LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR

5BV1

EXTRACCIÓN DE ADN DE BACTERIASPRÁCTICA 1

CUANTIFICACIÓN DE ADN POR ESPECTROFOTOMETRÍA Y

VISUALIZACIÓN EN GEL DE AGAROSAPRÁCTICA 2

EQUIPO #2

MARMOLEJO PÉREZ OMARMENDEZ VIRAMONTES CLAUDIA

PROFESORES

DR. FRANCISCO SÁNCHEZ LÓPEZ M. EN C. MARIO JOSUÉ AGUILAR

SILAO DE LA VICTORIA, GTO.15 DE SEPTIEMBRE DEL 2015

Resultados

Obtención de peso molecular mediante la utilización del marcador comercial.

Mediante el uso de electroforesis en gel de agarosa se extrajo elmaterial genético de Escherichia coli. En el gel se depositaron variasmuestras de los diferentes equipos, junto con un marcador de pesomolecular los cuales se muestran en la siguiente figura.

Se utilizo un marcador de peso molecular en este caso HyperLadder™1kb, y se graficaron el número de pb contra la distancia enpíxeles de cada banda como se muestra en la figura 3.

ADN de E. Coli Equipo #2

Marcador de pesomolecular

Banda 2

Figura 1. Visualización en rayos UV del marcador comercial y muestra después deelectroforesis en gel de agarosa. La primera columna

Banda 1

Figura 2. Tamaño en pares de bases del marcador de peso molecular con respecto ladistancia en píxeles.

Como se muestra en la figura 1 en la columna perteneciente a lamuestra del equipo 2 se visualizan 2 diferentes bandas, la banda 1recorrió una distancia de 78 píxeles y la banda 2 recorrió unadistancia de 351 píxeles, utilizando el modelo de la graficaanterior se obtiene un tamaño de 10.25x10 3 pb y de 130pbrespectivamente.

Ya que el peso molecular de un nucleótido es de 330g/mol el pesocorrespondiente para la banda 1 es de 6.77x106 g/mol y de la banda2 es de 8.6x104 g/mol.

Obtención de la concentración mediante análisis densitométrico.

Para este cálculo se utilizó el software llamado ImageJ. El cualanaliza un área delimitada de una imagen y automáticamente arrojauna grafica de la cantidad de luz en píxeles que se encuentran alo largo de la selección, también cuenta con diferentes tipos deherramientas una de las cuales sirve para calcular el área que sedesee delimitar de dichas graficas en píxeles. Primero se delimito el área de la imagen que contenía las bandasdel marcador comercial, las cuales arrojaron las curvas que semuestran en la figura 4. A pesar de que el marcador cuenta con 14

bandas, se calculó el área de 7, debido a que eran las curvasmejor definidas.

Luego se realizo el mismo procedimiento para la muestra arrojandola gráfica que se muestra a continuación.

Una vez obtenidas las áreas bajo la curva de las 7 bandasseleccionadas del marcador se graficaron con su correspondienteconcentración como se muestra en la siguiente figura.

Figura 4. Gráfica de cantidad de luz en píxeles alo largo del marcador molecular.

Figura 5. Gráfica de cantidad de luz enpíxeles a lo largo de la muestra.

Figura 5. Datos obtenidos mediante el análisis densitométrico.

Se obtuvo el modelo mediante regresión lineal, sustituyendo en elmodelo los valores de las bandas de la muestra se obtiene que laconcentración en la banda 1 es de 24.65ng/banda y para la banda 2se obtiene una concentración de 952.47 ng/banda. EN La práctica sedepositaron 4μl de muestra teniendo así una concentración porbanda de 6.16ng/μl para la banda 1 y 238.11 para la banda 2.

Obtención de concentración mediante métodos espectrofotométricos.

Un segundo método para la estimación de los ácidos nucleicos esmidiendo su densidad óptica (OD) por espectrofotometría usando elThermo Scientific NanoDrop 2000, el cual mostraba laconcentración, la absorbancia a una determinada longitud de onda yel cociente (260/280,260/230).

Fuente del ADN Bacteriano FresaConcentración (ng/µL) 1054.8 661.2

A260(10 mm) 21.095 13.224

A280(10mm) 13.535 11.848

260/280 1.56 1.12

260/230 1.80 0.42

Figura 6. Resultados obtenidos por análisis espectofotometrico para muestra de ADN de E. coli

y de fresa.

Discusión

En la primera práctica se inoculó Escherichia coli en medio LB estéril.Posteriormente se incubo aproximadamente por 24 horas permitiendoasí que la bacteria entrase en fase estacionaria.

Para la primera extracción de ADN se decanto el sobrenadante y seresuspendió la pastilla microbiana en buffer TE (Tris-HCl; EDTA),posteriormente se agrego SDS al 10% y proteínasa K todos estoscomponentes inhiben la acción y desnaturalizan las enzimasnucleasas. (Zabala, 2005; Pingound, 2010). Con la utilización deestos componentes se pretendió degradar aquellos compuestos que noson de interés.

EL SDS además de las funciones ya descritas permite romper lamembrana celular y nuclear y liberar el ácido nucleico, y laproteinasa K libera el ADN de las histonas donde se encuentranproteínas que lo mantienen empaquetado.

Durante la etapa de extracción y purificación se mantuvo lasmuestras a una baja temperatura lo cual resulto apropiado ya quees una variable importante para mantener integro el ADN aislado(Salazar).

Cabe mencionar que durante el proceso de extracción y separaciónde ADN involucro agitación mecánica, que ayudo a la separación delas dos cadenas de ADN ya que se genera un flujo hidrodinámico.Además que la molécula de E. coli es larga y se requiere una fuerzadébil para ocasionar su ruptura.(Salazar,)

En el siguiente paso se agrego CTAB para remover escombroscelulares, polisacáridos y proteínas no hidrolizadas las cuales enla etapa de separación de fases por mezcla de solventes fueronprecipitados y se encuentran en la fase orgánica (Pingound, 2010).

Según Philips (2005) el ADN tiene carga negativa otorgada por susgrupos fosfato.(Salazar, 2007). Aprovechando esta propiedad seagrego una mezcla polar de solventes orgánicos compuesta porfenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1).y así separar loscomponentes de interés en este caso ácidos nucleicos en la faseacuosa.

Esta fase se transfirió a un tubo nuevo donde se adicionoIsopropanol que precipita los ácidos nucleicos ya que soninsolubles en soluciones alcohólicas (Philips, 1995; Salazar,2007). Inmediatamente después se observo la formación de lashebrillas de ADN.En la parte final de la extracción se centrifugó el tubo a10000rpm y la pastilla obtenida se dejo secar para luego volver aresuspenderla en buffer TE.

Una vez terminada la extracción se procedió a la cuantificación yvisualización del ADN en gel de agarosa.

La concentración estimada con el marcador y su modelo nos diceque la primera banda tiene un tamaño de 10.25 Kb, y la segunda untamaño de 130 pb. Debido a que el marcador posee un rango detamaño de 10037 a 200 pb y que de acuerdo con Krebs,(2014) eltamaño del genoma de E. coli es de 4.6 Mb a 5.5 Mb el tamaño de ADNobtenido es solo una estimación de lo que puede estar presente enla muestra.

Para este tipo de extracciones donde se quiere extraer ADN de altopeso molecular Pingoud (2010) sugiere utilizar concentración deagarosa de hasta 0.3% a 2% ya que así se logra una mayor movilidadelectroforética sin embrago hay mayor rango de separación entrelas bandas (Salazar, 2007). La concentración de agarosa con la quese trabajo fue 1% permitiendo así migración efectiva únicamente alos fragmentos de ADN de bajo peso molecular no obstante lostamaños de pares de bases reportados para ADN genómico de E. coli sonmuy superiores al rango de tamaño que se puede obtener por unaelectroforesis en gel de agarosa.(Salazar, 2007).

Otro de los factores de gran importancia es la elaboración del gelde resolución, ya que de este depende la transmisión de lacorriente eléctrica, y además mantiene el pH sin variacionesmientras se hace la corrida electroforética. La elaboración enesta práctica del gel fue realizada por otro equipo por lo cual nose desconoce si los resultados obtenidos fueron alterados por estapreparación.

El análisis en el NanoDrop permitió estimar la concentración deácidos nucleicos en solución. A una longitud de onda de 260 nm seobtuvo una concentración de 1054.8 ng/μl y 661.2 ng/μl parabacteria y fresa respectivamente.

Salazar menciona que para medir el nivel de contaminación porproteínas el cociente 260/280 se considera optimo cuando estaentre 1.8-2.0. De acuerdo con los resultados existe presencia deproteínas ya que el cociente es de 1.56 y 1.12 para la muestra ADNde E. coli y de fresa respectivamente.

Además el cociente 260/230 nos sirve para la determinación decontaminación por fenolatos, compuestos aromáticos, tiocianatos,péptidos u otros compuestos. Una muestra pura se espera un rangode 2-2.2. Para las muestras de ADN de E. coli y fresa los cocientesfueron de 1.8 y 0.42 respectivamente, uno de los contaminantes enambas muestras posiblemente sea el EDTA ya que ambas muestras enla metodología ocupan resuspender en buffer TE el cual contieneEDTA.(Salazar).

Para el análisis densitométrico una de las variables a considerares el tiempo de corrida electroforética, ya que la bibliografíaindica un tiempo alrededor de 60 y 40 minutos, dejar correr el gelel tiempo necesario ayuda a tener una mejor resolución de lasbandas. Entre mejor resolución tenga la banda el programa podrádeterminar mejor la cantidad de luz.

Conclusiones El marcado de peso molecular utilizado en la práctica resulto

ser inadecuado para la estimación del ADN genómico de E. coli,no obstante este marcador permite estimar fragmentos pequeñosde ácidos nucleicos.

La concentración de 1% de agarosa no es la apropiada si sedesea la visualización de fragmentos de ADN de gran tamañocomo los requeridos para fragmentos de ADN genómico de E. coli.

La técnica no menciona la utilización de RNAsas lo cualhubiera asegurado la ausencia de ARN y la estimación de laconcentración de ácidos nucleicos se deba únicamente por losfragmentos de ADN

Teniendo en cuenta que el ADN genómico de E. coli esaproximadamente de 4.6Mb-5.5Mb se debió disminuir a 25V o 75Vy el tiempo de electroforesis aumentarse para conseguir lamejor resolución posible.

Cuestionario 1

1.- Mencione la función de cada uno de los compuestos que seutilizan durante la práctica

1. El buffer TE (Tris-HCl; EDTA) se utiliza en la resuspención de lapastilla bacteriana debido a que el EDTA inhibe la acción denucleasas.

2. El SDS (dodecil sulfato sódico) no solo se utiliza para desplazarlas estructuras lipídicas de las proteínas si no que también lasdespliegan (lisa la bacteria).

3. La proteinasa K es una enzima que rompe las proteínas que posteriormente se extraen con disolventes orgánicos.

4. El NaCl crea un medio isotónico que estabiliza los ácidos nucleicoslibres.

5. El CTAB además de solubilizar la membrana celular forma un complejocon el ADN permitiendo su precipitación.

6. La solución fenol/cloroformo/alcohol isoamílico se utiliza paramantener separadas las fases después de la centrifugación ademásque evita la aparición de espuma tras la agitación.

7. El isopropanol sirve para precipitar el ácidos nucleicos.

2.- Indique 5 protocolos de biología molecular que dependen de laextracción de ADN, cite al menos un estudio que utilice cadaprotocolo.

1) Reacción en cadena de polimerasa (PCR): Analysis of relative gene expressiondata using real-time quantitative PCR and the 2 ΔΔCT method−

2) Clonación de un fragmento de DNA: Aislamiento de clones conactividad endo-B-1, 4-glucanasa a partir de un segmento de ADN de13Kb de Clostridium sp IBUN22A.

3) Pruebas de paternidad: Aplicación de las técnicas de polimorfismode DNA en la resolución de casos de abigeato, identificaciónindividual y determinación de paternidad

4) Detección de enfermedades: Extracción de ADN de Trypanosoma cruzimediante tratamiento con bromuro de hexadecil-trimetil-amonio.

5) Identificación de cadáveres: Revelado de manchas latentes:efectividad del luminol y evaluación de su efecto sobre el estudiodel DNA

3.- Redacte un protocolo de extracción de ADN con base en elmétodo mostrado en el video. (Sugiera cantidades y tiempos paracada paso):

Lisis celular1) Congelar 24 horas 100gr de fresas dentro de una bolsa de plástico

para crear los cristales dentro de las células.2) Dejar descongelar las fresas a temperatura ambiente.

Extracción de DNA3) Una vez descongeladas las fresas, añadirle 50ml de jugo de piña a

temperatura ambiente.4) Moler hasta obtener una mezcla homogenizada 5) Filtrar el contenido de la bolsa depositando el jugo en un vaso de

de vidrio previamente desinfectado6) Agregar 50 ml de Bacardi y dejar reposar hasta observar

precipitación en la fase acuosa.7) Transferir la fase acuosa a un recipiente de vidrio.8) Dejar en el refrigerador durante 2 horas y repetir el paso 5 y 6.

Cuestionario 21.) ¿De qué manera cuantificarías el ADN en caso de no

contar con espectrofotómetro?Se puede utilizar la técnica de Fluorometría la cual es mássensible y menos susceptible a interferencias de proteínas ycontaminantes que estén presentes en la muestra. Elfundamento de esta técnica es la unión especifica decolorantes fluorescentes al ácido nucleico que absorbe la luza una longitud de onda determinada y emite luz de unalongitud de onda superior es decir una de menor energía. Deesta manera se hace una relación entre la concentración deácido nucleico y la intensidad de emisión fluorescente.También esta técnica necesita de estándares de concentraciónconocida, para poder interpolar y así encontrar unaconcentración desconocida.Uno colorante empleado es el Hoechst 33258 una bis-benzimidaque se intercala en la doble cadena de ADN en regiones ricasde AT que se emite en el espectro a 35 0nm y se emite en elvisible a 450 nm.

2.) Menciona otra tinción que podrías utilizar de DNA engeles de agarosaSe puede utilizar el SYBR®Safe, el cual se une de manera nocovalente a los ácidos nucleicos. Tiene una fluorescencia a280 nm, una excitación máxima a 502 nm y una emisión máxima a530 nm. El ADN puede visualizarse con una luz ultravioletaen el rango de 470 a 530 nm.

BIBLIOGRAFIA

1) Jorge Zabala Castro. (2005). Manual De Tecnicas Basicas De Biologia Molecular. Merida, Mexico: Ediciones De La Universidad Autonoma De Yucatan.

2) Bruce Alberts, Dennis Bray, Karen Hopkin,Peter Alter. (2004). Introducción A La Biología Molecular. Madrid- España: Medica Panamericana

3) Gloria Morcillo, Estrella Cortés, josé García. (2013). Biotecnología y Alimentos. Madrid, España: UNED

4) John Hedges, Erica Hedges. (2004). Restos óseos de necrópolis tardorromanasdel Puerto de Mazarrón, Murcia. Murcia- Roma: (Editrial no disponible)

5) Denisse Peña Tapia. (2005, septiembre 2). Estudio de La Diversidad Genetica De Caricaceas en el Sur Del pais Mediante marcadores RAPD. 66. 2015, septiembre 9, De . Base de datos: google.books.com.

6) Wilberth Philips, Helga Ramirez & Paul J. Fritz. (1995). Marcadores De ADN:Teoria, Aplicaiones Y Protocolos De Trabajo. Turrialba, Costa Rica: CATIE.

7) Recuperado el 13 de septiembre de 2015 a las 11:00 AM: http://scielo.isciii.es/scielo.php?pid=S1135-76062002000200004&script=sci_arttext

8) Recuperado el 13 de septiembre de 2015 a las 11:10 AM: http://www.revistabiomedica.org/index.php/biomedica/article/view/943

9) Recuperado el 13 de septiembre de 2015 a las 11:15 AM: http://sedici.unlp.edu.ar/handle/10915/11122

10) Recuperado el 13 de septiembre de 2015 a las 11:18 AM: http://revistas.javeriana.edu.co/index.php/scientarium/article/view/4944

11) Recuperado el 13 de septiembre de 2015 a las 11:25 AM: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1046202301912629

12) Adriana Salazar Montes.(2013).Biología molecular.México, D.F: Mc Graw Hill.13) A. Pingound.( 2010).Biochemical Methods. Germany, Institut fur biochieme

justus- lienbig:Wiley14) Joselyn E. Crebs.(2014).Lewin´s Genes XI. India. Daryaganj: Jones and

Barlett publishers.