、3 -甲基-2-丁烯醛、乙酸丁

酯、乙酸.3-甲基丁酯、乙酸3-甲基-3-丁烯-1-基酯、乙酸3- 甲基-2-丁烯-1-基酯、3-己烯-1-醇、乙酸3-己烯-1-基酯、

檸檬烯、香葉醇（反-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇）、香茅醇

（3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇）、（E）-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、

149050.doc -180-

1434921

(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-辛 三烯及2,3-環庚烯醇毗咤。在多個

實施例中，在氣相之揮發性有機部分中，以重量百分比為

單位，此等第二組分之一之量相對於異戊二烯之量(亦

即，組分重量除以異戊二烯重量x 100)為大於或約0.01、

0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、

70 ' 80 ' 90 ' 100 或 110%(w/w)。

在本文所述之任何組合物之一些實施例中，至少一部分

異戊二烯處於氣相中。在一些實施例中，至少一部分異戊

二烯處於液相(諸如冷凝物)中。在一些實施例中，至少一

部分異戊二烯處於固相中。在一些實施例中，至少一部分

異戊二烯吸附於固體支撐物，諸如包括二氧化矽及/或活

性碳之支撐物。在一些實施例中 ' 組合物包括乙醇。在一

些實施例中，組合物包括約75至約90重量％之乙醇，諸如

約75至約80重量％、約80至約85重量％或約85至約90重量

%之乙醇。在一些實施例中，組合物包括約4至約15重量％

之異戊二烯，諸如約4至約8重量％、約8至約12重量％或約

12至約15重量％之異戊二烯。

在一些實施例中，系統包括本文所述之任何細胞及/或

組合物。在一些實施例中，系統包括反應器，其腔室包含

製造大於約 400、500、600、700、800、900、1,000、

1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、

5,000 nmol/gwcm/h 或 5,000 nmol/gwcm/h 以上之異戊二烯之培

養中細胞。在一些實施例中，系統並非封閉系統。在一些

實施例中，自系統中移出至少一部分異戊二烯。在一些實

149050.doc -181 -

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施例中，系 統包括 包含異戊二烯之氣相。在 多個實施例

中，氣相包含本文所述之任何組合物。

在本文所述之任何組合物、系統及方法之一些實施例

中，於氣相中製造非可燃濃度之異戊二烯。在一些實施例

中，氣相包含小於約9.5%（體積）之氧氣。在一些實施例

中，氣相包含大於或約9.5%（體積）之氧氣，且氣相中異戊

二烯之濃度低於可燃下限或高於可燃上限。在一些實施例

中，氣相中非異戊二烯之部分包含約0%至約100%（體積）

之氧氣，諸如約10%至約100% （體積）之氧氣。在一些實施

例中，氣相中非異戊二烯之部分包含約0%至約99%（體積）

之氮氣。在一些實施例中，氣相中非異戊二烯之部分包含

約1%至約5 0%（體積）之CO2。

在本文所述之任何態樣之一些實施例中5培養中細胞製

造大於或約 400、500、600、700、800、900、1,000、

1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、

5,000 nmol/gwcm/h或 5,000 nmol/gwcm/h以上之異戊二烯。在

本文所述之任何態樣之一些實施例中，培養中細胞使細胞

培養基中大於或約 0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、

0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、

0.8、0.9 ' 1.0、1.2、1.4、1.6% 或 1.6% 以上之碳轉化成異

戊二烯。在本文所述之任何態樣.之一些實施例中，培養中

細胞製造大於或約1、10、25、50、100 ' 150、200、

250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、

1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、

149050.doc -182-

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5,000、10,000 ' 100,000奈克異戊二烯/公克細胞（細胞濕

重）/小時（ng/gwcm/h）或 100,000 ng/gwcm/h 以上之異戊二烯。

在本文所述之任何態樣之一些實施例中，培養中細胞製造

累積力價（總量）大於或約為1、10、25、50 ' 100、150、

200、250、300、400、500、600、700、800、900、

1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、

4,000、5,000、10,000、50,000、100,000 毫克異戊二烯/公

升培養液（mg/L培4 ά 5其中培養液體積包括細胞及細胞培

養基之體積）或100,000 mg/L培養液以上之異戊二烯。異戊二

烯製造之其他例示性速率及異戊二烯製造之總量揭示於本

文中。

在本文所述之任何態樣之一些實施例中，細胞進一步包

含編碼IDI多肽之異源核酸。在本文所述之任何態樣之一

些實施例中，細胞進一步包含編碼IDI多肽之內源核酸之

複本插入物。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，細

胞進一步包含編碼DXS多肽之異源核酸。在本文所述之任

何態樣之一些實施例中，細胞進一步包含編碼DXS多肽之

內源核酸之複本插入物。在本文所述之任何態樣之一些實

施例中，細胞進一步包含一或多種編碼IDI多肽及DXS多

肽之核酸。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，一種

核酸編碼異戊二烯合成酶多肽、IDI多肽及DXS多肽。在

本文所述之任何態樣之一些實施例中，一種載體編碼異戊

二烯合成酶多肽、IDI多肽及DXS多肽。在一些實施例

中，載體包含選擇性標記物，諸如抗生素抗性核酸。

149050.doc -183 ・

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在本文所述之任何態樣之一些實施例中5異源異戊二烯

合成酶核酸可操作地連接於T7啟動子，諸如中等複本質體

或高複本質體中所含之T7啟動子。在本文所述之任何態樣

之一些實施例中，異源異戊二烯合成酶核酸可操作地連接

於Trc啟動子，諸如中等複本質體或高複本質體中所含之

Trc啟動子。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，異

源異戊二烯合成酶核酸可操作地連接於Lac啟動子，諸如

低複本質體中所含之Lac啟動子。在本文所述之任何態樣

之一些實施例中，異源異戊二烯合成酶核酸可操作地連接

於內源啟動子，諸如內源鹼性絲胺酸蛋白酶啟動子。在一

些實施例中，異源異戊二烯合成酶核酸整合至不含選擇性

標記物之細胞的染色體中。

在一些實施例中，一或多種MVA途徑、IDI、DXP或異

戊二烯合成酶核酸置於在停滯期比在生長期更具活性之啟

動子或因子的控制下。舉例而言，一或多種MVA途徑、

IDI、DXP或異戊二烯合成酶核酸可置於停滯期。因子（諸如

RpoS）之控制下。在一些實施例中，一或多種MVA途徑、

IDI、DXP或異戊二烯合成酶核酸置於在停滯期可誘導之

啟動子，諸如在停滯期可由反應調控子誘導呈活性之啟動

子的控制下。

在本文所述之任何態樣之一些實施例中，至少一部分細

胞於連續培養物（諸如未經稀釋之連續培養物）中歷經至少

或約5、10 ' 20 ' 40 ' 50 ' 60、65次或65次以上之細胞分

裂，維持異源異戊二烯合成酶核酸。在本文所述之任何態

149050.doc -184-

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樣之一些實施例中，包含異戊二烯合成酶、IDI或DXS核

酸之核酸亦包含選擇性標記物，諸如抗生素抗性核酸。

在本文所述之任何態樣之一些實施例中，細胞進一步包

含編碼MVA途徑多肽（諸如來自釀酒酵母或糞腸球菌之

MVA途徑多肽）之異源核酸。在本文所述之任何態樣之一

些實施例中，細胞進一步包含編碼MVA途徑多肽（諸如來

自釀酒酵母或糞腸球菌之MVA途徑多肽）之內源核酸之複

本插入物。在本文所述之任何態樣之一些實施例中，細胞

包含異戊二烯合成酶、DXS及MVA途徑核酸。在本文所述

之任何態樣之一些實施例中，細胞包含異戊二烯合成酶核

酸、DXS核酸、IDI核酸、及MVA途徑核酸（以及IDI核

酸）。

在本文所述之任何態樣之一些實施例中，異戊二烯合成

酶多肽為來自以下植物之多肽：諸如葛屬（例如山葛或大

葛藤）或楊屬（例如美洲山楊、銀白楊、黑楊、毛果楊、或

銀白楊與歐洲山楊雜交種）。

在本文所述之任何態樣之一些實施例中'細胞為細菌細

胞，諸如革蘭氏陽性細菌細胞（例如桿菌屬細胞，諸如枯

草桿菌細胞；或鏈黴菌屬細胞，諸如青紫鏈黴菌、天藍色

鏈黴菌或灰色鏈黴菌細胞）。在本文所述之任何態樣之一

些實施例中，細胞為革蘭氏陰性細菌細胞（例如大腸桿菌

屬細胞，諸如大腸桿菌細胞；紅假單胞菌屬，諸如沼澤紅

假單胞菌細胞；假單胞菌屬，諸如螢光假單胞菌細胞或惡

臭假單胞菌細胞；或泛菌屬細胞，諸如檸檬泛菌細胞）。

149050.doc • 185-

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在本文所述之任何態樣之一些實施例中，細胞為真菌細

胞，諸如絲狀真菌細胞(例如木黴屬細胞，諸如里氏木黴

細胞；或麴菌屬細胞，諸如米麴菌及黑麴菌)；或酵母細

胞(例如耶氏酵母屬細胞，諸如解脂耶氏酵母細胞；或酵

母屬細胞，諸如釀酒酵母)。

在本文所述之任何態樣之一些實施例中，微生物多肽碳

源包括一或多種來自酵母或細菌之多肽。在本文所述之任

何態樣之一些實施例中，植物多肽碳源包括一或多種來自

•大豆、玉米、芥花、麻風樹、棕櫚、花生、向日葵、椰

子、芥子、油菜籽、棉籽、棕櫚仁、橄欖、紅花、芝麻或

亞麻子之多肽。

在厭氧微生物中使用合成氣作為能源製造異戊二烯

在一些實施例中，在厭氧微生物中使用合成氣作為能源

製造生物異戊二烯組合物'如2009年12月22 0申請之美國

臨時專利申請案第61/289,347號及第61/289,355號中所述，

該等申請案之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。

由厭氧生物體自合成氣製造異戊二烯可提供許多優於由

好氧生物體自糖製造異戊二烯之優勢。首先，異戊二烯之

最大理論質量產率可大於好氧生物體，如下文進一步論

述。其次，厭氧生物體不具有呈NAD(P)H形式之過量還原

力，而NAD(P)H須經由細胞生長、形成副產物(諸如甘

油、乳酸或乙醇)或使用分子氧進行氧化而得以轉換。在

無需此NAD(P)H轉換之情況下，厭氧生物體之能產率較

高、需氧量較低、醱酵熱較低及操作該過程之效用成本較

149050.doc -186-

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低。第三，由於系統中缺乏氧氣，故厭氧生物體之釋出氣

體中異戊二烯濃度較高、產生可燃性異戊二烯-氧氣混合

物之可能性較低、回收較容易及異戊二烯品質較高。第

四，藉由使用現有基礎結構，諸如經設計用於製造生物乙

醇之現有植物，可更容易使厭氧生物體生長。

適用於製造異戊二烯之厭氧生物體可包括專性厭氧菌、

兼性厭氧菌及耐氧厭氧菌。專性厭氧菌可為選自由以下組

成之群之任一者或組合：揚氏梭菌(Clostridium

ljungdahlii)、產乙醇梭菌｛Clostridium autoethanogenum)、

黏液真桿菌(Eurobacterium limosum｝、食一氧化碳梭菌

｛Clostridium carboxy div or an s')、產生分解鏈球菌

(P ept o str ept o co ecus productus)及食甲基丁 酸桿菌

(Butyribacterium methylotrophicum) ° 適用作 製造異 戊二烯

之能源的合成氣可經由多種過程自原料得到，該等過程包

括甲烷重整、煤液化、共燃、醱酵反應、酶促反應及生質

氣化。

例示性純化方法

在一些實施例中，本文所述之任何方法均進一步包括回

收共同製造之化合物。在一些實施例中，本文所述之任何

方法均進一步包括回收異戊二烯。在一些實施例中，本文

所述之任何方法均進一步包括由低溫膜、基於吸附基質之

分離方法回收氫氣。

使用本文所述之組合物及方法製造之異戊二烯及氫氣可

使用標準技術加以回收，諸如氣提、膜增強型分離、分

149050.doc -187-

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餾、吸附/脫附、滲透蒸發（pervaporation）、使異戊二烯自

固相熱脫附或真空脫附，或用溶劑萃取固定或吸附於固相

之異戊二烯（參見，例如美國專利第4,703,007號、第

4,570,029號及第 4,740,222號（「Recovery and Purification of Hydrogen from Refinery and Petrochemical Off-gas Streams j ），各藉此以全文引用的方式併入,尤其關於異

戊二烯回收與純化方法（'007及'029專利）且關於氫氣回收與

純化方法（'222專利））。在特定實施例中，用醇（諸如乙醇、

甲醇、丙醇或其組合）進行萃取蒸餾來回收異戊二烯。在

一些實施例中，異戊二烯回收包含以液體形式分離異戊二

烯（諸如異戊二烯之純溶液或異 戊二烯於溶劑中之溶液）。

氣提包含以連續方式自醱酵釋出氣流中移出異戊二烯蒸

氣。該移出可以若干不同方式達成 > 包括（但不限於）吸附

於固相、分配至液相中、或直接冷凝（諸如因與冷凝線圈

接觸而冷凝或因壓力增加而冷凝）。在一些實施例中，在

稀異戊二烯蒸氣流之露點之上對該蒸氣進行膜富集，從而

冷凝得到液體異戊二烯。在一些實施例中，對異戊二烯進

行壓縮及冷凝。

異戊二烯回收可包含一個步驟或多個步驟。在一些實施

例中，自醱酵釋出氣體中移出異戊二烯蒸氣及使異戊二烯

轉化成液相係同時進行。舉例而言，可使異戊二烯自釋出

氣流中直接冷凝而形成液體。在一些實施例中，自醱酵釋

出氣體中移出異戊二烯蒸氣及使異戊二烯轉化成液相係依

序進行。舉例而言，可使異戊二烯吸附於固相，接著用溶

149050.doc -188 -

1434921

劑自固相萃取。

氫氣回收可包含一個步驟或多個步驟。在一些實施例

中，自醱酵釋出氣體中移出氫氣及使氫氣轉化成液相係同

時進行。在一些實施例中，自醱酵釋出氣體中移出氫氣及

使氫氣轉化成液相係依序進行。舉例而言，可使氫氣吸附

於固相，接著經由壓力擺動(pressure swing)自固相脫附。

在一些實施例中，濃縮並壓縮所回收之氫氣。

在一些實施例中，本文所述之任何方法均進一步包括純

化異戊二烯。舉例而言，使用本文所述之組合物及方法所

製造之異戊二烯可使用標準技術加以純化。純化係指使異

戊二烯與一或多種在製造異戊二烯時所存在之組分分離的

過程。在一些實施例中，以實質上純液體之形式獲得異戊

二烯。純化方法之實例包括⑴用液體萃取劑自溶液蒸餾，

及(ii)層析。本文中所用之「經純化異戊二烯」意謂已與

一或多種在製造異戊二烯時所存在之組分分離的異戊二

烯。在一些實施例中，至少約20重量％的異戊二烯與在製

造異戊二烯時所存在之其他組分分離。在多個實施例中，

異戊二烯之純度至少或約為25重量％、30重量％、40重量

% ' 50重量％、60重量％、70重量％、75重量％、80重量

% ' 90重量％、95重量％或99重量％。可藉由任何適當方

法，例如 藉由管 柱層析、HPLC分析 或GC-MS分析 來檢驗

純度。

在一些實施例中5本文所述之任何方法均進一步包括純

化氫氣。舉例而言，使用本文所述之組合物及方法所製造

149050.doc ・ 189-

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之氫氣可使用標準技術加以純化。純化係指使氫氣與一或

多種在製造氫氣時所存在之組分分離的過程。在一些實施

例中，以實質上純氣體之形式獲得氫氣。在一些實施例

中，以實質上純液體之形式獲得氫氣。純化方法之實例包

括（i）低溫冷凝及（ii）固體基質吸附。本文中所用之「經純

化氫氣」意謂已與一或多種在製造氫氣時所存在之組分分

離的氫氣。在一些實施例中，至少約20重量％的氫氣與在

製造氫氣時所存在之其他組分分離。在多個實施例中5氫

氣之純度至少或約為25重量％、30重量％、40重量％、50 重量％、60重量％、70重量％、75重量％、80重量％、90重

量％、95重量％或99重量％。可藉由任何適當方法，例如

藉由管柱層析或GC-MS分析來檢驗純度。

在一些實施例中，藉由將一或多個移出異戊二烯之回收

步驟之後殘留之至少一部分氣相引入用於製造異戊二烯之

細胞培養系統（諸如醱酵槽）中使該氣相再循環。

自醱酵槽釋出氣體純化生物異戊二烯組合物之方法及裝

置描述於2009年12月18日申請之美國臨時專利申請案第

61/88,142號中，該文獻以全文引用的方式併入本文中。

來自醱酵槽釋出氣體之生物異戊二烯組合物可含有生物

異戊二烯，以及揮發性雜質及生物副產物雜質。在一些實

施例中，使用一種方法自醱酵槽釋出氣體純化生物異戊二

烯組合物，該方法包含：（a）在第一管柱中使醱酵槽釋出氣

體與溶劑接觸以形成：包含溶劑、大部分異戊二烯及大部

分生物副產物雜質之富異戊二烯溶液，及包含大部分揮發

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性雜質之蒸氣；（b）將富異戊二烯溶液自笫一管柱轉移至第

二管柱；及（c）在第二管柱中自富異戊二烯溶液氣提異戊二

烯以形成：包含大部分生物副產物雜質之貧異戊二烯溶

液，及經純化之異戊二烯組合物。

圖169說明一種純化異戊二烯之例示性方法、及一種例

示性裝置。可由此項技術中之任何方法5例如美國臨時專

利申請案第61/187,944號中所述，自可再生資源（例如碳

源）產生包含異戊二烯之醱酵槽釋出氣體，該申請案之內

容藉此以引用的方式併入，尤其關於產生包含異戊二烯之

醱酵槽釋出氣體之方法。可將自一或多個個別醱酵槽

12（例如串聯及/或並聯連接之1、2、3、4、5、6、7、8個

或8個以上醱酵槽）產生之醱酵槽釋出氣體引導至第一管柱

14。如下文所述，可將醱酵槽釋出氣體引導穿過分離單元

16及/或由壓縮構件（諸如壓縮系統18）壓縮。另外，在與溶

劑接觸之前可在任何點處視情況降低醱酵槽釋出氣體之溫

度，例如以形成冷凝物或部分冷凝物（此可有助於一或多

種釋出氣體組分（諸如異戊二烯）溶解）。在管柱14中可使醱

酵槽釋岀氣體與溶劑（例如本文所述之任何溶劑，諸如非

極性高沸點溶劑）接觸（例如吸收於其中）。自剩餘溶劑/醱

酵槽釋出氣體混合物中分離吸收於溶劑（尤其非極性高沸

點溶劑）中之傾向較小的揮發性雜質，得到包含大部分揮

發性雜質之蒸氣（例如在開口 20處退出），及具有大部分異

戊二烯及大部分生物副產物雜質之富異戊二烯溶液（例如

在開口 22處）。在與醱酵槽釋出氣體接觸之前、同時及/或

149050.doc -191 -

1434921

之後可視情況由任何適合方式（例如由蒸汽）加熱溶劑，此

可有助於自剩餘溶液中分離揮發性雜質。可將蒸汽引導穿

過管柱（在任何適合位置處，諸如釋出氣體之入口附近及/

或揮發性雜質出口之相對端，如圖1 69中所示）以提供可有

助於移除揮發性雜質之吹掃蒸氣相。

可將具有大部分異戊二烯及大部分生物副產物雜質之富

異戊二烯溶液（例如在開口 22處）引導至第二管柱24。第二

管柱可與第一管柱14分離（如圖169中所示）或可為包含第一

管柱與第二管柱之單一管柱的一部分（例如串聯式管柱，

其中溶劑在一端或一端附近進入第一管柱，且在相對端或

相對端附近退出第二管柱）。可在第二管柱中自富異戊二

烯溶液氣提異戊二烯以產生經純化之異戊二烯組合物（例

如在開口 26處）及包含大部分生物副產物雜質之貧異戊二

烯溶液（例如在開口 2 8處）。可由任何適合方式（例如由蒸

汽）加熱富異戊二烯溶液，此可有助於自剩餘溶液汽提異

戊二烯。可將蒸汽引導穿過管柱（在任何適合位置處，諸

如富異戊二烯溶液入口點之相對端及/或貧異戊二烯溶液

出口端附近，如圖169中所示）。

如本文所述，管柱可為習知管柱且具有任何適合尺寸。

例示性管柱類型可自 包括 Koch Modular Process Sy stems （Paramus, NJ）、Fluor Corporation（Irving, TX）、

Kuhni USA（Mount Holly, NC）在內之製造商購得。一般而

言，管柱經設計以使蒸氣/液體接觸最大化，從而達成所

要效率。此係藉由用裝填材料或沿管柱以規則間隔隔開之

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塔盤填充管柱來達成。適合之裝填材料包括基於金屬、玻

璃、聚合物及陶瓷材料之無規類型與結構化類型。例示性

無規填料類型包括拉西環(Raschig ring)、巴耳環(Pall ring)、A-PAK 環、矩鞍環(Saddle ring)、Pro-Pak、Heli- Pak ' 陶 瓷矩鞍(Ceramic saddle)及 FLEXIRINGS®。結構化

填料包括絲網及多孔金屬板型材料。專供管柱填料之製造

商包括 ACS Separations & Mass-Transfer Pro ducts (Houston, TX)、Johnson Bros. Metal Forming Co.(Berkeley, IL)及

Koch Glitsch, Inc. Knight Div.(East Canton, OH)。氣提管

柱之效率係以管柱中之理論板高度及總板數表示。一般而

言，存在之理論板數愈多，管柱效率愈高。實驗室規模之

管柱可購 自 Ace Glass(Vineland, NJ)、Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)及 C hemglass(Vineland, NJ)。適合之玻璃管柱

類型包括韋氏(Vigreux)、史耐德(Snyder)、漢培爾

(Hempie)及多孔板型管柱。管柱可包括裝填材料5或含有

經設計以使蒸氣/液體接觸最大化之特徵。實驗室規模之

氣體洗滌器單元(部件號CG-1830-10)可購自Chemglass，且

由填料玻璃管柱、溶劑儲集器及溶劑再循環泵組成。

可由任何適合方式(例如使用回流冷凝器34及/或吸附系

統36，諸如二氧化矽吸附系統)進一步純化來自第二管柱

24之經純化異戊二烯組合物(例如在開口 26處退出)。回流

減少異戊二烯產物中之溶劑組成。可使貧異戊二烯溶液再

循環回第一管柱以供再使用(例如5如圖169中所示在開口

30處)。在再循環至第一管柱14之前可由任何適合方式(例

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如由液液萃取及/或吸附系統32，諸如二氧化矽吸附系統）

純化貧異戊二烯溶液以減少生物副產物之量。另外，在再

循環至第一管柱14之前（例如，在視情況純化異戊二烯溶

液之前、同時及/或之後）可由任何適合方式降低貧異戊二

烯溶液之溫度。圖169展示在純化貧異戊二烯溶液之前在

開口 40處降低貧異戊二烯溶液之溫度的實例（在此狀況

下，使用冷卻劑來降低溫度）。

包含大部分揮發性雜質之蒸氣（例如在圖1 69中開口 20處

退出之蒸氣）可包含小部分異戊二烯（例如未保留於富異戊

二烯溶液中之殘餘異戊二烯）。可由任何適合方式（例如吸

附系統38，諸如活性碳吸附系統）自包含大部分揮發性雜

質之蒸氣中再收集殘餘異戊二烯以供使用，且在一些狀況

下，如圖1 69中所示，可將殘餘異戊二烯與經純化異戊二

烯組合物合併（例如在額外純化（諸如類似於系統36之吸附

系統）之前、期間或之後）。圖169亦展示視情況選用之捕集

器件42（例如熱氧化器及/或CO?捕集系統），該捕集器件能

夠減少自蒸氣釋放至大氣中之不合需要之組分（CO2）的

量°

例示性異戊二烯化學轉化

儘管異戊二烯之當前工業用途主要在於製造合成橡膠 ，

但異戊二烯為反應性共瓶二烯且經歷多種化學轉化以形成

氧化物及較高分子量的煙°舉例而言，鈕（0）錯合物

（Pd（acac）2-Ph3P及Pd（OAc）2-Ph3P）催化異戊二烯於醇溶劑

中二聚及調聚以得到線性異戊二烯二聚體（例如2,7-二 甲

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基-1,3,7-辛三烯)及甲氧基二甲基辛二烯(Zakharkin, L. I.及

Babich, S. A. Russ. Chem. Bull. (1976)，第 1967-1968 頁)。

Adams, J. M.及 Clapp, Τ. N.(Clay and Clay Minerals (1986),

34(3), 287-294)報導異戊二烯於二價及三價過渡金屬交換

之蒙脫石(例如Cr3+蒙脫石)上反應得到異戊二烯二聚體及

與甲醇之加成物。由Ni(O)胺基亞麟酸酯系統催化異戊二烯

線性二聚得到區位選擇性尾-尾線性二聚體，伴隨競爭性

環二聚化反應(Denis, Philippe; Croizy, Jean Francois; Mortreux, Andre; Petit, Francis, Journal of Molecular

Catalysis (1991), 68(2), 159-75 ； Denis, Philippe; Jean, Andre; Croizy, Jean Francois; Mortreux, Andre; Petit, Francis, Journal of the American Chemical Society (1990), 112(3), 1292-4)。研究發現新型對掌性胺基亞麟酸酯配位

體(例如(+)-MeCH2CHMeCH(NH2)CH2OPPh2)為 異戊 二烯線

性二聚中之均相催化劑，使得轉化率高於50%(Masotti, Henriette; Peiffer, Gilbert; Siv, Chhan; Courbis, Pierre; Sergent, Michelle; Phan Tan Luu, Roger, Bulletin des

Societes Chimiques Beiges (1991), 100(1), 63-77)。

在二硝基甲酚作為聚合抑制劑存在下於110-250°C下使

異戊二烯熱二聚，得到高產率之二聚體及極少聚合物(美

國專利第4,973,787號)。Ni催化之異戊二烯二聚得到由80% 1,5-二甲基-1,5-環辛 二烯及20% 1,6-二甲基-1,5-環 辛二烯

組成之二甲基-1,5-環辛二烯混合物(D oppelt, Pascal; Baum, Thomas Η.; Ricard, Louis, Inorganic Chemistry (1996),

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35(5), 1286-91) ° 用催化量之C ρ*Κυ(η4-異戊二烯)Cl 及AgOTf使異戊二烯轉化成二甲基環辛二烯(Itoh, Kenji;Masuda, Katsuyuki; Fukahori, Takahiko; Nakano,Katsumasa; Aoki, Katsuyuki; Nagashima, Hideo,Organometallics (1994), 13(3), 1020-9)。JP59065026A (1984)報導藉由在包含綬酸鐵或0-二酮化合物、有機鋁或

有機鎂化合物及具有推電子基團之2,2匸聯毗咤衍生物之催

化劑存在下使異戊二烯環二聚化來製備1,6-二甲基-1,5-環

辛二烯。藉由使異戊二烯於含有綬酸鎳或阡酮、有機鋁或

有機鎂化合物及經取代之亞磷酸三苯酯之三組分催化劑上

環二聚化來製備二甲基環辛二烯(JP58055434A, 1983)。藉

由在100-300°C下，於惰性有機溶劑中，在含有Fe(3)鹽、

有機鋁化合物及活化劑之均相催化劑存在下(SU615056A1, 1978)，在含有乙醯基丙酮酸鎳、亞磷酸三芳基酯及全氫

鋁酚烯(perhydroalumophenolene)之均相催化劑存在下

(SU493455A1, 1975)，在含有殺酸鎳或殺酸鹽或鎳與1-舞

基-3-残基化合物之螯合化合物、三烷基鋁、二烷基鎂或獲

自共誕二烯與鎂之活性有機鎂化合物、亞磷酸三芳基酯及

三級胺之混合物的催化劑存在下(JP48064049A, 1973)，或

在由環烷酸鎳、Et3Al及磷酸三鄰甲苯酯構成之催化劑存

在下(Suga, K.; Watanabe, S.; Fujita, T.; Shimada, T., Israel

Journal of Chemistry (1972), 10(1), 15-18)，使異戊二烯環

二聚化來製備1,5-二甲基-1,5-環辛二烯。美國專利第

3,954,665 號揭 示在[(η3-C6H5)NiBr] 2或[M(NO)2X]2(M=Fe、

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Co ； X=C1、I ' Br）與辨基鐵、辨基錯或鼓基鎳之反應產物

存在下使異戊二烯二聚。歐洲專利第2411號（1981）揭示

在-5°C至+20°C下使異戊二烯於Fe（NO）2Cl-雙（1,5-環辛二

烯）鎳催化劑上環二聚化，得到1-甲基-4-異丙烯基-1-環己

烯與2-甲基-4-異 丙烯基-1-環己烯及1,4-二甲基-4-乙烯

基-1-環己烯與2,4-二甲基-4-乙烯基-1-環己烯。美國專利

第4,189,403號揭示藉由使異戊二烯與亞磷酸參（經取代煙

基）酯、亞碑酸參（經取代煙基）酯或亞銖酸參（經取代煙基）

酯及VIII族金屬（0）化合物（例如乙醯基丙酮酸鎳）之混合型

催化劑接觸來製備1,5-二甲基-1,5-環辛二烯及1,4-二甲

基-4-乙烯基-1-環 己烯。Jackstell, R.; Grotevendt, A.; Michalik, D.; El Firdoussi, L.; Beller, M. J. Organometallic

Chem. （2007） 692（21）, 4737-4744提及使用鈕/碳烯催化劑

使異戊二烯二聚。Bowen, L.; Charernsuk, Μ.; Wass, D.F. Chem. Commun. （2007） 2835-2837描述使用 雙（二芳基

麟基）胺鎔催化劑製造線性及環狀異戊二烯三聚體。

據報導，異戊二烯在Ni催化劑存在下二聚得到順-2-異

丙烯基-1-甲基乙烯基環丁烷（Billups, W. E.; Cross, J. Η.; Smith, C. V., Journal of the American Chemical Society

（1973）, 95（10）, 3438-9）。在多種亞磷酸酯作為電子供體存

在下由環烷酸鎳及異戊二烯鎂催化異戊二烯［78-79-5］寡

聚,得到含有二 甲基環辛二烯［39881-79-3］之環狀二聚

體；尤其在1,1,1-參（瓶甲基）丙烷亞磷酸酯［39865-19-5］存

在下選擇性地得到 三甲基環十二烷三烯［39881-80-6］（Suga,

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Kyoichi; Watanabe, Shoji; Fuj ita, Tsutomu; Shimada, Takashi, Journal of Applied Chemistry & Biotechnology

(1973), 23(2), 131-8) ° W02006/05 1 011 揭 示藉由在包含 Ni 及/或Ti、一或多種有機金屬化合物及VA族化合物之催化

劑系統存在下使異戊二烯三聚來製備適用於香水及芳香劑

之三甲基環十二烷三烯，且該反應係於含建基溶劑中進

行。Ligabue, R. A.; Dupont, J.; de Souza, R. F., Alegre, R.S. J. Mol. Cat. A: Chem. (2001), 169(1-2), 11-17描述在

離子液體中使用亞硝醯基鐵催化劑使異戊二烯選擇性二聚

成六員二聚體。Huchette, D.; Nicole, J.; Petit, F., Tetrahedron Letters (1979), (12), 1035-8描述以電化學方式

產生亞硝醯基鐵催化劑，隨後用於使異戊二烯二聚成環己

烯二聚體。Zakharkin, L. I.; Zhigareva, G. G.; Pryanishnikov, A. P. Zhurnal Obshchei Khimii (1987), 57( 1 1), 25 51-6描述

異戊二烯於錯合鎳及鐵催化劑上環化寡聚。

使用所引用之參考文獻中揭示之各催化劑系統及反應條

件使本文所述之高純度異戊二烯起始組合物發生化學轉

化。熟習此項技術者可使此項技術中已知之其他催化劑及

反應條件，諸如應用於1,3-丁二烯化學轉化之催化劑及反

應條件適於異戊二烯起始組合物。

在一些實施例中，工業上有益量之高純度異戊二烯起始

物質經歷催化化學轉化，得到二聚體及三聚體。使用此項

技術中已知之方法鑑別催化劑系統。較佳催化劑包括已知

以高效率使異戊二烯轉化成二聚體及三聚體之催化劑。實

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例包括基於鈕、鎳、鈕、鐵及銘■之催化劑。

在一些實施例中，工業上有益量之高純度異戊二烯起始

物質進行熱二聚或催化二聚。藉由在壓力下加熱異戊二烯

起始組合物而使該起始組合物轉化成包括不飽和6員及8員

環之二聚體混合物。在一些實施例中，在壓力下將起始異

戊二烯組合物加熱至高於或約100、125、150、175、

200、225或250°C。在一些實施例中，在抗氧化劑(例如

2,6-二-第三丁基-4-甲基苯酚)存在下加熱起始異戊二烯組

合物以防止自由基介導之聚合。在一些實施例中，由一或

多種選自此項技術中已知用於催化異戊二烯環二聚化之催

化劑的催化劑加速反應'例如美國專利4,144,278 ' 4,181,707、5,545,789及歐洲專利EP0397266A2中所述之亞

硝醯基鹵化鐵催化劑。Ligabue等人(2001) J. Mol.

Catalysis A: Chemical, 169 (2), 11-17 描述於離子液體中使

用亞硝醯基鐵催化劑。催化劑之實例包括(但不限

於)Fe(NO)2Cl2及CH* 蒙脫石。在另一實例中，使用釘催化

劑使異戊二 烯起始 組合物轉化成C 1 0環狀 二聚體(例如二甲

基-環辛二烯之混合物)(Itoh, Kenj i; Masuda, Katsuyuki; Fukahori, Takahiko; Nakano, Katsumasa; Aoki, Katsuyuki; Nagashima, Hideo, Or ganomet allies (1994), 13(3), 1020- 9)。

在一特定實施例中，在壓力下及在抗氧化劑存在下將呈

液態之異戊二烯起始組合物加熱至高於100°C以製造包括

以下6員及8員環之二聚體混合物：例如檸檬烯(1-甲基-4-

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（丙-1·■烯-2-基）環己-1-烯）、1-甲基-5-（丙-1-烯-2-基）環

己-1-烯、1,4-二甲基-4-乙烯基環己烯、2,4-二甲基-4-乙烯

基環己烯、1,5-二甲基環辛-1,5-二烯、1,6-二甲基環

辛-1,5-二烯、2,6-二甲基-1,3-環辛二烯、2,6-二甲基-1,4- 環辛二烯、3,7-二甲基-1,5-環辛二烯、3,7-二甲基-1,3-環

辛二烯、3,6-二甲基-1,3 -環辛二烯，及如 Or ganomet allies

（1994）, 13（3）, 1020-9中所述之其他8員環異戊二烯二聚

體。涵蓋此等化合物之所有立體異構體。最佳在不存在氧

氣下使異戊二烯轉化成二聚體以避免製造不合需要之反應

產物。

在一些實施例中5工業上有益量之高純度異戊二烯起始

物質進行光二聚，得到4員環二聚體。藉由光照射使異戊

二烯起始組合物轉化成包含以下一或多者之混合物：1,2- 二（丙-1-烯-2-基）環丁烷、1,3-二（丙-1-烯-2-基）環丁烷、1- 甲基-1-乙烯基-3-（丙-1-烯-2-基）環丁烷、1-甲基-1-乙烯

基-2-（丙-1-烯-2-基）環丁烷、1,3-二甲基-1,3-二乙烯基環丁

烷、1,2-二甲基-1,2-二乙烯基環丁烷及其立體異構體。在

一些實施例中5在催化劑（例如鎳催化劑）或光敏劑（例如苯

甲酮）存在下使高純度異戊二烯起始物質二聚，得到4員環

二聚體，例如順-2-異丙烯基-1-甲基乙烯基環丁烷，以及6 員及 8 員 環[參見：Hammond, J.S.; Turro, N.J.; Liu, R.S.H. （1963） 「Mechanisms of Photochemical Reactions inSolution j ° XVI. Photosensitized Dimerization of Conjugated Dienes. J. Org. Chem., 28, 3297-3303] °

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在一些實施例中，在催化劑系統存在下使工業上有益量

之高純度異戊二烯起始物質轉化成環狀三聚體。在一些實

施例中，環狀三聚體為三甲基環十二烷三烯。在一些實施

例中，催化劑系統包含鎳催化劑。在一些實施例中，催化

劑系統包含錄化合物。在一些實施例中，催化劑系統包含

鎳催化劑及鉢化合物。在一些實施例 中，催化劑系統包含

一或多種有機金屬化合物、及VA族化合物。在一些實施

例中，於含無基溶劑中進行催化轉化。在一特定實施例

中，在包含Ni及/或Ti、一或多種有機金屬化合物、及VA 族化合物之催化劑系統存在下使起始 異戊二烯組合物轉化

成三甲基環十二烷三烯，且該反應係於含舞基溶劑中進

行。

在一些實施例中，工業上有益量之高純度異戊二烯起始

物質藉由用C2至C5不飽和煙處理而熱轉化或催化轉化成

C7至C14範圍內之煌。C2至C5煙可為烯煙、二烯或烘煙。

舉例而言，在一些實施例中，使異戊二烯與乙烯及適當催

化劑接觸以製造C7化合物。在另一實施例中，使異戊二烯

與1,3-T二烯接觸以形成環狀C9煙。氫化此等C7至C14煙

會得到適合用作噴射機燃料及其他航空燃料之組合物。在

另一實施例中，源自異戊二烯及一或多種不飽和煙之不飽

和C7至C1 4煙經歷脫氫以形成適合用作噴射機燃料及其他

航空燃料或用作該等燃料之摻合原料的芳族衍生物。

在一些實施例中，於醇溶劑中使用催化劑系統使工業上

有益量之高純度異戊二烯起始物質轉化成線性二聚體及三

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聚體之混合物。此反應當在甲醇或乙醇中進行時亦製造烷

氧基衍生物。在一些實施例中5催化劑系統為鈕基催化劑

系統，例如乙醯基丙酮酸鈕-三苯基麟系統或乙酸鈕-三苯

基麟系統。在一些實施例中，醇溶劑為甲醇、乙醇或異丙

醇。產物性質視所用催化劑及溶劑而定。舉例而言'當在

異丙醇溶劑中使用鈕基催化劑系統（例如Pd（acac）2-Ph3P或

Pd（OAc）2-Ph3P）時，形成線性異戊二烯二聚體，例如2,7- 二甲基-1,3,7-辛三烯及2,7-二甲基-2,4,6-辛三烯。當在甲

醇中進行此反應時5除線性異戊二烯二聚體（諸如二甲基

辛三烯）以外，亦形成甲氧基二甲基辛二烯（例如1-甲氧

基-2,7-二甲基-2,7-辛二烯及3-甲氧基-2,7-二甲基-1,7-辛二

烯）。一些反應製造線性異戊二烯三聚體，諸如α-法呢烯

（α-farnesene，3,7,11-三甲基-1,3,6,10-十 二烷四怖）、［3 -法

呢烯（7,11-二甲基-3-亞甲基-1,6,10-十二烷三烯）及其他位

置異構體（例如5來自異戊二烯單元之尾-尾及頭-頭加

成）。在另一實例中，使用Ν,Μ雙（二芳基麟基）胺鎔催化劑

使異戊二烯轉化成線性及環狀C15三聚體（Bowen, L.; Charernsuk, M.; Wass, D.F. Chem. Commun. （2007） 2835- 2837）。

在一些實施例中，工業上有益量之高純度異■戊二烯起始

物質藉由在酸催化劑存在下與乙醇及其他醇反應而轉化成

燃料氧化物。在一實施例中5酸·催化劑為硫酸。在另一實

施例 中，酸催化劑為固相硫酸（例如Dowex Marathon®） ° 其他催化劑包括液相與固相氟磺酸，例如三氟甲烷磺酸及

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Nafion-H（DuPont）。在類似於 Hensel 等人［Hensen, K.; Mahaim, C.; Holderich, W.F., Applied Catalysis A: General

（1997） 140（2）, 31 1-329］所述之條件下，亦可使用沸石催化

劑（例如0-沸石）進行檸檬烯及相關單務之甲氧基化。在一

些實施例中，由無基化/酯化過程或此項技術中之其他已

知烯煙反應使高純度異戊二烯起始物質轉化成醇及酯，例

如用諸如過乙酸及3-氯過苯甲酸之過酸進行過氧化以得到

環氧化物；及用i）水與酸催化劑及ii）硼氫化方法進行水合

以得到醇及二醇。該等反應描述於例如Michael B. Smith 及 Jerry March, Advanced Organic Chemistry: Reactions,

Mechanisms, and Structure，第 6版，John Wiley & Sons, 2007中。圖3及圖4展示可自起始異戊二烯組合物製造之醇

及氧化物之實例。

在一些實施例中，使工業上有益量之高純度異戊二烯起

始物質部分地氫化成單烯煙（例如2-甲基丁-1-烯、3-甲基-

T -1-烯及2-甲基丁-2-烯）。在一些實施例中，使用傳統煙

陽離子催化（諸如用於使異丁烯轉化成異辛烷）使單烯煙進

行二聚或與其他烯煙反應。參見，例如H.M. Lybarger. Isoprene in Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical

Technology，第 4 版，Wiley, New York （1995）, 14, 934- 952。在一些較佳實施例中，高純度異戊二烯起始物質為

生物異戊二烯組合物。

在一些實施例中，工業上有益量之高純度異戊二烯起始

物質進行部分氫化以形成單烯煙（例如2-甲基丁 -1-烯、3-

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甲基-丁-1-烯及2-甲基丁 -2-烯)。在一些較佳實施例中，高

純度異戊二烯起始物質為生物異戊二烯組合物。在一些實

施例中，異戊二烯起始物質之部分亂化製造高產率之單烯

煙，而極少轉化成異戊烷且殘餘異戊二烯含量較低。在一

些實施例中，製造單烯煙與異戊烷之混合物，其中殘餘異

戊二烯含量較低。在一些實施例中，部分氫化為選擇性氫

化，其中優先製造特定單烯煙，諸如2-甲基丁-2-烯、2-甲

基丁 -i_烯或3-甲基丁 -1-烯。較佳氫化催化劑提供高催化

活性，隨著時間推移維持催化活性，且對異戊二烯轉化成

單烯煙具有高選擇性。

適用於異戊二烯起始組合物之部分氫化之催化劑可含有

噬白族金屬‘諸如鎚、筐巴 ' 鈍或釘；或過渡金屬'諸如鎳、

盆古、銅、鐵、雀目；或貴金屬，諸如銀或金，呈單質形式、

或與有機及無機配位體形成之鹽或錯合物形式。在一些情

況下，亦可使用此等金屬之合金。此等金屬及其衍生物可

為純的或與其他活性及惰性物質混合。可使催化劑吸附於

支撐材料(諸如活性碳、氧化鋁或二氧化矽)以使有效表面

積最大化。已知氫化催化劑之實體形態對其效能具有顯著

影響。較佳氫化催化劑包括異相鈕催化劑，諸如鈕/碳

(Pd/C)、鈕/氧化鋁(Pd/Al2O3)或鈕/二氧化矽(Pd/SiO2)，相

對於支撐材料之等級範圍為0.1% Pd至20% Pd(w/w) °適合

之選擇性氫化催化劑之一實例為LD 2773，一種耐硫、促

進型鈕 / 氧化鋁(Axens, Rueil-Malmaison Cedex, France) ° 允許異戊二烯轉化成異戊烯，而極少轉化成異戊烷之部分

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氫化催化劑 包括林德拉催化劑（Lindlar catalyst）（經喳嚇處

理之Pd/BaSO4）、經笫15族元素（Ν、P、As）之三苯基衍生

物處理之Pd/C、經含硫化合物處理之Pd/C、硫化銅、及

Pd/Fe合金。一種較佳催化劑包含鈕吸附於蛋殼型氧化鋁

（δ-Α12Ο3）。在精煉工業中用於自熱解汽油中移除二烯煙及

烘煙之催化劑為尤其較佳的，例如基於Ni/Al2O3及

Pd/Al2O3之催化劑。用於異戊二烯轉化成異戊烯之另一適

合類別之催化劑為工業中用於氫化處理熱解汽油之催化

劑。參見，例如美國專利第7,014,750號及第6,9949,686號

及其中所引用之參考文獻。一般而言，用於熱解氣體氫化

處理之催化劑允許换煙及二烯煙（例如異戊二烯及間戊二

稀）選擇性轉化成單烯煙。

氫源可為氫氣，或包括（但不限於）氫氣（H2）、甲酸、朋·

或異丙醇之氫源。氫源可以化學或生物方式得到。在一些

實施例中，用於氫化之氫氣係在醱酵期間與異戊二烯共同

製造。氫 化可在0.5 atm至200 atm之範 圍內或200 atm以 上

之氫壓下進行。溫度可在0°C至200°C之範圍內。

預期來自生物異戊二烯組合物的部分氫化之產物含有最

初存在於起始異戊二烯組合物中之某些雜質及/或該等雜

質之氫化衍生物，諸如丙酮、乙醇、戊醇、乙酸乙酯、乙

酸異戊酯、甲基乙基酮及其他飽和極性雜質。

在一些實施例中，異戊二烯起始組合物在鈕催化劑存在

下進行部分氫化或選擇性氫化。舉例而言，諸如

Pd/CaCO3、Pd/BaSO4、Pd/C、鈕黑、Pd/SiO3、Pd/Al2O3 或

149050.doc -205-

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Pd/SiO2之鈕催化劑顯示使異戊二烯以相 比完全還原之C5 烷煙高於95%之選擇性轉化成單烯經。使用此等鈕催化劑

得到單烯煙產物之混合物，其中5% Pd/CaCO3對3-甲基

Τ-l-烯具有最高選擇性且5% Pd/SiO2對2-甲基丁 -2-烯具有

最高選擇性（參見G.C. Bond 及 A.F. Rawle. J. Mol. Catalysis

A: Chemical 1 09 （1996） 261-271） ° Bond 及 Rawle 亦 已顯示

鈕-金及鈕-銀催化劑（例如Pd-Au/SiCh及Pd-Ag/SiCh）對異戊

二烯還原成單烯煙相比完全還原之C5烷煙具有高選擇性。

在一些實施例中，已使用二氧化矽支撐型聚醯胺基胺

（PAMAM）樹枝狀聚合物-鈕錯合物選擇性催化環狀及非環

狀二烯還原成單烯煙異構體之混合物。對各種單烯煙異構

體之選擇性視催化劑中所用之確切PAMAM配位體而定（參

見 P.P. Zweni及 H. Alper. Adv. Synth. Catal. 348 （2006） 725- 731）。在一些實施例中，可使用無機支撐物（例如金屬沸

石）上之VIB族金屬作為催化劑使異戊二烯還原成單烯煙 。

舉例而言，使用Mo/A12O3催化劑使1,3-T二烯選擇性還原

成各別單烯煙（參見US 6,235,954 Β1）。在某一實施例中，

可使用由IB、VIB、VIIB族金屬 或鋅促進之VIII族金屬催

化劑使異戊二烯還原成單烯煙以減少催化劑中毒（參見US 6,949,686 B2）。在一些實施例中，可使用可呈蜂巢組態之

整體式催化劑床使異戊二烯還原成單烯煙。整體式催化劑

床之催化劑支撐材料可包括金屬，諸如鎳、鎖、鈕、鎧、

釘、銀、鐵、銅、钻、銘·、鉉、錫'及其合金或混合物

（參見US 7,014,750 B2）。在一些實施例中，可使用 蛋殼型

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Pd/5-Al2O3催化劑使異戊二烯還原成單烯煙，尤其在反應

不含水之情況下。蛋殼型Ρά/δ-Α12Ο3催化劑對單烯煙相比

完全還原之烷煙具選擇性，且2-甲基丁-2-烯為熱力學上有

利之異構體（參見 J.-R. Chang 及 C.-H. Cheng. Ind. Eng.

Chem. Res. 36 （1997） 4094-4099）。

可容易地使用酸催化劑使輕質烯煙（C3-C6）二聚，得到

高碳烯煙（C6-C 1 2，亦稱為二聚烯）。舉例而言，此項技術

中充分描述使用多種酸催化劑使異丁烯（2-甲基丙烯）轉化

成異辛烯，該等酸催化劑包括硫酸、磷酸及其他無機酸、

磺酸、氟磺酸、沸石及酸性黏土。

在一些實施例中，異戊二烯起始組合物進行部分氫化或

選擇性氫化以形成單烯煙，且單烯煙使用傳統煙陽離子催

化（諸如用於使異丁烯轉化成異辛烷），例如硫酸、磷酸及

其他無機酸、磺酸、氟磺酸、沸石及酸性黏土進行二聚或

與其他烯煙反應。參見，例如H.M. Lybarger. Isoprene in Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology，第 4 版，Wiley, New York （1995）, 14, 934-952。在一些較佳實

施例中，高純度異戊二烯起始物質為生物異戊二烯組合

物。可使用呈液體與固體形式之酸催化劑。酸樹脂為較佳

的且包括 Amberlyst 15、Amberlyst 35、Amberlyst XE586 ' Amberlyst XN101 0（Rohm and Haas）及類似酸性離

子交換樹脂。酸性分子篩亦為較佳催化劑，包括中孔酸分

子篩，諸如 ZSM-5、鎂鹼沸石（ferrierite）、ZSM-22及 ZSM- 23。

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在一些實施例中，異戊二烯起始組合物進行部分氫化或

選擇性氫化以形成異戊烯。在一些實施例中，使異戊烯二

聚化以得到C10二聚烯，諸如異癸烯。在一些實施例中，

使異戊烯與諸如丙烯、丁烷或異丁烯之烯煙二聚化以得到

C8-C10二聚烯。在一些實施例中，使用樹脂催化劑(例如

Amberlyst、Amberlyst 35、Amberlyst 15、Amberlyst XN1010、Amberlyst XE586)使單烯煙進行二聚化以製造二

異戊烯。已顯示使用該等樹脂催化劑使裂化及其他寡聚反

應減至最少，且在最佳條件下，樹脂催化劑對二聚體之選

擇性高於92%，而對形成三聚體之選擇性低於8%。參見，

例如 M. Marchionna 等人 Catalysis Today 65 (2001) 3 97- 403。在一些實施例中，使用含有酸性中孔分子篩，諸如

嵌入沸石 結構ZSM-5、鎂鹼沸石、ZSM-22或ZSM-23中 之

中孔篩之催化物質使單烯煙進行二聚。在一特定實施例

中，催化物質在高溫(例如至少900°C )下熱穩定。在另一特

定實施例中，單烯燈實質上不含多元不飽和煙，諸如異戊

二烯。使用含有酸性中孔分子篩之催化物質進行二聚可使

得對二聚體之選擇性超過80%。參見，例如US 2007/0191662 A1。在一些實施例中，使用固體酸性催化

劑(例如固體磷酸催化劑、酸性離子交換樹脂)使單烯煙進

行二聚。使用固體磷酸催化劑時對二聚體之選擇性可為至

少75%、至少85%或至少90%。參見，例如US 2009/0099400 A1 及 US 6,660,898 B1。

有效二聚有時可需要在原料流中存在極性組分，諸如水

149050.doc -208-

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及氧化化合物。實例包括醇，諸如甲醇、乙醇及第三丁

醇；醍，諸如甲基第三丁基醍(MTBE)及甲基第三戊基醸

(TAME)；或酯，諸如C 1至C5乙酸酯。在一些實施例中，

可藉由在酸.催化劑存在下用醇處理而使異戊烯轉化成酰，

諸如TAME。

在一些實施例中，可使本文所述之任何方法所製造之單

烯煙的C10二聚體還原成完全飽和之C10烷基化物(例如藉

由氫化)。在一特定實施例中，可使用催化劑使異戊二烯

或單烯煙還原成烷基化物，該催化劑含有以下兩者之混合

物：酸組分，諸如硫酸、氟磺酸、全鹵烷基磺酸、離子液

體1或布朗斯特酸(Bronsted acid)與路易斯酸(Lewis acid) 之混合物；聚合物組分，諸如聚丙烯酸酯(參見US 2010/0094072 A1)。

在一些實施例中，工業上有益量之高純度異戊二烯起始

物質在酸催化劑存在下進行寡聚以製造二聚體、三聚體、

高碳寡聚物、芳族產物及/或聚合產物。反應之動態控制

可有利於某些產物，例如低碳寡聚物，但結膠及焦化為已

知導致催化劑失活之問題。

例示性不飽和異戊二烯衍生物

在一些實施例中，自異戊二烯製造燃料成分之組合物及

系統進一步包含用於異戊二烯起始組合物化學轉化成燃料

成分之不飽和煙或氧化物中間物。在某一實施例中，不飽

和煙中間物包含一或多種選自由以下組成之群的不飽和異

戊二烯二聚體：1,2-二(丙-1-烯-2-基)環丁烷、1,3-二(丙-1-

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烯-2-基）環丁烷、1-甲基-1-乙烯基-3-（丙-1-烯-2-基）環丁

烷、1-甲基-1-乙烯基-2-（丙-1-烯-2-基）環丁烷、1,3-二甲

基-1,3亠4乙烯基環丁烷、1,2-二甲基-1,2-二乙烯基環丁

烷、1-甲基-4-（丙-1-烯-2-基）環己-1-烯、1-甲基-5-（丙-1- 烯-2-基）環己-1-烯、1,4-二甲基-4-乙烯基環己烯、2,4-二

甲基-4-乙烯基環己烯、1,5-二甲基環辛-1,5-二烯、1,6-二

甲基環辛-1,5-二烯、1,4-二甲基-4-乙烯基-1-環己烯、2,4-

二甲基-4-乙烯基-1-環己烯、2,7-二甲基-1,3,7-辛三烯、

2,7-二甲基-2,4,6-辛三烯、2,6-二甲基-1,3-環辛二烯、2,6-

二甲基-1,4-環辛二烯、3,7-二甲基-1,5-環辛二烯、3,7-二

甲基-1,3-環辛二烯及3,6-二甲基-1,3-環辛二烯。在一些實

施例中，不飽和煙中間物包含一或多種不飽和三聚體5諸

如a-法呢烯、0-法呢烯、三甲基環十二烷三烯（例如1,5,9- 三甲基-（\E,5E,9E）-環十二烷三烯及其位置異構體及幾何

異構體）及三甲基十二烷四烯及其類似物。在一些實施例

中，不飽和氧化物中間物包含一或多種不飽和甲基醵，諸

如1-甲氧基-2,7-二甲基-2,7-辛二烯及3-甲氧基-2,7-二甲

基-1,7-辛二烯及其類似物。在一些實施例中，不飽和氧化

物中間物包含一或多種不飽和乙基讎，諸如乙基3-甲基-3- 丁烯基酰、乙基1,1-二甲基-2-丙烯基酰、乙基1,2-二甲

基-2-丙烯基醒、乙基2-甲基-3-丁烯基醍及其類似物。在

一些實施例中1不飽和氧化物中間物包含一或多種不飽和

醇，諸如3-甲基-3-丁烯-1-醇、2-甲基-3-丁烯-2-醇、3-甲

基-3-丁烯-2-醇、2-甲基-3-丁烯-1-醇及其類似物。在一些

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實施例中，不飽和氧化物中間物包含一或多種不飽和酯 ，

諸如乙酸3-甲基-3-丁烯-1-基酯、乙酸2-甲基-3-丁烯-2-基

酯、乙酸3-甲基-3·•丁烯-2-基酯、乙酸2-甲基-3-丁烯-1-基

酯及其他C3-C18脂族護酸酯。在某一實施例中，不飽和煙

中間物包含一或多種異戊烯，例如2-甲基丁 -1-烯、3-甲

基-丁 -1-烯及2-甲基丁 -2-烯。在一些實施例中，不飽和煙

中間物包含一或多種源自異戊烯的二聚化之二異戊烯。

流程I.例示性不飽和6員及8員環中間物

1-甲基·4-（丙-1- 烯-2-基）環己-1-烯

1-甲基-5-（丙-1- 烯-2-基）環己-1-烯

1,4-二甲基-4-乙烯基環己烯

2,4-二甲基-4- 乙烯基環己烯

1,5-二甲基環辛

-1,5-二烯

1,6-二甲基環辛

-1,5-二烯

3,6-二甲基-

1,3-環辛二烯

149050.doc -211 -

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流程Η.例示性不飽和4員環中間物

1-甲基-3-（丙-1-烯-2-基）

-1-乙烯基環丁烷

1-甲基-2-（丙-1-烯-2-基）

-1-乙烯基環丁烷

1,3-二甲基-1,3- 二乙烯基環丁烷

1,2-二甲基-1,2- 二乙烯基環丁烷

1,2-二（丙-1-烯-2-基）

環丁烷

1,3-二（丙-1-烯-2-基）

環丁烷

\

\

\

流程III.例示性不飽和異戊二烯調聚物及氧化物中間物

2,7-二甲基辛-1,3,7-三烯 2,7-二甲基辛-2,4,6-三烯 3,7,11-三甲基十二烷-1,3,7,11-四烯

3,7,11-三甲基十二烷-1,3,6,10-四烯 7,11-—甲基-3-亞甲基十二烷-1,6,10-三烯

8-甲氧基-2,7-二甲基辛-1,6-二烯 3-甲氧基-2,7-二甲基辛-1,7-二烯

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流程iv.例示性不飽和乙基醍中間物

乙基1,2-二甲基-2-丙烯基髄

乙基1,1-二甲基-2-丙烯基醸

乙基2-甲基-3-丁烯基酰

流程V.例示性不飽和醇中間物

3-甲基-3-丁烯-1-醇 2-甲基-3-丁烯-2-醇 2-甲基-3-丁烯-1-醇

流程VI.例示性不飽和酯中間物

乙酸3-甲基-3-丁烯-1·•基酯

OAc

乙酸2-甲基-3-丁烯-2-基酯

AcO

乙酸3-甲基-3-丁烯-2-基酯 乙酸2-甲基-3-丁烯-1-基酯

例示性氫化不飽和中間物

在氫化催化劑存在下對不飽和異戊二烯衍生物進行氫化

以製造飽和化合物。對飽和化合物進行表徴且評估其作為

149050.doc -213 ・

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燃料之價值。在一些實施例中，供氫化用之氫源為氫氣。

在一些實施例中，氫氣係與生物異戊二烯共同製造，如

2008年12月30日申請之美國臨時專利申請案第61/141,652 號、及US 2009/0203102 A1中所述。在一些實施例中，氫

化催化劑為鈕基催化劑，諸如Pd/C（例如5%（重量）Pd/C）。

在一些實施例中'氫化催化劑為阮尼鎳（Raney Nickel）催

化劑。在一些實施例中，氫化催化劑為均相催化劑，諸如

釘基或錢基均相氫化催化劑。在一些實施例中，氫化不飽

和異戊二烯二聚體及三聚體以製造適用於製造燃料之飽和

C1 0及C1 5煙。在一些實施例中，氫化不飽和環狀二聚體

以製造飽和環狀C10煙，諸如1,2-雙（異丙基）環丁烷、1,2- 雙（異丙基）環丁烷、1-甲基-4-異丙基環己烷、1-甲基-3-異

丙基環己烷、1-乙基-1,4-二甲基環己烷、1-乙基-1,3-二甲

基環己烷、1,5-二甲基環辛烷及1,4-二甲基環辛烷。在一

些實施例中，氫化不飽和環狀三聚體以製造飽和環狀C 1 5 煙，諸如1,5,9-三甲基環十二烷及1,5,10-三甲基環十二烷

（參見流程VII）。在一些實施例中，氫化不飽和線性二聚體

以製造飽和脂族C10煙，諸如2,6-二甲基辛烷、2,7-二甲基

辛烷及3,6-二甲基辛烷。在一些實施例中，氫化不飽和線

性三聚體以製造飽和脂族C15煙，諸如2,6,10-三甲基十二

烷、2,7,10-三甲基十二烷及3,7,10-三甲基十二烷（參見流

程VIII）。在一些實施例中，使異戊烯之二聚產物（癸烯或

C10二聚烯）完全氫化成異烷煙（例如2,3,4,4-四甲基己烷、

2,2,3,4-四甲基己烷、2,3,3,4-四甲基己烷及3,3,5-三甲基庚

149050.doc -214-

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烷）（參見流程Villa）。在一些實施例中，氫化工業上有益

量之高純度異戊二烯起始組合物以製造包含2-甲基丁烷之

產物。在一些實施例中，氫化不飽和異戊二烯羟基化物以

製造飽和整基化物，諸如C5醇及二醇（例如3-甲基-丁-1- 醇、2-甲基-Τ -1-醇及2-甲基-丁-2-醇、3-甲基-丁-1,3-二醇

及2-甲基-丁 -2,3-二醇）、C-10醇及二醇（例如3,7-二甲基

辛-1-醇、2,7••二甲基辛-1-醇、2,7-二甲基辛-2-醇及2,7-二

甲基辛-2,7-二醇）及環狀C-10醇（例如2-（4-甲基環己基）

丙-2-醇、2-（4-甲基環 己基）丙-1-醇、2-（1,4-二甲基環己基）

乙醇及4-乙基-1,4-二甲基環己醇）（參見流程IX）。在一些實

施例中，氫化不飽和異戊二烯氧化物以製造飽和醵，諸如

1,3-二乙氧基-3-甲基丁烷、1-乙氧基-3-甲基丁烷、1-甲氧

基-2,7-二甲基辛烷及3-甲氧基-2,7-二甲基辛烷（參見流程

X）。應瞭解，當氫化烯煙部分時，製造一或多種立體異構

體。立體異構體之間的相對比率視所用反應條件及催化劑

而定。適用時，各個及每一立體異構體均欲為本文所述之

飽和煙及氧化物。

流程VII.源自異戊二烯之環煙之實例

來自2+2光二聚之雙

（異丙基）環丁烷

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來自熱環化二聚或催化環化二聚之環己烷

來自熱環化二聚或催化環化二聚之1,5-二甲基環辛烷及1,6-二甲基環辛烷

來自異戊二烯環化三聚之1,5,9-三甲基環十二烷及1,5,10-三甲基環十二烷

149050.doc -216-

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流程VIII.源自異戊二烯之脂族煙之實例

2-甲基丁烷 2,6,10-三甲基十二烷（法呢烷）

2,7-二甲基辛烷

3,6-二甲基辛烷

3,7,10-三甲基十二烷

流程Villa.源自異戊烯之異癸烷之實例

2,3,4,4-四甲基己烷 2,2,3,4-四甲基己烷 2,3,3,4-四甲基己烷 3,3,5-三甲基庚烷

149050.doc -217-

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流程IX.源自異戊二烯之IsoFuel™醇之實例

流程X.源自異戊二烯之IsoFuel™氧化物之實例

3-甲基四氫咲喃 3-甲基-2-丁酮 乙酸異戊酯

149050.doc -218-

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異戊二烯與乙醇之反應產物（參見S.Reyer之附加陳述）

甲醇溶劑中Pd催化之異戊二烯調聚所製造之烷氧基衍生物

（參見 Zakharkin （1976））

在某一實施例中，藉由使工業上有益量之高純度異戊二

烯起始組合物發生化學轉化而製造之燃料成分包含飽和異

戊二烯衍生物。在一些實施例中，燃料成分包含源自異戊

二烯之飽和C10及C15煙。在一些實施例中，燃料成分包

含一或多種選自由以下組成之群的飽和環狀C10煙：1,2-

雙（異丙基）環丁烷、1,2-雙（異丙基）環丁烷、1-甲基-4-異丙

• 基環己烷、1-甲基-3-異丙基環己烷、1-乙基-1,4-二甲基環

己烷、1-乙基-1,3-二甲基環己烷、1,5-二甲基環辛烷及1,4- 二甲基環辛烷。在一些實施例中，燃料成分包含一或多種

選自由以下組成之群的飽和環狀C15煙：1,5,9-三甲基環十

二烷及1,5,10-三甲基環十二烷。在一些實施例中，燃料成

分包含一或多種選自由以下組成之群的飽和脂族C10煙：

2,6-二甲基辛烷、2,7-二甲基辛烷及3,6-二甲基辛烷。在一

些實施例中 > 燃料成分包含一或多種選自由以下組成之群

的飽和脂族C15煙：2,6,10-三甲基十二烷、2,7,10-三甲基

149050.doc -219-

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十二烷及3,7,10-三甲基十二烷。在一些實施例中’燃料成

分包含2-甲基丁烷。在一些實施例中5燃料成分包含一或

多種選自由以下組成之群的異烷煙：2,3,4,4-四甲基己

烷、2,2,3,4-四甲基己烷、2,3,3,4-四甲基己烷及3,3,5-三甲

基庚烷。在一些實施例中，燃料成分包含一或多種選自由

以下組成之群的飽和舞·基化物:3-甲基-Τ -1-醇、2-甲基-

T -1-醇及2-甲基-丁-2-醇、3-甲基-丁 -1,3-二醇、2-甲基-

丁 -2,3-二醇、3,7-二甲基辛-1-醇、2,7-二甲基辛-1-醇、

2,7-二甲基辛-2-醇、2,7-二甲基辛-2,7-二醇、2-（4-甲基環

己基）丙-2-醇、2-（4-甲基環己基）丙-1-醇、2-（1,4-二甲基環

己基）乙醇及4-乙基-1,4-二甲基環己醇。在一些實施例

中5燃料成分包含一或多種選自由以下組成之群的飽和

酰:1,3-二乙氧基-3-甲基丁烷、1-乙氧基-3-甲基丁烷、1 - 甲氧基-2,7-二甲基辛烷及3 -甲氧基-2,7-二甲基辛垸。在一

些實施例中5燃料成分包含一或多種選自由以下組成之群

的異戊二烯氧化物：3 -甲基四氫咲喃、3 -甲基-2-丁酮及乙

酸異戊酯。

在一些實施例中，自異戊二烯製造燃料成分之組合物及

系統進一步包含催化異戊二烯起始組合物化學轉化成燃料

成分或用於製造燃料成分之中間物的催化劑°在一些實施

例中，自異戊二烯製造燃料成分之組合物及系統進一步包

含催化不飽和中間物氫化以製造飽和燃料成分之催化劑°

在一些實施例中，催化劑為所述之任何催化劑，或本文所

述之一或多種催化劑之組合。

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製造燃料之方法及/或製程

本發明提供自異戊二烯製造燃料成分之方法及/或製

程，其包含：(a)獲得工業上有益量之高純度異戊二烯；及

(b)使該工業上有益量之高純度異戊二烯之至少一部分化學

轉化成燃料成分。在一實施例中，在連續化學過程中使高

純度異戊二烯組合物轉化成燃料組分。在另一實施例中，

在化學轉化成燃料組合物之前進一步純化高純度異戊二

烯。在另一實施例中，使高純度異戊二烯化學轉化成中間

組合物；該中間組合物經歷進一步化學轉化以製造燃料或

燃料組分。在另一實施例中，將所製造之燃料組分與石油

餾出物及其他視情況選用之添加劑混合以製成燃料。在一

些較佳實施例中，高純度異戊二烯為生物異戊二烯組合

物。

在一些實施例中，自異戊二烯製造燃料成分之方法包含

獲得工業上有益量之高純度異戊二烯組合物。在一些實施

例中，適用於本發明之高純度異戊二烯組合物包含大於或

約 2 ' 5 ' 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、

200、300、400、500、600、700、800、900< 1000 mg之

異戊二烯。在一些實施例中，高純度異戊二烯組合物包含

大於或約2、5 > 10 ' 20 ' 30 ' 40、50、60 ' 70、80、90 ' 100 g之異戊二烯。在一些實施例中，起始異戊二烯組合

物包含大於或約 0.2 ' 0.5 ' 1、2 ' 5 ' 10 ' 20、50、100、

200、5 00、1000 kg之異戊二烯。

在一些實施例中，自異戊二烯製造燃料成分之方法包含

149050.doc -221 -

1434921

獲得工業上有益量之高純度異戊二烯組合物。在一些實施

例中，以起始組合物中所有C 5焼之總重量計，高純度異戊

二烯起始組合物包含大於或約98.0、98.5、99.0、99.5或

1 00重量％之異戊二烯。在一些實施例中，以組合物中所

有C5煙之總重量計，適用於本發明之高純度異戊二烯組合

物包含大於或約 99.90 ' 99.92、99.94、99.96、99.98 或 100 重量％之異戊二烯。在一些實施例中，以組合物中所有C5 焼之總重量計，高純度異戊二烯組合物包含小於或約

2.0 、 1.5 、 1.0 、 0.5 、 0.2 、 0.12 、 0.10 、 0.08 、 0.06 、

0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、

0.00005或0.00001重量％之非異戊二烯之C5煙（諸如1,3-環

戊二烯、順-1,3-戊二烯、反-1,3-戊二烯、1,4-戊二烯、1- 戊块、2-戊烘、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烘、

戊-4-烯-1-块、反-戊-3-烯-1-烘或順-戊-3-烯-1-块）。在一

些實施例中，以組合物中所有C5煙之總重量計，高純度異

戊二烯組合物具有小於或約2.0、1.5 ' 1.0 ' 0.5、0.2、

0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、

0.001 ' 0.0005、0.0001 - 0.00005 或 0.00001 重量 ％之1,3-環

戊二烯、順-1,3-戊二烯、反-1,3-戊二烯、1,4-戊二烯、1- 戊块、2-戊烘、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁块、

戊-4 -烯-1-块、反-戊-3-烯-1-烘或順-戊-3-烯T -块。在特定

實施例中，高純度異戊二烯組合物具有大於約2 mg之異戊

二烯，且以組合物中所有C5煙之總重量計，具有大於或約

98.0、98.5、99.0、99.5、99.90、99.92、99.94、99.96、

149050.doc -222-

1434921

99.98或100重量％之異戊二烯。

在一些實施例中，自異戊二烯製造燃料成分之方法包含

獲得工業上有益量之高純度異戊二烯組合物。在一些實施

例中，適用於本發明之高純度異戊二烯組合物具有小於或

約 50、40、30、20、10 ' 5 ' 1、0.5、0.1、0.05、0.01 或

0.005卩g/L抑制異戊二烯聚合之化合物（組合物中抑制異戊

二烯聚合之任何化合物）。在特定實施例中，組合物亦具

有大於約2 mg之異戊二烯。

在一些實施例中，自異戊二烯製造燃料成分之方法包含

獲得工業上有益量之高純度異戊二烯組合物。在一些實施

例中，適用於本發明之高純度異戊二烯組合物具有一或多

種選自由乙醇、丙酮、C5異戊二烯醇及具有10個或10個以

上碳原子之類異戊二烯化合物組成之群的化合物。在一些

實施例中-高純度異戊二烯組合物具有大於或約0.005、

0.01、0.05 ' 0.1 ' 0.5 ' 1 ' 5 ' 10、20、30、40、60、80、

100或120卩g/L之乙醇、丙酮、C5異戊二烯醇（諸如3-甲基-

3 -丁烯-1-醇或3 -甲基-2-丁烯-1-醇）,或前述任意兩者或兩

者以上。在特定實施例中，高純度異戊二烯組合物具有大

於約2 mg之異戊二烯，且具有一或多種選自由乙醇、丙

酮、C5異戊二烯醇及具有10個或10個以上碳原子之類異戊

二烯化合物組成之群的化合物。

在一些實施例中，自異戊二烯製造燃料成分之方法包含

獲得工業上有益量之高純度異戊二烯組合物。在一些實施

例中5適用於本發明之高純度異戊二烯組合物包括異戊二

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烯及一或多種選自由以下組成之群的第二化合物, 2·•庚

酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2,4,5-三甲基毗。定、2,3,5-三甲

基嘔嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1 -丙醇' 雙

乙醯' 2 -丁酮' 2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯' 2-甲

基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊

酮、3 -甲基-1-丁醇、異丁酸乙酯、3 -甲基-2-丁烯醛、乙酸

丁酯、乙酸3-甲基丁酯、乙酸3-甲基-3-丁烯-1-基酯、乙酸

3-甲基-2-丁烯-1-基酯、3-己烯-1-醇、乙酸3-己烯-1-基

酯、檸檬烯、香葉醇（反-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇）、香

茅醇（3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇）、（E）-3,7-二甲基-1,3,6-辛三

烯、（Z）-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯及2,3-環庚烯醇毗呢°在

多個實施例中，以重量百分比為單位 > 此等第二組分之一

之量相對於異戊二烯之量（亦即，組分重量除以異戊二烯

重量 χΙΟΟ）為大於或約 0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、

5 > 10 ' 20 ' 30 ' 40 ' 50 ' 60 ' 70 ' 80 ' 90 ' 100 或

110%（w/w）。在一些實施例中,以重量百分比為平位'甲

硫醇之量相對於異戊二烯之量為小於0.01%（w/w） °在一些實施例中，自異戊二烯製造燃料成分之方法包含

獲得工業上有益量之高純度異戊二烯組合物。在一些實施

例中，該方法包含自生物過程獲得工業上有益量之高純度

異戊二烯組合物，該生物過程包含：（a）在適於製造異戊二

烯之培養條件下培養包含編碼異戊二烯合成酶多肽之異源

核酸的細胞'其中該等細胞⑴製造大於約40° nmol/gwcm/h 之異戊二烯，（ii）使細胞自細胞培養基中消耗之碳有超過

149050.doc -224-

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約0.002莫耳％轉化成異戊二烯，或（iii）使異戊二烯之平均

體積生產力大於約0.1 mg異戊二烯/L培养波/h；及（b）製造異

戊二烯。在一些實施例中，細胞具有如下異源核酸：⑴編

碼異戊二烯合成酶多肽，例如來自諸如葛屬之植物的天然

存在之多肽；及（ii）可操作地連接於啟動子，例如T7啟動

子。在一些實施例中，在包括碳源之培養基中培養細胞，

該碳源為諸如（但不限於）碳水化合物、甘油、丙三醇、二

痙基丙酮、單碳源、油、動物脂肪、動物油、脂肪酸、脂

質、磷脂、甘油脂、單酸甘油酯、二酸甘油酯、三酸甘油

酯、可再生碳源、多肽（例如微生物或植物蛋白質或肽）、

酵母提取物、來自酵母提取物之組分，或前述兩者或兩者

以上之任何組合。在一些實施例中，於限制性葡萄糖條件

下培養細胞。在某一實施例中，細胞進一步包含編碼IDI 多肽之異源核酸。在一些實施例中，細胞進一步包含編碼

MDV途徑多肽之異源核酸。在某一實施例中，該方法包含

使用以下文獻中所述之方法製造異戊二烯：2008年7月2日

申請之美國臨時專利申請案第61/134,094號，WO 2010/003007，及2008年12月15日申請之美國專利申請案

第12/335,071號（US 2009/0203102 A1），其以全文引用的方

式併入。

在某一實施例中，該方法包含獲得由製造異戊二烯之培

養中細胞產生之氣相（釋出氣體）。在一些實施例中，培養

中細胞製造大於約400 nmol/gwcm/h之異戊二烯。在一些實

施例中'當以1 vvm之速率釋氣時，氣相包含大於或約5、

149050.doc •225 ・

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10、20、30、40、50、60、70、80、90 ' 100 卩g/L之異戊

二烯。在一些實施例中，以揮發性有機部分中所有C5煙之

總重量計，氣相之揮發性有機部分包含大於或約99.90、

99.92、99.94、99.96、99.98 或 100 重量 ％ 之異戊二烯。在

一些實施例中，以揮發性有機部分中所有C5煙之總重量

計5氣相之揮發性有機部分包含小於或約2.0、1.5、1.0' 0.5、0.2、0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、

0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005 或 0.00001 重量 ％

之非異戊二烯之C5煙（諸如1,3-環戊二烯、順-1,3-戊二烯、

反-1,3-戊二烯、1,4-戊二烯、1-戊块、2-戊块、1-戊烯、2- 甲基-1-丁烯、3 -甲基-1-丁烘、戊-4-烯-1-烘、反-戊-3- 烯-1 -烘或順-戊-3-烯-1 -焕）。在一些實施例中，以揮發性

有機部分中所有C 5煙之總重量計，氣相之揮發性有機部分

具有小於或約 2.0、1.5、1.0、0.5、0.2、0.12、0.10、

0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、

0.0001 ' 0.00005 或 0.00001 重量 ％之1,3-環戊二烯、順-1,3- 戊二烯、反-1,3-戊二烯、1,4-戊二烯、1-戊块、2-戊烘、

1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁块、戊-4-烯-1-烘、

反-戊-3-烯-1-烘或順-戊-3-烯-1-烘。在特定實施例中，氣

相之揮發性有機部分具有大於約2 mg之異戊二烯，且以揮

發性有機部分中所有C5煙之總重量計，具有大於或約

99.90、99.92、99.94、99.96、99.98 或 100 重量 ％之異戊二

烯。

在某一實施例中，該方法包含獲得由製造異戊二烯之培

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養中細胞產生之氣相（釋出氣體）。在一些實施例中，氣相

之揮發性有機部分具有小於或約50 ' 40 ' 30 ' 20 ' 10、

5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 或 0.005 卩g/L抑制異戊二烯聚

合之化合物（氣相之揮發性有機部分中抑制異戊二烯聚合

之任何化合物）。在特定實施例中，氣相之揮發性有機部

分亦具有大於約2 mg之異戊二烯。在一些實施例中，氣相

之揮發性有機部分具有一或多種選自由乙醇、丙酮、C5異

戊二烯醇及具有10個或10個以上碳原子之類異戊二烯化合

物組成之群的化合物。在一些實施例中，氣相之揮發性有

機部分具有大於或約0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、

5、10、20、30、40、60、80、100 或 120 卩g/L之乙醇、丙

酮、C5異戊二烯醇（諸如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁

烯-1 -醇），或前述任意兩者或兩者以上。在特定實施例

中，氣相之揮發性有機部分具有大於約2 mg之異戊二烯，

且具有一或多種選自由乙醇、丙酮、C5異戊二烯醇及具有

10個或10個以上碳原子之類異戊二烯化合物組成之群的化

合物。在一些實施例中，氣相之揮發性有機部分包括異戊

二烯及一或多種選自由以下組成之群的第二化合物：2-庚

酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2,4,5-三甲基。比咤、2,3,5-三甲

基。比嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、雙

乙醯、2- 丁酮、2-甲基-3- 丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲

基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊

酮、3-甲基-1-丁醇、異丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸

丁酯、乙酸3-甲基丁酯、乙酸3-甲基-3-丁烯-1-基酯、乙酸

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3 -甲基-2-丁烯-1-基酯、3-己烯-1-醇、乙酸3-己烯-1-基

酯、檸檬烯、香葉醇（反-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇）、香

茅醇（3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇）、（E）-3,7-二甲基-1,3,6-辛三

烯、（Z）-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯及2,3-環庚烯醇毗。定。在

多個實施例中，在氣相之揮發性有機部分中’以重量百分

比為單位，此等第二組分之一之量相對於異戊二烯之量

（亦即，組分重量除以異戊二烯重量χίοο）為大於或約

0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、

50、60、70、80、90、100 或 110%（w/w）。在一些實施例

中，該方法進一步包括自氣相回收異戊二烯°舉例而言 '

包含異戊二烯之氣相中之異戊二烯可使用標準技術加以回

收，諸如氣提、膜增強型分離、分餾、吸附/脫附、滲透

蒸發、使異戊二烯自固相熱脫附或真空脫附'或用溶劑萃

取固定或吸附於固相之異戊二烯（參見'例如美國專利第

4,703,007號及第4,570,029號，各藉此以全文引用的方式併

入，尤其關於異戊二烯回收與純化方法）°在〜些特定實

施例中，用醇（諸如乙醇、甲醇、丙醇或其組合）進行萃取

蒸餾來回收異戊二烯。在一些實施例中’異戊二烯回收包

含以液體形式分離異戊二烯（諸如異戊二烯之純溶液或異

戊二烯於溶劑中之溶液）。氣提包含以連續方式自醱酵釋

出氣流中移出異戊二烯蒸氣。該移出可以若干不同方式達

成，包括（但不限於）吸附於固相、分配至液相中 ' 或直接

冷凝（諸如因與冷凝線圈接觸而冷凝或因壓力增加而冷

凝）。在一些實施例中，在稀異戊二烯蒸氣流之露點之上

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對該蒸氣進行膜富集，從而冷凝得到液體異戊二烯。在一

些實施例中，對所回收之異戊二烯進行壓縮及冷凝。

異戊二烯回收可包含一個步驟或多個步驟。在一些實施

例中，自醱酵釋出氣體中移出異戊二烯蒸氣及使異戊二烯

轉化成液相係同時進行。舉例而言，可使異戊二烯自釋出

氣流中直接冷凝而形成液體。在一些實施例中，自醱酵釋

出氣體中移出異戊二烯蒸氣及使異戊二烯轉化成液相係依

序進行。舉例而言，可使異戊二烯吸附於固相，接著用溶

劑自固相萃取。

在一些實施例中，提供一種製造環狀異戊二烯二聚體之

方法 > 其包含加熱純生物異戊二烯。所製造之環狀異戊二

烯二聚體可為6員環二聚體（例如［2 + 4］電環化產物，諸如檸

檬烯）或8員環二聚體或其混合物。6員環二聚體之實例包

括（但不限於）1-甲基-4-（丙-1-烯-2-基）環己-1-烯、1-甲

基-5-（丙-1-烯-2-基）環己-1-烯、1,4-二甲基-4-乙烯基環己

烯、2,4-二甲基-4-乙烯基環己烯及其類似物。8員環二聚

體之實例包括（但不限於）1,5-二甲基環辛-1,5-二烯、1,6-二

甲基環辛T , 5 -二烯及其類似物。在一實施例中，藉由將以

生物方法製造之純異戊二烯加熱至約100°C至約300°C、較

佳約150°C至約250°C之温度而使之二聚。維持壓力為約2 至3 atm。在另一實施例中，可使用適於催化共輛二烯二

聚化之催化劑。可由催化劑及其他反應條件控制產物混合

物中各種二聚體之比例。舉例而言，鎳催化劑可促進8員

環二聚體形成。

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在一些實施例中，提供一種製造環狀異戊二烯二聚體之

方法，其包含使生物異戊二烯進行光二聚。所製造之環狀

異戊二烯二聚體可為一或多種4員環二聚體或其混合物。4 員環二聚體之實例包括（但不限於）1,2-二（丙-1-烯-2-基）環

丁烷、1,3-二（丙-1-烯-2-基）環丁烷、1-甲基-1-乙烯基-3- （丙-1-烯-2-基）環丁烷、1-甲基-1-乙烯基-2-（丙-1-烯-2-基）

環丁烷、1,3-二甲基-1,3 -二乙烯基環丁烷、1,2-二甲

基-1,2-二乙烯基環丁烷及其類似物。在一實施例中，藉由

較佳在諸如苯甲酮之光敏劑存在下用UV光照射以生物方

法製造之純異戊二烯而使之二聚。

可氫化異戊二烯二聚體以形成可充當燃料或摻合至燃料

中之飽和C ί ο煙。在一實施例中，對不飽和異戊二烯二聚

體進行催化氫化以製造部分氫化及/或完全氫化之產物°

完全氫化之產物的實例包括（但不限於）1-甲基-4-異丙基環

己烷及1-甲基-5-異丙基環己烷、1,4-二甲基-4-乙基環己

烷、2,4-二甲基-4-乙基環己烷、1,2-二異丙基環丁烷及1,3- 二異丙基環丁烷、1-甲基-1-乙烯基-3-（丙-1-烯-2 -基）環丁

烷、1-甲基-1-乙基-2-（丙-2-基）環丁烷、1,3-二甲基-1,3-乙

基環丁烷、1,2-二甲基-1,2-二乙基環丁烷、1,5-二甲基環

辛烷、1,6-二甲基環辛烷及其類似物。

在一些實施例中，自異戊二烯製造燃料成分之方法包

含：（a）獲得工業上有益量之本文所述之任何高純度異戊二

烯起始組合物；（b）使高純度異戊二烯起始組合物之至少一

部分化學轉化成燃料成分5其包含：⑴在壓力下將高純度

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異戊二烯組合物加熱至高於或約ioo°c，（ii）使起始異戊二

烯組合物之至少一部分轉化成不飽和環狀異戊二烯二聚

體，及（iii）氫化不飽和環狀異戊二烯二聚體以製造飽和環

狀異戊二烯二聚體。在一些實施例中，在壓力下將起始異

戊二烯組合物加熱至高於或約100 ' 125 ' 150、175、

200、225或250°C。在一些實施例中，在抗氧化劑（例如

2,6-二-第三丁基-4-甲基苯酚）存在下加熱起始異戊二烯組

合物以防止自由基介導之聚合。在一實施例中，在二硝基

甲酚作為聚合抑制劑存在下進行異戊二烯之熱二聚。適合

之抗氧化劑可用作聚合抑制劑。在一些實施例中，起始異

戊二烯組合物之至少一部分轉化成包括以下6員及8員環之

不飽和二聚體混合物：例如檸檬烯（1-甲基-4-（丙-1-烯-2- 基）環己-1-烯）、1-甲基-5-（丙-1-烯-2-基）環己-1-烯、1,4-二

甲基-4-乙烯基環己烯、2,4-二甲基-4-乙烯基環己烯、1,5- 二甲基環辛-1,5-二烯、1,6-二甲基環辛-1,5-二烯、2,6-二

甲基-1,3-環辛二烯、2,6-二甲基-1,4-環辛二烯、3,7-二甲

基-1,5-環辛二烯、3,7-二甲基-1,3-環辛二烯及3,6-二甲

基-1,3-環辛二烯。在一些實施例中，起始異戊二烯組合物

中大於或約 20、30 ' 40 ' 50 ' 60 ' 70、75、80、85、90 ' 95、98、99或100%之異戊二烯轉化成不飽和環狀異戊二

烯二聚體。在一些實施例中，由諸如鈕基催化劑（例如

Pd/C，例如5%（重量）Pd/C）之氫化催化劑催化不飽和環狀

異戊二烯二聚體之氫化。在一些實施例中，飽和環狀異戊

二烯二聚體包含一或多種選自由以下組成之群的C10煙：

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1-甲基-4-異丙基環己烷、1-甲基-3-異丙基環己烷、1,5- —甲基環辛烷及1,4-二甲基環辛烷°在一些較佳實施例中’

起始異戊二烯組合物為生物異戊二烯組合物。

在一些實施例中，自異戊二烯製造燃料成分之方法包

含：（a）獲得工業上有益量之本文所述之任何高純度異戊二

烯起始組合物；（b）使高純度異戊二烯起始組合物之至少一

部分化學轉化成燃料成分5其包含：⑴使高純度異戊二烯

組合物與催化劑系統接觸，（订）使起始異戊二烯組合物之

至少一部分轉化成不飽和異戊二烯二聚體及/或三聚體5

及（iii）氫化不飽和二聚體及/或三聚體以製造飽和C10及/或

C15煙。在一些實施例中，起始異戊二烯組合物中大於或

約 20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95、98、

99或100%之異戊二烯轉化成不飽和異戊二烯二聚體及/或

三聚體。在一些實施例中，使起始異戊二烯組合物與此項

技術中已知之適當催化劑系統接觸以得到一或多種選自由

以下組成之群的不飽和環狀異戊二烯二聚體：1,2-二

（丙-1-烯-2-基）環丁烷、1,3-二（丙-1-烯-2-基）環丁烷、1-甲

基-1-乙烯基-3-（丙-1-烯-2-基）環丁烷、1-甲基-1-乙烯基-2- （丙-1-烯-2-基）環丁烷、1,3-二甲基-1,3-二乙烯基環丁烷、

1,2-二甲基-1,2-二乙烯基環丁烷、1-甲基-4-（丙-1-烯-2-基）

環己-1-烯、1-甲基-5-（丙-1-烯-2-基）環己-1-烯' 1,4-二甲

基-4 -乙烯基環己烯、2,4 -二甲基-4 -乙烯基環己烯' 1,5 -二

甲基環辛-1,5-二烯、1,6-二甲基環辛-1,5-二烯、1,4-二甲

基-4-乙烯基-1-環己烯、2,4-二甲基-4-乙烯基-1-環己烯、

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2.7- 二甲基-1,3,7-辛三烯、2,7-二甲基-2,4,6-辛三烯、2,6- 二甲基-1,3-環辛二烯、2,6-二甲基-1,4-環辛二烯、3,7-二

甲基-1,5-環辛二烯、3,7-二甲基-1,3-環辛二烯及3,6-二甲

基-1,3-環辛二烯。在一些實施例中，使起始異戊二烯組合

物與此項技術中已知之適當催化劑系統接觸以得到一或多

種不飽和環狀異戊二烯三聚體，諸如三甲基環十二烷三烯

及三甲基十二烷四烯及其類似物。在一些實施例中，使起

始異戊二烯組合物與此項技術中已知之適當催化劑系統接

觸以得到一或多種不飽和線性異戊二烯二聚體及/或三聚

體，諸如二甲基辛三烯（例如2,7-二甲基-1,3,7-辛三烯及

2.7- 二甲 基-2,4,6-辛三烯）及三甲基十二烷四烯（例如2,6,10- 三甲基-1,5,9,11-+二烷四烯、α-法呢烯及0-法呢烯）及其類

似物。在一些較佳實施例中，起始異戊二烯組合物為生物

異戊二烯組合物。

在一些實施例中，自異戊二烯製造燃料成分之方法包含

使高純度異戊二烯組合物與催化劑系統接觸以使起始異戊

二烯組合物之至少一部分轉化成不飽和異戊二烯二聚體及/

或三聚體。在一些實施例中，催化劑系統包含Ni、Fe或Co 催化劑，且起始組合物中之異戊二烯轉化成8員環異戊二

烯二聚體，包含二甲基環辛二烯，諸如1,5-二甲基環辛-

1.5- 二烯及1,6-二甲基環辛-1,5-二烯。在一些實 施例中，

催化劑系統包含鎳化合物。Ni催化之異戊二烯二聚得到由

1.5- 二甲基-1,5-環辛二烯與1,6-二甲基-1,5-環辛二烯以約

90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、

149050.doc - 233 ・

1434921

20:80及10:90比率組成之二甲基-1,5-環辛二烯混合物。在

一實施例中，催化劑系統包含三組分催化劑，其含有發酸

鎳或0-酮、有機鋁或有機鎂化合物及經取代之亞磷酸三苯

酯。舉例而言，在氮氣氛圍下將高純度異戊二烯起始組合

物於無水甲苯中之脫氣溶液與Ni（acac）2、Et3Al及亞磷酸參

（3,4-雙（二甲基胺基）苯基）酯混合，且在95°C下加熱該混合

物以得到二甲基環辛二烯。在另一實施例中，催化劑系統

包含發酸鐵或片二酮化合物、有機鋁或有機鎂化合物及具

有推電子基團之2,2'-聯。比噬衍生物。舉例而言，將起始異

戊二烯組合物與乙烯基丙酮酸鐵、4,4七二甲基-2,2'-聯毗口定

及Et3Al於甲苯中之混合物一起加熱以得到優良產率之1,6- 二甲基-1,5-環辛二烯。在一些較佳實施例中5起始異戊二

烯組合物為生物異戊二烯組合物。

在一些實施例中，自異戊二烯製造燃料成分之方法包含

使高純度異戊二烯組合物與催化劑系統接觸 以使起始異戊

二烯組合物之至少一部分轉化成不飽和異戊二烯二聚體及/

或三聚體。在一些實施例中5催化劑系統包含Ru、Fe ' Ni 或Pd催化劑或其組合，且起始組合物中之異戊二烯轉化成

包含6員環異戊二烯二聚體之混合物。在一實施例中’催

化劑系統為Fe（NO）2Cl-雙（1,5-環辛二烯）鎳催化劑系統，且

起始組合物中之異戊二烯在低溫（例如-5°C至+20°C）下環二

聚化，得到1-甲基-4-異丙烯基-1-環己烯與2-甲基-4-異丙

烯基-1-環己烯及1,4-二甲基-4-乙烯基-1-環己烯與2,4-二甲

基-4-乙烯基-1 -環己烯。在另一實施例中5與亞磷酸參（經

149050.doc •234·

1434921

取代煙基）酯、亞碑酸參（經取代煙基）酯或亞録酸參（經取

代煙基）酯 及VIII族 金屬（0）化合物（例 如 乙醯基丙酮酸鎳）之

混合型催化劑接觸使起始組合物中之異戊二烯轉化成1,4- 二甲基-4-乙烯基-1-環 己烯及1,5-二甲基-1,5-環辛二烯。在

另一實施例中，異戊二烯起始組合物與釘催化劑（參見，

仞］如 Itoh, Kenji; Masuda, Katsuyuki; Fukahori, Takahiko;Nakano, Katsumasa; Aoki, Katsuyuki; Nagashima, Hideo,Organometallics (1994), 13(3), 1020-9)接觸使異戊二烯轉

化成CIO環狀二聚體（例如二甲基-環辛二烯之混合物）。制

催化劑可以兩個步驟自RuCL及五甲基環戊二烯（C5Me5H） 合成。該製程可以分批模式進行且回收催化劑並使之再循

環。在一些較佳實施例中，起始異戊二烯組合物為生物異

戊二烯組合物。該方法之一實施例於流程XI中說明。

流程XI

異戊二烯

熱及/或

催化劑------- ►

6員環二聚體 8員環二聚體。

在一些實施例中， 自異戊二烯製造燃料成分之方法包含

使高純度異戊二烯組合物與催化劑系統接觸以使起始異戊

149050.doc -235 -

1434921

二烯 組合物之至少一部分轉化成不飽和異戊二烯二聚體及/

或三聚體。在一些實施例中，催化劑系統包含Ni、Ti ' Al 或Mg催化劑或其混合物，且起始組合物中之異戊二烯轉

化成包含環狀異戊二烯三聚體（諸如三甲基環十二烷三烯）

之混合物。在一實施例中，用於異戊二烯三聚之催化劑系

統包含Ni及/或Ti ' 一或多種有機金屬化合物、及VA族化

合物。反應可於含瓶基溶劑中進行。在另一實施例中，在

多種亞磷酸酯作為電子供體存在下由環烷酸鎳及異戊二烯

鎂催化異戊二烯寡聚，得到含有二甲基環辛二烯之環狀二

聚體；尤其在1,1,1-參（遂甲基）丙烷亞磷酸酯存在下選擇性

地得到三甲基環十二烷三烯。

在一些實施例中，自異戊二烯製造燃料成分之方法包含

使高純度異戊二烯組合物與催化劑系統接觸以使起始異戊

二烯組合物之至少一部分轉化成不飽和異戊二烯二聚體及/

或三聚體。在一些實施例中'催化劑系統包含Ni、Pd或Cr 催化劑或其混合物'且起始組合物中之異戊二烯轉化成調

聚物或線性二聚體及/或三聚體。在一實施例中，包含

Pd（O）錯合物（例如 Pd（acac）2-Ph3P 及 Pd（OAc）2-Ph3P）之催化

劑系統催化異戊二烯二聚及調聚以得到線性異戊二烯二聚

體（例如2,7-二甲基-1,3,7-辛三烯）。在一種變化形式中，於

甲醇溶劑中進行反應，且製造甲基醍，諸如甲氧基二甲基

辛二烯（例如1-甲氧基-2,7-二甲基-2,7-辛二烯及3-甲氧

基-2,7-二甲基-1,7-辛二烯）。在另一實施例中，催化劑系

統包含二價及三價過渡金屬交換之蒙脫石（例如Cr3+蒙脫

149050.doc -236-

1434921

石）。在另一實施例中，催化劑系統包含Ni（O）胺基亞麟酸

酯催化劑，且起始組合物中之異戊二烯轉化成區位選擇性

尾-尾線性二聚體。在一些變化形式中，由競爭性環二聚

化反應形成線性二聚體。在另一實施例中，催化劑系統包

含Ν,Μ雙（二芳基麟基）胺鎔催化劑（參見，例如Bowen, L.; Charernsuk, Μ.; Wass, D.F. Chem. Commun. （2007） 2835- 2 83 7），且異戊二烯轉化成線性及環狀C15三聚體。在一種

變化形式中，鎔催化劑係自CrC13（THF）3及PNP麟配位體就

地製成。

在一些實施例中，自生物異戊二烯組合物製造燃料成分

之方法包含如下使生物異戊二烯組合物中之大部分異戊二

烯發生化學轉化：（i）使生物異戊二烯組合物與催化異戊二

烯三聚之催化劑接觸以製造不飽和異戊二烯三聚體，及

（ii）氫化異戊二烯三聚體以製造燃料成分。在一些實施例

中，在化學轉化期間生物異戊二烯組合物中至少約95%之

異戊二烯轉化成非異戊二烯化合物。

在一些實施例中，自異戊二烯製造燃料成分之方法包

含：（a）獲得工業上有益量之本文所述之任何高純度異戊二

烯起始組合物；（b）使起始異戊二烯組合物之至少一部分轉

化成不飽和異戊二烯衍生物；及（c）氫化不飽和異戊二烯衍

生物以製造飽和化合物。在一些實施例中，以分批模式使

不飽和異戊二烯衍生物氫化成飽和化合物。在一些實施例

中，以連續模式使不飽和異戊二烯衍生物氫化成飽和化合

物。該方法之一實施例於流程XII中說明。

149050.doc -237 -

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流程XII

金屬催化齊!

異戊二烯

在一些實施例中，自異戊二烯製造燃料成分之方法包

含：（a）獲得工業上有益量之本文所述之任何高純度異戊二

烯起始組合物；（b）使起始異戊二烯組合物之至少一部分轉

化成氧化異戊二烯衍生物；及視情況，（c）氫化任何不飽和

氧化異戊二烯衍生物以製造飽和氧化物。在一些實施例

中，在醇（例如甲醇或乙醇或其混合物）存在下使異戊二烯

起始組合物與催化劑接觸以形成包含一或多種不飽和或飽

和髄（例如甲基醸或乙基醍或其混合物）之氧化異戊二烯衍

生物。在一些實施例中，催化劑為酸催化劑，諸如硫酸、

固相硫酸（例如Dowex Marathon®）、液相及固相氟磺酸（例

如三 氟甲烷磺酸及Nafion-H（DuPont））。在 類似於Hensel等

人［Hensen, K.; Mahaim, C.; Holderich, W.F., Applied

Catalysis A: General （1997） 140（2）, 311-329］所述之條件

下，亦可使用沸石催化劑（例如0-沸石）進行檸檬烯及相關

單蒔之甲氧基化。在一些實施例中，異戊二烯起始組合物

或不飽和異戊二烯二聚體或三聚體進行氧化/氫化以形成

149050.doc -238 -

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包含一或多種醇（諸如C5、C10及C15醇及二醇）之羚基化異

戊二烯衍生物。在一些實施例中，異戊二烯起始組合物進

行無基化/酯化以形成醇及酯。舉例而言，用諸如過乙酸

及3-氯過苯甲酸之過酸對生物異戊二烯或不飽和中間物進

行過氧化以得到環氧化物；且用i）水與酸催化劑及ii）硼氫

化方法進行水合以得到醇及二醇。該等反應描述於例如

Michael B. Smith 及 Jerry March, Advanced Organic

Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure > 第 6版,

John Wiley & Sons, 2007中。在一些較佳實施例 中，起始

異戊二烯組合物為生物異戊二烯組合物。

在一些實施例中，自異戊二烯製造燃料成分之方法包

含：（a）獲得工業上有益量之本文所述之任何高純度異戊二

烯起始組合物；（b）使起始異戊二烯組合物部分地氫化成單

烯煙（例如2-甲基丁 -1-烯、3 -甲基-丁 -1-烯及2-甲基丁 -2- 烯）；及（c）自單烯煙製造燃料成分。在一實施例中，單烯

煙進行二聚。在另一實施例中，使用傳統煙陽離子催化

（諸如用於使異丁烯轉化成異辛烷）使單烯煙與其他烯煙反

應。二聚或與其他烯煙反應之產物接著進行氫化以得到飽

和燃料成分。在一些較佳實施例中5高純度異戊二烯為生

物異戊二烯組合物。在某一實施例中，使用鈕催化劑部分

地氫化起始異戊二烯組合物，該鈕催化劑為諸如

Pd/CaCO3、Pd/BaSO4、Pd/C、鈕黑、Pd/SiO3、Pd/Al2O3 或

Pd/SiO2。在某一實施例中，使用二氧化矽支撐型聚醯胺

基胺（PAMAM）樹枝狀聚合物-鈕錯合物部分地氫化起始異

149050.doc -239-

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戊二烯組合物。在某一實施例中，使用鈕-金及鈕-銀催化

劑（例如Pd-Au/SiO2及Pd-Ag/SiO2）部分地氫化起始異戊二

烯組合物對異戊二烯還原成單烯煙相比完全還原之C5烷煙

具有高選擇性。在某一實施例中，使用無機支撐物（例如

金屬沸石）上之VIB族金屬作為催化劑（例如Mo/A12O3催化

劑）部分地氫化起始異戊二烯組合物。在某一實施例中，

使用可呈蜂巢組態之整體式催化劑床部分地氫化起始異戊

二烯組合物。整體式催化劑床之催化劑支撐材料可包括金

屬，諸如鎳、筐白、鈕、錢、釘 '銀、鐵 '銅、鈕、鎔'

銘、錫，及其合金或混合物。在某一實施例中，使用蛋殼

型Ρά/δ-Α12Ο3催化劑部分地氫化起始異戊二烯組合物'尤

其在反應不含水之情況下。在某一實施例中，使用由IB、

VIB、VIIB族金屬或鋅促進之VIII族金屬催化劑部分地氫

化起始異戊二烯組合物以減少催化劑中毒。使異戊二烯轉

化成異戊烯（單烯煙）之方法可以連績模式或分批模式使用

均相或異相催化劑進行。該方法之一實施例於流程XIII中

說明。

流程ΧΙΠ

149050.doc -240-

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在一些實施例中，異戊二烯的部分氫化所製造之異戊烯

在液相中於離子交換樹脂及沸石上進行三聚。參見

GranGranollers, Ind. Eng. Chem. Res., 49 （8） » 第 3561-3570頁（2001）。

在一些實施例中，自異戊二烯製造燃料成分之方法包

含：（a）獲得工業上有益量之本文所述之任何高純度異戊二

烯起始組合物；（b）使起始異戊二烯組合物部分地氫化成單

烯煙（例如2-甲基丁 -1-烯、3 -甲基-丁 -1-烯及2-甲基丁 -2- 烯）；（c）使單烯煙與用於單烯煙二聚化之催化劑接觸以與

另一單烯煙形成二聚烯；及（d）氫化二聚產物（二聚烯）以製

造飽和煙燃料成分。在一些較佳實施例中，高純度異戊二

烯為生物異戊二烯組合物。在一些實施例中，另一單烯煙

為源自高純度異戊二烯起始組合物之異戊烯。在一些實施

例中，另一單烯煙為來自另一來源之烯煙，諸如丙烯、丁

烷或異丁烯。在一些實施例中，供二聚用之催化劑為樹脂

催化劑（例如 Amberlyst、Amberlyst 35、Amberlyst 1 5、

Amberlyst XN1010、Amberlyst XE586）。在一些實施 例

中，供二聚用之催化劑為含有酸性中孔分子篩，諸如嵌入

沸石結構ZSM-5、鎂鹼沸石、ZSM-22或ZSM-23中之中孔

篩的催化物質。在一些實施例中，供二聚用之催化劑為在

高溫（例如至少900°C）下熱穩定之催化物質。在一些實施例

中，供二聚用之催化劑為含有酸性中孔分子篩之催化物

質。在一些實施例中，供二聚用之催化劑為固體酸性催化

劑（例如固體磷酸催化劑、酸性離子交換樹脂）。該方法之

149050.doc -241 -

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一實施例於流程XIV中說明。

流程XIV

2,3,3,4-四甲基己烷 3,3,5-三甲基庚烷

在一些實施例中，自異戊二烯製造燃料成分之方法包

含：（a）獲得工業上有益量之本文所述之任何高純度異戊二

烯起始組合物；（b）使起始異戊二烯組合物部分地氫化成異

戊烯（例如2-甲基丁 -1-烯、3-甲基-丁 -1-烯及2-甲基丁 -2- 烯）；（c）使異戊烯與醇及催化劑接觸以形成氧化物；及（c） 自異戊烯氧化物製造燃料成分。在一些較佳實施例中5高

純度異戊二烯為生物異戊二烯組合物。在一些實施例中5

異戊烯與乙醇接觸且所形成之燃料氧化物為醐5諸如

TAME。

在一些實施例中，本文所述之任何方法均進一步包括在

化學轉化之前純化起始異戊二烯組合物。舉例而言，使用

本發明之組合物及方法所製造之異戊二烯可使用標準技術

加以純化。純化係指使異戊二烯與一或多種在製造異戊二

烯時所存在之組分分離的過程。在一些實施例中'以實質

上純液體之形式獲得異戊二烯。純化方法之實例包括⑴用

液體萃取劑自溶液蒸餾，及（ii）層析。本文中所用之「經

149050.doc -242-

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純化異戊二烯」意謂已與一或多種在製造異戊二烯時所存

在之組分分離的異戊二烯。在一些實施例中，至少約20重

量％的異戊二烯與在製造異戊二烯時所存在之其他組分分

離。在多個實施例中，異戊二烯之純度至少或約為25重量

% ' 30重量％、40重量％、50重量％、60重量％、70重量

% ' 75重量％、80重量％、90重量％、95重量％或99重量

%。可藉由任何適當方法，例如藉由管柱層析、HPLC分析

或GC-MS分析來檢驗純度。在一些實施例中，藉由初始吸

附於活性碳、接著脫附並濃縮而自醱酵釋出氣體中回收生

物異戊二烯以得到用於化學轉化成燃料成分之液體異戊二

烯組合物。

製造燃料之連續製程

本發明亦提供一種自異戊二烯製造燃料成分之連續製

程，其包含：（a）連續製造工業上有益量之高純度異戊二

烯；及（b）連續使該工業上有益量之高純度異戊二烯之至少

一部分化學轉化成燃料成分。在本發明之一連續製程中，

由例如生物過程（例如培養製造異戊二烯之細胞）連續製造

高純度異戊二烯流，且將其通至用於化學轉化之反應器

中。在一些實施例中，於連續純化單元中使用萃取蒸餾、

冷凝、吸附或膜將來自醱酵釋出氣體之異戊二烯與水及其

他永久氣體（例如。2、N2及CO?）分離，該連續純化單元中

氧氣含量降至ppm範圍且其他問題雜質得以移除；使用異

相催化劑使異戊二烯蒸氣催化轉化成二聚體（C10）及三聚

體（C15）；分離所要產物且使未反應之異戊二烯返回至反

149050.doc -243 ·

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應器以供進一步轉化。在一些實施例中5藉由量測 氣相中

所需C10燈之含量來監測催化二聚。

在一些實施例中，使以生物方法製造之異戊二烯流通過

維持在約100°C至約300°C之溫度下的化學反應器（例如反應

管），該化學反應器中以生物方法製造之異戊二烯進行二

聚反應。在一種變化形式中，使異戊二烯二聚體與產物流

分離且使至少一部分未反應之異戊二烯再循環回化學反應

器中。在一實施例中，於第二化學反應器中使所製造之不

飽和異戊二烯二聚體與氫化催化劑及氫源接觸，從而製造

部分氫化及/或完全氫化之產物。該製程可進一步包含自

製造異戊二烯之生物反應器之釋出氣體中回收異戊二烯的

步驟。

在一些實施例中，首先將含有共同製造之氫氣的生物異

戊二烯流與氫氣分離，使生物異戊二烯流通過維持在約

100°C至約300°C之溫度下的化學反應器（例如反應管），該

化學反應器中以生物方法製造之異戊二烯進行二聚反應。

在一種變化形式中，使異戊二烯二聚體與產物流分離且使

至少一部分未反應之異戊二烯再循環回化學反應器中。在

一實施例中，於第二化學反應器中使所製造之不飽和異戊

二烯二聚體與氫化催化劑及氫源接觸，從而製造部分氫化

及/或完全氫化之產物。在一種變化形式中，自共同製造

之異戊二烯-氫氣中分離之氫氣流用於氫化步驟。該製程

可進一步包含自製造異戊二烯之生物反應器之釋出氣體中

回收異戊二烯的步驟。該製程可進一步包含以下步驟：使

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用 此項技術中已知之純化方法（諸如低溫冷凝及固體基質

吸附）純化自共同製造之異戊二烯-氫氣中分離之氫氣流。

自燃料產物移除二烯及聚合物

燃料組合物常常含有可隨著時間推移形成膠、樹脂、聚

合物及其他不合需要之副產物的不飽和化合物（烯煙、二

烯煙及聚烯煙）（參見，例如Pereira及Pasa （2006） Fuel, 85,

1860-1865及其中之參考文獻）。一般而言，隨著既定化合

物之不飽和度增加，彼化合物形成該等副產物之可能性愈

大。異戊二烯為當存在於燃料組合物中時易於形成不合需

要之聚合副產物的1,3-二烯。儘管存在可降低副產物形成

程度之燃料添加劑（抗氧化劑、自由基抑止劑等），但該等

副產物仍可隨著時間推移而形成。烯煙因自燃料中蒸發或

因含烯煙燃料不完全燃燒而釋放至大氣中時，亦可有助於

形成地面臭氧。

因此，完全或部分源自異戊二烯之燃料組合物應含有極

少乃至不含異戊二烯。一系列方法可用於自燃料組合物移

除異戊二烯，諸如藉由蒸餾而純化，與醇反應以形成醍，

或氫化以使異戊二烯轉化成飽和衍生物。或者，可用親二

烯物（諸如蘋果酸酊）處理異戊二烯，從而製造不會有助於

形成不合需要之副產物的惰性加成物。

提供包含異戊二烯衍生物且實質上不含異戊二烯之燃料

組合物。在一些實施例中5燃料組合物含有小於0.01% ' 0.1% ' 1% ' 2% ' 3% ' 4% ' 5% ' 10% 或 15% 之異戊二烯。

亦提供使生物異戊二烯組合物化學轉化成包含異戊二烯衍

149050.doc -245 -

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生物且實質上不含異戊二烯之燃料組合物的方法。在一些

實施例中，使來自生物異戊二烯組合物之大部分異戊二烯

轉化成燃料成分。在一些實施例中，使來自生物異戊二烯

組合物之大部分異戊二烯轉化成可進一步轉化以製造燃料

成分之中間物。在一些實施例中，使來自生物異戊二烯組

合物之大部分異戊二烯轉化成非異戊二烯之化合物。「大

咅卩分」為 99.99%、99.9%、99%、98%、97%、96%、

95%、90%、85%或 80%。

在一些情況下，異戊二烯與其他共瓠二烯可形成具有膠

狀稠度之聚合產物，其可降低所要產物之產率及/或使催

化劑失活(參見'例如 R.C.C. Pereira 及 V.M.D. Pasa. Fuel

85 (2006) 1860-1865)。在一些實施例中，提供測定產物混

合物中存在之共髄二烯之量的方法。D.F. Andrade等人描

述測定所存在之共瓠二烯之量的多種方法｛Fuel (2010), doi:10.106/j.fuel/2010.01.003) > 包括以下：1) UOP-326 方

法(順丁烯二酸酊方法)，量測經由與二烯進行狄爾斯-阿爾

德反應所消耗之順丁烯二酸St之量的半定量方法；2)極譜

法；3)氣相層析法，其中二烯可與衍生化試劑，諸如4-甲

基-1,2,4-三哇嗽-3,5-二酮(MTAD)或4-苯基-1,2,4-三。坐。林-

3,5-二酮(PTAD)反應；4) HPLC ； 5)超臨界流體層析法；6) NMR ； 7) UV及近IR光譜法；及8)其他光譜方法，其可包

括首先用氟硼酸對硝基苯重氮鹽對二烯進行衍生處理。

本文中提供使結膠減至最少及/或減少已產生之膠之量

的方法。在一些實施例中，使用抗氧化劑使結膠減至最

149050.doc -246-

1434921

少。在其他實施例中，使聚合副產物再循環回製程物流。

在一些實施例中，經由烯煙複分解使聚合副產物解聚。烯

煙複分解可使用鈕或鎬催化劑進行'諸如2,6-二異丙基苯

基醯亞胺基新值二烯雙 己基（neophylidene）銅雙（2-第三丁

基苯氧化物）（參見US 5,446,102）。

在一些實施例中，本文所述之任何方法均進一步包括對

此等反應之產物進行表徴且評估潛在燃料價值。舉例而

言，由此項技術中已知之標準方法對產物進行表徴，例如

GC/MS、NMR、UV-Vis及IR光譜法、沸 點溫度、密 度及其

他物理特性。可由雙重碳-同位素指紋分析對產物進行進

一步表徴（參見美國專利第7,169,588號）。由量測燃料特性

之參數來評估產物之潛在燃料價值，該等特性為諸如能量

密度、熱值、水溶度、辛烷/十六烷值、密度、黏度 ' 表

面張力、汽化蛤、蒸氣擴散度、閃點、自燃點、可燃限

度、濁點及化學穩定性。

如同商業石油燃料一般，可測試BioIsoFuel™產品之酸

度、密度、痕量礦物含量、苯、總芳族物含量、水含量及

腐蝕度。為確保BioIsoFuel™產品中之微量雜質不會不利

地影響其材料特性，亦可藉由標準ASTM測試（諸如用水及

銅條針對腐 蝕度進行卡爾費希爾測試（Karl Fischer））測試

樣品之腐蝕度及與燃料系統之相容性。

燃料組合物

本發明提供一種包含由本文所述之任何方 法及製程製造

之燃料成分的燃料組合物。在一些實施例中 > 燃料成分包

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含一或多種選自由以下組成之群的煙：源自異戊二烯之飽

和C1 0及C15煌，及異戊二烯之氧化衍生物。預期

BioIsoFuelTM煙產品與石油、汽油及柴油完全相容。預期

BioIsoFuel™與商業石油燃料之摻合物具有較理想之特

性，因為其不含酸、硫、芳族物或其他不合需要之雜質。

在一些較佳實施例中，燃料成分包含生物異戊二烯之衍

生物。預期對源自由非基於石化之可再生資源製成之生物

異戊二烯的燃料將存在顯著需求。咸信工業用戶及消費者

相較以源自石化製程之異戊二烯製成之燃料組分將偏向於

購買源自該等環保型來源之燃料組分。進一步咸信，用戶

將願意為該等以可再生資源製成之環保型產品支付額外費

用。本文所述之源自生物異戊二烯組合物之燃料組分提供

可驗證為源自非基於石化之資源的益處。

在一些實施例中，燃料成分包含一或多種飽和環狀C10 煙，諸如1,2-雙（異丙基）環丁烷、1,2-雙（異丙基）環丁烷、

1-甲基-4-異丙基環己烷、1-甲基-3-異丙基環己烷、1-乙

基-1,4-二甲基環己烷、1-乙基-1,3-二甲基環己烷、1,5-二

甲基環辛烷及1,4-二甲基環辛烷。在一些實施例中，燃料

成分包含一或多種飽和環狀C15煌，諸如1,5,9-三甲基環十

二烷及1,5,10-三甲基環十二烷。在一些實施例中，燃料成

分包含一或多種飽和脂族C10煙，諸如2,6-二甲基辛烷、

2,7-二甲基辛烷及3,6-二甲基辛烷。在一些實施例中，燃

料成分包含一或多種飽和脂族C15煙，諸如2,6,10-三甲基

十二烷、2,7,10-三甲基十二烷及3,7,10-三甲基十二烷。在

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一些實施例中，燃料成分包含2-甲基丁烷。在一些實施例

中，燃料成分包含一或多種選自由以下組成之群的煙：

1,2-雙（異丙基）環丁烷、1,2-雙（異丙基）環丁烷、1-甲基-4- 異丙基環己烷、1-甲基-3-異丙基環己烷、1-乙基-1,4-二甲

基環己烷、1-乙基-1,3-二甲基環己垸、1,5-二甲基環辛

烷、1,4-二甲基環辛烷、1,5,9-三甲基環十二烷、1,5,10-三

甲基環十二烷、2,6-二甲基辛烷、2,7-二甲基辛烷、3,6-二

甲基辛烷、2,6,10-三甲基十二烷、2,7,10-三甲基十二烷、

3,7,10-三甲基十二烷及2-甲基丁烷。

在一些實施例中*燃料成分包含一或多種飽和舞基化

物，諸如C5醇及二醇（例如3-甲基-丁-1-醇、2-甲基-丁-1- 醇及2-甲基-丁-2-醇、3-甲基-丁-1,3-二醇及2-甲基-丁-2,3- 二醇）、C-10醇及二醇（例如3,7-二甲基辛-1-醇、2,7-二甲

基辛-1-醇、2,7-二 甲基辛-2-醇及2,7-二 甲基辛-2,7-二醇）及

環狀C-10醇（例如2-（4-甲基環 己基）丙-2-醇、2-（4-甲基環己

基）丙-1-醇、2-（1,4-二甲基環己基）乙醇及4-乙基-1,4-二甲

基環己醇）。在一些實施例中5燃料成分包含一或多種飽

和醒,諸如1,3-二乙氧基-3 -甲基丁烷、1 -乙氧基-3 -甲基丁

烷、1-甲氧基-2,7-二甲基辛烷及3-甲氧基-2,7-二甲基辛

烷。在一些實施例中，燃料成分包含一或多種選自由以下

組成之群的異戊二烯衍生氧化物：3-甲基-丁 -1-醇、2-甲

基-丁-1-醇、2-甲基-丁-2-醇、3-甲基-丁-1,3-二醇、2-甲

基-T -2,3-二醇、3,7-二甲基辛-1-醇、2,7-二甲基辛-1-醇、

2,7-二甲基辛-2-醇、2,7-二甲基辛-2,7-二醇、2-（4-甲基環

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己基）丙-2-醇、2-（4-甲基環己基）丙-1-醇、2-（1,4-二甲基環

己基）乙醇、4-乙基-1,4-二甲基環己醇、1,3■•二乙氧基-3-甲基丁烷、1-乙氧基-3-甲基丁烷、1-甲氧基-2,7-二甲基辛烷

及3-甲氧基-2,7-二甲基辛烷。

在一些實施例中，在經歷根據本文所述之任何方法及製

程之步驟之後，燃料成分包含小於或約0.5卩g/L之來自非

異戊二烯之C5煙的產物。在一實施例中，在經歷根據本文

所述之任何方法及製程之步驟之後，燃料成分實質上不含

來自非異戊二烯之C5煙的產物。在一些實施例中，以起始

組合物中所有C 5煙之總重量計，燃料成分包含小於或約

0.2、0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、

0.001、0.0005、0.0001、0.00005 或 0.00001 重量 ％之非異

戊二烯之C5煙（諸如1,3-環戊二烯、順-1,3-戊二烯、反-1,3- 戊二烯、1,4-戊二烯、1-戊块、2-戊烘、1-戊烯、2-甲

基-1-丁烯、3-甲基-1-丁块、戊-4-烯-1-块、反-戊-3-烯-1- 烘或順-戊-3 -烯-1 -烘）。在一些實施例中，燃料成分包含濃

度小於100、1 0 ' 1、0.1或0.01 ppm之非異戊二烯之C5煙

（諸如1,3-環戊二烯、反-1,3-戊二烯、順-1,3-戊二烯、1,4- 戊二烯、1-戊烘、2-戊块、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲

基-1-丁块、戊-4 -烯T -媒、反-戊-3 -烯T -缺或順-戊-3- 烯-1-缺）。

應瞭解，在經歷本文所述之各種製程之後，本文所述之

生物異戊二烯組合物中非異戊二烯之組分將轉化成不同產

物。方法/製程中所用之金屬基催化劑對非異戊二烯之組

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分的敏感度視此等組分之性質及含量而不同。對於熱二聚

製程，將耐受較多化合物。在一些狀況下，非異戊二烯之

組分將與異戊二烯反應以製造加成物，例如甲基丙烯醛及

甲基乙烯基酮與異戊二烯進行狄爾斯-阿爾德反應以得到6 員產物。不飽和加成物可進一步氫化成於燃料成分及組合

物中存在之飽和衍生物，例如1,4-二甲基-1-（舞甲基）環己

烷及1 -（1-羚乙基）-4-甲基環己烷（參見流程XV）。

流程XV.源自Bioisoprene™之痕量雜質之實例

i）經氫化之狄爾斯-阿爾德加成物

1,4-二甲基-1-（経甲基）環己烷 1-（1-握乙基）-4-甲基環己烷

ii）烷煙

iii）醇

0H

2-丙醇

iv）酯

2-甲基丁烷

2-甲基-1-丙醇

乙酸乙酯

3-甲基戊烷

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在一些實施例中，在經歷根據本文所述之任何方法及製

程之步驟之後，燃料成分包含來自選自由以下組成之群之

化合物的產物：乙醇、丙酮、C5異戊二烯醇及具有10個或

1 0個以上碳原子之類異戊二烯化合物。在一些實施例中，

在經歷根據本文所述之任何方法及製程之步驟之後，燃料

成分包含一或多種來自一或多種選自由以下組成之群之化

合物的產物：乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、甲基丙烯醛、甲

基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基環氧乙烷、順-3-甲基-1,3- 戊二烯及反-3-甲基-1,3-戊二烯、C5異戊二烯醇（諸如3-甲

基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇）、2-庚酮、6-甲基-5- 庚烯-2-酮、2,4,5-三甲基嘔。定、2,3,5-三甲基。比嗪、香茅

醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1 -丙醇、雙乙醯、2-丁酮、2-甲

基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁

醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、異

丁酸乙酯、3-甲基-2- 丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3 -甲基丁

酯、乙酸3-甲基-3-丁烯-1-基酯、乙酸3-甲基-2-丁烯-1-基

酯、3-己烯-1-醇、乙酸3-己烯-1-基酯、檸檬烯、香葉醇

（反-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇）、香茅醇（3,7-二甲基-6- 辛烯-1-醇）、（E）-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、（Z）-3,7-二甲

基-1,3,6-辛三烯及2,3-環庚烯醇毗咤。在一些實施例中，

燃料成分包含一或多種選自由以下組成之群的化合物：

1,4-二甲基-1-（軽甲基）環己烷、1-（1-無乙基）-4-甲基環己

烷、2-甲基丁烷、3-甲基戊烷、2-丙醇、2-甲基-1-丙醇、

2-丁醇、3-甲基-1-丁醇、乙酸乙酯及乙酸3-甲基-1-丁酯。

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在一些實施例中，燃料成分包含一或多種選自由以下組成

之群的化合物：1,4-二甲基甲基）環 己烷、i-（i-無乙

基）-4-甲基環己烷、2-甲基丁烷、3-甲基戊烷、2-丙醇、2- 甲基-1-丙醇、2-丁醇、3-甲基-1-丁醇、乙酸乙酯及乙酸3- 甲基-1-丁酯，其含量大於或約為10 ppm ' 1 ppm、100 ppb、10 ppb 或 1 ppb °在一些實施例中，燃料成分包含一或多種選自由以下組

成之群的化合物：乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、甲基丙烯

醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基環氧乙烷、順-3-甲

基-1,3-戊二烯及反-3·■甲基-1,3-戊二烯、C5異戊二烯醇（諸

如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇）、2-庚酮、6- 甲基-5-庚烯-2-酮、2,4,5-三甲基。比。定、2,3,5-三甲基毗

嗪、香茅醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、雙乙醯、2-丁

酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3- 甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1- 丁醇、異丁酸乙酯、3 -甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3- 甲 基丁酯、乙酸3-甲基-3-丁烯-1-基酯、乙酸.3-甲基-2-丁

烯-1-基酯、3-己烯-1-醇、乙酸3-己烯-1-基酯、檸檬烯、

香葉醇（反-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇）、香茅醇（3,7-二甲

基-6-辛烯-1-醇）、（E）-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、（Z）-3,7- 二甲基-1,3,6-辛三烯及2,3-環庚烯醇。比咤，其含量大於或

約為 10 ppm、1 ppm、100 ppb、1 0 ppb或 1 ppb。

碳指紋分析

可基於雙重碳-同位素指紋分析將源自生物異戊二烯之

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BioIsoFuel與源自石化碳之燃料相區分。另外，可藉由雙

重碳-同位素指紋分析確定生物來源之碳（例如葡萄糖與甘

油）的特定來源（參見美國專利第7,169,588號，其以引用的

方式併入本文中）。

此方法適用於區分化學上相同之物質，且由生物圈（植

物）組分生長之來源（且可能為年份）來分配產物中之碳。同

位素14c及13（2帶來關於此問題之補充資訊。核半衰期為

5730年之放射性碳定年 同位素（“C）無疑允許在化石

（「死」）原料與生物圈（「活」）原料之間分配標本碳

［Currie, L. A. 「Source Apportionment of Atmospheric Particles j » Characterization of Environmental Particles, J. Buffle及 Η. P. van Leeuwen編，the IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series 之第 I 卷第 1 部分 （Lewis Publishers, Inc） （1992） 3 74］。放射性碳定年之基本假設為

大氣中Me濃度恆定使得活生物體中“C恆定。當處理分離

之樣品時，可由以下關係近似推斷出樣品年齡：t=（-5730/ 0.693）ln（A/Ao）（等式14），其中t=年齡，5730年為放射性碳

之半衰期，且A及Α。分別為樣品及現代標準之"C放射性比

度［Hsieh, Y., Soil Sci. Soc. Am J., 56, 460, （1992）］。然

而，由於自1950年起已進行大氣核測試且自1850年起已燃

燒化石燃料，"C已獲得第二地球化學時間特徵。20世紀

60年代中期，在核測試頂峰期"C於大氣CO2中且因此於活

生物圈中之濃度近似翻倍。此後，濃度已逐漸返回至約

1.2x10-“之穩態宇宙（大氣）基線同位素比率《//“ο ，近

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似鬆弛「半衰期」為7-10年。（此後一半衰期不得照字面意

義理解；實際上，自核時代開始起，吾人必須使用詳細的

大氣核輸入/衰變函數來追蹤大氣及生物圈"C之變化。）此

後一生物圈“C時間特徴提出每年對最新生物圈碳進行定

年之承諾。可由加速器質譜法（AMS）量測“C，結果以單位

「現代碳分數」（fM）給出。fM係由國家標準與技術研究院

（National Institute of Standards and Technology，NIST）標

準參考物質（Standard Reference Materials » SRM）4990B及

4990C定義，分別稱為草酸標準HOxI及HOxII。基本定義

涉及HOxI之14C/12C同位素比率之0.95倍（參考AD 1950）。

此約等效於經衰變修正之工業革命前木材。對於當前活生

物圈（植物物質），fM約為Μ °穩定的碳同位素比率（,3C/12C）提供來源判別及分配之補

充路徑。既定生物來源之物質中13C/12 C之比率為在將二氧

化碳固定時大氣二氧化碳中13C/12 C之比率的結果，且亦反

映確切代謝途徑。區域性變化亦存在。石油、C 3植物（闊

葉樹）、C4植物（草）及海相碳酸鹽在13C/12C及相應没3c值方

面皆顯示顯著差異。此外，分析發現C3及C4植物之脂質物

質與源自相同植物之碳水化合物組分之物質因代謝途徑而

不同。在量測精度內，“C因同位素分餾效應而顯示較大

變化，.對本發明而言最顯著之處為光合機制。植物中碳同

位素比率之差異的主要原因與植物中光合碳代謝途徑（尤

其在初級發化（亦即，初始固定大氣CO2）期間發生之反應）

之差異密切相關。兩大類植物為併有「」（或Calvin-

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Benson）光合循環之植物及併有「C4」（或Hatch-Slack）光合

循環之植物。諸如硬木及針葉樹之C3植物在溫帶氣候帶占

主導。在C3植物中，初級co2固定或發化反應涉及核酮

糖-1,5-二磷酸梭化酶，且第一穩定產物為三碳化合物。另

一方面，C4植物包括諸如熱帶草、玉米及甘蔗之植物。在

C4植物中，涉及另一種酶（磷酸烯醇-丙酮酸殺化酶）之另一

寇化反應為初級護化反應。第一穩定碳化合物為實質上脫

除發.基之四碳酸。由此釋放之C02係由C3循環再固定。

C4與C3植物均展現一定範圍之13C/,2C同位素比率，但典

型 值為約-10 至-14%o（per mil）（C4）及-2 1 至-26%o（C3）［Weber 等人，J. Agric. Food Chem., 45, 2942 （1997）］ ° 煤及石油

一般處於此後一範圍內。技C量測標度最初由皮狄組擬箭

石（pee dee belemnite，PDB）石 灰石設定為零來定義，其中

各值係以自此物質之千分率偏差給出。「513C j值為千分

率'縮寫成％。，且計算如下（等式15）：

（死三

（叱* ）標準

（也/叫χΙΟΟ% 等式 15)

由於PDB參考物質（RM）已耗竭，故已與IAEA、USGS、

NIST及其他所選國際同位素實驗室協同開發一系列替代性

RM。自PDB之％。偏差的記號為013C。藉由高精度穩定比率

質譜法（IRMS）對分子離子質量為44、45及46之CO?進行量

測。

對於源自石油精煉廠之C5流之萃取蒸餾的異戊二烯，

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”3c為約-22%。至約-24%。。此範圍為源自石油之輕質不飽

和煙之典型範圍，且源自基於石油之異戊二烯之產物通常

含有”3c相同之異戊二烯單元。由源於玉米之葡萄糖（513C 為-10.73%。）與最少量之其他含碳營養素（例如酵母提取物）

醱酵製造之生物異戊二烯可製得異戊二烯，其可聚合成

為-14.66%o至-14.85%。之聚異戊二烯。自該生物異戊二

烯製造之產物所預期之a"c值應比源自基於石油之異戊二

烯之產物具有較小負值。對於源自異丁烯與甲醛的反應之

異戊二烯，8"c值可為約-34.4%o，此係因為甲醛常常源自

具有負值大得多之”3c值的原料。

用來自利用生物可再生碳源之細胞培養物的異戊二烯製

成之本發明燃料及燃料成分可根據其”3c值及其他燃料特

徵如此加以鑑別。在一些實施例中，源自生物異戊二烯之

燃料成分的δ13ϋ值大於（負值小於）-22%ο。在一些實施例

中，源自生物異戊二烯之燃料成分的"3（3值大於-20、-18、

-16、-14 ' -12或-10%。。在一些實施例中，源自生物異戊

二烯之燃料成分的6"c值在-22至-10%。、-21至-12%。或-20 至-14%o之範圍內。在一些實施例中，源自生物異戊二烯

之燃料 成分的513C值在-34至-24%。、-34至-25%。、-33 至-25%。、-32 至-24%。、-32 至-25%。、-31 至-25%。、-30 至-29%o、-30.0 至-29.5%o、-29.5 至-28.5%。或-29.0 至-28.5%。

之範圍內。

在一些實施例中，源自生物異戊二烯之燃料成分包含放

射性碳-14。在一些實施例中，14C/12C比率大於或約為

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1.0x10-”、1.05x10-”、1.1X10-”、1.15x10-12 或 1 .2x10」2。

在一些實施例中，源自生物異戊二烯之燃料成分的fM值大

於或約為0.9、0.95、1.0、1.05或1.1。在一些實施例中，

源自生物異戊二烯之燃料成分的fM值大於或約為0.9 ' 0.95 ' 1.0 ' 1.05或1.1，且嵌3c值大於（負值小於）-22%。。在

一些實施例中，源自生物異戊二烯之燃料成分的fM值大於

或約為 0.9、0.95、1.0、1.05 或 1.1，且 013C 值 在-22 至-10%o ' -21至-12%o或-20至-14%o之範圍內。在一些實施

例中，源自生物異戊二烯之燃料成分的fM值大於或約為

0.9 ' 0.95 ' 1.0 ' 1.05 或 1.1，且嵌‘c 值在-3 4 至-24%。、-34 至-25%o、-33 至-25%。、-32 至-24%。、-32 至-25%。、-3 1 至-25%o、-30 至-29%。、-30.0 至-29.5%。、-29.5 至-28.5%。

或-29.0至-28.5%o之範圍內。

生物異戊二烯衍生物及相關BioIsoFuel、中間物及混合

物可整於14C（fM）及雙重碳-同位素指 紋分析 而與其石化來

源性對應物完全區分，指示新型目標組合物。

在一些實施例中，本發明之燃料成分的能量密度高於乙

醇。在一些實施例中，燃料成分增進燃料（例如基於石油

之燃料）之十六烷值。在一些實施例中，燃料成分減少基

於石油之燃料之排放。在一些實施例中，燃料組合物之辛

烷值在約80至約120之範圍內。在一些實施例中，燃料組

合物之十六烷值在約30至約130之範圍內。

在一些實施例中，本發明之燃料組合物包含一或多種二

甲基環辛烷化合物。在一些實施例中，本發明之燃料組合

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物包含一或多種C10煙，諸如經取代之環己烷。在一些實

施例中，本發明之燃料組合物包含一或多種本文所述之異

戊二烯衍生氧化物。在一些實施例中，本文所述之任何燃

料組合物均進一步包含基於石油之燃料，以絶燃料組合物

之總重量或總體積計，該基於石油之燃料之量為約1 %至

約95%(以重量計或體積計)。

本發明另外提供製造燃料組合物之方法，其包含獲得石

油餾出物及添加本發明之燃料成分。

本發明可藉由參考以下實例而進一步加以理解，該等實

例係作為說明而提供，且不欲作為限制。

實例

實例1 ：在表現重組野葛異戊二烯合成酶之大腸桿菌中製

造異戊二烯

I. 構築用於在大腸桿菌中表現野葛異戊二烯合成酶之

載體

野葛(山葛)異戊二烯合成酶基因(IspS)之蛋白質序列獲

自GenBank(AAQ84170)。針對大腸桿菌密碼子使用最佳化

之野葛異戊二烯合成酶基因購自DNA2.0(SEQ ID NO:1)。

藉由用3明LUllI/Fsfl進行限制性核酸內切酶分解而自供應

之質體中移出異戊二烯合成酶基因，經凝膠純化，且接合

至已用 Ncol/Pstl 分解之 pTrcHis2B (In vitro gen)中。設計構

築體，使得異戊二烯合成酶基因5,之終止密碼子在Fsfl位

點之前。因此，當構築體表現時，His標籤不連接於異戊

二烯合成酶蛋白。藉由定序來驗證所得質體pTrcKudzu(圖

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2及圖 3 ； SEQ ID N0:2)。

亦將異戊二烯合成酶基因選殖至pET16b(Novagen)中。

在此狀況下，將異戊二烯合成酶基因插入pET16b中，使得

重組異戊二烯合成酶蛋白含有N端His標籤。藉由使用引子

組 pET-His-Kudzu-2F : 5'-CGTGAGATCATATGTGTGCGAC CTCTTCTCAATTTAC(SEQ ID NO:49)及 pET-His-Kudzu- R : 5'-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAG CTG(SEQ ID NO:50)進行 PCR 而自 pTrcKudzu 擴增異戊二烯

合成酶基因。分別在基因之5'末端之Nd e I位點處及3'末端

之BamYL 1位點處添加此等引子。使用上述質體pTrcKudzu 作為模板DNA，根據製造商之說明書使用Herculase聚合酶

(Stratagene)，且以10 pMol之濃度添加引子。以25卩1之總

體積進行PCR。用Ndel/BamH 1分解PCR產物且將其選殖至

經相同酶分解之pET16b中。將接合混合物轉型至大腸桿菌

Topi 0 (Invitrogen)中且藉由定序選擇正確純系。所得質體

命名為 pETNHisKudzu(圖 4及圖 5 ； SEQ ID NO:51)，其 中

野葛異戊二烯合成酶基因自T7啟動子開始表現。

亦將野葛異戊二烯合成酶基因選殖至低複本數質體

pCL1920中。使用引子自上述pTrcKudzu擴增野葛異戊二烯

合成酶基因。前置引子將HindHI位點及大腸桿菌共同RBS 添加至5'末端。尸sfl選殖位點已存在於pTrcKudzu中緊鄰终

止密碼子之3'處，由此構築反置引子以使得最終PCR產物

包括 Fsfl 位點。引子序列為：HindIII-rbs-Kudzu F : 5'- CATATGAAAGCTTGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAAC

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C（SEQ ID N0:5 1）及 BamHl-Kudzu R :5'-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGC

TG（SEQ ID NO:50）。使用Herculase聚合酶，以濃度為10 pmol之引子及1 ng模板D NA（pTrcKudzu）擴增PCR產物。擴

增方案包括30次循環（95°C下持續1分鐘，60°C下持續1分

鐘，72°C下持續2分鐘）。用ΗΐηάΠΙ及戸sH分解產物且將其

接合至亦已用HindlH及FsH分解之pCL192 0中。將接合混

合物轉型至大腸桿菌Top 10中。藉由定序檢查若干轉型

體。所得質體命名為pCL-lac-Kudzu（圖6及圖7 ； SEQ ID NO:4）。

II.測定異戊二烯產量

對於震盪燒瓶培養，將1 ml培養物自震盪燒瓶轉移至20 ml CTC頂部 空 間 小瓶（Agilent小瓶目錄號5 188 2753 ；瓶蓋

目錄號5188 2759）中。將瓶蓋旋緊，且在等效溫度、以250 rpm震盪下培育小瓶。30分鐘後，自培育箱移出小瓶且如

下所述進行分析（關於此檢驗之一些實驗值，參見表1）。

在測定醱酵槽中異戊二烯產量之狀況下，自醱酵槽之釋

出氣體獲取樣品且如下所述直接進行分析（關於此檢驗之

一些實驗值，參見表2）。

使用與 CTC Analytics（Switzerland）CombiPAL 自動取樣器

相接且以頂部空間模式操作之Agilent 6890 GC/M S系統進

行分析。使用 Agilent HP-5MS GC/MS 管柱（30 mx0.25 mm ； 0.25 |im膜厚度）分離分析物。設置取樣器以注射500 |iL頂部空間氣體。GC/MS方法利用気作為載氣，流速為1

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ml/min °保持注射口在2 50 °C下，分流比為50:1 °歷經2分

鐘之分析持續時間'保持烘箱溫度為37°C。以m/z為67之

單離子監測(SIM)模式操作Agilent 5793N質量選擇偵測

器。自1.4分鐘至1.7分鐘切斷偵測器以允許永久氣體溶

離。在此等條件下，觀測到異戊二烯(2-甲基-1,3-T二烯)

在1.78分鐘時溶離。使用校準表來定量異戊二烯之絕對

量，且發現自1卩g/L至70,000卩g/L呈線性。使用 此 方法估

算偵測限度為50至1 00 ng/L。

III.在含有表現重組異戊二烯合成酶之大腸桿菌細胞之震

盪燒瓶中製造異戊二烯

將上述載體引入大腸桿菌菌株BL21(Novagen)中以製造菌株

BL21/ptrcKudzu、BL21/pCL-lac-Kudzu 及 BL21/pETHisKudzu。

塗佈菌株使其分離於LA(魯利亞瓊脂(Luria agar))+發节青

黴素(50卩g/ml)上，且在37°C下培育隔夜。將單一群落接

種至含有20 ml魯利亞-貝爾塔尼培養液(LB)及綬节青黴素

(100 pg/ml)之250 ml擋板式震盪燒瓶中。在20°C、以200 rpm震盪下使培養物生長隔夜。量測隔夜培養物之OD6oo，

且將培養物稀釋至含有30 ml MagicMedia(Invitrogen)+矮.

芾青黴素(100 μg/ml)之250 ml擋板式震盪燒瓶中直至ODgoo

達到 約0.05。在30°C、以200 rpm震盪下培育培養物。當

OD60ο 為約 0.5-0.8 時，添加 400 μΜ IPTG，且在 30°C、以

200 rpm震盪下再培育細胞6小時·。在用IPTG誘導後0、2、

4及6小時，收集培養物之1 ml等分試樣，測定ODgoo '且

如上所述量測所製造之異戊二烯之量。結果展示於圖8

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中ο

IV.以14公升醱酵自BL21/ptrcKudzu製造異戊二烯

自批式補料培養物測定含有重組野葛異戊二烯合成酶基

因之大腸桿菌大規模製造之異戊二烯。關於酸酵培養基

(TM2)，毎公升醱酵培養基的配方如下：K2HPO4 13.6 g、

KH2PO4 13.6 g ' MgSO4*7H 2O 2 g、單水合檸檬酸2 g、檸

檬酸鐵鉄0.3 g、(NH4)2SO4 3.2 g '酵母提取物5 g ' ΙΟΟΟχ 改質痕量金屬溶液1 ml。所有組分一起添加且溶解於去離

子水(diH2O)中。用氫氧化鉀(KOH)將pH值調整至6.8且補

足體積。用0.22卩過濾器(僅採用過濾器，而非高壓滅菌

器)對最終產物進行過濾滅菌。ιοοοχ改質痕量金屬溶液之

配方如下：單水合檸檬酸40 g ' MnSO4*H 2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4*7H 2O 1 g、CoC12*6H 2O 1 g、ZnSO4*7H 2O 1 g、CuSO4*5H 2O 100 mg、H3BO3 100 mg、NaMoO4*2H 2O 100 mg o將各組分逐一溶解於去離子水中，用HCl/NaOH 將pH值調整至3.0，接著補足體積，且用0.22卩過濾器進行

過濾滅菌。

在14 L生物反應器中進行此實驗以監測在醱酵所要之pH 6.7及溫度34°C下自葡萄糖形成異戊二烯之情況。在大豆腺

(soytone)-酵母提取物-葡萄糖培養基中製備自冷凍小瓶中

獲取之大腸桿菌菌株BL21/ptrcKudzu之接種體。在接種體

生長至ΟD55o=O・6之後»對兩個600 ml燒瓶進行離心，且使

內含物再懸浮於70 ml_L清液中以將細胞顆粒(70 ml物質，

OD 3.1)轉移至生物反應器中。在接種後之多個時間，移

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出樣品且如上所述測定所製造之異戊二烯之量。結果展示

於圖9中。

實例2：在表現重組楊屬異戊二烯合成酶之大腸桿菌中製

造異戊二烯

楊屬（銀白楊與歐洲山楊雜交種）異戊二烯合成酶之蛋白

質序列（Schnitzler, J-P 等人，（2005） 0α”站 222:777-786）獲

自GenBank（CAC35696）。針對大腸桿菌進行 密碼子 最佳化

之基因購自 DNA2.0（p9796-poplar，圖 30及圖 3 1 : SEQ ID NO:14） °藉由用BspLVWI/PstI進行 限制 性核 酸內切 酶分解

而自供應之質體中移出異戊二烯合成酶基因，經凝膠純

化，且接合至已用NcoX/PstI分解之pTrcHis2B中。選 殖構

築體，使得插入物中之終止密碼子在Fsfl位點之前 > 從而

得到His標籤不連接於異戊二烯合成酶蛋白之構築體。藉

由定序來驗證所得質體pTrcPoplar（圖32及圖33 ； SEQ ID NO:15）。

實例2B：證實來自若干楊屬異戊二烯合成酶之異戊二烯合

成酶活性

檢查以下異戊二烯合成酶：銀白楊（寄存編號

BAD98243 ；圖 13 7A及 B ； SEQ ID NO:30）、黑楊（寄存編號

CAL69918 ；圖 13 7（2及。；SEQ ID NO:31）、美洲山楊（寄存

編號 AAQ16588 ；圖 137E、F及 G ； SEQ ID NO:32-33）、毛

果楊（寄存編號 ACD70404 ；圖 137H 及 I ； SEQ ID NO:34）、

銀白楊與歐洲山楊雜交種（寄存編號CAJ29303 ；圖137J及

K ； SEQ ID NO:35）及 MCM112-Kudzu。

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pET24Kudzu(亦稱作MCM112)如下構築：將野葛異戊二

烯合成酶基因自pCR2.1載體(Invitrogen)次選殖'至pET24d 載體(Novagen)中。使用引子 MCM50 5'-GATCATGCATTCG CCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGTGTGCGACCTCTTCTC AATTTACT(SEQ ID NO:52)及 MCM53 5'-CGGTCGACGG ATCCCTGCAG TTAGACATAC ATCAGCTG(SEQ ID NO:50) 自pTrcKudzu模板DNA擴增野葛IspS基因。使用Taq DNA聚

合酶(Invitrogen)進行PCR反應，將所得PCR產物選殖至

pCR2.1-TOPO TA選殖載體(Invitrogen)中，且轉型至大腸

桿菌Top 1 0化學性勝任細胞(Invitrogen)中。將轉型體塗於

含有蔻节青黴素(50 gg/ml)之L瓊脂上，且在37°C下培育隔

夜。用單一轉型體接種含有50 pig/ml梭节青黴素之5 ml魯

利亞培養液培養物5且在3 7°C下生長隔夜。藉由對自1 ml 液體培養物(魯利亞培養液)分離之質體DNA進行定序而針

對正確插入物篩選五個群落，且使用QIAprep Spin Miniprep套組(Qiagen)進行純化。命名為MCM93之所得質

體於pCR2.1骨架中含有野葛IspS編碼序列(圖137L)。

MCM93之序 列(SEQ ID NO:3 6)展 示於圖137M及N中。

藉由用Fez!及BawHl (Roche)進行限制性核酸內切酶分解

來移出野葛編碼序列，且使用QIAquick凝膠萃取套組

(Qiagen)進行凝膠純化。用Ncol及BamHI(Roche)分解

pET24d載體DNA，用 蝦鹼性磷酸酶(Roche)處理，且使用

QIAprep Spin Miniprep套組(Qiagen)進行純化。使用快速

DNA接合套組(Roche)將野葛IspS片段接合於經

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NcoUBamH\分解之pET24d，片段與載體之比率為5:1，總

體積為20卩1。將一部分接合混合物(5卩1)轉型至大腸桿菌

Top 10化學性勝任細胞中'且塗於含有康黴素(50卩g/ml) 之L瓊脂上。藉由定序確認正確轉型體，且將其轉型至化

學性勝任BL21(XDE3)pLysS細胞(Novagen)中。在37°C下生

長隔夜後'於含有康黴素(50 μg/ml)之L瓊脂上選擇單一群

落。命名為pET24D-Kudzu之所得質體之圖譜展示於圖

1370 中。pET24D-Kudzu 之序列(SEQ ID NO:37)展示於圖

137P及Q中。

對於美洲山楊、銀白楊、黑楊及毛果楊'選殖至pET24a 表現載體(Novagen)中之針對大腸桿菌最佳化之異戊二烯

合成酶基因係購自DNA2.0(Menlo Park, CA) °合成葉綠體

轉運肽序列經移除之基因，從而表現成熟蛋白°

野葛異戊二烯合成酶之構築體在此實例中用作對照。將

質體轉型至大腸桿菌表現宿主BL21(DE3)plysS中‘且使轉

型體於0.6 ml TM3培養基中生長。TM3培養基之配方如

下:K2HPO4(13.6 g/1)、KH2PO4(13.6 g/1)、MgSO4*7H 2O(2 g/L)、單水合檸檬酸(2 g/L)、檸檬酸鐵鉉(0.3 g/L)、

(NH4)2SO4(3.2 g/L)、酵母提取物(0.2 g/L)、1 ml ΙΟΟΟχ 痕

量元素溶液，用氫氧化鉉將pH值調整至6.8 '用無菌去離

子水補足體積，且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌°

1000X痕量元素溶液之配方如下：單水合檸檬酸(40 g/L)' MnSO4*H 2O(30 g/L)、NaCl(10 g/L)、FeSO4*7H 2O(l g/L)、

CoC12*-6H 2O(1 g/L)、ZnSO4*7H 2O(l g/L)、CuSO4*5H 2O(l00

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mg/L）、H3BO3（ 1 00 mg/L）、NaMoO4*2H2O（ 100 mg/L）。將

各組分逐一溶解於去離子水中，用HCl/NaOH將pH值調整

至3.0,補足體積，且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌。

用400 μΜ IPTG誘導培養物，且繼續生長至ODgoo為約

5。將培養物之等分試樣轉移至深孔玻璃板中，且用鋁板

密封件將孔密封。在25°C、以450 rpm震盪下培育該板30 分鐘。藉由將溫度升至70°C，持續5分鐘而使反應熱滅

活。藉曲如實例1部分II中所述之GCMS方法量測全細胞頂

部空間氣體。

自以類似方式生長之培養物獲得Km值，但收集細胞且由

冷凍/解凍溶菌酶方案溶解。將體積為400卩L之培養物轉

移至新的96孔板（Perkin Elmer，目錄號6008290）中，且藉

由於Beckman Coulter Allegra 6R離心機中 以25 00 xg離心來

收集細胞。將顆粒再懸浮於200 mL低滲緩衝液（5 mM MgCl2，5 mM Tris HC1，5 mM DTT，pH 8.0）中，且

在-80°C下將該板冷凍最少60分鐘時間。藉由解凍該板且

添加32 mL異 戊二烯 合成酶DMAPP檢驗 緩衝液（57 mM Tris HC1 ' 19 mM MgCl2、74 mg/mL DNase I（Sigma，目錄號

DN-25） 、2.63 χ 105 U/mL ReadyLyse 溶菌 酶溶液

（Epicentre »目錄號Rl 802M ）及5 mg/m L分子 生物級BSA）來

製備細胞溶菌液。在25°C、震盪下將板培育30分鐘，接著

置於冰上。將DMAPP及溶菌液以所要濃度添加至密封深

孔玻璃磚中以進行上文所述之全細胞頂部空間氣體檢驗。

使反應進行1小時，接著由上文所述之加熱步驟而終止，

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且亦如所述量測頂部空間氣體活性。

在一替代方法中，自以25 mL體積培養且如上所述以類

似方式誘導之細胞量測酶活性。藉由離心收集細胞，且藉

由在由 50%甘油以 1:1 與 20 mM Tris/HCl(pH 7.4)、20 mM MgCl2 ' 200 mM KC1、1 mM DTT混合而組成之緩衝液中

進行弗 氏壓碎(French press)來溶解顆粒。在含有75卩L檢

驗 緩衝液(66.6 mM Tris/HCl(pH 8)、6.66 mM DMAPP、43 mM MgCl2)之2 mL螺旋蓋小瓶中檢驗體積為25卩L之溶菌

液的異戊二烯合成酶活性。在30°C下培育反應物1 5分鐘，

且藉由經小瓶隔板添加1 00卩L 250 mM EDTA而淬滅。藉

由如實例1部分II中所述之GC/MS來量測異戊二烯。

所有測定活性之方法均顯示源自純種楊之楊屬酶比楊屬

［銀白楊與歐洲山楊雜交種］高數倍。圖138及圖139分別展

示全細胞頂部空間氣體檢驗及DMAPP檢驗之此等結果，

且今人驚訝地指示來自黑楊(P· nigra)、美洲山楊(P. tremuloides} ' 毛果楊(P trichocarpa)及銀白楊(P alba}之

酶的活性皆顯著高於雜交體［銀白楊與歐洲山楊雜交種］。

DMAPP檢驗如下進行：將體積為400卩L之培養物轉移至

新的96孔板(Perkin Elmer，目錄號6008290)中，且藉由於

Beckman Coulter Allegra 6R離心機中以2500xg離心來收集

細胞。將顆粒再懸浮於200 mL低滲緩衝液(5 mM MgCl2，5 mM Tris HCI，5 mM DTT，pH 8.0)中，且在-80°C下將該

板冷凍最少60分鐘時間。藉由解凍該板且添加32 mL異戊

二烯合成酶DMAPP檢驗緩衝液(57 mM Tris HCI、19 mM

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MgCl2、74 mg/mL DNase I（Sigma，目錄號 DN-25）、

2.63 x 1 05 U/mL ReadyLyse 溶 菌 酶溶液（Epicentre，目 錄號

R1802M）及5 mg/mL分子生物級BSA）來製備細胞溶菌液。

在25°C、震盪下將板培育30分鐘，接著置於冰上。為製造

異戊二烯，將80 mL溶菌液等分試樣轉移至96孔深孔玻璃

板（Zinsser ＞目錄號3 600600）中，且添加10 mM DMAPP於

100 mM KHPO4（pH 8.2）（Cayman Chemical，目 錄號 63 180） 中之20 mL溶液。用鋁板密封件（Beckman Coultor，目錄號

538619）密封該板，且在30°C、震盪下培育60分鐘。藉由

加熱玻璃磚（70°C下持續5分鐘）來終止酶促反應。如實例1 部分II中所述定量分析各孔之細胞頂部空間氣體。

銀白楊、美洲山楊、毛果楊之異戊二烯合成酶活性顯著

高於野葛。在所有測試酶中，來自銀白楊之酶以最高活性

表現。與全細胞頂部空間氣體檢驗相比，以細胞溶菌液所

觀測到之較高活性可能歸因於DMAPP方面的限制，

DMAPP為此等酶之受質，由細胞之內源去氧木酮糖5-磷酸

（DXP）途徑傳遞。

Km動力學參數對於測定該值之所有酶而言經量測為約2 至 3 mM °實例3：在表現重組野葛異戊二烯合成酶之檸檬泛菌中製

造異戊二烯

將實例1所述之pTrcKudzu及pCL-lac Kudzu質體電穿孔

至檸檬泛菌中（美國專利第7,241,587號）。分別在含有梭卒

青黴素（200 μg/ml）或壯觀黴素（spectinomycin）（5 0 gg/ml）之

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LA_L選擇轉型體。如實例1中針對表現重組野葛異戊二烯

合成酶之大腸桿菌菌株所述，自震盪燒瓶製造異戊二烯且

測定所製造之異戊二烯之量。結果展示於圖10中。

實例4：在表現重組野葛異戊二烯合成酶之枯草桿菌中製

造異戊二烯

I. 構築供野葛異戊二烯合成酶表現用之枯草桿菌複製

質體

在叩"啟動子控制下，使用複製質體(具有氯黴素抗性

卡匣之pBS 19)於枯草桿菌aprEnprE Pxyl-comK菌株

(BG3594comK)中表現野葛異戊二烯合成酶基因。使用PCR 獨立地擴增異戊二烯合成酶基因 ' 叩尸E啟動子及轉錄終止

子，且將其融合。接著將構築體選殖至PBS19中且轉型至

枯草桿菌中。

a) 擴增叩尸E啟動子

使用以下引子自枯草桿菌之染色體DNA擴增aprE馭動

子：

叩尸Ε啟動子Mfel之CF 797 (+)起始端

5,- GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (SEQ ID NO:53)

CF 07-43 (-)融合叩rE啟動子與野葛ispS5，- ATrGAGAAGAGGTCGCACACACTCTTTACCCTCTCCTTTTA (SEQ ID NO:54)

b) 擴增異戊二烯合成酶基因

自質體pTrcKudzu(SEQ ID NO:2)擴增野葛異戊二烯合成

酶基因。該基因已針對大腸桿菌進行密碼子最佳化且由

DNA 2.0合成。使用以下引子：

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CF 07-42 (+)融合aprE啟動子與野葛異戊二烯合成酶基因

(GTG起始密碼子)

5'- TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT (SEQ ID NO:55)

CF 07-45 (-)融合野葛異戊二烯合成酶基因之3,末端與终止子

5，- CCAAGGCCGGrmTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (SEQ IDNO:56)

C) 擴增轉錄终止子

使用以下引子，自先前定序之質體pJHPms382擴增解澱

粉桿菌｛Bacillus amyliquefaciens｝的鹼性絲胺酸蛋白 酶之终

止子。

CF 07-44 (+)融合野葛異戊二烯合成酶之3,末端與终止子

5'- GAITAACCAGCTGATGTATGTCTAAAAAAAACCGGCCTTGG (SEQ ID NO:57)

解澱粉桿 菌 終止子(BamHI)之CF 07-46 (-)末端

5'- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO:58)

使用PCR，用以下引子將野葛片段與終止子片段融合：

CF 07-42 (+)融合叩尸E啟動子與野葛異戊二烯合成酶基因

(GTG起始密碼子)

55- TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT (SEQ ID NO:55)

解澱粉桿菌 終止子(BamHI)之CF 07-46 (-)末端

5'- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO:58)

使用PCR，用以下引子將野葛终止子片段與啟動子片段

融合：

αρ对;啟動子Mfel之CF 797 (+)起始端

5、GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (SEQ ID NO:53)

解澱 粉桿菌终止子(BamHI)之CF 07-46 (-)末端

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5'- GACATGACGGATCCGAITACGAATGCCGTCTC (SEQ IDNO:58)

使用Qiagen套組純化融合PCR片 段，且用限制性酶欧I 及BamHI分解。使用Qiagen套組對此經分解之DNA片 段進

行凝膠純化，且接合至已用EcoRI及BamHI分解且經凝膠

純化之載體(稱為pBS19)。

將接合混合物轉型至大腸桿菌Top 1 0細胞中，且在

LA+50梭节青黴素板上選擇群落。選擇總共六個群落，且

在LB + 50覆苯青黴素中生長隔夜，接著使用Qiagen套組分

離質體。用£coRI及BamHI分解該等質體以檢查插入物，

且遞呈三個正確質體以供以下引子定序：

αρ尸E啟動子之CF 149 ( + ) EcoRI起始端

5'- GACATGAATTCCTCCATITTCTTCTGC (SEQ ID NO:59)

pXX 049中之CF 847 (+)序列(叩仔啟動子之末端)

5'- AGGAGAGGGTAAAGAGTGAG (SEQ ID NO:60)

CF 07-45 (-)融合野葛異戊二烯合成酶之3,末端與終止子

5，- CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (SEQ ID NO:56)

野葛異戊二烯合成酶之CF 07-48 (+)定序引子

5，CTTTTCCATCACCCACCTGAAG (SEQ ID NO:61)

野葛異戊二烯合成酶中之CF 07-49 (+)定序引子

5'- GGCGAAATGGTCCAACAACAAAATTATC (SEQ IDNO:62)

藉由定序判定命名為pBS Kudzu #2之質體(圖52及圖

12 ； SEQ ID NO:5)為正確的，且將其轉型至BG 3594 comK( 一種枯草桿菌宿主菌株)中。在LA+5氯黴素板上進

行選擇。轉型體在LA+5氯黴素上選擇且導向單一群落，

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接著於LB + 5氯黴素中生長直至其OD6oo達到1·5為止。

在-80°C下，於甘油存在下，將其冷凍儲存於小瓶中。所

得菌株命名為CF 443 °II. 在含有表現重組異戊二烯合成酶之枯草桿菌細胞之震

盪燒瓶中製造異戊二烯

用來自LA+氯黴素（Cm，25 μg/ml）之CF 443之單一群落

接種隔夜培養物。在37°C、以200 rpm震盪下，使培養物

於LB + Cm中生長。使用此等隔夜培養物（1 ml）接種含有25 ml Grants II培養基及氯黴素之250 ml擋板式震盪燒瓶，最

終濃度為25 μg/ml ° Grants II培養基配方為10 g大豆月東、3 ml 1 Μ Κ2ΗΡΟ4 ' 75 g 葡萄糖、3.6 g 尿素、100 ml lOxMOPS，用 H2O補 足至 1 L，pH 7.2 ； lOxMOPSg己方 為

83.72 g MOPS、7.17 g三（舞 甲基）甲 基甘胺 酸（tricine）、12 g KOH顆粒、10 ml 0.276 M K2SO4溶液、10 ml 0.528 Μ MgCl2溶液、29.22 g NaCl、100 ml 100x微量營養素，用

H2O補足至1 L ；且lOOx微量營養素配方為1.47 g CaCl2*2H 2O、0.4 g FeSO4*7H 2O、0.1 g MnSO4*H 2O、0.1 g ZnSO4*H 2O、0.05 g CuC12*2H 2O、0.1 g CoC12*6H 2O、

0.1 g Na2MoO4*2H 2O，用H?。補足至1 L。在3 7°C下培育震

盪燒瓶，且在1 8、24及44小時獲取樣品。在18小時，對

CF443及對照菌株之頂部空間氣體進行取樣。此表示異戊

二烯之1 8小時積累情況。如實例1所述，藉由氣相層析測

定異戊二烯之量。異戊二烯產量藉由表現重組異戊二烯合

成酶而顯著提高（圖11）。

149050.doc -273 ·

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III. 以14 L醱酵由CF443製造異戊二烯

自批式補料培養物測定於複製質體上含有重組野葛異戊

二烯合成酶基因之枯草桿菌大規模製造之異戊二烯。藉由

在含有大豆粉(Cargill)、磷酸錦及磷酸鉀、硫酸鎂、及檸

檬酸、氯化鐵及氯化鎰之溶液的營養素培養基中進行習知

批式補料醱酵來培養表現野葛異戊二烯合成酶基因之桿菌

菌株CF 443或不表現野葛異戊二烯合成酶基因之對照菌

株。在醱酵之前，使用包括纖維素酶、半纖維素酶及果膠

酶之酶混合物浸漬培養基90分鐘(參見WO 95/041 34) °用

60% wt/wt 葡萄糖(Cargill DE99 右旋糖、ADM Versadex greens 或 D anisco 轉化糖)及 99% wt/wt 油(Western Family 大

豆油，其中99% wt/wt為添加至細胞培養基中之前油的濃

度)對14 L分批醱酵進行補料。當批料中之葡萄糖不可偵

測時，開始補料。補料速率經數小時均勻變化，且加以調

整以在等碳基礎上添加油。使用28% w/v氫氧化4安將pH值

控制在6.8-7.4。在起泡之狀況下，將消泡劑添加至培養基

中。將醱酵溫度控制在37°C且以750 rpm攪動醱酵培養

物。在整個過程中監測多個其他參數，諸如pH值、

DO%、氣流及壓力。維持DO%高於20。經36小時時程獲

取樣品且分析細胞生長(OD550)及異戊二烯產量。此等實驗

之結果呈現於圖53A及圖53B中。

IV. 將野葛異戊二烯合成酶(ispS)整合於枯草桿菌中

在叩,E啟動子控制下，將野葛異戊二烯合成酶基因選殖

於整合質體(pJHIOl-cmpR)中。在測試條件下，未偵測到

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異戊二烯。

實例5：在木黴屬中製造異戊二烯

I. 構築用於在里氏木黴中表現野葛異戊二烯合成酶之

載體

由DNA 2.0合成針對解脂耶氏酵母進行密碼子最佳化之

野葛IS基因(SEQ ID NO:6)(圖13)。此質體充當以下PCR擴

增反應之模板：1卩1質體模板(20 ng/μΐ)、1卩1引子EL- 945(10 卩M)5，-GCTTATGGATCCTCTAGACTATTACACGTAC ATCAATTGG(SEQ ID NO:63)、1 卩1 引子 EL-965(10 μΜ)5'- CACCATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTAC(SEQ ID NO: 64)、1 μΐ dNTP(10 mM)、5 μΐ lOxPfuUltra II 融合 HS DNA 聚合酶緩衝液、1 μΐ PfuUltra II融合HS DNA聚合酶、40 μΐ 水，總反應體積為50 μΐ °前置引子之5,末端含有其他4個

核昔酸，其不對應於針對解脂耶氏酵母(* lipolytica)進行

密碼子最佳化之野葛異戊二烯合成酶基因，但為選殖至

pENTR/D-TOP Ο載體中所必需。反置引子之5'末端含有其

他2 1個核昔酸，其不對應於針對解脂耶氏酵母進行密碼子

最佳化之野葛異戊二烯合成酶基因，但經插入以供選殖至

其他載體骨架中。使用MJ Research PTC-200溫度循環器， 如下進行PCR反應：95°C下持續2分鐘(僅第一次循環)、

95°C下持續30秒、55°C下持續30秒、72°C下持續3 0秒(重複

27次循環)、最後一次循環後於72°C下持續1分鐘。在1.2% E-gel上分析PCR產物以確認針對解脂耶氏酵母進行密碼子

最佳化之野葛異戊二烯合成酶基因成功擴增。

149050.doc - 275 -

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接著遵循製造商之方案，使用以下TOPO pENTR/D- TOPO選殖套組選殖PCR產物：1 μΐ PCR反應物、1卩1鹽溶

液、1卩1 TOPO pENTR/D-TOP0載體及3卩1水，總反應體積

為6卩1。在室溫下培育反應物5分鐘。將1微升TOPO反應物

轉型至TOP1(H匕學性勝任大腸桿菌細胞中。在LA+50 卩g/ml康黴素板上選擇轉型體。揀選數個群落，且將各群

落接種至含有LB + 50 pig/ml康黴素之5 ml管中，且在37°C、

以200 rpm震盪下使培養物生長隔夜。遵循製造商之方

案，使用QIAprep Spin Miniprep套組自隔夜培養管中分離

質體。對數個質體進行定序以驗證DNA序列為正確的。

編碼針對解脂耶氏酵母進行密碼子最佳化之野葛異戊二

烯合成酶基因之單一 pENTR/D-TOPO質 體用於Gateway選

殖至定製pTrex3g載體中。pTrex3g之構築描述於WO 2005/001036 A2 中。遵循製造商關於 Gateway LR Clonase II酶混合套組(Invitrogen)之方案進行反應：1卩1針對解脂

耶氏酵母進行密碼子最佳化之野葛異戊二烯合成酶基因

pENTR/D-TOPΟ供體載體、1 μΐ pTrex3g 目的載體、6 μΐ ΤΕ緩衝液，pH 8.0，總反應體積為8卩1。在室溫下培育反

應物1小時，接著添加1卩1蛋白酶K溶液5且在37°C下繼續

培育10分鐘。接著將1卩1反應物轉型至TOP104匕學性勝任

大腸桿菌細胞中。在LA+50 |ig/ml發节青黴素板上選擇轉

型體。揀選數個群落，且將各群落接種至含有LB + 50 pig/ml梭节青黴素之5 ml管中，且在3 7°C、以200 rpm震盪

下使培養物生長隔夜。遵循製造商之方案，使用QIAprep

149050.doc -276-

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Spin Miniprep套組(Qiagen, Inc.)自隔夜培養管中分離質

體。對數個質體進行定序以驗證DNA序列為正確的。

使用基因槍PDS-1000/HE粒子傳遞系統將針對解脂耶氏

酵母進行密碼子最佳化之野葛異戊二烯合成酶pTrex3g質

體(圖14)以基因槍技術轉型至四重缺失之里氏木黴菌株中

(參見 W0 2005/001036 A2)。使用專利公開案 WO 2005/001036 A2之實例11中所列之方案來分離穩定轉型體

及評估震盪燒瓶。

II. 在重組里氏木黴菌株中製造異戊二烯

將上述異戊二烯合成酶轉型體之1 ml老培養物(15小時及

36小時)轉移至頂部空間小瓶中。密封小瓶且在30°C下培

育5小時。量測頂部空間氣體且由實例1所述之方法鑑別異

戊二烯。兩個轉型體顯示痕量異戊二烯。可藉由培育14小

時來增加異戊二烯之量。兩個陽性樣品顯示歷經14小時培

育，異戊二烯之含量為約0.5卩g/L。未轉型之對照顯示異

戊二烯之含量不可偵測。此實驗顯示當向里氏木黴供給外

源異戊二烯合成酶時，其能夠自內源前驅物製造異戊二

烯。

實例6：在耶氏酵母屬中製造異戊二烯

I. 構築用於在解脂耶氏酵母中表現野葛異戊二烯合成酶

之載體

構築用於在解脂耶氏酵母中表現野葛異戊二烯合成酶基

因之載體的起點為載體pSPZl(MAP29Spb)。此載體之完整

序列(SEQ ID NO:7)展示於圖15中。

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藉由使用解脂耶氏酵母菌株GICC 120285之染色體DNA作為模板進行PCR來擴增以下片段：無啟動子形式之

URA3基因、18S核糖體RNA基因之片段、解脂耶氏酵母

XPR2基因之轉錄終止子，及兩個含有XPR2及ICL1基因之

啟動子的D NA片段。使用以下PCR引子：

ICL1 355- GGTGAATTCAGTCTACTGGGGATTCCCAAATCTATATATACTGCAGGTGAC (SEQ IDNO:65)

ICL1 55，- GCAGGTGGGAAACTATGCACTCC (SEQ ID NO:66)

XPR 35'- CCTGAATTCTGTTGGATTGGAGGATTGGATAGTGGG (SEQ ID NO:67)

XPR 55'- GGTGTCGACGTACGGTCGAGCTTATTGACC (SEQ ID NO:68)

XPRT355- GGTGGGCCCGCATTTTGCCACCTACAAGCCAG (SEQ ID NO:69)

XPRT 55'- GGTGAATTCTAGAGGATCCCAACGCTGTTGCCTACAACGG (SEQ ID NO:70)

Y18S35;- GGTGCGGCCGCTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCG (SEQ ID NO:71)

Y18S 55'- GGTGGGCCCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAG (SEQ ID NO:72)

YURA35'- GGTGACCAGCAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGG (SEQ ID NO:73)

YURA 50

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5'- GGTGCGGCCGCCTTTGGAGTACGACTCCAACTATG (SEQ ID NO:74)

YURA 515'- GCGGCCGCAGACTAAATTTATTTCAGTCTCC (SEQ ID NO:75)

對於PCR擴增，按照 製造商之說明書使用PfuUltrall聚合

酶(Stratagene)、供應商提供之緩衝液及dNTP、2.5 μΜ引

子及指定模板DNA。使用以下循環進行擴增：95°C下持續

1分鐘；34次(95°C下持續30秒；55°C下持續30秒；72°C下

持續3分鐘)；及72°C下持續10分鐘，接著在4°C下培育。

由DNA 2.0獲得編碼針對耶氏酵母中之表現進行密碼子

最佳化之野葛異戊二烯合成酶基因的合成DNA分子(圖

16 ； SEQ ID NO:8)。在XPR2及ICL1啟動子控制下載運合

成野葛異戊二烯合成酶基因之質體pYLA(KZl)及pYLI (KZ1)之構築流程的全部細節分別呈現於圖18中。亦構築

對照質體，其中插入交配因子基因(MAP29)來替代異戊二

烯合成酶基因(圖18E及圖18F) ο可使用類似選殖程序表現楊屬(銀白楊與歐洲山楊雜交

種)異戊二烯合成酶基因。楊屬異戊二烯之序列描述於

Miller B.等人(2001) Planta 213, 483-487 中，且展示於圖

17中(SEQ ID NO:9)。產生在XPR2及ICL 1啟動子控制下載

運合成楊屬異戊二烯合成酶基因之質體pYLA(POPl)及

pYLI(POPl)的構築流程分別呈現於圖18 A及圖18B中。

II. 由重組解脂耶氏酵母菌株製造異戊二烯

用 SacII 分 解載體 pYLA(KZl)、pYLI(KZl)、pYLA (MAP29)及pYLI(MAP29)，且使用該等載體藉由標準乙酸

149050.doc -279-

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鍾/聚乙二醇程序將解脂耶氏酵母菌株CLIB 122轉型成尿

昔原養型(uridine prototrophy)。簡言之，藉由離心(4000 rpm，10分鐘)收集於YEPD(1%酵母提取物、2%蛋白腺、

2%葡萄糖)中生長隔夜之酵母細胞，用無菌水洗滌一次，

且懸浮於0.1 Μ乙酸錘(pH 6.0)中。將細胞懸浮液之200 μΐ 等分試樣與線性化質體DNA溶液(10-20 pg)混合，在室溫

下培育10分鐘'且於相同緩衝液中與1 ml 50% PEG 4000 混合。在室溫下再培育懸浮液1小時，接著在42°C下熱休

克2分鐘。接著將細胞塗於SC his leu板(0.67%酵母氮源、

2%葡萄糖、各100 mg/L之白胺酸及組胺酸)上。在30°C下

培育3-4天後，出現轉型體。

在3 0°C、震盪下，使三個來自pYLA(KZl)轉型之分離

物、三個來自pYLI(KZl)轉型之分離物、兩個來自

pYLA(MAP29)轉型之分離物及兩個來自pYLI(MAP29)轉型

之分離物於YEP7培養基(1%酵母提取物、2%蛋白月東，pH 7.0)中生長24小時。藉由離心自10 ml培養物中收集細胞，

再懸浮於3 ml新鮮YEP7中，且置於15 ml螺旋蓋小瓶中。

在室溫、平緩(60 rpm)震盪下，培育小瓶隔夜。如實例1所

述，藉由氣相層析，使用質譜偵測器來分析此等小瓶之頂

部空間氣體中之異戊二烯含量。以pYLA(KZl)及pYLI (KZ1)獲得之所有轉型體皆製造可易於偵測之量的異戊二

烯(0.5卩g/L至1卩g/L，圖20)。在載運植酸酶基因而非異戊

二烯合成酶基因之對照菌株的頂部空間氣體中未偵測到異

戊二烯。

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實例7：在表現野葛異戊二烯合成酶及Mi、或Qxs、或Mi與

Qxs之大腸桿菌中製造異戊二烯

I. 構築編碼野葛異戊二烯合成酶及HZ、或dxs、或Hi與

故S之載體以供在大腸桿菌中製造異戊二烯

i) 構築 pTrcKudzuKan用賦予康黴素抗性之基因置換pTrcKudzu(實例1所述)之

Wa基因。為移除靛α基因，用BspH I分解pTrcKudzu ＞用蝦

鹼性磷酸酶(SAP)處理，在65°C下熱滅活，接著用Klenow 片段及dNTP填補末端。由瓊脂糖凝膠純化5 kbp大片段，

且使用 引子 MCM22 5'-GATCAAGCTTAACCGGAATTG CCAGCTG(SEQ ID NO:76)及 MCM23 5'-GATCCGATCGTCA GAAGAACTCGTCAAGAAGGC(SEQ ID NO:77)月等該片段接

合於已自pCR-Blunt-II-TOP Ο進行PCR擴增之kanr基因，用

HindHI及尸皿I分解，且填補末端。在含有50 μg/ml康黴素

之LA上選擇載運賦予康黴素抗性之質體(pTrcKudzuKan)的

轉型體。

ii) 構築 pTrcKudzu yIDI Kan用Fsfl分解pTrcKudzuKan，用SAP處理，進行熱滅活及

凝膠純化。用合成RBS將其接合於編碼來自釀酒酵母之idi

的 PCR產物。PCR之弓I 子為 Nsil-YIDI 1 F 5'-CATCAATG CATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC(SEQ ID NO:78) 及 Pstl-YIDI 1 R 5'-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC (SEQ ID NO:79)；且模板為釀酒酵母基因 組DNA。PCR產

物在接合之前用Nsil及Pstl分解且經凝膠純化。將接合混

149050.doc •281 ・

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合物轉型至化學性勝任TOP 10細胞中，且在含有50卩g/ml康黴素之LA上進行選擇。分離數個轉型體且定序，所得

質體稱為 pTrcKudzu-yIDI(kan)(圖 34 及圖 35 ； SEQ IDNO:16)。

iii) 構築 pTrcKudzu DXS Kan用Pstl分解質體pTrcKudzuKan，用SAP處理，進行熱滅

活及凝膠純化。用合成RBS將其接合於編碼來自大腸桿菌

之dxs的PCR產 物。PCR之 引子為MCM13 5'-GATCAT GCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGAT ATTGCCAAATACCCG(SEQ ID NO:80)及 MCM14 5'-CATG CTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT(SEQ ID NO:81)； 且模板為大腸桿菌基因組DNA。PCR產物在接合之前用

Nsil及Fsfl分解且經凝膠純化。將所得轉型反應物轉型至

TOP1 0細胞中，且在含有50 |ig/ml康黴素之LA上進行選

擇。分離數個轉型體且定序，所得質體稱為pTrcKudzu- DXS(kan)(圖 36及圖 37 ； SEQ ID NO:17)。

iv) 構築 pTrcKudzu-ylDI-dxs (kan)用 PstI 分解 pTrcKudzu-ylDI(kan)，用 SAP 處理，進行熱

滅活及凝膠純化。用合成RBS將其接合於編碼大腸桿菌t/xs 之 PCR 產物(引子 MCM13 5'-GATCATGCATTCGCCCTT AGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATAC CCG(SEQ ID NO:80)及 MCM14 5'-CATGCTGCAGTTATGCC AGCCAGGCCTTGAT(SEQ ID NO:81)；模板 TOPIO 細胞)，

該PCR產物已用Nsil及FsH分解且經凝膠純化。最終質體稱

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為 pTrcKudzu-ylDI-dxs （kan）（圖 21 及圖 22 ； SEQ IDNO:10）。

v） 構築 pCL PtrcKudzu使用SspI自pTrcKudzu分解來自上述實例1之含有啟動

子、結構基因及終止子之DNA片段，且進行凝膠純化。將

其接合於已用PvwII分解、用SAP處理且經熱滅活之

pCL1920。將所得接合混合物轉型至T0P10細胞中，且在

含有50卩g/ml壯觀黴素之LA中進行選擇。分離數個純系且

定序，且選擇其中兩者。pCL PtrcKudzu及pCL PtrcKudzu （A3）具有相反定向之插入物（圖38-41 ； SEQ ID NO:18- 19）。

vi） 構築 pCL PtrcKudzu yIDI將上述（ii）之經Nsil-PstI分解、經凝膠純化之IDI PCR擴

增子接合至已用Pst\分解、用SAP處理且經熱滅活之pCL PtrcKudzu中。將接合混合物轉型至TOP 1 0細胞中，且在含

有50卩g/ml壯觀黴素之LA中進行選擇。分離數個純系且定

序，所得質體稱為pCL PtrcKudzu yIDI（圖42及圖43 ； SEQ ID NO:20）。

vii） 構築 pCL PtrcKudzu DXS將上述（iii）之經Nsil-Pstl分解、經凝膠純化之DXS PCR

擴增子接合至已用Fsfl分解、用SAP處理且經熱滅活之pCL PtrcKudzu （A3）中。將接合混合物轉型至TOP10細胞中，

且在含有50 壯觀黴素之LA中進行選擇。分離數個純

系且定序，所得質體稱為pCL PtrcKudzu DXS（圖44及圖

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45 ； SEQ ID N0:21)。

II.量測在不同複本數下表現野葛異戊二烯合成酶、及/

或dxs之培養物的頂部空間氣體中之異戊二烯

使先前經質體 pTrcKudzu(kan)(A)、pTrcKudzu-ylDI kan(B)、pTrcKudzu-DXS kan(C)、pTrcKudzu-ylDI-DXS kan(D)轉型之大腸桿菌BL210DE3)之培養物於LB + 50 μg/ml 康黴素中生長。使 pCL PtrcKudzu(E)、pCL PtrcKudzu、pCL PtrcKudzu-ylDI(F)及 pCL PtrcKudzu- DXS(G)之培 養物於LB及50卩g/ml壯觀黴素中生長。在。時

(OD600為約0.5)用400 μΜ IPTG誘導培養物，且獲取樣品以

供量測頂部空間氣體中之異戊二烯(參見實例1)。結果展示

於 圖23A-23G中。

藉由轉型將質體pTrcKudzu-ylDI-dxs (kan)引 入大腸桿 菌

菌株BL 21中。在20°C下使所得菌株BL21/pTrc Kudzu IDI DXS於含有康黴素(5 0 μg/ml)之LB中生長隔夜，且用於接

種含有 1% 葡萄糖之 TM3(13.6 g K2PO4、13.6 g KH2PO4 > 2.0 g MgSO4*7H 2O、2.0 g單水合檸檬酸、0.3 g檸様酸鐵

鉉、3.2 g (NH4)2SO4、0.2 g 酵母提取物、1.0 ml ΙΟΟΟχ 改

質痕量金屬溶液'調整至pH 6.8且用田0補足，且經過濾

滅菌)之震盪燒瓶。在30°C下培育該等燒瓶直至OD600達到

0.8為止，接著用400 μΜ IPTG進行誘導。在誘導後之多個

時間獲取樣品，且如實例1所述量測頂部空間氣體中異戊

二烯之量。結果展示於圖23H中。

III.在大腸桿菌/pTrcKudzu yIDI DXS中自生質製造異戊

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二烯

測試菌株BL21 pTrcKudzuIDIDXS自 三種類型之生質(甜

菜渣、玉米乾草及軟木漿)產生異戊二烯之能力，使用葡

萄糖作為對照。藉由酶促水解製備生質之水解產物

(Brown, L及 Torget, R., 1996, NREL standard assay method Lap-009 「Enzymatic Saccharification of LignocellulosicBiomass j )，且在基於葡萄糖當量稀釋下使用。在此實例

中，葡萄糖當量等於1%葡萄糖。使用來自BL21 (DE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)之板新鮮轉型細胞之單一群落

接種5 ml LB +康黴素(50 μβ/ιη1)。在25°C、震盪下培育培養

物隔夜。次日，於25 ml TM3 + 0.2% YE+1%原 料中 將隔夜

培養物稀釋至OD6oo為0.05。原料為玉米乾草、甜菜渣或軟

木漿。使用葡萄糖作為陽性對照，且不使用葡萄糖作為陰

性對照。在30°C、以1 80 rpm震盪下培育培養物。監測培

養物之O D600 '且當其O D6oo達到約0.8時，在1小 時及3小 時

如實例1所述分析培養物之異戊二烯產量。培養物未經誘

導。含有所添加之原料的所有培養物所製造之異戊二烯均

等同於葡萄糖陽性對照之情況。實驗一式兩份進行且展示

於圖46中。

IV.在大腸桿菌/pTrcKudzuIDIDXS中自轉化糖製造異戊

二烯

使用來自 BL21 (%DE3)/pTrcKudzu yIDI DXS (kan)之板

新鮮轉型細胞之單一群落接種5 ml LB+康黴素(50 gg/ml)。在25°C、震盪下培育培養物隔夜。次日，於25 ml

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TM3+0.2% YE+1%原料中將隔夜培養物稀釋至OD6oo為

0.05。原料為葡萄糖、轉化葡萄糖或玉米乾草。藉由酶促

處理蔗糖糖漿製備轉化糖原料（Danisco轉化糖）。如下文

（部分V）所述來製備AFEX玉米乾草。使細胞於30°C下生

長，且當培養物之OD6oo達到約0.8-1.0時（0小時），量測第

一樣品。在0小時、1小時及3小時，分析培養物之生長（如

由OD600量測）及異戊二烯產量（如實例1）。結果展示於圖47 中οV. 自經AFEX預處理之玉米乾草製備水解產物

經AFEX預處理之玉米乾草獲自密西根生物技術研究所

（Michigan Biotechnology Institute） ° 預處理條件為 60% 濕

度'1：1氨負載，及於90°C下持續30分鐘，接著空氣乾燥。

經AFEX預處理之玉米乾草中之水分含量為21.27%。經

AFEX預處理之玉米乾草中葡聚糖及木聚糖之含量分別為

31.7%及19.1%（乾基）。糖化過程如下：將20 g經AFEX預處

理之玉米乾草添加至具有5 ml 1 Μ檸檬酸鉞緩衝液（pH 4.8）、2.25 ml 乙醇纖維素酶 1000（Accellerase 1000）、0.1 ml格林酶H121（Grindamyl H121）（來自麵包製造工業用之黑

麴菌的Danisco木聚糖酶產品）及72.65 ml去離子水之500 ml 燒瓶中。將該燒瓶置於迴轉式震盪器中且在50°C下培育96 小時。自震盪器中獲取一個樣品且使用HPLC進行分析。

水解產物含有38.5 g/Ι葡萄糖、21.8 g/Ι木糖，及10.3 g/Ι之

葡萄糖及/或木糖寡聚物。

VI. 酵母提取物對生長於批式補料培養物中之大腸桿菌之

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異戊二烯產量的影響

如先前關於含有上述pTrcKudzu yIDI DXS質體之大腸桿

菌細胞所述，以14 L規模進行醱酵。以指數速率補給酵母

提取物（Bio Springer, Montreal, Quebec, Canada） ° 在 40 小

時醱酵期間，傳遞至醱酵槽中之酵母提取物之總量在

70-830 g之間變化。在550 nm波長下量測醱酵培養液之光

學密度。醱酵槽內之最终光學密度與所添加之酵母提取物

之量成比例（圖48A）。如先前所述測定醱酵槽之釋出氣體

中之異戊二烯含量。異戊二烯力價隨著醱酵過程而增加

（圖48B）。所製造之異戊二烯之量與所補給之酵母提取物

之量成線性比例關係（圖48C）。

VII. 以pTrcKudzu DXS yIDI之5 00 L醱酵製造異 戊二烯

使用具有野葛異戊二烯合成酶、釀酒酵母IDI及大腸桿

菌 DXS核酸（大腸桿菌 BL2 1 （XDE3） pTrc Kudzu dxs yidi）之

大腸桿菌細胞之500公升醱酵來製造異戊二烯。異戊二烯

含量經15小時時期自50卩g/L變為300卩g/L。基於平均異戊

二烯濃度、通過器件之平均流量及異戊二烯析出

（breakthrough）程度，計算出所收集之異戊二烯之量為約

17 g。

VIII. 以生長於批式補料培養物中之大腸桿菌之500 L醱酵

製造異戊二烯

培養基配方（每公升醱酵培養基）：

K2HPO4 7.5 g、MgSO4*7H 2O 2g、單水合檸檬酸 2g、檸

檬酸鐵鉄0.3 g '酵母提取物0.5 g > ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶

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液1 ml °所有組分一起添加且溶解於去離子水中。對此溶

液進行高壓滅菌。用氨氣(NH3)將pH值調整至7.0且補足體

積。滅菌及調整pH值之後，添加10 g葡萄糖' ° . 1 g鹽酸硫

胺素、及抗生素。

lOOOx改質痕量金屬溶液：

單水合檸檬酸 40 g ' MnSO4*H 2O 30 g、NaCl 10 g ' FeSO4*7H 2O 1 g、CoC12*6H 2O 1 g、ZnSO4*7H 2O 1 g、

CuSO4*5H 2O 100 mg、H3BO3 100 mg、NaMoO4*2H 2O 100 mg。將各組分逐一溶解於去離子水中5用HCl/NaOH將pH 值調整至3.0，接著補足體積，且用0.22微米過濾器進行過

濾滅菌。

在500-L生物反應器中用含有pTrcKudzu yIDI DXS質體

之大腸桿菌細胞進行醱酵。進行此實驗以監測在醱酵所要

之pH 7.0及溫度30°C下自葡萄糖及酵母提取物形成異戊二

烯之情況。在大豆腺-酵母提取物-葡萄糖培養基中製備自

冷凍小瓶中獲取之大腸桿菌菌株之接種體。接種體生長至

OD 0.15(在550 nm下所量測)之後，使用20 ml接種體接種

含有2.5-L大豆腺-酵母提取物-葡萄糖培養基之生物反應

器。使2.5-L生物反應器物質在30°C下生長至OD為1.0，且

將2.0-L物質轉移至500 L生物反應器中。

以指數速率補給酵母提取物(Bi。Springer, Montreal, Quebec, Canada)及葡萄糖。在50小時醱酵期間，傳遞至生

物反應器中之葡萄糖及酵母提取物之總量分別為181.2 kg Λ 17.6 kg。生物反應器內隨時間而變之光學密度展示於圖

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49A中。如先前所述測定生物反應器之釋出氣體中之異戊

二烯含量。異戊二烯力價隨著醱酵過程而增加(圖49B)。

在50小時醱酵期間所製造之異戊二烯之總量為55.1 g，且

製造時程展示於圖49C中。

實例8：在表現野葛異戊二烯合成酶及重組甲懇戊酸途徑

基因之大腸桿菌中製造異戊二烯

I. 選殖下游MVA途徑

選殖下游甲楚戊酸途徑之策略如下。藉由PCR自釀酒酵

母染色體DNA擴增甲無戊酸生物合成途徑之四種基因：甲

羟戊酸激酶(MVK)基因、磷酸甲無戊酸激酶(PMK)基因、

二磷酸甲舞戊酸去梭酶(MVD)基因及異戊烯基二磷酸異構

酶基因，且將其個別地選殖至pCR Bluntll TOPO質體

(Invitrogen)中。在一些狀況下，自大腸桿菌染色體DNA擴

增基因。設計引子，使得在5,末端，起始密碼子上游8 bp處插入大腸桿 菌共同RBS(AGGAGGT(SEQ ID NO:82)或

AAGGAGG(SEQ ID NO:83))，且在 3'末端添加 位點。

接著將該等基因依次選殖至pTrcHis2B載體中，直至整個

途徑得到組裝為止。

來自釀酒酵母S288C之染色體DNA獲自ATCC(ATCC 204508D)。按照製造商之說明書，使用引子MVKF(5'- AGGAGGTAAAAAAACATGTCATTACCGTTCTTAACTTCT GC，SEQ ID NO:84)及 MVK-Pstl-R(5'-ATGGCTGCAGGC CTATCGCAAATTAGCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTG'SEQ ID NO:85)且使用PfuTurbo，自釀酒酵母之染色體

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擴增MVK基因。藉由經1.2% E-gel(Invitrogen)進行電泳來

鑑別尺寸正確之PCR產物(1370 bp)，且將其選殖至

pZeroBLUNT TOPO中。所得質體命名為pMVKl。用SacI

及Taq 1限制性核酸內切酶分解質體pMVKl，用凝膠純化片

段且將其接合至經SacI及BstBl分解之pTrcHis2B中。所得

質體稱為pTrcMVKl。

藉由使用以下引子進行PCR來擴增甲羟戊酸生物合成途

徑中之第二個基因 PMK : Pstl-PMKl R(5'-GAATTCGCC CTTCTGCAGCTACC，SEQ ID NO: 86)及 BsiHKA I-PMK1 F(5'-CGACTGGTGCACCCTTAAGGAGGAAAAAAACATGT CAG，SEQ ID NO:87)。按照製造商之說明書，使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)進行PCR反應。用尸s fl及Β^ζΉΚΙ分

解尺寸正確之產物(1387 bp)，且將其接合至經戸s，I分解之

pTrcMVKl中。所得質體稱為pTrcKK。以相同方式選殖

MVD及 汕·基因。使用引子對Pstl-MVD 1 R(5'-GTGCT GGAATTCGCCCTTCTGCAGC，SEQ ID NO:88)及 Nsil- MVD 1 F(5'-GTAGATGCATGCAGAATTCGCCCTTAAGGA GG，SEQ ID NO:89)進行PCR以擴增MVD基因，且使用引

子對 Pstl-YIDI 1 R(5'-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTA TAGC，SEQ ID NO:79)及 Nsil-YIDI 1 F(5'-CATCAATG CATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC，SEQ ID NO:78) 進行PCR以擴增yIDI基因。在一些狀況下，使用來自大腸

桿菌之IPP異構酶基因。為擴増來自大腸桿菌染色體

DNA之湖，使用以下引子組：Pstl-CIDI 1 R(5'-GTGTG

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ATGGATATCTGCAGAATTCG，SEQ ID ΝΟ:90）Λ Nsil-CIDI 1 F（5'-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATG， SEQ ID N0:91）。模板DNA為由標準 方法自大腸桿菌FM5 中分離之染色體 DNA（WO 96/35796 及 WO 2004/033646，各

藉此以全文引用的方式併入，尤其關於核酸分離）。最终

質體對於編碼酵母混，基因之構築體稱為pKKDIy，或對於

編碼大腸桿菌idi基因之構築體稱為pKKDIc。將質體轉型

至大腸桿菌宿主BL21中以供後續分析。在一些狀況下，將

野葛異戊二烯合成酶選殖至pKKDIy中，得到質體

pKKDIyIS。

亦將下游MVA途徑選殖至含有康黴素抗生素抗性標記物

之pTrc中。用限制性核酸.內切酶Apal及Pstl分解質體

pTrcKKDIy，在1.2%瓊脂糖E-gel上分離5930 bp片 段，且

根據製造商之說明書使用Qiagen凝膠純化套組進行純化。

用限制性核酸內切酶Apal及尸异I分解實例7中所述之質體

pTrcKudzuKan，且使用Qiagen凝膠純化套組經1.2% E-gel 純化含有載體之33 3 8 bp片段。使用Roche快速接合套組接

合3338 bp載體片段及5 93 0 bp下游MVA途徑片段。將接合

混合物轉型至大腸桿菌TOP10細胞中，且在37°C下使轉型

體生長隔夜，同時在含有康黴素（50卩g/ml）之LA上進行選

擇。藉由限制性酶分解來驗證轉型體，且冷凍一個轉型體

作為儲備物。質體命名為pTrcKanKKDIy。

II. 將野葛異戊二烯合成酶基因選殖至pTrcKanKKDIy中

藉由使用引子 MCM50 5'-GATCATGCATTCGCCCTTAG

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GAGGTAAAAAAACATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTAC T(SEQ ID NO:52)及 MCM53 5'-CGGTCGACGGATCCC TGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQ ID NO:50)進 行

PCR，自實例1中所述之pTrcKudzu擴增野葛異戊二烯合成

酶基因。將所得PCR片段選殖至pCR2.1中，且轉型至大腸

桿菌TOP10中。此片段含有野葛異戊二烯合成酶之編碼序

列、及含有大腸桿菌RBS之上游區域。在37°C下培育轉型

體隔夜，同時在含有鰻节青黴素(50卩g/ml)之LA上進行選

擇。藉由定序驗證片段正確插入，且此菌株命名為

MCM93。

用 限制 性核 酸內切 酶Nsil及户"I分解 來自菌 株MCM93之

質體以釋放含有RBS及野葛異戊二烯合成酶之1724 bp插入

物。在1.2%瓊脂糖E-gel上分離1724 bp片段，且根據製造

商之說明書使用Qiagen凝膠純化套組進行純化。用限制性

核酸內切酶Fs/Ι分解質體pTrcKanKKDIy，在37°C下用SAP 處理30分鐘，且使用Q iagen PCR淨化套組進行純化。使用

Roche快速接合套組接合該質體及編碼野葛異戊二烯合成

酶之DN A片段。將接合混合物轉型至大腸桿菌TOP 1 0細胞

中，且在37°C下使轉型體生長隔夜，同時在含有50卩g/ml 康黴素之LA上進行選擇。藉由限制酶分解驗證正確轉型

體，且質體命名為pTrcKKDylklSKan(圖24及圖25 ； SEQ ID NO:11)。將此質體轉型至 BL21(XDE3)細胞(Invitrogen) 中ο

III.自表現重組下游甲誣戊酸途徑及野葛異戊二烯合成酶

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之大腸桿菌中之甲羯戊酸製造異戊二烯

在調整至pH 7.1且補充有0.5%葡萄糖及0.5%甲経戊酸之

MOP S 培養基(Neidhardt 等人 , (1974) J. Bacteriology 119: 736-747)中培養菌株BL21/pTrcKKDyIkISKan。亦使用相同

條件，但在不添加0.5%甲理戊酸之情況下設置對照培養

物。自具有1%接種體之隔夜接種培養物開始培養，且當

培養物之OD600已達到0.3至0.5時，用500 μΜ IPTG進行誘

導。在30°C、以250 rpm震盪下使培養物生長。誘導後3小

時，使用實例1中所述之頂部空間檢驗來分析異戊二烯產

量。最大異戊二烯產量為6.67x10-4 mol/L培養液/OD6oo/h，其

中L培養液為培養液體積且包括細胞培養基體積與細胞體

積。未補充甲發戊酸之對照培養物不製造可量測之異戊二

烯。

IV. 選殖上游MVA途徑

自糞腸球菌選殖包含編碼三種酶促活性之兩種基因的上

游甲羚戊酸生物合成途徑。mvaE基因編碼具有乙醯基-

CoA乙醯轉移酶與3-舞基-3-甲基戊二醯基-CoA(HMG-CoA) 還原酶(該途徑中之第一個蛋白質與第三個蛋白質)之酶促

活性的蛋白質，且mvaS基因編碼該途徑中之第二個酶

HMG-CoA還原酶。使用以下引子，自前部具有大腸桿菌

核糖體結合位點及間隔子之糞腸球菌(E. faecalis)基因組

DNA(ATCC 700802D-5)擴增 mvaE基因：

mvaE w/ RBS + ATG起始密碼子SacI之CF 07-60 (+)起始端

5! - GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQID NO:93)

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CF 07-62 (-)融合之間具有RBS之mvaE與秫vaS5' - TTTATCAATCCCAAITGTCATGTTTITITACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC(SEQ ID NO :94)

使用以下引子，自前部具有大腸桿菌RBS及間隔子之糞

腸球菌基因組DNA(ATCC 700802D-5)擴增mvaS基因：

CF 07-6 1 (+)融合之間具有RBS之秫ναΕ與mvaS5'-GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA (SEQ ID NO:95)

秫 vaS 基因 Bglll 之 CF 07-102 (-)末端

55 -GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:96)

藉由使用以下引子進行PCR將PCR片段融合在一起：

mvaE w/ RBS + ATG起始密碼子SacI之CF 07-60 (+)起始端

5, -GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQID NO:93)

秫 yaS 基因 Bglll 之 CF 07-102 (-)末端

5'-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:96)

使用Qiagen套組純化融合PCR片段，且用限制性酶cl 及BglH分解。使用Qiagen套組對此經分解之DNA片段進行

凝膠純化，且將其接合至已用SacI及Bglll分解且經凝膠純

化之市售載體pTrcHis2A中。

將接合混合物轉型至大腸桿菌Top 1 0細胞中，且在

LA+5 0 |ig/ml發芾青黴素板上選擇群落。選擇總共六個群

落，且在LB + 50卩g/ml護苯青黴素中生長隔夜，且使用

Qiagen套組分離質體。用SacI及Bglll分解質體以檢查插入

物，且用以下引子對一個正確質體進行定序 ：

mvaE基因之CF 07-5 8 (+)起始端

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5, - ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC (SEQ ID NO:97)

mvaE基因之CF 07-59 (-)末端

5, - ATGITATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (SEQ ID NO:98)

mvaS基因之CF 07-82 (+)起始端

5, - ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (SEQ ID NO:99)

mvaS基因之CF 07-83 (-)末端

5, - TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 100)

mvaE 中 之 CF 07-86 (+)序列

5' - GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC (SEQ ID NO:101)

mvaE 中 之 CF 07-87 (+)序 列

5, - TTGCCAATCATATGATTGAAAATC (SEQ ID NO:102)

mvaE 中 之 CF 07-88 (+)序 列

55 - GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (SEQ ID NO: 103)

mvaS 中之 CF 07-89 (+)序列

5, - GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC (SEQ ID NO: 104)

藉由 定序判 定稱為pTrcHis2AUpperPathway# 1之質 體為正

確的，且將其轉型至市售大腸桿菌菌株BL21中。在LA+5 0 μg/ml梭芾青黴素上進行選擇。選擇兩個轉型體，且於

LB + 50卩g/ml戮节青黴素上生長直至其OD6oo達到1.5為止。

在-80°C下，於甘油存在下，將兩個菌株冷凍於小瓶中。菌

株對於BL21分離株#1中 之pTrcHis2AUpperPathway# 1命名為

CF 449，且對於BL21 分離株#2 中之pTrcHis2AUpperPathway#l 命名為CF 450 °分析發現，兩個純系之表現相同。

V. 將上游MVA途徑選殖至pCL1920中

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用限制性核酸內切酶SspI分解質體pTrcHis2AUpperPathway 以釋放含有pTrc-秫gE-mvaS-（His標籤）-終止子之片段。在

此片段中，his標籤未轉譯。使用Qiagen凝膠純化套組，經

1.2% E-gel純化此具有鈍末端之4.5 kbp片段。藉由用限制

性核酸內切酶Pvull分解載體，用SAP處理且使用Qiagen凝

膠純化套組經1.2% E-gel進行凝膠純化來製備來自

pCL1920之已脫除磷酸且具有鈍末端的4.2 kbp片段。使用

Roche快速接合套組接合該兩個片段，且將其轉型至

TOP10化學性勝任細胞中。在含有壯觀黴素（5 0卩g/ml）之

LA上選擇轉型體。藉由以PCR針對插入物之存在進行篩選

來鑑別正確群落。質體命名為pCL PtrcUpperPathway（圖26 及圖 27A-27D ； SEQ ID NO:12）。

VI. 表現組合之上游與下游甲羟戊酸途徑之菌株

為獲得具有完整甲舞戊酸途徑與野葛異戊二烯合成酶之

菌株'將質體 pTrcKKDylklSkan 與 pCLpTrcUpperPathway 均

轉型至BL21（XDE3）勝任細胞（Invitrogen）中，且在含有康

黴素（50卩g/ml）及壯觀黴素（50卩g/ml）之LA上選擇轉型體。

由質體製劑檢查轉型體以確保兩個質體均保留於宿主中。

菌株命名為MCM127。

VII. 自大腸桿菌/pUpperpathway中之葡萄糖製造甲羊車戊酸

將 BL2 1/pTrcHis2A-mvaE/mvaS 或 FM5/p pTrcHis2A- mvaE/mvaS之單一群落接種至LB +梭卒青黴素（100 μg/ml） 中，且在37°C '以200 rpm震盪下生長隔夜。將此等培養

物稀釋至250 ml擋板式燒瓶中之50 ml培養基中，以使

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OD600達到0·1。培養基為ΤΜ3 + 1%或2%葡萄糖+ 心青黴

素(100卩g/ml)，或TM3 + 1%葡萄糖+水解大豆油+梭苯青黴

素(100 Mg/ml)，或TM3 +生質(製備之甜菜渣、玉米乾草或

柳枝稷)。在3 0°C、以200 rpm震盪下使培養物生長約2-3小

時，直至OD6oo達到0.4為止。此時，藉由添加IPTG(400 μ,Μ)誘導mvaE mvaS構築體中之表現。誘導後再培育培養

物20或40小時，以2小時至6小時時間間隔、接著必要時在

24 ' 36及48小時獲取樣品。如下完成取樣：移出1 ml培養

物，量測OD600，使細胞於微量離心機(microfuge)中集結

成粒，移出上清液且分析其中之甲無戊酸。

使用TM3培養基及2%葡萄糖作為細胞培養基，具有編碼

糞腸球菌AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合成酶及HMG-CoA還

原酶多肽之核酸的大腸桿菌細胞之14公升醱酵製造22公克

甲舞戊酸。使用LB培養基及1%葡萄糖作為細胞培養基，

此等細胞之震盪燒瓶中每公升製造2-4公克甲羟戊酸。在

此等菌株中製造甲理戊酸指示，MVA途徑在大腸桿菌中發

揮功能。

VIII.自含有上游及下游MVA途徑與野葛異戊二烯合成酶之

大腸桿菌BL21製造異戊二烯

藉由在如上所述含有上游及下游MVA途徑與野葛異戊二

烯合成酶基因之質體與實例7中所述含有idi、dxs及dxr與

異戊二烯合成酶基因之質體的多種組合中進行轉型來產生

以下菌株。所用宿主細胞為化學性勝任BL21(XDE3)，且由

標準方法進行轉型。在含有康黴素(50 μg/ml)、或康黴素

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與壯觀黴素(濃度均為50 mg/ml)之L瓊脂上選擇轉型體。在

37°C下使板生長。所得菌株指定如下：

在康黴素與壯觀黴素(各50卩g/ml)上生長

MCM127-於BL21(XDE3)中之pCL上游MVA+pTrcKKDylklS (kan) MCM131-於BL21(AOE3)中之pCL 1920+pTrcKKDyIkIS (kan) MCM125-於BL210DE3)中之pCL上游MVA+pTrcHis2B (kan) 在康黴素(50卩g/ml)上生長

MCM64-於BL21(人DE3)中之pTrcKudzu yIDI DXS (kan)MCM50-於BL21(ADE3)中之pTrcKudzu (kan)MCM 123-於BL21(ADE3)中之pTrcKudzu yIDI DXS DXR (kan)

將來自冷凍器儲備物之上述菌株於LA+適當抗生素上劃

線培養(streak)，且在37°C下生長隔夜。使用來自各板之單

一群落接種震盪燒瓶(25 ml LB +適當抗生素)。在22°C、以

200 rpm震盪下培育該等燒瓶隔夜。次日早晨，將該等燒

瓶轉移至37°C培育箱中，且在以200 rpm震盪下再生長4.5 小時。對25 ml培養物進行離心以使細胞集結成粒，且將

細胞再懸浮於5 ml LB +適當抗生素中。接著將培養物稀釋

至25 ml LB+1%葡萄糖+適當抗生素中，以使ODgoo達到

0.1 θ對各菌株設置兩個燒瓶，一組經IPTG(800卩Μ)誘導

且笫二組未經誘導。在37°C、以250 rpm震盪下培育培養

物。1.50小時後(緊接取樣時間點1之後)誘導一組培養物。

在各取樣時間點'量測OD6oo且如實例1中所述測定異戊二

烯之量。結果呈現於表3中。所製造之異戊二烯之量以特

定菌株之峰值產量處之量表示。

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表3.大腸桿菌菌株中異戊二烯之產量

菌株 異戊二烯（卩g/L/OD/h）MCM50 23.8MCM64 289MCM125 NDMCM131 痕量

MCM127 874

ND :未偵測到

痕量：峰存在，但不可積分。

IX.分析甲翔戊酸

由Sigma-Aldrich（WI, USA）供應甲羟戊酸內酯（1.0 g， 7.7 mmol）（CA S編號503-48-0）溶解於水（7.7 mL）中之漿液，

且用亂氧化鉀（7.7 mmol）處理以產生甲裁戊酸之鉀鹽。藉

由*H NMR分析確認轉化成甲舞戊酸。藉由以14,000 rpm離

心5分鐘移除細胞1接著將上清液之3 0 0卩1等分試樣添加至

900 μΐ Η2Ο中，藉此製備供HPL C分析用之樣品。隨後添加

過氯酸（36卩1之70%溶液），接著混合且於冰上冷卻5分鐘。

接著再次對樣品進行離心（14,000 rpm，持續5分鐘），且將

上清液轉移至HPLC。以相同方式製備甲持戊酸標準物

（20、10、5、1及0.5 g/L）。藉由使用以5 mM硫酸以0.6 mL/min溶離且具有折射率（RI）偵測之BioRad Aminex 87- H+管柱（300 mmx7.0 mm）進行HPLC來分析 甲舞.戊酸（20卩L 注射體積）。在此等條件下，甲蔣戊酸在18.5分鐘時以內酯

形式溶離。

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X.自含有上游MVA途徑與野葛異戊二烯合成酶之大腸桿

菌BL21製造異戊二烯

使用表現甲羟戊酸途徑多肽及野葛異戊二烯合成酶之大

腸桿菌的15-L規模醱酵，自批式補料培養物中之細胞製造

異戊二烯。此實驗證實，在葡萄糖限制性條件下生長之細

胞製造2.2 g/L之異戊二烯。

培養基配方（每公升醱酵培養基）：

使用以下組分產生培養基（毎公升醱酵培養基）：k2hpo4

7.5 g ' MgSO4*7H 2O 2 g、單水合檸檬酸2 g、檸檬酸鐵鉉

0.3 g '酵母提取物0.5 g及ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液1 ml。

所有組分一起添加且溶解於去離子水中。對此溶液進行高

壓滅菌。用氫氧化鉄（3 0%）將pH值調整至7.0且補足體積。

滅菌及調整pH值之後，添加10 g葡萄糖、0.1 g鹽酸硫胺

素、及抗生素。

ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液：

使用以下組分產生ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液：單水合檸

檬酸 40 g ' MnSO4*H 2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4*7H 2O 1 g、CoC12*6H 2O 1 g、ZnSO4*7H 2O 1 g、CuSO4*5H 2O 100 mg ' H3BO3 100 mg 及 NaMoO4*2H 2O 100 mg。將各組分逐

一溶解於去離子水中'用HCl/NaOH將pH值調整至3.0，接

著補足體積，且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌。

在15-L生物反應器中，用含有pCL PtrcUpperPathway（圖

26）及pTrcKKDylkl S質體之BL21 （DE3）大腸桿 菌細胞進行

醱酵。進行此實驗以監測在醱酵所要之pH 7.0及溫度30°C

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下自葡萄糖形成異戊二烯之情況。將自冷凍小瓶中獲取之

大腸桿菌菌株之接種體於LB培養液瓊脂板（含抗生素）上劃

線培養，且在37°C下培育。將單一群落接種至大豆月東-酵

母提取物-葡萄糖培養基中。接種體生長至OD 1.0（在550 nm下所量測）之後，使用500 mL接種體接種5-L生物反應

器。

以指數速率補給葡萄糖直至細胞到達停滯期為止。此

後，葡萄糖補料減至滿足代謝需求。在54小時醱酵期間傳

遞至生物反應器之葡萄糖的總量為3.7 kg °藉由添加異丙

基-β-D-l-硫代哌喃半乳糖昔（IPTG）達成誘導。當550 nm下

之光學密度（OD55o）達到值為10時，使IPTG濃度達到25 μΜ。當OD550達到190時，IPTG濃度升至50 μΜ °在醱酵38 小時之時，IPTG濃度升至100卩Μ。生物反應器內隨時間

而變之OD550概況展示於圖54中。如本文所述測定生物反

應器之釋出氣體中之異戊二烯含量。異戊二烯力價隨著醱

酵過程而增加，最終值達到2.2 g/L（圖55）。在54小時醱酵

期間所製造之異戊二烯之總量為15.9 g，且製造時程展示

於圖5 6中。

XI,在15-L規模下自表現甲铿戊酸途徑基因且於批式補料

培養物中生長之大腸桿菌醱酵而製造異戊二烯

使用表現甲羟戊酸途徑多肽及野葛異戊二烯合成酶之大

腸桿菌的15-L規模醱酵，自批式補料培養物中之細胞製造

異戊二烯。此實驗證實，在葡萄糖限制性條件下生長之細

胞製造3.0 g/L之異戊二烯。

149050.doc -301 -

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培養基配方（每公升醱酵培養基）：

使用以下組分產生培養基（每公升醱酵培養基）：k2hpo4

7.5 g、MgSO4*7H 2O 2 g、單水合檸檬酸2 g、檸檬酸鐵鉄

0.3 g、酵母提取物0.5 g及ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液1 ml。

所有組分一起添加且溶解於去離子水中"對此溶液進行高

壓滅菌。用氫氧化錠（30%）將pH值調整至7.0且補足體積。

滅菌及調整pH值之後，添加10 g葡萄糖、0.1 g鹽酸硫胺

素、及抗生素。

1000X改質痕量金屬溶液：

使用以下組分產生1000X改質痕量金屬溶液：單水合檸

檬酸 40 g、MnSO4*H 2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4*7H 2O 1 g、CoC12*6H 2O 1 g ' ZnSO4*7H 2O 1 g、CuSO4*5H 2O 100 mg ' H3BO3 100 mg 及 NaMoO4*2H 2O 100 mg ° 將各組分逐

一溶解於去離子水中，用HCl/NaOH將pH值調整至3.0，接

著補足體積，且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌。

在15-L生物反應器中，用含有pCL PtrcUpperMVA及pTrc KKDylklS質體之BL21 （DE3）大腸桿菌細胞進行醱酵。進

行此實驗以監測在醱酵所要之pH 7.0及温度30°C下自葡萄

糖形成異戊二烯之情況。將自冷凍小瓶中獲取之大腸桿菌

菌株之接種體於LB培養液瓊脂板（含抗生素）上劃線培養，

且在37°C下培育。將單一群落接種至胰蛋白腺-酵母提取

物培養基中。接種體生長至OD 1.0（在550 nm下所量測）之

後，使用500 mL接種體接種5-L生物反應器。

以指數速率補給葡萄糖直至細胞到達停滯期為止。此

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後，葡萄糖補料減至滿足代謝需求。在59小時醱酵期間傳

遞至生物反應器之葡萄糖的總量為2.2 kg。藉由添加IPTG 達成誘導。當5 50 nm下之光學密度(OD550)達到值為10時，

使IPTG濃度達到25卩Μ。當OD550達到190時，IPTG濃度升

至50卩Μ。生物反應器內隨時間而變之OD550概況展示於圖

93中。如本文所述測定生物反應器之釋出氣體中之異戊二

烯含量。異戊二烯力價隨著醱酵過程而增加，最終值達到

3.0 g/L(圖94)。在59小時醱酵期間所製造之異戊二烯之總

量為22.8 g，且製造時程展示於圖95中。在醱酵期間所利

用之參與製造異戊二烯之碳的莫耳產率為2.2% =自葡萄糖

製得之異戊二烯之重量百分比產率為1 .0%。

XII.在15-L規模下自表現甲羟戊酸途徑基因且於批式補料

培養物中生長之大腸桿菌醱酵而製造異戊二烯

使用表現甲無戊酸途徑多肽、大葛藤異戊二烯合成酶及

野葛異戊二烯合成酶之大腸桿菌的15-L規模醱酵，自批式

補料培養物中之細胞製造異戊二烯。此實驗證實，在葡萄

糖限制性條件下生長之細胞製造3.3 g/L之異戊二烯。

i)構築 pCLPtrcUpperPathwayHGS2使用弓I 子 Nsil-RBS-HGS F(CTTGATGCATCCTGCATTCG

CCCTTAGGAGG，SEQ ID NO: 1 05)及 pTrcR(CCAGGCAAA TTCTGTTTTATCAG « SEQ ID NO:106)且使用 pTrcKKDylklS 作為模板，對編碼大葛藤異戊二烯合成酶之基因進行PCR 擴増。用Ns汀及Fsfl對由此獲得之PCR產物進行限制酶分

解，且經凝膠純化。根據製造商之說明書，用FsH對質體

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pCL P trc Up perPathway進行限制 酶分解，且使用rAPid鹼性

磷酸酶（Roche）脫除磷酸.。

將此等DNA片段接合在一起，且將接合反應物轉型至大

腸桿菌Top 10化學性勝任細胞（Invitrogen）中，塗於含有壯

觀黴素（50 Mg/ml）之L瓊脂上，且在37°C下培育隔夜。使用

Qiaquick Spin Mini-prep套組自6個純系製備質體DNA。用

限制性酶EcoRV及Mlul分解質體DNA，以鑑別插入物具有

正確定向（亦即，基因之取向與pTrc啟動子相同）之純系。

所得正確質 體命名為p CLP tr cUpperP ath way HGS 2。使 用

本文所述之頂部空間檢驗對此質體進行檢驗且發現在大腸

桿菌Top 10中製造異戊二烯，由此驗證基因之功能性。將

質體轉型至含有pTrcKKDylklS之BL21（LDE3）中以得到 菌

株 BL2 1 /pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDylklS。此菌

株與 BL21/pCL PtrcUpperMVA及 pTrc KKDylklS 菌株（實例 8 部分XI）相比，具有異戊二烯合成酶之額外複本。此菌株

與實例8部分XI中所用之BL2 1 /pCL PtrcUpperMVA及pTrc KKDylklS菌 株相比，HMGS之表現及活性亦增加。

ii）在 15-L 規模下，由表現 pCLPtrcUpperPath wayHGS 2- pTrcKKDylklS且於批式補料培養物中生長之大腸桿菌醱酵

製造異戊二烯

培養基配方（每公升醱酵培養基）：

使用以下組分產生培養基（每公升醱酵培養基）：k2hpo4

7.5 g ' MgSO4*7H 2O 2 g、單水合檸檬酸2 g、檸檬酸鐵鉉

0.3 g '酵母提取物0.5 g及ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液1 ml。

149050.doc -304-

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所有組分一起添加且溶解於去離子水中。對此溶液進行高

壓滅菌。用氫氧化鉉（30%）將pH值調整至7.0且補足體積。

滅菌及調整pH值之後，添加10 g葡萄糖、0.1 g鹽酸硫胺

素、及抗生素。

ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液：

使用以下組分產生ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液：單水合檸

檬酸 40 g、MnSO4*H 2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4*7H 2O 1 g、CoC12*6H 2O 1 g、ZnSO4*7H 2O 1 g、CuSO4*5H 2O 100 mg ' H3BO3 100 mg 及 NaMoO4*2H 2O 100 mg 0 將各組分逐

一溶解於去離子水中，用HCl/NaOH將pH值調整至3.0，接

著補足體積，且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌。

在15 L生物反應器中，用含有pCLPtrcUpperPathwayHGS2 及pTrc KKDylkl S質體之BL21 （DE3）大腸桿 菌細胞進行醱

酵。進行此實驗以監測在醱酵所要之pH 7.0及溫度30°C下

自葡萄糖形成異戊二烯之情況。將自冷凍小瓶中獲取之大

腸桿菌菌株之接種體於LB培養液瓊脂板（含抗生素）上劃線

培養，且在37°C下培育。將單一群落接種至胰蛋白腺··酵

母提取物培養基中。接種體生長至OD 1.0（在550 nm下所

量測）之後，使用500 mL接種體接種5-L生物反應器。

以指數速率補給葡萄糖直至細胞到達停滯期為止。此

後，葡萄糖補料減至滿足代謝需求。在58小時醱酵期間傳

遞至生物反應器之葡萄糖的總量為2.1 kg。藉由添加IPTG 達成誘導。當550 nm下之光學密度（OD55o）達到值為9時，

使IPTG濃度達到25卩Μ。當OD550達到170時，IPTG濃度升

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至50 μΜ °生物反應器內隨時間而變之OD550概況展示於圖

104中。如本文所述測定生物反應器之釋出氣體中之異戊

二烯含量。異戊二烯力價隨著醱酵過程而增加5最終值達

到3.3 g/L（圖105）。在58小時醱酵期間所製造之異戊二烯之

總量為24.5 g ＞且製造時程展示於圖106中。在醱酵期間所

利用之參與製造異戊二烯之碳的莫耳產率為2.5%。自葡萄

糖製得之異戊二烯之重量百分比產率為1 .2%。分析顯示'

與表現CL PtrcUpperMVA 及 pTrc KKDylklS 質體之 BL21 相

比，異戊二烯合成酶之活性增強約3-4倍（數據未圖示）。

XIII.將下游甲羟戊酸途徑整合於大腸桿菌之染色體中

將含有甲舞·戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦

磷酸去莪酶及IPP異構酶之合成操縱子整合至大腸桿菌之

染色體中。必要時，可藉由在操縱子之5,處整合不同啟動

子來改變表現。

表4列出此實驗所用之引子。

表4.引子

MCM78 整合構築體之attTn7 向上反置引子

gcatgctcgagcggccgcTTTTAATCAAACATCCTGCCAACTC(SEQ ID NO:107)

MCM79 整合構築體之attTn7 向下反置引子

gatcgaagggcgatcgTGTCACAGTCTGGCGAAACCG(SEQ ID NO:108)

MCM88 整合構築體之attTn7 向上前置引子

ctgaattctgcagatatcTGTTTTTCCACTCTTCGTTCACTTT(SEQ ID NO: 109)

MCM89 整合構築體之attTn7 向下前置引子

tctagagggcccAAGAAAAATGCCCCGCTTACG(SEQID NO: 110)

MCM104 GI1.2啟動子-MVK Gatcgcggccgcgcccttgacgatgccacatcctgagcaaataattcaaccac taattgtgagcggataacacaaggaggaaacagctatgtcattaccgttcttaact tc(SEQ ID NO:111)

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i）構築標靶載體

MCM105 aspA终止子-yIDI Gatcgggccccaagaaaaaaggcacgtcatctgacgtgccttttttatttgtaga cgcgttgttatagcattcta(SEQ ID NO:112)

MCM120 attTn7前置引子： attTn7同源，GB標記

物同源

aaagtagccgaagatgacggtttgtcacatggagttggcaggatgtttgattaaa agcAATTAACCCTCACTAAAGGGCGG(SEQ ID NO: 113)

MCM127 1.2 GI互補反置引

子：GB標記物同源

（超長），啟動子，

RBS，ATG

AGAGTGTTCACCAAAAATAAIAACCTTTCCCGG TGCAgaagttaagaacggtaatgacatagctgtttcctccttgtgttatccgct cacaattagtggttgaattatttgctcaggatgtggcatcgtcaagggcTAAT ACGACTCACTATAGGGCTCG(SEQ ID NO:114)

選擇attTn7位點 以供整合。藉 由PCR，自MG1655細胞擴

增上游（attTn7向 上）（引 子MCM78及MCM79）及下 游（attTn7 向下）（引 子MCM88及MCM89）同 源之區域。在94°C下使具

有 1 jiL 10 μΜ 引子、3 再蒸餾水、45 gL Invitrogen Platinum 高保真 PCR 超混試劑（PCR Supermix High Fidelity） 及刮下之MG1655群落的50卩L反應物變性2分鐘，循環25 次（94°C T 2分鐘，50°C T 30秒，及68°C下1分鐘），在72°C 下延長7分鐘，且冷卻至4°C。根據製造商之說明書，將此

所得DNA選殖至pCR2.1（Invitrogen）中，得到質體

MCM278（attTn7 向上）及 MCM252（attTn7 向下）。將來自

MCM252之經分解且經凝膠純化之832 bp Apal-Pvul片 段選

殖至經Apal-Pvul分解 且經凝膠純化之質體pR6K中，產生

質體MCM276。將來自MCM278之經分解且經凝膠純化之

825 bp Pstl-Notl片段選殖至經Pstl-Notl分解且經凝膠純化

之MCM276中，產 生質 體MCM281。

ii）選殖下游途徑及啟動子

根據製造商之說明書'使用Roche Expand Long PCR系

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統，用引子 MCM104 及 MCM105 自 pTrcKKDylklS 擴 增

MVK-PMK-MVD-IDI基因。用NotHpal分解此產物，且

將其選殖至已用Notl及Apal分解且經凝膠純化之MCM281 中。使用 Stratagene Pfu Ultra II '用引子 MCM120 及

MCM127 自 GeneBridges FRT-gb2-Cm-FRT 模板 DNA 擴増

CMR卡匣。使用四份含有1卩L之約10 ng/μΕ模板、各1 pL 之引子、1.25卩L 10 mM dNTP、5 μΣ 10χ緩衝液、1卩L酶

及39.75卩L再蒸餾水之50卩L PCR反應物進行PCR變性程

式：95°C下4分鐘，5次循環（95°C下20秒，55°C下20秒，

72°C下2分鐘），25次循環（95°C下20秒，58°C下20秒，72°C 下2分鐘，72°C下10分鐘）；接著冷卻至4°C。彙集反應物，

在Qiagen PCR淨化管柱上純化，且用於電穿孔含有質體

MCM296之經水洗Pirl細胞。在2 mM電擊管（cuvette）中，

以2.5 V及200歐姆（ohm）進行電穿孔。在30°C下於LB中回

收電穿孔反應物3小時。在具有CMP5、Kan50之LA上選擇

轉型 體 MCM330（圖 107及圖 108 A-108C ； SEQ ID NO:25） ° iii）整合至大腸桿菌染色體中

用SnaBI分解來自MCM330之經小規模純化DNA （Qiaquick Spin套組），且將其用於電穿孔含有GeneBridges 質體 pRedET Carb 之 BL21 （DE3）（Novagen）或 MG1655。在

30°CT使細胞生長至OD約為1，接著在37°C下用0.4% L-阿

拉伯糖誘導1.5小時。在4°C再蒸餾水中洗滌此等細胞三

次，隨後與2卩L DNA 一起進行電穿孔。在含有氯黴素（5 pg/ml）之L瓊脂上選擇整合體，隨後確認在L瓊脂+康黴素

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(50 μg/ml)上不 會生長。冷凍BL21整合體 MCM331及

MG1655 整合體 MCM333。

iv)構築編碼野葛異戊二烯合成酶之pET24D-Kudzu將野葛異戊二烯合成酶基因自pCR2.1載體(Invitrogen)次

選殖至pET24d載體(Novagen)中。詳言之，使用引子

MCM50 5'-GATCATGCAT TCGCCCTTAG GAGGTAAAAA AACATGTGTG CGACCTCTTC TC AATTTACT(SEQ ID NO:52)及 MCM53 5'-CGGTCGACGG ATCCCTGCAG TTAGACATAC ATCAGCTG(SEQ ID NO:50)自 pTrcKudzu模

板DNA擴增野葛異戊二烯合成酶基因。使用Taq DNA聚合

酶(Invitrogen)進行PCR反應，且將所得PCR產物選殖至

pCR2.1 -ΤΟΡΟ ΤΑ選殖載體(Invitrogen)中，且轉型至大腸

桿菌Topi 0化學性勝任細胞(Invitrogen)中。將轉型體塗於

含有竣苯青黴素(50卩g/ml)之L瓊脂上，且在37°C下培育隔

夜。用單一轉型體接種含有50卩g/ml菽节青黴素之5 ml魯

利亞培養液培養物，且在37°CT生長隔夜。藉由對自1 ml 液體培養物(魯利亞培養液)分離之質體DNA進行定序來針

對正確插入物篩選五個群落，且使用QIAprep Spin Miniprep套組(Qiagen)進行純化。命名為MCM93之所得質

體於pCR2.1骨架中含有野葛異戊二烯合成酶編碼序列。

藉由用Pcil及BamH 1 (Roche)進行限制性核酸內切酶分解

來移出野葛編碼序列，且使用QIAquick凝膠萃取套組

(Qiagen)進行凝膠純化。用Ncol及BamHI(Roche)分解

pET24d載體DNA，用 蝦鹼性磷酸酶(Roche)處理，且使用

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QIAprep Spin Miniprep套組（Qiagen）進行純化。使用快速

DNA接合套組（Roche）將野葛異戊二烯合成酶片段接合於

經Ncol/BamHi分解之pET24d，片段與載體之比率為5:1，

總體積為20卩1。將一部分接合混合物（5卩1）轉型至大腸桿

菌Top 10化學性勝任細胞中 '，且塗於含有康黴素（50 卩g/ml）之L瓊脂上。藉由定序確認正確轉型體'且將其轉

型 至化學性勝任BL21（XDE3）pLysS細胞（Novagen）中。在

37°C下生長隔夜後'於含有康黴素（50卩g/ml）之L瓊脂上選

擇單一群落。命名為pET24D-Kudzu之所得質體之圖譜展

示於圖 109 中。pET24D-Kudzu 之序列（SEQ ID NO:26）展示

於圖110A及圖110B中。使用頂部空間檢驗確認異戊二烯

合成酶活性。

ν）製造菌株

用質 體 pCLPtrcupperpathway 與 pTrcKudzu 或 pETKudzu 共

同轉型菌株MCM331及MCM333，得到表5中所示之菌株。

表5.製造菌株

背景 整合下游 上游MVA質體 異戊二烯合成

酶質體

製造菌株

BL21(DE3) MCM331 pCLPtrcUpper Pathway

pTrcKudzu MCM343

BL21(DE3) MCM331 pCLPtrcUpperPathway

pET24D-Kudzu MCM335

MG1655 MCM333 pCLPtrcUpper Pathway

pTrcKudzu MCM345

vi）在15-L規模下自表現甲羟戊酸途徑基因且於批式補料培

養物中生長之大腸桿菌醱酵而製造異戊二烯

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培養基配方（毎公升酸酵培養基）：

使用以下組分產生培養基（毎公升醱酵培養基）：k2hpo4

7.5 g ' MgSO4*7H 2O 2 g、單水合檸檬酸2 g、檸檬酸鐵鉉

0.3 g '酵母提取物,0.5 g及ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液1 ml。

所有組分一起添加且溶解於去離子水中。對此溶液進行高

壓滅菌。用氫氧化錢（30%）將pH值調整至7.0且補足體積。

滅菌及調整pH值之後，添加10 g葡萄糖、0.1 g鹽酸硫胺

素、及抗生素。

1000X改質痕量金屬溶液：

使用以下組分產生1000X改質痕量金屬溶液：單水合檸

檬酸 40 g、MnSO4*H 2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4*7H 2O 1 g、CoC12*6H 2O 1 g、ZnSO4*7H 2O 1 g、CuSO4*5H 2O 100 mg、H3BO3 100 mg 及 NaMoO4*2H 2O 100 mg ° 將各組分逐

一溶解於去離子水中，用HCl/NaOH將pH值調整至3.0，接

著補足體積，且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌。

在15-L生物反應器中，用含有上述gil.2整合下游MVA途

徑以及 pCL PtrcUpperMVA 及 pTrcKudzu 質體之 BL2 1 （DE3） 大腸桿菌細胞進行醱酵。進行此實驗以監測在醱酵所要之

pH 7.0及溫度30°C下自葡萄糖形成異戊二烯之情況。將自

冷凍小瓶中獲取之大腸桿菌菌株之接種體於LB培養液瓊脂

板（含抗生素）上劃線培養，且在37°C下培育。將單一群落

接種至胰蛋白腺-酵母提取物培養基中。接種體生長至OD 1.0（在550 nm下所量測）之後，使用500 mL接種體接種5-L 生物反應器。

149050.doc -311 -

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以指數速率補給葡萄糖直至細胞到達停滯期為止。此

後，葡萄糖補料減至滿足代謝需求。在57小時醱酵期間傳

遞至生物反應器之葡萄糖的總量為3.9 kg。藉由添加IPTG 達成誘導。當二氧化碳析出速率達到100 mmol/L/h時，使

IPTG濃度達到100卩Μ。生物反應器內隨時間而變之OD550 概況展示於圖111Α中。如本文所述測定生物反應器之釋出

氣體中之異戊二烯含量。異戊二烯力價隨著醱酵過程而增

加，最終值達到1.6 g/L（圖111B） °醱酵過程中異戊二烯之

比生產力展示於圖111C中，且峰值為1.2 mg/OD/h。在57 小時醱酵期間所製造之異戊二烯之總量為1 6.2 g。在醱酵

期間所利用之參與製造異戊二烯之碳的莫耳產率為0.9%。

自葡萄糖製得之異戊二烯之重量百分比產率為0.4%。

XIV.使用甘油作為碳源，自含有野葛異戊二烯合成酶之大

腸桿菌BL21製造異戊二烯

使用表現野葛異戊二烯合成酶之大腸桿菌的15-L規模醱

酵，自批式補料培養物中補給甘油之細胞製造異戊二烯。

此實驗證實，在甘油存在下（不存在葡萄糖）生長之細胞製

造2.2 mg/L之異戊二烯。

培養基配方（每公升醱酵培養基）：

使用以下組分產生培養基（每公升醱酵培養基）：K2HPO4 7.5 g ' MgSO4*7H 2O 2 g、單水合檸檬酸2 g、檸檬酸鐵鉉

0.3 g及ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液1 ml。所有組分一起添加

且溶解於去離子水中。對此溶液進行高壓滅菌。用氫氧化

鉉（30%）將pH值調整至7.0且補足體積。滅菌及調整pH值之

149050.doc -312-

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後,添加5.1 g甘油、0.1 g鹽酸硫胺素、及抗生素。

ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液：

使用以下組分產生培養基（每公升醱酵培養基）：單水合

檸檬酸 40 g、MnSO4*H 2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4*7H 20 1 g、CoC12*6H 2O 1 g、ZnSO4*7H 2O 1 g、CuSO4*5H 2O 1 00 mg ' H3BO3 1 00 mg 及 NaMoO4*2H 2O 1 00 mg 0 將各組

分逐一溶解於去離子水中，用HCl/NaOH將pH值調整至

3.0,接著補足體積，且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌。

在15-L生物反應器中，用含有pTrcKudzu質體之BL21 （DE3）大腸桿菌細胞進行醱酵。進行此實驗以監測在醱酵

所要之pH 7.0及温度35°C下自甘油形成異戊二烯之情況。

將自冷凍小瓶中獲取之大腸桿菌菌株之接種體於LA培養

液瓊脂板（含抗生素）上劃線培養，且在37°C下培育。將單

一群落接種至大豆腺-酵母提取物-葡萄糖培養基中且在

35°C下生長。接種體生長至OD 1.0（在550 nm下所量測）之

後，使用600 mL接種體接種7.5-L生物反應器。

以指數速率補給甘油，直至550 nm下細胞之光學密度

（OD550）達到153為止。在36小時醱酵期間傳遞至生物反應

器之甘油的總量為1.7 kg。除接種體中之葡萄糖以外，未

添加葡萄糖至生物反應器中。藉由添加IPTG達成誘導。當

OD550達到值為50時，使IPTG濃度達到20卩Μ。生物反應

器內隨時間而變之OD550概況展示於圖57中。如本文所述

測定生物反應器之釋出氣體中之異戊二烯含量。異戊二烯

力價隨著醱酵過程而增加，最終值達到2.2 mg/L（圖58）。

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在54小時醱酵期間所製造之異戊二烯之總量為20.9 mg ‘且製造時程展示於圖59中。

XV.使用轉化糖作為碳源，在1 5-L規模下自表現甲舞■戊酸

途徑基因且於批式補料培養物中生長之大腸桿菌醱酵而製

造異戊二烯

使用表現甲舞戊酸途徑多肽及野葛異戊二烯合成酶之大

腸桿菌的15-L規模醱酵，自批式補料培養物中補給轉化糖

之細胞製造異戊二烯。此實驗證實，在轉化糖存在下生長

之細胞製造2.4 g/L之異戊二烯。

培養基配方（每公升醱酵培養基）：

使用以下組分產生培養基（每公升醱酵培養基）：K2HPO4 7.5 g、MgSO4*7H 2O 2 g、單水合檸檬酸2 g、檸檬酸鐵鉉

0.3 g '酵母提取物0.5 g及ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液1 ml。

所有組分一起添加且溶解於去離子水中。對此溶液進行高

壓滅菌。用氫氧化鉉（30%）將pH值調整至7.0且補足體積。

滅菌及調整pH值之後，添加10 g轉化糖、0.1 g鹽酸硫胺

素、及抗生素。

1000X改質痕量金屬溶液：

使用以下組分產生1000Χ改質痕量金屬溶液：單水合檸

檬酸 40 g、MnSO4*H 2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4*7H 2O 1 g、CoC12*6H 2O 1 g ' ZnSO4*7H 2O 1 g ' CuSO4*5H 2O 100 mg ' H3BO3 100 mg 及 NaMoO4*2H 2O 100 mg 0 將各組分逐

一溶解於去離子水中'用HCl/NaOH將pH值調整至3.° ‘接

著補足體積，且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌。

149050.doc -314-

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在15-L生物反應器中，用含有pCL PtrcUpperMVA及pTrc KKDylkl S質體之BL21 （DE3）大腸桿菌細胞進行醱酵。進

行此實驗以監測在醱酵所要之pH 7.0及溫度30°CT自轉化

糖形成異戊二烯之情況。將自冷凍小瓶中獲取之大腸桿菌

菌株之接種體於LB培養液瓊脂板（含抗生素）上劃線培養，

且在37°C下培育。將單一群落接種至胰蛋白腺-酵母提取

物培養基中。接種體生長至OD 1.0（在550 nm下所量測）之

後，使用500 mL接種體接種5-L生物反應器。

以指數速率補給轉化糖直至細胞到達停滯期為止。此

後，轉化糖補料減至滿足代謝需求。在44小時醱酵期間傳

遞至生物反應器之轉化糖的總量為2.4 kg °藉由添加IPTG 達成誘導。當550 nm下之光學密度（OD550）達到值為9時，

使IPTG濃度達到25卩Μ。當OD550達到200時，IPTG濃度升

至50卩Μ。生物反應器內隨時間而變之OD550概況展示於圖

96中。如本文所述測定生物反應器之釋出氣體中之異戊二

烯含量。異戊二烯力價隨著醱酵過程而增加，最終值達到

2.4 g/L（圖97）。在44小時醱酵期間所製造之異戊二烯之總

量為18.4 g，且製造時程展示於圖98中。在醱酵期間所利

用之參與製造異戊二烯之碳的莫耳產率為1.7%。自葡萄糖

製得之異戊二烯之重量百分比產率為0.8%。

實例9.構築上游及下游MVA途徑以供整合至枯草桿菌中

I. 在枯草桿菌中構築上游MVA途徑

在叩"啟動子控制下，將來自糞腸球菌之上游途徑整合

至枯草桿菌中。該上游途徑由兩個基因組成：編碼AACT

149050.doc -315-

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及HMGR之mvaE，及編碼HMGS之mvaS。該 兩個基因融合

在一起'其間具有終止密碼子，在mvaS之前具有RBS位

點，且該兩個基因處於"rE啟動子控制下。終止子位於

mvaE基因之後。在mvaE基因之後選殖氯黴素抗性標記

物，且藉由使用側接同源區進行雙雜交(double cross)而在

aprE基因座處整合構築體。

藉由PCR擴增四個DNA片段，使之含有允許其經由PCR 反應融合在一起之懸垂物(overhang)。根據製造商之說明

書，使用Herculase聚合酶進行PCR擴增。

1. PaprEaprE畋動子PstI之CF 07-134 (+)起始端

55- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID N0:115)

CF 07-94 (-)融合 PaprE與 ntvaE

5'- CAATAATAACTACTGTTTTCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAA (SEQ ID NO: 116)

模板：枯草桿菌染色體DNA2. mvaE

CF 07-93 (+)融合mvaE與αρτΕ馭動子(GTG起始密碼子)

5'- TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO: 117)

CF 07-62 (-)融合之間具有RBS之mvaE與mvaSy- TITATCAATCCCAATTGTCATGITrTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC (SEQ ID NO:94)

模板：糞腸球菌染色體DNA(來自ATCC)3. mvaS

CF 07-61 (+)融合之間具有RBS之mvaE與mvaS

149050.doc -316-

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5'-GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA(SEQ ID NO:95)

CF 07-124 (-)融合秫vaS末端與终止子

5、CGGGGCCAAGGCCGGTTimTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ IDNO: 118)

模板：糞腸球菌染色體DNA4. 解澱粉桿菌鹼性絲胺酸蛋白酶终止子

CF 07-123 (+)融合mvaS末端與终止子5、 ACCGTTCGTTCTTATCGAAACTAAAAAAAACCGGCCITGGCCCCG (SEQ IDNO: 119)

解澱粉桿菌 終止子BamHI之CF 07-46 (-)末端

5'- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO:58)

模板：解澱粉桿菌染色體DNAP C R融合反應

5.融合 mvaE與 mvaS

CF 07-93 ( + )融合mvaE與αρ尸E啟動子(GTG起始 密碼子)

5'- TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO: 117)

CF 07-124 (-)融合秫vaS末端與終止子

55- CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ IDNO: 118)

模板：上述#2及#36.融合mvaE-mvaS與aprE馭動子

aprE啟動子PstI之CF 07-134 (+)起始端

5s- GACATCTGCAGCTCCAITTTCTTCTGC (SEQ ID NO: 115)

CF 07-124 (-)融合mvaS末端與終止子

55- CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ IDNO:118)

149050.doc -317-

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模板：上述#1及#47.融合PaprE-mvaE-mvaS與终止子

叩尸E啟動子PstI之CF 07-134 (+)起始端

5'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO:115)

解澱粉桿 菌終止子BamH I之CF 07-46 (-)末端

5，- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO:58)

模板：#4與#6用限制性核酸內切酶Pstl/BamHI分解產物5且將其接合

於經 Pstl/BamHI 分解之 pJM 102(Perego, Μ. 1993. Integrational vectors for genetic manipulation in Bacillus

subtilis，第 615-624 頁。A. L. Sonenshein, J. A. Hoch及 R. Losick (編),Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria: biochemistry, physiology, and molecular genetics. American Society for Microbiology, Washington, D.C.)。將

接合物轉型至大腸桿菌TOP 10化學性勝任細胞中，且在含

有寇苯青黴素(50卩g/ml)之LA上選擇轉型體。藉由定序鑑

別 正確質體且命名 為pJMUpperpathway2(圖50及圖51)°將

經純化之質體DNA轉型至枯草桿菌aprEnprE Pxyl-co机K 中，且在含有氯黴素(5 Mg/ml)之L瓊脂上選擇轉型體。選

擇正確群落，且依序塗於含有10、15及25 μg/ml氯黴素之

L瓊脂上以擴増含有上游途徑之卡匣的複本數。

藉由使所得菌株於含有1%葡萄糖及1%之LB中生長來測

試該菌株之甲理戊酸產量。藉由GC分析培養物之甲舞■戊

酸產量。

149050.doc -318-

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隨後使用此菌株作為整合下游甲羟戊酸途徑之宿主。

使用以下引子對上述各種構築體進行定序。

定序引子：

aprE馭動子PstI之CF 07-134 (+)起始端

5'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO: 115)

mvaE基因 之CF 07-58 (+)起始端

5'- ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC (SEQ ID NO:97)

mvaE基因之CF 07-59 (-)末端

5'- ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (SEQ ID NO:98)

mvaS基 因 之CF 07-82 (+)起始端

5'- ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (SEQ ID NO:99)

mvaS基因之CF 07-83 (-)末端

55- TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 100)

mvaE 中之 CF 07-86 (+)序列

5，- GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC (SEQ ID NO:101)

mvaE 中 之 CF 07-87 (+)序 列

55- ITGCCAATCATATGATTGAAAATC (SEQ ID NO: 102)

mvaE 中之 CF 07-88 (+)序列

5'- GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (SEQ ID NO: 103)

mvaS 中之 CF 07-89 (+)序列

55- GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC (SEQ ID NO: 104)

在含有濃度為5卩g/ml之氯黴素之LA上選擇轉型體。藉

由定序確認一個群落正確整合，且將其塗於含有經數天濃

度漸増(最终含量達到25 μg/ml)之氯黴素之LA_L。此使得

149050.doc -319-

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含有相關基因之卡匣擴增。所得菌株命名為CF 455 :pJMupperpathway# 1 X枯草桿菌 aprEnprE Pxyl comK｛經擴

增以於含有25 μg/.ml氯黴素之LA上生長）。

II. 在枯草桿菌中構築下游MVA途徑

將由基因mvkl ' pmk、mpd及idi組成之下游MVA途徑組

合於由來自枯草桿菌染色體之nprE區域（整合位點）之側接

DNA區域、叩,归啟動子及壯觀黴素抗性標記物組成之卡匣

中（見圖28及圖29 : SEQ ID N0:13） °由DNA2.0合成 此卡

匣，且將其整合至含有整合於aprE基因座處之上游MVA途

徑的枯草桿菌染色體中。自實例4中所述之複製質體表現

野葛異戊二烯合成酶基因，且將其轉型至整合有上游與下

游途徑之菌株中。

實例10：例示性異戊二烯組合物及其製造方法

I. 含有異戊二烯之醱酵釋出氣體之組成分析

用含有兩種編碼類異戊二烯前驅物生物合成之完整甲舞

戊酸途徑、酵母異戊二烯基焦磷酸異構酶及野葛異戊二烯

合成酶之質體（pCL upperMev ； pTrcKKDylklS）的重組大腸

桿菌BL21 （DE3）菌株進行14 L規模醱酵。在峰值異戊二烯

生產力時間（27.9小時已醱酵時間，「EFT」）左右，將14 L 槽之醱酵釋出氣體收集至20 mL頂部空間小瓶中，且藉由

頂部空間GC/MS分析揮發性組分。

用 配備有 Agilent HP-5MS GC/M S 管柱（30 m><250 μπι ； 0.25卩m膜厚度）之Agilent 6890 GC/M S系統進行頂部空間

分析。使用combiPAL自動注射器自20 mL頂部空間小瓶中

149050.doc -320-

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取出500卩L等分試樣。GC/MS方法利用氨作為載氣，流速

為1 mL/min。保持注射口在250°C下，分流比為50:1。使烘

箱溫度在37°C下初始保持2分鐘，接著以2 5°C/min之速率增

至237°C，總方法時間為10分鐘。Agilent 5793N質量選擇

偵測器在m/z 29至m/z 3 00之間掃描。此系統之偵測限度為

約0.1卩g/La.號或約0.1 ppm。必要時，可使用具有較低偵測

限度之更敏感設備。

釋出氣體由以下組成：99.925%（v/v）永久氣體（Ν?、CO2 及O2）、約0.075%異 戊二烯（2-甲基-1,3- 丁二烯）（約750 ppmv，2100 gg/L），及微量（＜50 ppmv）乙醇、丙酮及兩種

C5異戊二烯醇。未測定水蒸氣之量，但據估算其等於0°C

下之平衡蒸氣壓。藉由對GC/MS層析圖（圖86A及圖86B）中

峰下方之面積進行積分來確定揮發性有機部分之組成，且

列於表6中。乙醇及丙酮標準物之校準曲線使得能夠使用

標準方法將GC面積轉換成以卩g/L為單位之氣相濃度。

表6.醱酵釋出氣體中揮發性有機組分之組成。在使用表現

異源甲舞戊酸途徑、酵母異戊二烯基焦磷酸異構酶及野葛

異戊二烯合成酶的大腸桿菌BL21 （DE3）菌株醱酵之27.9小

時時間點分析釋出氣體。

化合物 RT(min) GC面積 面積％ 濃度（卩g/L）乙醇 1.669 239005 0.84 62+/- 6丙酮 1.703 288352 1.02 42+/- 4異戊二烯（2-甲基-1,3-丁二烯）

1.829 27764544 97.81 2000+/- 200

3・甲基・3-丁烯-1・醇 3.493 35060 0.12 <103-甲基2 丁烯-1-醇 4.116 58153 0.20 <10

149050.doc -321 -

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π. 量測在重組大腸桿菌菌株醱酵期間與異戊二烯共同製

造之痕量揮發性有機化合物（VOC）用含有兩種編碼類異戊二烯前驅物生物合成之完整甲理

戊酸途徑、酵母異戊二烯基焦磷酸異構酶及野葛異戊二烯

合成酶之質體（pCL upperMev ； pTrcKKDylklS）的重 組大腸

桿菌BL21 （DE3）菌株進行14 L規模醱酵。

使醱酵釋出氣體通過冷卻之頂部空間小瓶 以濃縮並鑑別

痕量揮發性有機組分。對此醱酵之釋岀氣體進行取樣，且

使其以1 L/min之速率通過裝填有石英棉（2 g）並以乾冰冷

卻至-78°C之20 mL頂部空間小瓶，持續10分鐘。用新瓶蓋

將小瓶重新封蓋'且藉由頂部空間GC/MS，使用實例1 0部

分I中所述之條件分析所捕獲之VOC。在圖87A-87D中觀測

到之化合物比率為醱酵釋出氣體中之總含量、-78°C下之

相對蒸氣壓及質譜儀之偵測器回應值的組合。舉例而言，

異戊二烯相對於氧化揮發物（例如 丙酮及 乙醇）之低含量與

此物質之高揮發性相關，使得其在-78°C下不會積累於頂

部空間小瓶中。

許多此等化合物之存在為源自生物來源之異戊二烯組合

物所特有。結果描繪於圖87A-87D中且概述於表7A及表7B 中 ο

149050.doc -322-

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表7A :在-78 °C下低溫捕獲(cryo-trapping)之後由大腸桿菌

BL21 (DE3)(pCL upperMev ； pTrcKKDylklS)製造之釋出

氣體中存在之痕量揮發物

化合物 RT(min) GC面積ί 面積％2 比率％?

乙醛 1.542 4019861 4.841 40.14乙醇 1.634 10553620 12.708 105.39丙酮 1.727 7236323 8.714 72.26

2-甲基-1,3-T二烯 1.777 10013714 12.058 100.001-丙醇 1.987 163574 0.197 1.63雙乙醯 2.156 221078 0.266 2.21

2-甲基-3-丁烯-2-醇 2.316 902735 1.087 9.012-甲基-1-丙醇 2.451 446387 0.538 4.463-甲基-1-丁醛 2.7 165162 0.199 1.65

1-丁醇 2.791 231738 0.279 2.313-甲基-3-丁烯-1-醇 3.514 14851860 17.884 148.32

3-甲基-1-丁醇 3.557 8458483 10.185 84.473・甲基-2·■丁烯·1-醇 4.042 18201341 21.917 181.763-甲基-2-丁烯醛 4.153 1837273 2.212 18.35乙酸3-甲基丁酯 5.197 196136 0.236 1.96

乙酸3-甲基-3-丁烯-1-基酯 5.284 652132 0.785 6.512-庚酮 5.348 67224 0.081 0.67

2,5-二甲基。比嗪 5.591 58029 0.070 0.58乙酸3・甲基・2-丁烯-1·基酯 5.676 1686507 2.031 16.84

6・甲基・5-庚烯^2・酮 6.307 101797 0.123 1.022,4,5-=.甲基毗咤 6.39 68477 0.082 0.682,3,5-三甲基毗嗪 6.485 30420 0.037 0.30

(Ε)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯 6.766 848928 1.022 8.48(Ζ)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯 6.864 448810 0.540 4.48丁酸3・甲基・2・丁烯基酯 7.294 105356 0.127 1.05

香茅醛 7.756 208092 0.251 2.082,3-環庚烯醇毗咤 8.98 1119947 1.349 11.18

1 GC面積為對應於所列化合物之峰下方的未修正面積。

2面積％為峰面積相對於所有化合物之總峰面積，以％表

示。

3比率％為峰面積相對於2-甲基-1,3-T二烯之峰面積，以％

表示。

149050.doc -323 -

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表7B.在-196°C下低溫捕獲之後由大腸桿菌BL21(DE3)(pCL upperMev ； pTrcKKDylklS)製造之釋出氣體

中存在之痕量揮發物

化合物 RT(min) GC面積1 面積％2 比率％3

乙醛 1.54 1655710 0.276 0.33甲硫醇 1.584 173620 0.029 0.03

乙醇 1.631 10259680 1.707 2.03丙酮 1.722 73089100 12.164 14.43

2-甲基-1,3-T二烯 1.771 506349429 84.269 100.00

乙酸甲酯 1.852 320112 0.053 0.061-丙醇 1.983 156752 0.026 0.03雙乙醯 2.148 67635 0.011 0.012-丁酮 2.216 254364 0.042 0.05

2-甲基-3-丁烯-2-醇 2.312 684708 0.114 0.14

乙酸乙酯 2.345 2226391 0.371 0.442-甲基-1-丙醇 2.451 187719 0.031 0.043-甲基-1-丁醛 2.696 115723 0.019 0.023-甲基-2-丁酮 2.751 116861 0.019 0.02

1-丁醇 2.792 54555 0.009 0.012-戊酮 3.034 66520 0.011 0.01

3-甲基-3-丁烯-1-醇 3.516 1123520 0.187 0.223-甲基-1-丁醇 3.561 572836 0.095 0.11異丁酸乙酯 3.861 142056 0.024 0.03

3-甲基2 丁烯-1-醇 4.048 302558 0.050 0.063-甲基-2-丁烯醛 4.152 585690 0.097 0.12

乙酸丁酯 4.502 29665 0.005 0.01乙酸3-甲基丁酯 5.194 271797 0.045 0.05

乙酸3-甲基-3-丁烯-1-基酯 5.281 705366 0.117 0.14乙酸3-甲基-2-丁烯-1-基酯 5.675 815186 0.136 0.16

(E)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯 6.766 207061 0.034 0.04(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯 6.863 94294 0.016 0.02

2,3-環庚烯醇。比呢 8.983 135104 0.022 0.03

1 GC面積為對應於所列化合物之峰下方的未修正面積°

2面積％為峰面積相對於所有化合物之總峰面積’以％表

示 °

3比率％為峰面積相對於2-甲基-1,3-T二烯之峰面積，以％

表示。

149050.doc -324-

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III.源自醱酵之異戊二烯中不存在C5煙異構體

使用於液氮中冷卻之2 mL頂部空間小瓶進行醱酵釋出氣

體中存在之異戊二烯的低溫捕獲。首先使釋出氣體（1 L/min）通過含有氫氧化鏡顆粒之20 mL小瓶以使2 mL小瓶

（-196°C ）中冰及固體CO?之積累最少。使約10 L釋出氣體通

過小瓶，此後在通氣下將其溫至-78°C，接著用新瓶蓋重

新密封且藉由GC/MS進行分析。

以使用100卩L氣密性注射器之Agilent 6890 GC/MS系

統，以頂部空間模式進行GC/MS頂部空間分析。使用

Zebron ZB-624 GC/M S 管柱（30 mx250 μηι : 1.40 pm膜厚

度）分離分析物。GC自動注射器配備有氣密性100卩L注射

器，且調整針高度以允許注射來自2mL GC小瓶之50卩L頂

部空間樣品。GC/MS方法利用氨作為載氣，流速為1 mL/min。保持注射口在200°C下，分流比為20:1。歷經5分

鐘之分析持續時間，保持烘箱溫度為37°C。以m/z為55、

66、67及70之單離子監測（SIM）模式操作Agilent 5793N質

量選擇偵測器。在此等條件下，觀測到異戊二烯在2.966 分鐘時溶離（圖88B） °亦使用此方法分析石油來源性異戊

二烯（Sigma-Aldrich）之標準物，且發現其含有其他C5煙異

構體，該等異構體在主峰之前或之後不久溶離且基於經修

正之GC面積來定量（圖88 A） °

149050.doc •325 ・

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表8A :石油來源性異戊二烯之GC/MS分析

化合物 RT(min) GC面積 全部C5煙之面積％

2-甲基-1-丁烯 2.689 18.2X103 0.017%

(Z)-2-戊烯 2.835 ΙΟ.όχΙΟ4 0.101%

異戊二烯 2.966 10.4χ107 99.869%

1,3-環戊二烯

（CPD）3.297 12.8X103

__________0.012%

表8B :醱酵來源性異戊二烯之GC/MS分析（全部C5煙.％）

化合物 RT(min) 經修正之GC面積 全部C5^%

異戊二烯 2.966 8.1X107 100%

在獨立實驗中，分析C5煌之標準混合物以判定各化合物

之偵測器回應值是否相同。該等化合物為2-甲基-1-丁烯、

2-甲基-1,3-T 二烯、（E）-2-戊烯、（Z）-2-戊烯及（E）-l,3-戊

二烯。在此狀況下，在 Agilent DB-Petro 管柱（100 mx0.25 mm，0.50卩m膜厚度）上於50°C下保持1 5分鐘來進行分析。

GC/MS方法利用氛作為載氣，流速為1 mL/min。保持注射

口在200°C下'分流比為50:1。以m/z 19至m/z 250之全掃

描模式操作Agilent 5793N質量選擇偵測器°在此等條件

下，濃度為10。卩g/L之各標準物在實驗誤差內產生相同偵

測器回應值。

IV.使包含異戊二烯之組合物吸附於固相

使以生物方法製造之異戊二烯吸附於活性碳'使得固相

含有50%至99.9%碳、0.1%至50%異戊二烯、0.01%至5%水

及微量（＜0.1%）其他揮發性有機組分。

使醱酵釋出氣體穿過保持於0°C下之銅冷凝線圈，接著

149050.doc - 326-

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穿過顆粒狀二氧化矽乾燥劑過濾器以移除水蒸氣。接著使

已除濕之釋出氣體穿過含碳過濾器（Koby Jr, Koby Filters, MA），達到藉由GC/MS在過濾器排氣中偵測到異戊二烯析

出之程度。可藉由計算釋出氣體中之濃度、總流動速率及

在收集期之析出百分比間接地確定吸附於濾筒之異戊二烯

的量。或者，可藉由熱、真空或溶劑介導之脫附自過濾器

回收所吸附之異戊二烯。

V. 收集並分析經冷凝之異戊二烯

對醱酵釋出氣體除濕，且藉由經適合吸附劑（例如鹼石

棉）過濾來移除co2 °接著使所得釋出氣流穿過經液氮冷卻

之冷凝器以冷凝氣流中之VOC。收集容器含有第三丁基兒

茶酚以抑制所得異戊二烯冷凝物。藉由GC/MS及NMR分析

冷凝物以使用標準方法（諸如本文所述之彼等方法）測定純

度。

VI. 藉由醱酵製造異戊二烯醇

對表現野葛異戊二烯合成酶之大腸桿菌BL21 （DE3）菌株

之釋出氣體進行的分析揭示，存在異戊二烯與3-甲基-3-丁

烯-1-醇（異戊二烯醇）。整個醱酵過程之醱酵釋出氣體中該

兩種化合物之含量展示於圖89中，如由頂部空間GC/M S所

測,定。在此實驗中，所獲得之異戊二烯醇（3-甲基-3-丁烯-

1-醇，3-MBA）之含量接近10 Mg/L»出瓦龍。其他實驗得到在

醱酵釋出氣體中含量為約20卩g/Lji出瓦體。

實例11 ：在表現甲拜戊酸途徑基因且於批式補料培養物中

醱酵之大腸桿菌中使生長與異戊二烯製造相分離

149050.doc -327-

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實例11說明使細胞生長與甲您戊酸及異戊二烯製造相分

離。

I. 醱酵條件

培養基配方（每公升醱酵培養基）：

使用以下組分產生培養基（每公升醱酵培養基）：K2HPO4 7.5 g、MgSO4*7H 2O 2 g、單水合檸檬酸2 g、檸檬酸鐵鉉

0.3 g、酵母提取物0.5 g及ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液1 ml。

所有組分一起添加且溶解於去離子水中。對此溶液進行高

壓滅菌。用氫氧化鉉（30%）將pH值調整至7.0且補足體積。

滅菌及調整pH值之後 > 添加10 g葡萄糖、。.1 g鹽酸硫胺

素、及抗生素。

ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液：

使用以下組分產生1000X改質痕量金屬溶液：單水合檸

檬酸 40 g、MnSO4*H 2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4*7H 2O 1 g、CoC12*6H 2O 1 g、ZnSO4*7H 2O 1 g、CuSO4*5H 2O 100 mg、H3BO3 100 mg 及 NaMoO4*2H 2O 100 mg ° 將各組分逐

一溶解於去離子水中'用HCl/NaOH將pH值調整至3.° ‘接

著補足體積，且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌°

用含有 pTrcHis2AUpperPathway（亦稱為 pTrcUpperMVA ‘ 圖 91及圖 92A-92C ； SEQ ID NO:23）（50 pg/mlM 节青黴素）

或 pCL PtrcUpperMVA（亦稱為 pCL PtrcUpperPathway（圖

26））（50 Mg/ml壯觀黴素）質體之大腸桿菌細胞進行醱酵。對

於製造異戊二烯之實驗，大腸桿菌細胞亦含有pTrc KKDyIkIS（50 pg/ml康黴素）質體。進行此等實驗以監測在

149050.doc - 328-

1434921

醱酵所要之pH 7.0及溫度30°C下自葡萄糖形成甲翔戊酸或

異戊二烯之情況。將自冷凍小瓶中獲取之大腸桿菌菌株之

接種體於LA培養液瓊脂板(含抗生素)上劃線培養，且在

37°C下培育。將單一群落接種至胰蛋白月東-酵母提取物培

養基中。接種體生長至在550 nm下所量測之光學密度為

I. 0之後，將其用於接種生物反應器。

以指數速率補給葡萄糖直至細胞到達停滯期為止。此

後，葡萄糖補料減至滿足代謝需求。藉由添加IPTG達成誘

導。藉由將經過氯酸(Sigma-Aldrich 244252號)處理之樣品

(0.3 Μ，在4°C下培育5分鐘)施加於有機酸HPLC管柱

(BioRad 125-0140號)來測定醱酵培養液中甲無戊酸之濃

度。藉由將培養液甲無戊酸峰尺寸與藉由用過氯酸處理甲

羟戊酸內酯(Sigma-Aldrich M4667號)形成D,L-甲舞.戊酸而

產生之校準曲線相比較來測定濃度。如本文所述測定生物

反應器之釋出氣體中之異戊二烯含量。每公升醱酵培養液

所製造之異戊二烯之量即定為異戊二烯力價。

II. 在150-L規模下自表現pTrcUpperMVA質體之大腸桿菌

BL21 (DE3)細胞製造甲理戊酸

將如上文實例11部分I中所說明於板上生長之BL21 (DE3)細胞接種至含有45 mL胰蛋白腺-酵母提取物培養基

之燒瓶中，且在30°C、以170 rpm震盪下培育5小時。將此

溶液轉移至胰蛋白腺-酵母提取物培養基之5-L生物反應器

中 > 且在30°C及27.5 rpm下使細胞生長至培養物之OD550達

到1.0。將5 L接種體接種至含有45-kg培養基之150 L生物

149050.doc -329 -

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反應器中。當OD 550達到值為10時，使IPTG濃度達到1-1 mM。生物反應器內隨時間而變之OD550概況展示於圖60A 中。甲經戊酸力價隨著醱酵過程而增加5最終值達到6 1 .3 g/L(圖60B)。整個醱酵中之比生產力概況展示於圖60C 中，且與圖60A之比較說明生長與甲舞■戊酸製造相分離°

在5 2.5小時醱酵期間自14.1 kg所利用之葡萄糖製造之甲Μ 戊酸的總量為4.0 kg。在醱酵期間所利用之參與製造甲無

戊酸之碳的莫耳產率為34.2%。

III.在15-L規模下自表現pTrcUpperMVA質體之大腸桿菌

BL21 (DE3)細胞製造甲誣戊酸

將如上文實例11部分I中所說明於板上生長之BL21 (DE3)細胞接種至含有500 mL胰蛋白腺-酵母提取物培養基

之燒瓶中，且在3 0°C、160 rpm下生長至OD5 50為1·°。將此

物質接種至含有4.5 kg培養基之15-L生物反應器中°當

OD550達到值為10時，使IPTG濃度達到1.° mM °生物反應

器內隨時間而變之OD550概況展示於圖61A中。甲無戊酸力

價隨著醱酵過程而增加'最終值達到53.9 g/L(圖61B) °整

個醱酵中之比生產力概況展示於圖61C中'且與圖61A之

比較說明生長與甲铿戊酸製造相分離°在46.6小時醱酵期

間自2.1 kg所利用之葡萄糖製造之甲羟戊酸的總量為491 g ο在醱酵期間所利用之參與製造甲無戊酸之碳的莫耳產

率為28.8%。

IV.在1 5-L規模下自表現pTrcUpperMVA質體之大腸桿菌

FM5細胞製造甲巍戊酸

149050.doc •330 ·

1434921

將如上文實例11部分I中所說明於板上生長之FM5細胞接

種至含有500 mL胰蛋白腺-酵母提取物培養基之燒瓶中 ，

且在30°C、160 rpm下生長至OD550為1.。。將此物質接種至

含有4.5-kg培養基之15-L生物反應器中。當OD550達到值為

30時，使IPTG濃度達到1.0 mM。生物反應器內隨時間而

變之OD550概況展示於圖62A中。甲蔣戊酸力價隨著醱酵過

程而增加，最终值達到23.7 g/L(圖62B)。整個醱酵中之比

生產力概況展示於圖62C中，且與圖62 A之比較說明生長

與甲羟戊酸製造相分離。在5 1.2小時醱酵期間自1 . 1 kg所

利用之葡萄糖製造之甲無戊酸的總量為140 g。在醱酵期

間所利用之參與製造甲理戊酸之碳的莫耳產率為15.2%。

V. 在 15-L 規模下自表現 pCL PtrcUpperMVA 及 pTrc KKDylklS質體之大腸桿菌BL21 (DE3)細胞製造異戊二烯

將如上 文實例11部分I中所說明於板 上生長 之表現pCL PtrcUpperMVA 及 pTrc KKDylkl S質體之 BL21 (DE3)細胞接

種至含有500 mL胰蛋白月東-酵母提取物培養基之燒瓶中，

且在30°C、160 rpm下生長至OD550為1.。。將此物質接種至

含有4.5-kg培養基之15-L生物反應器中。當OD550達到值為

10時，使IPTG濃度達到25 μΜ °當OD550達到190時，IPTG 濃度升至50卩Μ。在醱酵38小時之時，IPTG濃度升至100 μΜ °生物反應器內隨時間而變之OD550概況展示於圖63Α 中。異戊二烯力價隨著醱酵過程而増加，最終值達到2.2 公克/公升培養液(圖63Β)。整個酸酵中之比生產力概況展

示於圖63C中，且與圖63Α之比較說明生長與異戊二烯製

149050.doc -331 -

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造相分離。在54.4小時醱酵期間自2.3 kg所利用之葡萄糖

製造之異戊二烯的總量為15.9 g。在醱酵期間所利用之參

與製造異戊二烯之碳的莫耳產率為1-53%。

VI. 在 15-L 規模下 自 表現 pCL PtrcUpperMVA 及 pTrc KKDylklS質體之大腸桿菌BL21 (DE3) tuner細胞製造異戊

二烯

將如上文實例11部分I中所說明於板上生長之表現pCL PtrcUpperMVA及 pTrc KKDylklS 質體之 BL21 (DE3) tuner細

胞接種至含有500 mL胰蛋白腺-酵母提取物培養基之燒瓶

中，且在30 °C' 1 60 rpm下 生長至OD550為1·。。將此物質接

種至含有4.5-kg培養基之15-L生物反應器中。當O D550達到

值為10時，使IPTG濃度達到26 μΜ。當OD550達到175時，

IPTG濃度升至50 μΜ °生物反應器內隨時間而變之OD550

概況展示於圖64Α中。異戊二烯力價隨著醱酵過程而增

加，最終值達到1.3公克/公升培養液(圖64Β)。整個醱酵中

之比生產力概況展示於圖64C中，且與圖64Α之比較說明

生長與異戊二烯製造相分離。在48.6小時醱酵期間自1.6 kg所利用之葡萄糖製造之異戊二烯的總量為9.9 g。在醱酵

期間所利用之參與製造異戊二烯之碳的莫耳產率為

1.34%。

VII. 在 15-L 規模下自表現 pCL PtrcUpperMVA 及 pTrc KKDylkl S質體之大腸桿菌MG1655細胞製造異戊二烯

將如上 文實例11部分I中所說明於板上生長之表現pCL PtrcUpperMVA及 pTrc KKDylklS 質 體之 MG1655 細胞接種至

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含有500 mL胰蛋白月東-酵母提取物培養基之燒瓶中，且在

3 0 °C、160 rpm下生長至OD550為10°將此物質接種至含有

4.5-kg培養基之15-L生物反應器中。當OD550達到值為45 時，使IPTG濃度達到24卩Μ。生物反應器內隨時間而變之

OD55o概況展示於圖65 A中。異戊二烯力價隨著醱酵過程而

增加，最終值達到393毫克/公升培養液（圖65B）。整個醱酵

中之比生產力概況展示於圖65C中，且與圖65A之比較說

明生長與異戊二烯製造相分離。在67.4小時醱酵期間自

520 g所利用之葡萄糖製造之異戊二烯的總量為2.2 g。在

醱酵期間所利用之參與製造異戊二烯之碳的莫耳產率為

0.92%。

VIII.在 15-L 規模下自表現 pCL PtrcUpperMVA 及 pTrc KKDylklS質 體之大 腸桿菌MG1655ack-pta細 胞製 造異戊

二烯

將如上文實例11部分I中所說明於板上生長之表現pCL PtrcUpperMVA 及 pTrc KKDylklS 質體之 MG1 655ack-pta 細

胞接種至含有500 mL胰蛋白月東-酵母提取物培養基之燒瓶

中，且在30°C、160 rpm下生長至OD550為1.。。將此物質接

種至含有4.5-kg培養基之1 5-L生物反應器中。當OD550達到

值為10時，使IPTG濃度達到30卩Μ。生物反應器內隨時間

而變之OD550概況展示於圖66Α中。異戊二烯力價隨著醱酵

過程而増加，最終值達到368毫克/公升培養液（圖66Β） °整

個醱酵中之比生產力概況展示於圖66C中，且與圖66 Α之

比較說明生長與異戊二烯製造相分離。在56.7小時酸酵期

149050.doc - 333 ·

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間自531 g所利用之葡萄糖製造之異戊二烯的總量為1·8g。在醱酵期間所利用之參與製造異戊二烯之碳的莫耳產

率為0.73%。

IX.在 15-L 規模下 自表現 pCL PtrcUpperMVA 及 pTrc KKDylklS質體之大腸桿菌FM5細胞製造異戊二烯

將如上文實例11部分I中所說明於板上生長之表現pCL PtrcUpperMVA及pTrc KKDylklS質體之FM5細胞接種至含

有500 mL胰蛋白腺-酵母提取物培養基之燒瓶中，且在

3 0°C ' 160 rpm下生長至OD550為10°將此物質接種至含有

4.5-kg培養基之15-L生物反應器中。當OD550達到值為15 時，使IPTG濃度達到27 μΜ °生物反應器內隨時間而變之

OD550概況展示於圖67Α中。異戊二烯力價隨著醱酵過程而

增加，最終值達到235毫克/公升培養液（圖67Β） °整個醱酵

中之比生產力概況展示於圖67C中，且與圖67Α之比較說

明生長與異戊二烯製造相分離。在52.3小時醱酵期間自

948 g所利用之葡萄糖製造之異戊二烯的總量為1.4 g。在

醱酵期間所利用之參與製造異戊二烯之碳的莫耳產率為

0.32%。

實例12：在表現甲鲤戊酸途徑基因且於批式補料培養物中

醱酵之大腸桿菌之指數生長期期間製造異戊二烯

實例1 2說明在細胞之指數生長期期間製造異戊二烯。

培養基配方（每公升醱酵培養基）：

使用以下組分產生培養基（每公升醱酵培養基）：k2hpo4

7.5 g ' MgSO4*7H 2O 2 g、單水合樺檬酸2 g、檸檬酸鐵鉉

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0.3 g '酵母提取物0.5 g及ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液1 ml。

所有組分一起添加且溶解於去離子水中。對此溶液進行高

壓滅菌。用氫氧化鉉（3 0%）將pH值調整至7.0且補足體積。

滅菌及調整pH值之後，添加10 g葡萄糖、0.1 g鹽酸硫胺

素、及抗生素。

ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液：

使用以下組分產生1000Χ改質痕量金屬溶液：單水合檸

檬酸 40 g、MnSO4*H 2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4*7H 2O 1 g ' CoC12*6H 2O 1 g、ZnSO4*7H 2O 1 g、CuSO4*5H 2O 100 mg、H3BO3 1 00 mg 及 NaMoO4* 2H2O 100 mg。將各組分逐

一溶解於去離子水中，用HCl/NaOH將pH值調整至3.0，接

著補足體積，且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌。

在15-L生物反應器中，用含有pCL PtrcUpperMVA及pTrc KKDylkl S質體之ATCCU303大腸桿菌細胞進行醱酵。進行

此實驗以監測在醱酵所要之pH 7.0及溫度30°C下自葡萄糖

形成異戊二烯之情況。將自冷凍小瓶中獲取之大腸桿菌菌

株之接種體於LB培養液瓊脂板（含抗生素）上劃線培養，且

在37°C下培育。將單一群落接種至胰蛋白月東-酵母提取物

培養基中。接種體生長至OD 1.0（在550 nm下所量測）之

後，使用500 mL接種體接種5-L生物反應器。

以指數速率補給葡萄糖直至細胞到達停滯期為止。此

後，葡萄糖補料減至滿足代謝需求。在50小時醱酵期間傳

遞至生物反應器之葡萄糖的總量為2.0 kg。藉由添加IPTG 達成誘導。當5 50 nm下之光學密度（OD55o）達到值為10時，

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使IPTG濃度達到25卩Μ。當OD550達到190時，IPTG濃度升

至50卩Μ。生物反應器內隨時間而變之OD550概況展示於圖

99中。如本文所述測定生物反應器之釋出氣體中之異戊二

烯含量。異戊二烯力價隨著醱酵過程而增加，最終值達到

1.4 g/L（圖100）。在50小時醱酵期間所製造之異戊二烯之總

量為10.0 g。生物反應器內隨時間而變之異戊二烯比生產

力概況展示於圖101中。在醱酵期間所利用之促成製造異

戊二烯之碳的莫耳產率為1 .1%。自葡萄糖製得之異戊二烯

之重量百分比產率為0.5%。

實例13 ：異戎二烯之可燃性模型化與測試

I. 異戊二烯之可燃性模型化與測試之概述

對多種燈/氧氣/氮氣/水/二氧化碳混合物進行可燃性模

型化與實驗。此模型化與測試實驗旨在界定在固定壓力及

溫度下於指定蒸汽及一氧化碳濃度下異戊二烯及氧氣/氮

氣之可燃性曲線。一批模型條件展示於表9中 > 且所進行

之一批實驗展示於表5中。

表9.模型化異戊二烯可燃性之概述

系列温度

(°C)壓力

(psig)

蒸汽

濃度

（重量%）

二氧化碳 濃度

（重量%）

異戊二烯

濃度

（體積％）

氧氣 濃度

（體積％）

A 40 0 0 0 變化 變化

B 40 0 4 0 變化 變化

C 40 0 0 5 變化 變化

D 40 0 0 10 變化 變化

E 40 0 0 15 變化 變化

F 40 0 0 20 變化 變化

G 40 0 0 30 變化 變化

149050.doc -336 -

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表10.異戊二烯可燃性測試之概述

II. 計算絕熱火焰溫度（CAFT）模型之描述

系列號温度

(°C)-壓力

(psig)

蒸汽

濃度

（體積％）

異戊二烯

濃度

（體積％）

氧氣

濃度

（體積％）

1 40 0 0 變化 變化

2 40 0 4 變化 變化

使用燃燒傳播之計算絕熱火焰溫度（CAFT）以及所選極

限火焰溫度來確定異戊二烯之可燃包絡範圍。此研究中

用 於計算火焰溫度之電腦程式為NASA Glenn Research Center CEA（化學平衡與應用（Chemical Equilibrium with Applications））軟體。

使用均勻燃燒機制（其中燃料與氧化劑均呈氣態）之絕熱

火焰溫度模型確定可燃包絡範圍涉及五個步驟：選擇所要

反應物，選擇測試條件，選擇極限火焰溫度，改變反應

物，及自計算結果構建可燃包絡範圍。

在此選擇所要反應物之第一步驟中，必須決定將存在於

系統中之反應物質及各者之量。在許多狀況下，用於計算

之電腦程式具有反應物及產物物質之清單。若程式中未發

現有待研究之物質的任何資料，則可自其他來源（諸如

JANAF表）或自網際網路獲得資料。在此當前模型中，

水、氮氣、氧氣及二氧化碳之資料存在於程式資料庫中。

程式資料庫並不含異戊二烯物質；因此,手動併入熱力學

特性。

下一步驟為決定發生燃燒過程之初始壓力及溫度條件。

149050.doc - 337 -

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在此模型中，壓力為1個大氣壓（絕對壓力），且溫度為

40°C（異戊二烯之沸點）。

燃燒之極限火焰溫度可基於理論原理進行選擇或以實驗

方式測定。各方法具有其自身之限制。

基於先前研究，煙之極限火焰溫度處於1000 K至1500 K 之範圍內。對於此模型'選擇之值為1500 K。此為一氧化

碳至二氧化碳之反應（高度放熱反應5且形成大比例之火

焰能）可自我維持之溫度。

一旦已決定極限火焰溫度，即對既定反應物混合物（物

質濃度）進行模型計算且確定絕熱火焰溫度。僅在溫度高

於極限火焰溫度時，視為已發生火焰傳播。接著改變反應

物混合物組成以生成傳播及非傳播混合物之資料集 。

此類型之模型顯示與以實驗方式確定之可燃限度良好吻

合。所導出之包絡範圍以外之區域不可燃，且包絡範圍以

內之區域可燃。包絡範圍形成鼻狀。包絡範圍之鼻端與氣

態燃料之極限氧濃度（LOC）相關。

III.計算絕熱火焰溫度（CAFT）模型之結果

系列A至G之CAFT模型結果分別繪製於圖68至圖74中。

該等圖繪製對於若干氧氣/亂氣比率（以重量計），隨燃料濃

度（以重量計）而變之計算絕熱火焰溫度（使用NASA CEA程

式）。高於1500 K（所選極限火焰溫度）之曲線部分含有足以

供火焰傳播之燃料含量。以圖68至圖74中所呈現之形式可

能難以解釋結果。另外，當前形式並不利於與一般依體積

百分比呈現之實驗數據進行比較。

149050.doc -338 -

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使用系列A作為實例，以傳統可燃包絡範圍之形式繪製

圖68中之數據。使用圖6 8及橫越縱座標上1500 K溫度線之

讀數，吾人可藉由使切線落至與該切線相交之各曲線（氧

氣與氮氣之比率）的橫座標而確定此極限火焰溫度之燃料

濃度。接著可以針對既定重量百分比的氧化劑之燃料重量

百分比形式將此等值製成表格（圖75A）。接著在瞭解燃料

組成（100重量％異戊二烯）及氧化劑組成（水、氧氣及氮氣

之相對含量）之情況下，可確定莫耳量。

自此等莫耳量可計算體積百分比濃度。接著可繪製體積

百分比濃度以產生可燃包絡範圍（圖75B）。包絡範圍所包

括之區域為可爆炸範圍，且不包括之區域為非爆炸範圍。

包絡範圍之「鼻端」為極限氧濃度。圖76A及圖76B含有

自圖69中所呈現之數據產生之系列B之可燃包絡範圍的計

算體積濃度。可對圖70-74中所呈現之數據使用類似方

法。

IV.可燃性測試實驗設備與程序

在4公升高壓容器中進行可燃性測試。該容器之形狀為

圓筒形,其內部直徑為6"且內部高度為8.625"。使用由PID 控制器控制之外部加熱器維持容器（及內部氣體）之溫度。

為防止熱損失，在壓力容器周圍纏繞陶瓷棉及反射絕熱

體。使用K型熱電偶量測氣體空間之溫度以及容器自身之

溫度。圖77說明測試容.器。

在進行測試之前，抽空容器且用氮氣吹掃以確保移除先

前測試之任何氣體。接著將容器抽成真空。此舉完成後，

149050.doc - 339-

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壓力通常為約0.06巴。歸因於氮氣吹掃，設想造成此初始

壓力之氣體為氮氣。使用分壓，接著添加適量水、異戊二

烯、氮氣及氧氣以達成所述測試條件。容器內磁性驅動之

混合風扇確保氣態內含物混合。使氣體混合約2分鐘，在

點火之前約1分鐘關閉風扇。

點火器在計時器電路上包含1 ·5歐姆鎳鎔線圈及AC電壓

源。使用示波器'確定34.4 VAC歷經3.2秒傳遞至點火

器。3.8安培之最大電流約一半進入點火週期中。因此5

最大功率為1 3 1 W，且在點火週期中所提供之總能量為約

210 J。

使用連接至數據扌頡取系統之可變磁阻Validyne DP2 1 5壓

力轉導器攧取爆燃數據。若壓力升高大於或等於5%，則

將氣體混合物視為已爆燃。

V. 可燃性測試之結果

在40°C及0 psigT，在無蒸汽下進行第一實驗系列（系列

1）。在濃度變化之異戊二烯及氧氣下進行測試 > 產生圖

78A中所示之可燃性曲線。此曲線中所示之數據點僅為毗

鄰曲線之數據點。此系列所獲得之所有數據點之詳細清單

展示於圖80A及圖80B中。

圖78B概述圖78A中所示之可爆炸數據點。圖78C為實驗

數據與CAFT模型預測之可燃包絡範圍的比較。模型與實

驗數據極好吻合。差異可歸因於測試腔室之非絕熱性質及

模型之限制。模型著眼於氧化反應之無限時間範圍，且未

將任何反應動力學限制考慮在內。

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另外，模型受其資料庫中平衡化學物質之數目限制，且

由此可能不會適當預測熱解物質。又，模型所開發之可燃

包絡範圍使用極限火焰溫度之一個值(1500K)。視反應化

學物質而定，極限火焰溫度之值可在Ι,ΟΟΟΚ至1,500Κ之範

圍內。在高於化學計量之燃料/氧化劑含量的燃料濃度下

所形成之熱解化學物質之複雜性質為模型可能不會準確預

測此系統之可燃上限的一個原因。

在40°C及0 psig下，於4%之固定蒸汽濃度下進行第二實

驗系列(系列2)。在濃度變化之異戊二烯及氧氣下進行測

試，產生圖79A中所示之可燃性曲線。此曲線中所示之數

據點僅為毗鄰曲線之數據點。此系列所獲得之所有數據點

之詳細清單展示於圖8 1中。歸因於系列1中數據之間的相

似性，僅測試可燃下限、極限氧濃度及可燃上限之關鍵

點。添加4%蒸汽至測試混合物中並未顯著改變可燃包絡

範圍之關鍵界限。應注意，較高濃度之蒸汽/水及/或其他

惰性物可能影響可燃包絡範圍。

圖79B概述圖79A中所示之可爆炸數據點。圖79C為實驗

數據與CAFT模型預測之可燃包絡範圍的比較。模型與實

驗數據極好吻合。差異可歸因於系列1中所述之相同因

素。

VI.計算3個大氣壓之壓力下空氣中異戊二烯之可燃限度

實例13部分I至IV中所述之方法亦用於計算在3個大氣壓

之系統絕對壓力及40°C下異戊二烯之可燃限度。將此等結

果與實例1 3部分I至IV中在1個大氣壓之系統絕對壓力及

149050.doc -341 -

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40°C下獲得之結果相比較。由於可燃包絡範圍因系統初始

壓力增加而擴展或變大，故測試此較高壓力。可燃上限最

受影響，其次為極限氧組成。可燃下限受影響最小（參

見，例如「Bulletin 627-Flammability Characteristics of Combustible Gases and Vapors j 由 Michael G. Zabetakis撰

寫且由先前美國礦務局（US Bureau of Mines）公開（1965）， 其藉此以全文引用的方式併入，尤其關於可燃限度之計

算）。

在圖82中，繪製隨異戊二烯（燃料）濃度（以總燃料/氮氣/

氧氣之重量百分比表示）而變之計算絕熱火焰溫度，其中

系統壓力最初為3個大氣壓。計算火焰溫度與最初在1個大

氣壓之系統中所確定之計算火焰溫度極為類似（圖83）。因

此，當使用計算絕熱可燃數據產生可燃包絡範圍時'曲線

極為類似（見圖84及圖85）。因此，基於此等理論計算結

果，系統壓力自1個大氣壓增至3個大氣壓不會導致可燃包

絡範圍顯著增加/變寬。必要時，可使用實驗測試（諸如本

文所述在1個大氣壓之壓力下的實驗測試）驗證此等模型結

果。

VII.可燃性研究之概述

針對40°C及ο psig下異戊二烯/氧氣/氮氣/水/二氧化碳系

統之可燃包絡範圍開發計算絕熱溫度模型。所開發之

CAFT模型與在此項工作中進行之測試所產生之實驗數據

良好吻合。系列1及2之實驗結果驗證系列A及B之模型結

果。

149050.doc - 342 -

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實例14：表現構築體與菌株

I. 構築編碼甲理戊酸激酶之質體

合成編碼馬氏甲烷球菌（Methanosarcina mazei）下游MVA 途徑之構築體（寄存編號NC_003901.1、NC_003901.1、

NC_003 901.1及NC_003 901.1，各藉此 以全文引用的方式併

入），同時針對大腸桿菌中之表現進行密碼子最佳化。此

構築體稱為馬氏甲烷球菌（M. mazei）古生下游途徑操縱子

（圖112A-112C ； SEQ ID NO:27）且 編 碼 馬氏甲 烷球菌

MVK（ 一種推定的去梭酶）、IPK及IDI酶。根據製造商之方

案，使用黏接溫度為55°C且延長時間為60秒之30次循環，

使用 Strategene Herculase II Fusion 套組，利用引子

MCM165及 MCM177（表11）對編 碼 MVK之 基因（寄 存編號

NC_003901.1）進行PCR擴增。使用Qiagen PCR管柱純化此

擴增子，接著在37°C下於10卩L含Pmel之反應物中（在NEB 緩衝液4及BSA存在下）分解。1小時後，添加Nsil及Roche 緩衝液Η，在37°C下再持續1小時。在Qiagen PCR管柱上純

化經分解之DNA，且將其接合於11卩L反應物、5 pL Roche 快速接合酶緩衝液1、1卩L緩衝液2 ' 1卩L質體、3卩L擴増

子及1卩L接合酶中以類似方式分解並純化之質體

MCM29（MCM29為經編碼野葛異戊二烯合成酶之

pTrcKudzu轉型之大腸桿 菌TOP 1 0（lnvitrogen））（在室溫下1 小 時）。MCM 29為pTrcKudzuKan。將接 合反應 物引入

Invitrogen TOP 10 細胞 中，且在 L A/kan50 板上、於 37 °C 下

培育隔夜，藉此選擇轉型體。對所得質體MCM382中之

149050.doc -343 ・

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MVK插入物進行定序（圖 113A-113C ； SEQ ID NO:28）。

表11.寡核普酸

II. 產生過度表現甲羟戊酸激酶及異戊二烯合成酶之菌株

MCM161 馬氏甲烷球菌

MVK forCACCATGGTATCCTGTTCTGCG(SEQ ID NO:120)

MCM162 馬氏甲烷球菌

MVK revTTAATCTACTTTCAGACCTTGC(SEQ ID NO:121)

MCM165 馬氏甲烷球菌

MVK for w/ RBSgcgaacgATGCATaaaggaggtaaaaaaacATGGTATCCTGTTCTGCGCCGGGTAAGATTTACCTG(SEQ ID NO:122)

MCM177 馬氏甲烷球菌

MVK rev PstgggcccgtttaaactttaactagactTTAATCTACTTTCAGACCTTGC (SEQ ID NO:123)

將質體MCM382轉型至已於LB培養基中生長至對數中期

且在冰 冷無菌水中洗 滌三次之MCM33 1細 胞（其 含有 編碼釀

酒酵母甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲理戊酸焦磷

酸去發酶及IPP異構酶之染色體構築體gil.2KKDyI）中。將

1卩L DNA添加至50卩L細胞懸浮液中，且在2 mm電擊管中

以2.5伏特（volt）、25卩Fd對此混合物進行電穿孔，隨即在

37°C下於500 μΧ LB培養基中回收1小時。轉型體在 .

LA/kan50上選擇且稱為MCM391 °由相同電穿孔方案將質

體MCM82引入此菌株中，接著在L A/kan50/spec50上進行

選擇。所得菌株MCM40 1含有cmp標記之染色體構築體

gil.2KKDyI、kan標記之質體MCM382，及spec標記之質體

MCM82（其為編碼糞腸球菌mvaE及mvaS之pCL PtrcUpperPathway）。參見表 12。

149050.doc -344-

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表12.過度表現甲瓶戊酸激酶及異戊二烯合成酶之菌株

MCM382 大腸桿菌 BL21 （XDE3） pTrcKudzuMVK（馬氏甲烷球菌）GI1.2KKDyI

MCM391 MCM331 pTrcKudzuMVK（馬氏甲烷球菌）

MCM401 MCM33 lpTrcKudzuMVK（馬氏甲烷球菌）pCLPtrcUpperpathway

MCM396 MCM333pTrcKudzuMVK（馬氏甲烷球菌）

MCM406 MCM3 3 3pTrcKudzuM VK（馬氏甲烷球菌）pCLPtrcUpperpathway

III.構築質體MCM376-來自pET200 D中馬氏甲烷球菌古生

下游途徑之MVK使用Invitrogen Platinum HiFi PCR混合物，使用引子

MCM161及MCM162（表11）對來自馬氏甲烷球菌古生下游途

徑操縱子（圖 112A-112C ； SEQ ID NO:27）之 MVK ORF 進行

PCR擴增。將45卩L PCR混合物與1卩L模板、各1 |iL之引子

（10卩M）及2卩L水組合。反應如下循環：94°c下持續2分

鐘；94°C下持續30秒、55°C下持續30秒及68°C下持續1分15 秒，循環30次；接著72°C下持續7分鐘；及4笆下直至冷

卻。根據製造商之方案，將3卩L此PCR反應物接合於

Invitrogen pET200D 質體。將 3 |1L 此接合物引入 Invitrogen TOP 10細胞中，且在LA/kan50上選擇轉型體。自轉型體分

離質體且對插入物進行定序，得到MCM376（圖114A- 114C ； SEQ ID NO:29）。

IV.產生表現菌株MCM378根據製造商之方案，將質體MCM376#型至Invitrogen

BL21（DE3） pLysS細胞中。在LA/kan50上選擇 轉型體

MCM378。

149050.doc -345 -

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實例15：在20 mL分批規模下由表現上游甲将戊酸.(MVA)

途徑、整合下游MVA途徑(gil.2KKDyI)、馬 氏甲烷球菌甲

遂戊酸激酶及野葛異戊二烯合成酶且於批式補料培養物中

生長之大腸桿菌製造異戊二烯

培養基配方(每公升醱酵培養基)：

每公升醱酵培養基含有K2HPO4 13.6 g、KH2PO4 13.6 g、MgSO4*7H 2O 2 g '單水合檸檬酸2 g '檸檬酸鐵鉄0.3 g、(NH4)2SO4 3.2 g '酵母提取物1 g及ΙΟΟΟχ痕量金屬溶液

1 ml。所有組分一起添加且溶解於去離子水中。用氫氧化

鉄(3 0%)將pH值調整至6.8且補足體積。用0.22微米過濾器

對培養基進行過濾滅菌。滅菌及調整pH值之後，添加葡萄

糖(2.5 g)及抗生素。

ΙΟΟΟχ痕量金屬溶液：

ΙΟΟΟχ痕量金屬溶液含有單水合檸檬酸40 g ' MnSO4*H 2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4*7H 2O 1 g、

CoC12*6H 2O 1 g ' ZnSO4*7H 2O 1 g、CuSO4*5H 2O 100 mg、H3BO3 100 mg 及 NaMoO4*2H 2O 100 mg。將各組分逐

一溶解於去離子水中，用HCl/NaOH將pH值調整至3.0 ＞接

著補足體積，且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌。

菌株：

MCM343細胞為含有上游甲無戊酸(MVA)途徑(pCL上

游)、整合下游MVA途徑(gil.2KKDyI)及野葛異戊二烯合成

酶(pTrcKudzu)之BL21 (DE3)大腸桿 菌細胞。

MCM401細胞為含有上游甲參戊酸(MVA)途徑(pCL

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PtrcUpperPathway）、整合下游 MVA途徑（gi 1,2KKDyI）及 高

表現量之馬氏甲烷球菌甲懇戊酸激酶與野葛異戊二烯合成

酶（pTrcKudzuMVK（馬 氏甲烷球菌））之BL21 （DE3）大腸桿菌

細胞。

藉由在30°C之溫度下使菌株以20 mL工作體積於100 mL 生物反應器中生長來分析異戊二烯產量。將自冷凍小瓶中

獲取之大腸桿菌菌株之接種體於LB培養液瓊脂板（含抗生

素）上劃線培養，且在30°C下培育。將單一群落接種至培

養基中且生長隔夜。將細菌稀釋至20 mL培養基中直至550 nm下所量測之光學密度達到0.05。密封100 mL生物反應

器，且以8 mL/niin之速率泵出空氣。藉由使用磁性攪拌棒

以600 rpm攪拌而對培養基進行充分攪動。使用線上Hiden HPR-20質譜儀分析生物反應器之釋出氣體。監測對應於異

戊二烯、CO2及空氣中天然存在之其他氣體的質量。藉由

合計 隨時間而變之各別氣體濃度（%）來計算積累之異戊二

烯及CO2產量。自總和扣除大氣CO2以估算因代謝活性而

釋放之CO2。

將表現完整甲楚戊酸途徑及野葛異戊二烯合成酶之菌株

（MCM343）的異戊二烯產量與在100 mL生物反應器中另外

亦過度表現馬氏甲烷球菌MVK及野葛異戊二烯合成酶之菌

株（MCM401）相比較。在相同條件下使細菌於葡萄糖作為

碳源之合成培養基（defined media）中生長。藉由添加異丙

基-β-D-l-硫代哌喃半乳糖昔（IPTG）誘導製造異戊二烯，最

終濃度為100卩Μ或200卩Μ。釋出氣體量測結果揭示，過

149050.doc -347-

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度表現MVK與異戊二烯合成酶之菌株(MCM401)相比僅表

現甲羚戊酸途徑及野葛異戊二烯合成酶之菌株(MCM343) 製造顯著更多異戊二烯'如圖U5A-115D中所示°在10° 卩Μ誘導下，MCM401菌株所製造之異戊二烯為MCM343菌

株的2倍。在200 μΜ IPTG誘導下，MCM40 1菌株所製造之

異戊二烯為MCM343菌株的3.4倍。對生物反應器之釋出氣

體中之CO2(其為代謝活性之量度)的分析指示，代謝活性

與IPTG誘導及異戊二烯製造無關。

實例16 ：在15-L規模下亩表現上游甲稜戊酸(MVA)途徑、

整合下游MVA途徑(gil.IKKDyl)、馬氏甲烷球菌甲舞戊酸

激酶及野葛異戊二烯合成酶且於批式補料培養物中生長之

大腸桿菌製造異戊二烯

培養基配方(每公升醱酵培養基)：

每公升醱酵培養基含有K2HPO4 7-5 g、MgSO4*7H 2O 2 g、單水合檸檬酸2 g '檸檬酸鐵鉉0.3 g '酵母提取物0.5 g 及ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液1 ml °所有組分一起添加且溶

解於去離子水中。對此溶液進行高壓滅菌°用氫氧化鉉

(30%)將pH值調整至7.0且補足體積。滅菌及調整pH值之

後，添加10g葡萄糖、0.1 g鹽酸硫胺素、及抗生素°

1000X改質痕量金屬溶液：

1000Χ改質痕量金屬溶液含有單水合檸樣酸40 g、

MnSO4*H 2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4*7H 2O 1 g、

CoC12*6H 2O 1 g、ZnSO4*7H 2O 1 g、CuSO4*5H 2O 100 mg、H3BO3 100 mg 及 NaMoO4*2H 2O 100 mg。將各組分逐

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一溶解於去離子水中，用HCl/NaOH將pH值調整至3.0，接

著補足體積，且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌。

在15-L生物反應器中，用含有上游甲理戊酸（MVA）途徑

（編碼糞腸球菌 mvaE 及 mvaS 之 pCL PtrcUpperPathway）、整

合下游MVA途徑（編碼釀酒酵母甲羟戊酸激酶、甲理戊酸

磷酸激酶、甲鲤戊酸焦磷酸去叛酶及IPP異構酶之

gi 1.2KKDyI）及高表現量之馬氏甲烷球菌甲舞.戊酸激酶與

野葛異 戊二烯合成酶（pTrcKudzuMVK（馬氏甲 烷球菌））之

BL2 1 （DE3）大腸桿菌細胞進行醱酵。進行此實驗以監測在

醱酵所要之pH 7.0及溫度30°C下自葡萄糖形成異戊二烯之

情況。將自冷凍小瓶中獲取之大腸桿菌菌株之接種體於LB 培養液瓊脂板（含抗生素）上劃線培養，且在37°C下培育。

將單一群落接種至胰蛋白月東-酵母提取物培養基中。接種

體生長至OD 1.0（在550 nm下所量測）之後，使用500 mL接

種體接種15-L生物反應器中之5-L培養基。

以指數速率補給葡萄糖直至細胞到達停滯期為止。此

後，葡萄糖補料減至滿足代謝需求。在68小時醱酵期間傳

遞至生物反應器之葡萄糖的總量為3.8 kg。藉由添加異丙

基-β-D-l-硫代哌喃半乳糖昔（IPTG）達成誘導。當550 nm下

之光學密度（OD550）達到值為9時，使IPTG濃度達到5 1 μΜ。當OD550達到149時，IPTG濃度升至88卩Μ。當

OD550=1 95時，再添加IPTG使濃度升至119 μΜ ；且當

OD550=2 10時，再添加IPTG使濃度升至152卩Μ。生物反應

器內隨時間而變之OD550概況展示於圖116中。使用Hiden

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質譜儀測定生物反應器之釋出氣體中之異戊二烯含量°異

戊二烯力價隨著醱酵過程而增加，最终值達到23.8 g/L（圖

117）。在68小時醱酵期間所製造之異戊二烯之總量為227.2 g，且製造時程展示於圖118中。如由TCER量測之代謝活

性概況展示於圖119中。在醱酵10小時與39小時之間，總

活菌數（總群落形成單位）降低兩個數量級（圖120）。在醱酵

期間所利用之參與製造異戊二烯之碳的莫耳產率為

13.0% ο自葡萄糖製得之異戊二烯之重量百分比產率為

6.3%。

實例17 ：在15-L規模（2x100 μΜ IPTG誘 導）下由表 現上游

甲製戊酸（MVA）途徑、整合下游MVA途徑（gil.IKKDyl）、

馬氏甲烷球菌甲経戊酸激酶及野葛異戊二烯合成酶且於批

式補料培養物中生長之大腸桿菌製造異戊二烯

培養基配方（每公升醱酵培養基）：

每公升醱酵培養基含有K2HPO4 7.5 g ' MgSO4*7H 2O 2 g、單水合檸檬酸2 g '檸檬酸鐵鉉0.3 g '酵母提取物0.5 g 及ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液1 ml。所有組分一起添加且溶

解於去離子水中。對此溶液進行高壓滅菌。用氫氧化鉉

（30%）將pH值調整至7.0且補足體積。滅菌及調整pH值之

後，添加10g葡萄糖、0.1 g鹽酸硫胺素、及抗生素。

1000X改質痕量金屬溶液：

1000Χ改質痕量金屬溶液含有單水合檸檬酸40 g、

MnSO4*H 2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4*7H 2O 1 g、

CoC12*6H 2O 1 g、ZnSO4*7H 2O 1 g、CuSO4*5H 2O 100

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mg ' H3BO3 1 00 mg及NaMoO4*2H2O 100 mg。將各組分逐

一溶解於去離子水中，用HCl/NaOH將pH值調整至3.0，接

著補足體積，且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌。

在15 L生物反應器中，用含有上游甲理戊酸（MVA）途徑

（編碼糞腸球菌 mvaE 及 mvaS 之 pCL PtrcUpperPathway） ' 整

合下游MVA途徑（編碼釀酒酵母甲経戊酸激酶、甲理戊酸

磷酸激酶、甲舞戊酸焦磷酸去梭酶及IPP異構酶之

gil.2KKDyI）及高表現量之馬氏甲烷球菌甲铿戊酸激酶與

野葛異戊二烯合成酶（pTrcKudzuMVK（馬氏甲烷球菌））之

BL21 （DE3）大腸桿菌細胞進行醱酵。進行此實驗以監測在

醱酵所要之pH 7.0及温度30°C下自葡萄糖形成異戊二烯之

情況。將自冷凍小瓶中獲取之大腸桿菌菌株之接種體於LB 培養液瓊脂板（含抗生素）上劃線培養，且在37°C下培育。

將單一群落接種至胰蛋白腺-酵母提取物培養基中。接種

體生長至OD 1.0（在550 nm下所量測）之後，使用500 mL接

種體接種15-L生物反應器中之5-L培養基。

以指數速率補給葡萄糖直至細胞到達停滯期為止。此

後，葡萄糖補料減至滿足代謝需求。在55小時醱酵期間傳

遞至生物反應器之葡萄糖的總量為1.9 kg。藉由添加異丙

基-β-D-l-硫代哌喃半乳糖普（IPTG）達成誘導。當550 nm下

之光學密度（OD550）達到值為9時，使IPTG濃度達到111 卩Μ。當OD550達到155時，IPTG濃度升至193卩Μ。生物反

應器內隨時間而變之OD550概況展示於圖121中。使用

Hiden質譜儀測定生物反應器之釋出氣體中之異戊二烯含

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量。異戊二烯力價隨著醱酵過程而增加，最終值達到19.5 g/L（圖122）。在55小時醱酵期間所製造之異戊二烯之總量

為133.8 g，且製造時程展示於圖123中。瞬時體積生產力

水準達到高達1.5公克異戊二烯/公升培養液/小時之值（圖

124）。瞬時產率水準達到高達17.7% w/w（圖125） °如由

TCER量測之代謝活性概況展示於圖126中。在醱酵8小時

與3 6小時之間，總活菌數（總群落形成單位）降低兩個數量

級（圖127）。在醱酵期間所利用之參與製造異戊二烯之碳的

莫耳產率為15.8% °在整個醱酵中自葡萄糖製得之異戊二

烯之重量百分比產率為7.4%。

另外，作為對照，在1 5 -L生物反應器中，用含有上游甲

舞戊酸（MVA）途徑（編碼糞腸球菌mvaE及mvaS之pCL PtrcUpperPathway）、整合下游MVA途徑（編碼釀酒酵母 甲

舞戊酸激酶、甲袖戊酸磷酸激酶、甲整戊酸焦磷酸去梭酶

及IPP異構酶之gil.2KKDyI）及高表現量之馬氏甲烷球菌甲

舞戊酸激酶與野葛異戊二烯合成酶（pTrcKudzuMVK（馬氏

甲烷球菌））之BL21 （DE3）大腸桿菌細胞進行醱酵°進行此

實驗以監測在醱酵所要之pH 7.0及温度3 0°C下自葡萄糖

起，如由CER量測之未經誘導細胞代謝活性。將自冷凍小

瓶中獲取之大腸桿菌菌株（上述MCM40 1）之接種體於LB培

養液瓊脂板（含抗生素）上劃線培養，且在37°C下培育°將

單一群落接種至胰蛋白腺-酵母提取物培養基中。接種體

生長至0D 1.0（在550 nm下所量測）之後，使用50° mL接種

體接種15-L生物反應器中之5-L培養基。以指數速率補給

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葡萄糖直至細胞到達停滯期為止。此後，葡萄糖補料減至

滿足代謝需求。

圖148比較上述未經誘導細胞與實例16及17中藉由添加

異 丙基-β-D-l-硫代哌喃 半乳糖昔(IPTG)而誘導之細胞的

CER概況。

實例 18 :在 15-L規模(補給 1x50 μΜ IPTG + 150 μΜ IPTG進

行誘導)下由表現上游甲遂戊酸(MVA)途徑、整合下游

MVA途徑(gil.ZKKDyl)、馬氏甲烷球菌甲無戊酸激酶及野

葛異戊二烯合成酶且於批式補料培養物中生長之大腸桿菌

製造異戊二烯

培養基配方(每公升醱酵培養基)：

每公升醱酵培養基含有K2HPO4 7.5 g、MgSO4*7H 2O 2 g '單水合檸檬酸2 g、檸檬酸鐵鉄0.3 g、酵母提取物0.5 g 及ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液1 ml。所有組分一起添加且溶

解於去離子水中。對此溶液進行高壓滅菌。用氫氧化鉉

(30%)將pH值調整至7.0且補足體積。滅菌及調整pH值之

後，添加10g葡萄糖、0.1 g鹽酸硫胺素、及抗生素。

ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液：

ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液含有單水合檸檬酸40 g、

MnSO4*H 2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4*7H 2O 1 g、

CoC12*6H 2O 1 g、ZnSO4*7H 2O 1 g、CuSO4*5H 2O 100 mg、H3BO3 100 mg 及 NaMoO4* 2H2O 100 mg。將各組分逐

一溶解於去離子水中，用HCl/NaOH將pH值調整至3.0，接

著補足體積，且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌。

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在15-L生物反應器中，用含有上游甲理戊酸（MVA）途徑

（編碼糞腸球菌 mvaE 及 mvaS 之 pCL PtrcUpperPathway） ' 整

合下游MVA途徑（編碼釀酒酵母甲羟戊酸激酶、甲無戊酸

磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸去梭酶及IPP異構酶之

gil.2KKDyI）及高表現量之馬氏甲烷球菌甲理戊酸.激酶與

野葛異戊二烯合成酶（pTrcKudzuMVK（馬氏甲烷球菌））之

BL2 1 （DE3）大腸桿菌細胞進行醱酵。進行此實驗以監測在

醱酵所要之pH 7.0及溫度30°C下自葡萄糖形成異戊二烯之

情況。將自冷凍小瓶中獲取之大腸桿菌菌株之接種體於LB 培養液瓊脂板（含抗生素）上劃線培養，且在37°C下培育。

將單一群落接種至胰蛋白腺-酵母提取物培養基中。接種

體生長至OD 1.0（在550 nm下所量測）之後，使用500 mL接

種體接種15-L生物反應器中之5-L培養基。

以指數速率補給葡萄糖直至細胞到達停滯期為止。此

後，葡萄糖補料減至滿足代謝需求。在55小時醱酵期間傳

遞至生物反應器之葡萄糖的總量為2.2 kg。藉由添加異丙

基-β-D-l-硫代哌喃半乳糖昔（IPTG）達成誘導。當550 nm下

之光學密度（OD55o）達到值為10時，使IPTG濃度達到51 μΜ °除外加（spike）IPTG以外5當Ο D550= 1 θ時,亦開始恆

定補料且經1 8小時傳遞1 64 mg IPTG °生物反應器內隨時

間而變之OD550概況展示於圖128中。使用Hiden質譜儀測

定生物反應器之釋出氣體中之異戊二烯含量。異戊二烯力

價隨著醱酵過程而增加，最終值達到22.0 g/L（圖129）。在

55小時醱酵期間所製造之異戊二烯之總量為170.5 g，且製

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造時程展示於圖130中。如由TCER量測之代謝活性概況展

示於圖1 3 1中。當歷經約1.7小時進入生物反應器之氣流自

8 slpm降至4 slpm時，釋出氣體中異戊二烯之濃度自0.51% 增至0.92%（w/w）（圖132）。如由總二氧化碳析出速率

（TCER）量測，此等異戊二烯含量升高似乎不會對細胞代謝

活性造成任何負面影響，因為在37.2小時與39.3小時之間

TCER僅下降7%（圖13 2）。在醱酵7小時與36小時之間，總

活菌數（總群落形成單位）降低兩個數量級（圖133） °在醱酵

期間所利用之參與製造異戊二烯之碳的莫耳產率為

16.6%。在整個醱酵中自葡萄糖製得之異戊二烯之重量百

分比產率為7.7%。

實例19：外部施加之異戊二烯對1 L規模下於批式補料培

養物中生長之野生型大腸桿菌的影響

培養基配方（每公升醱酵培養基）：

每公升醱酵培養基含有K2HPO4 7.5 g、MgSO4*7H 2O 2 g '單水合檸檬酸2 g、檸檬酸鐵鉉0.3 g、酵母提取物0.5 g 及ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液1 ml。所有組分一起添加且溶

解於去離子水中。對此溶液進行高壓滅菌。用氫氧化鉄

（30%）將pH值調整至7.0且補足體積。滅菌及調整pH值之

後，添加10 g葡萄糖、0.1 g鹽酸硫胺素、及抗生素。

ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液：

ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液含有單水合檸檬酸40 g、

MnSO4*H 2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4*7H 2O 1 g、

CoC12*6H 2O 1 g、ZnSO4*7H 2O 1 g、CuSO4*5H 2O 100

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mg、H3BO3 100 mg及NaMoO4*2H2O 100 mg ° 將各組分逐

一溶解於去離子水中'用HCl/NaOH將pH值調整至3.0，接

著補足體積，且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌°

在1-L生物反應器中，用BL21 (DE3)大腸桿菌細胞進行

醱酵。進行此實驗以監測在醱酵所要之pH 7.0及溫度3 0°C 下於葡萄糖批式補料生物反應器中異戊二烯對細胞生存力

及代謝活性的影響。將來自冷凍小瓶之大腸桿菌菌株之接

種體接種至胰蛋白月東-酵母提取物培養基中°接種體生長

至OD 1.0(在550 nm下所量測)之後，使用50 mL接種體接

種1-L生物反應器中之0.5-L培養基。

以指數速率補給葡萄糖直至細胞到達停滯期為止°此

後，補給葡萄糖補料以滿足代謝需求。使用氮氣作為載體向

生物反應器中補給異戊二烯。在生長中期(OD550=3 1-44)'異

戊二烯補給速率為1 g/L/h，且持續總共75分鐘(13.2小時至

14.4小時)。生物反應器內隨時間而變之OD550概況展示於

圖134中。如由TCER量測之代謝活性概況展示於圖135 中。在將異戊二烯引入生物反應器中之時段期間，總活菌

數(總群落形成單位)增加14倍(圖136)。

實例20：由釀酒酵母製造異戊二烯及表現異戊二烯合成酶

根據雜交釀酒酵母/甲醇酵母(Pichia pastoris)密碼子使

用表針對表現對野葛異戊二烯合成酶進行最佳化，合成該

酶，且將其選殖至pDONR221:1943。中(藉由DNA 2.0，圖

140展示圖譜且圖141展示序列(SEQ ID NO:38))。根據製造

商之方案進行Gateway®選殖(Invitrogen)反應：由於

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pDONR221:19430為「入 口」載體，故使用 LR Clonase II酶（LR反應物）將經密碼子最佳化之異戊二烯合成酶引入

「目的」載體 pYES-DEST5 2（Invitrogen）中。

接著，根據製造商之方案將LR反應物轉型至Top 10化學

性勝任細胞（Invitrogen）中，且在含有50 μ&/ιη1發节青黴素

之LA板上選擇具有含異戊二烯合成酶ORF之pYES-DEST52 質體的細菌。藉由使用 illustra PuReTaq Ready-To-Go™ PCR珠粒（GE Healthcare）-以T7前置引子及 酵母異 戊二烯

合成酶-Rev2引子（參見表13）進行群落PCR（關於引子濃度

及熱循環參數，見下文）來測試個別陽性轉型體。

表13.擴增異戊二烯合成酶之引子序列

引子名稱 序列（5,至3，） 用途

酵母 HGS-For2 CACCAAAGACTTCATAGACT (SEQ ID NO: 124)

供最佳化之酵母異戊二烯合成

酶用之前置引子

酵母 HGS-Rev2 AGAGATATCTTCCTGCTGCT (SEQ ID NO: 125)

供最佳化之酵母異戊二烯合成

酶用之反置引子

T7前置引子 TAATACGACTCACTATAGGG (SEQ ID NO: 126)

PCR及定序引子

由miniprep （Qiagen）純化得到 正確尺寸（1354 bp）之PCR片

段的質體，且發送以供使用T7前置引子及酵母異戊二烯合

成酶-For2引 子（參見表13）進行定序（Quintara Biosciences, Berkeley, CA）。將定序操作之結果與pDONR22 1:1 943 0之

已知序列相 比較（使用Vector NTI軟體，Invitrogen） ＞且選

擇單一質體pDW14以供進一步研究（圖142A展示圖譜，且

圖142B及C展 示完 整序列（SEQ ID NO:39））。pDW14序 列與

pDONR221:19430序列之差異在於單一核昔酸（在圖142B中

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以粗體標記）。單一核昔酸變化（G變為A）不會導致ORF發

生變化，因為其處於離胺酸編碼密碼子之第三位置處。

使用 釀酒酵母EasyComp轉型套組（Invitrogen）中 所述之

方案，將經純化之pDW14轉型至釀酒酵母菌株INVSc-1 中。如 pYES-DEST52 Gateway Vector手冊（Invitrogen）中所

述，在含2%葡萄糖、不含尿。密咤之SC基本培養基上選擇

並維持具有pDW14或pYES-DEST52（其含有完整URA3基

因）之INVSc-1菌株。選擇含有pDW14之INVSc-1及具有

pYES-DEST52之單一對照菌株的兩個獨立分離株以供進一

步分析。

為誘導異戊二烯合成酶表現，使培養物於液體SC基本培

養基中生長隔夜。接著將培養物稀釋至OD60 ο為約0.2且生

長2-3小時。使培養物旋轉離心，洗滌一次，再懸浮於等

體積（10 ml）之含1%棉子糖、2%半乳糖、不含尿。密。定的SC 基本培養基中，且生長隔夜以誘導異戊二烯合成酶表現。

測定菌株之OD6oo（圖1 44A），藉由離心收集菌株並使其再

懸浮於2 ml溶解緩衝液（50%甘油與PEB（pH 7.4，Tris鹼

2.423 g/L、MgCl2（無水）1.904 g/L、KC1 14.910 g/L、DTT 0.154 g/L、甘油50 mL/L）之1:1混合物）中。

使溶解混合物通過弗氏壓碎器三次'且由SDS-PAGE分

析溶菌液。為進行庫馬斯凝膠分析（Coomassie gel analysis）（圖 143 A），根據製造商之方案（Invitrogen Novex 系統），用含還原劑之2xSDS負載緩衝液以1:1稀釋樣品，

將其（總體積20卩1）負載至4-12% bis-tris凝膠上，在MES緩

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衝液中進行電泳,且使用SimplyBlue SafeStain染色。

使用WesternBreeze套組(Invitrogen)轉移異戊二烯合成酶

且在硝化纖維素膜上進行呈色偵測。一次抗體為以1:1000 稀釋於Invitrogen抗體稀釋劑中之10週1799A。進行一次抗

體結合，接著用標記有Alexa Fluor 488之二次抗體

(Invitrogen，目錄號A-1 1008)顯色以允許定量測定信號。

如Invitrogen所述進行西方墨點程序。以使用藍色濾光片

設置之Molecular Dynamics Storm儀器 記錄螢光信號，且

以Molecular Dynamics ImageQuant影像分析 套裝軟體進行

定量分析。自所製造之異戊二烯之量除以誘導培養物之

a600或由西方墨點法測 定之異 戊二烯 合成酶 蛋白濃 度的比

率來計算文庫成員之比活性。圖143B展示與具有pYES- DEST52之對照(泳道1)相比，異戊二烯合成酶存在於具有

pDW14之經誘導I NVSc- 1菌株(泳道2及3)中。

對來自各菌株之25卩L溶菌液進行異戊二烯合成酶頂部

空間DMAPP檢驗，該溶菌液中添加有5 gL 1 M MgCl2、5 卩L 100 mM DMAPP及 65 卩L 50 mM Tris(pH 8)。在 30°C 下

於1.8 mL氣密性GC管中進行反應，持續15分鐘。藉由添加

100卩L 250 mM EDTA(pH 8)終止反應。圖144B展示與對照

才目比'具有pDW14之經誘導菌株的比活性值(p.g HG/L/OD)。具有pDW 14之經誘導菌株所展示之活性為缺

乏異戊二烯合成酶之對照的約20倍。

PCR循環參數

Illustra PuReTaq Ready-To-Go™ PCR 珠粒(GE

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Healthcare)與濃度各為0.4卩Μ之寡核音酸引子對一起使

用，總體積/反應為25 μΐ °為分析由LR Clonase反應

(Invitrogen)所得之質體，將來自選擇性板上之個別群落的

少量細菌添加至含有上述PCR混合物之各管中。反應循環

如下：1)95°C下持續4分鐘；2)95°C下持續20秒；3)52°C下

持續20秒；4)72°C下持續30秒；步驟2至4循環5次；5)95°C 下持續20秒；6)55°C下持續20秒；7)72°C下持續30秒；步

驟5至7循環25次，72°C下持續10分鐘'及4°C下直至冷

卻。

實例21：在假單胞菌中製造異戊二烯，及結合假單胞菌構

築pBBR5HGSOpt2_2之其他革蘭氏陰性細菌，及量測異戊

二烯合成酶活性

針對不同的相關微生物物種對編碼大葛藤(野葛植物)異

戊二烯合成酶之基因進行密碼子最佳化(表14 ； fluo-opt2v2 為所選序列)，且藉由DNA2.0(Menlo Park, CA)合成該基

因。fluo-opt2v2之圖譜及序列可見於圖145A及圖145B中

(SEQ ID NO:40)。將Hindlll及BamHI限制性位點添加至合

成之序列中以更易於選殖'且在ATG之前添加RBS以增強

轉錄。

在不同型式之經密碼子最佳化之大葛藤異戊二烯合成酶

中，稀有密碼子之數目隨微生物物種而變。數輪最佳化使

得所有相關物種中之基因均不含稀有密碼子。

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表14.稀有密碼子之數目

生物體 fluo-optl(引用)

fluo-opt2 fluo-opt3 大腸桿菌

optfluo-opt2v2

螢光假單胞菌Pf-5 19 X X 57 0沼澤红假單胞菌C GA009 37 13 3 74 0惡臭假單胞菌F1 0 0 0 29 0箍 胺酸棒狀桿菌(ATCC) 4(Ser) 0 0 0 0螢光假單胞菌PfO-1 l(Val) 0 0 57 0

基因係由DNA2.0提供於選殖載體中。用Hindlll/BamHI 分解載體，對對應於相關插入物之色帶進行凝膠純化，且

與經 Hindlll/BamHI分解之 pBBRlMCS5(Kovach 等人，Gene

166:175-176, 1995，其以全文引用的方式併入，尤其關於

pBBRlMCS5)(圖146A展示圖 譜且圖146B及C展 示序列

(SEQ ID NO:41)) 一起移交。此得到質體 pBBR5HGSOpt2_2 (圖147A展示圖譜且圖147B及C展示序列(SEQ ID NO:42))，其中異戊二烯合成酶係自pBBRlMCS5中呈現之

lac啟動子表現。

將載體轉型於大腸桿菌S17-1中且與惡臭假單胞菌F1 ATCC700007及螢光假單胞菌ATCC 13525 一起交配。在LB 上結合之後，於M9+16 mM檸檬酸鈍+50 gg/ml慶大黴素上

選擇具有質體之假單胞菌屬菌株。使用Qiagen套組

(Valencia, CA)，由質體製劑檢查由此產生之菌株中質體的

存在。

藉由使菌株於TM3培養基(如實例1部分II中所述)+10 g/L 葡萄糖中生長，收集對數中期之生質，由弗氏壓碎器打碎

細胞且進行DMAPP檢驗來檢驗重組菌株惡臭假單胞菌、

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pBBR5HGSOpt2_2及螢光假單胞菌之異戊二烯合成酶活

性。檢驗結果呈現於表15中。由DMAPP檢驗量測到活性

存在，確認異戊二烯合成酶於假單胞菌中表現。

在使用質體pBBR5HGSOpt2_2自lac啟動子表現異戊二烯

合成酶之惡臭假單胞菌及螢光假單胞菌中檢查異戊二烯合

成酶活性。

表15.惡臭假單胞菌及螢光假單胞菌中之異戊二烯合成酶

活性

菌株 OD 異戊二烯合成酶活性

mg 異戊二烯/(LhOD)

螢光假單胞菌，pBBR5HGSOpt2 2 1.46 0.96

惡臭假單胞菌，pBBR5HGSOpt2 2 3.44 0.65

對照(惡臭假單胞菌，無質體) 8.32 待測定

實例22：大腸桿菌及假單胞菌屬菌株於蔗糖上相比於葡萄

糖上之生長，及使用兩種受質表現異戊二烯合成酶

I. 製備液體蔗糖

按以下方式將結晶原料蔗糖溶解於水中：向250 g糖中

添加750 g H2O。攪拌溶液且溫和加熱直至溶解。某種物

質不可溶。溶解後將溶液重量調整至1 kg以補充蒸發之

水。量測溶液體積為940 mL。因此，溶液濃度為265 g/L。產品標籤標明15 g原料蔗糖中有14 g碳水化合物。因

此，溶液之碳水化合物濃度為248 g/L。量測乾固體為

24.03% ＞充分接近預期的250 g/kg。溶液之pH值為5.49。

使用酶促/光譜檢驗，以葡萄糖氧化酶量測葡萄糖濃度。

葡萄糖濃度為17.4 g/L。

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由於大多數微生物不使用蔗糖，但可使用葡萄糖及果

糖，故將溶液一分為二。一半進行一次高壓滅菌，持續30 分鐘（原樣蔗糖）。發生某種轉化，因為葡萄糖含量增至

29.75 g/L（參見圖149）。使用磷酸將另一半溶液調整至pH 4.0，接著藉由高壓滅菌使溶液轉化（轉化蔗糖）。三次30分

鐘循環足以獲得完全轉化，如圖149中所示。將兩種溶液

用於下文所述之生長曲線。

II.不同大腸桿菌及假單胞菌屬菌株於蔗糖上相比於葡萄

糖上之生長曲線

在25 ml TM3 + 10 g/L葡萄糖中接種表16中呈現之各菌株

之一個群落 > 且在3O°C及200 rpm下生長隔夜。TM3描述於

實例7章節II中。次日早晨，使用各1 ml之培養物接種含有

25 mL TM3及10 g/L葡萄糖、10 g/L原樣蔗糖或10 g/L轉化

蔗糖（上述蔗糖溶液）之燒瓶。在3 0°C及200 rpm下培育該等

燒瓶，且有規律地獲取樣品以量測OD6oo。圖1 50及圖1 5 1 展示對於葡萄糖及轉化蔗糖，假單胞菌屬菌株與大腸桿菌

菌株之生長速率及生質產率相當。螢光假單胞菌顯示一些

亦能夠使用未轉化之蔗糖的跡象。

表16.此研究中所用之菌株

菌株

大腸桿菌 BL21MG1655ATCC11303B REL 606

假單胞菌屬 惡臭假單胞菌Fl（ATCC700007）螢光假單胞菌（ATCC13525）____________

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III.比較表現異戊二烯合成酶之大腸桿菌於葡萄糖或蔗糖

上生長時的異戊二烯產量

使如實例14章節II中所述含有完整MVA途徑、馬氏甲烷

球菌甲短戊酸.激酶及大葛藤異戊二烯合成酶之大腸桿菌

MCM401(BL21(DE3))於 TM3 + 10 g/L 葡萄糖或 10 g/L轉化蔗

糖(基於糖漿之碳水化合物濃度)中生長°用在TM3 +10 g/L 葡萄糖上達到OD6oo=0・2之隔夜培養物接種燒瓶°必要時

添加抗生素。兩小時後，用400 μΜ IPTG誘導大腸桿菌培

養物。生長6小時後，使用如實例2B中所述之DMAPP檢驗

來量測異戊二烯產量及異戊二烯合成酶活性。結果呈現於

表17中且明確說明以每個細胞計在異戊二烯及異戊二烯合

成酶產量方面轉化蔗糖與葡萄糖等效°

表17.

菌株 碳源 0D 異戊二烯合成酶活性

mg 異戊二烯/(LhOD)異戊二烯產量

mg 異戊二烯/(LhOD)

MCM401 葡萄糖 2.20 21.06 8.98

MCM401 轉化蔗糖 2.32 20.20 9.23

實例23 ：構築表現釀酒酵母gil.2KKDyI#縱子、銀白楊異

戊二烯合成酶、馬氏甲烷球菌甲無■戊酸■激酶、pCL上游

MVA(糞腸球菌mvaE及mvaS)及ybhE (pgl)之大腸桿菌菌株

⑴構築菌株EWL201(BL21, Cm-GIl.2-KKDyI)

大腸桿菌 BL21(Novagen商標 > EMD Biosciences, Inc.)為

經 MCM331 Pl溶菌液(根據 Ausubel等人，Current

Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc. 中所述之方法製備的溶菌液)轉導之接受菌株° MCM331細

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胞含有編碼釀酒酵母甲無戊酸激酶、甲舞戊酸磷酸激酶、

甲遂戊酸焦磷酸去寇酶及IPP異構酶之染色體構築體

gil.2KKDyI(亦即，來自釀酒酵母之gil.2-KKDyI操縱子)。

藉由將細胞塗佈於L瓊脂及20 μg/μl氯黴素上來選擇轉導

體。在3 0°C下培育板隔夜。轉導體之分析顯示，對照板

(針對逆轉之水+細胞對照板，及針對溶菌液污染之水與P 1 溶菌液對照板)上無群落。

揀選四個轉導體且用於接種5 mL L培養液及20 μβ/μ1氯

黴素。在30°C、以200 rpm震盪下使培養物生長隔夜。為

製造各轉導體之基因組DNA製劑以供PCR分析，對1.5 mL 隔夜細胞培養物進行離心。用400卩1再懸浮緩衝液(20 mM Tris、1 mM EDTA、50 mM NaCl，pH 7.5)使 細胞顆 粒再懸

浮5且添加4卩1不含DNase之RNase(Roche) °在37°C下將管

培育30分鐘，接著添加4 μΐ 10% SDS及4 μΐ 10 mg/ml蛋白

酶K儲備溶液(Sigma-Aldrich)。在37°C下將管培育1小時。

將細胞溶菌液轉移至2 ml Phase Lock Light Gel管

(Eppendorf)中，且添加各200卩1之飽和 苯酚(pH 7.9) (Ambion Inc.)及氯仿。將管充分混合，且微量離心5分

鐘。用400 μΐ氯仿進行第二次莘取，且將水層轉移至新的

eppendorf管中。藉 由添加1 ml 100%乙醇且離心5分鐘而使

基因組DNA沈澱。用1 ml 70%乙醇洗滌基因組D NA顆粒。

移除乙醇且對基因組DNA顆粒進行簡單空氣乾燥。用200 μΐ ΤΕ使基因組DNA顆粒再懸浮。

使用 Pfu Ultra II DNA 聚.合酶(Stratagene)及 200 ng/μΐ基

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因組DNA作為模板，根據製造商之方案製備兩組不同的

PCR反應管。對於第1組，使用引子MCM130及GB Cm-Rev(表1 8)確保轉導體成功整合至attTn7基因座中。第1 組之PCR參數為95°C下持續2分鐘(僅第一次循環)，9 5 °C下

持續25秒，55°C下持績25秒，72°C下持續25秒(重複步驟

2-4 ＞循環28次)，72°C下持續1分鐘。對於第2組，使用引

子MVD For及MVD Rev(表1 8)確保適當整合gil.2-KKDyI操

縱子。笫2組之PCR參數為95°C下持續2分鐘(僅第一次循

環)，95°C下持續25秒，55°C下持續25秒，72°C下持續10秒

(重複步驟2-4，循環28次)，72°C下持續1分鐘。在1.2% E-gel(Invitrogen Corp.)上分析PCR擴增子，顯示全部4個轉

導體純系皆正確。揀選一者且命名為菌株EWL20 1 ° (ii)構築菌株 EWL204(BL21,環出-GI1.2-KKDyI)

如 Datsenko及 Wanner (2000)(Datsenk。等人 ‘ Proc Natl.

Acad. Sci USA 97:6640-6645, 2000)所述，使用質體 pCP20 使菌株EWL201之氯黴素標記物環出°使用PCR產物使大

腸桿菌K-12中之染色體基因於單一步驟中失活(Datsenko等

人，PNAS, 97: 6640-6645, 2000)。使 EWL201 細胞於 L 培養

液中生長至對數中期，接著在冰冷無菌水中洗滌3次°取

50卩1細胞懸浮液之等分試樣與1 μΐ pCP20混合，且使用

Gene Pulser 電穿孔儀(Bio-Rad Inc.)在 2 mm 電擊管

(Invitrogen Corp.)中以2.5伏特及25 p,Fd對細胞懸浮液混合

物進行電穿孔。即刻將1 ml LB添加至細胞中'接著轉移

至具有金屬蓋之14 ml聚丙烯管(Sarstedt)中。藉由使細胞

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在30°C下生長1小時來回收細胞。在L瓊脂及20 μg/μl氯黴

素及50卩g*l 稜芾青黴素上選擇轉型體，且在30°C下培育

隔夜。次日，在30°C下使單一純系於10 ml L培養液及50 卩g/pJ稜等青黴素上生長至對數早期。接著使生長培養物之

溫度轉換至42°C，持續2小時。進行連續稀釋，接著將細

胞塗佈於LA板(無抗生素選擇)上，且在30°C下培育隔夜。

次日，揀選20個群落，且貼於L瓊脂(無抗生素)及LA及20 卩g/叩氯黴素板上。接著在30°C下培育分析板隔夜。能夠在

LA板上生長 > 但不能在LA及20 μg/μl氯黴素板上生長之細

胞被視為氯黴素標記物環出(揀選一株且命名為菌株

EWL204)。

(iii)構築質體 pEWL230(pTrc P. alba)基於針對大腸桿菌表現之密碼子最佳化方法，將編碼銀

白楊異戊二烯合成酶(P. alba HGS)之合成基因的製造外包

給DNA2.0 Inc.(Menlo Park, CA)。將合成基因按定製選殖

至質體 pET24a(Novagen 商標，EMD Biosciences, Inc.)中，

且凍乾交付(圖 152、圖 153A-B ； SEQ ID NO: 43)。

根據製造商之方案，使用pET24 P. alba HGS(作為模

板)、引 子 MCM182 及 MCM192、及 Herculase II Fusion DNA聚合酶(Stratagene)進行PCR反應，以擴增銀白楊異戊

二烯合成酶(戸. alba HGS)。PCR條件如下：95°C下持續2分

鐘(僅第一次循環)；95°C下持續25秒，55°C下持續20秒，

72°C下持續1分鐘，重複25次循環；最終在72°C下延長3分

鐘。使用Q lAquick PCR純化套組(Qiagen Inc.)純化銀白楊

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異戊二烯合成酶PCR產物。

接著 在含有1 μΐ 8spHI核 酸內切酶(New England Biolabs) 與2卩1 ΙΟχΝΕΒ緩衝液4之20卩1反應物中分解銀白楊異戊二

烯合成酶PCR產物。在37°C下培育反應物2小時。接著使用

QIAquick PCR純化套組純化經分解之PCR片 段。在含有1 μΐ Fsfl核酸內切酶(Roche)與2 μΐ 10χ緩衝液Η之20卩1反應

物中進行二次限制酶分解。在37°C下培育反應物2小時。

接著使用QIAquick PCR純化套組純化經分解之PCR片 段。

在含有1 μΐ Ncol核 酸.內切酶(Roche)、1 μΐ Fsfl核 酸內切酶

及2 μΐ 10x緩衝液Η之20卩1反應物中分解質體

pTrcHis2B (In vitro gen Corp.)。在 3 7 °C 下培育反應物 2 小

時。使用 1.2% E-gel(Invitrogen Corp.)對經分解之

pTrcHis2B載體進行凝膠純化，且使用QIAquick凝膠萃取

套組(Qiagen)進行萃取(圖154)。使用Bsp^XI及Need位點之

相容黏性末端，製備含有5卩1銀白楊異戊二烯合成酶插入

物、2 μΐ pTrc 載體、1 μΐ Τ4 DNA接合酶(New England Biolabs) ' 2 μΐ 10x接合酶緩衝液及10卩1再蒸餾水之20 μΐ 接合反應物。在室溫下培育接合混合物40分鐘。藉由使

0.025卩m硝化纖維素膜濾器(Millipore)漂浮於皮氏培養皿

(petri dish)中之再蒸餾水中且在室溫下將接合混合物平緩

施加於硝化纖維素膜濾器之上並保持30分鐘，使接合混合

物脫鹽。使MCM446細胞(參見章節II)於LB中生長至對數

中期，接著在冰冷無菌水中洗滌3次。將50卩1細胞懸浮液

之等分試樣與5卩1脫鹽之pTrc P.alba HGS接合混合物混

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合。使用Gene Pulser電穿孔儀，在2 mm電擊管中以2.5伏

特及25卩Fd對細胞懸浮液混合物進行電穿孔。即刻將1 ml LB添加至細胞中，接著轉移至具有金屬蓋之14 ml聚丙烯

管（Sarstedt）中。藉由使細胞在30°C下生長2小時來回收細

胞。在L瓊脂及50卩g/pil梭芾青黴素及10 mM甲整戊酸上選

擇轉型體，且在30°C下培育。次日，揀選6個轉型體，且

在30°C下於5 ml L培養液及50 μβ/μ1^ 青黴素管中生長隔

夜。使用QIAquick Spin Miniprep套組（Qiagen）對隔夜培養

物進行質體製備。歸因於使用供繁殖質體之BL21細胞，將

用PB緩衝液（5χ）及PE緩衝液（3χ）洗滌Spin管 柱之修 改併入

製造商之標準方案中以獲得高品質質體DNA。用20卩1反應

物中之尸sfl分解質體以確保尺寸正確之線性片段。全部6個

質體皆 具有正確尺寸5且運送至Quintara Biosciences （Berkeley, CA）以 用 引 子 MCM65、MCM66、EL1000（表 18） 進行定序。DNA定序結果顯示全部6個質體皆正確。揀選

一個質體，命名為質 體EWL230（圖155、圖156A-B ； SEQ ID NO:44）。

iv）構築質體 pEWL244（pTrc P. alba-mMVK）根據製造商之方案，使用MCM376（作為模板）（參見以下

章節（V））、引子 MCM165 及 MCM177（參見表 18）及 Pfu Ultra II Fusion DNA聚合酶（Stratagene）進行PCR反應 以擴増 馬 氏

甲烷球菌MVK基因。PCR條件如下：95°C下持續2分鐘（僅

第一次循環）；95°C下持續25秒，55°C下持續25秒，72°C下

持續18秒，重複28次循環；72°C下最終延長1分鐘。使用

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QIAquick PCR純化套組(Qiagen Inc.)純化馬氏甲烷球菌

MVK PCR產物。

接著在含有8 μΐ PCR產物、2 μΐ Pmel核酸內切酶(New England Biolabs)、4 卩1 1 0 χΝΕΒ 緩衝液 4 ' 4 μΐ 1 0 χΝΕΒ BSA及22卩1再蒸餾水之40卩1反應物中分解馬氏甲烷球菌

MVK PCR產物。在37°C下培育反應物3小時。接著使用

QIAquick PCR純化套組純化經分解之PCR片段。在含有2 μΐ Ns汀核酸內切酶(Roche)、4.7 μΐ 10x緩衝液Η及40卩1經

Pmel分解之馬氏甲烷球菌MVK片 段之47卩1反應物 中進行

二次限制酶分解。在37°C下培育反應物3小時。接著使用

1.2% E-gel對經分解之PCR片段進行凝膠純化，且使用

QIAquick凝膠萃取套組進行萃取。在含有10卩1質體、2 μΐ Pmel核 酸內 切酶、4 μΐ 10χΝΕΒ 緩衝液 4 ' 4 μΐ ΙΟχΝΕΒ BSA及20卩1再蒸餾水之40卩1反應物中分解質體EWL230。

在37°C下培育反應物3小時。接著使用QIAquick PCR純化

套組純化經分解之PCR片段。在含有2 μΐ PstI核酸內切

酶、4.7 μΐ lOx緩衝液Η及40卩1經Pmel分解之EWL230線性

片段之47卩1反應物中進行二次限制酶分解。在37°C下培育

反應物3小時。接著使用1.2% E-gel對經分解之PCR片段進

行凝膠純化，且使用QIAquick凝膠莘取套組進行萃取(圖

157)。使用Ns汀及為，1位點之相容黏性末端 > 製備含有8 μΐ 馬氏甲烷球菌MVK插入物、3 μΐ EWL23。質 體、1卩1 Τ4 DNA接合酶、2 μΐ 10><接合酶緩衝液及6卩1再蒸餾水之20 卩1接合反應物。在16°C下培育接合混合物隔夜。次日'藉

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由使0.025 pm硝化纖維素膜濾器漂浮於皮氏培養皿中之再

蒸餾水中且在室溫下將接合混合物平緩施加於硝化纖維素

膜濾器之上並保持3 0分鐘，使接合混合物脫鹽。使

MCM446細胞於LB中生長至對數中期，接著在冰冷無菌水

中洗滌3次。將50卩1細胞懸浮液之等分試樣與5卩1脫鹽之

pTrc P.alba-mMVK接合混合物混合。使用Gene Pulser電穿

孔儀，在2 mm電擊管中以2.5伏特及25卩Fd對細胞懸浮液

混合物進行電穿孔。即刻將1 ml LB添加至細胞中，接著

將細胞轉移至具有金屬蓋之14 ml聚丙烯管中。藉由使細

胞在30°C下生長2小時來回收細胞。在LA及50卩g/以梭节青

黴素及5 mM甲羟戊酸板上選擇轉型體，且在30°C下培育。

次日，揀選6個轉型體，且在30°C下於5 ml LB及50 μ§/μ1 教.芾青黴素管中生長隔夜。使用QIAquick Spin Miniprep套

組對隔夜培養物進行質體製備。歸因於使用供繁殖質體之

BL21細胞，將用PB緩衝液（5χ）及PE緩衝液（3χ）洗滌Spin管

柱之修改併入製造商之標準方案中以獲得高品質質體

DNA。用20叮反應物中之Pstl分解質體以確保尺寸正確之

線性片段。6個質體中之三者具有正確尺寸，且運送至

Quintara Biosciences 以用引子 MCM65 、MCM66、

EL1000、EL1003及EL1006（表18）進 行定序。DNA定 序 結

果顯示全部3個質體皆正確。揀選一者且命名為質體

EWL244（圖 158及圖 159A-B ； SEQ ID NO:45）。

ν）構築質體MCM376-來自pET200D中馬氏甲烷球菌古生下

游途徑之MVK

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使用Invitrogen Platinum HiFi PCR混合物5使用引子

MCM16 1及MCM162(表18)對來自馬氏甲烷球菌古生下游

途徑操縱子(圖160A-C : SEQ ID NO:46)之MVK ORF進行

PCR擴增。將45 μL PCR混合物與1卩L模板、各1卩L之引子

(10 μΜ)及2 p.L水組合。反應如下循環：94 °C下持續2分

鐘；94°C下持續30秒、55 °C下持續30秒及68°C下持續1分15 秒，循環30次；接著72°C下持續7分鐘；及4°C下直至冷

卻。根據製造商之方案，將3卩L此PCR反應物接合於

Invitrogen pET200 D質體。將3卩L此接合物引入Invitrogen TOP10細胞中，且在LA/kan50上 選擇轉型體。自轉 型體分

離質體且對插入物進行定序'得到MCM376(圖161 Α-C)。

vi)構 築菌株 EWL251(BL21(DE3), Cm-GI 1.2-KKDyI, pTrc P.alba-mMVK)

使MCM331細胞(其含有編碼釀酒酵母甲羟戊酸激酶、甲

楚戊酸磷酸激酶、甲無戊酸焦磷酸去菽酶及IPP異構酶之

染色體構築體gil.2KKDyI)於LB中生長至對數中期，接著

在冰冷無菌水中洗滌3次。將50卩1細胞懸浮液與1卩1質體

EWL244混合。使用Gene Pulser電穿孔儀，在2 mm電 擊 管

中以2.5伏特及25卩Fd對細胞懸浮液混合物進行電穿孔。即

刻將1 ml LB添加至細胞中，接著將細胞轉移至具有金屬

蓋之14 ml聚丙烯管中。藉由使細胞在30 °C下生長2小時來

回收細胞。在LA及50卩g/卩1殺卡青黴素及5 mM甲楚戊酸板

上選擇轉型體'且在37°C下培育。選擇一個群落且命名為

菌株 EWL251。

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vii）構築菌株 EWL256（BL21（DE3）, Cm-GI 1.2-KKDyI, pTrcP.alba-mMVK, pCL上游 MVA）

使EWL251細胞於LB中生長至對數中期，接著在冰冷無

菌水中洗滌3次。將50明細胞懸浮液與1卩1質體MCM82（包

含編·碼 糞 腸球菌mvaE及mvaS之pCL PtrcUpperPathway（亦

稱為「pCL上游MVA j ））混合。如上文實例8所述構築質體

pCL Ptrc Upper Pathway。使·用 Gene Pulser電穿孔儀，在 2 mm電擊管中以2.5伏特及25卩Fd對細胞懸浮液混合物進行

電穿孔。即刻將1 ml LB添加至細胞中。接著將細胞轉移

至具有金屬蓋之14 ml聚丙烯管中。藉由使細胞在30°C下生

長2小時來回收細胞。在LA及50 μg/μl發苯青黴素及50 卩g/卩1壯觀黴素板上選擇轉型體，且在37°C下培育。揀選一

個群落且命名為菌株EWL256。

表18 ：引子序列

引子

名稱

引子序列

MCM130 ACCAATTGCACCCGGCAGA(SEQ ID NO: 127)

GB Cm Rev

GCTAAAGCGCATGCTCCAGAC(SEQ ID NO: 128)

MVD For GACTGGCCTCAGATGAAAGC(SEQ DD NO: 129)

MVD Rev CAAACATGTGGCATGGAAAG(SEQ IDNO:130)

MCM182 GGGCCCGTTTAAACTTTAACTAGACTCTGCAGTTAGCGTTCAAACGGCAGAA (SEQIDNO:131)

MCM192 CGCATGCATGTCATGAGATGTAGCGTGTCCACCGAAAA(SEQ ID NO:132)

MCM65 ACAATTTCACACAGGAAACAGC(SEQ ID NO:133)

MCM66 CCAGGCAAATTCTG riTlAl CAGiSEQ ID NO: 106)

EL1000 GCACTGTCTTTCCGTCTGCTGC(SEQ ID NO: 134)

MCM165 GCGAACGATGCATAAAGGAGGTAAAAAAACATGGTATCCTGTTCTGCGCCGGG

TAAGATTTACCTG(SEQ ID NO: 122)

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MCM177 GGGCCCGTITAAACTTTAACTAGACTTTAATCTACTTTCAGACCTTGC(SEQ IDNO: 123)

EL1003 GATAGTAACGGCTGCGCTGCTACC(SEQ ID NO:137)

EL1006 GACAGCTTATCATCGACTGCACG(SEQ ID NO:138)

MCM161 CACCATGGTATCCTGTTCTGCG(SEQ ID NO:120)

MCM162 TTAATCTACTTTCAGACCTTGC(SEQ ID NO:121)

viii)構築菌株 RM1 11608-2(Cm-GI1.2-KKDyI, pTrc P.alba-mMVK, pCL上游 MVA, pBBRCMPGI 1.5-pgl)藉由在複製質體PBBR1MCS5(慶大黴素)(獲自Dr. K.

Peterson, Louisiana State University)上組成性表現ybhE基

因(編碼大腸桿菌6-磷酸葡糖酸內酯酶)來構築製造異戊二

烯之大腸桿菌BL21菌株(EWL256)。

用於Red/ET介導之整合及抗生素標記物環出的基於FRT 之重組卡匣、及質體係獲自Gene Bridges GmbH (Germany)。根據Gene Bridges之方案進行使用此等材料之

程序。使用引 子 Pgl-F(SEQ ID NO:139)及 PglGI 1.5-R(SEQ ID NO: 140) >根據製造商之方案使用Stratagene Herculase II Fusion套組自FRT-gb2-Cm-FRT模板擴增抗性卡匣。PCR 反應物(最終體積50卩L)含有：5卩L緩衝液、1 |iL棋板

DNA(FRT-gb2-Cm-F > 來自 Gene Bridges)、10 pmol 各引

子、及1.5卩L 25 mM dNTP混合物，用蒸餾水(dH2O)製成

50卩L。反應如下循環：1><95°C 2分鐘；接著，(95°C 30 秒，63 °C 30秒，72°C 3分鐘)循環30次。

使用Q iaQick PCR純化套組(Qiagen)純化所得PCR產物，

且如下電穿孔至具有含pRed-ET重組酶之質體的電穿孔勝

任MG1655細胞中。藉由在30°C下於5 mL L培養液中生長

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至OD6oo為約0·6來製備細胞。藉由添加4%阿拉伯糖來誘導

細胞表現重組酶，且在30°C下使細胞生長30分鐘，接著在

37°C下生長30分鐘。在冰冷蒸餾水中將1.5 mL細胞等分試

樣洗滌3-4次。使最终細胞顆粒再懸浮於40卩L冰冷蒸餾水

中，且添加2-5卩L PCR產物。在Gene Pulser電穿孔儀(Bio­Rad Inc.)中，於1 mm間隙之電擊管中以1.3 kV進行電穿

孔。在30°C下回收細胞1-2小時，且塗於含有氯黴素(5 μg/mL)之L瓊脂上。藉由PCR及使用側接整合位點之引子

(2個引子組：pgl及 49 rev及 3' EcoRV-pglstop :底部 Pgb2及

頂部GB's CMP (946))定序來分析五個轉型體。選擇正確轉

型體，且 此菌株命名為MG1655 GI1.5-pgl::CMP。

使用MG1655 GI1.5-pgl::CMP之染色體DNA作為模板以

產生含有FRT-CMP-FRT-GI1.5-ybhE構築體之PCR片段。將

此構築體如下選殖至pBBRlMCS5(慶大黴素)中。使用5,引

子 Pglconfirm-F(SEQ ID NO: 141)及 3'引 子 3' EcoRV- pglstop(SEQ ID NO:142)擴增此處稱作 CMP-GI1.5-pgl之片

段。如 製造商所建議，使用Invitrogen TOPO-Blunt選殖套

組將所得片 段選殖至質體載體pCR-Blunt II-TOPO中。將

具有C MP-GI1.5-pgl片段之Ns汀片 段選殖至pBBRlMCS5(慶

大黴素)之尸sH位點中。製備含有5 μΐ CMP-GI1.5-pgl插入

物、2 μΐ PBBR1MCS5(慶大黴素)載體、1卩1 T4 DNA接合

酶(New England Biolabs) ' 2 μΐ 10x 接合酶緩衝液及 10 μΐ 再蒸餾水之20卩1接合反應物。在室溫下培育接合混合物40 分鐘，接著使用上文所揭示之參數將2-4卩L接合混合物電

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穿孑L至電穿孔勝任ToplO細胞(Invitrogen)中。在含有10Mg/ml氯黴素及5 gg/ml慶大黴素之L瓊脂上選擇轉型體。使

用上文所述之許多引子以及Sequetech, CA所提供之自身T3及反置引子來確定所選純系之序列。此質體命名為

pBBRCMPGI1.5-pgl(圖 162、圖 163A-B及 SEQ ID NO:48)。

如本文所述將質體pBBRCMPGI1.5-pgl電穿孔至EWL256 中，且將轉型體塗於含有氯黴素(10卩g/mL)、慶大黴素(5 卩g/mL)、壯觀黴素(50 gg/mL)及梭苯青黴素(50 gg/mL)之L 瓊脂上。選擇一個轉型體且命名為菌株RM111608-2。

引子：

Pgl-F5'-ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCTGTTACAGTCAGTTGAATTAACCCTCACTAAAGGGCGGCCGC-35 (SEQ ID NO: 139)

PglGI1.5-R5:-GCTGGCGATATAAACTGTTTGCTTCATGAATGCTCCTTTGGGTTACCTCCGGGAAACGCGGTTGATTTGTTTAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATAGTCAAGGGC GTGACGGCTCGCTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAG-3' (SEQ ID NO: 140)

3' EcoRV-pglstop :5!-CTT GAT ATC TTA GTG TGC GTT AAC CAC CAC (SEQ ID NO: 142)

pgl+49 rev : CGTGAATTTGCTGGCTCTCAG(SEQ ID NO:

136)底部 Pgb2 : GGTTTAGTTCCTCACCTTGTC(SEQ ID NO:

135)頂咅pGB's CMP (946) : ACTGAAACGTTTTCATCGCTC(SEQ

ID NO:92)Pglconfirm-F

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55-ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCT-35 (SEQ ID N0:141)

實例24：藉由在大腸桿菌中組成性表現ybhE (pgl)改良異

戊二烯產量

此實例展示與在野生型層面上表現g/zE之對照菌株(亦

即EWL256)相比，在組成性表現大腸桿菌ybhE (pgl)之菌

株中之異戊二烯產量。基因ybhE (pgl)編碼抑制異源表現

之蛋白質的轉譯後葡糖基化且改良產物溶解度及產率，同

時亦改良生質產率及通過戊糖磷酸途徑之通量的大腸桿菌

6-磷酸葡糖酸內酯酶(Aon等人，Applied and Environmental

Microbiology, 74(4): 950-958, 2008)。

i)小規模分析

培養基配方(每公升醱酵培養基)：K2HPO4 13.6 g、

KH2PO4 13.6 g ' MgSO4* 7H2O 2 g、單水合檸檬酸 2 g、檸

檬酸鐵鉄0.3 g ' (NH4)2SO4 3.2 g '酵母提取物1 g、ΙΟΟΟχ 痕量金屬溶液1 ml。所有組分一起添加且溶解於去離子水

中。用氫氧化鑛(30%)將pH值調整至6.8且補足體積。用

0.22微米過濾器對培養基進行過濾滅菌。滅菌及調整pH值

之後 > 添加5.0 g葡萄糖、及抗生素。

ΙΟΟΟχ痕量金屬溶液(每公升醱酵培養基)：單水合檸檬

酸 40 g、MnSO4*H 2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4*7H 2O 1 g、

CoC12*6H 2O 1 g、ZnSO4*7H 2O 1 g、CuSO4*5H 2O 100 mg、H3BO3 100 mg、NaMoO4*2H 2O 100 mg。將各組分逐

一溶解於去離子水中。用HCl/NaOH將pH值調整至3.0，接

著補足溶液體積，且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌。

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(a)實驗程序

藉由使菌株於來自 MicroReactor Technologies, Inc 之

Cellerator™中生長來分析異戊二烯產量。24個孔中每一者

之工作體積均為4.5 mL °溫度維持在30°C下5 pH值設定點

為7.0，氧氣流量設定點為20 seem，且攪動速率為800 rpm。將自冷凍小瓶中獲取之大腸桿菌菌株之接種體於LB 培養液瓊脂板(含抗生素)上劃線培養’且在3 0°C下培育°

將單一群落接種至含抗生素之培養基中且生長隔夜。將細

菌稀釋至4.5 mL含抗生素之培養基中以使550 nm下所量測

之光學密度達到0.05。

使用氣相層析-質譜儀(GC-MS)(Agilent)頂部空間檢驗來

分析釋出氣體中之異戊二烯。如下製備樣品：將10°卩L完

整培養液置於密封GC小瓶中，且在30°C下培育30分鐘之固

定時間。在由70°C下培育5分鐘組成之熱滅活步驟之後5

將樣品負載於GC上。

在操作過程中，使用微定量板式讀取器(Spectramax)獲

得波長550 nm下之光學密度(OD)。藉曲用異戊二烯濃度

(pg/L)除以OD讀數及時間(小時)來獲得比生產力。

在200及400 μΜ IPTG誘導水準下評估兩種菌株EWL256 及RM11608-2。在誘導後1、2.5、4.75及8小時分析樣品之

異戊二烯產量及細胞生長(。。550)。一式兩份操作樣品°

(b)結果

實驗證實，在2種不同之IPTG濃度下，表現g砧(pgl)之

菌株的異戊二烯比生產力相比對照菌株顯著增加2-3倍°

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ii)在15-L規模 下自表現Cm-GI1.2-KKDyI、馬 氏甲 烷球菌

甲無戊酸激酶、銀白楊異戊二烯合成酶及ybhE

(pgl)(RM1 11608-2)且於批式補料培養物中生長之大腸桿菌

醱酵而製造異戊二烯

培養基配方(每公升醱酵培養基)：K2HPO4 7.5 g、

MgSO4*7H 2O 2 g、單水合檸檬酸2 g、檸檬酸鐵鉉0.3 g、

酵母提取物0.5 g ' ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液1 ml。所有組

分一起添加且溶解於去離子水中。對此溶液進行高壓滅

菌。用氫氧化錢(3 0%)將pH值調整至7.0且補足體積。滅菌

及調整pH值之後，添加10 g葡萄糖、0.1 g鹽酸硫胺素、及

抗生素。

ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液：單水合檸檬酸40 g、

MnSO4*H 2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4*7H 2O 1 g、

CoC12*6H 2O 1 g、ZnSO4*7H 2O 1 g、CuSO4*5H 2O 100 mg、H3BO3 100 mg、NaMoO4*2H 2O 1 00 mg。將各組分逐

一溶解於去離子水中，用HCl/NaOH將pH值調整至3.0，接

著補足體積，且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌。

在15-L生物反應器中，用含有上游甲短戊酸(MVA)途徑

(pCL上 游)、整合下游MVA途徑(gil.2KKDyI)、高 表現量

之馬氏甲烷球菌甲舞戊酸激酶與銀白楊異戊二烯合成酶

(pTrcAlba-mMVK)及高表現量之大腸桿菌pgZ(pBBR-pgl)的

BL21 (DE3)大腸桿菌細胞進行醱酵。進行此實驗以監測在

醱酵所要之pH 7.0及温度34°C下自葡萄糖形成異戊二烯之

情況。解凍冷凍小瓶中之大腸桿菌菌株，且接種至胰蛋白

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月東-酵母提取物培養基中。接種體生長至OD 1.0（在55° nm下所量測）之後，使用500 mL接種體接種1 5-L生物反應

器，使得初始體積達到5-L。

以指數速率補給葡萄糖直至細胞到達停滯期為止°此

後，葡萄糖補料減至滿足代謝需求。在40小時（59小時）醱

酵期間傳遞至生物反應器之葡萄糖的總量為3.1 kg（59小時

之時為4.2 kg）。藉由添加IPTG達成誘導。當550 nm下之光

學密度（OD55o）達到值為4時，使IPTG濃度達到11° μΜ °當

OD550達到150時，IPTG濃度升至192 μΜ °生物反應器內

隨時間而變之O D55oM況展示於圖164A中。使用Hiden質譜

儀測定生物反應器之釋出氣體中之異戊二烯含量°異戊二

烯力價隨著醱酵過程而增加'在40小時之時達到3 3.2 g/L 之最大值（59小時之時達到48.6 g/L）（圖1 64B） °異戊二烯力

價隨著醱酵過程而增加'在40小時之時達到40.0 g/L之最

大值（59小時之時達到60.5 g/L）（圖1 64C） °在40小時（59小

時）醱酵期間所製造之異戊二烯之總量為281.3 g（59小時之

時為451.0 g），且製造時程展示於圖164D中。體積生產力

之時程展示於圖164E中 > 且顯示在。小時與40小時之間維

持1.0 g/L/h之平均速率（在19小時與59小時之間維持1.4 g/L/h）。如由CER量測之代謝活性概況展示於圖164F中°

在醱酵期間所利用之參與製造異戊二烯之碳的莫耳產率在

40小時之時為19.6%（在59小時之時為23.6%）。自葡萄糖製

得之異戊二烯之重量百分比產率在40小時之時為8.9%（在

59小時之時為10.7%）。

149050.doc -380-

1434921

實例25：在表現馬氏甲烷球菌甲無戊酸激酶、銀白楊異戊

二烯合成酶、pCL上游MVA(糞腸球菌mvaE及mvaS)及

ybhE (pgl)之大腸桿菌菌株中共同製造異戊二烯與氫氣

收集醱酵釋出氣體並分析其中之氫氣及異戊二烯含量

使用菌株RMU 1608-2(大腸桿菌BL21 (DE3), pCL上游

MVA, cmR-gi 1.2-yKKDyI, pTrcAlba-mMVK, pBBR cmR- gil.5-pgl)及 EWL 256(大腸桿菌 BL21 (DE3), pCL 上游 MVA, cmR-gi 1.2-yKKDyI, pTrcAlba-mMVK)進行醱酵。細菌菌株

之構築描述於上文實例23中。

自表現馬氏甲烷球菌甲無戊酸激酶、銀白楊異戊二烯合

成酶、pCL上游MVA(糞腸球菌mvaE及mvaS｝且組成性表現

ybhE (pgl)(RMU 1608-2)或正常表現ybhE (pgl)(EWL256)之

大腸桿菌菌株EWL256及RM111608-2的批式補料培養物測

定自大腸桿菌大規模製造之異戊二烯。此實驗證實在葡萄

糖存在下生長之細胞會共同製造異戊二烯與氫氣。

關於醱酵培養基(TM2)，每公升TM2醱酵培養基的配方

如下：K2HPO4 13.6 g ' KH2PO4 13.6 g、MgSO4*7H 2O 2 g '單水合檸檬酸2 g、檸檬酸鐵錠0.3 g、(NHD2SO4 3.2 g '酵母提取物5 g ' ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液1 ml。ΙΟΟΟχ 改質痕量金屬溶液：單水合檸檬酸40 g ' MnSO4*H 2O 30 g、NaCl 10 g、FeSO4*7H 2O 1 g、CoC12*6H 2O 1 g、

ZnSO4*7H 2O 1 g、CuSO4*5H 2O 100 mg、H3BO3 100 mg、

NaMoO4*2H 2O 100 mg。對於ΙΟΟΟχ改質痕量金屬溶液，將

各組分逐一溶解於去離子水中，用HCl/NaOH將pH值調整

149050.doc •381 ・

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至3.0，接著於蒸餾水中補足至最终體積，且用0.22微米

(μιη)過濾器進行過濾滅菌(此溶液未經高壓滅菌)°對於

ΤΜ2醱酵培養基，所有組分一起添加 > 溶解於去離子水

中，用氫氧化鉀(ΚΟΗ)將pH值調整至6.8，補足體積'且用

0.22微米(卩m)過濾器對培養基進行過濾滅菌。葡萄糖以

99DE(右旋糖當量)、71% DS(乾固體)之糖漿形式源自於

Cargill。

在15 L生物反應器中，用含有上游甲霽戊酸(MVA)途徑

(pCL上游MVA)、整合下游MVA途徑(cmR-gil.2- yKKDyl)、馬氏甲烷球菌甲羟戊酸激酶及銀白楊異戊二烯

合成酶(pTrcAlba-mMVK)且組成性表現ybhE (pgl) (RM1 11608-2)或正常表現ybhE (pgl)(EWL256)之大腸桿菌

菌株EWL256或RM111608-2進行醱酵。進行此實驗以監測

在醱酵所要條件(pH 7.0及溫度34°C)下自葡萄糖形成異戊

二烯之情況。

在蛋白腺-酵母提取物培養基中製備自冷凍小瓶中獲取

之適當大腸桿菌菌株之接種體。接種體生長至°D550 = °.6 之後，使用600 mL接種體接種含有TM2培養基之15-L生物

反應器。以指數速率補給葡萄糖直至細胞到達停滯期為

止。此後,葡萄糖補料減至滿足代謝需求。在67小時醱酵

期間傳遞至生物反應器之葡萄糖的總量為3.9 kg°藉由添

加異丙基邛-D-1-硫代哌喃半乳糖昔(IPTG)達成誘導。當

550 nm下之光學密度(OD550)達到值為9時，使IPTG濃度達

到102 μΜ。當ΟD550達至U 140時，IPTG濃度升至192 μΜ。

149050.doc -382 -

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在接種後之多個時間，移出樣品且如下文所述測定所製造

之異戊二烯之量。如下文所論述，使用Hiden HPR-2 0質譜

儀測定生物反應器之釋出氣體中氫氣、氮氣、氧氣、二氧

化碳及異戊二烯之含量。

藉由以1 L彈出就聽/min向20 mL玻璃頂部空間小瓶釋氣1 0 秒將1 5-L生物反應器之醱酵釋出氣體之樣品收集於小瓶

中，且用配備有經鐵氟龍塗覆之隔板(Agilent, CA)的金屬

螺旋蓋密封。在收集30分鐘內分析小瓶。

藉 由將 Hiden HPR-20 質譜儀(Hiden Analytics, U.K.)之入

口管置於未封蓋頂部空間小瓶中1 - 2分鐘，以4 scc/min(4 mL/min)之速率將兩種樣品輸注至該質譜儀中，來分析該

兩種樣品。HPR-20儀器經組態以掃描對應於氫氣｛m/z 2)、

氮氣(m/z 28)、氧氣(m/z 32)、二氧化碳(m/z 44)及異戊二

烯(m/z 67)之質量。法拉第偵測器(Faraday detector)用於質

量28 ' 32 ' 44及67。SEM偵測器用於氫氣(秫/ζ 2)。以壓力

之任意單位(托(Torr))量度偵測器回應值。藉由與可靠氫氣

標準相比較來估算絕對氫氣含量。使用MASsoft V 6.21.0.5 1軟體(Hiden Analytics, United Kingdom)記錄結

果。

結果

自兩個醱酵操作獲取釋出氣體樣品，且如上所述進行分

析：

A)菌株 RM111608-2(大腸桿菌 BL21 (DE3), pCL 上游，

cmR-gi 1.2-yKKDyI, pTrcAlba-mMVK, pBBR cmR-gi 1.5-

149050.doc -383 -

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pgl) °在64.8小時■獲取操作中之樣品'在此期間醱酵以厭

氧方式操作，氮氣以1 νvm進行釋氣。

B)菌株E WL256(大腸桿菌 BL21 (DE3), pCL 上游，cmR- gil .2-yKKDyI, pTrcAlba-mMVK) ° 在 34.5 小時獲取操作中

之樣品，在此期間醱酵以好氧方式操作，空氣以1 Vvm進

行釋氣。

結果描繪於圖165A-B中。在兩種狀況下，除異戊二烯、

氧氣及二氧化碳以外，亦偵測到低含量之氫氣°氫氣之基

線讀數為0.95x10-8托。樣品α與B均得到約1.3x10"托之讀

數。基於與氫氣標準之比較，樣品A及B之釋出氣體中存

在之氫氣的量據估算小於10 ppmv(體積百萬分率)'但高

於基線。如圖165A-B中所示，樣品A與B均亦含有大量異

戊二烯及二氧化碳。

實例26：在表現馬氏甲烷球菌甲楚戊酸·激酶、銀白揚異戊

二烯合成酶、pCL上游MVA(糞腸球菌mvaE及mvaS)及

ybhE (pgl)之大腸桿菌菌株中共同製造異戊二烯與氫氣

收集醱酵釋出氣體並分析其中之氫氣及異戊二烯含量

此實驗之目的在於在經工程改造之大腸桿菌菌株中共同

製造氫氣與異戊二烯。為達成此目的’將在如本文所述而

製備之菌株 EWL256 [BL21 (DE3), pCL 上游，cmR-gil.2- yKKDyl, pTrcAlba-mMVK]中表現一部分編碼大腸桿菌氫

化酶-3之幻/c操縱子，不過本文所述之任何細菌菌株均可

以類似方式修飾'諸如RM1U608-2。藉由此項技術中已

知之標準選殖方法，基於公開可用之基因序列來製備包含

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力火操 縱 子基因 勺北(gi|1613063 1)、砂cC(gi|16130630)、

hycD{gi \ 16130629)、hycE(g,i \ 16130628)、hycF{gi \ 16130627)及 砂cG(gi|16130626)之 表現 構築體，且 將其引 入菌株

EWL256中以製造新型菌株EWL256+Hyd-3。

單獨或與EWL256+Hyd-3組合來評估其他突變對共同製

造氫氣與異戊二烯之影響，如下：引入與氫化酶-3成熟或

調控有關之基因(例如hycH(gi|16130625)及hycl (gi|16130624))；使以下失活或缺失：與氫氣吸收或轉運有

關之基因(例如大腸桿菌氫化酶-1 (hya操縱子)及氫化酶-

2(hyb操縱子))或相關蛋白質(例如甲酸去氫酶

歹(gi|16130624))、甲酸裂解酶抑制子(纫當(gi| 16130632))、

甲酸去氫酶Ν、α次單位 S/〃G(gi| 161 29433))、甲酸去氫酶

Ο '大型 次單位 ㈤oG(gi|1613 1734))、硝酸 還原酶

(〃"G(gi|16129187))、反丁 烯二酸還原酶調控子(fnr

(gi| 16129295))及 乙醯基-輔酶 A 合成酶(acs

(gi|16131895)))；使與氫化酶上調有關之基因(例如甲酸氫

解酶活化子(/72〃(gi|16130638))失活；使以下失活或缺

失：與醱酵副產物製造有關之基因(例如乳酸去氫酶

(ZiZ/z^(gi| 16129341))、反丁 烯二酸還原酶膜蛋白

(/'rcZC(gi|16131977)) > 醇 去氫酶(aa/zE(gi| 1 6 1 29202))、丙酮

酸氧化酶 OoxB(gi| 16128839))、丙酮酸去氫酶El組分

ackA/pta(aceE(gi\16128107))、甲酸去 氫酶調 控蛋白

(砂景(gi|16130632))及甲酸轉運體 A 與 B(Foc^(gi| 1 61 2887 1) 與戶ocg(gi|16130417))；或表現與氫氣代謝有關之異源基

149050.doc -385 -

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因(例如來自 丙酮丁 醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

甘油醛-3-磷酸去氫酶(gapC(gi| 1 5893997)) °基本上如上文實例25中所述，單獨或以組合形式使用經

修飾以包含一或多種如本文所述之其他突變的經工程改造

之菌株 EWL 256+Hyd-3 變異體(BL21 (DE3), pCL 上游，

cmR-gil.2-yKKDyI, pTrcAlba-mMVK 及 hycB-F)進行醱酵 °

藉由基本上如上文所述分析釋出氣體樣品來評估氫氣與異

戊二烯之共同製造。基於異戊二烯與氫氣共同製造之速率

來選擇菌株以供進一步分析。

除非另有規定，否則本文中所用之所有技術及科學術語

之含義皆為熟習本發明所屬領域之技術者通常所理解之含

義。Singleton 等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology » 第 2 版，John Wiley and Sons, New York (1994)，及 Hale 與 Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, N.Y. (1991)向熟習

此項技術者提供本發明中所用之許多術語的通用辭典°應

瞭解，本發明並不限於所描述之特定方法、方案及試劑'

因為其可變化。熟習此項技術者亦應瞭解'類似或等效於

本文所述之任何方法及材料亦可用於實施或測試本發明°

實例27：在含有上游甲無戊酸■途徑、或上游與下游甲適■戊

酸途徑及野葛異戊二烯合成酶之大腸桿菌fadR atoC

LS5218中自脂肪酸.或棕櫚油製造異戊二烯或甲無戊酸

大腸桿 歯fadR atoC菌株LS5218(6966號)獲自大腸桿菌保

藏中心(Coli Genetic Stock Center) ° FadR編碼負性調控編

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碼脂肪酸降解酶之表現的轉錄抑制子（Campbell等人

Bacterial. 183: 5982-5990, 2001）。AtoC為兩組分調控系統

中之回應調控子，在該系統中AtoS調控乙醯乳酸代謝。

fadR atoC菌株允許脂肪酸降解基因組成性表現，且將長鏈

脂肪酸併入長鏈長度的聚楚基烷酸酯中。當棕櫚油用作甲

逾戊酸或異戊二烯製造之碳源時，棕櫚油轉化成甘油與脂

肪酸。關於此之方法在此項技術中為熟知的，且藉由與脂

肪酶（例如豬胰脂肪酶、皺褶假絲酵母｛Candida rugosa）脂

肪酶或其他類似脂肪酶）一起培育而以酶促方式進行或藉

由用諸如氫氧化錮之鹼皂化而以化學方式進行 。

i）表現上游甲翔戊酸途徑之大腸桿菌fadR atoC菌株

藉由使用標準方法將pCLPtrcUpperPathway電穿孔至

LS5218 中來產生菌株 WW4（Sambrooke 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 2 版，Cold Spring Harbor, 1989）。當在補充有C12脂肪酸（FA）或棕櫚油作為

碳源之TM3培養基中培養細胞時，藉由製造甲裁戊酸

（MVA）來證實質體併入。為證實由WW4自脂肪酸製造

MVA，將來自隔夜培養物之細胞以1:100稀釋至補充有

0.25% C12 FA（Sigma，目錄號 L97 5 5）之 5 mL經改質 TM3培

養基（不含酵母提取物之TM3）中。在30°C下培育經IPTG誘

導之培養物隔夜之後，MVA產量之第一標誌（24 mg/L）顯而

易見。產量經三天漸增，所製造之MVA之最終含量為194 mg/L。為證實由WW4自油製造MVA，將來自隔夜培養物

之細胞以1:100稀釋至每5 mL TM3培養基補充有200 mg經

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分解棕櫚油之經改質TM3培養基中。在30°C下培育經IPTG誘導之培養物隔夜之後，MVA產量之第'標誌（50 mg/L）顯而易見。產量經三天漸增，所製造之MVA之最终含量為

5 00 mg/L。

ii）表現上游與下游MVA途徑及野葛異戊二烯合成酶之大腸

桿奩fadR afoC菌株

用pMCM118 [pTrcKKDylklS]轉型大腸桿菌菌株WW4 （LS52 1 8 fadR atoC pCLPtrcUpperPathway） » 得到 WW1 0 ° 當在TM3及葡萄糖中培養菌株且用IPTG（100、3 00或900 卩M）誘導時，由製造異戊二烯之跡象來證實質體併入。菌

株對IPTG相對敏感，且甚至在100 μΜ IPTG下仍顯示顯著

生長缺陷。此等結果展示於圖70A中。

為測試自十二烷酸製造異戊二烯，在37°C、以200 rpm 震盪下於含有壯觀黴素（50 gg/ml）及康黴素（50 之L培養液中培養WW10隔夜。如下用經改質TM3培養基洗滌

細胞：進行離心且以其原始培養體積再懸浮於此培養基

中。將來自 此起子培養物（starter culture）之經洗滌且再懸

浮之細胞以1:100及1:10稀釋至含有0.125% C12脂肪酸

（Sigma ＞目錄號L 9755）之5 mL經改質TM3培養基中。

為證實自棕櫚油製造甲羟戊酸，在37°C及250 rpm下用

脂肪酶預分解該油數夭以釋放脂肪酸（由震盪管時所形成

之泡沫判斷水解跡象）。

另外，藉由將經洗滌之細胞以1 ： 10稀釋至具棕櫚油之試

管中所含之經改質TM3培養基中來設置培養物。藉由將

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0.125% C12FA添加至其餘（2.5 mL）未經進一步稀釋（生物轉

化）之經洗滌細胞中來設置另一管。在30°C、以250 rpm震

盪下生長3.75小時後，藉由添加50 μΜ IPTG誘導所有培養

物。繼續培育4小時，此後用經修改之頂部空間檢驗來檢

驗各200卩L之培養物的異戊二烯積累（在30°C、以500 rpm 震盪下1小時之積累）。在GCMS分析之前，藉由在檢驗玻

璃磚上培育12小時來進行另一異戊二烯檢驗。繼續培育經

誘導之培養物隔夜，且次日早晨再次檢驗200卩L等分試樣

之異戊二烯產量（1小時、30°C、500 rpm Shel-Lab震盪

器）。此等培養物之分析顯示製造大量異戊二烯。在自已

培育並誘導隔夜之後的隔夜起子培養物以1/10稀釋下接種

之培養物中觀測到最,高含量之異戊二烯。此結果表明此培

養物繼續生長且其細胞密度增加。此等結果展示於圖70B 中。由於脂肪酸懸浮液之外觀混濁，故不可直接量測細胞

密度。因此，藉由將培養物之等分試樣塗板來測定此培養

物之細胞密度，且顯示有8χ107個群落形成單位。此大致

對應於0.1之OD6oo。儘管如此，此培養物提供顯著異戊二

烯產量；在不含此實例中所述之途徑的類似菌株中未觀測

到異戊二烯。

實例28：表現來自鍵黴菌屬植物之異戊二烯合成酶

野葛異戊二烯合成酶之基因獲自質體pJ20 1:198 13。質

體pJ201:19813編碼來自大葛藤（野葛植物）之異戊二烯合成

酶，且針對螢光假單胞菌、惡臭假單胞菌、沼澤紅假單胞

菌及棒狀桿 菌進行密碼子最佳化（圖79A-79C（SEQ ID

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NO:123))。用限制 性酶Ndel及BamHI分解質體pJ201:19813 會釋放基因isol9813，將該基因接合至鏈黴菌-大腸桿菌穿

梭載體 pUWL201PW(Doumith 等人，Mol. Gen. Genet. 264: 477-485, 2000 ；圖 71)中以產生 pUWL201_iso。藉由

pUWL201_iso之限制性分析驗證成功選殖。在允許於鏈黴

菌屬中組成性表現，而不允許在大腸桿菌中表現之erm啟

動子控制下表現異戊二烯合成酶isol9813 °女口 Hopwood 等人，The John innes foundation, Norwich,

1985所述，藉由原生質體轉型將PUWL201PW (無插入物)

及pUWL20 l_iso引入白色鏈黴菌 {Streptomyces

al bus)] 1074 (Sanchez 等人，Chem. Biol. 9:5 19-5 3 1, 2002) 中°

用 1.9 pg pUWL201PW或 2.9 gg pUWL201_iso轉 型原生

質體懸浮液之200卩1等分試樣。在28°C下於非選擇性R5-瓊

脂板上培育隔夜之後，藉由在含有硫鏈絲菌素

(thiostrepton)(250 pg/ml)之R3 -疊層瓊脂中再培育4天來選

擇陽性轉型體。使用質體微型套組(Plasmid Mini Kit，

Qiagen)，由質體製劑檢查硫鏈絲菌素抗性轉型體中pUWL 質體的存在。將所製備之質體DNA再引入大腸桿菌DH5a 中以產生足量質體DNA留待藉由限制性分析加以分析。在

含胺芾青黴素之L瓊脂板上選擇陽性轉型體，且藉由用

Ndel及BamHI核酸內切酶分解質體DNA來進行插入物分

析。在陽性pUWL201 iso純系中鑑別出呈1.7 kb片段形式

之異戊二烯合成酶，而在對照菌株(pUWL201PW)中未觀

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測到該片段。

分析含有對照質體pUWL201PW或編碼異戊二烯合成酶

之pUWL201_is。的白色鏈黴菌（S. albus）之野生型菌株及轉

型體之異戊二烯形成。在存在或不存在硫鏈絲菌素（200 Pg/ml）之情況下於固體培養基（胰蛋白酶大豆培養液瓊脂，

TSB ； 2.5 ml）_L 一式兩份培養菌株，且在28°C下於密封頂

部空間小瓶（總體積20 ml）中培育4天。藉由GC-MS以SIM 模式分析500卩1頂部空間樣品（終點量測），且根據參考滯

留時間及分子質量（67 m/z）來鑑別異戊二烯。由先前產生

之校準曲線來定量頂部空間樣品中存在之異戊二烯。儘管

野生型白色鏈黴菌及具有pUWL201PW之對照菌株所製造

之異戊二烯的濃度略微高於偵測限度（0.04-0.07 ppm），但

具有pUWL201_iso之白色鏈黴菌所製造之異戊二烯與對照

相比至少過量10倍（0.75 ppm ；圖72）。結果證實在放線菌

（Actinomycetes）族群之原核生物體中成功表現植物來源性

異戊二烯合成酶。

實例 29 ：回收 Bioisoprene™

自一組四個14-L規模醱酵中以兩步操作回收

Bioisoprene™ ＞該兩步操作包含藉由使異戊二烯吸附於活

性碳而自醱酵釋出氣體氣提異戊二烯，接著進行離線蒸汽

脫附並冷凝以得到液體Bioisoprene™（圖166A及圖166B）。

四個醱酵槽所製造之Bioisoprene™之總量為1150 g（ 1 6.9 mol） ＞其中953 g（14 mol，83 %）由碳濾器吸附。蒸氣脫附/

冷凝步驟之後‘所回收之液體Bioisoprene™之量為810 g ＞

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對應於總回收產率70%。分析所回收之Bioisoprene™中雜

質的存在。

Bioisoprene™液體之分析與雜質概況

藉由GC/MS及氣相層析/火焰離子化偵測(GC/FID)來分

析所回收之Bioisoprene™液體以確定雜質之性質及含量°

測得產物之純度〉99.5%，且含有若干主要雜質以及許多微

量組分。GC/FID層析圖描繪於圖167中，且雜質之典型含

量展示於表19中。雜質概況類似於在此規模上製造之其他

Bioisoprene™批次。

表19.數批Bioisoprene™中所見之雜質之性質及含量概述

化合物

滯留時間(min)濃度範圍

GC/MS GC/FID

乙醇 1.59 11.89 <50 ppm

丙酮 1.624 12.673 <100 ppm

甲基丙烯醛 1.851 15.369 <200 ppm

甲基乙烯基酮 1.923 16.333 <20 ppm

乙酸乙酯 2.037 17.145 100 至 800 ppm

3-甲基-1,3-戊二烯 2.27 18.875 50至500 ppm

甲基乙烯基環氧乙烷 2.548 19.931 <100 ppm

異戊二烯醇 2.962 21.583 <500 ppm

3-甲基-1-丁醇 2.99 21.783 <50 ppm

3-己烯-1-醇 4.019 24.819 <100 ppm

乙酸異戊烯酯 4.466 25.733 200至 1000 ppm

乙酸3-己烯-1-基酯 5.339 27.223 <400 ppm

檸樣烯 5.715 27.971 <500 ppm

其他環狀物 5.50-6.50 27.5-28.0 <200 ppm

藉由用吸附劑處理而純化Bioisoprene™

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吸附劑在工業中廣泛用於自煙原料中移除痕量雜質。適

合之吸附劑包括基於沸石、氧化鋁及二氧化矽之物質。

Bioisoprene™可藉由通過矽膠，且在較小程度上利用氧化

鋁而實質上得到純化。圖168展示在處理之前(A)及用氧化

鋁處理之後(B)或二氧化矽處理之後(C)Bioisoprene™樣品

之GC/FID層析圖。來自BASF之S elexsorb™吸附劑產品為

選擇 用於自Bioisoprene™中 移除極性雜質 之吸附劑之一。

特定言之，Selexsorb CD及CDX產品由於經證實在自異戊

二烯及丁二烯原料中移除極性雜質方面具效用而為較佳

的。

實例30：化學轉化Bioisoprene™

化學品及溶劑按自Sigma Aldrich Corp(WI, USA)接收時

之原樣使用。Bioisoprene™係藉由使表現異戊二烯合成酶

及 異源甲羟戊酸(MVA)異戊二烯前驅物生物合成途徑之大

腸桿菌BL21菌株醱酵而製造。藉由使生物異戊二烯吸附於

活性碳、接著進行蒸汽脫附並冷凝以獲得粗液體生物異戊

二烯，而自醱酵釋出氣體中回收生物異戊二烯。藉由在臨

用前進行分餾而純化生物異戊二烯。

】H NMR分析

在Varian VNMRS 500 MHz NMR系 統上記錄質子(’Η)核

磁共振(NMR)光譜。除非另有規定，否則所有NMR光譜皆

以四甲 基矽烷(TMS，0 ppm)或 氯仿(CHCh，7.26 ppm)作

參考，且峰頻率以ppm形式加以記錄。在鼠化氯仿(CDC13) 或甲醇(CD3OD)中操作樣品。

149050.doc -393 -

1434921

GC/MS分析

使用與 CTC Analytics（Switzerland）CombiPAL 自動取樣器

相接且以頂部空間模式操作之Agilent 6890 GC/MS系統進

行分析。使用 Agilent HP-5MS GC/MS 管柱（3。m><0.25 mm ； 0.25卩m膜厚度）分離分析物。設置自動取樣器以自10 |iL液體注射器注射1卩L液體樣品。GC/MS方法利用氨作為

載氣，流速為1 mL/min。保持注射口在250°C下'分流比

為100:1 °烘箱程式始於50°C，持續2分鐘；以25°C/min之

速率增至225°C ；接著保持1分鐘，總操作時間為10分鐘。

以m/z 29至m/z 500之掃描模式操作Agilent 5793N質量選擇

偵測器。採用1 .5分鐘之溶劑延遲。在此等條件下，觀測

到異戊二烯（2-甲基-1,3-T二烯）在0.675分鐘時溶離。

GC/FID分析

使用與 CTC Analytics（Switzerland）CombiPAL 自動取樣器

相接且以液體模式操作之Agilent 6890 GC/FID系統進行分

析。使用 Agilent DB-Petro GC 管柱（100 m><0.25 mm ； 0.50 卩m膜厚度）分離分析物。設置自動取樣器以自10卩L液體注

射器注射1卩L液體樣品。GC/FID方法利用氨作為載氣，流

速為1 mL/min。保持注射口在200°C下，分流比為50:1。烘

箱程式始於50°C，持續15分鐘；以25°C/min之速率增至

250°C ；接著保持10分鐘，總操作時間為33分鐘。以恆定

組成模式保持FID偵測器在280°C下 > 氫氣流速為35 mL/min且空氣流速為250 mL/min。在此等條件下，觀測到

異戊二烯（2-甲基-1,3-丁二烯）在13.54分鐘時溶離。

149050.doc -394-

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ι. 經由狄爾斯-阿爾德熱環化加成製備環狀異戊二烯二

聚體

在2,6-二-第 三丁基-4-甲 基苯酚(0.165 g - 0.05 mol)充當

熱聚合抑制劑存在下，於150°C下加熱異戊二烯(1.02 g，

0.015 mol)並持續24小時。在密封厚壁玻璃反應容器中進

行反應，反應之前該反應容器已於真空烘箱中乾燥24小

時。用磁性攪拌器攪拌反應混合物。藉由氣相層析與質譜

儀偵測器(GC-MS)監測反應進程。反應完成後，以己烷作

為溶離劑，使用矽膠層析純化所得異構體混合物。在旋轉

式真空蒸發器上濃縮後，藉由GC-MS及0-NMR對產物進

行 表徵。GC/MS :產物 A: 5.17, 5.19 min ；產物 B: 5.72, 5.74 min ；產物 C: 6.11 min。,H-NMR (CDC13) δ: 5.8 (m);5.4 (m); 4.95 (m); 2.4-1.2 (m) °II. 經由Pd催化之寡聚製備異戊二烯寡聚物

在密封厚壁玻璃反應容器中混合異戊二烯(2.03 g - 0.03 mol)與異丙醇(1.79 g，0.03 mol) °反應之前，玻璃腔室於

真空烘箱中乾燥24小時。在惰性氮氣氛圍下完成所有試劑

的轉移。將 乙醯基丙酮酸鈕(0.55 mg，0.06 mmol)及三苯

基麟(1.49 mg » 0.19 mmol)添加至反應混合物中。接著在

經由磁性攪拌器促成混合下，將反應腔室加熱至100°C，

持續24小時。藉由GC-M S分析反應過程。一旦反應完成，

即藉由使用己烷作為溶離劑進行矽膠管柱層析來分離產

物。藉由GC-M S及'H-NMR光譜法對最終產物進行表徵。

GC/MS :產物 A: 5.54 min ；產物 B: 6.6 min ；產物 C: 6.85

149050.doc •395 ·

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min °III.氫化不飽和化合物

將實例2中所獲得之異構體混合物(1.36 g，0.01 mol)置於配備有磁性攪拌器且含有氫化催化劑(Pd/c，5重量

%)(0.21 g，0.1 mmol)之玻璃腔室中。在進行實驗之前真

空乾燥所有玻璃器皿。將氫氣引入系統中且保持壓力為3atm。數小時後，自反應混合物過濾反應混合物中之

Pd/C，且使用矽膠層析法分離產物。使用GC-M S及NMR完

成最終分析。

IV.製備乙氧基化異戊二烯衍生物

在配備有磁性攪拌器之厚壁玻璃腔室中混合異戊二烯

(0.982 g，0.014 mol)與絕對乙醇(0.665 g，0.014 mol)。將

催化量之濃硫酸添加至反應混合物中，接著在85°C下攪拌

隔夜。藉由GC-MS監測反應進程。加熱16小時後，GC-MS 痕量分析揭示存在具有以下滯留時間之異構體的混合物 ：

產物 A: 2.66 min m/z+=99 ；產物 Β: 3.88 m/z+=99, 114 ；產

物 C: 5.41 min, m/z+=87, 99, 114。

V. 使用釘催化劑使異戊二烯轉化成C10環狀二聚體

rk

已使用釘催化劑以極佳產率使異戊二烯轉化成C10環狀

+異構體

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二聚體，即轉化成二甲基-環辛二烯之混合物(Itoh, Kenji; Masuda, Katsuyuki; Fukahori, Takahiko; Nakano, Katsumasa; Aoki, Katsuyuki; Nagashima, Hideo, Or ganomet allies

(1994), 13(3), 1020-9)。據報導，在中等溫度(低至60°C)下

轉化率高於95%。可使用氯化釘(RuC13)及五甲基環戊二烯

(C5Me5H)作為起始物質，以兩個簡易步驟製備催化劑，基

於五甲基環戊二烯基之釘有機金屬化合物。對於二聚反

應，用三氟甲磺酸銀(AgOTf)活化催化劑以製造活性物

質，但亦可使用其他活化劑。

VI.使用諮催化劑使異戊二烯轉化成C15三聚體

異戊二烯

CrCI3(THF)3 + PNP西己位體+ MAO

甲苯

氫化

可使用鎔催化劑與P-N-P配位體Μ雙(二芳基麟基)胺使

異戊二烯轉化成C15三聚體。就地製備催化劑且使用ΜΑ0 將其活化，如 Bowen, L.; Charernsuk, Μ.; Wass, D.F. Chem.

Commun. (2007) 2835-2837 中所述。在中等温度(70°C)下，

所報導之異戊二烯轉化成由線性產物與環狀產物之混合物

(3:1)組成之C15三聚體的轉化率高達95%。在每種狀況下

均鑑別出四聚體為另一主要產物。

VII.氫化異戊二烯

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使用 H-cube氫化儀器(ThalesNano, Princeton, NJ, U.S.A.) 以連續方式將異戊二烯(10 mL於絕對乙醇中之10%溶液

(v/v))氫化成2-甲基丁烷(異戊烷)。將異戊二烯溶液以0.5 mL/min泵送穿過保持於70°C下之10% Pd/C催化劑筒。在1 atm壓力下使用「全模式」引入氫氣。收集產物且藉由'H NMR及GC/FID進行分析，確認異戊二烯以超過90%之產率

轉化成2-甲基丁烷，加之微量部分氫化之單烯煙。'H NMR (500 MHz, CDCI3)： δ 0.8 (m, 9Η, CH3)· 1.12 (m, 2H, CH2)· 1.37 (m, 1H, CH)。GC/FID : 2-甲基丁烷；滯留時間

= 12.69分鐘。

VIII. 部分氫化異戊二烯

混合 Bioisoprene™ 產品(5 0 mL ， 0.5 mol)與甲苯(200 mL)，且在40°C及5巴氫氣壓力下、於Midi-Cube氫化儀器

(ThalesNano, Budapest, Hungary)_L、在 5% Pd/C催化劑上

使其部分地氫化。基質流動速率為10 mL/min ＞且以125 mL/min(5 mmol/min)傳遞氫氣。使產物流再循環穿過儀

器，持續2小時，此後藉由GC/MS及GC/FID分析產物之等

分試樣，顯示大部分起始物質已轉化成異戊烯(2 -甲基-1- 丁烯、2-甲基-2-丁烯及3-甲基-1-丁烯)之混合物，加之異

戊烷及某些未反應之異戊二烯(圖170)。

IX. 選擇性氫化Bioisoprene™產品

在上述實例中所列舉之條件下，使用蛋殼型Ρύ/δ-Α12Ο3 催化劑選擇性氫化Bioisoprene™產品，得到 異戊烯之混合

物，其中2-甲基-2- 丁烯為主要產物，佔總異戊烯之超過

149050.doc -398 -

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50%，且3-甲基-1-丁烯為次要產物，佔總異戊烯產物之不

足25%，如GC/M S分析所測定。異戊烷及殘餘異戊二烯之

量佔總產物流之不足10%。當使用硫化鈕/碳催化劑進行反

應時，獲得類似結果。

X. 在氣相中部分氫化Bioisoprene™產品

將含有Bioisoprene™產品之乾燥氣流與略微過量之氫氣

（mol/mol）混合，且使氣態混合物通過異相氫化催化劑，諸

如美國專利申請案20090203520中所述之具有高孔隙體積

之IB族促進之鈕催化劑，以製造異戊烯與一或多種雜質之

混合物，該一或多種雜質係源自最初產生Bioisoprene™產

品之醱酵過程。在0.5巴至200巴之範圍內之壓力及0°C至

200°C之溫度下進行轉化。

XI. 用固體酸催化劑使異戊烯二聚

在室溫下將2-甲基-2-丁烯（1.5 mL）及甲苯（4 mL）與

Amberlyst 15酸樹脂（186 mg）—起攪拌12小時。自反應混

合物中移出等分試樣（500卩L）且將其轉移至GC小瓶中。藉

由GC/MS分析該混合物（圖171），且揭示部分轉化成適合用

作BioIsofuel™組分之C10二聚體（二異戊烯）。

視情況在實例30部分VII中所述之條件下，或經由此項

技術中已知用於使烯煙氫化成異烷煙之條件［參見，例如

Marichonna （200 1）］，完全氫化二聚反應之產物（二異戊

烯，C10二聚烯）。

XII. 用固體酸催化劑使Bioisoprene™產品寡聚

在室 溫下將Bioisoprene™單體、2-甲基-2-丁烯（1.5 mL）

149050.doc -399-

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及甲苯（4 mL）之混合物與Amberlyst 15酸樹脂（1 86 mg）—起

攪拌12小時。自反應混合物中移出等分試樣（500 |iL）且將

其轉移至GC小瓶中。藉由GC/MS分析混合物（圖172），且

揭示由異戊二烯、線性、環狀及芳族C10、C15及高碳寡

聚物組成之複雜產物混合物。

Bioisoprene™ 單體

Amberlyst 15 酸樹脂

甲苯，20°C,密封容器，12小時

線性、環狀及芳族二聚體、

三聚體及高碳寡聚物

XIII.用固體酸催化劑使Bioisoprene™產 品連續寡聚

在含有Amberlyst 1 5離子交換樹脂或等效催化劑之二聚

反應器中，使Bioisoprene™單體連續轉化成C 1 0二聚體及

C15三聚體。Bioisoprene™原料流包含Bioisoprene™單體

且視情況包含Bioisoprene™之C5衍生物及共溶劑。在20 °C 至200°C之範圍內之溫度及0.5巴至200巴之壓力下進行該過

程。在第一分餾管柱中分餾二聚步驟之產物以自高碳

（＞C5）寡聚物分離未反應之異戊二烯。使C5餾份返回至二

聚反應器，且將〉C5重餾份引入第二分餾管柱中，在該管

柱中自頂部氣流收集所要C10/C15餾份。將由〉C15寡聚物

組成之底部餾份饋入含有諸如Grubbs第2代催化劑之複分

解催化劑的重質再循環反應器中。複分解催化劑使一部分

高碳寡聚物餾份經由烯煙交叉複分解反應轉化成較輕組

分，隨後將其饋入如圖173中所描繪之1號分餾管柱中。

總體上，該過程使得生物異戊二烯單體轉化成

149050.doc -400-

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BioIsofuel™前驅物CIO二聚體及C15三聚體，接著在實例

30章節VII中所述之條件下對其進行部分或完全氫化。所

得部分或完全飽和之化合物適合用作BioIsofuel™組合物

及BioIsofuel™摻合原料。

實例31. 13C/12 C同位素分析

可如下進行“C分析：將0.5至1.0 mg樣品負載至錫杯中

以使用Costech ECS40 1 0元素分析儀作為ThermoFinnigan Delta Plus XP同位素比率質譜儀之入口來進行碳同位素分

析。將樣品滴入1020°C下之氧化亞鋁/氧化結燃燒反應器

中，使燃燒氣體於氨流中以85 mL/min通過銅反應器

(650°C)以使ΝΟχ轉化成Ν2 ο使用3 m 5A分子篩管柱分離

CO2與N2。接著，使用兩種實驗室標準(乙醯苯胺B， -29.52±0.02%om ；及玉米澱粉 A，-11.0 1±0.02%ο)針對 VPDB 量表校準，3C/12C比率，該兩種實驗室標準已藉由使用Τ. B. Coplen等人，New Guidelines for 613C Measurements, Anal. Chem., 78, 2439-2441 (2006)之雙標準方法進行離線燃燒與

雙重入口分析而針對VPDB量表經仔細校準。Coplen之教

示內容以引用的方式併入本文中以達成教示測定"3c值之

技術的目的。

2008年6月30 0申請之美國臨時專利申請案第61/133,521 號、及WO 2010/05525 A1列出原料及源自各種來源之異戊

二烯之聚合物的”3c值，包括表20中所列者。

149050.doc -401 -

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表20

樣品 6,3C棕櫚油 -30.00

酵母提取物 -25.70

來自莘取蒸餾之商用聚異戊二烯 -23.83

來自軟木漿之糖 -23.00

來自異戊二烯樣品B（乳液聚合）之聚異戊二烯 -19.67

轉化糖 -15.37

來自異戊二烯樣品A（敛催化劑）之聚異戊二烯 -14.85

來自甜菜渣之葡萄糖 -13.00

來自玉米乾草之葡萄糖 -11.20

玉米澱粉 -11.10

葡萄糖 -10.73

實例32-例示性燃料特性

表21列出可使用本文所述之方法自異戊二烯製造之某些

化合物的燃料特性。

149050.doc -402-

1434921

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(58.

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二申

149050.doc -403 -

1434921

本文中所提供之標題並不限制本發明之各個態樣或實施

例，該等態樣或實施例總體上可參考說明書而獲得°

本說明書中所引用之所有公開案、專利申請案及專利皆

以引用的方式併入本文中，如同各個別公開案、專利申請

案或專利特定及個別地以引用的方式併入一般°詳言之’

本文中所引用之所有公開案均係出於描述及論述可能與本

發明結合使用之組合物及方法的目的而以引用的方式明確

併入本文中。儘管已出於清楚理解之目的而經由說明及實

例略為詳細地描述前述發明內容，但一般技術者鑒於本發

明之教示將顯而易知，可在不脫離隨附申請專利範圍之精

神或範疇下對其作出某些變化及修改°

149050.doc -404 -

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附錄1

例示性1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶核 酸與多肽

ATH: AT3G21500(DXPSl)AT4G1556O(CLA1)AT5G11380(DXPS3)OSA: 4338768 4340090 4342614CME: CMF089CPFA: MALI3P 1.186TAN: TA20470TPV:TP01_0516ECO: b0420(dxs)ECJ: JW0410(dxs)ECE: Z0523(dxs)ECS: ECsO474ECC: c0531(dxs)ECI: UTI89_C0443(dxs)ECP: ECP_0479ECV: APECOl_1590(dxs)ECW: EcE24377A_0451(dxs)ECX: EcHS_A049lSTY: STY0461(dxs)STT: t2441(dxs)SPT: SPA2301(dxs)SEC: SC0463(dxs)STM: STM0422(dxs)YPE: YPO3177(dxs)YPK: yl008(dxs)YPM: YP_0754(dxs)YPA: YPA1.2671YPN: YPN_0911YPP: YPDSF_2812YPS: YPTB0939(dxs)YPI: YpsIP31758_3112(dxs)SFL: SF0357(dxs)SFX: S0365(dxs)SFV: SFV_0385(dxs)SSN: SSON_0397(dxs)SBO: SBO_0314(dxs)SDY: SDY_0310(dxs)EC A: ECA1131(dxs)PLU: plu3887(dxs)BUC: BU464(dxs)BAS: BUsg448(dxs)WBR: WGLpl44(dxs)SGL: SG0656KPN: KPN_00372(dxs)BFL: Bfl238(dxs)BPN: BPEN_244(dxs)

HIN: HI1439(dxs)HIT: NTHI1691 (dxs)HIP: CGSHiEE_04795HIQ: CGSHiG&_01080HDU: HD0441(dxs)HSO: HS_0905(dxs)PMU: PM0532(dxs)MSU: MS1059(dxs)APL: APL_0207(dxs)XFA: XF2249XFT: PD1293(dxs)XCC: XCC2434(dxs)XCB:XC_1678XCV: XCV2764(dxs)XAC: XAC2565(dxs)XOO: XOO2017(dxs)XOM: XOO_1900(X001900)VCH: VC0889VVU:VVl_0315VVY: VV0868VPA: VP0686VFI: VF0711PPR: PBPRA0805PAE: PA4044(dxs)PAU: PA14_11550(dxs)PAP: PSPA7_1057(dxs)PPU: PP_0527(dxs)PST: PSPTO_0698(dxs)PSB: Psyr_0604PSP: PSPPH_0599(dxs)PFL: PFL_551O(dxs)PFO: Pfl项07PEN: PSEEN0600(dxs)PMY: Pmen_3844PAR: Psyc_0221(dxs)PCR: Pcryo_0245ACI: ACIAD3247(dxs)SON: SO_1525(dxs)SDN: Sden_2571SFR: Sfri_2790SAZ: Sama_2436SBL: SbalJ357SLO: Shew_2771SHE: Shewmr4_2731SHM: Shewmrf 2804SHN: Shewana3_2901

149050.doc -405 -

1434921

SHW: Sputw3181_2831ILO: IL2138(dxs)CPS: CPS_1088(dxs)PHA: PSHAa2366(dxs)PAT: Patl_1319SDE: Sde_3381PIN: Ping]2240MAQ: Maqu_2438MCA: MCA0817(dxs)FTU: FTT1018c(dxs) ·FTF: FTF1018c(dxs)FTW: FTW_0925(dxs)FTL: FTL_1072FTH: FTH_1047(dxs)FTA: FTA_1131(dxs)FTN: FTN_0896(dxs)NOC:NocJ743AEH:Mlg_1381HCH: HCH_05866(dxs)CSA: Csal项099ABO: ABQ2166(dxs)AHA: AHA_3321(dxs)BCI: BCI_0275(dxs)RMA: Rmag_0386VOK: COSVj)360(dxs)NME: NMB1167NMA: NMA0589(dxs)NMC: NMC0352(dxs)NGO: NG00036CVI: CV_2692(dxs)RSO: RSc2221(dxs)REU: Reut_A0882REH: H1632732(dxs)RME: Rmet_2615BMA: BMAA0330(dxs)BMV: BMASAVPl_1512(dxs)BML: BMA10299J706(dxs)BMN: BMA10247_A0364(dxs)BXE: Bxe_B2827BUR: Bcepl8194_B2211BCN: Bcen_4486BCH: Bcen2424_3879BAM: Bamb_3250BPS: BPSS1762(dxs)BPM: BURPS 1710b_A0842(dxs)BPL: BURPS 1106A_A2392(dxs)BPD: BURPS668_A2534(dxs)BTE: BTH_II0614(dxs)BPE: BP2798(dxs)BPA: BPP2464(dxs)BBR: BB1912(dxs)

RFR: Rfer_2875POL: Bpro_1747PNA: Pnap_1501AJS: Ajs_1038MPT: Mpe_A2631HAR: HEAR0279(dxs)MMS: mma_0331NEU:NE1161(dxs)NET: Neut_1501NMU: Nmul_A0236EBA: ebA4439(dxs)AZO: azoll98(dxs)DAR: Daro_3061TBD: Tbd_0879MFA: MflaL.2133HPY: HP0354(dxs)HPJ: jhp0328(dxs)HPA: HPAG1_O349HHE: HH0608(dxs)HAC: Hac_0968(dxs)WSU: WS1996TDN: Tmden_0475CJE: Cj0321(dxs)CJR: CJE0366(dxs)CJJ: CJJ81176_0343(dxs)CJU: C8J_0298(dxs)CJD: JJD26997_1642(dxs)CFF: CFF8240_0264(dxs)CCV: CCV52592_1671(dxs)CCV52592_1722CHA: CHAB381_1297(dxs)CCO: CCC13826_1594(dxs)ABU: Abu_2139(dxs)NIS: NIS_0391(dxs)SUN: SUN_2055(dxs)GSU: GSU0686(dxs-l) GSU1764(dxs-2)GME: Gmet_1934 Gmet_2822PCA: Pcar_1667PPD:PproJ191 Ppro_2403DVU: DVU1350(dxs)DVL: Dvul_1718DDE: Ddej2200LIP: LI0408(dsx)DPS: DP2700ADE: Adeh_1097MXA: MXAN_4643(dxs)SAT: SYN_02456SFU: SfunT 1418PUB: SARil_0611(dxs)MLO: mlr7474MES: Meso_0735

149050.doc -406-

1434921

SME: SMc00972(dxs)ATU: Atu0745(dxs)ATC:AGR_C_1351RET: RHE_CH00913(dxs)RLE: RL0973(dxs)BME: BMEI1498BMF: BABl_0462(dxs)BMS: BR0436(dxs)BMB: BruAbl_0458(dxs)BOV: BOV_0443(dxs)BJA: bl!26ii(dxs)BRA: BRADO2161(dxs)BBT: BBta_2479(dxs)RPA: RPA0952(dxs)RPB: RPB_4460RPC:RPC_1149RPD: RPD_4305RPE: RPE_1067NWI: Nwi_0633NHA: Nhain_0778BHE: BH04350(dxs)BQU: BQ03540(dxs)BBK: BARBAKC583_0400(dxs)CCR: CC_2068SIL: SPO0247(dxs)SIT: TM1040_2920RSP: RSP_0254(dxsA) RSP_1134(dxs)JAN: Jann_0088 Jann_0170RDE: RD Γ 0101 (dxsfRD l_0548(dxs)MMR: Mmarl0_0849 ~HNE: HNE_1838(dxs)ZMO: ZMO1234(dxs) ZMO1598(dxs)NAR: Saro_0161SAL: Sa心354ELI: ELIJ2520GOX: GOX0252GBE: GbCGDNIHl_0221 GbCGDNIHl_2404RRU: Rru_A0054 Rru_A2619MAG: amb2904MGM: Mmcl_1048SUS: Acid_1783BSU: BGH715(dxs)BHA: BH2779BAN: BA4400(dxs)BAR: GBAA4400(dxs)BAA: BA 4853BAT: BAS4081BCE: BC4176(dxs)BCA: BCE_4249(dxs)BCZ: BCZK3930(dxs)

BTK: BT9727_3919(dxs)BTL: BALH_3785(dxs)BLI:BL01523(dxs)BLD: BLiO2598(dxs)BCL: ABC2462(dxs)BAY: RBAM_022600BPU: BPUM_2159GKA: GK2392GTN: GTNG_2322LMO: lmol365(tktB)LMF: LMOf2365_1382(dxs)LIN: linl4O2(tkt窃LWE: lwel380(tktB)LLA: L108911(dxsA) L123365(dxsB)LLC: LACR_1572 LACR_1843LLM: llmg_0749(dxsB)SAK: SAK~0263LPL: lp_26l0(dxs)LJO: LJ0406LAC: LBA0356LSL: LSL_0209(dxs)LGA: LGAS_O35OSTH: STH1842CAC: CAC2077 CA_P0106(dxs)CPE: CPE1819CPF: CPF_2073(dxs)CPR: CPFT 1787(dxs)CTC: CTC01575CNO: NT01CX_1983CTH: Cthe_0828CDF: CD1207(dxs)CBO: CBO1881 (dxs)CBA: CLB_1818(dxs)CBH: CLC_1825(dxs)CBF: CLIJ945(dxs)CKL: CKL_1231(dxs)CHY: CHY_1985(dxs)DSY: DSY2348DRM: Dred_1078PTH: PTH_1196(dxs)SWO: Swol_0582CSC: Csac_1853TTE: TTE1298(dxs)MTA: Moth_1511MPE: MYPE730MGA: MGA_1268(dxs)MTU: Rv2682c(dxsl) Rv3379c(dxs2)MTC: MT2756(dxs)MBO: Mb2701c(dxsl) Mb3413c(dxs2)MLE: ML1038(dxs)MPA: MAP2803c(dxs)

149050.doc -407-

1434921

MAV: MAV_3577(dxs)MSM: MSMEG_2776(dxs)MMC: Mmcs_2208CGL:NCgll827(cgll902)CGB: cg2083(dxs)CEF: CE1796CDI: DIP1397(dxs)CJK:jklO78(dxs)NFA: nfa37410(dxs)RHA: RHAl_ro06843SCO: SC06013(SC1C3.01)SCO6768(SC6A5.17)SMA: SAV1646(dxsl) SAV2244(dxs2)TWH: TWT484TWS: TW280(Dxs)LXX: Lxxl0450(dxs)CMI: CMM_1660(dxsA)A AU: AAur_1790(dxs)PAC: PPA1062TFU:Tfu_1917FRA: Francci3_1326FAL: FRAAL2O88(dxs)ACE: Acel_1393SEN: SACE_1815(dxs) SACE_4351BLO:BL1132(dxs)BAD: BAD_0513(dxs)FNU: FN1208 FN1464RBA: RB2143(dxs)CTR: CT331(dxs)CTA: CTA_0359(dxs)CMU: TC0608CPN: CPnl060(tktB_2)CPA: CP0790CP J: CPjl060(tktB_2)CPT: CpB1102CCA: CCA00304(dxs)CAB: CAB301(dxs)CFE: CF0699(dxs)PCU: pc0619(dxs)TPA: TP0824TDE: TDE1910(dxs)LIL: LA3285(dxs)LIC: LIC10863(dxs)LB J: LBJ_0917(dxs)LBL: LBL10932(dxs)SYN: sl!1945(dxs)SYW: SYNW1292(Dxs)SYC: sycl087_c(dxs)

SYF: Synpcc7942_0430SYD: Syncc9605_1430SYE: Syncc9902_1069SYG: sync_1410(dxs)SYR: SynRCC307_1390(dxs)SYX: SynWH7803_1223(dxs)CYA: CYA_1701(dxs)CYB: CYB_1983(dxs)TEL: tll0623GVI: g!10194ANA: alr0599AVA: Ava_4532PMA: Pro0928(dxs)PMM: PMM0907(Dxs)PMT: PMT0685(dxs)PMN: PMN2A_0300PMI: PMT931 兄0893ΡΜΒ: A9601_09541(dxs) PMC:P9515_09901(dxs) PMF:P9303_15371(dxs)PMG: P9301_09521(dxs)PMH: P9215_09851PMJ:P9211J08521PME: NATLl_09721(dxs)TER: Tery_3042BTH: BT_1403 BT_4099BFR: BF0873 BF4306BFS: BF0796(dxs) BF4114PGI: PG2217(dxs)CHU: CHU_3643(dxs)GFO: GFoj3470(dxs)FPS: FP0279(dxs)CTE: CT0337(dxs)CPH: Cpha266_0671PVI: Cvib_0498PLT: PlutJ0450DET: DET0745(dxs)DEH: cbdb_A720(dxs)DRA: DRJ475DGE: Dgeo_0994TTH: TTC1614TTJ: TTHA0006AAE: aq_881TMA: TM1770PMO: Pmob_1001

149050.doc -408-

1434921

例示性乙醯基-CoA-乙醯轉移酶核酸與多肽

HSA: 38(ACAT1) 39(ACAT2)PTR: 451528(ACAT1)MCC: 7O7653(ACAT1) 708750(ACAT2)MMU: 110446(Acatl) 110460(Acat2)RNO: 25014(Acatl)CFA: 484063(ACAT2) 489421(ACAT1)GGA:418968(ACAT1) 421587(RCJMB04_34i5)XLA: 379569(MGC69098)414622(MGC81403)414639(MGC81256)444457(MGC83664)

XTR: 394562(acat2)DRE: 30643(acat2)SPU: 759502(LOC759502)DME: Dmel_CG 10932 Dmel_CG9149CEL: T02G5.4 T02G5.7 T02G5.8(kat-l)ATH: AT5G4823 0(AC AT2/EMB1276)OSA: 4326136 4346520CME: CMA042C CME087CSCE: YPL028W(ERG10)AGO: AGOS_ADR165CPIC: PICST_31707(ERG10)CAL: CaO19.1591(ergl0)CGR: CAGL0L12364gSPO: SPBC215.09cMGR: MGG_01755 MGG_13499ANI: AN1409.2AFM: AFUA_6G 14200 AFUA_8G04000AOR: AO090103000012 A0090103000406CNE: CNC05280UMA: UM03571.1DDL· DDB_0231621PFA: PF14 0484TET: TTHERM_00091590TTHERM_00277470 TTHERM_00926980TCR: 511003.60ECO: b2224(atoB)ECJ: JW2218(atoB) JW5453(yqeF)ECE: Z4164(yqeF)ECS: ECs3701ECC: c2767(atoB) c3441(yqeF)ECI: UTI89_C2506(atoB)UTI89_C3247(yqeF)

ECP: ECP_2268 ECP_2857ECV: APEC01_3662(yqeF)APECOl_4335(atoB)APECOl_43352(atoB)ECX: EcHS_A2365STY: STY3164(yqeF)STT: t2929(yqeF)SPT: SPA2886(yqeF)SEC: SC2958(yqeF)STM: STM3019(yqeF)SFL: SF2854(yqeF)SFX: S3052(yqeF)SFV: SFV_2922(yqeF)SSN: SSON_2283(atoB) SSON_3004(yqeF)SBO: SBO_2736(yqeF)ECA: ECA1282(atoB)ENT: Ent638_3299SPE: Spro_0592HIT: NTHI0932(atoB)XCC: XCC1297(atoB)XCB: XC_2943XCV: XCV1401(thlA)XAC: XAC1348(atoB)XOO: XOO1881(atoB)XOM: XOO_1778(X001778)VCH: VCA0690VCO: VC0395_0630VVU: VV2_0494 VV2_0741VVY: VVA1043 VVA1210VPA: VPA0620 VPA1123 VPA1204PPR: PBPRB1112 PBPRB1840PAE: PA2001(atoB) PA2553 PA3454PA3589 PA3925PAU: PA14_38630(atoB)PPU: PP_2051(atoB) PP_2215(fedAx)PP_3754 PP_4636PPF: Pput 2009 Pput 2403 Pput 3523Pput_4498" - —PST: PSPTO_0957(phbA-l)PSPTO_3164(phbA-2)PSB: Psyr_0824 Psyr_3031PSP: PSPPH_0850(phbAl)PSPPH_2209(phbA2)

149050.doc -409-

1434921

PFL: PFL_1478(atoB-2) PFL_2321PFL_3066 PFL_4330(atoB-2) PFL_5283PFO: Pfl_1269 Pfl_1739 Pfl_2074 Pfl_2868PEN: PSEEN3197 PSEEN3547(fadAx) PSEEN4635(phbA)PMY: Pmen_1138 Pmen_2036 Pmen_3597Pmen_3662 Pmen_3820PAR: Psyc_0252 Psyc_1169PCR: Pcryo_0278 Pcryo_1236 Pcryo_1260PRW: PsycPRwf_2011ACI: ACIAD0694 ACIAD1612 ACIAD2516(atoB)SON: SO_1677(atoB)SDN: Sden_1943SFR: Sfri_1338 Sfri_2063SAZ: Sama_1375SBL: Sbal_1495SBM: Shewl85_1489SBN: Sball95_1525SLO: Shew_1667 Shew_2858SPC: Sputcn32_1397SSE: Ssed_1473 Ssed_3533SPL: Spea_2783SHE: Shewmr4_2597SHM: Shewmr7_2664SHN: Shewana3_2771SHW: Sputw3181_2704ILO: IL0872CPS: CPS_1605 CPS_2626PHA: PSHAa0908 PSHAal454(atoB) PSHAal586(atoB)PAT: Patl_2923SDE: Sde_3149PIN: Ping_0659 Ping_2401MAQ: Maqu_2117 Maqu_2489 Maqu_2696 Maqu_3162CBU: CBU_0974LPN: lpgl825(atoB)LPF: lpll789LPP: lppl788NOC:Noc_1891AEH: Mlg_0688 Mlg_2706HHA: Hhal_1685HCH: HCH_05299CSA: Csal_0301 Csal_3068ABO: ABO_0648(fadAx)

MMW: Mmwyll_0073 Mmwyll_3021Mmwyll_3053 Mmwyll_3097Mmwyll_4182AHA: AHA_2143(atoB)CVI: CV_2088(atoB) CV_2790(phaA)RSO: RSc0276(atoB) RScl632(phbA) RScl637(bktB) RScl761(RS02948)REU: Reut_A0138 Reut_A1348Reut_A1353 Reut_B4561 Reut_B4738Reut_B5587 Reut_C5943 Reut_C6062 REH: H16_A0170 H16_A0867 H16 A0868 H16_A0872H16_A1297H16_A1438(phaA) H16_A1445(bktB)H16ZA1528 H16_A1713 H16_A1720H16_A1887 H16_A2148 H16_B0380H16[B0381 H16[B0406 H16_B0662H16_B0668 H16_B0759 H16_B1369Hl ό^Β 1771 一

RME: Rmet_0106 Rmet_1357 Rmet_1362 Rmet_5156BMA: BMA1316 BMA1321(phbA)BMA1436BMV: BMASAVP1_A1805(bktB) BMASAVPl_A1810(phbA)BML: BMA10299_A0086(phbA) ΒΜΑ10299_Α009ΪBMN: BMA10247_1076(bktB)BMA10247_l 081 (phbA)BXE: Bxe_A2273 Bxe_A2335 Bxe_A2342Bxe_A4255 Bxe_B0377 Bxe_B0739Bxe_C0332 Bxe_C0574 Bxe_C0915BVI: Bcepl808_0519 Bcepl808_1717Bcepl808_2877 Bcepl808_3594Bcepl808_4015 Bcepl808_5507Bcepl808_5644BUR: Bcepl8194_A3629Bcepl8194_A5080 Bcepl8194_A5091Bcepl8194_A6102 Bcepl8194_B0263 Bcepl8194[B1439Bcepl8194_C6652 Bcepl8194_C6802Bcepl819<C6874Bcepl8194_C7118 Bcepl8194_C7151 Bcepl8194_C7332BCN: Bcen_1553 Bcen_1599 Bcen_2158 Bcen_2563 Bcen_2998 Bcen_6289BCH: Bcen2424_0542 Bcen2424_1790Bcen2424_2772Bcen2424_5368Bcen2424_6232 Bcen2424_6276

149050.doc -410-

1434921

BAM: Bamb_0447 Bamb_1728 Bamb_2824Bamb_4717 Bamb_5771 Bamb_5969BPS: BPSL1426 BPSL1535(phbA)BPSL1540BPM: BURPS 1710b_2325(bktB)BURPS 1710b_2330(phbA)BURPS 1710b_2453(atoB-2)BPL: BURPS 1106A_2197(bktB)BURPS 1106A_2202(phbA)BPD: BURPS668_2160(bktB)BURPS668_2165(phbA)BTE: BTHJ2144 BTHJ2256 BTHJ2261PNU: Pnuc_0927ΒΡΕ: BP0447 BP0668 BP2059ΒΡΑ: BPP0608 BPP1744 BPP3805BPP4216BPP4361BBR: BB0614 BB3364 BB4250 BB4804BB4947RFR: Rfer_0272 Rfer_1000 Rfer_1871Rfer_2273 Rfer_2561 Rfer_2594Rfer_3839POL: Bpro 1577 Bpro 2140 Bpro 3113Bpro_4187PNA: Pnap_0060 Pnap_0458 Pnap_0867Pnap_l 159 Pnap_2136 Pnap_2804AAV: Aave_0031 Aave_2478 Aave_3944Aave_4368AJS:Ajs_0014Ajs_0124Ajs_1931Ajs_207fAjs_2317 Ajs_3548Ajs_3738Ajs_3776VEI: Veis_1331 Veis_3818 Veis_4193DAC: Daci_0025 Daci_0192 Daci_3601Daci_5988MPT: Mpe_A 1536 Mpe_A 1776Mpe_A 1869 Mpe_A3367HAR: HEAR0577(phbA)MMS: mma_0555NEU: NE2262(bktB)NET: Neut_0610EBA: ebA5202 p2A409(tioL)AZO: azo0464(fadAl) azo0469(fadA2) azo2172(thlA)DAR: Daro_0098 Daro_3022HPA: HPAGl_0675HAC: Hac_0958(atoB)GME: Gmet_1719 Gmet_2074 Gmet_2213Gmet_2268 Gmet_3302

GUR: Gura_3043BBA: Bd0404(atoB) Bd2095DOL: Dole_0671 Dole_1778 Dole_2160Dole_2187ADE: Adeh_0062 Adeh_2365AFW: Anael09_0064 Anae 109 1504MXA: MXAN_3791SAT: SYN_02642SFU: Sfum_2280 Sfum_3582RPR: RP737RCO: RC1134RC1135RFE: RF_0163(paaJ)RBE: RBE_0139(paaJ)RAK: A1C_O582ORBO: A1I_O7215RCM: A1E_O476OPUB: SARll_0428(thlA)MLO: mlr3847MES: Meso_3374PLA: Plav_1573 Plav_2783SME: SMal450 SMcO3879(phbA)SMD: Smed_0499 Smed_3117 Smed_5094Smed_5096ATU: Atu2769(atoB) Atu3475ATC: AGR_C_5022(phbA) AGR_L_2713RET: RHE_CH04018(phbAch)RHE_PC00068(ypc00040)RHE_PF00014CphbAf)RLE: RL4621(phaA) pRL100301 pRL120369BME: BMEI0274 BMEII0817BMF: BABl_1783(phbA-l)BAB2_0790(^hbA-2)BMS: BR1772(phbA-l) BRA0448(phbA-2)BMB: BruAbl_1756(phbA-l)BruAb2_0774(^hbA-2)BOV: BOV_1707(phbA-l)OAN: Oant_1130 Oant_3107 Oant_3718Oant_4020BJA: bll0226(atoB) bll3949 bll7400 bll7819 blr3724(phbA)BRA: BRADO0562(phbA)BRADO0983(pimB) BRADO3110BRADO3134(atoB)BBT: BBta_3558 BBta_3575(atoB)BBta_5147(pimB) BBta_7072(pimB)BBta_7614(phbA)

149050.doc -411 -

1434921

RPA: RPA0513(pcaF) RPA0531RPA3715(pimB)RPB: RPB_0509 RPB_0525 RPB_1748RPC: RPC 0504 RPC 0636 RPC 0641RPC_0832_RPC_1050 RPC_2005RPC_2194 RPC_2228RPD: RPD_0306 RPD_0320 RPD_3105RPD_3306_ "RPE: RPE_0168 RPE_0248 RPE_3827NWI: Nwi_3060XAU: Xaut_3108 Xaut_4665CCR: CC_0510 CC_0894 CC_3462SIL: SPOOl42(bktB) SPO0326(phbA)SPO0773 SPO3408SIT: TM1040_0067 TM1040_2790TM1040_3026 TM1040_3735RSP: RSP_0745 RSP_1354 RSP_3184RSH: Rsphl7029_0022 Rsphl7029_2401 Rsphl7029_3179_Rsphl7029_3921RSQ: Rsphl7025_0012 Rsphl7025_2466Rsphl7025_2833_JAN: Jann_0262 Jann_0493 Jann_4050RDE: RDl_0025 RDl_0201(bktB) RDl_3394(phbA)PDE: Pden_2026 Pden_2663 Pden_2870Pden_2907 Pden_4811 Pden_5022DSH: Dshi_0074 Dshi_3066 Dshi_3331MMR: Mmarl0_0697HNE: HNE_2706 HNE_3065 HNE_3133NAR: Saro_0809 Saro_1069 Saro_1222 Saro_2306 Saro_2349SAL: Sala_0781 Sala_1244 Sala_2896 Sala_3158_SWI: Swit_0632 Swit_0752 Swit_2893Swit_3602"Swit_4887 Swit_5019Swit_5309ELI: ELI_01475 ELI_06705 ELI_12035GBE: GbCGDNIHl_0447ACR: Acry_1847 Acry_2256RRU: Rru_A0274 Rru_A1380 Rru_A1469Rru_A1946 Rru_A3387MAG: amb0842MGM: Mmcl_1165ABA: Acid345_3239BSU: BG11319(mmgA) BG13063(yhfS)BHA: BH1997 BH2029 BH3801(mmgA)BAN: BA3687 BA4240 BA5589

BAR: GBAA3687 GBAA4240 GBAA5589BAA: BA_0445 BA_4172 BA_4700BAT: BAS3418 BAS3932 BAS5193BCE: BC3627 BC4023 BC5344BCA: BCE_3646 BCE_4076 BCE_5475BCZ: BCZK3329(mmgA) BCZK3780(thl)BCZK5044(atoB)BCY: Bcer98_2722 Bcer98_3865BTK: BT9727_3379(mmgA)BT9727_3765(thl) BT9727_5028(atoB)BTL: BALH_3262(mmgA)BALH_3642(fadA) BALH_4843(atoB)BLI: BL03925(mmgA)BLD: BLiO3968(mmgA)BCL: ABC0345 ABC2989 ABC3617ABC3891(mmgA)BAY: RBAM_022450BPU: BPUM_2374(yhfS) BPUM_2941BPUM_3373_OIH: OB0676 OB0689 OB2632 OB3013GKA: GK1658 GK3397SAU: SA0342 SA0534(vraB)SAV: SAV0354 SAV0576(vraB)SAM: MW0330 MW0531(vraB)SAR: SAR0351(thl) SAR0581SAS: SAS0330 SAS0534SAC: SACOL0426 SACOL0622(atoB)SAB: SAB0304(thl) SAB0526SAA: SAUSA300_0355SAUSA300_0560(vraB)SAO: SAOUHSC_00336SAOUHSC_00558SAJ: SaurJH9_0402SAH: SaurJHl_0412SEP: SE0346 SE2384SER: SERP0032 SERP0220SHA: SH0510(mvaC) SH2417SSP:SSP0325 SSP2145LMO: lmol414LMF: LMOf2365_1433LIN: linl453LWE: lwel431LLA: L11745(thiL) L25946(fadA)LLC: LACR_1665 LACR_1956LLM: llmg_0930(thiL)SPY: SPy_0140 SPy_1637(atoB)

149050.doc -412-

1434921

SPZ: M5005_Spy_0119 M5005_Spy_0432M5005_Spy_1344(atoB)SPM: spyM18_0136 spyM18_1645(atoB)SPG: SpyM3_0108 SpyM3_1378(atoB)SPS: SPs0110SPs0484SPH: MGAS10270_Spy0121MGAS10270_Spy0433MGAS10270_Spyl461 (atoB)SPI: MGAS 10750_Spy0124MGAS10750_Spy0452MGAS10750_Spyl453(atoB)SPJ: MGAS2096_Spy0123MGAS2096_Spy0451MGAS2096_Spyl365(atoB)SPK: MGAS9429_SpyO121MGAS9429_Spy0431MGAS9429_Spyl339(atoB)SPF: SpyM50447(atoB2)SPA: M6_SpyO166 M6_SpyO466M6_Spyl390SPB: M28_SpyO117 M28_SpyO42OM28_Spyl385(atoB)SAK: SAK_0568LJO: LJ1609LAC: LBA0626(thiL)LSA: LSA1486LDB: Ldb0879LBU: LBUL_0804LBR: LVIS_2218LCA: LSEI_1787LGA: LGAS_1374LRE: Lreu_0052EFA: EFl364OOE: OEOE_0529STH: STH2913 STH725 STH804CAC: CAC2873 CA_P0078(thiL)CPE: CPE2195(atoB)CPF: CPF_2460CPR: CPR_2170CTC: CTC00312CNO: NT01CX_0538 NT01CX_0603CDF: CD1059(thlAl) CD2676(thlA2)CBO: CB03200(thl)CBE: Cbei_0411 Cbei_3630CKL: CKL_3696(thlAl) CKL_3697(thlA2)CKL_3698(thlA3)AMT: Amet_4630

AOE: Clos_0084 Clos_0258CHY: CHY_1288 CHY_1355(atoB)CHY_1604 CHY_1738DSY: DSY0632 DSY0639 DSY1567DSY1710 DSY2402 DSY3302DRM: Dred_0400 Dred_1491 Dred_1784Dred_1892 _ -SWO: Swol_0308 Swol_0675 Swol_0789Swol_1486 Swol_1934 Swol_2051TTE: TTE0549(paaJ)MTA: Moth_1260MTU: Rvll35ARvl323(fadA4)Rv3546(fadA5)MTC: MT1365(phbA)MBO: Mbll67 Mbl358(fadA4)Mb3576(fadA5) Mb3586c(fadA6)MBB: BCG_1197 BCG_1385(fadA4)BCG_3610糸dA5) BCGL3620c(fadA6)MLE: ML1158(fadA4)MPA: MAP2407c(fadA3)MAP2436c(fadA4)MAV: MAV_1544 MAV_1573 MAV1863 MAV_5081_ ~MSM: MSMEG_2224 MSMEG_4920MUL: MUL_0357MVA: Mvan_1976 Mvan_1988 Mvan_4305Mvan_4677 Mvan_4891MGI: Mflv_1347 Mflv_1484 Mflv_2040 Mflv_2340"Mflv_4356 Mflv_4368MMC: Mmcs_1758 Mmcs_1769Mmcs_3796 Mmcs_3864MKM: Mkms_0251 Mkms_1540Mkms_l 805 Mkms_1816 Mkms_2836Mkms[3159 _ —Mkms_3286 Mkms_3869 Mkms_3938Mkms_4227 Mkms_4411 Mkms_4580Mkms_4724 Mkms_4764 Mkms_4776MJL: Mjls_0231 Mjls_1739 Mjls_1750Mjls_2819 Mjls_3119 Mjls_3235Mjls_3800 Mjls_3850 Mjls_4110Mjls[4383 Mjls_4705 Mjls_4876Mjls_5018 Mjls_5063 Mjls_5075CGL: NCgl2309(cgl2392)CGB: cg2625(pcaF)CEF: CE0731 CE2295CJK:jkl543(fadA3)NFA: nfal0750(fadA4)

149050.doc -413 -

1434921

RHA: RHAl_ro01455 RHAl_ro01623RHAl_ro01876 RHAl_ro02517(catF)RHAl_ro03022 RHAl_ro03024RHAl[ro03391 RHAl_ro03892RHAl_ro04599 RHAl_ro05257RHAl[ro08871 一

SCO: SCO5399(SC8F4.03)SMA: SAV1384(fadA5) SAV2856(fadAl)ART: Arth_1160 Arth_2986 Arth_3268Arth_407f 一

NCA: Noca_1371 Noca_1797 Noca_1828Noca_2764 Noca_4142TFU: Tfii_152O Tfu_2394FRA: Francci3_3687FRE: Franeanl_1044 Franeanl_2711Franeanl_2726 Franeanl_3929Franeanl_4037 Franeanl_4577FAL: FRAAL2514 FRAAL2618FRAAL5910(atoB)ACE: Acel_0626 Acel_0672SEN: SACE_1192(mmgA)SACE_2736(fadA6) SACE_4011(catF)SACE_6236(fadA4)STP: Strop_3610SAQ: Sare_1316 Sare_3991RXY: Rxyl 1582 Rxyl 1842 Rxyl 2389Rxyl_2530~FNU: FN0495BGA: BGOllO(fadA)BAF: BAPKO_0110(fadA)LIL: LA0457(thiLl) LA0828(thiL2)LA4139(fadA)LIC: LIC10396(phbA)LBJ: LBJ_2862(paaJ-4)LBL: LBL_0209(paaJ-4)

RCA: Rcas_0702 Rcas_3206HAU: Haur_0522DRA: DR_1072 DR_1428 DR_1960DR_2480DR_A0053DGE: Dgeo_0755 Dgeo_1305 Dgeo_1441Dgeo_1883TTH: TTC0191 TTC0330TTJ: TTHA0559TME:Tmel_1134FNO: Fnod_0314PMO: Pmob_0515HMA: rmAC0896(acaB3) rmAC2815(aca2) rmAC3497(yqeF)rmB0240(acal) rrnB0242(acaB2)rmB0309(acaBl)TAC: Ta0582TVO: TVN0649PTO: PTO1505APE:APE_2108SSO: SSO2377(acaB-4)STO: ST0514SAI: Saci_0963 Saci_1361(acaBl)MSE: Msed_0656PAI: PAE1220PIS: Pisl_0029 Pisl_1301PCL: Pcal_0781PAS: Pars_0309 Pars_1071CMA: Cmaq_1941

SYN: slrl993(phaA)SRU: SRU_1211(atoB) SRU_1547CHU: CHU_1910(atoB)GFO: GFO_1507(atoB)FJO: Fjoh_4612FPS: FP0770 FP1586 FP1725RRS: RoseRS 3911 RoseRS 4348

149050.doc -414-

1434921

例示性HMG-CoA合成酶核酸與多肽

HSA: 3157(HMGCS1) 3158(HMGCS2) PTR: 457169(HMGCS2) 461892(HMGCS1)MCC: 7O2553(HMGCS1) 713541(HMGCS2)MMU: 15360(Hmgcs2) 208715(Hmgcsl)RNO: 24450(Hmgcs2) 29637(Hmgcsl)CFA: 479344(HMGCS1) 607923(HMGCS2)BTA: 4O7767(HMGCS1)SSC: 397673(CH242-38B5.1)GGA: 396379(HMGCS1)XLA: 380091(hmgcsl) 447204(MGC80816)DRE: 394060(hmgcsl)SPU: 578259(LOC578259)DME: Dmel_CG4311 (Hmgs)CEL: F25B4.6ATH: AT4G1182O(BAP1)OSA: 4331418 4347614CME: CMM189CSCE: YML126C(ERG13)AGO: AGOS_ADL356CPIC: PICST_83020CAL: CaO 19_7312(CaO 19.7312)CGR: CAGL0H04081gSPO: SPAC4F8.14c(hcs)MGR: MGG_01026ANI: AN4923.2AFM: AFUA_3G 10660 AFUA_8G07210AOR: A0090003000611 A0090010000487CNE: CNC05080 CNG02670 UMA:UM05362.1ECU: ECU10_0510DDI: DDBDlG^FT_0217522DDB_0219924(hgsA)TET:TTHERM_00691190TBR:Tb927.8.6110YPE: YPO1457YPK: y2712(pksG)YPM: YP_1349(pksG)YPA: YPA_0750YPN: YPN_2521YPP: YPDSFJ517YPS: YPTB1475CBD: COXBU7E912_1931TCX:Tcr_1719DNO: DNO_0799BMA: BMAA1212

BPS: BPSS1002BPM: BURPS1710b_A2613BPL: BURPS1106A_A1384BPD: BURPS668_A1470BTE: BTHJI1670MXA: MXAN_3948(tac)MXAN_4267(mvaS)BSU: BG10926(pksG)OIH: OB2248SAU: SA2334(mvaS)SAV: SAV2546(mvaS)SAM: MW2467(mvaS)SAR: SAR2626(mvaS)SAS: SAS2432SAC: SACOL2561SAB: SAB2420(mvaS)SAA: SAUSA300_2484SAO: SAOUHSC_02860SAJ: SaurJH9_2569SAH: SaurJHl_2622SEP: SE2110SER: SERP2122SHA: SH0508(mvaS)SSP: SSP0324LMO: lmol415LMF: LMOf2365_1434(mvaS)LIN: linl454LWE: lwel432(mvaS)LLA: L13187(hmcM)LLC: LACR_1666LLM: llmg_0929(hmcM)SPY: SPy_0881(mvaS.2)SPZ: M5005_Spy_0687(mvaS.l)SPM: spyM18_0942(mvaS2)SPG: SpyM3_0600(mvaS.2)SPS:SPsl253SPH: MGAS10270_Spy0745(mvaS 1)SPI: MGAS 10750_Spy0779(mvaS 1)SPJ: MGAS2096J§pyO759(mvaS 1)SPK: MGAS942丈SpyO743(mvaSl)SPF: SpyM51121(mvaS)SPA: M6_Spy0704SPB: M28_SpyO667(mvaS.l)SPN: SP_1727SPR: sprl 571 (mvaS)SPD: SPD_1537(mvaS)SAG: SAG1316SAN: gbsl386SAK: SAK_1347

149050.doc -415 -

1434921

SMU: SMU.943cSTC: strO577(mvaS)STL: stuO577(mvaS)STE: STER_0621SSA: SSA_0338(mvaS)SSU: SSU05_1641SSV: SSU98_1652SGO: SGO_0244LPL: lp_2067(mvaS)LJO: LJ1607LAC: LBA0628(hmcS)LSA: LSA1484(mvaS)LSL: LSL_0526LDB: LdbO881(mvaS)LBU: LBUL_0806LBR: LVIS_Ϊ363LCA: LSEI 1785

LGA: LGAS_1372LRE: Lreu_0676PPE: ΡΕΡΕ_θ868EFA: EF1363OOE: OEOE_0968LME: LEUM_1184NFA: nfa22120SEN: SACE_4570(pksG)BBU: BB0683BGA: BG0706BAF: BAPKO_0727FJO: Fjoh_0678HAL: VN&1615G(mvaB)HMA: rrnAC1740(mvaS)HWA: HQ2868A(mvaB) NPH: NP2608A(mvaB_l) NP4836A(mvaB_2)

例示性理甲基戊二醯基・CoA還原酶核酸與多肽

HSA: 3156(HMGCR) VVU: VV2 0117PTR: 471516(HMGCR) VVY: VVA0625MCC: 705479(HMGCR) VPA: VPA0968MMU: 15357(Hmgcr) VFI: VFA0841RNO: 25675(Hmgcr) PAT: Patl_0427CFA: 479182(HMGCR) CBU: CBU_0030 CBU_0610BTA: 407159(HMGCR) CBD: COXBU7E912_0151GGA: 395145(RCJMB04_14m24) COXBU7E912_0622(hmgA)SPU: 373355(LOC373355) TCX: Tcr_1717DME: Dmel_CG 10367(Hmgcr) DNO: DNO_0797CEL: F08F82 CVI: CVJ806OSA: 4347443 SUS: Acid_5728 Acid_6132SCE: YLR450W(HMG2) SAU: SA2333(mvaA)YMLO75C(HMG1) SAV: SAV2545(mvaA)AGO:AGOS_AER152W SAM: MW2466(mvaA)CGR: CAGL0L11506g SAB: SAB2419c(mvaA)SPO: SPCC162.09c(hmgl) SEP: SE2109ANI: AN3817.2 LWE: lweO819(mvaA)AFM: AFUA_1G11230AFUA_2G03700 LLA: L10433(mvaA)AOR:AO090103000311 A0090120000217 LLC: LACR_1664CNE: CNF04830 LLM: llmg_0931 (mvaA)UMA:UM03014.1 SPY: SPy_0880(mvaS.l)ECU: ECU10_1720 SPM: spyM18_0941(mvaSl)DDI: DDB_0191125(hmgA) SPG: SpyM3_0599(mvaS.l)DDB_0215357(hmgB) SPS: SPsl254TBR:"Tb927.6.4540 SPH: MGAS10270_Spy0744TCR: 506831.40 509167.20 SPI: MGAS10750j§py0778LMA: LmjF30.3190 SPJ: MGAS2096盘py0758VCH: VCA0723 SPK: MGAS94291.Spy0742VCO: VC0395_0662 SPA: M6_Spy0703

149050.doc -416-

1434921

SPN: SP_1726 MST: Msp_0584(hmgA)SAG: SAG1317 MSI: Msm_0227SAN: gbsl387 MKA: MKO355(HMG1)STC: strO576(mvaA) AFU: AF1736(mvaA)STL: stuO576(mvaA) HAL: VNG1875G(mvaA)STE: STER_0620 HMA: rmAC3412(mvaA)SSA: SSA_0337(mvaA) HWA: HQ3215A(hmgR)LPL: lp_0447(mvaA) NPH: NP0368A(mvaA_2)LJO: LJ1608 NP2422A(mvaA_l)LSL: LSL_0224 TAC: Ta0406mLBR: LVIS_0450 TVO:TVN1168LGA: LGAS_1373 PTO: PTO1143EFA: EFl364 PAB: PAB2106(mvaA)NFA:nfa22110 PFU:PF1848BGA: BG0708(mvaA) TKO: TK0914SRU: SRU_2422 RCI: RCIX1027(hmgA) RCIX376(hmgA)FPS: FP2341 APE: APE_1869MMP: MMP0087(hmgA) IHO: IgniJ0476MMQ:MmarC5_1589 HBU: Hbut_1531MAC: MA3073(hmgA) SSO: SSO0531MBA: Mbar_A1972 STO: ST1352MMA: MM_0335 SAI: Saci_1359MBU: Mbu〔1098 PALPAE2182MHU: Mhun_3004 PIS: Pisl_0814MEM: Memar_2365 PCL: Pcal_1085MBN: Mboo_0137 PAS: Pars_0796MTH: MTH562

例示性甲鲤戊酸激酶核酸與多肽

HSA: 4598(MVK)MCC: 707645(MVK)MMU: 17855(Mvk)RNO: 81727(Mvk)CFA: 486309(MVK)BTA: 505792(MVK)GGA: 768555(MVK)DRE: 492477(zgc: 103473)SPU: 585785(LOC585785)DME: Dmel_CG33671OSA: 4348331SCE: YMR208W(ERG12)AGO: AGOS_AER335WPIC: PICST_40742(ERG12)CGR: CAGL0F03861gSPO: SPAC13G6.11CMGR: MGG_06946ANI: AN3 869.2AFM: AFUA_4G07780

AOR: ΑΘ090023000793CNE: CNK01740ECU: ECU09_1780DDI: DDBDRAFT_0168621TET: TTHERM_00637680TBR: Tb927.4.4070TCR: 436521.9 509237.10LMA: LmjF31.0560CBU: CBU_0608 CBU_0609CBD: COXBU7E912_0620(mvk)LPN: lpg2039LPF: lpl2017LPP: lpp2022BBA: BdlO27(lmbP) Bdl630(mvk)MXA: MXAN_5019(mvk)OIH: OB0225 -SAU: SA0547(mvaKl)SAV: SAV0590(mvaKl)SAM: MW0545(mvaKl)

149050.doc -417-

1434921

SAR: SAR0596(mvaKl) LSL: LSL_0685(eRG)SAS: SAS0549 LDB: Ldb0999(mvk)SAC: SACOL0636(mvk) LBU: LBUL_0906SAB: SAB0540(mvaKl) LBR: LVIS_0858SAA: SAUSA300_0572(mvk) LCA: LSEf 1491SAO: SAOUHSC_00577 LGA: LGAS_1033SEP: SE0361 LRE: Lreu_0915SER: SERP0238(mvk) PPE: PEPE10927SHA: SH2402(mvaKl) EFA: EF0904(mvk)SSP: SSP2122 OOE: OEOE_1100LMO: ImoOOlO LME: LEUM_1385LMF: LMOf2365_0011 NFA: nfa22070LIN: linOOlO BGA: BG0711LWE: IweOOll(mvk) BAF: BAPKO_0732LLA: L7866(yeaG) FPS: FP0313LLC: LACR_0454 MMP:MMP1335LLM: llmg_0425(mvk) MAE: Maeo_0775SPY: SPy_0876(mvaKl) MAC: MA0602(mvk)SPZ: M5005_Spy_0682(mvaKl) MBA: Mbar_A1421SPM: spyM18_0937(mvaKl) MMA: MM_1762SPG: SpyM3_0595(mvaKl) MBU: Mbu〔2395SPS: SPsl258 MHU: Mhun_2890SPH: MGAS10270_Spy0740(mvaKl) MEM: Memar_1812SPI: MGAS 10750J§pyO774(mvaKl) MBN: Mboo_2213SPJ: MGAS2096盘pyO753(mvaKl) MST: Msp_0858(mvk)SPK: MGAS94291Spy0737(mvaKl) MSI: Msm_1439SPF: SpyM51126(mvaKl) MKA: MK0993(ERG12)SPA: M6_SpyO699 HAL: VNG1145G(mvk)SPB: M28_SpyO662(mvaKl) HMA: rmAC0077(mvk)SPN: SP_0381 HWA: HQ2925A(mvk)SPR: spr0338(mvk) NPH: NP2850A(mvk)SPD: SPD_0346(mvk) PTO: PTO1352SAG: SAG1326 PHO: PH 1625SAN: gbsl396 PAB: PAB0372(mvk)SAK: SAK_1357(mvk) PFU: PF1637(mvk)SMU: SMU181 TKO: TK1474STC: strO559(mvaKl) RCI: LRC399(mvk)STL: stuO559(mvaKl) APE: APE_2439STE: STER_0598 HBU: HbuL0877SSA: SSA_0333(mvaKl) SSO: SSO0383SSU: SSU05_0289 STO: ST2185SSV: SSU98_0285 SAI: Saci_2365(mvk)SGO: SGO_0239(mvk) MSE: Msed_1602LPL: lp_1735(mvaKl) PAI: PAE3108LJO: LJ1205 PIS: Pisl_0467LAC: LBA1167(mvaK) PCL: Pcal_1835LSA: LSA0908(mvaKl)

149050.doc -418-

1434921

例示性磷酸甲捶戊酸激酶核酸與多肽

HSA: 10654(PMVK)PTR: 457350(PMVK)MCC: 717014(PMVK)MMU: 68603(Pmvk)CFA: 612251(PMVK)BTA: 513533(PMVK)DME: Dmel_CG 10268ΑΓΗ: AT1G31910OSA: 4332275SCE: YMR220W(ERG8)AGO: AGOS_AER354WPIC: PICST_52257(ERG8)CGR: CAGL0F03993gSPO: SPAC343.01CMGR: MGG_05812ANI:AN2311.2AFM: AFUA_5G10680AOR:AO090010000471CNE: CNM00100UMA: UM00760.1DDL· DDBDRAFT_0184512TBR: Tb09.160.3690TCR: 507913.20 508277.140LMA:LmjF15.1460MXA:MXAN_5017OIH: OB0227SAU: SA0549(mvaK2)SAV: SAV0592(mvaK2)SAM: MW0547(mvaK2)SAR: SAR0598(mvaK2)SAS: SAS0551SAC: SACOL0638SAB: SAB0542(mvaK2)SAA: SAUSA300_0574SAO: SAOUHSC_00579SAJ: SaurJH9_06?5SEP: SE0363 "SER: SERP0240SHA: SH2400(mvaK2)SSP: SSP2120LMO: lmo0012LMF: LMOf2365_0013LIN: lin0012LWE: lwe0013LLA: L10014(yebA)LLC: LACR_0456LLM: llmg_0427

SPY: SPy_0878(mvaK2)SPZ: M5005_Spy_0684(mvaK2)SPM: spyMll_0列9SPG: SpyM3_0597(mvaK2)SPS: SPsl256SPH: MGAS10270_Spy0742(mvaK2)SPI: MGAS 10750j§py0776(mvaK2)SPJ: MGAS2096_Spy0755(mvaK2)SPK: MGAS94291Spy0739(mvaK2)SPF: SpyM51124(mvaK2)SPA: M6_Spy0701SPB: M28_Spy0664(mvaK2)SPN: SP_0383SPR: spr0340(mvaK2)SPD: SPD_0348(mvaK2)SAG: SAG 1324SAN: gbsl394SAK: SAK_1355SMU: SMU.938STC: strO561(mvaK2)STL: stuO561(mvaK2)STE: STER_0600SSA: SSA_0335(mvaK2)SSU: SSU05_0291SSV: SSU98_0287SGO: SGO_0241LPL: lp_1733(mvaK2)LJO: LJ1207LAC:LBA1169LSA: LSA0906(mvaK2)LSL: LSL_0683LDB: LdbO997(mvaK)LBU: LBUL_0904LBR: LVIS_0860LCA: LSEI_1092LGA: LGAS_1035LRE: Lreu_0913PPE: PEPE10925EFA: EF0902NFA: nfa22090BGA: BG0710BAF: BAPKO_0731NPH: NP2852ASSO: SSO2988STO: ST0978SAI: Saci_1244

149050.doc -419-

1434921

例示性二磷酸甲無戊酸去覆酶核酸與多肽

HSA: 4597(MVD)PTR: 468069(MVD)MCC: 696865(MVD)MMU: 192156(Mvd)RNO: 81726(Mvd)CFA: 489663(MVD)GGA: 425359(MVD)DME: Dmel_CG8239SCE: YNRO43W(MVD1)AGO: AGOS_AGL232CPIC: PICST_90752CGR: CAGL0C03630gSPO: SPAC24C9.03MGR: MGG_09750ANI: AN4414.2AFM: AFUA_4G07130AOR: A0090023000862CNE: CNL04950UMA: UM05179.1DDL DDBDRAFT_0218058TET: TTHERM_00849200TBR: Tbl0.05.0010 Tbl0.61.2745TCR: 507993.330 511281.40LMA: LmjF 18.0020CBU: CBU_0607(mvaD)CBD: COXBU7E912_0619(mvaD)LPN: lpg2040LPF: lpl2018LPP: lpp2O23TCX: Tcr_1734DNO: DNO_0504(mvaD)BBA: Bdl629MXA: MXAN_5018(mvaD)OIH: OB0226SAU: SA0548(mvaD)SAV: SAV0591(mvaD)SAM: MW0546(mvaD)SAR: SAR0597(mvaD)SAS: SAS0550SAC: SACOL0637(mvaD)SAB: SAB0541(mvaD)SAA: SAUSA300_0573(mvaD)SAO: SAOUHSC_00578SAJ: SaurJH9_0614SAH: SaurJH匚0629SEP: SE0362SER: SERP0239(mvaD)SHA: SH2401(mvaD)

SSP: SSP2121LMO: ImoOOllLMF: LMOf2365_0012(mvaD)LIN: linOOllLWE: lweOO12(mvaD)LLA: L9089(yeaH)LLC: LACR_0455LLM: llmg_0426(mvaD)SPY: SPy_0877(mvaD)SPZ: M5005_Spy_0683(mvaD)SPM: spyM18_0938(mvd)SPG: SpyM3_0596(mvaD)SPS: SPsl257SPH: MG AS 10270_Spy0741 (mvaD) SPI: MGAS10750盘pyO775(mvaD) SPJ: MGAS2096j§py0754(mvaD)SPK: MGAS9429_Spy0738(mvaD)SPF: SpyM51125(mvaD)SPA: M6_Spy0700SPB: M28_SpyO663(mvaD)SPN: SP_0382SPR: spr0339(mvdl)SPD: SPD_0347(mvaD)SAG: SAG1325(mvaD)SAN: gbsl395SAK: SAK_1356(mvaD)SMU: SMR937STC: str0560(mvaD)STL: stuO56O(mvaD)STE: STER_0599SSA: SSA_0334(mvaD)SSU: SSU05_0290SSV: SSU98_0286SGO: SGO_0240(mvaD)LPL: lp_1734(mvaD)LJO: LJ1206LAC: LBA1168(mvaD)LSA: LSA0907(mvaD)LSL: LSL_0684LDB: LdbO998(mvaD)LBU: LBUL_0905LBR: LVIS_0859LCA: LSEI_1492LGA: LGAS_1034LRE: Lreu_0914PPE: PEPE10926EFA: EF0903(mvaD)LME: LEUM1386

149050.doc -420-

1434921

NFA: nfa22080BBU: BB0686BGA: BG0709BAF: BAPKO_0730GFO: GFO 3632FPS: FP031b(mvaD)HAU: Haur_1612HAL: VNG0593G(dmd)HMA: rmAC1489(dmd)HWA: HQ1525A(mvaD)

NPH: NP1580A(mvaD)PTO: PTO0478 PTO1356SSO: SSO2989STO: ST0977SAI: Saci_1245(mvd)MSE: Msed_1576

例示性異戊烯基磷酸激酶(IPK)核酸與多肽

Methanobacterium thermoautotrophicum gi|2621082Methanococcus jannaschii DSM 2661 gi| 1590842;Methanocaldococcus jannaschii gi| 1590842 Methanothermobacter thermautotrophicus gi|2621082Picrophilus torridus DSM9790 (IG-57)

gi|48477569Pyrococcus abyssi gi| 14520758Pyrococcus horikoshii OT3 gi|3258052Archaeoglobus fulvidus DSM4304 gi|2648231

例示性異戊烯基-二磷酸&異構酶(IDI)核酸與多肽

HSA: 3422(IDI1) 91734(IDI2)PTR: 450262(IDI2) 45O263(IDI1)MCC: 710052(LOC710052) 721730(LOC721730)MMU: 319554(Idil)RNO: 89784(Idil)GGA: 42O459(IDI1)XLA: 494671(LOC494671)XTR: 496783(idi2)SPU: 586184(LOC586184)CEL: K06H7.9(idi-l)ATH: AT3G02780(IPP2)OSA: 4338791 4343523CME: CMB062CSCE: YPL117C(IDI1)AGO: AGOS_ADL268CPIC: PICST_6899O(IDI1)CGR: CAGL0J06952gSPO: SPBC106.15(idil)ANI: AN0579.2AFM: AFUA 6G11160AOR: A0090023000500CNE: CNA02550

UMA: UM04838.1ECU: ECU02_0230DDL DDB_0191342(ipi)TET: TTHERM_00237280TTHERM_00438860TBR:Tb09.211.0700TCR: 408799.19 510431.10LMA: LmjF35.5330EHI: 46.t00025ECO: b2889(idi)ECJ: JW2857(idi)ECE: Z4227ECS: ECs3761ECC: c3467ECI: UTI89_C3274ECP: ECP_2882ECV: APECO1_3638ECW: EcE24377A_3215(idi)ECX: EcHS_A3048STY: STY3195STT: t2957SPT: SPA2907(idi)SEC: SC2979(idi)

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1434921

STM: STM3039(idi)SFL: SF2875(idi)SFX: S3074SFV: SFV_2937SSN: SSON_3042 SSON_3489(yhfK)SBO: SBO_3103SDY: SDY_3193ECA: ECA2789PLU: plu3987ENT: Ent638_3307SPE: Spro_2201VPA: VPA0278VFI: VF0403PPR: PBPRA0469(mvaD)PEN: PSEEN4850CBU: CBU_0607(mvaD)CBD: COXBU7E912_0619(mvaD)LPN: lpg2051LPF: lpl2029LPP: lpp2034TCX:Tcr_1718HHA: Hhal_1623DNO: DNO_0798EBA: ebA5678 p2A143DVU: DVU1679(idi)DDE: Dde_1991LIP: LI1134BBA:Bdl626AFW: Anael09_4082MXA: MXANj5021(fhi)RPR: RP452RTY: RT0439(idi)RCO: RC0744RFE: RF_0785(fhi)RBE: RBE_0731(fhi)RAK:A1C_O419ORBO: Allj04755RCM: A1E_O2555RRI:A1G_O4195MLO: mlr6371RET: RHE_PD00245(ypd00046)XAU: Xau?4134SIL: SPO0131SIT: TM1040_3442RSP: RSP_0276RSH: Rsphl7029_1919RSQ:Rsphl7025_1019JAN: Jarm_0168RDE: RDil0147(idi)DSH: Dshi_3527BSU: BG11440(ypgA)

BAN: BAI520BAR: GBAA1520BAA: BA_2041BAT: BAS1409BCE: BC1499BCA: BCE1626BCZ: BCZK1380(fni)BCY: Bcer98_1222BTK: BT9727_1381(fhi)BTL: BALH_1354BLI: BL02217(fhi)BLD: BLiO2426BAY: RBAM_021020(fhi)BPU: BPUM_2020(fhi)OIH: OB0537SAU: SA2136(fhi)SAV: SAV2346(fhi)SAM: MW2267(fhi)SAR: SAR2431(fhi)SAS: SAS2237SAC: SACOL2341(fni)SAB: SAB2225c(fni)SAA: SAUSA300_2292(fni)SAO: SAOUHSC_02623SEP: SE1925SER: SERP1937(fhi-2)SHA: SH0712(fhi)SSP: SSP0556LMO: lmol383LMF: LMOf2365_1402(fhi)LIN: linl420LWE: lwel399(fhi)LLA:L11083(yebB)LLC: LACR_0457LLM: llmg_0428(fni)SPY: SPy_0879SPZ: M5005_Spy_0685SPM: spyM18_0940SPG: SpyM3项598SPS: SPsl255SPH: MGAS10270_Spy0743SPI: MGAS10750j§py0777SPJ: MGAS2096j§py0756SPK: MGAS942乂Spy0740SPF: SpyM51123(fhi)SPA: M6_Spy0702SPB: M28_SpyO665SPN: SP_0384SPR: spr0341(fhi)SPD: SPD_0349(fhi)SAG: SAG1323

149050.doc -422-

1434921

SAN: gbsl393SAK: SAK_1354(fhi)SMU: SMU.939STC: strO562(idi)STL: stu0562(idi)STE: STER_0601SSA: SSA_0336SGO: SG01.0242LPL: lp_1732(idil)LJO: LJ1208LAC: LBA1171LSA: LSA0905(idi)LSL: LSL_0682LDB: Ldb0996(fhi)LBU: LBUL_0903LBR: LVIS_0861LCA: LSEI_1493LGA: LGAS_1036LRE: Lreu_0912EFA: EF0901OOE: OEOE_1103STH: STH 1674CBE: Cbei_3081DRM: Dred_0474SWO: Swol_1341MTA: Moth_1328MTU: Rvl745c(idi)MTC: MT1787(idi)MBO: Mbl774c(idi)MBB: BCG_1784c(idi)MPA: MAP3079cMAV: MAV_3894(fhi)MSM: MSMEG_1057(fhi)MSMEG_2337(fhi)MUL: MUL_0380(idi2)MVA: Mvan_1582 Mvan_2176MGI: ΜΑν_Γ842 Μί1ν_4Ϊ87MMC: Mmcs_1954MKM: Μ1αηΓ2000MJL: Mjls_1934CGL: NCgl2223(cgl2305)CGB: cg2531(idi)CEF: CE2207CDI: DIP1730(idi)NFA: nial9790 nfe22100RHA: RHAl_ro00239SCO: SCO6750(SC5F2A.33c)SMA: SAV1663(idi)LXX: Lxx23810(idi)CMI: CMM_2889(idiA)AAU:AAur_0321(idi)

PAC:PPA2115FRA: Francci3_4188FRE: Franeanl_5570FAL: FRAAL6504(idi)KRA: Krad_3991SEN: SACE1.2627(idiB_2) SACE_5210(idi)STP: Strop_4438SAQ: Sare_4564 Sare_4928RXY: RxyF.0400 _BBU: BB0684BGA: BG0707SYN: S111556SYC: syc2161_cSYF: Synpcc7942_1933CYA: CYA_2395(fhi)CYB: CYB_2691(fhi)TEL: til 1403ANA: all4591AVA: Ava_2461 Ava_B0346TER:Ter£1589 _SRU: SRU_1900(idi)CHU: CHLL0674(idi)GFO: GFO_2363(idi)FJO: Fjoh 0269FPS: FP1792(idi)CTE: CT0257CCH: Cag_1445CPH: Cpha266_0385PVI: Cvib_1545PLT: Plut_1764RRS: RoseRS_2437RCA: Rcas_2215HAU: Hau〔4687DRA: DR_1087DGE: Dgeo_1381TTH: TT_P0067TTJ: TTHB110MJA: MJ0862MMP: MMP0043MMQ:MmarC5_1637MMX: MmarC6_0906MMZ: MmarC7_1040MAE: Maeo_1184MVN: Mevan_1058MAC: MA0604(idi)MBA: Mbar_A1419MMA:MM_1764MBU: Mbur_2397MTP: Mthe.0474MHU: Mhun_2888MLA: MlabJ665

149050.doc -423 -

1434921

MEM: Memar l 814MBN: Mboo_2211MTH: MTH48MST: Msp_0856(fhi)MSI: Msm_1441MKA: MK0776(lldD)AFU: AF2287HAL: VNG1818G(idi) VNG6081G(crt_l) VNG6445G(crt_2) VNG7060 VNG7149 HMA: rmAC3484(idi)HWA: HQ2772A(idiA) HQ2847A(idiB) NPH: NP0360A(idiB_l) NP4826A(idiA) NP5124A(idiB_2)TAC: Ta0102TVO: TVN0179PTO: PTO0496PHO: PH 1202PAB: ΡΑΒΙ662PFU: PF0856

TKO: TK1470RCI: LRC397(fhi) APE: APE_1765.1 SMR: Smar_0822 IHO: Igni_0804 HBU: Hbut_0539 SSO: SS00063 STO: ST2059 SAI: Saci_0091 MSE: Msed_2136 PAI: PAE0801 PIS: Pisl_1093 PCL: Pcal_0017 PAS: Pars_0051 TPE: Tpen_0272

例示性異戊二烯合成酶核酸與多肽

Genbank寄存編號

AY341431AY316691AY279379AJ457070AY182241

149050.doc -424-

1434921

【圖式簡單說明】

圖ί為針對大腸桿菌中之表現進行密碼子最佳化之野葛

異戊二烯合成酶基因的核普酸序列(SEQ ID NO:1)。atg起

始密碼子為斜體，终止密碼子為粗體，且添加之尸sfl位點

加下劃線。

圖2為pTrcKudzu之圖譜。

圖 3A-C為 pTrcKudzu之核音酸序列(SEQ ID N0:2) ° RBS 加下劃線，野葛異戊二烯合成酶起始密碼子為粗體大寫字

母，且終止密碼子為粗體大寫字母。載體骨架為

pTrcHis2B。

圖4為pETNHisKudzu之圖 譜。

圖 5 A-C為 pETNHisKudzu之核昔酸序列(SEQ ID NO:3)。

圖6為pCL-lac-Kudzu之圖譜。

圖 7A-C為 pCL-lac-Kudzu之核普酸序列(SEQ ID NO:4)。

圖8A為展示不含載體之大腸桿菌BL21細胞中異戊二烯

產量之圖。

圖8B為展示含有pCL-lac-Kudzu之大腸桿菌BL2 1細胞中

異戊二烯產量之圖。

圖8C為展示含有pTrcKudzu之大腸桿菌BL21細胞中異戊

二烯產量之圖。

圖8D為展示含有pETN-HisKudzu之大腸桿菌BL2 1細胞中

異戊二烯產量之圖。

圖9A為展示在14公升批式補料醱酵中大腸桿菌

BL21/pTrcKudzu之0D隨醱酵時間而 變之圖。

149050.doc -425 -

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圖9B為展示在14公升批式補料醱酵中大腸桿菌

BL21/pTrcKudzu之異戊二烯產量隨醱酵時間而變之圖°

圖10A為展示檸檬泛菌中之異戊二烯產量之圖。不含重

組野葛異戊二烯合成酶之對照細胞。灰色菱形表示異戊二

烯合成，黑色正方形表示ODgoo 0

圖10B為展示表現pCL-lac Kudzu之檸檬泛菌中之異戊二

烯產量之圖。灰色菱形表示異戊二烯合成，黑色正方形表

示 ODgoo。

圖10C為展示表現pTrcKudzu之檸檬泛菌中之異戊二烯產

量之圖。灰色菱形表示異戊二烯合成，黑色正方形表示

ODgoo °圖11為展示表現重組異戊二烯合成酶之枯草桿菌中之異

戊二烯產量之圖。BG3594comK為不含質體之枯草桿菌菌

株(天然異戊二烯製造)。CF443為含有pBSKudzu之枯草桿

菌菌株BG3594comK(重組異戊二烯製造)。y軸上之IS表示

異戊二烯。

圖 12A-C為 pBS Kudzu #2之核昔酸序列(SEQ ID NO:5) °圖13為針對耶氏酵母屬中之表現進行密碼子最佳化之野

葛異戊二烯合成酶的核昔酸序列(SEQ ID NO:6)。

圖14為包含針對耶氏酵母屬中之表現進行密碼子最佳化

之野葛異戊二烯合成酶基因之pTrex3g的圖譜°

圖15A-C為載體pSPZl(MAP29Spb)之核昔酸序列(SEQ ID NO:7)。

圖16為針對耶氏酵母屬中之表現進行密碼子最佳化之合

149050.doc -426-

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成野葛(山葛)異戊二烯基因的核普酸序列(SEQ ID N0:8)。

圖17為合成雜交楊屬(銀白楊與歐洲山楊雜交種)異戊二

烯合成酶基因之核昔酸序列(SEQ ID N0:9)。ATG起始密碼

子為粗體，且終止密碼子加下劃線。

圖18 A(圖18A1及圖18A2)展示概述載體pYLA 1、pYLI 及 pYL2(SEQ ID NO:75、73、72、71、70、69)之構造的示

意圖。

圖 18B 展示概述載體 pYLA(POPl)(SEQ ID NO:68、69)之

構造的示意圖。

圖18C展示概述載體pYLA(KZl)之構造的示意圖。

圖18D展 示概述載體pYLI(KZl)(SEQ ID NO:66、67)之構

造的示意圖。

圖18E展示概述載體pYLI(MAP29)之構造的示意圖。

圖18F展示概述載體pYLA(MAP29)之構造的示意圖。

圖19A展示異戊二烯之MVA及DXP代謝途徑(基於F. Bouvier等人，Progress in Lipid Res. 44: 357-429, 2005)。

以下描述包括途徑中各多肽之替代性名稱及揭示用於量測

指定多肽之活性之檢驗的參考文獻(此等參考文獻中之每

一者各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於針對MVA及

DXP途徑中之多肽的多肽活性之檢驗)。甲舞戊酸途徑：

AACT ；乙 醯基-CoA乙 醯轉移酶，MvaE，EC 2.3.1.9 θ檢

驗：J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002 ； HMGS ；理 甲基.

戊 二醯基-CoA 合 成 酶，MvaS，EC 2.3.3.10。檢 驗：J. Bacteriol., 184: 4065-4070, 2002 ； HMGR ； 3-楚基-3-甲基

149050.doc - 427 -

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戊 二醯基-CoA 還 原 酶，MvaE，EC 1.1.1.34 ° 檢驗：J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002 ； MVK ；甲無戊 酸激酶，

ERG12，EC 2.7.1.36。檢驗：Curr Genet 19: 9-14, 1991。

PMK ；磷酸甲控戊酸激酶，ERG8，EC 2.7.4.2。檢驗：

Mol Cell Biol., 11: 620-631, 1991 ； DPMDC ；二磷酸 甲舞.

戊酸去發酶，MVD1，EC 4.1.1.33。檢驗：Biochemistry, 33: 13355-13362, 1994 : IDI ；異戊烯基-二磷酸 8-異構

酶，IDI1，EC 5.3.3.2。檢驗：J. Biol. Chem. 264: 19169- 19175, 1989。DXP途徑：DXS ； 1 -去氧木酮糖-5-磷酸合成

酶，dxs，EC 2.2.1.7。檢驗：PNAS, 94: 12857-62, 1997 ；

DXR ； 1-去氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構酶，dxr，EC 2.2.1.7。檢驗：Eur. J. Biochem. 269: 4446-4457, 2002 ；

MCT ； 4-二磷酸胞昔-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶，

IspD，EC 2.7.7.60。檢驗：PNAS, 97: 6451-6456, 2000 ； CMK ； 4-二磷酸胞昔-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶，IspE > EC 2.7.1.148。檢驗：PNAS, 97: 1062-1067, 2000 ； MCS ；

2C-甲基-D-赤 藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶，IspF ，EC

4.6.1.12。檢驗：PNAS, 96: 11758-11763, 1999 ； HDS ； 1- M 基-2-甲基-2-(E)- 丁烯基4-二磷酸合成酶，ispG ，EC 1.17.4.3。檢驗：J. Org. Chem., 70: 9168-9174, 2005 ； HDR ； 1-無基-2-甲基-2-(E)- 丁烯基4-二磷酸還原酶，

IspH，EC 1.17.1.2。檢驗：JACS, 126:12847-12855, 2004。

圖19B說明經典MVA途徑及經修改之MVA途徑。1,乙醯

149050.doc -428 -

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基-CoA乙醯轉移酶(AACT) ； 2, HMG-CoA合成酶

(HMGS) ； 3, HMG-CoA還原酶(HMGR) ； 4,甲将戊酸激酶

(MVK) ； 5,磷酸甲無戊酸激酶(PMK) ； 6,二磷酸甲無戊

酸去梭酶(MVD或DPMDC) ； 7 *異戊烯基二磷酸異構酶

(IDI) ； 8,磷酸甲羟戊酸去殺酶(PMDC) ； 9，異戊烯基磷

酸激酶(IPK)。經典MVA途徑自反應1經由反應5及6行進至

反應7，而經修改之MVA途徑行進至反應8及9。結構式中

之P及PP分別為磷酸及焦磷酸。此圖獲自Koga及Morii, Microbiology and Mol. Biology Reviews, 71:97-120, 2007， 其以全文引用的方式併入，尤其關於經修改之MVA途徑之

核酸與多肽。經修改之MVA途徑存在於例如一些古生生物

體，諸如馬氏甲烷球菌中。

圖20(圖20 A及圖20B)展示描繪不含(左圖)或含有(右圖)

野葛異戊二烯合成酶基因之重組解脂耶氏酵母菌株之異戊

二烯產量之GC-MS分析結果的圖。箭頭表示可靠異戊二烯

標準物之溶離時間。

圖 2 1 為 pTrcKudzu yIDI DXS Kan之圖譜。

圖 22A-D為 pTrcKudzu yIDI DXS Kan之核昔酸.序列(SEQ ID NO:10)。

圖23A為展示在BL2 1 /pTrcKudzukan中自葡萄糖製造異戊

二烯之情況之圖。0時為用IPTG(400 μmol)誘 導之時間。x 軸為誘導後時間；y軸為OD6oo，且y2軸為異戊二烯總生產力

(卩g/L頂部空間氣體)或比生產力(gg/L頂部空間氣體/OD)。菱

形表示OD6oo，圓圈表示異戊二烯總生產力(μg/L)，且正方

149050.doc -429-

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形表示異戊二烯比生產力（μg/L/OD）。

圖23B為展示在BL21/pTrcKudzu yIDI kan中自葡萄糖製

造異戊二烯之情況之圖。0時為用IPTG（400 μmol）誘導之

時間。飞軸為誘導後時間；y軸為OD6oo，且y2軸為異戊二

烯總生產力（卩g/L頂部空間氣體）或比生產力（卩g/L頂部空間

氣體/0D）。菱形表示OD6oo，圓圈表示異戊二烯總生產力

（卩g/L），且正方形表示異戊二烯比生產力（μg/L/OD）。

圖23C為展示在BL2 Ι/pTrcKudzu DXS kan中自葡萄糖製

造異戊二烯之情況之圖。0時為用IPTG（400 μmol）誘 導之

時間。乂軸為誘導後時間；y軸為OD6oo，且y2軸為異戊二

烯總生產力（卩g/L頂部空間氣體）或比生產力（卩g/L頂部空間

氣體/0D）。菱形表示OD6oo，圓圈表示異戊二烯總生產力

（μg/L），且正方形表示異戊二烯比生產力（|ig/L/OD）。

圖23D為展示在BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan中自葡萄

糖製造異戊二烯之情況之圖。0時為用IPTG（400 μmol）誘

導之時間。χ軸為誘導後時間；y軸為OD6oo，且y2軸為異

戊二烯總生產力（卩g/L頂部空間氣體）或比生產力（卩g/L頂部

空間氣體/OD）。菱形表示OD600，圓圈表示異戊二烯總生

產力（卩g/L），且正方形表示異戊二烯比生產力（卩g/L/OD）。

圖23E為展示在BL21/pCL PtrcKudzu中自葡萄糖製造異

戊二烯之情況之圖。0時為用IPTG（400卩mol）誘導之時

間。χ軸為誘導後時間；y軸為Ο Dgoo 5且y2軸為異戊二烯

總生產力（卩g/L頂部空間氣體）或比生產力（卩g/L頂部空間氣

體/OD）。菱形表示OD6oo，圓圈表示異戊二烯總生產力

149O5O.doc -430-

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(卩g/L)，且正方形表示異戊二烯比生產力(μg/L/OD)。

圖23F為展示在BL21/pCL PtrcKudzu yIDI中自葡萄糖製

造異戊二烯之情況之圖。。時為用IPTG(400 μmol)誘 導之

時間。X軸為誘導後時間；y軸為ΟD6oo '且y2軸為異戊二

烯總生產力(卩g/L頂部空間氣體)或比生產力(卩g/L頂部空間

氣體/OD)。菱形表示OD6oo，圓圈表示異戊二烯總生產力

(μg/L)，且正方形表示異戊二烯比生產力(μg/L/OD)。

圖23G為展示在BL21/pCL PtrcKudzu DXS中自葡萄糖製

造異戊二烯之情況之圖。0時為用IPTG(400 μmol)誘導之

時間。X軸為誘導後時間；y軸為OD6oo，且y2軸為異戊二

烯總生產力(卩g/L頂部空間氣體)或比生產力(卩g/L頂部空間

氣體/OD)。菱形表示OD6oo，圓圈表示異戊二烯總生產力

(|ig/L)，且正方形表示異戊二烯比生產力(μg/L/OD)。

圖23H為 展示在BL21 /pTrcKudzuIDIDXSkan中自葡萄糖

製造異戊二烯之情況之圖。箭頭表示用IPTG(400 μιηοΐ)誘

導之時間。X軸為誘導後時間；y軸為OD6oo，且y2軸為異

戊二烯總生產力(曲/L頂部空間氣體)或比生產力(卩g/L頂部

空間氣體/OD)。黑色菱形表示OD6oo，黑色三角形表示異

戊二烯生產力(卩g/L)，且白色正方形表示異戊二烯比生產

力 Wg/L/OD)。

圖 24 為 pTrcKKDylklS kan之圖譜。

圖 25A-D 為 pTrcKKDylklS kan 之核昔酸序列(SEQ ID NO:11)。

圖 26 為 pCL PtrcUpperPathway 之圖譜。

149050.doc -431 -

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圖 27A-27D 為 pCL PtrcUpperPathway 之核昔酸序列(SEQID NO:12)。

圖28展示含有下游MVA途徑及酵母idi以供整合至枯草桿

菌染色體中nprE基因座處之卡匣的圖譜。nprE上游/下游表

示距nprE基因座各1 kb之序列以供整合。aprE啟動子(鹼性

絲胺酸蛋白酶啟動子)表示叩尸丘基因之啟動子(-3 5、-10' + 1轉錄起始位點，RBS)。MVK1表示酵母甲楚戊酸激酶基

因。RBS-PMK表示起始位點上游具有桿菌屬RBS之酵母磷

酸甲舞戊酸激酶基因。RBS-MPD表示起始位點上游具有桿

菌屬RBS之酵母二磷酸甲理戊酸去發酶基因。RBS-IDI表

示起始位點上游具有桿菌屬RBS之酵母idi基因。终止子表

示來自解澱粉桿菌之鹼性絲胺酸蛋白酶轉錄终止子。

SpecR表示壯觀黴素抗性標記物。「供擴增用之nprE上游重

複序列」表示用於擴增之上游區域之正向重複序列°

圖29A-D為含有下游MVA途徑及酵母idi以供整合至枯草

桿菌染色體中nprE基因座處之卡匣的核昔酸序列(SEQ ID NO:13)。

圖30為p9796-poplar之圖譜。

圖 3 1 A-Β為 p9796-poplar之核音酸序列(SEQ ID NO: 1 4)。

圖32為pTrcPoplar之圖譜。

圖 33A-C為 pTrcPoplar之核音酸序列(SEQ ID NO:15)。

圖 34為 pTrcKudzu yIDI Kan之圖譜。

圖 3 5 Α-C 為 pTrcKudzu yIDI Kan 之核音酸序列(SEQ ID NO:16)。

149050.doc -432-

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圖 36為 pTrcKudzuDXS Kan之 圖 譜。

圖 37A-C 為 pTrcKudzuDXS Kan 之核昔酸序歹 *J (SEQ ID N0:17)。

圖38為pCL PtrcKudzu之圖譜。

圖39A-C為pCL PtrcKudzu之核昔酸序列(SEQ ID N0:18)。

圖 40 為 pCL PtrcKudzu A3 之圖譜。

圖 41A-C 為 pCL PtrcKudzu A3 之核 音酸序 列(SEQ ID NO:19)。

圖 42 為 pCL PtrcKudzu yIDI之圖譜。

圖 43A-C 為 pCL PtrcKudzu yIDI之核普酸序列(SEQ ID NO:20)。

圖 44為 pCL PtrcKudzu DXS之圖 譜。

圖 45A-D 為 pCL PtrcKudzu DXS之核昔酸序列(SEQ ID NO:21)。

圖46A-E展示描繪自生質原料而得之異戊二烯產量之

圖。A圖展示自玉米乾草而得之異戊二烯產量，B圖展示

自甜菜渣而得之異戊二烯產量，C圖展示自軟木漿而得之

異戊二烯產量，D圖展示自葡萄糖而得之異戊二烯產量， 且E圖展示自不含其他原料之細胞而得之異戊二烯產量 。

灰色正方形表示在接種後指定時間培養物之OD600量測

值，且黑色三角形表示在接種後指定時間之異戊二烯產

量 °

圖47 A展示描繪在未添加葡萄糖之培養物中由BL21

149050.doc -433 ・

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(XDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)而得之異戊二烯產量之

圖。正方形表示OD6oo，且三角形表示所製造之異戊二烯

(卩g/ml)。

圖 47B展示描繪由 BL21 (ADE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)自1%葡萄糖原料轉化糖而得之異戊二烯產量之圖。

正方形表示OD6oo，且三角形表示所製造之異戊二烯

(μg/ml)。

圖 47C展示描繪亩 BL21 (XDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)自1%轉化糖原料而得之異戊二烯產量之圖。正方形

表示OD6oo，且三角形表示所製造之異戊二烯(Kg/ml)。

圖 47D展示描繪由 BL21 (XDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)自1% AFEX玉米乾草原料而得之異戊二烯產量之圖。

正方形表示OD6oo，且三角形表示所製造之異戊二烯

(μg/ml)。

圖48A-C展示顯示酵母提取物對異戊二烯產量之影響的

圖。A圖展示在以不同量之酵母提取物進行補料之醱酵槽

內光學密度之時程。B圖展示在以不同量之酵母提取物進

行補料之醱酵槽內異戊二烯力價之時程。每公升醱酵培養

液所製造之異戊二烯之量即定為力價。C圖展示酵母提取

物對生長於批式補料培養物中之大腸桿菌之異戊二烯產量

的影響。

圖49A-C展示顯示在500 L生物反應器中含有

pTrcKudzu+ylDI+DXS質體之大腸桿菌細胞之異戊二烯產

量之圖。A圖展示在以葡萄糖及酵母提取物進行補料之

149050.doc -434-

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5 00-L生物反應器內光學密度之時程。B圖展示在以葡萄糖

及酵母提取物進行補料之500-L生物反應器內異戊二烯力

價之時程。每公升醱酵培養液所製造之異戊二烯之量即定

為力價。C圖展示以葡萄糖及酵母提取物進行補料之500-L生物反應器中所製造之總異戊二烯之時程。

圖 50為 pJMupperpathway2之圖譜。

圖 5 1A-C 為 pJMupperpathway2 之核昔酸序列（SEQ ID NO:22）。

圖52為pBS Kudzu #2之 圖 譜。

圖5 3A為展示在14公升批式補料醱酵中表現重組野葛異

戊二烯合成酶之桿菌屬在醱酵時間期間之生長的圖。黑色

菱形表示不含重組異戊二烯合成酶之對照菌株

（BG3594comK）（天然異戊二烯製造），且灰色三角形表示

CF443，含有pBSKudzu之桿 菌屬菌 株BG3594comK （重 組異

戊二烯製造）。

圖53B為展示在14公升批式補料醱酵中表現重組野葛異

戊二烯合成酶之桿菌屬在醱酵時間期間之異戊二烯產量的

圖。黑色菱形表示不含重組異戊二烯合成酶之對照菌株

（BG3594comK）（天然異戊二烯製造），且灰 色三角形表示

CF443，含有pBSKudzu之桿菌屬菌株BG3594comK（重組異

戊二烯製造）。

圖54為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內光學密度

之時程。

圖55為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內異戊二烯

149050.doc -435 -

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力價之時程。每公升醱酵培養液所製造之異戊二烯之量即

定為力價。

圖56為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內所製造之

總異戊二烯之時程。

圖57為以甘油進行補料之15-L生物反應器內光學密度之

時程。

圖58為以甘油進行補料之15-L生物反應器內異戊二烯力

價之時程。每公升醱酵培養液所製造之異戊二烯之量即定

為力價。

圖59為以甘油進行補料之1 5-L生物反應器內所製造之總

異戊二烯之時程。

圖60A-60 C為以葡萄糖進行補料之150-L生物反應器內光

學密度、甲羟戊酸力價及比生產力之時程。

圖61A-61C為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內光

學密度、甲卷戊酸力價及比生產力之時程。

圖62A-62 C為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內光

學密度、甲理戊酸力價及比生產力之時程°

圖63A-63 C為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內光

學密度、異戊二烯力價及比生產力之時程°

圖64A-64 C為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內光

學密度、異戊二烯力價及比生產力之時程。

圖65A-65 C為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內光

學密度、異戊二烯力價及比生產力之時程。

圖66A-66 C為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內光

149050.doc -436-

1434921

學密度、異戊二烯力價及比生產力之時程。

圖67A-67 C為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內光

學密度、異戊二烯力價及比生產力之時程。

圖68為系列A之計算絕熱火焰溫度隨多種氧含量之燃料

濃度而變之圖。圖例以圖中曲線出現之次序列出該等曲

緣。舉例而言，圖例中之第一條目（40°C下於空氣中之異

戊二烯）對應於圖中最高曲線。

圖69為系列B之計算絕熱火焰溫度隨多種氧含量與4%水

之燃料濃度而變之圖。圖例以圖中曲線出現之次序列出該

等曲線。

圖70為系列C之計算絕熱火焰溫度隨多種氧含量與5% CO?之燃料濃度而變之圖。圖例以圖中曲線出現之次序列

出該等曲線。

圖71為系列D之計算絕熱火焰溫度隨多種氧含量與10% CO?之燃料濃度而變之圖。圖例以圖中曲線出現之次序列

出該等曲線。

.圖72為系列E之計算絕熱火焰溫度隨多種氧含量與15% CO2之燃料濃度而變之圖。圖例以圖中曲線出現之次序列

出該等曲線。

圖73為系列F之計算絕熱火焰溫度隨多種氧含量與20% CO2之燃料濃度而變之圖。圖例以圖中曲線出現之次序列

出該等曲線。

圖74為系列G之計算絕熱火焰溫度隨多種氧含量與30% CO2之燃料濃度而變之圖。圖例以圖中曲線出現之次序列

149050.doc -437-

1434921

出該等曲線。

圖75A為系列A之重量百分比至體積百分比之CAFT模型

結果轉換之表格。

圖75B為以體積百分比繪製的圖68中系列A之CAFT模型

之可燃性結果之圖。

圖76 A為系列B之重量百分比至體積百分比之CAFT模型

結果轉換之表格。

圖76B為以體積百分比繪製的圖69中系列B之CAFT模型

之可燃性結果之圖。

圖77為描繪可燃性測試容器之圖。

圖78A為測試系列1（0%蒸汽、0 psig及40°C）之可燃性曲

線之圖。

圖78B為概述測試系列1之爆炸及非爆炸數據點之表格。

圖78C為測試系列1與CAFT模型相比較之可燃性曲線之

圖。

圖79A為測試系列2（4%蒸汽、0 psig及40°C）之可燃性曲

線之圖。

圖79B為概述測試系列2之爆炸及非爆炸數據點之表格。

圖79C為測試系列2與CAFT模型相比較之可燃性曲線之

圖。

圖80A-B為測試系列1之詳細實驗條件及結果之表格。

圖8 1為測試系列2之詳細實驗條件及結果之表格。

圖82為所繪製之在3個大氣壓之壓力下計算絕熱火焰溫

度隨多種氮氣/氧氣比率之燃料濃度而變之圖。

149050.doc -438-

1434921

圖83為所繪製之在1個大氣壓之壓力下計算絕熱火焰溫

度隨多種氮氣/氧氣比率之燃料濃度而變之圖。

圖84為使用來自圖82之數據且遵循實例13中所述之方法

構建之可燃包絡範圍之圖。實驗數據點（圓圈）係來自本文

所述在1個大氣壓之初始系統壓力下進行之測試。

圖85為使用來自圖83之數據且遵循實例13中所述之方法

構建之可燃包絡範圍之圖。實驗數據點（圓圈）係來自本文

所述在1個大氣壓之初始系統壓力下進行之測試。

圖86A為醱酵釋出氣體之GC/MS層析圖。

圖86B為圖86A之放大圖，其展示醱酵釋出氣體中存在

之微量揮發物。

圖87A為在-78°C下低溫捕獲之後釋出氣體中存在之痕量

揮發物之GC/MS層析圖。

圖87B為在-196°C下低溫捕獲之後釋出氣體中存在之痕

量揮發物之GC/MS層析圖。

圖87C為圖87B之放.大圖。

圖87D為圖87C之放大圖。

圖88A-B為比較來自石油來源性異戊二烯（圖88A）與來自

以生物方法製造之異戊二烯（圖8 8B）之C5煙的GC/M S層析

圖。標準物含有三種在異戊二烯主峰附近溶離之C5煙雜質

（圖88A）。相比之下，以生物方法製造之異戊二烯含有一

定量之乙醇及丙酮（過柱時間為3.41分鐘）（圖88A） °圖89為分析表現野葛異戊二烯合成酶且補給葡萄糖與3

g/L酵母提取物之大腸桿菌BL21 （DE3） pTrdS菌株之醱酵

149050.doc -439 -

1434921

釋出氣體之圖。

圖90展示結構上類似於異戊二烯且亦可能充當聚合催化

劑毒物之若干雜質之結構。

圖 91 為 pTrcHis2AUpperPathway（亦稱為 pTrcUpperMVA）之圖譜。

圖 9 2 A- 9 2 C 為 pTrcHis2 AUpperPathway （亦稱為

pTrcUpperMVA）之核普酸序列（SEQ ID NO:23） 0圖93為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內光學密度

之時程。

圖94為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內異戊二烯

力價之時程。每公升醱酵培養液所製造之異戊二烯之量即

定為力價。

圖95為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內所製造之

總異戊二烯之時程。

圖96為以轉化糖進行補料之15-L生物反應器內光學密度

之時程。

圖97為以轉化糖進行補料之15-L生物反應器內異戊二烯

力價之時程。每公升醱酵培養液所製造之異戊二烯之量即

定為力價。

圖98為以轉化糖進行補料之15-L生物反應器內所製造之

總異戊二烯之時程。

圖99為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內光學密度

之時程。

圖100為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內異戊二

149050.doc -440-

1434921

烯力價之時程。毎公升醱酵培養液所製造之異戊二烯之量

即定為力價。

圖101為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內異戊二

烯比活性之時程。

圖 102為 pCLPtrcUpperPathwayHGS2之圖譜。

圖 103A-103 C 為 pCLPtrcUpperPathwayHGS2 之核 昔酸序

列(SEQ ID NO:24)。

圖104為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內光學密

度之時程。

圖105為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內異戊二

烯力價之時程。每公升醱酵培養液所製造之異戊二烯之量

即定為力價。

圖106為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內所製造

之總異戊二烯之時程。

圖 107 為質體 MCM330(attTn7 處之 FRT-cm-FRT-gi 1.2- KKDy)之圖譜。

圖108A-108C為質體MCM330之核 昔酸序 列(SEQ ID NO:25)。

圖 109為 pET24D-Kudzu之圖譜。

圖110A-B為pET24D-Kudzu之核昔酸序列(SEQ ID NO:26)。

圖111 A為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內光學密

度之時程。

圖111B為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內異戊二

149050.doc -441 -

1434921

烯力價之時程。每公升醱酵培養液所製造之異戊二烯之量

即定為力價。

圖111C為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器中異戊二

烯比生產力之時程。

圖112 A為馬氏甲烷球菌古生下游途徑操縱子之圖譜°

圖112B-C為馬氏甲烷球菌古生下游途徑操縱子之核昔酸

序列（SEQ ID NO:27）。

圖113A為MCM3 82-pTrcKudzuMVK（馬氏甲烷球菌）之圖

譜。

圖113B-C為MCM3 82-pTrcKudzuMVK（馬氏甲烷球菌）之

核昔酸序列（SEQ ID NO:28）。

圖114A為MCM376-來自pET200D中馬氏甲烷球菌古生下

游途徑之MVK之圖譜。

圖114B-C為MCM3 76-來自pET200D中馬氏甲烷球菌古生

下游途徑之MVK之核昔酸序列（SEQ ID NO:29）。

圖115 A-11 5 D展示過度表現MVK及異戊二烯合成酶會增

加異戊二烯產量。在100 mL生物反應器中、以100及200 μΜ IPTG誘導製造異戊二烯下、於葡萄糖上生長期間’在

22小時時程中量測自MCM401及MCM343積累之異戊二烯

及CO2。圖115A為自MCM343積累之異戊二烯（%）之圖°圖

115B為自MCM401積累之異戊二烯（%）之圖°圖U5C為自

MCM343積累之C。2（%）之圖。圖115D為自MCM401積累之

CO2（%）之圖。

圖116為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內光學密

149050.doc -442-

1434921

度之時程。

圖117為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應 器 內 異 戊 二

烯力價之時程。每公升醱酵培養液所製造之異 戊 二 烯 之 量

即定為力價。

圖118為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應 器 內 所 製 造

之總異戊二烯之時程。

圖119為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應 器 內 總 二 氧

化碳析出速率(TCER)或代謝活性概況之圖。

圖120為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應 器 內 在 異 戊

二烯製造期間細胞生存力之圖。TVC/OD為1 mL培養液

中、1個光學密度單位(OD550)下的總活菌數(群落形成單

位)。

圖121為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內光學密

度之時程。

圖122為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內異戊二

烯力價之時程。每公升醱酵培養液所製造之異戊二烯之量

即定為力價。

圖123為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內所製造

之總異戊二烯之時程。

圖124為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內體積生

產力之時程。每小時每公升培養液所製造之異戊二烯之量

即定為體積生產力。

圖125為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內瞬時產

率之時程。在數據點之間的時間間隔期間向生物反應器補

149050.doc -443 -

1434921

給之每單位量的葡萄糖（公克）所製造之異戊二烯之量（公

克）（w/w）即定為瞬時產率。

圖126為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內總二氧

化碳析出速率（TCER）或代謝活性概況之圖°

圖127為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內在異戊

二烯製造期間的細胞生存力° TVC/ODA 1 mL培養液中、1 個光學密度單位（OD55o）下的總活菌數（群落形成單位）°

圖128為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內光學密

度之時程。

圖129為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內異戊二

烯力價之時程。每公升醱酵培養液所製造之異戊二烯之量

即定為力價。

圖130為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內所製造

之總異戊二烯之時程。

圖1 3 1為以葡萄糖進行補料之1 5-L生物反應器內總二氧

化碳析出速率（TCER）或代謝活性概況之圖。 、

圖132為展示以下情況之圖：進入生物反應器之氣流瞬

間減少使得釋出氣體中異戊二烯之濃度突增’此不會導致

代謝活性（TCER）顯著下降。TCER或代謝活性為總二氧化

碳析出速率。

圖133為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內在異戊

二烯製造期間細胞生存力之圖。TVC/OD為1 mL培養液

中、1個光學密度單位（OD55o）下的總活菌數（群落形成單

位）。

149050.doc -444 -

1434921

圖134為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內光學密

度之時程。垂直點線表示將異戊二烯以1 g/L/h之速率引入

生物反應器中之時間間隔。

圖135為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內之總二

氧化碳析出速率(TCER)或代謝活性概況。垂直點線表示將

異戊二烯以1 g/L/h之速率引入生物反應器中之時間間隔。

圖136為以葡萄糖進行補料之15-L生物反應器內在異戊

二烯製造期間的細胞生存力。TVC/0D為1 mL培養液中、1 個光學密度單位(OD550)下的總活菌數(群落形成單位)。垂

直點線表示將異戊二烯以1 g/L/h之速率引入生物反應器中

之時間間隔。

圖137A-B為銀白楊pET24a之序列：異戊二烯合成酶基

因以粗體字母突出顯示(SEQ ID NO:30)。

圖137C-D為黑楊pET24a之序列：異戊二烯合成酶基因

以粗體字母突出顯示(SEQ ID NO:31)。

圖137E-F為美洲山楊pET24a之序列(SEQ ID NO:3 2)。

圖137G為美洲山楊異戊二烯合成酶基因之胺基酸序列

(SEQ ID NO:33)。

圖1 37H-I為毛果楊pET24a之序列：異戊二烯合成酶基因

以粗體字母突出顯示(SEQ ID NO:34)。

圖137J-K為歐洲山楊與銀白楊雜交種pET24a之序列：異

戊二烯合成酶基因以粗體字母突出顯示(SEQ ID NO:3 5)。

圖137L為在pCR2.1骨架中含有野葛IspS編碼序列之

MCM93的圖譜。

149050.doc -445-

1434921

圖 13 7M-N為 MCM93之序列(SEQ ID NO:3 6)。

圖 1370為 pET24D-Kudzu之圖譜。

圖 13 7P-Q為 pET24D-Kudzu之序列(SEQ ID NO:37) 0圖1 3 8為如全細胞頂部空間檢驗中所量測之多個楊屬物

種之異戊二烯合成酶表現數據。Y軸為以IPTG誘導之0.2 mL培養物所製造之異戊二烯'卩g/L/OD °

圖139為如DMAPP檢驗所量測之楊屬異戊二烯合成酶之

相對活性。楊屬酶之活性顯著高於野葛異戊二烯合成酶°

楊屬［銀白楊與歐洲山楊雜交種］僅具有痕量(<1%)活性且

未展示於圖中。

圖 140為 pDONR221:19430-hybrid_HGS之圖譜。

圖 141 為 pDONR221:1943 0-hybrid_HGS 之核 昔酸序列'

針對酵母進行密碼子最佳化之野葛異戊二烯合成酶之序列

(SEQ ID NO:38)。

圖142A為pDW14之圖譜。

圖142B-C為pDW14之完整核昔酸序列(SEQ ID NO:39) °圖143展示具有pDW14或pYES-DEST52之經誘導INVSc-1

菌株。圖143A :以半乳糖誘導且以SimplyBlue SafeStain (Invitrogen)染色之INVSc-1菌株所產生之溶菌液的4-12% bis tris凝膠(Novex, Invitrogen) ° 圖 143B :使用 WesternBreeze 套組(Invitrogen)對上述菌株進行之西方墨點分析°泳道如

下：1，INVSc-l+pYES-DEST52 ； 2 > INVSc-1+pDW 14(分

離株 1) ； 3，INVSc-l+pDW14(分離株 2)。指示 MW(kDa)(使

用SeeBlue Plus2分子量標準)。

149050.doc -446-

1434921

圖144（圖144A及 圖144B）展 示具有pDW14或pYES- DEST52之經誘導INVSc-1菌株。圖144 A :在溶解之前半乳

糖誘導之菌株的OD6oo。y軸為OD6oo。圖144B :在對照菌

株及具有異戊二烯合成酶之菌株中異戊二烯合成酶頂部空

間DMAPP檢驗。以jug HG/L/OD計算比活性。樣品如下：

對照，INVSc-l+pYES-DEST52 ； HGS-1，INVSc-l + pDW14（分離株 1） ； HGS-2，INVSc-1+pDWl 4（分離株 2）。

圖145A為經密碼子最佳化之異戊二烯合成酶fluo-opt2v2 之圖譜。

圖145B為經密碼子最佳化之異戊二烯合成酶fluo-opt2 v2 之核昔酸序列（SEQ ID NO:40）。

圖146A為pBBRlMCS5之 圖 譜。

圖146B-C為pBBRlMCS5之核音酸序列（SEQ ID N0:41）。

圖 147A 為 pBBR5HGSOpt2_2 之圖譜。

圖 147B-C 為 pBBR5HGSOpt2_2 之核 昔酸序 列（SEQ ID NO:42）。

圖148為未 經誘導、經IPTG（4x50卩mol）誘 導 或 經IPTG （2x100卩mol）誘導之菌株MCM40 1的CER相對於醱酵時間

之圖。

圖149展示在pH值經調整或未經調整之蔗糖溶液中，隨

高壓滅菌循環（一次循環=30 min）次數而變之葡萄糖濃度。

圖150展示惡臭假單胞菌F1及螢光假單胞菌ATCC13525 於葡萄糖、蔗糖及轉化蔗糖上之生長曲線（隨時間而變之

149050.doc -447-

1434921

θϋόοο) °圖 151展示大腸桿菌 BL21(DE3)、MG1655、ATCC11303

及B REL 606於葡萄糖、蔗糖及轉化蔗糖上之生長曲線(隨

時間而變之OD6oo)。

圖152為質體pET24 P. alba HGS之圖譜°

圖1 53A-B為質體pET24 P. alba HGS之核昔酸序列(SEQ ID NO:43)。

圖154為展示用於核酸內切酶分解以構築質體EWL2 3 0之

限制性位點、及BspHI與Ncol位點之間的相容黏性末端之

示意圖。

圖155為質體EWL230之圖譜。

圖156A-B為質體EWL230之核昔酸序列(SEQ ID NO:44)。

圖157為展示用於核酸內切酶分解以構築質體EWL244之

限制性位點、及Nsil與PstI位點之間的相容黏性末端之示

意圖。

圖158為質體EWL244之圖譜。

圖159A-B為質體EWL244之核昔酸序列(SEQ ID NO:45)。

圖160A為馬氏甲烷球菌古生下游途徑操縱子之圖譜°

圖160B-C為馬氏甲烷球菌古生下游途徑操縱子之核昔酸

序列(SEQ ID NO:46)。

圖161A為MCM3 76-來自pET200D中馬氏甲烷球菌古生下

游途徑之MVK之圖譜。

149050.doc -448 ・

1434921

圖161B-C為MCM376-來自pET200 D中馬氏甲烷球菌古生

下游途徑之MVK之核昔酸序列（SEQ ID NO:47）。

圖162為質體pBBRCMPGI1.5-pgl之圖譜。

圖163A-B為質體pBBRCMPGI1.5-pgl之核昔酸序列（SEQ ID NO:48）。

圖164A-F為在15-L規模下由表現馬氏甲烷球菌甲霽戊酸

激酶 ' 銀白楊異戊二烯合成酶及j?gZ（RHMl 11608-2）且於批

式補料培養物中生長之大腸桿菌菌株製造異戊二烯之圖。

圖164A展示以葡萄糖進行補料之15 L生物反應器內光學密

度之時程。圖1 64B展示以葡萄糖進行補料之15 L生物反應

器內異戊二烯力價之時程。每公升醱酵培養液所製造之異

戊二烯之量即定為力價。計算異戊二烯之方法：59小時內

所製造之累積異戊二烯（g）/59小時之時醱酵槽體積（L）［=］公

克/公升培養液。圖164C亦展示以葡萄糖進行補料之15 L 生物反應器內異戊二烯力價之時程。計算異戊二烯之方

法:J（瞬時異戊二烯製造速率，g/L/h）dt（t=0-59小時）［=］公

克/公升培養液。圖1 64D展示以葡萄糖進行補料之15-L生

物反應器內所製造之總異戊二烯之時程。圖1 64E展示以葡

萄糖進行補料之15-L生物反應器內的體積生產力。圖164F 展不以葡飼糖進行補料之15-L生物反應器內的二氧化碳析

出速率（CER）或代.謝活性概況。

圖1 65 A-Β為展示在15-L生物反應器中醱酵所產生之釋出

氣體之分析情況的圖。樣品A為在64.8小時取樣之菌株

RM111608-2。樣品B為在34.5小時取樣之菌株EWL256（大

149050.doc -449-

1434921

腸桿菌 BL21 (DE3), pCL 上游，cmR-gi 1.2-yKKDyI,pTrcAlba-mMVK)。對於兩種樣品'均偵測到氫氣高於基,

線(0.95x10-8 托)。

圖166A展示例示性Bioisoprene™回收單元°

圖1 66B展示例示性Bioisoprene™脫附/冷凝配置°

圖167展示Bioisoprene™產品之GC/FID層析圖°該物質

經測定為99.7%純。

圖168A-C展示在處理之前(A)及用氧化鋁處理之後(B)或

二氧化矽處理之後(C)Bioisoprene™樣品之GC/FID層析

圖。此等層析圖中未展示異戊二烯峰。

圖169展示自醱酵釋出氣體純化異戊二烯之製程及相關

裝置之圖。

圖170展示部分氫化之BioIsopreneTM單體之GC/FID層析

圖。化合物l(RT=12.30 min)=3-甲基-1- 丁烯'化合物2 (RT=12.70 min) = 2-甲基丁烷，化合物 3(RT=13.23 min)=2- 甲基-1-丁烯，化合物4(RT=13.53 min)=異戊二烯’化合物

5(RT=14.01 min) = 2-甲基-2-丁 烯。

圖171展示源自Amberlyst-1 5酸樹脂催化之2-甲基-2- 丁

烯二聚化之產物的GC/MS總離子層析圖°

圖172展示源自Amberlyst 15酸樹脂催化之Bioisoprene™

單體寡聚之產物的GC/MS總離子層析圖°

圖173展示使用二聚反應器將C5流轉化成C10/C15產物

流之製程流程圖。C5流包含Bioisoprene™單體及/或

Bioisoprene™單體之C5衍生物。

149050.doc -450 -

1434921

【主要元件符號說明】

12 醱酵槽

14 第一管柱/管柱

16 分離單元

18 壓縮系統

20 開口

222426283032343638

開口

第二管柱

開口

開口

開口

吸附系統

回流冷凝器

吸附系統/系統

吸附系統

4042

開口

捕集器件

149050.doc -451 -

1434921

序列表<110>美商戴尼斯科美國公司

<120>包含異戊二烯衍生物之燃料組合物

<140> TO 099119620<141> 2010-06-15

<150> US 61/187,959<151> 2009-06-17<160> 142

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0<210> 1<211> 1701<212> NA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

cctcttctca atttactcag attaccgagc caaacctgtg gaatttcgaa ttcctgcaat tggaggagaa agcgaccaaa ctggaggaag cccagccgct giccctgctg gagctgatcg aatttgaaaa agacatcatt aaagccctgg agaacaaatc tcgaggtttc aactgaaagg agggtgagaa tgaaagaagg atcaccagcg

<400> 1 atgtgtgcga aactatcagc gtggaaaagc cgtgtagaca ctgacctaca gaaaacaaaa cagcacggtt ttcagcggtg ctgggtttcg aagaacaacc gaactgccatgaaccgaaag aaccgcatca gtacagaccc tgcaccagaa ctggctagca aactggattt ggtatggcgc cagacccgca ctggtgacga tcatcgatga ttcaccgatg ctgtagagcg aaactgtgtt tcctggcact gagaaaggtc ataacaacct tttctgcaag aggcgaaatg gaaaacgcca tgccagcagc ciggigcgtt gagctggaacaccagcgagg aacaggcccg atgaatcgtg aacgcgttag gttaacatgg cacgtgtttc gactacgcga ctgaaaaccg ctgatgtatg tctaactgca

gcgtttcctc aggaagacat ctagctgcgt gtggcgagac

tgacctgpac gcaaccgctc tcaggatgtt tttgagcgtt tgacgtccaa ggcctgctga cctgctggag gaggcgcgta cattaatacc aaggttgcag tctgcaccgt ccggaggcac ccagctgctg ctggagcigg agagctgcaa gatctgtccc tgtacgcgac cgcctgatgg gtttggtgaa tgtcgcaaag cgtgtatgac clgggacgtt gtacaacacc gtcctatctg gtccaacaac ctccggtgta ctccgaccac latcttccgc taccaattct cgaagaactg cgactccacc ccactgcacc catcaaactg g

gtttatggca aacgctatta gttaacgaca acgaaaagct aaaattatcc gcgctgctgg gcgctgcgtt ctgigcaacg atcattagct cgtaaactga ctgctgccta taccagtatgctgctgattg accctttccc

ataattcccg tcgttccgca 60 ccctggagaa cgacctgaaa 120 aagttcgctg catgatcaac 180 acgatgigca '"aaaacatcgt tgtctttccg tcaaggataa gcctgtatga ccttttccat aacaagtgag gttggttcct cgaagctgga gctggtggac aagtttattt ctgttactaa ctctggacga acaccctgcc cgtcctattc ggcgtgaact cggctttctc cgccgtctta ccctgaccga atciggccac acatgcacga tcgacgccga aagcgttcat gcgatggtct

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1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1701

2

俄

人

0>l>2>3>

n n tl «1

<2<2<2<2<220><223>合成構築體

.<400> 2 gtttgacagc ggaagctgtg gcactcccgt tgaaatgagc taacaatltc caatttaica aaaat taaag gacctcttct

t tatcatcga gtatggctgt tctggataat tgttgacaai acacaggaaa gacaatctgt aggiatatat caatttactc

ctgcacggtg gcaggtcgta gttitttgcg laatcaiccg cagcgccgct gtgggcactc laatgtatcg agattaccga

caccaatgct aatcactgca ccgacatcat gctcgtaiaa gagaaaaagc gaccggaatt attaaataag gcataattcc

tctggcgtca taattcgtgt aacggltctg tgtfiiggaat gaagcggcac atcgattaac gaggaataaa cgtcgttccg

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149050-序列表.doc -1 -

1434921

gccaaacctg tggaatttcg aattcctgca atccctggag aacgacctga aagtggaaaa 540getggaggag aaagcgacca 丄一：睥二二 二二二：二：二二二cacccagccg ctgtccctgc tggagetgat cgacgatgtg cagcgcctgg gtctgaccta ooU caaatttgaa aaagacatca ……aaagaacaaa tttcgaggtt

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__ α。… 一 __ _ tttttgagcg tttcaaggat aaagaaggtg gtttcagegg 840 tgaactgaaa ggtgacgtcc aaggeetget gagcctgtal gaagegtett ” ------- ---- ------ atcacccacc

tctgacctgc tctcaggatg

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“ ___ _ gtctggtgac 1320gacgtgtatg acgtttatgg cactctggac gaactgcaac tgttcaccga cgctgggacg ttaaegetat taacaccctg ccggactata tgaaactgtg ctgtacaaca ccgttaacga cacgtcctat “一 ctgtcctatc tgaegaaaag ctggcgtgaa

aacctgctgg aggaggcgcg taccttttccegagggtgag - __ ______cctgaaagaa ggcattaata ccaaggttgc agaacaagtg agccacgccc atatcaccag cgtctgcacc gtctggaggc acgttggttc etggataaat agaaccgcat caccagctgc tgctggagcl ggcgaagctg galttlaaca cctgcaccag caaactggat gccagacccg gatcalcgat tgctgtagag tticctggca tcataacaac _ _agaggegaaa tggtccaaca acaaaattat cccggctttccagcgtttcc tcctccggtg tagegetget ggcgccgtctgcaggaagac atctccgacc acgcgctgcg ttccctgaccttctagctgc gttatcttcc gcctgtgcaa cgatctggcc acctclgcggaegtggegag actaccaatt ctatcattag ctacatgcac gaaaaegatgggaacaggcc cgcgaagaac 一 一 一，

agcgactcca tcccactgca cgcatcaaac cagctggtac tetgaatage ggctgttttg geggatgaga

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aaagagctgc aagatctgtc ccgctggtgg accgagatgg tttgtacgcg accgcctgat ggaagtttat ttctgggcac cagtttggtg aatgtcgcaa agctgttact aaaatgtttg

tgcgtaaact ccctgctgcc cctaccagta tgctgctgat catatgggaa gccgicgacc

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tgaacgcgtt ggcacgtgtt gactgaaaac tgtctaactg cagaagagga tctccagcttagaacgcaga ageggtetga acctgacccc atgccgaact tccccatgcg agagtaggga actgggcctt tcgttttatc cgccgggagc ggatttgaac cgccataaac tgccaggcat cgtttctaca aactcttttt gagacaataa ccctgataaa acalttccgt gtcgccctta cccagaaacg etggtgaaag catcgaactg gatctcaaca tccaatgatg agcactttta cgggcaagag caactcggtc gccgcataca accagtcaca gaaaagcatc l：一〜―二二 cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa ggagctaacc gcttttttgc accggagctg aatgaagcca ggcaacaacg attaatagac ggctggctgg tgcagcactg tcaggcaact gcattggtaa tttttaattt ttaaegtgag _ ttgagatcct ttttttctgc gegtaatetg agcggtgglt tgtttgccgg atcaagagct cagcagagcg cagataccaa atactgtcct caagaactct gtagcaccgc ctacatacct tgccagtggc gataagtegt gtcttaccgg ggcgcagcgg ctacaccgaa gagaaaggcg gcttccaggg tgagegtega cgcggccttt gttatcccct ccgcagccga acgaccgagc gcggtatttt ctccttacgc tacaatctgc tetgatgeeg tgggtcatgg ctgcgccccg ctgctcccgg catccgctta aggttttcac cgtcaicacc aagcggcatg catttacgtt gatagcgccc ggaagagagt aigtcgcaga gtatgccggt gccacgtltc tgcgaaaacg egggaaaaag

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gaatggaaaa atggaaateg ctgggtcgcc ccgattaacc tctagaacaa tcatcattga agcctgatac ggcagtagcg

1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220

aagagaaagg cctttctgca tggaaaaege tatgccagca gtctggtgcg eggagetgga gtaccagcga agatgaateg cagttaacat cagactacgc agctgatgta aaactcatct gttlaaacgg agattaaatc 2280 cggtggtccc 2340 gtgtggggtc 2400 cagtcgaaag 2460 aggacaaatc 2520 gcaggacgcc 2580 ggcctttttg 2640 atccgctcat 2700

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________ ctatlctcag aatgacttgg ttgagtactc 3060 ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc 3120二肅ettaettetg acaacgatcg gaggaccgaa 3180

acaacalggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga 3240taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat 3300

ttgcgcaaac tattaaetgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca 3360tggatggagg cggataaagl tgcaggacca cttctgcgci cggcccttcc 3420tttattgctg ataaatetgg ageeggtgag cgtgggtctc gcggtatcat 3480gggccagatg gtaageede ccgtatcgta gttatctaca cgacgggg^g 3540atggatgaac gaaatagaca gategetgag ataggtgcct cactgattaa 3600ctgtcagacc aagttlactc ................aaaaggatci aggtgaagat ttttcgttcc aetgagegte

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gcagcgagtc agtgagegag gaageggaag agegeetgat 4560atetgtgegg tatttcacac cgcatatggt gcactctcag 4620catagitaag ccagtataca ctccgctatc gctacgtgac 4680acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt 4740cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag 4800gaaaegegeg aggcagcaga teaattegeg egegaaggeg 4860gacaccatcg aatggtgcaa aacctttcgc ggtatggcat 4920caattcaggg tggtgaatgt gaaaccagta acgttatacg 4980gtetettate agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca 5040

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149050-序列表.doc -2-

1434921

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ggaccgcttg clgcaactct

570057605820 5880 5940

<210> 3<211> 7404<212> DNA<213>人工序列

<220><223〉合成構築體

tgacagctta agtcaggcac ctggalgctg cggatatagi

tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa 60 cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 120 taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt 180 tcctcctttc agcaaaaaac Itatlgctca gcggtggcag

tagcagccgg atccctgcag ttagacatac agcagcagu tgatgcggtt ttcagtcgcg tggtaggtgc agtgggaaac acgtgccatg agcagggtgg agtcgctaac gcgitcacga ttacgcagtt

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cttcgcgggc igglagtcic agataacgca cggagatgtc cggaggagga tggaccatt t aggacaggtt tgtacagtgc _cccagcgctc tacagcatcg gtgaacagtt gcagttcgtc acacgtcatc gatgatcgtc accagaccaa acattttagt caaactgcgg gtctggcgcc atacccagtg cccagaaata

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_ __ _ ― 1980cacatatgac gaccttcgat 2040 tggcccatgg latatcicct 2100 atccgclcac ctctacgccg tatatcgccg tgtttcggcg ___ —ttgcatgcac cattcctlgc 2400 ttcctaatgc ~ ■'

<400> 3ttclcatgtl ttgctaacgc caccgtcacc gcgggatatcgccccaaggg gt tatgclag cgggctltgl agggicaaic atcgccatac cgctt taggc gtcgatcagtcatgtagcia atgatagaat cagatcgltg cacaggcgga cagggaacgc cggcgccagc agccgggata acgccagctt ggacgtgtcgggtgtlaata gcgttaacgt cagagtgcca taaacgtcat aacagctttg cgacattcac _ _aacttccatc aggcggtcgc gtacaaaatc cagtttgcta gccaggccca tctcggtcca ccagcgggac agatcttgca gctctttctg gtgcagggtc tgtaccatgt taaaatccag cttcgccagc tccagcagca gctggtgatg cggttcttlc ggttcgtatt tatccaggaa ccaacgigcc iccagacggt gcagacgctg gtgatatggc agttccaggg cgtggctcac (tgttctgca----------- ------ --------aaaggtacgc caggctcagc cttgaaacgc agacagagcg _ _gtutccagg gctitaatga tgtctitttc aaaittgiag gtcagaccca ggcgctgcacaicgtcgatc agctccagca gggacagcgg cigggigici acacggttga tcatgcagcgaacttcllcc tccagittgg tcgctttctc ctccagcttt iccactttca ggtcgttctccagggattgc aggaattcga aattccacag gtttggctga tagtttgcgg aacgacgggaattalgcicg gtaatctgag taaattgaga agaggtcgcaatggccgctg ctgtgatgat icttaaagit aaacaaaatt tagtgagicg tattaatttc ggccggcatc accggcgcca tggggaagat cgggctcgcc ggcaggcccc gtggccgggg gactgttggg cgccatctcc ggcggcggtg ctcaacggcc tcaacctaci actgggctgc _ taagggagag cgtcgagatc ccggacacca tcgaatggcg caaaaccttt caigatagcg cccggaagag agtcaaitca gggtggtgaa tgtgaaacca acgatgtcgc agagtatgcc ggtgtctctt atcagaccgt ttcccgcgtg ccagccacgt tictgcgaaa acgcgggaaa aagtggaagc ggcgaiggcg acattcccaa ccgcgtggca caacaactgg cgggcaaaca ccacciccag tciggccctg cacgcgccgi cgcaaattgt ccgatcaact gggtgccagc gtggtggtgt cgatggtaga giaaagcggc ggtgcacaat cttctcgcgc aacgcgtcag

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149050-序列表.doc -3-

1434921

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tctcgaccga ' "atgactatcg ccggcagcgc ggcctgtcgc cccgccacca ctgggctacg tettgetgge cttctcgctt ccggcggcat _ gatgacgacc atcagggaca gcttcaagga 4140 atcactggac egetgategt cacggcgatt 4200 ttggcatgga ttgtaggcgc cgccctatac 4260 gcaiggagcc gggccacctc gacctgaatg 4320 ccactccaag aattggagcc aatcaattct 4380

ϋ”…cttggcagaa catatccalc gcgtccgcca 444° cgcatctcgg gcagcgttgg gtcctggcca egggtgegea 4500 aggacccggc taggctggcg gggttgcctt actggttagc 4560 gagegaaegt gaagegaetg etgetgeaaa aegtetgega 4620 gtcttcggtt tccgtgtttc gtaaagtctg gaaaegegga 4680 atgttccgga tctgcatcgc aggatgetge tggctaccct 4740 ttaaegaage gctggcattg accctgagtg attlttctct 4800 gccagttgtt taccctcaca acgttccagt aaccgggcat 4860 ategigagea ....................... >ηπΑlacacggagggacatctgtg aategettea cgaccacgct gatgagettt 5100 ttcggtgatg aeggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc 5160 etgtaagegg atgeegggag cagacaagcc cgtcagggcg 5220

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1434921

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<220><223>合成構築體

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149050-序列表.doc -7-

1434921

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ggcagcatgg atttgaggtt tcccaggaag ccttttctgg 360 actltttgga gaatctcaag gaggacacca aggccatcct 420 tcctggctct tgagggcgag aatattctgg atgaggctcg 480 tgaaggagtl gtcggaggaa aagatcggaa aggaactggc 540 ttgaacttcc cctgcaicga cgiacccagc acagaaaaaa ggaggatgct aatcaggttc tgattcagag cgtgtaccag cgtgactlgc gactggccac gaagctccac tttgctaaag tgggtgtggc ctltgagcct cagtactccg _ _ cttttgtcac tatcatcgac gacatctacg atgttiacgg 900 tcttcacgga cgctgtcgag cgatgggatg tgaatgccat tgaagttgtg tttcttggcg ctctacaaca caattaatga aggacaaggg agagaacatt ctgccctacc cctttttgca ggaagccaag tggctctata tcggcaacgc t tggaagict tccagcggcc tggtccagaa catcaagaaa gaggagattg cccgacclic gcacaicttt cccgaggaga agclggctac

gactggaggc 600 tgctcgaact 660 gagagacaag 720 atcgattgat 780 actgccgaaa 840

cgacigtgca tctgtgtcgt atgaacctga ttcgccaaac

aacagccaat cgagtclgtg cggttctctg ttglacttac cataacggtg gctticggtg attaccgagc

ttactaaagc acaaatctac ctctccagtt agaacctcca atgaccttgc gtlacatgcg tcgatgaaac catttgttga acgcgcacac cgatcctgcc

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1641

<210> 10<211> 8804<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

tatgggaatt cgtcgaccat ggatgagaga aaacagaatt gaagtgaaac tgccaggcat ttgtttgtcg tgcgaagcaa aat taagcagttattttict aaaiacattc cctctggtaa ggitgggaag tctgaiggcg caggggatca ttgaacaaga

tagaacaaaa actcatctca gaagaggatc 60 atcattgagt ttaaacggtc xccagcttgg 120

cgaagctttccatcatcatc _agattttcag cctgalacag attaaatcag aacgcagaag ISO tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac gccgtagcgc cgatgglagt gtggggtctc caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac gtgaacgctc tcctgagtag gacaaatccg cggcccggag ggtggcgggc aggacgcccg aaggccatcc

ctgaccccai 240 cccatgcgag 300 tgggcctttc 360 ccgggagcgg 420 ccataaactg 480 tttctacaaa 540 ggaattgcca 600 ggctttctcg 660 atgaggatcg 720

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tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg 780 acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg 840 ggitcttttt gtcaagaccg acctgiccgg tgccctgaat 900 gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca 960 tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca tacicggatg gaagccggtc ttgtcgatca

gaactgltcg ccaggctcaa ggcgatgcct tgtggccggc gctgaagagc cccgattcgc aatcccttaa cgtgagtttt

<400> 10 gctggtacca tgaatagcgc ctgttttggc cggtctgata gccgaactca agtagggaac gtt ttatctg atttgaacgt ccaggcatca clctllttgt gctggggcgc ccgccaagga tttcgcatgactattcggct atgactgggc ctgtcagcgc aggggcgccc gaactgcaag acgaggcagc gctgtgctcg acgttgtcac Eggcaggatc tcctgtcatc gcaatgcggc ggctgcatac caicgcalcg agcgagcacg gacgaagagc atcaggggct cccgacggcg aggatctcgt gaaaatggcc gcttttctgg caggacaiag cgttggctac cgcttccicg tgctttacgg cttcttgacg agttcttctg agcgtcagac aatctgctgc agagctacca tgtccttcta aiacctcgct _ _ _ _taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggrtcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacciaca

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cccgtagaaa ttgcaaacaa actcttttic gtgtagccgt cigctaatcc

cgcgccagcc cgtgacccat attcatcgac ccgigatati tatcgccgct acatgaccaaagatcaaagg atcttcttga gatccttttt aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt cgaaggtaac tggct tcagc agagcgcaga agttaggcca ccacttcaag aactctgtag tgtiaccagi ggcigctgcc agtggcgata

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1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980

149050-序列表.doc -11 -

1434921

ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 2220 gagctgatac cgcicgccgc agccgaacga ccgagcgcag 2340

gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 2040 aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 2100 tctttatagl cctgtcgggt ttcgccacct ctgacitgag cglcgatttt tgtgatgctc 2160gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 2220cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tccigcgtta tcccctgatt ctgtggataa 2280ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgcicgccgc agccgaacga ccgagcgcag 2340cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 2400gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 2460gltaagccag tatacactcc gctatcgcia cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac 2520ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gctigtctgc tcccggcatc cgcttacaga 2580caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tticaccgtc atcaccgaaa 2640cgcgcgaggc agcagatcaa ttcgcgcgcg aaggcgaagc ggcatgcatt tacgttgacaccatcgaatg gtgcaaaacc utcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat 2760tcagggtggt gaatgtgaaa ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct 2820cttatcagac cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg 2880aaaaagtgga agcggcgatg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac 2940iggcgggcaa acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc 3000cgtcgcaaat tgtcgcggcg aitaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg 3060tgtcgatggt agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg 3120

utcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat 2760 gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg 2880

c°caacgcgt cagtgggctg atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg iggaagctgc ctgcactaat gttccggcgl tatttcttga tgtctctgac cagacaccca 3240

catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg 3300 ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc icggcgcgtc 3360 tggctggcat aaatalctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac 3420 c；—aigtccggtt tlcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg 3480 cactgcgalg ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg 3540 gtccgggctg cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga tacgacgata 3600 ctcatgtlat atcccgccgt caaccaccai caaacaggat tttcgcctgc 3660

3780 3840 3900 3960 4020

catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg 3300 tcaacagtat tattttctcc cattgggtca tgcgtctggc gggaaggcga ctggagtgcc gcatcgttcc ccattaccga ccgaagacag----- „—— -- ,tggggcaaac cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt gcccgtclca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcai taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgaglt agcgcgaatt gatctggttt gacagcitai catcgactgc acggtgcacc aatgcitctg gcgtcaggca gccatcggaa gctgtggtat ggctgtgcag ' 」... ................................. ................

tcccgttctg gataatgt11 algagctgtl gacaattaal aatitcacac aggaaacagc ttatcagaca atctgtgtgg tlaaagaggt atatattaat tcttctcaat ttactcagat aacctgtgga atttcgaatt gaggagaaag cgaccaaact

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ttaataccaaaaagaaggca caccagcgtc ccgcatcacc caccagaaag agctgcaaga clggattltg

gtcgtaaatc actgcataat tcgtgtcgct caaggcgcac tttgcgccga catcataacg gttctggcaa ataitctgaa 4080 catccggctc gtataatgtg tggaattgtg gccgctgaga aaaagcgaag cggcactgct gcactcgacc ggaattatcg attaacltta gtatcgatta aataaggagg aataaaccat taccgagcat aattcccgtc gttccgcaaa cctgcaatcc ctggagaacg acctgaaagt

o ______ ggaggaagaa gttcgctgca tgatcaaccgcagccgctgt ccctgctgga gctgatcgac gatgtgcagc gcctgggtct11tgaaaaag acatcattaa agccctggaa aacatcgtac tgctggacgaaacaaatctg acctgcacgc aaccgctctg tctttccgtc tgctgcgtcagaggtttctc aggatgtttt tgagcgtttc aaggataaag aaggtggtttctgaaaggtg acgtccaagg ccigcigagc ctgiatgaag cgtcttacctggtgagaacc tgctggagga ggcgcgtacc ttttccatca cccacctgaa 。

ttaataccaa ggttgcagaa caagtgagcc acgccctgga actgccatat 4920tgcaccgtct ggaggcacgt tggttcctgg ataaatacga accgaaagaa 4980agctgctgct ggagciggcg aagctggatt ttaacatggt acagaccctg 5040

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5460 5520 5580 5640

-kg-* —。一 一 5700 acgatggtac cagcgaggaa 5760 ggaaaaagat gaatcgtgaa 5820

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gggacgttaa acaacaccgl cctatctgac ccaacaacaa

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ο。___ m aattatcccg gctttctcca agtacctgga aaacgccagcgtttcctcct ccggtgtagc gctgctggcg ccgtcttact tttccgtatg ccagcagcag

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tggtcatgat cgataatgct

…，…… gggtuacta ——一 aattacittt acaacaaaga gccactgaaa aaataacttt 6420 catgctgctc tcatccacta tgtatigatg acgaattagg 6480

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149050-序列表.doc -12-

1434921

catcctaltt tataagalca aegetaaaga aaacttgact gtcaacccaa acgtcaalga 6720agitagagac ttcaaatggg tttcaccaaa tgatttgaaa actatgtttg ctgacccaag 6780tlacaagttt acgccttggt ttaagaltat ttgegagaatgcaattagat gacctttctg aagtggaaaa tgacaggcaaacgcgtcclg cattcgccct ccgaccctgg cactggtcga ccgaaactct gcgacgaact cacttcgcct ccgggctggg __ _ _accccgtttg accaattgat tlgggatgtg gggcaicagg cttatccgca accggacgcc gcgacaaaat cggcaccatc egteagaaag geggtetgea iggegeggeg aaagegaata igaegtatta agegteggge attcaicaac geeggaattg gtattgcggt gtcatlggcg atggegegat gatatccgtc etgatatget gtcggcgcgc tcaacaacca egegaaggeg ggaaaaaagt accgaagaac atattaaagg aactacatcg gcccggtgga atgcgcgacc (gaaaggccc gaaccggcag aaaaagaccc ggttgtttgc egaaaagtag ttgtgcgaaa cggcagcgaa ggttccggca tggtcgagtt gccgagcaac acgcggtgac gtcgcgattt actccacttt attcaaaagc ttccggtcct caaacccatc agggtgcttt aigaccccga gegatgaaaa gatggcccgt cagcggtgcg ctggaaaaac taccaattgg cttaactttg gtacgctgal etggtegata tgcgttttgt agccatgaag cgctggtcac gtgaaegaag tgctgatggc gaettettta ttccgcaagg gctggtatgg aagccaaaat

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<210> 11<211> 10992<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> H

actggiggga 6840 tgctataaca 6900 tgccaaatac agagagttta ttccagcggg tgtctacaac taaaattitg cccgttcccg 7260 ctccatcagt caccgtctgt tcacgcgggc ttccgaaaat ctcttcactg gctcaaacgc gclgggcltI gctaaagaac legtggttat tccctccagc tggcgactgg gatgegtgaa cgtggcaatt caaacccat t tgacgtggcg

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8280834084008460852085S08640

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8804

gtttgacagc ttatcatcga etgeaeggig ggaagctgtg gtatggctgt gcactcccgt tetggataat tgaaatgagc tgttgacaat taacaatttc caatttatca aaaattaaag gageteggat aaacatgtca ctctgctgtg getaataage taatcataag aaaat tggee ggatccgttg gtatatgttttttacccatc ggtgctgggt tatggcctac laagcatata aggaatagat taatggaaca gatcctaacc gitggtcacc tgccciacaa ggctgtagaa tggaetgett egatgatitg gactttgtta agatgatttt aagcgcaaaa aaataaaact

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accgggaaag gttattattt ttggtgaaca 540 tgctagtgtg tctgcgttga gaacctacct 600 tattgaat tg tgccatcacc tggcttgtct cttccactac caagaatatt cgcctctatt taatgaettg gaaaagetgt aggtgaaaag tgtattcacg taatgccctg elatttgaaa gttettagat tacaaaagat gaagccaatt gtlaagtaaa acaactattg gaattgataa teetggatta taccggtgct gcaaattgac agacttgggi aatcaaatcc ctagtattcc cgatctatia ttgccaggaa

gacttcccgg acattagctt 660 gaggatcaag taaactccca 720 caggaactcg ttagtctttt 780 catgcagcgt aagttttctt tctgtatcac

gatttcccag cttgttgctc clagatgc'ca tgiaaaggca

tttgtttcct 840 taaagtctac 900 tggeettage 960 cagaaaacga 1020 gtaccccttc 1080 aagactcaca 1140 ccattccaat gcgttcgtgt igggtgaatg ccgatgacga gaataaarca aaaatetgaggaaettatta

ggtggcggcg gttgctcttt agcttcaaaa gggactggct

agaaattgea gctgtttgtt aattatttga acacgaattt

1200 1260 1320 1380 1440 J 500 1560 1620 1680 1740 1800

149050-序列表.doc -13-

1434921

ttttctctga 2220 gaagattgag 2280aaaataatgt 2400

agacaaatat agagaagtta ttcataattt taaaaltgga agcgggtttg atgtagcggc attcccaccc gcattaatct actggcgcat ttggttgatg ttcgggatta actttatgga 匸與叶—- ------------- ·-；-；—二 ermccagaaggta aaaaattggt atgattcgca tatgccagaa agcttgaaaa tatatacaga 2760 actcgatcat gcaaattcta

gattacagcg cctgaaatca actaaagaat ctggtgccga cagaccttaa aaggagitct gcagtgatta ctaagcaaga tctaaggttc aatggctgga ccggaaactt atcttgataa

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ccct taagga ggaaaaaaaa atgaccgttt tcgcaaccct taagtattgg gggaaaaggg ccatatcagt gactttatcg caagatgacc ctgagtttga acgcgacact tigtggttaa gaactcaaaa ttgtcigcgc gacctacgcc cctcaltgcc cacattatct caatggaaac cagcagctgg tttagcttcc tccgctgctg

accatggact tcataagcta atttgcgata ggcctgcacc cttaaggagg aaaaaaacat I860 etcagagtig agagccttca gtgccccagg gaaagcgtta ctagctggtg gatatttagt VZU tliagataca aaatatgaag catttgtagt cggattatcg gcaagaatgc atgctgtagc 1980 ccatccitac ggttcattgc aagggtciga taagtttgaa gtgcgtgtga aaagtaaaca 2040 atttaaagat ggggagtggc tgtaccatat aagtcctaaa agtggcttca ttcctgtttc 2100 gataggcgga tctaagaacc ctitcattga aaaagttatc gciaacgtat ttagctactt 2160taaacctaac atggacgact actgcaatag aaacttgttc gttattgata ttttctctga 2220tgatgcctac cattctcagg aggatagcgt taccgaacat cgtggcaaca gaagattgag 228U111tcattcg cacagaattg aagaagttcc caaaacaggg ctgggctcct cggcaggttt 2340agtcacagtt ttaactacag ctttggcctc ctutttgta tcggacctgg aaaataatgt 2400

b ------ -------- t agcacaagtt gctcattgtc aagctcaggg 246Uatgtagcggc ggcagcatat ggatctatca gatatagaag 2520ctaatttgcc agatattgga agtgciactt acggcagtaa 2580aagaagactg gaatattacg attaaaagta accatttacc 2640tgggcgatat taagaatggt tcagaaacag taaaactggt 2700aie«ticgca tatgccagaa agcttgaaaa tatatacaga 2760gatitalgga tggactatct aaactagatc gctiacacga 2820aicagatatt tgagtctctt gagaggaaig actgtacctg 2880cagaagttag agatgcagtt gccacaatta gacgttcctt 2940

tatcgaacct cccgtacaaa ctagcttatt 3000 tacttgctta atacctggtg ctggtggtta 3060 tgttgatctt agggctcaaa ccgctaatga 3120 tgtaactcag gctgactggg gtgttaggaa 3180 ataacltaag gtagctgcat gcagaattcg 3240 acacagcatc cgltaccgca cccgtcaaca 330° acacgaagtt gaatctgccc accaattcgt 3360 tcagaacgtt gacctccgcg gctactgcac 3420 atggagaacc acacagcatc gacaatgaaa 3480

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149050-序列表.doc -14-

1434921

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149050-序列表.doc -15 -

1434921

<210> 12<211> 8703<212> DNA<213>人工序列

<223>合成構築體

<400> 12 cccgtcttac tgttgacaat acacaggaaa gacaatctgt aggtatatat ggtaaaaaaa ataaaggcag _ ttttaaaaag acattccact atttclgaag

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一…亠_, — τ aaa11gatca agtaatc111 ggaaatgttt 4oUtacaagcigg aaatggccaa aatcccgcac gacaaatagc aataaacagc ggtttgtctc 540atgaaaltcc cgcaatgacg gttaatgagg tctgcggatc aggaatgaag gccgtlattt 600tggcgaaaca attgattcaa ttaggagaag cggaagtttt aattgctggc gggat gaga 660atatglccca agcacctaaa ttacaacgtt ttaatlacga aacagaaagc tacgatgcgc 720ctttttctag tatgatgtat gatggattaa cggatgcctt tagtggtcag gcaatgggct 780taaclgctga aaatgtggcc gaaaagtatc atgtaactag agaagagcaa ga caatt t 840ctgtacattc acaattaaaa gcagctcaag cacaagcaga agggatattc gctgacgaaa 900tagccccatt agaagtatca ggaacgcttg tggagaaaga tgaagggalt cgccctaatt 960cgagcgttga gaagctagga acgcttaaaa cagtttttaa agaagacggt actgtaacag 020cagggaatgc atcaaccatt aatgatgggg citctgcttt gattattgct tcacaagaat 080atgccgaagc acacggtctt ccttatttag ctattattcg agacagtgtg gaagtcggta 1140itgatccagc ctatatggga atttcgccga ttaaagccat tcaaaaactg ttagcgcgcaatcaacttac tacggaagaa aitgatctgt atgaaatcaa cgaagcat11 gcagcaacttcaatCRtggt ccaaagagaa ctggctttac cagaggaaaa ggtcaacatt tatggtggcggtatttcatt aggtcatgcg attggtgcca caggtgctcg tttattaacg agtttaagttalcaattaaa tcaaaaagaa aagaaatatg gagtggcttc Utaig'Hf 譬???!???!taggactcgc tatgctacta gagagacctc agcaaaaaaa """ ° °teagtcctga ggaacgcctg gcttctcltc ttaatgaagg - aaaaagaatt tgaaaatacg gctttatctt cgcagatlgc caatcatatg attgaaaa c

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149050-序列表,doc -16-

1434921

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agccatgaaagttgegtgagctgggttcgt _ 。 _________“_________

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8703

149050-序列表.doc ・17-

1434921

<21O> 13<211> 9371<212> DNA<213>人工序列

^23＞合成構築體

<400> 13 tgtaacct tt aaagtgtttc atccgtagga tgtgctcccc gacaaaattg cagccgttcc tatgtiatat icgtcaccca cttattcaca tcatcaaaaa tcccgccatt ttgagatttg attgggatat aaaataagcc tagtaagatc acgcaatggg aagagtgatg ccgggtattc cttccaatac caacagcaag gtcgaacgta tatagtgaaa agccgtcagc gttcttttcc gtcctctcli taagttcaac agacactccc ttgtgcgctg ccggtttalt caat tgacca ttgaatcagc gcaatacata atgactgaat

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…____ _ „ 2160gtattcacgg taccccttca ggaatagata acgclgtggc 2220 tatttgaaaa agactcacat aatggaacaa taaacacaaa 2280 atttcccagc cattccaatg atcctaacct atactagaat 2340 ttgitgctcg cgttcgtgtg ttggicaccg agaaatticc 2400 tagaigccat gggtgaatgt gccctacaag gcttagagal 2460 gtaaaggcac cgatgacgag gctgtagaaa ctaataatga 25zu

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1434921

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149050-序列表.doc ・19-

1434921

catatcacag ttaacgaaaa acaaagagat aaatccagct acgaattaat gctttcggca cacagcaatI attugttcc ttaaaaacac aaaatgcaag tlgattatgc tggtgaagat ttgaacatct

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9371

<210> 14<211> 4339<212> 贝A<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 14 tagaaaaact catcgagcat ccatattttt gaaaaagccg aggatggcaa gatcctggta attaatttcc cctcgtcaaa gaatccggtg agaaiggcaa ccattacgct cgtcatcaaa 心----------▼气；------- 〜ccctgagcga ggcgaaatac gcgatcgctg tiaaaaggac aattacaaac aggaatcgag 420 tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca ΐcaacaatat 11tcacctga °trilooafa 1 tcttctaata cclggaacgc tgittttccg gggatcgcag tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagtggca agtctgacca tctcatclgt …aactctggcg catcgggctt ttatcgcgag cccatttata ctcgacgttt cccgttgaat tatcagggtt attgtctcat ataggggtca gtfittacaac

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149050-序列表.doc -20-

1434921

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5100 5160 5220528053405400

149050-序列表,doc -23 -

1434921

aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac 5460 cattcgacca Itgtcgatca ccaggctcaatgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac 5700 ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg 5820 agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg 5880 cgigagtttt cgttccactg agcgtcagac cccglagaaa 5940 gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 6000 gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 6060 莓卷曙混詞 taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt 6120 aacictgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 6180 agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 6240 cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 6300

_ ---- ί gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 6360ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 6420 gagagcgcac gagggagcli ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag ggaaaaacgc cagcaacgcg acatgttclt icctgcgtta gagctgatac cgctcgccgc cggaagagcg cctgatgcgg tatggtgcac tctcagtaca gctatcgcta cgtgactggg gccctgacgg gc

tcaccttgct cctgccgaga gcttgatccg gctacctgcc tactcggaig gaagccggic cgcgccagcc gaactgttcg cgtgacccat ggcgatgcct attcatcgac tgtggccggc ccgtgatait gctgaagagc tatcgccgct cccgattcgc acatgaccaa aatcccttaa agatcaaagg atcttcttga aaaaaccacc gctaccagcg cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga agttaggcca ccacttcaag tgttaccagt ggctgctgcc gatagttacc ggataaggcg gcttggagcg aacgacctac accgaactga

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cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctal 6540 gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgclc 6600 tcccctgatt ctgtggalaa ccgtattacc gcctitgagt 6660 agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 6720 tat11tctcc ttacgcalct gtgcggtatt tcacaccgca ο/οϋatctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc 6840 tcalggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc 6900

6912

<210> 17<211> 7902< 212> IM<213>人工序列

<223>合成構築體

<400> 17ttgtctgctc ccggcatccg tcagaggttt tcaccgtcat ggcgaagcgg catgcatlta gcatgatagc gcccggaaga tacgatgtcg cagagtatgc gccagccacg tltclgcgaa tacattccca gccacctcca gtctggccct gccgatcaac tgtaaagcgg cggtgcacaa ccgctggatg accaggatgc

cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg 60caccgaaacg cgcgaggcag cagatcaatt cgcgcgcgaa 120cgitgacacc atcgaatggl gcaaaacctt tcgcggtatg 180gagtcaattc agggtggtga atgtgaaacc agtaacgtta 240cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt ggtgaaccag 300aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc ggagctgaat 360acaacaactg gcgggcaaac aglcgttgct gattggcgtt 420gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat taaatclcgc 480

tgggtgccag cgiggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg cgtcgaagcc 540tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat cattaactat oOU

ccgciggaig "E典a” cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt tccggcgtta 660mcttgaig ictctgacca gacacccatc aacagtatta ttttctccca tgaagacggt 720acgcgactgg gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc gctgt agcg 780ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa atatctcact 840cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgacl ggagtgccat gtccggtttt 900

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1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920

accgcgtggc

caacaaacca igcaaatgct gaatgagggc gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc „ _ - - rt 宀"”’“纪accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc gccictcccc gcgcgtcggc cgattcatta atecaECtgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tfitsasttag cgcgaattga tctggtttga cagcttatca tcgactgcac ggtgcaccaa tgct tctggc gtcaggcagc catcggaagc tgtggiatgg ctgtgcaggt cgtaaatcac ilcataauc ftgtcictca aggcgcactc ，宀…tororroaratcataacggt tctggcaaat attctgaaat ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa aagcgaagcg gcactgctct ttaacaat11 aaiiatcgat taactttatt attaaaaatt laaggaggaa taaaccatgt gtgcgacctc ttctcaat11 ttcccetcgt tccgcaaact atcagccaaa ccigiggaat -ggagaacgac ctgaaagigg aaaagctgga ggagaaagcg accaaactgg aggaagaagticgctgcatg atcaaccgtg tagacaccca gccgctgtcc ctgctggagctgtgcagcgc cigggtctga cctacaaatt tgaaaaagac atcaitaaagcatcgtactg ctggacgaaa acaaaaagaa caaatctgac ctgcacgcaa …-…广utccgtctg ctgcgtcagc acggtttcga ggtttctcag gatgtttttg 帶光!漕 3撫 ggataaagaa ggtggtttca gcggtgaact gaaaggtgac gtccaaggcc tgctgagcct 2220 gtatgaagcg tcuacctgg gtttcgaggg tgagaacctg ctggaggagg cgcgtacctt 22S0 ttccatcacc cacctgaaga acaacctgaa agaaggcalt aataccaagg ttgcagaaca 23 0 agtgagccac gccctggaac tgccatalca ccagcgtctg caccgtctgg aggcacgttg 2400

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tgatcgacga 1980 ccctggaaaa 2040 ccgctctgtc 21(M)

149050-序列表.doc -24-

1434921

gtlcctggat aaatacgaac cgaaagaacc gcatcaccag ctgctgctgg agctggcgaa 2460gctggatttt aacatggtac agaccctgca ccagaaagag ctgcaagatc tgtcccgctg 2520gtggaccgag atgggcctgg ctagcaaact ggattttgta cgcgaccgcc tgatggaagt 2580ilatticlgg gcactgggta tggcgccaga cccgcagtti ggtgaaigtc gcaaagctgt 2640tactaaaatg tuggtctgg igacgatcat cgatgacglg tatgacgiti aiggcactct 2700ggacgaaclg caactgttca ccgatgctgt agagcgctgg gacgttaacg ctattaacac 2760cctgccggac tatatgaaac tgtglttcct ggcactgtac aacaccgtta acgacacgtc 2820ctaitctatt ctgaaagaga aaggtcataa caacctgtcc tatctgacga aaagctggcg 2880tgaactgtgc aaagcctttc tgcaagaggc gaaatggtcc aacaacaaaa ttatcccggc 2940tttctccaag tacctggaaa acgccagcgt ttcctcctcc ggtgtagcgc tgctggcgcc 3000gtcttacttt tccgtatgcc agcagcagga agacatctcc gaccacgcgc tgcgttccct 3060gaccgacttc catggtctgg------- * _ _ggccacctct gcggcggagc tggaacgtgg cgagactacc aaltctatca ttagctacat 3180gcacgaaaac gatggtacca gcgaggaaca ggcccgcgaa gaactgcgta aacigatcga 3240cgccgaatgg aaaaagatga aicgtgaacg cgttagcgac tccaccctgc tgcctaaagc 3300m acatggcacg tgtttcccac tgcacctacc agtatggcga 3360

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tgcgttctag ctgcgttatc ticcgccigt gcaacgatct 3120

gttcatggaa atcgcagtta tggtctgggt cgcccagact tttcccgatt aaccagctga atgagttttg atattgccaa cgactgttgc cgaaagagag __gacagcgtga gccgttccag cgggcacttc gcctccgggc tgggcacggt cgaactgacc 3660 gtggcgctgc actatgtcta caacaccccg tttgaccaat tgatttggga tgtggggcat 3720 caggcttatc cgcataaaat ------------- -------- ----aaaggcggtc tgcacccgtt gggcaltcat caacctccat ggcaaaaatc gccgcaccgl tttgaagcga tgaatcacgc aatgaaatgi cgatttccga tccggtaagc tttactcttc ccaattaaag agctgctcaa acgttgtt tg aagagctggg __ __ _gggcttatca ccacgctaaa gaacatgcgc gacctgaaag gcccgcagtt atgaccaaaa --------- ’ ’ *gtgcctaaat tattcaaaaa gcgat tactc gatcgctact gcgattggtg ggtacaaacc gatcaggtgc gcgggcattg cgctgcatac ctctataccg gcggtcggcg cgtcgtggcg agaaactggc gtcgccgaat cgctgaacgc gcgttaattc tggaaatggc attatgggcg gcgcaggcag cccgtgctga cgcgccgaac taactgcagc agaggatcig cagcttggct gttttggcgg cgcagaagcg gtctgataaa acagaatug cctggcggca _______gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgt catgcgagag tagggaacig ccaggcalca aataaaacga aaggctcagt ggcctttcgt * *................................gggagcggat ataaaclgcc tctacaaact aattgccagc __cttictcgcc gccaaggatc tgatggcgca gaggatcgti tggagaggct (gttccggct ccctgaatga cl tgcgcagc

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acccgatcac gtagcggcgg _cgaaagacaa caagctgatg 4500 agttttcacg taaattcccg 4560 tgacctttgc tgcgggtcig 4620 ctttcctgca acgcgcctat 4680 tcctgttcgc catcgaccgc 4740 cttttgatct ctcttacctg 4SOO aaaacgaatg tcgccagatg 4860 tgcgctaccc gcgtggcaac 4920 ttggcaaagg cattgtgaag 4980 tgatgccaga agcggcgaaa 5040 ttgtgaaacc gcttgatgaa 5100 tcaccgtaga agaaaacgcc 5160 tggcccatcg taaaccagta 5220 aaggaactca ggaagaaatg 5280 aaatcaaggc clggctggca 5340 gaacaaaaac cattgagttt tgatacagat gtagcgcggt

tcatctcaga 5400 aaacggtctc taaatcagaa ggicccacct ggggtctccc cgaaagaclg caaatccgcc 5760

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ctcggatgga cgccagccga tgacccatgg _ _ _tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg 6720 gtgaiatigc tgaagagcit ggcggcgaat 6780

6840690069607020 7080

149050-序列表.doc -25-

1434921

taccaaaiac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 7H0c-accgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 7200agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 72OUgctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcltggagcg aacgacctac accgaactga 7320eatacctaca gcgtgagcia tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 7380ggtaiccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 74acgcctggta ictttatagt cctgtcgggt ttcgccacci ctgacttgag cgtcgatttt 7500tgtgatgctc glcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 普ggttcctggc ctittgctig cctttigctc acatgttctt tcctgcgtta tcccclgalt 7620ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga 7680ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag itacgcatct gtgcggtatt aigccgcata gttaagccag gccccgacac ccgccaacac

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<210> 18<211> 6783<212> IMA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

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ttccacggtg tgcgtcaccc ggcaaccttg 1560 tggctggcga acgagcgcaa ggttlcggtc 1620 ctgttcttct acggcaaggt gctgtgcacg 1680

_ __ _ cctcggccgt cgcggcgctt gccggtggtg 1740ctgacEccgg aiiaagtHt tcgcStccic ggttttctgg aaggegagea tcgtttgttc 800gcccagcltc tgtatggaac gggcatgcgg atcagtgagg gtttgcaact £c22gtcaag I860gatetggatt tcgatcacgg cacgatcatc gtgcgggagg gcaagggctc caaggategg 1920eccttgatgt tacccgagag cttggcaccc agcctgcgcg agcaggggaa ttaattccca 1980cgggtttlgc tgcccgcaaa cgggctgttc tggtgttgct aglttgttat cagaategea 2040

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149050-序列表.doc -26-

1434921

Ictaattttt accaaaggat acaccataag gataccgtcc cataaaatta gctttgaaaa taccaattga atctgtaaat aattccgcta ataaagaaag ctttagtcag aacagacct t aatattcclt gticgctgcg atggattcat gcgt tttatg gccctctgat ctaatgcacc ttcgcgttgg ggctcgtata tgagaaaaag cgaccggaat gattaaataa agcataattc aatccctgga aagaagticg tcgacgatgt tggaaaacat ctctgtcttt gtttcaagga tgagcctgta gtaccttttc cagaacaagt cacgttggtt tggcgaagct cccgctgglg tggaagtita aagctgttac gcactcigga ttaacaccct acacgtccta gctggcgtga tcccggclti tggcgccgtc gttccctgac acgatctggc gctacatgca tgaicgacgc ctaaagcgtt atggcgatgg t tgaccct tt aitcgaagct catcalcatc agaagatttt attlgcctgg aacgccgtag catcaaataa tcggtgaacg caacggcccg cagaaggcca tctaaataca aat

cgct tgagaa tcctgatttc cattttccct gttctttccr gCltgglHC caactaattc gatgggctag tctgctagac gacctttgtg aataaaaaaa ttccgcagta aaaaccctaa ttglctccga ctcacggctc gcaaggaaac gcgggtctgc tttccagtct cagtaaggca ccgattcatt atgtgtggaa cgaagcggca tatcgattaa ggaggaataa ccgtcgttcc gaacgacctg ctgcatgatc gcagcgcctg cgtactgctg gacgaaaaca aaaagaacaa atctgacctg ccgtctgctg cgtcagcacg gtttcgaggt taaagaaggt tgaagcgtct catcacccac gagccacgcc cctggaiaaa ggattltaac gaccgagatg tuclgggca taaaatgttl cgaaclgcaa gccggactat tictattctg actgtgcaaa ctccaagtac ttacttitcc cgacttccat cacctctgcg cgaaaacgal cgaatggaaa catggaaatc tctgggicgc cccgattaac ttctagaaca atcatcat tg cagcctgata cggcagtagc cgccgatggt aacgaaaggc ctctcctgag gagggtggcg tcctgacgga llcaaatatg

<21O> 19<211> 6783<212> 命JA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 19 cccgtcttac tatcagggtt aaagagtttg gcctggcagt

(gtcgggaai attgtctcat tagaaacgca ttatggcggg

3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780

cttggcatag tttgtccact ggaaaatctc cacagttctc gtcatcagct ctctggttgc actgatgitc alcatctgag cgtattggtt tgtagggttt algciccgtt agacatacat tcaatgataa ctttgcigga tgttittttt gittatattc gataaaaaga atagatccca ttacaaaagg atgtcgcaaa aggcttaagt ccatcaggca tggcagtgaa ___tacccataat acaagaaaag cccgtcacgg gcttctcagg 4020 tatgtgglgc laictgactt gaccacttcg gattatcccg gcggtatcat aaigcagatt ttglgagcgg ctgctcttta ctttattatt accatgtgtg cgacctcttc gcaaactatc agccaaacct aaagtggaaa agctggagga aaccgtgtag acacccagcc gctgtccctg ggtctgacct acaaatttga aaaagacatc

aaagccttta 11 tagctaat ataagtgaac tgccacacag lagt tcattt t taatcacta

tcaatcgtgg a&gicaiagc ctcaattggt ttactagtcc aaacttgtaa attctgctag accctctgta

aatttataga taactcacta tcctctacaa

_ caaatcgctg 3840 tgtctttitc gtgacattca 3900 tggcactaca ggcgcctttt 3960

ggttgagtag gactaatcgc ctaggtgatt ttticctttg agttgtgggt

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agcaggaaga gttctagctg aacgtggcga aggaacaggc gtgaacgcgt tggcacgtgt

cagaacgcag cacctgaccc ctccccatgc gactgggcct ccgccgggag ccgccataaa gcgtttctac tgagacaata

ttctcaggat aggtgacgtc gaacctgctg aggcatlaat gcgtctgcac icaccagctg gaaagagctg it t tgtacgc gcagtttggt igacgtgtat gcgctgggac actgtacaac cctgtcctat atggtccaac ctcctccggt catctccgac cgttatcttc gactaccaat ccgcgaagaa tagcgactcc ttcccactgc ccgcatcaaa gcagctggta atctgaatag tggctgtt tt aagcggtctg catgccgaac gagagtaggg Ucgttttat cggatttgaa ctgccaggca aaactctttt accctgataa

agcagitcct 4080 ttcagactgg 4140 ctgtcgggaa 4200 t taatcatcc 4260 acagcgccgc tgtgggcact ttaatgtatc cagattaccg gaaitcctgc aaactggagg 4620 ctggagctga 4680 attaaagccc 4740 cacgcaaccg 4800 gtttttgagc caaggcctgc gaggaggcgc accaaggt tg cgtctggagg ctgctggagc caagatctgt gaccgcctga gaalgtcgca gacgtttatg gttaacgcta accgttaacg ctgacgaaaa aacaaaat ta gtagcgcigc cacgcgclgc cgcctgtgca tctatcatta ctgcgtaaac accctgctgc 6000 acctaccagt ctgctgctga ccatatggga cgccgtcgac ggcggatgag ataaaacaga tcagaagtga 6420 aactgccagg 6480 ctgttgtitg 6540 cgttgcgaag 6600 icaaattaag 6660 tgtttatttt atgcltcaat

43204380444045004560

4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940606061206180624063006360

672067806783

tcgcgtiggc gagcggatac aaaaggccat cgtcctgccc

cgaitcatta atatttgaat ccgtcaggal gccaccctcc

atgcagat ta gtatttagaa ggccltctgc gggccgttgc

t tgaagcatt aaataaacaa ttaatttgat ttcgcaacgt

60120180240

149050-序列表.doc -27-

1434921

tcaaatccgc tcccggcgga tttgtcciac tcaggagagc gttcaccgac aaacaacaga 300taaaacgaaa ggcccagtct ttcgactgag cctttcgttt tatttgatgc ctggcagttc 360cctactctcg catggggaga ccccacacta ccatcggcgc tacggcgttt cacttctgag 420ttcggcatgg ggtcaggtgg gaccaccgcg ctactgccgc caggcaaatt ctgttttatc 480agaccgcttc tgcgttctga t ttaatctgt atcaggctga aaatcttctc tcatccgcca 540

gtttaaactc aatgatgatg atgatgatgg tcgacggcgc 600ctcttclgag atgagttttt gttctagaaa gcttcgaatt cccatatggt 660gttagacata catcagctgg ttaatcggga aagggtcaat cagcagcagt 720ittcagtcgc gtagtctggg cgacccagac catcgccata ctggtaggtg 780cacgtgccat gttaactgcg atttccatga acgctttagg cagcagggtg 840

attcatcttt ttccattcgg cgtcgatcag tttacgcagt 900cctgttcctc gctggtacca tcgitucgt gcatgtagct aatgatagaa 960

cagctccgcc gcagaggtgg ccagatcgtt gcacaggcgg 1020tcagggaacg 1acggcgccag aagccgggat cacgccagct aggacgtgtc gggtgttaat

aaacagccaa gctggagacc gtttaaactc aatgatgatg atgatgatgg tcgacggcgc 600 lattcagatc ，accagctgca ttgatgcggtgagtcgctaa cgcgttcacg attcatcttt ttccattcgg cgtcgatcag tttacgcagt 90U tcttcgcggg c. „ ttggtagtct cgccacgttc aagataacgc agctagaacg caccagacca tcggagaigt cttcctgctg ctggcatacg ccggaggagg aaacgctggc gttttccagg ttggaccatt tcgcctcttg cagaaaggct taggacaggt tgttatgacc ttlctcittc ttgiacagtg ccaggaaaca cagtitcata tcccagcgct ctacagcatc tacacglcat cgatgatcgl ccaaactgcg ggtctggcgc cgtacaaaat ccagtttgct

ggtgcagggt gcggttcttt ggtgatatgg _ ----------ctttcagglt gttcttcagg tgggtgatgg aaaaggtacg cgcctcctcccaccctcgaa acccaggtaa gacgcttcat acaggctcag caggccttggtcagttcacc gctgaaacca ccttctttat ccttgaaacg ctcaaaaaca

lew心s cctcgaaacc gtgctgacgc agcagacgga aagacagagc ggttgcgtgc 2040aggtcagatt tgttcttttt gttttcgtcc agcagtacga tgttttccag ggctttaatg z UUatgtcttttt caaatttgta ggicagaccc aggcgctgca catcgtcgat cagctccagc 2160agggacagcg gctgggtgtc tacacggttg atcatgcagc gaacttcttc ctccagtttg 2220gicgctttcl cctccagctl ttccactttc aggtcgttct ccagggattg caggaattcg 2280aaattccaca ggntggctg … ............〜危宀—居gtaaattgag aagaggtcgc atatacctct ttaattttta agatrgtctg ataaattgtt tcctglgtga aattgttatc tgicaacagc tcatttcaga atctggcgta cccaacaglt gcgcagcctg aatggcgaat atctgtgcgg tatt tcacac cgcatatggt catagttaag ccagccccga cacccgccaa

tggaagtcgg gaaaagtaag tacttggaga ttgcacagtt agaatagaat tagtccggca tgcagttcgt ccagagtgcc

agctctttct agctggigat tgcagacgct ttaatgcctt agcaggttct acgtcacctt tcctgagaaa

cagcgcgtgg 1080 cagcgctaca 1140 aattttgttg 1200 tttcgtcaga 1260 gttaacggtg 1320 agcgttaacg ataaacgtca gcgacattca caggcggtcg cagatcttgc

ggtgaacagt _ _cacc-agacca aacattttag taacagcttt caiacccagt -… ——agccaggccc atctcggtcc accagcggga ctgiaccatg ttaaaatcca gcttcgccag ctccagcagc cggttcgtat ttatccagga accaacgtgc ctccagacgg cagttccagg gcgtggctca cttgttctgc aaccttggta

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atagtttgcg gaacgacggg acacatggtt ataataaagt aaagagcagt cgctcacaat

1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980

aattatgctc ggtaatctga 2340 tatttaatcg atacattaat 2400 ttccggtcga gtgcccacac 2460 tttttctcag cggcgctgtt 2520 atacgagccg gatgattaat 2580 ggcccgcacc gatcgccctt 2640 gcggtatttt ctccttacgc 2700 tacaatctgc tctgatgccg 2760

tattcctcct taatcgataa gccgcttcgc tccacacatt atagcgaaga ggcgcctgat gcactctcag ---------- _ 〜〜cacccgctga cgagcttagl aaagccctcg 2820gtagggctta ttatgcacgc ttaaaaataa 2940 tcggcttgaa cgaattgtta gacatlattt 3060 gtagtggaca aattcttcca actgatctgc 3120 aagataagcc tgtctagctt caagtatgac 3180

ctagatttta atgcggatgt tgcgattact tcgccaacta ttgcgataac aagaaaaagc 2880 cagcctttca tgatatatct cccaalttgttaaaagcaga cttgacctga tagttiggct gtgagcaatl atgigcttag tgcaiclaac JuUU

cgaagcggcg 'J，......... cmcagcctttca tgatatatcl cccaalttgt£Cttgagtta agccgcgccg gccgactacc ttggtgatct cgcctttcac gcgcgaggcc aagcgatctt cttcitgtcc 一。---。一 -------- - -gggctgatac tgggccggca ggcgctccat tgcccagtcg gcagcgacat ccttcggcgc 3240gattttgccg gitactgcgc tgtaccaaat gcgggacaac gtaagcacta catltcgctc 3JUUatcgccagcc cagtcgggcg gcgagttcca tagcgttaag gttteattta gcgcctcaaa 3360tagatcctgt teaggaaeeg gatcaaagag ttcctccgcc gctggaccta ccaaggcaac 3420gctatgttct cttgcttttg tcagcaagal agccagatca atgtegateg tggctggcic 3480gaagalacct gcaagaatgt cattgcgctg ccattctcca aattgcagtt cgcgcttagc o540iggataacgc cacggaatga ίgtegtegig cacaacaatg gtgaetteta cagcgcggag 3600aatctcgctc tctccagggg aageegaagt ttccaaaagg tegttgatea aagctcgccg 3660cgttgtttea tcaagcctta cggtcaccgt aaccagcaaa tcaataicac tgtgtggctt 3/zucaggccgcca tccactgcgg agccgtacaa atgtaeggee ageaaegteg gttegagatg 3780gegetegatg acgccaacia cctcigatag ttgagtegat aetteggega icaccgcttc 3840cctcatgatg tttaaclltg itttagggcg actgccctgc tgcgtaacat cgttgctgct 3900ccataacatc aaacalcgac ccacggcgta acgcgcttgc tgcttggatg cccgaggcat 3960agactgtacc ccaaaaaaac agtcataaca agccatgaaa accgccactg cgccgttacc 4020accgctgcgt teggteaagg ttctggacca gttgegtgag cgcatacgct aettgeatta 4080cagcttacga accgaacagg cttatgtcca ctgggttcgt gccttcatcc gtttccacgg 4140igtgcgtcac ccggcaacct tgggcagcag egaagtegag gcatttctgt cctggctggc 4200gaaegagege aaggtttcgg tclccacgca tegteaggea ttggcggcct tgctgttctt 4260ctacggcaag gtgclgtgca cggaictgcc ctggcttcag gagateggaa gacctcggcc 4320

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.yggi.q …—Β-. ο。—。--- - *- -~ *C£ntccaaggalc gggccttgal gttacccgag agctiggcac ccagcctgcg 45όυtlcagccggt ttgccggctg aaagcgctat 4680 acgggaggcg tcactggctc ccgtgttgtc 4740

tgactgitga 4800 tttactggtt 4860 clgttcatgg 4920

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ttcttccaga attgccatga ttttttcccc ______ggcagctitg attegataag cagcatcgcc igtttcaggc tgtctatgtg gctgtaacaa gttgtctcag gtgttcaatt tcatgttcta gttgctttgttcacctgttc taitaggtgt tacatgcigt tcatctgtta cattgtcgat

149050-序列表.doc -28-

1434921

igaacagctt ccgttttcat ctacttttgi gatcct tccg tgagaacgaa actggtgagc laggtaggaa gttctcaagt atcagtcggg tttacttatt ggtttcaaaa aagcattaac atgaacttaa citttgtgtt agacttaaca latctcttca ctggaaaatc ctcictggit agcgtattgg ggggttgagt gcgactaatc gctagttcat gtctaggtga ttttaatcac __ccttttcctt tgagttgtgg gtatctgtaa attctgctag aaattctgct agaccctctg taaattccgc tagacctttg _ .____ ___tcaagtggtt ataatttata gaataaagaa agaataaaaa aagataaaaa gaatagatcc 6300 cagccctgtg tataactcac tactttagtc agttccgcag tattacaaaa ggatgtcgca 6360 aacgctgttt gctcctctac cgcaagctcg ggcaaatcgc gctgtctttt aatggcacta agcccgtcac llttlgctgt cgtgacaggt I ta

tgaatgcacc aaaaactcgt ctgtgcatat ligitagtct tat t tagcca ccaugagat tgaattttig tctgatgtaa tcggttacga cggcctcgct

aaaagctclg atgtatctat cttttttaca 4980 ccctttgata ctgatagata tagtgtggtt Itgcatgtca atcgtgtagt tattttgtca tctatctagt

agttctttia tgttccagat ctaaaaacta tcaaagccit gctttagcta ttataagtga agtgccacac

tcgtgacatt caggcgcct t gggcttctca tcagcagt tc cattcagact

<210> 20<211> 7687<212> NA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400〉 20clggcgtaat tggcgaatgg catatggtgc cccgccaaca cgattacttc caaittgtgt gtttggctgt aagcggcgtc cctttcacgt tcttgtccaa cgctccattg taccaaatgc gagltccata tcaaagagtt agcaagatag ttgcgctgcc tcgtcgigca gccgaagt tt gicaccgtaa ccgtacaaat tcigatagtt uagggcgac acggcgtaac tcataacaag ctggaccagt tatgtccact ggcagcagcg tccacgcatc gatctgccct ctgaccccgg gcccagct tc gatciggan gccttgatgt cgggtutgc

agcgaagagg cgcctgatgc actctcagta cccgctgacg gccaactatt agggctiatt gagcaattat ggcltgaacg agtggacaaa gataagcctg cccagtcggc gggacaacgt gcgttaaggt cctccgccgc ccagatcaat attctccaaa caacaatggt ccaaaaggtc ccagcaaatc gtacggccag gagtcgaiac tgccctgctg gcgcttgctg ccatgaaaac tgcgtgagcg gggttcgtgc aagtcgaggc gtcaggcatt ggcltcagga atgaagtggt tgtatggaac tcgatcacgg tacccgagag tgcccgcaaa

ggacagttit tgatgcllca gtatgtlctc caiacitact cagtlaaagc tggttgttgg gatccalttgtaicaaccac caatitcata cccattggtt aagcctttta aitcatcaag gctaatctct ataaccactc ataaatcctc latattttat gaattttttt attctaattt ttcgcttgag laaccaaagg attcctgattaiacaccata agcattitcc ctactgaigt acgataccgt ccgttctttc cttgtagggi agcataaaat tagcttggti tigctttgaa aacaactaat tataccaatt gagatgggct

tgtaacggtg aacagttgtt 5040 caagagccat 一

cgttgttttt ctcaaaaatt gttttlctta ccattcattt tcaacltgga ttgctgtaag aactcatggt ataittgcct atagagiatl aactggaaaa aacttggcat iccacagttc

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tcatgctccg tcagacatac agtcaatgat _acctttgctg gaaaacttgt 6180 tgtglttttl ttgtttatat 6240

aaaacagacc tgaatattcc cagttcgctg tlatggat tc gggcgtttta clgccctctg attt tccagt ggctaatgca cccaglaagg

6420ttaaaaccct aaaggcttaa gtagcaccct ttttgtctcc gaccatcagg cacclgagtc 6480 cgctcacggc atgcaaggaa tggcgggtct

tctggcagtg aatgggggta 6540 actacccata gctatgtggt ctgaccactt cagcggtatc

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6600 6660 6720 6780 6783

cccgcaccga ggtattttct caatctgctc agct tagtaa gcgataacaa atgcacgctt gtgcttagtg aatignaga ttcttccaac tctagctlca agcgacatcc aagcactaca ttcatltagc tggacctacc gtcgatcgtg t tgcagt teg gacttctaca gttgatcaaa aataicactg caacgtcggt tteggegate cgtaacatcg ettggatgee cgccactgcg catacgctac cttcatccgt atttctgtcc ggcggccttg gateggaaga tcgcatcctc gggcatgcgg cacgatcatc cttggcaccc cgggctgttc

tcgcccttcc ccttacgcat tgatgeegea agccctcgct gaaaaagcca aaaaataata catctaacgc catiatttgc tgatetgege agtatgaegg tteggegega tttcgclcat gccicaaata aaggcaacgc getggetega egettagetg gegeggagaa gctcgccgcg tgtggcttca ΐegagatggc accgcttccc ttgctgctcc cgaggcatag ccgttaccac ttgcattaca ttccacggtg tggctggcga ctgttctlet cctcggccgt ggttttcigg atcagtgagg gtgcgggagg agcctgcgcg tggtgttgct

caacagttgc ctgtgcggta tagttaagee agatittaat gcctttcatg aaagcagaci ttgagttaag cgactacctt gcgaggccaa getgataetg ttttgccggt cgccagccca gatcctgttc tatgttctct agatacctgc gataacgcca tctcgctctc ttgittcatc ggccgccatc gctcgatgac tcatgatgtt ataacatcaa actgtacccc cgctgcgttc gcttacgaac tgcgtcaccc acgagcgcaa acggcaaggt cgcggcgctt aaggegagea gtttgcaact gcaagggctc agcaggggaa agtttgttat

gcagcctgaa 60 tttcacaccg 120 agccccgaca 180 gcggatgttg 240 atatatctcc 300 tgaccigata 360 ccgcgccgcg 420 gglgatctcg 480 gegatettet 540 ggccggcagg 600 taetgegetg 660 gtcgggcggc 720 aggaaccgga 780 tgcttttgtc 840 aagaatglca 900 eggaatgatg 960 lecaggggaa 1020 aagccitacg 1080 cactgcggag 1140 gccaactacc 1200 taactttgtt 1260 acatcgaccc 1320 aaaaaaacag 1380 ggtcaaggtt 1440 cgaacaggct 1500 ggcaaccttg 1560 ggtttcggtc 1620 gctglgcacg 1680 gccggtggtg 1740 icgttigctc 1800 gegggicaag 1860 caaggatcgg 1920 Haattccca 1980 cagaatcgca 2040

149050-序列表.doc -29-

1434921

tgccatgat t 2100 tegataagea 2160 tgtctcaggt 2220 ttaggtgtta 2280 aatgcaccaa 2340 gtgcatatgg 2400 gt tagtet tg 2460

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agaacgaacc attgagatca 2580

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agagccataa gaacctcaga tccttccgla tttagccagt 2^20 tigtttttgc gtgagccatg agaacgaacc attgagatca 2580 caaaaatttt gcctcaaaac tggtgagctg aatttttgca 2640 ttttcttagt ccgttatgta ggtaggaatc tgatgtaatg 2700 attcattttt atctggttgt tctcaagttc ggttacgaga 2760

atcaacgtat cagtcgggcg gcctcgctta 2820ttattticaa gcattaacal gaadtaaat 2940 tgagtittct tttgtgttag "Μttttcaaaag acttaacatg taaggcaata tctcttcact tltgtccact ggaaaatctc

atgcttcact atgttctcta tacttacllt gttaaagcat gttgttggta ttttgtcacctccatttgtc tatctagttc icaaccacca atttcatatl cattggttaa gccttttaaa ctcatggtag tcatcaaggc taatctctat atttgccttg aaccactcat aaatcctcat tattttatga atttttttaa tctaattttl cgcttgagaa

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149050-序列表.doe -30-

1434921

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149050·序列表.doc -31 -

1434921

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tctttaclta ttggtttcaa aacccatigg 7380 ttagttctlt taataaccac 7500catgttccag attatatttt 7560cactaaaaac taaitciaal 7620

149050-序列表.doc -32-

1434921

ttitcgcug agaaettgge atagtttgtc cactggaaaa ictcaaagcc tttaaccaaa 7680ggattcctga ittccacagt tctcgtcatc agetetetgg ttgctttagc taatacacca 7740taagcattit ccctactgat gitcalcalc tgagegtatt ggttataagt gaacgatacc 7800gtccgttctt teettgtagg gttttcaatc gtggggttga gtagigccac acagcataaa 7860attagettgg titcatgctc cgttaagtca tagcgactaa icgctagttc atltgctttg 7920aaaacaacta attcagacat acatctcaat tggtclaggt gattttaatc actataccaa 7980tigagatggg etagteaatg ataattacta gtccttttcc tttgagttgt gggtatctgt- 8040aaattetget agacctttgc tggaaaaett gtaaaitcig ctagaccctc tgtaaaticc 8100gctagacctt tgtgtgttit ttttgtuat attcaagtgg ttataattta tagaataaag 8160aaagaataaa aaaagataaa aagaatagat cccagccctg tgtataactc actactttag 8220tcagttccgc agtattacaa aaggatgtcg caaacgctgtccttaaaacc etaaaggett ccttttgtct ccgaccatca tgcgctcacg gctctggcag teatgeaagg aaactaccca tatggcgggt etgetatgig tgattttcca gtctgaccac cacccagtaa ggcagcggta

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<400> 22 icgctgcgct eggitatcca aaggccagga gacgagcatc _agataccagg cgtttccccc tggaagctcc cttaccggat acctgtccgc ctttctccct cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta _ gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta latgtaggcg gtgctacaga acagtatitg gtatetgege tcttgalccg gcaaacaaac attaegegea gaaaaaaagg gctcaglgga acgaaaactc ttcacclaga tccttttaaa taaact tggt etatitegtt ggctiaccat gatttatcag ttatccgcct gttaaiagtt tgcgcaacgt _ ___ _ o o otttggtalgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagtlac atgatccccc "j 亠 tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg

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eggtegtteg getgeggega gcggtatcag cagaatcagg ggataaegea ggaaagaaca accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt acaaaaatcg acgcicaagt

ggcggtaata 60aggccagcaa 120 ccgcccccct 180 aggactataa 240

ctcactcaaa tgtgagcaaa tccataggct

cagaggtggc gaaacccgac ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 300 tcgggaagcg tggcgctttc teatagetea 360 gttcgctcca tccggtaact

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ctgacagt ta caiccatagt ciggccccag caataaacca ccatccagtc

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atgttgtgca aaaaagcggt gccgcagtgt teegtaagat atgcggcgac agaaetttaa ttaccgctgt tctu taett aagggaataa

1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980

cgttettegg ggcgaaaaci ctcaaggaic cccactcgtg cacccaactg atcttcagca gcaaaaacag atactcatac ageggataca ccccgaaaag 一— 一aataggcgta tcacgaggcc etticgtctc tgacacatgc agctcccgga gacggicaca 2040

gcttgtctgt aagcggalgc cgggagcaga caagcccgtc agggegegte agcgggtgti 2100 ggcgggtgtc ggggeigget taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac 2160 catagatetg gagctglaat ataaaaacct lettcaacta acggggcagg ttagtgacat iagaaaaeeg actglaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa gccagtcatt aggcctatct -------------------aacagaatga lltlcctgct cccagtaaat _tttgggaaac aatttccccg aaccattata aaactctttg aagteattet Itacaggagt atcaaaaatt gtaaccagti agggtaaaat tgtggttaia

tatcactcat gcttttctgt cgagtigctc aagtgctcat tgagatccag tcaccagcgtgggcgacacg gaaatgttga

tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt accattatta tcatgacatt aacctataaa gcgcgtttcg gtgatgaegg tgaaaacctc

gacaaitcct gaatagagit igiacctgta aagatagegg gtaataatgg gtagaaggta gaagtccaig gaataataga

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gaaggcaaaa tgccgcaaaa tcttcctitt tcaatattat tatttgaatg tatttagaaa tgccacctga cgtctaagaa

cataaacaat laaatatatl attactatta aagagaaaaa ___tttctctaca tcagaaaggt ataaatcata ccaaatacca gagaatgttt tagatacacc atcccaataa latcaccctt gtttcggiat caaataaiga

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2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700cctaactctc egtegetatt

gtcactaaga aaataaatgc 2760 aaaacactaa talcaatttc 2820 ttaaatatet cttttctctt 2880

149050-序列表,doe -33-

1434921

ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa tttttatcta 2940aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcaita gaatcaatcc ttttttaaaa 3000gtcaatatta ctgtaacata aaiatatatt ttaaaaatat cccactttat ccaattttcg 3060tttgttgaac taatgggtgc ittagugaa gaataaaaga cctatgcggl gtgaaatacc 3120gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa 3180ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatia cgccagctgg cgaaaggggg 3240atgtgctgca aggcgaltaa gttgggtaac gccagggt11 tcccagtcac gacgttgtaa 33UU

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________ _______ t ccaattttcg 3060gaataaaaga cctatgcggl gtgaaatacc 3120

aacgacggcc agtgccaagc cagactcgtg attttccaaa cctgtctata aaattcccga tattggttaa tcittgcttg gcgaatgttc aicttatttc tcccttttct gtaaagttta ttttlcagaa cacgataata tccattgttc tcacggaagc acaggaattt gccgggactc aggagcattt

39604020

laaaagcagc tcaagcacaa 4500

tttaaagaag acggtactgt aacagcaggg aatgcatcaa ccauaatga tggggcttct 4680 gctttgatta ttgcttcaca * ' altcgagaca gtgtggaagt gccattcaaa aactgttagc atcaacgaag catttgcagc gaaaaggtca gctcgtttat gcttctttat aaaaaaaaca gaaggccaga attgccaatc atatgattga itacatttaa caglggacga gttattgcgg ctttgagtaa

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-* 負ca* 瞬訪 “Η心tcz ccauaatga tggggcttct 4680 agaatatgcc gaagcacacg gtcttcctta tttagctatt 4740 cggtaltgat ccagcctata tgggaatttc gccgattaaa 4800 gcgcaatcaa cttactacgg aagaaattga tctgtatgaa 4860 aact.tcaatc giggtccaaa gagaactggc tttaccagag 4920 tggcggtalt tcattaggtc atgcgaltgg tgccacaggt 4980 aagttatcaa ttaaatcaaa aagaaaagaa atatggagtg 5040 tggctiagga ctcgctatgc tactagagag acctcagcaa 5100 tcaaatgagt cctgaggaac gcctggcttc tcttctiaal 5160 tacaaaaaaa gaatttgaaa atacggcttt atcttcgcag 5220 aaatcaaatc agtgaaacag aagtgccgat gggcgttggc 5280 aactgattat ttggtaccaa tggcgacaga agagccctca 5340

giiawgg eng'g tggtgcaaaa atagcacaag gatttaaaac agtgaatcaa 5400 caacgcttaa tgcgtggaca aatcgttttt tacgatgttg cagatcccga gtcattgatt 5460

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_ _ lagitttttt gtgccccctt attatattga tatgaeggea 6420etggetgaag ccagaaatgt agaccctgga ............atggcggtga acccaatcag ccaagatatt gtgacatttg cagccaatgc — ； _ 7 <Ann atcttgacca aagaagataa agaggccatt gatatggtga ttgtcgggac gagtccagt 6600 ategatgagt caaaagcggc cgcagttgtc ttacatcgll taatggggat 「肯宀

gctcgctctt tcgaaatcaa ggaagettgt tacggagcaa cagcaggctt aagaatcacg tagee11aca tccagataaa asagtettgg tegtagegge aaatatggct taaattetgg cggtgagcct acacaaggag ctggggcggt gttgctagtg aaccgcgcat 11tggettta aaagaggata atgtgatget atctatgact tttggcgtcc aacaggccac ccgtatccta tggtcgalgg aacgaaacct acatccaalc ttttgcccaa gtctgggatg aacataaaaa cttgattttg cagattatga tgctttagcg ttccatattc cttacacaaa aaageettat tagcaaaaat ctccgaccaa actgaagcag aacaggaacg cgttatgaag aaagtategt etatagtegt egegtaggaa tatctgggac tcatttccct tttagaaaat gcaacgactt ggtttattca gttatggttc tggtgctgtc gctgaatttt ggtlatcaaa atcatttaca aaaagaaact catttagcac -ο--»»- 了，宀二巾 ίλλπchtctatcg etgaatatga agccatgltt gcagaaaett tagacacaga cattgatcaa 7440aegttagaag atgaattaaa atataglatt tetgetattacgaaaciaaa aaaaaccggc cltggccccg ccggttttll

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___ _ ___ aattttagcc 7140 acltgtatac gggttcactt 7200 taaccgcagg caatcaaalt 7260 tcactggtga attagtagct 7320 tgctggataa tcggacagaa 7380ataataccgt tcgttcttat 7500 attatttttc ttcctccgca 7560

149050-序列表.doc -34-

1434921

igltcaatcc gciccataat egaeggatgg ctccctctga aaattttaac gagaaaegge 7620 _一 - acgtctcaat cgccgcttcc 7680

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gggttgaccc cggittccgg gcaitcgtaa tccigtgtga glgtaaagcc gcccgctttc cagtcgggaa ggggagaggc ggtttgcgta

ggctcagtcc cgtaacggcc aagtcctgaa tcagcicaat gccgiaacgg teggeggegi tcgggatccc cgggiaccga getegaatte aatigttatc cgctcacaat tccacacaac tggggtgcct aatgaglgag ctaactcaca

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<210> 23<211> 8000<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 23gtttgacagc ttatcatcga etgeaeggtg caccaatgct (etggegteaggaagcigtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taaltcgtgtgcactcccgt tetggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctgtgaaatgagc tgttgacaal taatcaiccg getegtataa tgtgtggaattaacaatttc acacaggaaa cagcgccgct gagaaaaagc gaagcggcaccaatttatca gacaatctgt aaaattaaag aggtatatat gagetcagga ggtaaaaaaa atiggaaaat acaacacaac ggaaatgttt ggtttgtcic gccgttattt gggaitgaga atatgtccca tacgaigcgc ettt ttclag gcaatgggct taaetgetga

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120180240300360

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960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 I860 1920 1980

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eggteggage cgatgaacca aaaaaaacat aiaigacggc ggcaagacca _____ccgcagaagc gatcltgacc 3060 ctgagtccag latcgatgag 3120 ttcaacctti cgcicgctct 3180 tscagttagc taagaatcac 3240 cagatattgc ttgcaatgtt tgacgcaaga gtcctttgtc

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149050-序列表.doc -35-

1434921

ttatctggga 3720 tggtttattc 3780 tggttalcaa 3840 actttctatc 3900 aacgttagaa 3960 tcgaaactaa 4020 aaacicatct 4080 gtttaaacgg 4140

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&二福二 m二毎=”財 agggtggcgg gcaggacgcc 4500 taagc agaaggccat cctgacggat ggcctttttg 4560

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5100 5160 5220 5280

gctgaatatg gatgaatlaa gagatctgca cagaagagga tctccagct t gaagatttie agcctgatac agattaaatc 4200

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3…g—_ aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatcccttaaegtgag ttttcgttcc aetgagegte agaccccgia gaaaagatca aaggatettettgagatcct ttttttctgc gegtaatetg etgettgeaa acaaaaaaac caccgctaccagcggtggtt tgtttgccgg aicaagagct accaactctt tttccgaagg taaetggett

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149050-序列表.doc -39-

1434921

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149050-序列表.doc -41 -

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149050-序列表.doc -42-

1434921

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6974

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<210>-27<211> 3913<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

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149050-序列表.doc -43 -

1434921

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<210> 28<211> 684S<212> DNA<213>人工序列

<22O><223>合成構築體

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149050-序列表.doe -44-

1434921

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6848

149050-序列表.doc -45-

1434921

<210> 29<211> 6647<212> DNA<213>人工序列

<220〉<223>合成構築體

aagggcgagc tcaacgatcc ggctgclaac aaagcccgaa aggaagetga gttggctgct 60 gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt ettgaggagt 20 tttttgctga aaggaggaac tatatccgga tatcccgcaa gaggcccggc agtaccggca 1»U

tatgcctaca gcatccaggg tgaeggigee gaggatgacg atgagcgcat 24V igLiagciiLi caiacacggt gcclgactgc gtlagcaatt- taaetgtgat aaactaccgc 300 atlaaagdt ategatgata agctgtcaaa catgagaalt aattcttgaa gaegaaaggg 3ou

. tgteatgata ataatggttt ettagaegte 420 aacccctatt tgtttatttt tctaaaiaca 480 accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 540 『—η一tctccggccg cttgggtgga 600 gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtglt 660 ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct 720

二二二翌記 gcgttccttg 780 tggetgetat tgggcgaagt S40

taaccaagcc tgLtagattt

cgcctatttt lalaggttaa tttcggggaa atgtgcgcgg tatccgctca tgagacaata atgattgaac aagatggatt ggctatgact gggcacaact gcgcaggggc gcccggt tct caggaegagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg

cgcagctgtg ctcgacgttg teaetgaage gggaagggac 启二七二僅'-------- „ηΛaccRKggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc 900Tgatgcaatg cggcggctgc ataegettga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc 960^aaacatcgc ategageggg cacglactcg gatggaagee ggtcttgtcg -tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc ageegaaetg ttcgccaggccatgcccgac ggegaggate tcglcglgac acatggcgat geetgettgcggtggaaaat ggeeget111 ctggattcat cgaclgtggc cggctgggtgctaicaggac atagegttgg ctacccgtga tat tgctgaa gagettggcgtgaccgcttc ctcgtgcttt aeggtatege cgctcccgat tcgcagcgcatcgccttctt gaegagttet tetgageggg actctggggt tegaaatgacacgcctaact gtcagaccaa ...................... tnat 1 f5tttaaittaa -aacgtgagtt ttcgttccac gagatccttt itttetgege cggtggUtg tttgeeggat gcagagcgca gataccaaat agaacictgt agcaccgcct ccagtggcga taagtegtgt cEcagcggtc gggctgaacg _ __ - - -acaccgaact gagataccta cagegtgage tatgagaaag cgccacgctt cccgaagggaEaaaggegga cagglatccg gtaageggea gggtcggaac aggagagege aegagggagettccaggggg aaacgcctgg tatetttala gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttgagegtegatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 2160eggeetttit acggiicctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt 2220tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctitga gtgagetgat accgctcgcc 2280gcagccgaac gaccgagcgc agegagteag tgagegagga ageggaagag 「ggiattttct ccttacgcat ctgtgcggtaaatctgctci gatgccgcat agttaagccagtcaiggctg cgccccgaca cccgccaacactcccggcat ccgcitacag r *tsaagegatt cacagatgtc tgccigttca tccgcgtcca getegttgag agegtiaatg tetggettet gataaagegg gccatgttaa gggcggtttt ——. gtcactgatg cciccgtgta agggggattt ctgttcatgg gggtaatgat accgatgaaa 2820 egagagagga tgctcacgat acgggttact gatgatgaac atgcccggtt aetggaaegt 2880 tgtgagggta aacaactggc ggtatggatg cggcgggacc agagaaaaat caatgccagc gcttegttaa tacagatgta ggtgttccac agggiagcca gegatgeaga teeggaaeal aalggtgcag Γ" * *gaaacacgga aaccgaagac **** cagtcgcttc acgttcgctcccaacictgc Ecgagatgcg ccgcgtgcgg ctgctggaga tggcggacgc gaiggaia僅既» lictgccaag ggttggtttg cgcattcaca gttctccgca agaattgatt ggctccaatt 3360 cttggagtgg tgaatccgtt agcgaggtgc cgccggcttc cattcaggtc gaggtggccc 3420 ppctccatec acceceacgc aacgcgggga ggcagacaag gtatagggcg gcgcctacaa 3480

tglccctgat 3600

cctcgtgata aggtggcact t tcaaatatg aaggaagagt gaggctaltc ccggctgtca gaalgaactg

gcacgcaggt

atcaggatga 1020 tcaaggcgcg 1080 cgaatatcat '* tggcggaccg gcgaatgggc tcgccttcta

__ _ cgaccaagcg云負“a gtttactcat atatactua gattgattta aaacttcatl

aaggatctag gtgaagatcc 111ttgalaa tctcatgacc aaaatccctt tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gtaatctgct gcitgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca actgiccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg citaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct

1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100

崩二二二二二翌 cgcctgatgc 2340 tttcacaccg caatggtgca ctctcagtac 2400gtatacacic cgctalcgct acgtgactgg 2460

wgu… cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 2520HicccgguaT ccgcitacag acaagctgig accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg 2580tittcaccgt catcaccgaa acgcgcgagg cagctgcggt aaagctcatc agcgtggtcg 2640b , — -* *----- - — tttctccaga 2700

ttcctgtttg 2760

cactcagggt 2940 p、___ _________ gcagcatcct 3000

ggcgctgact tccgcgtttc cagactttac 3060 caitcatgtt gttgctcagg tcgcagacgt ttigcagcag 3 20

_ gcgtaicggt gattcattct gctaaccagt aaggcaaccc 3180cgccalccta gccgggtcct caacgacagg agcacgatca tgcgcacccg tg?銘繁鷲莪常ccaacgctgc ccgagatgcg ccgcgtgcgg ctgctggaga tggcggacgc gatgeatatg 3300lictgccaag ggttggtttg cgcattcaca gttctccgca agaattgatt ggctccaatt 3360cttggagtgg tgaatccgtt agcgaggtgc cgccggcttc cattcaggtc gaggtggccc 3420ggctccatgc accgcgacgc aacgcgggga ggcagacaag gtatagggcg gcgcctacaa 3480(ccatgccaa cccgtlccat gtgctcgccg aggcggcata aatcgccgtg acgatcagcg 3540gtccaatgai cgaagttagg clggtaagag ccgcgagcga tccttgaagc tgtccctgat 360ggtcgtcatc tacctgcctg gacagcatgg cctgcaacgc gggcatcccg atgccgccgg 3660lagcgagaag aatcataatg gggaaggcca tccagcctcg cgtcgcgaac gccagcaaga 3720cgtagcccag cgcgtcggcc gccatgccgg cgataatggc ctgcttctcg ccgaaacgtl 3780tggtggcggg accagtgacg aaggcttgag cgagggcgig caagattccg aataccgcaa 38^gcgacaggcc gatcatcglc gcgctccagc gaaagcggtc ctcgccgaaa atgacccaga 3Wgcgctgccgg cacctgtcct acgagttgca tgataaagaa gacagtcata agtgcggcga 3960cgatagtcat gccccgcgcc caccggaagg agctgactgg gttgaaggct clcaagggca 4020

149050-序列表.doe -46 -

1434921

tcggtcgaga tcccggtgcc taatgagtga gctaacttac attaattgcg ttgcgctcac 4080 tgcccgcltt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 4140 cggggagagg cggtttgcgt ggcaacagct ctggtitgcc gagctgictt gactcgglaa gtgggaacga cagtcgcctt cccgtlccgc ccagccagac gcagacgcgc tgglgaccca atgcgaccag ataatactgt tgatgggtgt _caggcagctt ccacagcaat ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca 4800ctgacgcgtt gcgcgagaag attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac gccgcltcgt 4860tctaccatcg acaccaccac gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattl aatcgccgcg 4920acaatttgcg acggcgcgtg cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac 4980tgtttgcccg ccagttgttg tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc 5040gcttccactt '"' acggtctgat ttcaccaccc cgccat tcga gcagcccagt

attgggcgcc agggtggttt ttcitttcac cagtgagacg 4200gattgccctt caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg 4260 ccagcaggcg …一 一cggtatcgtc gtatcccact accgagatat ccgcaccaac gcgcagcccg 4380 tggcgcgcal · tgccctcatt

aaaatcctgt ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat 4320tgcgcccagc gccatctgat cgitggcaac cagcatcgca 4440 cagcattigc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc 4500 tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttaigccag 4560 cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc 4620 atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa 4680 ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg 4740

tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa 5100 ggcatactct gcgacatcgt ataacgttac tggtttcaca 5160 ctcttccggg cgctatcatg ccataccgcg aaaggttttg 5220

11 tcccgcgt aagagacacc tgaattgact _ _ _tggtgtccgg gatctcgacg ctctccctta tgcgactccl gcattaggaa 5280agtaggttga ggccgttgag caccgccgcc gcaaggaatg gtgcatgcaa 5340

ggagatggcg cccaacagtc ccccggccac ggggcctgcc accatacccaagcgctcatg agcccgaagt ggcgagcccg atcttcccca tcggtgatgtggcgccagca gatcgagatc aacaaltccc gttctcatca __ _ ____ .gggaictgla cgacgatgac gataaggatc alcccttcac catggtatcc cgggtaagat tiaccigitc gtgcggtgga aclgcglacc gccagaicgg ccgcaccggt agaaaatgcg caaatctatt cggtgggctc acgagctgtt aaat taaagt tggttaccat ataccggcgi gctacccgga aacaactggt gictcctgga cgccctgggc gtgcggcagg tgcgtttggc cgctgaccgc tccggaaaaa aagtgaciat cactaaaccg

accgcacctg tggcgccggt tcgatcccgc gaaattaala ctctagaaal aatlttgltt tcatcatcai catggtaigg

gatgccggcc acgatgcgtc cgactcacta taggggaati aactttaaga aggagatata ctagcatgac tggtggacag

cggtctgggt cggctttggc acagggtgcc cccggaacgt tttctcctcc tttgatcgaa tctgtctggc

ggtgaacacg ccgtagttta tggcgaaact cgtgttcgcg cggaaclcaa tgactctatc ctggatttcg cctaltaacg agcagcgcag ctcagcctgc gcgtccccaa cgcaaactga accaaagagt ccgctgatga gactacgcat gttaacatct gctaaaatca tgcaaccaag accgagcaag

<210> 30<211> 6957<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 30

cgccgaaaca 5400 cggcgatata 5460 cggcglagag 5520 gtgagcggai 5580 catatgcggg 5640 caaatgggtc 5700 tgttctgcgc 5760 gcaattgcgt 5820 aclaltcaga 5880 gcggtaattg 5940 tccgacatcc 6000 ggtgcgctga 6060 cacgaaatcg 6120 ttcggcggcg 6180

aaaagcaccc gtgttttctt ccgt tactat aagaaatcgc ccgatacgta _ __ _aaactccgga ctgcggcatt gtgatlggcg 6240 tagtagctaa cgtacgtcag ctgcgcgaaa 6300 cctctattgg caaaatctct ccatcggccg cctgaigaac tagaactgag ccagctgatc cgggcgctgg cggcggtggc _ tggcagaagc ggtagcaggc gctggcggia 6600 gtctgaaagt agattaa

ttatgtgtct gaccgtcgat cgcgtctatt taaactgggc tgtttctacc

cgtatcggcg 6360 gtcaaccagg 6420 tattccgctc 6480 tgtatggttg 6540

6647

iggcgaaigg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcggglgtgg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt citictcgcc acgttcgccg gcutccccg tcaagctcta aatcgggggc gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cltgallagg gtgatggttc 240 acgtagtggg ccatcgccct ctttaatagt ggactcttgt ttttgattta taagggattt acaaaaattt aacgcgaatt tcggggaaat gtgcgcggaa tccgctcatg aattaattct tcatatcagg attatcaata actcaccgag gcagttccat gtccaacatc aatcaccatg agacttgttc cgttattcat

aatacaacct agtgacgact aacaggccag tcgtgattgc gcctgagcga

aattacaaac aggaatcgaa ittcacctga iggtgagtaa taaattccgt ctttgccatg tcgcacctga

atcaggatat ccatgcatca cagccagttt tticagaaac ttgcccgaca

tggttacgcg 60 tcttcccttc 120 iccctttagg 180

gaiagacggt ttttcgccct ttgacgttgg aglccacgtt 300 tccaaactgg aacaacactc aaccclatct cggtciattc 360 tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420 ttaacaaaat attaacgttt __cccctatttg tttatttttc tagaaaaact ccatattttt aggatggcaa atiaatttcc gaatccggtg ccattacgct

acaaittcag gtggcacttt 480 taaatacati caaatgaaac tttctgtaat tcggtctgcg

caaatatgta 540 tgcaatttat 600 gaaggagaaa 660 attccgactc 720 tcaagtgaga 780 atitctttcc 840 tcaaccaaac 900 ttaaaaggac 960 tcaacaatat

catcgagcat gaaaaagccg gatcctggta cctcgtcaaa aataaggttaagaatggcaa aagtttatgc cgtcatcaaa atcactcgca gacgaaatac gcgatcgctg gcaggaacac tgccagcgca cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag

icaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca agtctgacca tctcatctgt aactctggcg catcgggctt ttatcgcgag cccatttata

tgcaaccggc tct tctaata

aacatcattg gcaacgctac cccatacaat cgatagatig cccatataaa tcagcatcca

102010801140120012601320

149050-序列表.doc -47-

1434921

二話肅=財 actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620tgtccttcta gtgtagccgt aguaggcca ccacttcaag 1680• 1740

1800 1860 1920 1980

ggataaggcg aacgacctac cgaagggaga gagggagctt ctgacttgag 2040 cagcaacgcg 2100 tcctgcgtta 2160

tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400acccsccacc acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580gtttctccag 2640 tttcctgttt 2700 taccgatgaa 2760 tactggaacg 2820 tcactcaggg 2880 agcagcaicc 2940 ccagacttta 3000 ttttgcagca 3060

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg cicataacac 1380cccttgtatt actglttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa I440cgtgagtttt cgtlccacig agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 560gtggtttgtt tgccggatca agagctacca ; *ΛΑΛagagcgcaga taccaaatac t.二二二-„ - - _ - — 一

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgccagtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacccagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcgaccgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcticcaaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcacccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt itcgccacctcgtcgatttt tgtgatgcic gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgcgcctttttac ggttcctggc ctlttgctgg ccttllgctc acatgttctt 一

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc Z22Uagccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt icacaccgca tatatggtgc actctcagta 234Ucaatctgctc tgatgccgca t..„. . „ ' *ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac gctcccggca tccgcttaca「 .丁二’

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag _ _ . gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agclcgttga aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt ggtcactgat gcctccgtgt aagggggati tctgttcatg ggggtaatga acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcaatgccag cgcttcglla atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc igcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgltgctcag gtcgcagacg ---- ~ gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag laaggcaacc 3120ccgccagccl agccgggicc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 31oUcatgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg 厂站般”睥貝巧zinggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagcgctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc財gligcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcalgc cccgcgccca

1 tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600citttcacca ……tgcagcaagc aacggcggga

cagtgacgaa 3240tcatcgtcgc 3300

gtggcgggac gacaggccga --- „ -gctgccggca cctgccctac 3360

tagtcalgc cccgcgccca 3420taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

glgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660 ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720 tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780 gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840 Q . , - 一 ΊTggcactcca gtcgccttcc cgticcgcta 3960

gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080 ccglcttcat gggagaaaat aatactgllg atgggtgtct 4140 aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200 laguaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 426° gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320 cgagaittaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380 acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agitgttgtg 4440 ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt Lcccgcgttt 4500

a與5我j tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560 gacatcgtat aacgitactg glttcacatt caccaccctg aattgactct 4620 uiaiCaiicc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680 ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800 catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860 ggtgalgtcg gcgalatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

g.ggga gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 50^tutgttiaa ctttaagaag gagatataca ' ……“cm*gictttcacc gaaactgaaa ccgaagcicgggactatgat tacctgctgt cctccgacacagcgaaaaag ctggaagccg aagttcglcggaccctgctg gaactgattg acaacgtccaigatatccgt ggtgcgctgg atcgcttcgtgacttccctg cacggtacgg「一

ttctcaggaa gcgttcagcg ggaagatatc aaagctatcc aaacatcctg gacgaggcga aaagatcggt aaagagctgg ccgtacicag cgtctggaag cagtatggtc gaatcaggtt ctgctggagc tggcaattct gcgtgatctg cgtgaaacgt cccgtiggtg cttigctcgt gaccgcctga ttgagagctt 一一 ——.........................

gcaatactcc gactgccgta sctccgtcgc aaaaatgttt tctttcgtaa ccattatcga

ccggaaggag ctgactgggt algagtgagc taacttacat cctgtcgtgc cagctgcatt tgggcgccag ggtggttttt ccgcctggcc clgagagagt aatcctgtit gatggtggtt atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc cgcccagcgc catctgatcg i… gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca

to*— ~-oo— - - -oa J J ~ -- --ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcaltea 3900

gwiiigy，與八“，、即孙財莓訖“ tggcactcca gtcgccttcc Cgticcgcta 3960 teggetgaat ttgattgega gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020 agacagaact 一……一gctccacgcc ggtcagagac catcctggtc igtgcaccgc tggcacccag gggccagact ccacgcggtt icgcagaaac gtggctggcc catactctgc l cttccgggcg ctatcatgcc tctcgacgct c--- 1 --■-„ccgttgagca ccgccgccgc ccggccacgg ggcctgccac cgagcccgat cttccccatc gegeeggtga tgccggccac

taatgggcccatcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200 atccagcgga cgctttacag ttgatcggcg ggaggtggca gggaatgtaa

cactgtctti gcttcaaaga tgagcctgia aggttttcgc cagaacaggt

(aigcgttgt agcgtglcca ccgaaaatgt 5100 tcgttctgcg aactacgaac ctaacagctg 5160 ggacgagtcc atcgaagtat acaaagacaa 5220 cgagattaat aacgaaaaag cagaatttct 5280 gcgcctgggc ctgggttacc gtttcgagtc 5340 ttcctccggc ggcttcgatg cggtaaccaa 5400 ccgtctgctg cgtcaacacg gttttgaggt 5460 ccaaaacggc aacttcctgg agaacctgaa 5520 cgaggccagc ticctggctc tggaaggcga 5580 aatctctcat ctgaaagaac tgtctgaaga 5640 gaaccalgca ctggaactgc cactgcatcg 5700 talcgaggcc taccgtaaaa aggaggacgc ‘&八

ggattacaac atgatccagt ctgtatacca gcgtcgtgtg ggtctggcga ccaaactgca ciactgggcc gtgggtgtag cattcgaacc

57605820588059406000

149050-序列表.doe -48-

1434921

actattaacg aaatcgccta ctgaccaaag cctgggctga aacaaatcta ctccgacctr ccgctgcaac tggtgltcgc

cgaactggag cigtttactg atgcagttga 6060 gccggattac atgaaactgt gctttciggc 6120 cgacaacclg aaagaiaaag gtgagaacat 6180 cctgtgcaac gctttcctgc aagaagccaa 6240 tgacgactac ttcggcaacg catggaaaic 6300 tlacttcgcl gtcgtgcaga acattaaaaa 6360 tgacaccatc tctcgtcctt cccataictt 6420 tgcggaaatt gcgcgtggtg aaaccgcaaa 6480 tatctccgaa gaactggcta ccgaaagcgt 6540

cgatatctac gatgtatacg gcsccctgga gcgt tgggac giaaacgcca tcaacgaccl tcigtataac cctgccgtat glggctgtac ctcttctggcggaagagatc gaaaacctgc aaaaaiacca ccgtctgtgc aatgacctgg ctagcgcgtc tagcgtitct tgttacaigc gcactaaagg _ _gatgaalctg atcgatgaaa cctggaaaaa gatgaacaag gaaaaaclgg gtggtagcct 6600 gitcgcgaaa ccgttcgtgg aaaccgcgai caacctggca cgtcaaictc actgcacila 6660 tcataacggc gacgcgcata cctciccgga tgagclgacc aatcacigaa agcttgcggc cccgaaagga gggccictaa

ccgattctgc cgtttgaacg ctaaggatcc cgcactcgag caccaccacc accaccactg agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg

cgcaaacgcg ttctgtctgt 6720 gaattcgagc iccgtcgaca 6780 agatccggct gctaacaaag 6840 ataactagca taaccccttg 6900 aggaactata tccggat 6957

<210> 31<211> 6957<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 31tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc cagcglgacc gctacacttg ccagcgccct ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg gttccgattt aglgctltac ggcacctcga acgtagtggg ccatcgcccl cutaatagt ggacicttgi __ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg acaaaaattl aacgcgaatt _tcggggaaat gtgcgcggaa cccciatttg tttatttttc tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa „ cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca ittcacctga ...............tggtgagtaa taaattccgt ctttgccatg tcgcacctga tgttggaatt cccttgtatt cgtgagtttl gatcctitti gtggtttgit agagcgcaga aactctgtag caccgcciac agtggcgata agtcgtgtct

gatagacggt tccaaactgg

attaagcgcg gcgggtgtgg tggtiacgcg 60 agcgcccgct tcaagctcta ccccaaaaaa ttttcgccct aacaacactc

tlaacaaaat attaacgttt

atcaggatat ccatgcatca cagccagtti11 tcagaaac ttgcccgaca taatcgcggc actgt ttatg cgttccactg agcgtcagac ttctgcgcgt tgccggatca taccaaatac

tcttcccttc 120 tccctt tagg 180 gtgatggttc 240 agtccacgtt 300 cggtctaitc 360

cctttcgctt aatcgggggc cttgattagg ttgacgttgg aaccciatct ttaaaaaatg agctgattta 420 acaatucag gtggcacttt 480 taaatacatt -tttctgtaataataaggtta aagtttatgc atcactcgca

caaatatgta 540 tgcaatttat 600 gaaggagaaa 660 attccgaclc 720 tcaagtgaga 780 atttctttcc 840 tcaaccaaac 900 ttaaaaggac 960 tcaacaatat gggatcgcagtcttctaata cctggaatgc tgttttcccg ___ _ _

tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca agictgacca tctcaictgt aacatcattg gcaacgctac aactctggcg catcgggctt cccatacaal cgatagattg ttatcgcgag cccatttata ctagagcaag acgtttcccg taagcagaca gttttat tgt

cccgtagaaa t tgcaaacaa actcttutc

cccatataaa tcagcatcca ttgaatatgg icatgaccaa agatcaaagg aaaaaccacc cgaaggtaac agttaggcca tgttaccagt

1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 I860 1920 1980

ctcataacac aatcccttaa atcttcttga gctaccagcg Iggcttcagc ccacttcaag ggctgctgcc ggataaggcg aacgacciac cgaagggaga gagggagctlctgacttgag 2040 cagcaacgcg 2100 tcclgcgtta 2160 cgctcgccgc 2220 cctgaigcgg 2280 actctcagta 2340 tacgigactg 2400

aatctgctgc agagctacca tgtccttcta gtgtagccgi atacctcgct ctgclaatcc _taccgggttg gactcaagac gatagttacc

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg accgaaciga ----------- ‘aaggcggaca ccagggggaa cgtcgatttt gcctttttac icccctgatt agccgaacga _ _ __ _ __ ____lattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc _ ___ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gaccglclcc gggagctgca tgtgtcagag 2520 scagctgcgg taaagctcat atccgcgtcc agctcgttga ggccatgtta agggcggttt tcigttcatg ggggtaatga tgatgatgaa catgcccggt

gatacctaca gcgtgagcta ggtatccggt acgcctggta tgtgatgctc ggttcctggc ctgtggataa ccgagcgcag

tgagaaagcg ccacgcttcc glcggaacag gagagcgcac cctgtcgggt ttcgccacct cggagcctal ggaaaaacgc ccttttgcic acatgttctt

aagcggcagg tctttatagt gtcagggggg cttttgctgg ccgtaitacc gcctttgagt gagctgatac cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg

gctcccggca tccgctiaca gt 11 tcaccg tcatcaccga gtgaagcgat tcacagatgt aagcgitaat gtctggcttc ggtcactgat gcctccgtgt acgagagagg atgctcacga iigtgagggt aaacaacigg tcaatgccag cgcttcgtta tgcgatgcag atccggaaca

gacaagctgt aacgcgcgag ctgcctgttc tgataaagcg aagggggatt tacgggttac cggtatggai gcggcgggac cagagaaaaa atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt

cagcgtggtc 2580 gtttctccag 2640 tttccrgttt 2700 taccgatgaa 2760 tactggaacg 2820 tcactcaggg 2880 agcagcatcc 2940 ccagacttla 3000

149050-序列表.doc -49-

1434921

ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360tgcggcgacg atagteatge cccgcgccca 3420caagggcatc ggtegagate ccggtgccta 3480gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

cgaaacacgg aaaccgaaga gcagtcgctt(. ； _ ccgccagcct agccgggtcc catgccggcg 一 一

ggcttgagcg agggegtgea gctccagcga aagcggtcct gagttgcatg ataaagaaga ccggaaggag ctgactgggt atgagtgagc taacttacat cctgtcgtgc cagclgcatt tgggcgccag ggtggttttt ccgcctggcc etgagagagt aatcctgitt gatggtggtt aacggcggga atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc —-cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatggcalttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960teggetgaat ttgattgega gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4υδυgctccacgcc cagtcgcgta ccgtcltcat gggagaaaat aatactgttg atggglgtct 414Qggtcagagac alcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 420Qcatcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gegagaagat 426Uigtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc ' tggcacccag ttgatcggcg egagatttaa tcgccgcgac gggecagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac caiactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg tctcgacgct clcccttatg …——… ccgttgagca ccgccgccgc ccggccacgg ggcctgccac cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg

cacgttcgct egegtategg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120 tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240 agattccgaa egeegaaaat cagtcaiaag tgaaggetet taattgegtt aalgaategg

cttttcacca ----- =--= 〜tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc ageaggegaa 3720

tataacatga getgtetteg gtategtegt 3780 gcagcccgga ctcggtaatg “小gcgcgcattg 3840

ccctcattca 3900

cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200taccatcgac accaccacgc 4320 aatttgcgac ggegegtgea 4380 tttgcccgcc agttgttgtg 4440 ttccacttti icccgcgttt 4500 ggtetgataa gagacaccgg 4560 caccaccctg aaltgactct 4620

___ _ ___a” ccattcgatg gtgiccggga 4680 cgactcctgc_ attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740aaggaatggt gcatgcaagg agatggegee caacagtccc 4800catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

沖啓氏心…f 竇gegatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920gegeeggtga tgccggccac gatgegteeg gegtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

αυιναι-iaia 茹盆心：El gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040……___ etttaagaag gagatataca tatgcgttgl agcgtgtcca ccgaaaatgt 5100gtctttcacc gaaaetgaaa ccgaaacgcg tcgttctgcg aactacgaac 丄

ggactatgat tacctgctgt cctccgacac ggacgagtcc atcgaagtalagegaaaaag etggaageeg aagttcgtcg egagattaat aacgaaaaag _ 一

--■* acaacgtcca gcgcctgggc ctgggttacc gtttcgagtc 5340aicgcttcgt ttcctccggc ggcttcgatg cggtaaccaa 5400

g心林y心我 cacigtcttt ccgtctgctg cgtcaacacg gttttgaggt 5460ttctcagsaa gegtteageg gcttcaaaga ccaaaacggc aactteetga aaaacctgaa j

- ------------ ttcctggctcctgaaagaac

aattaatacg ttttgtttaa

actcactala ggggaattgt gagcggataa caattcccct

cgcacctgtg 4920ctagaaataa 5040ctaacagctg 5160 acaaagacaa 5220 cagaatttct 5280

gaccctgccg gaactgattg tgatatccgt cgtgcgctgg gacttccctg cacgcgacgg

cgaggccagc aatctctcat gaaccatgca ctggaactgc tatcgaggcc ggattacaac

tggaaggcga 5580 tgtctgaaga 5640 cactgcatcg 5700 aggaggacgc 5760 ctgtatacca 5820 ccaaactgca ”

ggaagatatc aaagctatcc tgagcctgta aaacatcctg gacgaggcga aggttttcgc aaagatcggt aaagatctgg cagaacaggt ccgtactcag cglctggaag cagtatggtc ggatcaggtt ctgctggagc tggcaattct gcgtgatctg cgtgaaacgt cccgttggtg gcgtcgtgtg ctttgctcgt gaccgcctga ttgagagctt ctactgggcc ------ -gcaatactcc gaclgccgta actccgtcgc aaaaatgttt tctttcgtaa ccattatcga cgatatctac gatgtatacg gcaccctgga cgaactggag ctgtttactg acgcagttga gegttgggac gtaaacgcca icgacgatct gccggatlac algaaactgt gelttetggc tciotataac actattaacg aaalcgccta cgacaacctg aaagataaag gigagaacat cctgccgiat ctgaccaaag cctgggctga cctglgcaac gctltcctgc aagaagccaa ο24ϋ giggetgtac aacaaatcta ctccgacctt ctcttctggc ccgctgcaac 1 ggaagagatc gataacctgc ccgtctgtgc aatgacctgg tagcgtttct tgttacatgc gatgaatetg ategatgaaa gttcgcgaaa ccgttcgtgg aaaccgcgat teataaegge gacgcgcata ccictccgga -------- ------------ - ， -aatcaclgaa ccgattctgc cgtttgaacg ctaaggatcc gaattegage tccgtcgaca o7o0 agcttgcggc cgcactcgag caccaccacc a--------- « ------ 了 二［二三 Αοηηcccgaaagga agctgagttg gctgclgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg 6900 gggcctctaa aegggtettg aggggttttt tgetgaaagg aggaactata teeggat 693/

taccgtaaaa atgatccagt ggtctggcga gtgggtgtag cattcgaacc

588059406000606061206180

tSgtgttcgc aaaaatacca ctagcgcgtc gcactaaagg cctggaaaaa

tgacgaatac ttcggcaacg catggaaatc 6300 ttacttcgct gtcgtgcaga acattaaaaa 6360 tgacatcatc tctcgtcctt cccatatctt 6420 tgcggaaatt gcgcgtggtg aaaccgcaaa 6480 tatctccgaa gaactggcta ccgaaagcgt 6540 gatgaacaag gaaaaactgg gtggtagcct 6600 caacctggca cgtcaatctc actgcactta 6660 tgagctgacc cgcaaacgcg ttctgtctgt 6720accaccactg agatccggct gctaacaaag 6840

<21O> 32<211〉 6957<212> 叫<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 32

149050-序列表.doe -50-

1434921

tggcgaatgg gacgcgccct gtageggege attaagegeg gcgggtgtgg tggttacgcg 60 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct _ ―ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg teaageteta aatcgggggc tccctttagg 180 gilccgattt agtgcttiac ggcacctcga ccccaaaaaa ettgattagg gtgatggttc 240 acgtagtggg ccatcgccct cttiaatagt ggaclcltgt ttttgattta taagggatti acaaaaaitt aaegegaatt leggggaaat gtgcgcggaa tccgctcatg aallaaitct tcatatcagg altalcaata actcaccgag gcagttccat gtccaacatc aatacaacct aatcaccatg agtgacgact agacttgttc aacaggccag cgttattcat tcgtgaitgc aattacaaac aggaategaa tttcacctga atcaggatat tggtgaglaa ccatgcatca taaattccgt cagccagttt cittgccatg tttcagaaac tcgcacctga ttgcccgaca tgttggaatt cccttgtatt cgigagtttt gatccttttt gtggtitgtt agagcgcaga aactctgtag agtggcgata agtcglgtct cagcggtcgg getgaaeggg gggttcgtgc accgaactga gatacctaca gcgtgagcta aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg ccagggggaa cgtcgatttt gccittttac tcccctgatt ageegaaega tattttctcc ___caatctgctc tgatgeegea tagttaagee agtatacact ccgctatcgc taegtgaetg 2400 gglcatggct ------------ ------------ ■_ _ ----gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagetgea tgtgtcagag 2520 gttttcaccg tcatcaccga aaegegegag gcagctgcgg taaagctcat cagegtggte 2580 gtgaagegat ------------ ---------- ----aagcgttaat ggteaetgat aegagagagg ttgtgagggt

cctitcgctt tcttcccttc 120

ttgacgttgg agtccacglt 300gatagaeggt ttttcgccct _tccaaactgg aacaacactc aaccctatci eggtetatte 360 tgccgatttc ggcctaitgg tlaaaaaalg agctgallta 420 t taacaaaat _cccctatttg tagaaaaact ccatattttt aggatggcaa at taatttcc gaatccggtg ccatlacgct geetgagega tgcaaccggc tettetaata tcaggagtac agtctgacca aactctggcg ttategegag ctagagcaag acgtttcccg taagcagaca gttttattgt

attaacgtit acaatttcag giggcactlt 480 ittatttlie taaatacatt caaatatgta 540 catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600 gaaaaageeg lltctgtaat gaaggagaaa 660 gatcctggta teggtetgeg attccgactc 720 cctcgtcaaa aataaggita ―agaatggcaa aagtttatgc cgtcatcaaa atcactcgca gacgaaatac gegategetg gcaggaacac tgccagcgca cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080 ggaiaaaatg ettgatggte ggaagaggca tctcatctgt catcgggctt cccatttata

tcaagtgaga 780 atttctttcc 840 tcaaccaaac 900 ttaaaaggac 960 tcaacaatat 1020

1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920

_ - __ 1980 ttcgccacct ctgacttgag 2040 ggaaaaaege cagcaacgcg 2100 acatgttctt teetgegtta 2160 gagctgatac cgctcgccgc 2220 cggaagagcg cclgalgcgg 2280 tatalggtgc actctcagta 2340

aacatcattg gcaacgctac cccatacaat cgatagattg cccatataaa tcagcatcca ttgaatatgg ctcataacac tcatgaccaa aatcccttaa

taategegge actgtttatg cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atettettga ttctgcgcgt tgccggatca taccaaatac caccgcctac

aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg agagctacca tgtccttcta atacctcgct taccgggttg

acgcctggta tctttatagt tgtgatgctc ggticctggc ctgtggalaa ccgagcgcag

gtcagggggg cttt tgctgg ccgtattacc gcctttgagt cgagtcagtg agcgaggaag

ttacgcatcl gigcggtatt tcacaccgca

aclctitttc cgaaggtaac tggcttcagc gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc gactcaagac gatagttacc ggataaggcg acacagccca gcttggagcg aacgacctac tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga gtcggaacag gagagcgcac gagggagclt cctgtcgggt cggagcctat ccttttgctc

gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

tcacagatgt gtciggctic gcctccgtgt atgctcacga

ctgcctgttc atccgcgtcc tgaiaaagcg ggccatgtta aagggggatt tctgttcatg tacgggttac tgatgaigaa

aaacaactgg eggtatggat tcaatgccag cgcttcgita atacagatgt tgcgatgcag atccggaaca taatggtgea cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt gcagtcgctt cacgttcgct egegtategg _ ccgccagcct agccgggicc tcaacgacag gagcacgatc catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaaegtitg ggcttgagcg agggegtgea agattccgaa gctccagcga aagcggtcct egeegaaaat gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag ceggaaggag ctgactgggt atgagtgagc taactiacat cctgtcglgc cagctgcatt tgggcgccag ggtggttitt ccgcctggcc etgagagagt aatcctgtit gatggtggtt atcccactac cgagatalcc cgcccagcgc catctgatcg

ggtttgtiga aaaccggaca ttgattgega taatgggccc cagtcgcgta atcaagaaat atccagcgga cgct ttacag get tegaege ttgatcggcg egagatttaa tcgccgcgac

acgccaatca gcaacgactg ttcagctccg ccatcgccgc tggttcacca cgcgggaaac aacgttactg gtttcacatt ataccgcgaa aggttttgcg

gcattlgcat tcggctgaat agacagaact gciccacgcc ggicagagac catcctggrc tgtgcaccgc tggcacccag gggccagact ggaggiggca ccacgcggtt gggaatgiaa icgcagaaac gtggclggcc catactctgc gacatcgtat cttccgggcg ctatcatgcc

gcggcgggac aggtgttcca gggcgctgac tgttgctcag tgattcattc

taccgcaagc gacccagagc tgcggcgacg caagggcatc

agctcgttga gtttctccag 2640 agggcggttl ggggtaatga catgcccggt cagagaaaaa __cagggtagcc agcagcatcc 2940 ttccgcgttt ccagacttta 3000 gtcgcagacg ttttgcagca 3060 tgctaaccag taaggcaacc 3120 atgcgcaccc gtggggccgc 3180 gtggcgggac cagtgacgaa 3240 gacaggccga tcatcgtcgc 3300 gcigccggca cctgtcctac 3360 atagtcatgc cccgcgccca 3420 ggtcgagatc ccggigccta 3480

tttcctgttt 2700 taccgatgaa 2760 tactggaacg 2820 tcactcaggg 2880

tgaaggetet __ ___taattgegit gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540 aatgaategg ccaacgcgcg gggagaggcg glligcgiai 3600 cttttcaccatgcagcaagc aacggcggga gcaccaacgc ttggcaaccagigagatatt gctaacagcg ccgtcttcat aacgccggaa tagttaatga

gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660 ggtccacgct talaacatga gcagcccgga gcatcgcagt tggcactcca tatgccagcc cgattigctg gggagaaaat cattagtgca tcagcccact cgcttcgttc

ggtttgcccc agcaggcgaa 3720 gctgtctt'cg gtatcgtcgt 3780 ctcgglaatg gcgcgcattg 3840 gggaacgatg ccctcaitca 3900 gtcgccttcc cgttccgcta 3960 agccagacgc agacgcgccg 4020 gtgacccaat gcgaccagat 4080 aatactgtig atgggtgtci 4140 ggcagcttcc acagcaaigg 4200 gacgcgttgc gcgagaagat 4260 taccatcgac accaccacgc 4320 aaittgcgac ggcgcgtgca 4380 tttgcccgcc agttgttgtg 4440 ttccactttt tcccgcgttt 4500 ggtctgataa gagacaccgg 4560 caccaccctg aattgactct 4620 ccattcgatg gtgtccggga 4680

149050-序列表.doc -51 -

1434921

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt ccggccacgg ggcctgccac catacccacg cgagcccgat cttccccatc gglgalgtcg gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg aat taatacg actcactata ggggaattgtttttgtttaa gtctttctct ggactatgai agcgaaaaag gaccctgctg tgalatccgt gacttccctg itctcaggaa ggaagatatc aaacatcctg aaagatcggt ccgtactcag gaaccaggt t gcgtgatctg cittgctcgt gcaatactcc cgatatctac gcgttgggac tctgtataac cctgccglat gtggctgtac ctct tclggc ggaagagatc ccgtctgigc tagcgtttct gatgaatctg gttcgcgaaa tcataacggc aatcactgaa agcitgcggc cccgaaagga gggcctctaa

ctttaagaag gaaactgaaa tacctgctgt ctggaagccg gaactgattg cgtgcgctgg cacggtacgg gcgttcagcg aaagctalcc gacgaggcga aaagagctgg cgtctggaag ctgclggagc cgtgaaacgt gaccgcctga gactgccgta gatgtatacg gtaaacgcca actattaacg ctgaccaaag aacaaatcta ccgctgcaac gaaaacctgc aatgacctgg tgttacatgc atcgatgaaa ccgttcgtgg gacgcgcata ccgattctgc cgcactcgag agctgagttg acgggtcttg

gagatataca ccgaaacgcg cctccgacac aagttcgtcg acaacgtcca atcgcttcgt cactgtctlt gcttcaaaga tgagcctgia aggttttcgc cagaacaggt cagtatggtc tggcaattct cccgttggtg trgagagctt actccgtcgc gcaccctgga tcaacgacct aaatcgccta cctgggctga ctccgacctt tgatcttcgc aaaaaiacca ctagcgcgtc gcactaaagg cctggaaaaa aaaccgcgat cctctccgga cgtttgaacg caccaccacc gctgctgcca aggggttttt

<2l0> 33<211a 560<212> PRT<2J3>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 33 Met Arg Cys

1Thr Glu ThrAsp Tyr Leu

35 Asp Lys Ala

50Glu Lys Ala65Arg Leu GlyAsp Arg PheLeu His Gly

115Glu Vai Ser

130Phe Leu Glu145Glu Ala SerLys Vai Phe

y

s

1»

i

G

H

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1 9 Γ

Gia

s 0OO

y ΓI

L A2

taggttgagg 4740 caacagtccc 4800 cccgaagtgg 4860 cgcacctgtg 4920 galcccgcga 4980 ctagaaataa 5040 ccgaaaatgt 5100 ctaacagctg 5160

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1434921

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149050-序列表.doc -53-

1434921

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6966

<210> 36<211> 5679<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 36aagggcgaat aetgeagata tccatcacac tggcggccgc tcgagcatgc atetagaggg 60

149050-序列表.doe -56-

1434921

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149050-序列表.doc -57-

1434921

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1434921

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3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080

atgatcgtgc cagaatgaat acctgagcaa aaglcagcgc tgtggaacac tggtcccgcc tgttcatcat cccatgaacacttaacatgg 4140 ctggacgcgg 4200 taccgcagct 4260 ccggagacgg 4320 gcgtcagcgg 4380 ggagtgtata 4440 latgcggtgt 4500 cgcttcctcg 4560 tcactcaaag 4620 gtgagcaaaa ccataggcic aaacccgaca tcctgttccg

4680474048004860

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6720678068406900

<210> 38<211> 1719<212> DNA<213>人工序列

<22Ο><223>合成構築體

149050-序列表.doc -59-

1434921

<400> 38 gaattcaaaa cgticagcta gatttgaaag atgataaaca agsctgggll cttciagalg aaaacaagaa tigclgagac i--- “gagggaggat __gccagttatt tggggtttga aggggaaaat ctactagagg aggccagaac acccatctga agaataactt gaaagaaggc 3二二：二二二二笔二f - catgcattgg aattgcccta ccaccaaaga cttcatagac ttgaagccag aiggtttttg ooUgacaagtatg aaccaaagga gcctcaccat caacttttat tggaattagc aaaactggat 720tttaacatgg ttcagacatt acaccagaaa gaattgcagg acctatcaag atggtggacg 780gagatgggti tagccagcaa t- _ - _ 1 了…了一 .......tgggcactgg gaatggcacc agaicctcaa tttggtgaat gtagaaaggcatgtttggtc tagtaacaat cattgatgat gtttatgatg tgtacggaacttacaactat icaccgacgc gattatatga agclgtgttt attttaaagg agaaagggca tgcaaagcat tccttcaaga aagtatcttg aaaacgcttc ttttccgtct gccagcagca tttcategtc tagteagate ctcttgcgtg tcagccgcag agttagagag gggtgaaacc aatgatggaa catccgaaga acaagcccgt tggaagaaga tgaaiagaga gagatagetg itaacatggc ggaaggcccg actacgccac aitaaccagl taatgtaegt

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1620 1680 1719

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<210> 39<211> 7658<212><213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 39 acggattaga cctcgtcttc acaataaaga ctggccccac ttagtttttt taacagatat ggtttgtatt ctctatactt gactcactat caaaatgtgt agctaactac gaaagtggaa aaacagagta gggtttaaca agatgaaaac gagacaacat aggattctca __ttattigggg tttgaagggg aaaaictact tctgaagaat aacttgaaag aaggcalcaa attggaaiig ccctaccacc aaagacttca gtatgaacca aaggagcctc accatcaact catggttcag acattacacc agaaagaatt gggtttagcc agcaagttag atttcgttag actgggaatg gcaccagaic ctcaaittgg tggtctagta acaatcattg atgatgttta actattcacc gacgcagttg aacgttggga tatgaagctg aaaggagaaa agcattcctt

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_______ ____________________ _ _ 2160 atagaattaa acigctactg aligatccti tccccattaa 2220 agggatccga attcacccag c11tcttgta caaagiggit 2280

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149050-序列表.doe -60-

1434921

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149050-序列表.doc -61 -

1434921

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<210> 40<211> 1746<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

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<210> 41<211> 4768<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

wbb— ctcacgcgct cctgcggcgg 60cctgtagggc aggctcatac ccctgccgaa ccgcttttgt cagccggtcg gccacggctt 120<400> 41 ctcgggccgt cicttgggct tgatcggcct tcttgcgcat cctgtagggc aggctcatac ccctgccgaa c二具 ---- - .onccfigcgtctc aacgcgct11 gagattccca gc111tcggc caatccctgc ggtgcatagg ?§乂cgcgtggctc gaccgcttgc gggctgatgg tgacgtggcc cactggtggc cgctccaggg 240cctcgtagaa cgcctgaatg cgcgtgtgac gigccitgct gccctcgatg ccccgttgca 300gccctagatc ggccacagcg gccgcaaacg tggtctgglc gcgggtcatc tgcgcltlgt 360tgccgatgaa ctccttggcc gacagcctgc cgtcctgcgt cagcggcacc acgaacgcgg 420tcatgtgcgg gctggtitcg tcacggtgga tgctggccgt cacgatgcga tccgccccgt 480act tgtccgc cagccacttg tgcgcctlet egaagaaege cgccigctgt lettggctgg 540ccgacttcca ccattccggg ctggccgtca tgacgtactc gaccgccaac acagcgtcct 600tgcgccgctt ctctggcagc aactcgcgca gtcggcccat cgcttcatcg gtgctgctgg ooOccgcccagtg ctcgttctct ggcgtcctgc tggegteage gttgggcglcggtaggcgtg ettgagaetg gccgccacgt tgcccatttt cgccagctict&atcgcgta tgccgccatg cctgcccctc cct11iggtg tccaaccggc

tcgcgctcgc 720 ttgcatcgca 780 tcgacggggg 840

149050-序列表.doc -62-

1434921

cagcgcaagg cggtgcctcc ggcgggccac tcaatgcttg agtatactca ctagactttg 900cttcgcaaag tcgtgaccgc ctacggcggc tgcggcgccc tacgggcttg ctctccgggc 960ttcgccctgc gcggtcgctg cgctccctig ccagcccgtg gatatgtgga cgatggccgc 1020gagcggccac cggctggctc gcttcgctcg gcccgtggac aaccctgctg gacaagctga 1080tggacaggct gcgcctgccc acgagctiga ccacagggat tgcccaccgg ctacccagcc 1140ttcgaccaca tacccaccgg ctccaactgc gcggcctgcg gccttgcccc atcaattttt 1200uaattttct ctggggaaaa gcctccggcc tgcggcctgc gcgcttcgct igccggttgg 1260acaccaagtg gaaggcgggt caaggctcgc gcagcgaccg cgcagcggct tggccttgac ----gcgcciggaa cgacccaagc ctatgcgagt gggggcagtc gaaggcgaag cccgcccgcc tgccccccga gcctcacggc ggcgagtgcg ggggttccaa gggggcagcg ccaccttggg caaggccgaa ggccgcgcag tcgatcaaca agccccggag gggccacttt ttgccggagg gggagccgcg ccgaaggcgt gggggaaccc cgcaggggtg cccttctttg ggcaccaaag aactagatat agggcgaaat gcgaaagact taaaaatcaa caacttaaaa aaggggggta cgcaacagct cattgcggca ccccccgcaa tagctcattg cgtaggttaa agaaaatclg taattgactg ccacttltac gcaacgcata aligtigtcg cgctgccgaa aagttgcagc igattgcgca tggtgccgca accgtgcggc accciaccgc atggagalaa gcatggccac gcagtccaga gaaatcggca ttcaagccaa gaacaagccc ggtcactggg tgcaaacgga acgcaaagcg catgaggcgt gggccgggct taitgcgagg aaacccacgg cggcaatgct gctgcatcac clcgtggcgc agatgggcca ccagaacgcc gtggtggtca gccagaagac actttccaag ctcatcggac gttctttgcg gacggtccaa tacgcagtca aggacttggt___ggccgagcgc iggatctccg tcgtgaagct caacggcccc ggcaccgtgt cggcctacgt 2Ϊ00ggtcaatgac cgcgtggcgt ggggccagcc ccgcgaccag ttgcgcctgt cggtgttcag 2160tgccgccgtg gtggttgatc acgacgacca ggacgaatcg ctgttggggc atggcgacct 2220gcgccgcatc ccgaccctgt atccgggcga gcagcaacta ccgaccggcc ccggcgagga 2280gccgcccagc cagcccggca ttccgogCat ggaaccagac ctgccagcci tgaccgaaac 2340ggaggaatgg gaacggcgcg ggcagcagcg cctgccgatg cccgatgagc cgigtittct 2400ggacgatggc gagccgttgg agccgccgac acgggtcacg cigccgcgcc ggtagcactt 2460gggttgcgca ------------------------ - ，ccctatacct cctgaatgga ggcagaataa gcctcaggca ccagcaatag acataagcgg ctatt taacg tttgctticg aatttctgcc attcatccgc gcgtttaagg gcaccaataa agtcggccta ttggttaaaa aaatattaac gcttacaatt aicggtgcgg gcctcttcgc

1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040

gcaacccgta agtgcgctgt tccagactat cggctgtagc cgcctcgccg 2520 tgtctgcctc cccgcgttgc gtcgcggtgc atggagccgg gccacctcga 2580 agccggcggc acctcgctaa cggattcacc gtttttatca ggctctggga 2640 atgatcatat cgtcaattat ----- ---- tttgagaagc acacggtcac

tacctccacg gggagagcct gagcaaactg 2700 acigcttccg gtagtcaata aaccggiaaa 2760 accctgccct gaaccgacga ccgggtcgaa 2820 ttattatcac ttattcaggc gtagcaccag 2880 aaaattacgc cccgccctgc cactcatcgc 2940 tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca 3000 aticaggclg cgcaactgtt gggaagggcg 3060 gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg 3120 gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga 3180 atlggagctc attcgaiatc gttccct tta tgtgaaattg aagcctgggg ____ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc 3540

ctgccttaaa aatgagctga tccat tcgcc

_ tat tacgcca attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gcgcgcgtaa tacgactcac tatagggcga tagaactagt ggatcccccg ggctgcagga cctcgagggg gggcccggta cccagctttt tggcgtaarc atggtcatag ctgtttcctg acaacatacg agccggaagc ataaagtgta icacattaal tgcgttgcgc tcactgcccg __ o 一Jgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgcatgcaia 3600

——— 一— acggcatgat 3660ttgcccatgg 3720 gttcggttcg 3780 tgaccgaacg 3840 tttttgtaca 3900 gtttgaigtt 3960

_ _ - _ 〜 j agicgcccta 4020aggtggctca agtatgggca tcattcgcac atgtaggctc ggccctgacc 4080 catgcgggct gctcttgatc ttticggtcg tgagttcgga gacgtagcca 4140 acatcagccg gactccgatt acctcgggaa cttgctccgt agtaagacat 4200 tgctgcctic gaccaagaag cggttgttgg cgctctcgcg gcitacgttc 4260 tgagcagccg cgtagtgaga tctatatcta tgatctcgca gtctccggcg 4320

agcaccggag gcagggcatt gccaccgcgc icatcaatct cctcaagcat gaggccaacg 4380 cgctiggtgc ttatgtgaic tacgtgcaag cagattacgg tgacgatccc gcagtggctc 4440

‘ - tgatatcgac ccaagiaccg 4500cgcggagttg ttcggtaaat 4560cgcgcccgcg ttcctgcigg 4620tcagcagctt ttcgcccacg 4680tcaacggccc cagggcgtcc 4740

4768

caccgcggtg gcggccgctc 3240 aagcttatcg ataccgtcga 3300 gtgagggtta attgcgcgct 3360 ttatccgctc acaattccac 3420 tgcctaatga gtgagciaac 3480

aaaactgttg taattcatta agcattctgc cgacatggaa gccatcacaa gaacctgaat cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat acgcacaccg tggaaacgga tgaaggcacg aacccagttg acataagcct laaactgxaa tgcaagtagc gtatgcgctc acgcaactgg tccagaacct cagcggtggt ---------- ■ .................gictatgcct atggagcagc aaacaaagtt aagtcaaatc cctactccca tcatcgcgct tgcccaggtt

aacggcgcag tggcggtttt catggcttgt tatgactgti cgggcatcca agcagcaagc gcgitacgcc gtgggtcgai aacgatgtta cgcagcagca acgatgttac gcagcagggc

tctatacaaa gttgggcata cgggaagaag tgatgcactt ccacctaaca attcgttcaa gccgagatcg gcttcccggc tgtcacaacg ccgccaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgclgggcct gttlctggcg ctggacitcc cgctgttccg gccttgatga tcgcggcggc cttggcctgc atatcccgat agaacgggct tcaggcgctc ccgaaggt<210> 42<211> 6466<212> 啲<213>人工序列

<22O><223>合成構築體

<400> 42ctcgggccgt ctctigggct tgatcggcct tcttgcgcat ctcacgcgct cctgcggcgg 60 cctgtagggc aggctcaiac ccctgccgaa ccgctttigt cagccggtcg gccacggctt 120

149050-序列表.doc -63-

1434921

ccegcgtctc aacgcgcltl gagattccca gcttttcggc caatccctgc ggtgcatagg 180 cecgtggctc gaccgcttgc gggcigatgg tgacgtggcc cactggtggc cgctccaggg cctcgtagaa cgcctgaatg cgcgtgtgac gtgccttgct gccctcgatg ccccgttgca 300gccctagatc ggccacagcg gccgcaaacg tggtctgglc gcgggtcatc tgcgctttgt 360tgccgatgaa ctccttggcc gacagcctgc cgtcctgcgt cagcggcacc acgaacgcgt 420tcatgtgcgg gctggtttcg tcacggtgga tgctggccgl cacgatgcga ccgccccgt 480acttgtccgc cagccacttg tgcgccttct cgaagaacgc cgcctgctgt tcttggctgg 540ccgacttcca ccallccggg ctggccgtca tgacgtactc gaccgccaac acagcgtcct 600tecgccgctt ctctggcagc aactcgcgca gtcggcccat cgcttcatcg gtgctgctgg 660igccctglg ctcgttctct ggcgtcctgc tggcgtcagc gttgggcgtc tcgcgctcgc 720ggtaggcgtg cttgagactg gccgccacgt tgcccatttt cgccagctlc ttgcatcgca 780flatcgcgta tgccgccatg cctgcccctc ccltttggtg tccaaccggc tcgacggggg 840ciececaaee cestgcctcc ggcgggccac tcaatgctig agtatactca ciagaclttg 900ciScaifl tcltlaccgc 您膜cggc tgcggcgccc tacgggfLtg ctctccgggc 960ttceccctgc gcggtcgctg cgctcccttg ccagcccgtg gatatgtgga cgatggccgc 020 gScctc cglctggctc gcttcgctcg gcccgtggac aaccctgctg gacaagctga 080 fSacSgc gclcctgccc acgagcttga ccacagggal tgcccaccgg ctacccagc 140

tcsaccaca tacccaccgg ctccaactgc gcggcctgcg gccttgcccc atcaat tt 200 ttaattttct ctggggaaaa gcctccggcc tgcggcctgc gcgcttcgct tgccggttgg 1260 acaccaagig gaaggcgggt caaggctcgc gcagcgaccg cgcagcggct tggccttgac 1320 蘇辭繇 cgacccalgc ctatgcgagt gggggcagtc gaaggcgaag cccgcccgcc 380 lECcccccea gcctcacggc ggcgagtgcg ggggttccaa gggggcagcg ccaccttggg 1 caaggccgaa tgccgcgcag tcgatcaaca agccccggag gggccacttt ttgccggagg 1500 gggHccfcg cKafggcgt ggjggaaccc cgcaggggtg cccttctttg ggcaccaaag 560 aactasatat agggcgaaat gcgaaagact taaaaatcaa caacttaaaa aaggggggta 1620 ScaicaJct cfugcggca cccccclcaa tagctcattg cgtaggttaa agaaaatctg 680 taattgactg ccacttttac gcaacgcaia attgttgtcg cgct&ccgaa aagttgcagc 1740 tgattgcgca Iggtgccgca accgtgcggc accciaccgc atggagataa S^tggccac 1800 gcagtccaga gaaatcggca ιtcaagccaa gaacaagccc ggtcactggg ® iqnn .acticaaafiCE calgaggcgt gggccgggct lattgcgagg aaacccacgg cggcaatgct J920 octQcatcac ctcstggcgc agatgggcca ccagaacgcc gtggtggtca gccagaagac 1980 ^cu ciatg c ci Sgic gftJugcg gacggtccaa tacgcagtc? aggacttggt 2040 Jgccgagcgl tegatcucg Tcgtgaagct caacggcccc ggcaccgtg cggcc acgt 2 00 uyicaateac cgcgtggcgt ggggccagcc ccgcgaccag ttgcgcctgt cggtgttcag !gccgccgtg gtggttgatc acgacgacca ggacgaatcg ctgttggggc atggcgacct 2220 icpcceca c ccgaccctgt alccggecga gcagcaacta ccgaccggcc ccggcgagga 2280 ^^cccalc caSccggca ttccgigclt ggalccagac clgccagcct tgaccgaaac 2340 ggaggaatgg gaacggcgcg ggcagcagcg cctgccgatg cccgatgagc cgtgttttct 2400 "EacCtglc Sagccgttgg agccgccgac acgggtcacg ctgccgcgcc ggtagcactt 2460 ggttgclca IctacccgU agtgcgctgt tccagactat cggctgtagc cgcc cgccg 2520 ccctatacct tgtctgcctc cccgcgttgc gtcgcgglgc atggagccgg £ccacctcga 2580 ccteaatgga agccggcggc acctc&ctaa cggattcacc gttlttatca ggctctggga 2640 憲囂:您 algatcatat cgicaattat tacctccacg gggagagcct gagcaaac g 2700 ^c?caggca ttlgagaagc acacggtcac actgcttccg gtagtcaata aaccggta a 2760 ®cagcaatag acataagcgg ciatitaacg accctgccct gaaccgacga ccgggtcgaa 2820 tulctucl aatttctgcc attcatccgc ttattatcac ttattcaggc 2 agcaccag 2880 gcgtttaagg gcaccaataa ctgccttaaa aaaattacgc cccgccctgc cactcatcgc 29 0 aeicggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca 30 aaatattaac gcttacaait iccaticgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg 3060 atetgtgegg gcctcttcgc tat tacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg 3120 偿腊籃 ttaacgccag ggttticcca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga 3180

-a tacgactcac tatagggcga attggagctc caccgcggtg gcggccgctc 3240 tagaaclagt ggatcctcac acgtacatca gctggttgat ggggaacggg tcgatgagca 3300,cCct et ecggttctcg gtggcgtaat ccgggcggcc cagcccgtcc ccatattggt 3360

tcfcacgcgi gccitgttca cggcgatctc calgaacgcc tlcggcagca 3420 let! c cgacacgcgc tegeggttea ttttcttcca ctcggcgtcg atcagct gc 3480

器最噩3 g!mccttt tcct^ctcg tgccgtcgtl ctegtgeatg tagetga ga 3540lectettggt ggtttcgccg cgttcgagtt ccgccgccga ggtcgccaga tcgttgcaca 3600 gccoaaagat cacgcaggac gagcgcacca ggccgtggaa gteggteagg gageggaggg 36cgtS cSa gatitcucc Tgctgctggc agaccgagaa glagclcggc gecagcagcg 3720coacEccact egaggacacg ctggcgttct ccaggtactl getgaaggeg gggatgatet 3780tfuattlc! !cacftggcf teftgeagga aggeettgea cagttcgcgc caget gg 3840tcaeataecl caegttattg tggcccttct ccitcaggat ggaglaggac gtgtcgttca 39W:嚮;:齢 calfgccagi a囂cacagct icatatagtc gggcagcgtg ttgatggcg 3960:黯偻藉 gciftccacc segteggtga agagetgeag tlcgtccagg gtaccgtaca 4020cstcataeac gtcaicgata atggtgacca gaccgaacat cttggtgacg gccttgcggc 08

c'JcCa ! gcgggtcc ggcgccatgc ccagcgccca gaagtacact tccaicaggc 4140g；；c!cgctc 囂;饗;gc Ugctggcga ggcccatctc ggtccaccac cggctcagg 4200retecaectc tttttggtgc agggtctgga ccatgttgaa atcgagtttg gccagitcca 426g g ga Icglc tcchggitt cgtacttgtc cagaaaccac cgcgcctcca 4320露*5ca5 Lltteatga tacggcagct ccagcgcglg ggacacc gc tcggccacc 4380

tcagatgggt galgctgaag gtacgggcct 444Ugatagetgge ctcgtacagg ctcagcaggc 45UU

cc^cacglc awcucagt tc&cggaga agcccccttc tttgtccltg aagegetega 4560銘鷺滂成 Pctcacctfa aasccatgct gccgcagcag gcggaagctc agggeggteg 4620

tegatgaget 4740 tcctcctcca 4800

aaatattaac

at gcgcgcgtaa

cctgcagctcggcggtgcag gcgttgatga tacggcagct tcgtgitgat cccctccttg aggitgttct cctccagcag attttcgcct tcgaaaccgaacacgtcctg gctcacctca aagccatgct嵩最濫*普至需/ :岩盅岩赤c遂呼Ctgcacgtc, ccagcaggct caggggctgg gigtccaccc ggltgatcal gcaacgcacc

gccgcagcag - cgtccagcag gacgatgttc

149050-序列表.doc -64-

1434921

gcuggtggc ctictctteg agcttctcca ccitcaggic gttttccagg actcgaagtt ccacaggttg ggctggtagt tcgcggaccg aeggetatta ictgggigaa ctggctgctg giggcgcaca tatgtatatc teettettaa gettategat accgtcgacc tcgagggggg gcccggtacc cagcttttgt gaggguaat igegegetig gcglaatcat ggicaiagct atccgctcac aattccacac cctaatgagt gagctaactc gaaacctgtc gtgccagctg gtattgggcg caigcataaa catcacaaac ggcatgatga tataaiattt gcccatggac ataageetgt tcggtlcgta _ __ _cagaaccttg accgaacgca geggtggtaa cggcgcagig gcggttttca Tggcttgtta 5580 tgactgtttt ----------- ----------- ----gggtcgatgt agcagggcag _____ _giaggetegg ccctgaccaa gtcaaatcca tgcgggctgc tettgatett ttcggtcgtg 5820

atcagccgga ctccgattac ctcgggaact 5880 ctgccttcga -agcagccgcg agggcaitgc atgtgateta tgggcaiacg tegt tcaagc gccaggtggc t tetggeget gcggcggcct aggcgciccc

aacatacgag ccggaagcat acattaattg cgtigcgcic cattaatgaa aactgtigta acctgaatcg gcacaccgtg aactgtaatg

ctctgcagga 4860 tgctcggtga 4920 agttaaacaa 4980 tccctttagt 5040 tgaaattgtt 51.00gtttcctgtg _ _

aaagtgtaaa gcctggggtg 5160 actgcccgct cgcggggaga cattctgccg

tlccagtcgg 5220 ggcggtttgc 5280 acatggaagc 5340 tcgccltgcg cccagttgac

tcggccaacg aticatiaag ccagcggcat cagcaccttg gaaacggaig aaggcacgaa _ _ caagtagcgt atgcgctcac gcaactggtc

540054605520

tttgtacagt ctatgcctcg ggcatccaag cagcaagcgc gttacgccgt 5640 ttgatgttat ggagcagcaa cgatgttacg cagcagcaac gatgitacgc 5700 tcgccctaaa acaaagttag gtggctcaag tatgggcatc attcgcacat 5760

agttcggaga tgclccgtag cictcgcggc atctcgcagt tcaagcatga ggccaacgcg acgatcccgc agtggctctc atatcgaccc cggagttgtt cgcccgcgtt agcagctttt aacggcccca

cgtagccacc taagacaitc ttacgttctg ctccggcgag

aagtaccgcc cggtaaattg cctgctggcg cgcccacggc gggcgtccag

tactcccaac atcgcgcttg cccaggtttg caccggaggc cttggtgctt tatacaaagt acctaacaat icacaacgcc ctgggcctgt cttgatgatc aacgggcttc

ccaagaagcg gttgttgficg 5940 tagtgagatc tatatctatg 6000 caccgcgctc atcaatctcc 6060 cgtgcaagca gattacggtg 6120 ggaagaagtg atgcactttg 6180 cgagatcggc ttcccggccg 6240 acttttcggg gaaatgtgcg 6300 ggacttcccg ctgttccgtc 6360 tggcctgcat gaaggt

atcccgattc 6420 6466

<210> 43<21]> 6957<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 43 tggcgaatgg cagcgtgacc ett tctcgcc gttccgattt acgtagtggg etttaatagt ttttgattta acaaaaatn tcggggaaat tccgcicatg tcatatcagg acicaccgag gtccaacatc aatcaccatg agacttgttc cgttattcat aatlacaaac tltcacctga tggtgagtaa taaattccgt ctitgccaig tcgcacctga tgttggaatt cccttgtatt cgtgagttit gatccttttt gtggtttgtt agagcgcaga aactctgtag agtggcgata cagcggtcgg accgaactga aaggcggaca ccagggggaa cgtcgatitt gcctttttac tcccctgat t ageegaaega

gacgcgccct gctacacttg acgttcgccg agtgctttac ccatcgccct ggactcttgt taagggattt aaegegaatI gtgcgcggaa aauaattct attatcaata gcagttccat aatacaacct agtgacgacl aacaggccag tegtgattge aggaategaa atcaggatat ccaigcatca cagccagttt ittcagaaac ttgcccgaca taategegge aetgt ttatg cgttccactg ttetgegegt tgeeggatea taccaaatac caccgcctac agtcgtgtct getgaaeggg gatacctaca ggiatccggt acgcctggta tgtgatgctc ggttcctggc ctglggataa ccgagcgcag

gtageggege ccagcgccct gctttccccg ggcacctcga gatagaeggt (ccaaactgg tgccgatttc t taacaaaat cccctatttg tagaaaaact ccatattttt aggatggcaa attaatttcc gaatccggtg ccattacgct geetgagega tgcaaccggc tcitctaata tcaggagtac agtcigacca aactctggcg ttategegag ciagagcaag taagcagaca agcgtcagac aatctgctgc agagctacca tgteetteta atacctcgct taccgggttg gggttcgtgc gegtgageta aagcggcagg tet t tatagt gtcagggggg cuttgctgg ccgtattacc egagteagtg

attaagegeg gcgggtgtgg agcgcccgct teaageteta ccccaaaaaa ttttcgccct aacaacactc ggcctattgg attaaegt tt tttatttttc caicgagcat gaaaaageeg galcctggta cctcgtcaaa agaatggcaa cgtcatcaaa gacgaaatac gcaggaacac cctggaatgc ggataaaatg tctcatctgt catcgggctt cccatttata acgtttcccg gttttattgt cccgtagaaa ttgcaaacaa actct tit tc gtgtagccgt ctgctaaicc gactcaagac acacagccca tgagaaagcggtcggaacag gagagcgcac cctgtcgggi cggagcctat ccttitgctc geetttgagt agegaggaag

tggttacgcg 60 tcttcccttc 120 tccctttagg 180

cctttcgctt aatcgggggc __cttgatiagg gtgaiggttc 240 ttgacgttgg agtccacgtt 300 aaccctatct eggtetatte 360 llaaaaaatg agetgattta 420 acaatttcag gtggcacttt 480 taaatacait caaatgaaac tttctgtaat teggtetgeg aataaggtta aagtttatgc atcactcgca gegategetg tgccagcgca tgttttcccg ettgatggte aacatcattg cccatacaat cccatataaa ttgaatatgg tcatgaccaa agatcaaagg aaaaaccacc cgaaggtaac agttaggcca tgt taccagt gatagttacc gcttggagcg ccacgcttccttcgccacct ggaaaaaege acatgttctt gagctgatac eggaagageg

caaatatgta 540 tgcaatttat 600 gaaggagaaa 660 attccgactc 720 tcaagtgaga 780 atttctttcc 840 tcaaccaaac 900 ttaaaaggac tcaacaatat gggatcgcag ggaagaggca gcaacgctac egatagattg tcagcaicca ctcataacac aatccct taa atettettga gctaccagcg tggettcagc ccacttcaag ggctgctgcc ggataaggcg aacgacctac egaagggaga gagggagett etgaettgag 2040 cagcaacgcg 2100 teetgegtta 2160 cgctcgccgc 2220 cctgatgcgg 2280

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980

149050-序列表.doc -65-

1434921

Itacgcatci tgatgeegea gcgccccgac tccgcttaca tcatcaccga tcacagatgt gtctggcttc

__ gcctccgtgtaegagagagg atgctcacga ttgtgagggt aaacaactgg tcaatgccag egettegtta tgcgatgcag atccggaaca cgaaacacgg aaaccgaaga gcagtcgctt cacgttcgct ccgccagcct agccgggtcc catgccggcg ataatggcct ggcttgagcg agggegtgea gctccagcga aagcggtcct

ataaagaaga ctgactgggt taactiacat

gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340 tagttaagee agtatacact ccgctatcgc taegtgaetg 2400 acccgccaac —：°一 二八gacaagctgt gaccgtctcc gggagetgea tgtgtcagag 2520

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149050-序列表.doc -66 -

1434921

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<220><223>合成構築體

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149050-序列表.doc -68-

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cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgttagggaactg ccaggcatca aataaaacga aaggctcagttttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga 一 ___ __________ttgaacgitg cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc ataaactgcc 3420 aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt tctacaaact 3480 ctttttgitt ----------------------gataaatgct cccttattcc tgaaagtaaa tcaacagcgg cltttaaagt tcgglcgccg __ ____________agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 3960ataacactgc ggccaactta cttctgacaa —ttttgcacaa catgggggat catgtaactcaagccatacc aaacgacgag cgtgacaccagcaaactatt aactggcgaa ctacttactctggaggcgga taaagttgca ggaccacttc__ ____ __ __ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtcicgcgg tatcatigca gcactggggc 4320 cagaiggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 4380 atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt 4440 cagaccaagt ttactcatat atactttaga .......... —ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa ttctgcgcgt tgccggatca taccaaatac caccgcctac agtcgtgtct gctgaacggg

atatgtatcc gcicatgaga caaiaaccct 3540atttttctaa atacattcaa _ _ _tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 3600 cttttttgcg gcattttgcc ttcctgittt tgctcaccca gaaacgctgg 3660 agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 3720 taagatccti gagagttttc gccccgaaga acguttcca atgatgagca 3780 tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac 3840 catacactat ictcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 3900

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___ gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 4980 gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcitcc cgaagggaga aaggcggaca 5040 ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 5100 acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccaccl ctgacttgag cgtcgatttt 5160 tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 5220 ggitcctggc ctuigctgg ccttttgclc acatgitctt ctgtggataa ccgtattacc ccgagcgcag cgagtcagtg ttacgcatct atgccgcaia gccccgacac cgcttacaga atcaccgaaa tacgttgaca gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa ccagtaacgt gccggtgtct cttalcagac cgtticccgc gtggtgaacc aaaacgcggg aaaaagtgga gcacaacaac tggcgggcaa ctgcacgcgc cgtcgcaaat agcgtggtgg tgtcgatggt aatcttctcg cgcaacgcgt gccaltgctg tggaagctgc cagacaccca tcaacagtat _ _catciggtcg catigggtca ccagcaaatc gcgctgttag tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat aaatatctca atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc atgtccggtt

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agcsgcgatg gcggagctga acagtcgttg ctgattggcg tgtcgcggcg attaaatctc agaacgaagc ggcgtcgaag cagtgggctg atcattaact ctgcactaat gt tccggcgt tattttcicc catgaagacg

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gtgcggtatt gltaagccag ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg caagctgiga ccgtctccgg gagctgcatg ___cgcgcgaggc agcagatcaa ttcgcgcgcg aaggcgaagc ccaicgaatg gigcaaaacc tttcgcggta

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149050-序列表.doc -69-

1434921

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<210> 46<211> 3913<212> DNA<213>人工序列

<220〉<223>合成構築體

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….2040 …___o._-o- gaagaaatac 2100

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-- gtcagtatgg tgttgaaggt gttgaaaaac 3180 caatccacct gaactttctg caagaagcgg 3240

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149050-序列表.doe -70-

1434921

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<22O><223>合成構築體

<400> 47aagggcgagc tcaacgatcc ggctgctaac gccaccgctg agcaataact agcataaccc 11tgctga aaggaggaac tatatccgga taaccaagcc tatgcctaca gcatccaggg

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2880294030003060312031803240

149050•序列表,doc -71 -

1434921

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gccatgccgg cgataatggc ctgcttctcg ccgaaacgtt 3/δ0 訪話cE祯 cgagggcgtg caagattccg aataccgcaa 3840 gcgctccagc gaaagcggtc ctcgccgaaa atgacccaga 3900 acgagttgca tgataaagaa gacagtcata agtgcggcga 3960 caccggaagg agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca 4020 taatgagtga gctaacttac attaattgcg ttgcgctcac 4080 aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 4140 attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg 4200

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* gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca 4440cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc 4500 tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttatgccag 4560 cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc 4620 atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa 4680 ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacaltagtg ^740 ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca ^800

gccgctttac aggcitcgac gccgcttcgt 4860agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg 4920ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac 4980ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc 5040

…“ acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa 5100aagagacacc ggcatactct gcgacatcgt ataacgttac tggtttcaca 5160tgaattgact ctcttccggg cgctatcatg ccataccgcg aaaggttttg 5220

. ----- ----------ctctccctta tgcgaclcci gcattaggaa jzgUgcagcccagl agtaggttga ggccgltgag caccgccgcc gcaaggaatg gtgcatgcaa 5340gpagatggcg cccaacagtc ccccggccac ggggcctgcc accataccca cgccgaaaca 5400agcgctcalg agcccgaagt ggcgagcccg atcttcccca icggtgatgt cggcgatata 5460ppcgccagca accgcacctg tggcgccggt gatgccggcc acgatgcgtc cggcgtagag 5520gatcgagatc tcgatcccgc gaaattaata cgactcacta taggggaatt gtgagcggat 湼那aacaattccc ctctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata catatgcggg 5640gttctcatca tcatcatcat catggtatgg clagcalgac tggtggacag caaat&ggtc 5/ϋυgggatctgta cgacgatgac gataaggatc atcccttcac catggtatcc *cgggtaagat ttacctgttc ggtgaacacg ccgtagttta tggcgaaactgtgcggtgga actgcgtacc cgtgttcgcg cggaactcaa tgactctatc --------

ccgcaccggt ctggatttcg aaaagcaccc ttatgtgtct gcggtaattg 5940 caaatctatt cctattaacg gtgitttctt gaccgtcgat tccgacatcc 600U cggtctgggt agcagcgcag ccgttactat cgcgtctatt ggtgcgctga oOou cggctttggc clcagcctgc aagaaatcgc taaactgggc cacgaaatcg acagggtgcc gcgtccccaa ccgatacgta tgtttctacc ttcggcggcg olcO cccggaacgt cgcaaactga aaactccgga ctgcggcatt gtgattggcg 6240 11tctcctcc accaaagagt tagtagctaa cgtacgtcag ctgcgcgaaa o3u(J

. 3如；話逞丄 cctctattgg caaaatctct cgtatcggcg 6360tctgtctggc gactacgcat ccatcggccg cctgatgaac gtcaaccagg 6420

___ _ Cgccctgggc gttaacatct tagaactgag ccagctgaic tattccgctc 6480 gtgcggcagg tgcgtttggc gctaaaatca cgggcgctgg ……一cgctgaccgc tccggaaaaa tgcaaccaag tggcagaagcaagtgactat cactaaaccg accgagcaag gtctgaaagt

cgtagcccag cgcgtcggcc tggtggcggg accagtgacg aaggcttgag gcgacaggcc gatcatcgtc gcgctgccgg cacctgtcct cgatagtcat gccccgcgcc tcggtcgaga tcccggtgcc igcccgcttt ccagtcggga cggggagagg cggtttgcgl ggcaacagct gattgccctt

agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca 4020

agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg 4200

gactcggtaa tggcgcgcat tgcgcccagc gtgggaacga tgccclcatt cagtcgcctt cccgttccgc ccagccagac gcagacgcgc tggtgaccca atgcgaccag ataatactgt tgatgggtgt caggcagctl ccacagcaat ctgacgcgtl gcgcgagaag attgtgcacc tctaccatcg acaccaccac gctggcaccc 住、、十一” - χ03Πacaatttgcg acggcgcgtg cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac 4980tgtttgcccg ccagttgttg tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc 5040gcttccactt ttlcccgcgt ntcgcagaa acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa 5100acggtctgat aagagacacc 厂一一…… ttcaccaccc "cgccaitcga tggtgtccgg gatcccgacg

gccagatcgg agaaaatgcg cggtgggctc acgagctgt t aaattaaagt tggtlaccat aiaccggcgt gctacccgga tttgatcgaa ccgclgatga aacaactggt ' gtctcctgga

caaatctatt cctattaacg gtgitttctt gaccgtcgat

<2l0> 48<2ll> 7519<212> IM<213>人工序列

<220><223〉合成構築體

tgttctgcgc 5760 gcaattgcgt 5820 actattcaga 5880tccgacatcc 6000

cggcggtggc tgtatggttg 6540 ggtagcaggc gctggcggta 6600 agat taa 6647

ctcttgggct tgatcggcct tcttgcgcat ctcacgcgct cctgcggcgg 60cctgtagggc aggctcatac ccctgccgaa ccgcttttgt cagccggtcg gccacggctt 120

ctcacgcgct cctgcggcgg 60^

ccgecgtctc aacgcgcitt gagattccca gcttttcggc caalccctgc ggtgcatagg 180cgcgtg&ctc gaccgcttgc gggctgatgg tgacgtggcc cactggtggc cgctccaggg 240cctcgtagaa cgcctgaatg cgcgtgtgac gtgccttgct gccctcgatg ccccgitgca 300gccctagatc ggccacagcg gccgcaaacg tggtctggtc gcgggtcatc tgcgctttgt 300Lccgatgaa ctccttggcc gacagcctgc cgicctgcgt cagcggcacc acgaacgcgg 420tcatgtgcgg gctggtttcg tcacggtgga tgctggccgt cacgatgcga tccgccccgt 480acttgtccgc cagccacttg tgcgccttct cgaagaacgc cgcctgctgt tcttggctgg 5 0ccgacttcca ccattccggg ctggccgtca tgacgtactc gaccgccaac acagcgtcct 600tgcgccgctt ctctggcagc aactcgcgca gtcggcccat cgcttcatcg gtgctgctgg 660ccgcccagtg ctcgttctct ggcgtcctgc tggcgtcagc gttgggcgtc tcgcgctcgc 720ogtaggcglg cttgagactg gccgccacgt tgcccatttt cgccagcttc ttgcaicgca 780tgatcgcgta tgccgccatg cclgcccctc ccttttggtg tccaaccggc tcgacggggg 840cagcgcaagg cggtgcctcc ggcgggccac tcaatgcttg agtatactca ctagacittg 900

149050-序列表.doc -72-

1434921

cticgcaaag tcgtgaccgc ctacggcggc tgcggcgccc tacgggcttg ctctccgggc ttcgcccigc gcggtcgctg cgctccctig ccagcccgtg gatatgtgga cgatggccgc gagcggccac cggctggclc gcttcgctcg gcccgtggac aaccctgctg gacaagctga tggacaggct '' * ttcgaccaca ttaat Lttcl acaccaagtg gcgcctggaa ________igccccccga gcctcacggc ggcgagigcg ggggitccaa gggggcagcg caaggccgaa ggccgcgcag tcgatcaaca gggagccgcg ccgaaggcgt aactagatat agggcgaaat cgcaacagct cattgcggca taattgactg ccacttttac tgattgcgca tggtgccgca gcagtccaga gaaatcggca acgcaaagcg catgaggcgt gctgcatcac ctcgtggcgc actttccaag ctcatcggac ggccgagcgc tggatctccg ggtcaatgac cgcgtggcgt tgccgccgtg gtggttgatc gcgccgcatc ccgacccigt gccgcccagc cagcccggca ggaggaatgg gaacggcgcg ggacgatggc gagccgttgg agccgccgac gggttgcgca gcaacccgta agtgcgctgt _ _____ccclatacct tgictgcclc cccgcgttgc gtcgcggtgc atggagccgg cctgaatgga ggcagaataa gcctcaggca ccagcaatag acataagcgg tttgctttcg aatttctgcc gcgmaagg gcaccaataa agtcggccta ttggttaaaa aaatattaac gcttacaatt atcggtgcgg gcctcttcgc attaagttgg gtaacgccag

tacgactcac ggatcccccg ccttcttgat agcggccttt gagatttltg gctgggtttc tgaaaacggt tgatatgaat tctggacaca t taactcait cggccccttc tgaccgtaaa ccggtgagat ctggcaggcc agacaaactg ctgcggcaaa cagggcgaac gccccggcac cgtgaattlg tgggltacct tggcatagtc cciatact 11 tgaaaataaa tcggtcttta ctgttgtaat ctgaatcgcc aacgggggcg ccagggatig gttttcaccg gtggtattca agggtgaaca atgagcatic tttctttacg ttgagcaact ggtggtatat taigccgata ccggagatga ccgggcctcc ccccggaccc ggccgctgcc

gcgcctgccc acgagcttga ccacagggat tgcccaccgg ctacccagcc lacccaccgg clggggaaaa gaaggcgggt cgacccaagc

ctccaaclgc gcggcctgcg gccttgcccc atcaatttti gcctccggcc tgcggcctgc gcgcttcgct caaggctcgc gcagcgaccg cgcagcggct ctatgcgagt gggggcagtc gaaggcgaag

gggggaaccc gcgaaagact ccccccgcaa gcaacgcata accgtgcggc ttcaagccaa gggccgggct agatgggcca gttctttgcg tcgtgaagct ggggccagcc acgacgacca atccgggcga t tccgggcat ggcagcagcg

cgctgccgaa atggagataa ggtcactggg aaacccacgg

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740

agccggcggc atgatcalat ttlgagaagc

agccccggag gggccacttt cgcaggggtg cccttctttg taaaaatcaa caacttaaaa tagcicattg cgtaggttaa atigttgtcg accctaccgc gaacaagccc tattgcgaggccagaacgcc gtggtggtca gacggtccaa tacgcagtca caacggcccc ggcaccgtgt ccgcgaccag ttgcgcctgt ggacgaatcg ctgttggggc gcagcaacia ccgaccggcc ggaaccagac ctgccagcct cctgccgatg cccgatgagc acgggtcacg ctgccgcgcc tccagactat cggctgtagc

gcgcgcgtaa tagaactagt cagaattcgc ccgaccgcat gagatgtggt aagccgcgcg tccgaaacgc ccatccgggg atatccagcg actgagctgt tgacgcgggc ccatcatcgc gtacggttgt acgacgccca gaacclacaa agcgcagact acgcgaaact ggctgcacci agat tccaga aalgctcctt gctcaggatg cgaggaagti acacagatca cgtcgcttgg caicgcagta catgalgaac ccatggtgaa tgaaactcac aataggccag ggaaatcgtc cggtgtaaca ggaaltccgg tgtgcttatl tataggiaca atatatcaac cgtatiatac gtcgaaaggc gtgcagaatg ctgagcccgc agctgctatt

tgccggttgg tggccttgac cccgcccgcc ccaccttggg ttgccggagg ggcaccaaag aaggggggta agaaaatctg aagttgcagc gcatggccac. 1800 tgcaaacgga cggcaatgct gccagaagac aggacttggt 2040 cggcctacgt 2100 cggtgttcag 2160 atggcgacct ccggcgagga tgaccgaaac cgtgttttct ggtagcactt cgcctcgccg 2520 gccacctcga 2580 ggctctggga 2640 gagcaaactg 2700 aaccggtaaa 2760 ccgggtcgaa 2820 gtagcaccag 2880 cactcatcgc aattttaaca

186019201980

22202280234024002460

acctcgctaa cgtcaattat acacggtcac ctat ttaacg attcatccgc ctgccttaaa aatgagctga _ _tccattcgcc attcaggctg cgcaactgti gggaagggcg tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga

attggagctc caccgcggtg gcggccgctc 3240 tcgagcggcc gccagtgtga gcgttaacca ccacccacat agcccctgct atcagatact aagccttctt

cggattcacc gtttttatca tacctccacg gggagagcct actgcttccg gtagtcaata accctgcccl gaaccgacga ttattatcac ttattcaggc aaaattacgc cccgccctgc tttaacaaaa atttaacgcg

29403000306031203180

tatagggcga ggctgcatgc atcttagtgt ttcatgcagt cccggcggca cgttggctgg aatcaggctg gcggtacggt atcagccgcc ttcgatatta gacgcaatac aacggtggtc caggcaaatg attggcggaa atct tccaga cccctggtga ggicagtgcg accaacatag atcgacaacc ctggctctca ccgggaaacg aagggcgtga ctagagaata ggaacttccg cgccgcacac gctcttttat tggtaccgaa ttcgaacccc agaglcccgc tcattaagca ttctgccgac agcggcaica gcaccitgtc aagaagttgt gctgagacga laacacgcca ctccagagcg ctatcccata atcaggcggg gtctttaaaa gactgaaatg ccagtgattt tactatgccg ggaagaggag ggaggacctt cgggcgcccg accccttccc agcctctgag ccaaaggcct acccgcttcc

cgccaacaat tgccgctgtg tacicaacac cgcaggcgta cggagaagtt ctttcagttc cgtitggaig ggtcctgcgc ttaatgccgg ccagcccctc tcacgttacc tatgcgtcgg

caacgggtgt ccgtgcggat gcatattgtt acttccgcag cgatcctgct tggcaaccgt cgcgttacgc tcggtggaaaccatcgtccg gggcgatacg agataacglt tgtccgggct tgtgtcagcg tcagtgcgcc gggctggcga tataaactgt cggttgattt gtltagtggt cggctcgcla atacaactca

ttcgccaggg ttacgccccg atggaagcca gccttgcgta cacgtttaaa ctcaataaac atatalgtgt ttcagtttgc accgtcttic

ccatattggc aaaacatatt catcttgcga atgaaaacgt tcaccagctccaagaaigtg aataaaggcc aggccgtaat atccagctga cctcaaaatg lictttacga ttttctccat atgaitaatt aacagcgcgg

gglUagllc gtcaacacgt cagacgtgcg ccccgcccct cccagaaagcattgctcagc ggtgctgtcc

tggatatctg 3300 tggtccctgc 3360 ttcgtatacc 3420 atcaacaitg 3480 gctgccatct 3540 taaatggcga 3600 ttccggcatc 3660 ccagacatcc 3720 gaataccata 3780 cacgagatga 3840 aacccacagc 3900 gaccacatcg 3960 cgcattgtaa 4020 actacccggc 4080 atacgccagg 4140 gaccaccaic 4200 ttcatgattc 4260 t tgcttcatg 4320 tgaattattt ctatagggcl aaaaaccaac agctctcaga cccigccact tcacaaacgg 4680 taatatttgc 4740 tcaaaacigg 4800 cctttaggga 4860 agaaactgcc 4920 tcatggaaaa 4980 attgccaiac 5040 ggataaaact acggtctggt tgccattggg ctcacctigt gctgctgcag cttttgaagc gagcccgccc gaaggagcaa

43804440450045604620

5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580

149050-序列表.doc -73-

1434921

atetgeaega gactagtgag tgcggggcgg gggggaactt ccaaagaacg gagccggtlg ccacttgtgt agcgccaagt gggaaaagcg cctcccctac ctlcgcggcc ClltlggCgg ggtaccaagc ggggcccggt catggteata gageeggaag ttgcgttgcg gaatcggcca gtaaitcatt tcgcca&cgg caicagcacc gtggaaacgg atgaaggcac

eglatgeget gtggcggttt aagcagcaag cgcgttacgc

gccctttagt taagggcgaa ttgatgcagg acccagctt t gctgtttcct cataaagtgl ctcactgccc acgcgcgggg aagcaitctg

acgtgctact tccatttgtc acgtcctgca cgacgcgagc 5640 cctgactagg ggaggagtgg aaggtggcgc gaaggggcca 5700 gcgcctaccg gtggatgtgg aatgtgtgcg aggccagagg 5760 gcccagcggg ccggtagaat gagggttaat ttccagcaca aattegatat tgttcccttt gtgtgaaatt aaagcctggg

getgetaaag cgcatgctcc agactgcclt 5820 gaagtlccta * cftOAtcaactgact ctggcggccg caagcttatc agtgagggtl gttatccgct -------------------------gtgcclaatg agtgagctaa ctcacattaa 624。

gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag etgeattaat 6300 agaggeggtt ccgacatgga ngtcgcctt gaacccagtt cacgcaactg gtccagaacc tcatggcttg

tactttctag agaataggaa 5880 gtaacagcta aaauagtcg 5940 ttactagtgg gataccgtcg _______aattgegege ttggegtaat 6120 cacaattcca cacaacatac 6180

atccgagctc 6000acctcgaggg 6060

tgcgtattgg agccatcaca gcgtataata gacataagcc

atgeaagtag taaeggegea tcgggcatcc _ _ _ _caacgatgtt acgcagcagc aacgatgtta cgcagcaggg taggtggctc ' ' "'J *ccatgcgggc aacatcagcc t tgctgcclt ttgagcagcc ggcagggcat ettatgtgat agttgggcat aattegitea gccgccaggt tgtttctggc ategeggegg ttcaggcgct

ttatgactgt cgtgggtcga

aaaaactgt t 6360 tgaacctgaa 6420 gacgcacacc 6480 gtaaactgta 6540 gcagcggtgg 6600 agtctatgcc 6660 tatggagcag 6720

aagtatgggc atcattcgca catgtaggct tgetettgat cttttcggtc gtgagttcgg ggactccgat tacctcggga acttgctccg cgaccaagaa gcggttgttg gcgctctcgc gegtagtgag atctalatct atgatetege tgccaccgcg ctcatcaatc etaegtgeaa gcagatiacg acgggaagaa gigatgcact ageegagate ggcacttttc getggaette ccttggcctg cccgaaggt

ggcttcccgg ggggaaatgt ccgctgttcc catatcccga

gcgctctcgc

gcgcatgcat aacggcatga tttgcccatg tgttcggttc ttgaccgaac ttttttgtac tgtttgatgt _____ -cagtcgccct aaaacaaagt 6780 cggccctgac caagtcaaat 6840

acctactccc 6900 ttcatcgcgc 6960 ctgcccaggt 7020 gagcaccgga 7080 gcgcttggtg 7140 ctctatacaa 7200 gccacctaac 7260 ttgtcacaac gcgctgggcc ggcct tgatg cagaacgggc

agacgtagcc tagtaagaca ggcttacgtt agtciccggc tgaggccaac cgcagtggct cccaagtacc gttcggtaaa gttcctgctg tttcgcccac

tcctcaagca gtgacgatcc tigatatcga ccgcggagtt gcgcgcccgc gtcagcagct ttcaacggcc ccagggcgtc

73207380744075007519

<210> 49<211> 37<212> DNA<213>人工序列

<223>合成構築體

<400> 49egtgagatea tatgtgtgcg accicttctc aatttac 37

<210> 50<211> 38<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 50eggtegaegg atccctgcag itagacatac atcagctg 38

<210> 51<211> 41<212> DNA<213>人工序列

<215合成構築體

<4ΰ0> 51ealatgaaag ettgtatega ttaaataagg aggaataaac c

<210> 52<21l> 60<212〉 DNA<213> 人工序列

<220><223> 合成構築體

<400> 52

41

149050-序列表.doe -74-

1434921

gatcatgcat tcgcccttag gaggtaaaaa aacatgtgtg cgacctcttc tcaatttact 60

<210> 53<211> 31<212> 叫A<213>人工序列

<220><223〉合成構築體

<400> 53gacatcaatt gctccatttt cttctgctat c<210> 54<211> 41<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

31

<400> 54attgagaaga ggtcgcacac actctttacc ctcicctttt a<21O> 55<2H> 41<212><213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 55taaaaggaga gggtaaagag tglglgcgac ctctlcicaa t<21O> 56<211> 41<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 56ccaaggccgg ttttttttag acatacatca gctggttaat c<210> 57<211> 41<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 57gattaaccag ctgatgtatg tctaaaaaaa accggccttg g<210> 58<211> 32<212> NA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 58gacatgacgg atccgattac gaatgccgtc ic<210> 59<2U> 27<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 59

41

41

41

41

32

149050-序列表.doc -75-

1434921

gacatgaatl cciccatltt cttctgc 27

<210> 60<211> 20<212> DNA<213>人工序列

<223>合成構築體

<400> 60aggagagggt aaagagtgag 20

<210> 61<211> 22<212> DNA<213>人工序列

<223>合成構築體

<400> 61cttttccatc acccacctga ag 22

<210> 62<211> 28<212> DNA<213> 人工序列

<220><223> 合成構築體

62<400>ggcgaaatgg tccaacaaca aaailaic 28

<210> 63<2U> 40<212> DNA<2Γ3>人工序列

<223>合成構築體

<400> 63gctiaiggat cctctagact attacacgta catcaattgg 40

<210> 64<211> 30<212> DNA<213> 人工序列

<220><223> 合成構築體

64<400>caccatgtgt gcaacctcci cccagtttac 30

<210> 65<211> 51<212> DNA<213>人工序列

<223>合成構築體

ggtgaattca gtctactggg gattcccaaa tctaiatata cigcaggtga c 51

<210> 66<211> 23<2I2> IMA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 66gcaggtggga aaclatgcac icc 23

149050-序列表.doc -76-

1434921

<210> 67<21ϊ> 36<2I2> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 67cctgaattct gttggaltgg aggatlggat agtggg<210> 68<211> 30<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 68■ggtgtcgacg tacggtcgag cttattgacc<210> 69<211> 32<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 69ggtgggcccg cattttgcca cctacaagcc ag<210> 70<211> 40<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 70ggtgaattct agaggatccc aacgctgttg cctacaacgg<210> 71<211> 36<212> DNA<213>人工序列

<223>合成構築體

<400> 71ggtgcggccg ctgtctggac ctggigagtt tccccg<210> 72<21l> 37<212> NA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 72gglgggccca ttaaatcagt tatcgtitat ttgatag<210> 73<211> 35<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 73ggtgaccagc aagtccatgg gtggtttgat catgg

36

30

32

40

36

37

35

149050-序列表.doc -77-

1434921

人工序列

<210> 74<211> 35<212> DNA<213>

<220><223> 合成構築體

<400>、二二》74 ggtgcggccg cctltggagt acgactccaa ctatg 35

<210> 75<211> 31<212> 邱<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 75gcggccgcag actaaa11 ta 11tcagtctc c 31

<210> 76<211> 28<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 76gatcaagctt aaccggaalt gccagctg 28

<21.0> 77<211> 33<212> DNA<213>人工序列

<220><223〉合成構築體

<400> 77gaiccgatcg tcagaagaac tcgtcaagaa ggc 33

<210> 78<211> 38<212> DNA<213>人工序列

登號合成構築體

<400> 78catcaatgca tcgcccttag gaggtaaaaa aaaatgac 38

<210> 79<211> 26<2i2> DNA<213>人工序列

快發合成構築體

<400> 79ccttctgcag gacgcgttgt tatagc 26

<210> 80<211> 60<212> K4A<213>人工序列

<223^合成構築體

gaicatgcai tcgcccttag gaggtaaaaa aacatgagtt ttgatattgc caaatacccg 60

149050-序列表.doc -78-

1434921

<210> 81<211> 31<212> E^A<213>人工序列

<22Ο><223>合成構築體

<400> 81 catgcigcag ttatgccagc caggccttga t<210> 82<21 以 7<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 82aggaggt

31

7<210> 83<211> 7<212> 胸<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 83aaggagg<210> 84<211> 41<212> DNA<213>人工序列

<22Ο><223>合成構築體

7

<400> 84aggaggtaaa aaaacatgtc attaccgttc ttaacttctg c 41<210> 85<211> 52<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 85atggctgcag gcctatcgca aaitagctta tgaagtccat ggtaaattcg tg 52<210> 86<211> 23<212> DNA<213>人工序列

^223>合成構築體

<400> 86gaattcgccc ttctgcagct acc 23<2W> 87<211> 38<212> WA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 87cgactggtgc acccttaagg aggaaaaaaa catgtcag 38<210> 88

149050-序列表.doc -79-

1434921

<211> 25<212> DNA<213> 人工序列

<220><223> 合成構築體

88<400>gtsctggaal tcgcccttcl gcagc 25

<210> 89<211> 32<212> 贝A<213>人工序列

3號合成構築體

<400> 89gtagatgcat gcagaattcg cccttaagga gg 32

<210> 90<211> 25<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 90gtgtgatgga tatctgcaga aitcg 25

<210> 91<211> 36<212> DNA<213> 人工序列

<220><223> 合成構築體

<400> .caicaatgca tcgcccttag gaggtaaaaa aacatg91 36

<210> 92<211> 21<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 92actgaaacgt tttcalcgct c 21

<210> 93<211> 50<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 93 ι …— ιgagacatgag ctcaggaggt aaaaaaacat gaaaacagta gt tat tat tg 50

<210> 94<211> 54<212> NA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 94tilatcaatc ccaattgtca tgltttttta cctcctttat tgttttctta aatc 54

<210> 95<211> 54

149050-序列表.doc -80-

1434921

<212> mA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 95gaiitaagaa aacaaiaaag gaggtaaaaa aacaigacaa ttgggattga taaa 54<210> 96<211> 40<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 96gacatgacat agatctttag tttcgataag aacgaacggt<210> 97<2I1> 26<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 97 atgaaaacag tagttattat tgatgc<210> 98<211> 33<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 98atgttattgt tttcttaaat catttaaaat age<210> 99<211> 26<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 99atgacaattg ggattgataa aattag<210> 100<211> 24<212> IMA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 100ttagttlcga taagaaegaa eggt<21O> 101<21!> 23<212> WA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

26

33

26

<400> 101gaaalagccc cattagaagt ate 23<210> 102<211> 24<2I2> E^A

149050-序列表.doc -81 -

1434921

<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 102ttgccaatca tatgattgaa aatc

<210> 103<211> 25<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 103gctatgcttc attagatcct latcg

<210> 104<211> 25<212> DNA<213>人工序列

<223>合成構築體

<400> 104gaaacciaca tccaatcttt tgccc

<210> 105<21l> 31<212> DNA<213>人工序列

<223>合成構築體

<400> 105cttgatgcat cctgcaticg cccttaggag g

<210> 106<211> 23<212> DNA<213>人工序列

<220><223〉合成構築體

<400> 106ccaggcaaat tctgttttat cag

<210> 107<211> 43<212> DNA<213〉人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 107gcatgctcga gcggccgctt ttaatcaaac atcctgccaa etc

<210〉 108<211〉 37<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 108gategaaggg egategtgte acagtctggc gaaaeeg

<210> 109<211> 43<212> 曲<213>人工序列

149050-序列表.doc -82-

1434921

<220><223>合成構築體

<400> 109ctgaattctg cagatatctg tttttccact ctlcgttcac ttt 43<210> 110<211> 33<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 110tctagagggc ccaagaaaaa tgccccgctl acg 33 <210> 111<211> 111<212> DNA<2I3>人工序列

<220><223>合成構築體

•<400> 111gatcgcggcc gcgcccttga cgatgccaca tcctgagcaa ataattcaac cactaattgt 60 gagcggataa cacaaggagg aaacagctat gtcattaccg ttcttaactt c 111 <210> 112<2ll> 75<212> NA<21.3>人工序列·

<223>合成構築體

<400> 112gatcgggccc caagaaaaaa ggcacgtcat ctgacgtgcc ttttttattt gtagacgcgt 60 igttatagca ttcta 75 <210> 113<21l> 81<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 113aaagtagccg aagatgacgg tttgtcacat ggagttggca ggatgtttga ttaaaagcaa 60 ttaaccctca ctaaagggcg g 81 <210> 114<211> 160<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 114agagtgttca ccaaaaataa taacctttcc cggtgcagaa gttaagaacg gtaatgacat 60agctgtttcc tccttgtgtt atccgctcac aattagtggt tgaattattt gclcaggalg 120tggcatcgtc aagggctaat acgactcact atagggctcg 160<210> 115<211> 27<212> mA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 115gacalclgca gclccatttt cttctgc 27

149050-序列表.doc -83-

1434921

<210> 116<211> 42<212> DMA<213>人工序列

餐费:合成構築體

<400> 116caaiaataac tactgtiitc actctttacc ctctcctttt aa 42

<210> 117<211〉 42<212> iMA<213> 人工序列

<220><223> 合成構築體

117<400>ttaaaaggag agggtaaaga gtgaaaacag tagttattat tg 42

<210> 118<211> 45<212> DNA<213>人工序列

<22^合成構築體

<400> 118cggggccaag gccggttttt tttagtltcg ataagaacga acggt 45

<210> 119<211> 45<212> DNA<213>人工序列

<22O><223>合成構築體

<400> 119accgttcgtt cltatcgaaa ctaaaaaaaa ccggccttgg ccccg 45

<210> 120<211> 22<212> DNA<213> 人工序列

<220><223> 合成構築體

120<400>caccatggta tcctgttctg eg 22

<210> 121<21l> 22<212> DNA<213> 人工序列

<220><223> 合成構築體

121<400>itaatctact ttcagacctt gc 22

<210> 122<2U> 66<212> DNA<213>人工序列

<220><223> 合成構築體

122<400>gegaaegatg cataaaggag gtaaaaaaac tacctg

atggtatcci gltctgcgcc gggiaagatt 6066

149050-序列表.doe -84-

1434921

<210> 123<211> 48<212> DNA<213〉人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 123gggcccgitt aaacttiaac tagactttaa tctactttea gaccttgc<21O> 124<211> 20<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 124caccaaagac ttcatagact<21O> 125<21]> 20<212> DNA<213>人工序列

<22Ο><223>合成構築體

<400> 125agagatatet tcctgctgct<210> 126<211> 20<212> DNA<213> 人工序列

48

20

20

<220><223> 合成構築體

126<400> taatacgact cactataggg 20<210> 127<211> 19<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 127accaattgca cccggcaga 19<210> 128<211> 21<212> TO<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 128getaaagege atgctccaga c 21<210> 129<211> 20<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 129gactggcctc agatgaaagc<210> 130

20

149050-序列表.doe -85-

1434921

<211> 20<212> DNA<213> 人工序列

<220><223> 合成構築體

130<400> caaacatgtg gcatggaaag 20

<210> 131<211> 52<212> DNA<213>人工序列

<22§合成構築體

<400> 131gggcccgttt aaactttaac tagactctgc agttagcgtt caaacggcag aa 52

<210> 132<2H> 38<212> DNA<213>人工序列

<223>合成構築體

<400> 132cgcatgcatg tcatgagatg tagcgtgtcc accgaaaa 38

<210> 133<211> 22<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 133 acaatticac acaggaaaca gc 22

<210> 134<21l> 22<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 134gcactgtcll tccgtctgct gc 22

<21O> 135<211> 21<212> DNA<213> 人工序列

<220><223> 合成構築體

135<400> ggtttagttc ctcaccttgt c 21

<21O> 136<21l> 21<212> DNA<213>人工序列

^23>合成構築體

<400> 136cgtgaatttg ctggctctca g 21

<210> 137<211> 24

149050-序列表.doc -86-

1434921

<212> mA<213>人工序列

<22Ο><223>合成構築體

<400> 137gatagtaacg gctgcgctgc tacc 24

<210> 138<211> 23<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 138gacagcttat catcgactgc acg 23 <210> 139<211> 67<212> 脚<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 139 accgccaaaa gcgactaatt cggccgc

ttagctgtta cagtcagttg aattaaccct cactaaaggg 6067

<210> 140<211> 152<212> DNA<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 140 gctggcgata gltgatttgt gctcgctaat

taaactgttt ttagtggttg acgactcact

gcttcatgaa aattatttgc atagggctcg

tgctcctttg ggttacctcc tcaggatgtg gcatagtcaa ag

gggaaacgcg 60gggcgtgacg 120

152<210> 141<211> 26<212> 負A<213>人工序列

<220><223>合成構築體

<400> 141accgccaaaa gcgactaatt t tagct 26

<210> 142<21ί> 30<212> 負A<213> 人工序列

<220><223> 合成構築體

142<400> cltgatatct tagtgtgcgt taaccaccac 30

149050-序列表.doc -87-

1434921

八、圖式：

et trgtg tgcga octet teres at t tact Ccirjatta cccg teg ttccgcdacict^tc^gcc^aacctgtgg^u Lituc jatLe·:- ye j jiccctgg·.!；raacgacctgau^^tggaa2a <j-：r.gg^qg3gaeiagcgaccaaactggaggaagaagt:tcgctgccicgatc<iac;c:gt.c* ：dgacacc c jqccg^tg t ccctgc:tgga jctgatcgacga tgtgcagcgccngagt or gacet<■：c-ia 21*~.tg aa^rjagacatcnttuacigQcctggaae^aciit^gtactgctggacgaaaacaaaHaaaacaaatc r,-jCjcc*:gc<i€ ：gcaaccgc:^Qi'jt-utt Lc-cgtctgctgcgtccigcdi3ggt t gatgr:tcttgagcgt^tcaagga.t.aaagaaggtggtttcagcngtgaLict,jaaaggtgacgtCij dd^geetgetgagcctgtatgaagegtettacGtgggtttcgagggtgagaaccLgetggeigga ggcgcgtacct 11 tccavcacccacctgaagaacaacctga^agjaggcaLtcid t: jcca jggtt gcag^acaagtgagccacgccct ggaactgcca tatcaccagcgtctgcaccgticrggaggc^ic yttggttcctggataaatacgaaccgadagaaccgcatcaccagetgetgetggagctgyega □ getiggat tt taacatggtacagaccctgcaccagaaagagctgcaaga tetg t cccijctjgt gg a<:cgagatgggcctggctagcaaactggar2 tt tgtacgcgaccgcctgatggaagr^^at*: t et jcgcact gggt a tggcgccagacccgcagt 11 ggt gaatgtcgcaaagctgt tacr 3 -ιειangt t Lgtjt I'j<j L(jecjfjatca t 二gm t,<jacgtgt<i tejaegt t tat ggcact)ί：-ί ωct g L t: <?accga tigctgtagagcgctgcjgacgt t<i^cgcta ttaacdC：cctgccg^act_r3 Ljtgaadc tgtgt tt cct gqcactgtacaa c^cegt taacgacacgtcctat tcta ttc tgc: a.ija g .3(ί a g g t cFit：iiiiCii£icct gtcctatctqacgaadcigctLggcgtgaaGtgtgcaaagcct Ket gedcigaq gegaaa tcjgtcea^caatjaaHattat cccggcvttctccaagtacctggdaactccjccacLTcjttt ccccctccggtgtsgcgctcjctggcgccgtettnett tteegtatgccagcagcaggBagacat ctccgaccarjgcgctgcgt tccctguccgact tccatgQtctggtgcgt tetaget. t □ tott: c：cgcctgtgcaacgatctggccscctctgcggcggagctggaacgtggcrj π ^occ-jccaatt ctatcatt age t tgcr^cg^a^scga t:ggt:accagcgaggaacaggcccci'j-i?iGascvgcgt a aactgatcg<icgccgaatggaa8 aaga tgaa tegt gaacgcgtt:agcgac：t.cc^zcc:t get g cccaaagcgttcatggciaatcgcag^raccatggcacgtgtttcccactgcci .:-.:1. ccag tcitu gcqatggtet cgggt cgcccaqactacgcgact qaaaaccgcateaaactgc:::g：_?tg3ΐ: t gacgg rttcccgattaaccaqcrqatgtat^rc

(SEQ ID~NO' 1)

圖1

1"

1434921

]V.r ηί ι-j I 丄 ι

1434921

gtt tgacagc^tatcatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagcTratcggaa gctg^ggtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataat tcgtg tcuct oaag<jcii?.\ctccc

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圖27C

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SEQ ID NO 28

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圖 114A

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發明專利說明書[公告末

中文說明書替換頁（102年12月）

（本說明書格式、順序及粗體字，請勿任意更動，※記號部分請勿填寫）

法申請案號：099119620•※申請日：99.06.15 洪IPC 分類：CJ"「。/& （20U6.U1）- /虬（2006.01）一、發明名稱：（中文/英文） 成言“/仅（2006.01）

ο \盘 ι^/ΐι /9ΠΠβ 01）從生物異戊二烯組合物製造燃料成分之方法及系統 UWbJi，

METHODS AND SYSTENS FOR PRODUCING FUELCONSTITUENTS FROM BIOISOPRENE COMPOSITIONS

•二、中文發明摘要： …w·■'· ‘：：·]. ,/·.；

本發明提供使用源自可再生碳之生物異戊二烯製造多種

煙燃料及燃料添加劑之方法、組合物及系統。

三、英文發明摘要：

The invention provides for methods, compositions and systems using bioisoprenederived from renewable carbon for production of a variety of hydrocarbon fuels and fuel additives.

C1490SOPBX201312C.doc

1434921 ------------------1 们丄[tfUpL月I。日修正2.' 第099119620號專利申請案

_ I______________ 二J 中文申請專利範圍替換本（102年12月）

七、申請專利範圍：

1. 一種自生物異戊二烯組合物製造燃料成分之方法，其包

括使該生物異戊二烯組合物中異戊二烯化學轉化成非異

戊二烯化合物，此係如下：

（a）使該生物異戊二烯組合物接受適於異戊二烯二聚化

之熱或催化條件，以製造異戊二烯二聚體，且接著催化

性氫化該異戊二烯二聚體，以形成飽和C10燃料成分；

或

• （b）⑴部分地氫化該生物異戌二烯組合物，以製造異戊

烯，（ii）使該異戊烯與選自由異戊烯、丙烯及異丁烯組成

之群的單烯煙二聚化，形成二聚烯（dimate），及（iii）完全

氫化該二聚烯，製造燃料成分；

其中該生物異戊二烯組合物係以生物方法製造。

2. 如請求項1之方法，其中該生物異戊二烯組合物中至少

約95%之異戊二烯轉化成非異戊二烯化合物。

.3.如請求項1之方法，其中將該生物異戊二烯組合物加熱

至約150°C至約250°C，製造不飽和環狀異戊二烯二聚體

且催化性氫化該不飽和環狀異戊二烯二聚體，製造飽和

環狀異戊二烯二聚體燃料成分。

4.如請求項1之方法，其中該方法包括：（i）使該生物異戊

二烯組合物與催化異戊二烯環二聚化之催化劑接觸，製

造不飽和環狀異戊二烯二聚體且催化性氫化該不飽和環

狀異戊二烯二聚體，製造飽和環狀異戊二烯二聚體燃料

成分。

CK9O5OPBX2O1312C.doc

1434921

5. 如請求項4之方法，其中該催化異戊二烯環二聚化之催

化劑包含選自由鎳催化劑、鐵催化劑及鎔催化劑組成之

群的催化劑。

6. 如請求項1之方法，其中該部分地氫化該生物異戊二烯

組合物之步驟包括使該生物異戊二烯組合物與氫氣及催

化異戊二烯部分氫化之催化劑接觸。

7. 如請求項6之方法，其中該催化異戊二烯部分氫化之催

化劑包含鈕催化劑。

8. 如請求項1之方法，其中該使該異戊烯與單烯煙二聚化

之步驟包括在催化單烯煙二聚化之催化劑存在下，使該

異戊烯與該單烯煙接觸。

9. 如請求項9之方法，其中該催化單烯煙二聚化之催化劑

包含酸催化劑。

10. 如請求項1之方法，其進一步包括在使該生物異戊二烯

組合物化學轉化成燃料成分之前，自該生物異戊二烯組

合物中純化該異戊二烯。

11. 如請求項1之方法，其中該生物異戊二烯組合物中至少

80%之異戊二烯係轉化成非異戊二烯化合物。

12. 如請求項1之方法5其中該生物異戊二烯組合物包含一

或多種選自以下所組成之群之化合物：乙醇、丙酮、C5 異戊二烯醇及具有10個或10個以上碳原子之類異戊二烯

化合物。

13. 如請求項1之方法，其中該生物異戊二烯組合物包含一

或多種選自以下所組成之群之化合物：乙醇、丙酮、甲

C149050PBX201312C.doc -2-

1434921

醇、乙醛、甲基丙烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯

基環氧乙烷、順-及反-3-甲基-1,3■•戊二烯及C5異戊二烯

醇。

14. 如請求項1之方法，其中該生物異戊二烯組合物包含一

或多種選自以下所組成之群之化合物：2-庚酮、6-甲基-

5-庚烯-2-酮、2,4,5-三甲基。比咤、2,3,5-三甲基。比嗪、香

茅醛(citronellal)、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、

雙乙醯、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲

基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2- 戊酮、3-甲基-1-丁醇、異丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、

乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、乙酸3-甲基-3-丁烯-1-基

酯、乙酸3-甲基-2-丁烯-1-基酯、3-己烯-1-醇、乙酸3-己

烯-1-基酯、檸檬烯(limonene)、香葉醇(geraniol :反-

3,7 -二 甲 基-2,6 -辛 二烯-1-醇)、香 茅 醇(citronellol : 3,7- 二甲基-6-辛烯-1-醇)、(E)-3,7-二 甲基-1,3,6-辛三烯、

(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯及2,3-環庚烯醇咀咤。

15. 如請求項1之方法，其中該生物異戊二烯組合物中之異

戊二烯係經連續化學轉化成非異戊二烯化合物。

16. 一種自生物異戊二烯組合物製造燃料成分之系統，其中

該生物異戊二烯組合物中之異戊二烯係化學轉化成非異

戊二烯化合物，該系統包含生物異戊二烯組合物及以

下：

(a)(i) —或多種能夠使該生物異戊二烯組合物中之異戊

二烯二聚化之化學品，或能夠使該生物異戊二烯組合物

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中之異戊二烯二欢化之熱源，及（ii）能夠氫化異戊二烯二

聚體以形成飽和C10燃料成分之催化劑；或

（b）（i）能夠部分地氫化該生物異戊二烯組合物中之異戊

二烯以製造異戊烯之化學品，（订）能夠使該異戊烯與選自

由異戊烯、丙烯及異丁烯組成之群的單烯煙二聚化以形

成二聚烯之化學品，及（iii）能夠完全氫化該二聚烯以製

造燃料成分之化學品；

其中該生物異戊二烯組合物係以生物方法製造。

17. 如請求項16之系統，其中該生物異戊二烯組合物包含大

於約2 mg之異戊二烯，且以該組合物中所有C5煙之總重

量計，包含大於或約99.94重量％之異戊二烯。

18. 如請求項16之系統，其中該一或多種能夠使異戊二烯二

聚化之化學品包含催化異戊二烯環二聚化之催化劑,其

包含選自由釘催化劑、鎳催化劑、鐵催化劑及鎔催化劑

組成之群的催化劑。

19. 如請求項16之系統，其中該氫化不飽和異戊二烯二聚體

之催化劑包含選自由鈕催化劑、鎳催化劑、釘催化劑及

錢催化劑組成之群的催化劑。

20. 如請求項16之系統，其中該能夠部分地氫化異戊二烯之

化學品包含鈕催化劑。

21. 如請求項16之系統，其中該能夠使該異戊烯與單烯煙二

聚化之化學品包含酸催化劑。

22. 如請求項16之系統，其中該生物異戊二烯組合物中至少

80%之異戊二烯係化學轉化成非異戊二烯化合物。

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23. 如請求項16之系統，其中該生物異戊二烯組合物包含一

或多種選自以下所組成之群之化合物：乙醇、丙酮、C5 異戊二烯醇及具有10個或10個以上碳原子之類異戊二烯

化合物。

24. 如請求項16之系統，其中該生物異戊二烯組合物包含一

或多種選自以下所組成之群之化合物：乙醇、丙酮、甲

醇、乙醛、甲基丙烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯

基環氧乙烷、順-及反-3-甲基-1,3-戊二烯及C5異戊二烯

醇。

25. 如請求項16之系統，其中該生物異戊二烯組合物包含一

或多種選自以下所組成之群之化合物：2-庚酮、6-甲基-

5-庚烯-2-酮、2,4,5-三 甲基。比咤、2,3,5-三甲基。比嗪、香

茅醛(citronellal)、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、

雙乙醯、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲

基-1-丙醇、3 -甲基-1-丁醛、3 -甲基-2-丁酮、1-丁醇、2- 戊酮、3-甲基-1-丁醇、異丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、

乙酸丁酯、乙酸.3-甲基丁酯、乙酸3-甲基-3-丁烯-1-基

酯、乙酸3-甲基-2-丁烯-1-基酯、3-己烯-1-醇、乙酸3-己

烯-1-基酯、檸檬烯(limonene) ' 香葉醇(geraniol)(反-3,7- 二甲基-2,6-辛 二烯-1-醇)、香茅 醇(citronellol)(3,7-二甲

基-6-辛烯-1-醇)、(E)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、(Z)-3,7- 二甲基-1,3,6-辛三烯及2,3-環庚烯醇。比咤。

26. —種燃料組合物，其包含由如請求項1之方法製造之燃

料成分，其中該燃料組合物具有大於-22%。或在-32%。至-

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24%o之範圍內之δ"。值。

27.如請求項26之燃料組合物，其中該燃料組合物實質上不

含異戊二烯。

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143 ----------- f网年*月 （。日修正替ΙΟ；:_______________ I四、指定代表圖：

（一） 本案指定代表圖為：第（14 ）圖。

（二） 本代表圖之元件符號簡單說明：

（無元件符號說明）

五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：

（無）

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