ESTUDIO DE UN MÉTODO EFICAZ PARA LA DETECCIÓN DE ESCHERICHIA COLI EN AGUAS

LABORATORIO -SANTIAGO PAG 1 DE 52 PROYECTO COLI ID

Copyright Grupo AGBAR 1997

0. ÍNDICE

0. ÍNDICE.....................................................................................................................................1

1. INTRODUCCIÓN....................................................................................................................5

1.1 IMPORTANCIA DE LOS ORGANISMOS COLIFORMES ........................................5

1.2 ....................................................... IMPORTANCIA DE LA ESCHERICHIA COLI 7

1.2.1.......IMPORTANCIA DE LA ESCHERICHIA COLI EN SANIDAD MEDIOAMBIENTAL . 8

2. DETERMINACION DE COLIFORMES.................................................................................9

3. OBJETIVO DEL ESTUDIO ....................................................................................................9

4. MÉTODOS Y MATERIALES.................................................................................................9

5. DESARROLLO DEL ESTUDIO ...........................................................................................10

5.1 ESTUDIO DE LOS MEDIOS USANDO CULTIVOS PUROS..................................10

5.1.1..........................................................................ESTUDIO DE ESPECIFICIDAD 11

5.1.2ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD, EFICIENCIA, EXACTITUD Y PRECISION DE RECUENTO DE LOS METODOS DE

5.2 ESTUDIO DE LOS MEDIOS USANDO MUESTRAS REALES..............................17

5.3 ESTUDIOS ESTADÍSTICOS......................................................................................18

6. IDENTIFICACIÓN DE COLONIAS .....................................................................................21

7. CONCLUSIONES..................................................................................................................21

8. OBJETIVOS...........................................................................................................................23

8.1 OBJETIVO PRINCIPAL .............................................................................................23

8.2 OBJETIVOS INTERMEDIOS.....................................................................................23

9. MATERIAL Y MÉTODOS....................................................................................................24

9.1 MUESTRAS DE AGUA..............................................................................................24

9.1.1................................................................................AGUAS SUPERFICIALES 24

9.1.2............................AGUAS SOMETIDAS A DIFERENTES TIPOS DE TRATAMIENTO 24

9.1.3...............................................................................AGUAS SUBTERRÁNEAS 25



9.2 ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS MEDIANTE MÉTODOS CROMOGÉNICOS ......................................................................................................25

9.3 ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS MEDIANTE MÉTODOS FLUOROGÉNICOS.....................................................................................................25

9.4 ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS MEDIANTE LOS MÉTODOS DE REFERENCIA..............................................................................................................25

9.5 RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFAS ...................................................25

9.6 VERIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE COLONIAS ..........................................26

9.7 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS DATOS ............................................................26

10. RESULTADOS ......................................................................................................................26

10.1..........................................................3.1. MUESTRAS DE AGUA SUPERFICIAL 26

10.1.1ANÁLISIS DE LA CAPACIDAD DE LOS MÉTODOS ID, MP Y CT PARA DETECTAR E. COLI EN AGUAS SUPERFICIA

10.1.2ANÁLISIS DE LA CAPACIDAD DEL MÉTODO ID PARA DETECTAR COLIFORMES TOTALES Y E. COLI

10.2....................AGUAS SOMETIDAS A DIFERENTES TIPOS DE TRATAMIENTO 31

10.2.1MUESTRAS DE AGUA SUPERFICIAL O EFLUENTES DE ALTA CALIDAD MEZCLADAS CON AGUA TRATA

10.2.2........................................MUESTRAS DE AGUA MARGINALMENTE CLORADA 35

10.3........MUESTRAS DE AGUA SOMETIDA A PROCESOS DE POTABILIZACIÓN 39

10.4.............................................................MUESTRAS DE AGUA SUBTERRÁNEA 40

10.5MUESTRAS DE AGUA CON ELEVADOS NIVELES DE BACTERIAS HETEROTROFAS 46

11. CONCLUSIONES..................................................................................................................48

12. BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................49



ESTUDIO DE UN MÉTODO EFICAZ PARA LA DETECCIÓN DE ESCHERICHIA COLI EN

AGUAS

MEMORIA DEL PROYECTO PGID99INN02E



PROYECTO REALIZADO POR EL LABORATORIO DE MICROBIOLO GIA DEL ISTITUTO DE INVESTIGACIONES Y ANÁLISIS ALIMENTA RIOS DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Y EL LABORATORIO CENTRAL DE AQUAGEST GALICIA.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

PROFESOR DOCTOR MANUEL JOAQUÍN GARRIDO VÁZQUEZ

PROFESOR DR. D. MANUEL ARAUJO PRADO

PROFESORA DRA. DÑA. ROSA ANA SUEIRO BENAVIDES

D. CARLOS SANTOS RODRÍGUEZ

LABORATORIO CENTRAL AQUAGEST GALICIA

D. MARIANO JULIO GÓMEZ LÓPEZ (INVESTIGADOR PRINCIPAL)

DÑA. MARÍA JOSÉ VÁZQUEZ GARCÍA

DÑA. MARÍA DEL PILAR PENA CAAMAÑO

DÑA. MARÍA TERESA DÍAZ DÍA



1. INTRODUCCIÓN

La próxima entrada en vigor de la Directiva 98/83 [1], sobre la calidad de las aguas destinadas al consu-mo público, que obliga a la determinación individual de la Escherichia coli, además de las coliformes totales supone, para las empresas suministradoras de agua, la adopción de nuevas estrategias de medida de dichas bacterias. Esta nueva reglamentación modifica a las nacionales de diversos países de la CEE y USA [2-6], que hasta este momento exigían solo la determinación de coliformes fecales y coliformes totales y, se adapta a las nuevas recomendaciones que la OMS [2] dio para la calidad bacteriológica de aguas potables en 1993. Estas directrices se enmarcan dentro de nuevos criterios de contaminación, se-gún los cuales los organismos coliformes se analizan solo como señalizadores de la eficacia del trata-miento y la integridad del sistema de distribución no como indicadores de la presencia de patógenos, mientras que los organismos coliformes termotolerantes, en este caso los se analizan como indicadores de polución fecal.

Hasta este momento, en casi todos los laboratorios de estas empresas se determinan coliformes totales y coliformes fecales de acuerdo con la definición siguiente: todo bacilo gramnegativo, capaz de desarro-llarse en presencia de sales biliares u otros agentes (tensioactivos) que tengan propiedades similares in-hibitorias del crecimiento y que sean capaces de fermentar la lactosa a temperaturas de 35º ó 37ºC, con producción de ácido, gas y aldehido en un lapso de 24 a 48 horas; también son oxidasa negativas, no esporágenas y reducen el nitrato a nitrito. Este grupo comprende, según la clasificación de Clark y Pagel los géneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter pertenecientes a la familia de las entero-bacterias. Sin embargo, hay autores que discrepan de esta clasificación como Lecrerc y Mossel [7] que incluyen Serratia y Buttiauxella.

En 1904, Eijkman [8] propuso que la producción de gas a partir de glucosa a 46º C podría ser un buen método para la determinación de coliformes de origen fecal. Una modificación de este método sirve para definir las bacterias coliformes fecales termotolerantes, que son las que poseen las propiedades antes citadas a una temperatura de 44º ó 45ºC. Estas últimas, cuando fermentan tanto la lactosa como otros sustratos adecuados, como el manitol, a las mismas temperaturas con producción de ácido y gas y que también forman indol a partir del triptófano, se consideran como presuntivas. Se puede confirmar que se trata de mediante la demostración de un resultado positivo en la prueba del rojo de metilo, al no producir acetilmetilcarbinol y no utilizar citrato como única fuente de carbono. Estas no son definiciones taxonó-micas sino prácticas de trabajo que se usan en el análisis del agua y, en ese sentido, están comprendidos miembros de diversos géneros. Así por ejemplo, algunos organismos que desde el punto de vista taxonó-mico se identificarían como coliformes no serán reconocidos como tales cuando se analizan en el agua, como también algunas cepas de que no son termotolerantes. En estos ejemplos se incluyen especies de bacterias coliformes que son anaerogénicas y algunas que no fermentan la lactosa. Dentro de los colifor-mes termotolerantes aparte de la E. coli, se pueden encontrar, entre otros menos frecuentes, Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae.

1.1 IMPORTANCIA DE LOS ORGANISMOS COLIFORMES

El uso de organismos intestinales normales como indicadores de contaminación fecal, en lugar de los patógenos mismos, es un principio de aceptación universal en la vigilancia y evaluación de la seguridad microbiana en los sistemas de abastecimiento de agua. Lo ideal sería que el hallazgo de dichas bacterias indicadoras denotara la presencia posible de todos los organismos patógenos pertinentes. Las exigencias a las que debe responder un organismo indicador las podemos agrupar en:

♦ Epidemiológicas: La relación entre un indicador, su naturaleza o concentración y la probabilidad de aparición de infecciones en la población debe establecerse a partir de estudios o encuestas epide-miológicas.



♦ Ecológicas: Un buen indicador debe ser específico de contaminación fecal; debe hallarse de forma constante en las heces de los animales de sangre caliente y estar asociado de forma exclusiva a las aguas residuales. Es decir, su presencia en ambientes no polucionados debe ser mínima o nula.

♦ Bacteriológicas: Los organismos indicadores deben ser más resistentes que los patógenos a los agentes desinfectantes y por otra parte, ser incapaces de reproducirse o crecer, en el ambiente acuá-tico.

♦ Taxonómicas: Los organismos indicadores deben ser fácilmente reconocibles y clasificables en especies de acuerdo con los criterios bacteriológicos existentes. Es decir, cuando un organismo in-dicador corresponda a una población de determinados organismos, ésta debe estar perfectamente de-finida.

♦ Metodológicas: Un buen organismo indicador debe ser fácilmente aislable, identificable y enume-rable en el menor tiempo posible y con el menor coste. Debe ser capaz de crecer en los medios de cultivo empleados, estar distribuido al azar en las muestras y ser resistente a la inhibición de su cre-cimiento por otras especies.

En la práctica, todos estos criterios no pueden darse en un solo organismo, aunque las bacterias colifor-mes cumplen muchos de ellos: están siempre presentes en aguas que contienen patógenos entéricos, su tiempo de supervivencia es muy superior al de microorganismos productores de enfermedades: Mc Feters y colaboradores [9] señalan que mientras un coliforme sobrevive una media de 17 horas, una Salmonella typhi tiene una vida media de 6 horas y un Vibrio cholerae tiene una vida media de 7,2 horas, razón por la cual puede suponerse que en la mayoría de los casos en los cuales el agua no contenga coliformes esta-rá libre de bacterias productoras de enfermedades. Por otra parte, el mejor indicador conocido de conta-minación fecal de origen humano o animal es la presencia de coliformes fecales, ya que las heces contie-nen dichos microorganismos, presentes en la flora intestinal, y, de ellos, entre un 90% y un 100% son mientras que en aguas residuales y muestras de agua contaminadas este porcentaje disminuye hasta un

59% [10]. De echo, un gramo de heces humanas contiene entre 5*109 y 5*1010 bacterias. Es decir, más del 40% del peso húmedo de las heces humanas está compuesto de células bacterianas.

Si bien las bacterias coliformes pueden no tener relación directa con la presencia de virus en aguas pota-bles, el uso de la prueba coliforme sigue siendo esencial para vigilar la calidad microbiana del agua en los sistemas de abastecimiento. Se sabe que los quistes de algunos parásitos son más resistentes a la des-infección que los organismos coliformes. La ausencia de estos últimos en agua de superficie que sola-mente ha sido desinfectada no significa necesariamente que también haya ausencia de quistes de Giar-dia, amebas u otros parásitos. Es preciso tener en cuenta que las bacterias coliformes no provienen solo de las heces de los animales de sangre caliente, sino también de la vegetación y el suelo [11-13]. Bajo ciertas condiciones, dichas bacterias pueden también persistir en nutrientes que provienen de materiales de construcción no metálicos. Por las razones expuestas, la presencia de algunos microorganismos coli-formes (1-10 ufc/100ml), especialmente en aguas subterráneas que no hayan sido tratadas, puede tener poca importancia desde el punto de vista sanitario, siempre que haya ausencia de organismos coliformes fecales.

También se han encontrado relaciones entre la y la fauna heterótrofa presente en el agua, de tal suerte que en experiencias de laboratorio se ha podido comprobar que en agua esterilizada en autoclave el nú-mero de presentes es inversamente proporcional al número de bacterias heterótrofas presentes [14]. Este resultado se refleja claramente en el gráfico 1:



0 1 2 3 4 5 6 7 8

2

3

4

5

6

7

Días

Col

if. 1

/L. Agua de mar esterilizada en autoclave + 100.000 bacterias marinas por mL

Agua de mar esterilizada en autoclave + 1000 bacterias marinas por mL

Agua de mar esterilizada en autoclave + 10 bacterias marinas por mL

Agua de mar esterilizada en autoclave

Período de Supervivencia de la E. colien agua de mar esterilizada tras la adición de bacterias marinas

Microbiologia de las aguas

G. Rheinheimer

Existen otros organismos que satisfacen algunos de estos criterios, aunque sin alcanzar el grado de satis-facción de las bacterias coliformes, y que en determinadas circunstancias, pueden usarse también como indicadores suplementarios de contaminación fecal. El significado que puede adjudicarse a la presencia o ausencia de determinados indicadores fecales varía con cada organismo y especialmente con el grado de relación que dicho organismo guarda con las heces.

1.2 IMPORTANCIA DE LA ESCHERICHIA COLI

Además de las características ya citadas, de todos los organismos coliformes, solo los tienen un origen específicamente fecal, pues están siempre presentes en grandes cantidades en las heces de los seres vivos de sangre caliente y rara vez se encuentran en agua o suelo que no haya sufrido algún tipo de contamina-ción fecal. Por tanto, se considera que la detección de éstos como organismos fecales o la presunción de constituye una información suficiente como para estimar la naturaleza fecal de dicha contaminación. Es poco probable que en el sistema de explotación se desarrollen nuevamente organismos fecales [15], salvo que existan los suficientes nutrientes bacterianos ( DBO > 14 mg/L, T>13ºC y no haya cloro libre resi-dual). Sin embargo, estudios recientes inyectando en sistemas de distribución, han demostrado que una vez contaminado éste, al cabo de unos diez días, se produce acumulación de bacterias en el biofilm de las tuberías. Pese a todo, la colonización de la red por dicho microorganismo es sólo parcial y transitoria [16]

Flanagan [6] ha resumido la interpretación de la presencia de como sigue: "Cuando los están presentes en un gran número, la interpretación es que ha tenido lugar una polución fuerte y/o reciente por desechos animales o humanos. Si el número de es pequeño indica que la polución, del mismo tipo, es menos re-ciente o menos importante. Si se detectan coliformes pero no señala que la polución es reciente pero de origen no fecal o de origen fecal pero lejana, de modo que los coliformes intestinales no han sobrevivi-do".

Otra característica importante de las , es que pueden ser vectores de algunas enfermedades. en este caso se trata de patógenos, de los cuales existen muchos serotipos diferentes capaces de causar gastroenteritis en humanos y animales, siendo éstas especialmente serias en recién nacidos y niños de edad inferior a 5 años. Pese a que se considera que los patógenos representan menos del 1% del total de coliformes pre-sentes en el agua contaminada, basta con 100 organismos para causar una enfermedad.



La importancia de este microorganismo queda patente en muchos casos a lo largo de la historia. Desde que Bray publicó en 1.945 el primer estudio epidemiológico sobre la presencia de cepas de en 42 de los 44 recién nacidos con diarrea que estaban ingresados en un hospital londinense, se han descrito muchos episodios de trastornos debidos a la contaminación producida por esta bacteria. [17-18]. Una extensa revisión de la importancia de este microorganismo y las características de sus serotipos puede encontrar-se en la referencia [17].

Entre los diversos tipos de patógenos podemos diferenciar:

♦ Enteropatogénico (EPEC): Son aquellas cepas asociadas a diarreas infantiles, denominadas a me-nudo gastroenteritis infantiles (GEI), que se presentaron en forma epidémica en la década de los 40 en los países industrializados, decreciendo a partir de 1.970.

♦ Enterotoxigénico (ETEC): Son capaces de producir enterotoxinas LT (enterotoxina termolábil), bastante parecida a la toxina del cólera y ST (enterotoxina termoestable), que parece encubrir a un grupo de varias toxinas parecidas. En la actualidad los ETEC constituyen una de las principales causas de diarrea infantil en los países en vías de desarrollo. En los países industrializados estas epidemias son excepcionales. Son también los agentes más frecuentes de la llamada diarrea del via-jero; enfermedad que se produce habitualmente a los 4-6 días de llegada a otro país, generalmente tropical.

♦ Enteroinvasivas (EIEC): Algunas cepas de pueden ser responsables de un cuadro clínico disenté-rico similar al de Shigella. La enfermedad se caracteriza por signos de toxemia con malestar, fiebre, intensos dolores intestinales y heces acuosas con sangre, mucus y pus. Estas cepas de pertenecen a un número limitado de serotipos y se parecen por sus características bioquímicas, antigénicas y por su comportamiento en modelos experimentales a las Shigellas aunque se diferencia de éstas por dar negativo el test de la lisina descarboxilasa. Se denominan enteroinvasivas ya que tras establecer contacto con el epitelio del intestino grueso, destruyen el borde ciliado y penetran en las células, dando lugar a ulceraciones e inflamación intestinal.

♦ E coli productora de verotoxina (VTEC): Es causa de diarrea, que tienen graves secuelas: colitis hemorrágica y posiblemente síndrome urémico hemolítico. Estas bacterias son, a diferencia de las anteriores clases, sorbitol y MUG (4-metilumbiliferil-β-D-glucorónido) negativos. Algunos autores incluyen a las bacterias de este grupo entre las ETEC, pero como clásicamente se ha considerado entre estas últimas a las bacterias capaces de producir LT y ST, se ha diferenciado entre ambas cla-ses.

1.2.1 IMPORTANCIA DE LA ESCHERICHIA COLI EN SANIDAD MEDIOAMBIENTAL .

Por citar sólo algunos de los numerosos y más recientes casos en los que la es la responsable de muertes y gastroenteritis a lo largo y ancho del planeta se tienen los ejemplos significativos siguientes: el que se produjo en Japón en el año 1996 con más de 9.500 personas contaminadas y una decena de muertes en la ciudad de Sakai, de infección de varios cientos de personas, incluyendo cinco muertos, en Inglaterra de-bido a su presencia en carne de vacuno y de no menos de 55 muertos en Estados Unidos y Canadá, se puede citar que entre diciembree de 1989 y enero de 1990, la comunidad agrícola de Cabaol, Missouri, se vió afectada por un E. coli hemorrágico que originó 4 muertes, 32 hospitalizaciones y 243 casos de di-arreas; siendo la hipótesis más sólida de contaminación la que achacó esta contaminación a los reempla-zos de medidores y a las roturas de la red de distribución que se produjeron poco antes de que se mani-festaran los primeros casos de la enfermedad [31]. Incluso, se puede destacar un caso más cercano, en la provincia de Lugo, donde según la Sociedad Gallega de Microbiología Clínica, ha afectado a no menos de ocho personas desde 1.992 y en 1.995 se detectó en un 2% de la carne que llegaba al matadero. Estos pocos ejemplos indican la importancia de controlar esta bacteria de una forma escrupulosa.



2. DETERMINACION DE COLIFORMES

Las bacterias coliformes, de acuerdo con la diversa y numerosa bibliografía existente [2,3,6,10,17,19-22], se pueden determinar, sin necesidad de grandes inversiones que incluyan la compra de aparatos sofistica-dos como PCR, medidores basados en el cambio de impedancia de un medio de cultivo, de diversas for-mas: métodos basados en el número más probable (NMP), de presencia-ausencia (P/A), basados en la filtración de membrana (MF) y métodos cromogénicos y/o fluorogénicos basados en reacciones específi-cas de estos microorganismos. Actualmente, los métodos NMP están en claro retroceso frente a las otras opciones. Entre los incluidos en la MF hay variaciones en el medio utilizado: puede ser Tergitol TTC, ENDO AGAR gelose, Agar de Chapman, Hektoen Agar, Levine EMB, Agar verde brillante-bilis, etc. e incluso en la forma de hacerlo: puede ser una filtración directa e incubación sobre una placa que conten-ga el medio o bien usar discos de cartón nutriente que se empapan con el medio. Los medios P/A tienen una desventaja inicial y que su nombre indica: no reflejan la "cantidad de contaminación" (número de colonias que se desarrollan) del agua analizada. En los medios cromogénicos y/o fluorogénicos, basados en reacciones con indicadores específicos (tecnología de sustrato definido), se produce un cambio de coloración o emisión de fluorescencia en caso de estar presentes organismos coliformes y respectiva-mente. Hay autores [17] que diferencian entre medio cromogénico y fluorogénico según el sustrato utili-zado (unos provocan coloración y otros fluorescencia), pero en este trabajo se consideran indistintamen-te.

El problema surge en el momento en que se quiere determinar específicamente el número de presentes ya que los medios cromogénicos más extendidos solo indican presencia o ausencia y los otros medios -los usados tradicionalmente en MF y NMP- no son selectivos, solo son presuntivos. Por las razones ex-puestas, es por lo que se precisa un método de detección que sea a la vez selectivo y confirmativo. Hace poco tiempo se han puesto a disposición de los microbiólogos nuevos medios de incubación, cromogéni-cos, que intentan evaluar simultáneamente organismos coliformes y Escherichia coli. Se trata de medios que contienen sustratos cromogénicos enzimáticos.

3. OBJETIVO DEL ESTUDIO

Es determinar la idoneidad de uno de los medios cromogénicos descritos en el capítulo anterior para ana-lizar y diferenciar organismos coliformes, intentando establecer una comparación de resultados con mé-todos ya existentes para confirmar que se trata de un medio válido y utilizable.

4. MÉTODOS Y MATERIALES

Como medio de referencia se ha escogido un medio de tripcasa de soja (TSA) de la casa Merck, medio general de crecimiento no selectivo. Como medios selectivos se han usado un medio ENDO AGAR-Gelose, de la casa bioMérieux, acorde con la norma ISO 9038-1, que ya ha sido comparado con otros medios [17,23-24] y establecido su crecimiento como idóneo para análisis de agua. El medio sobre el que se va a realizar el estudio es uno denominado COLI ID, de la misma casa. Para identificar las colonias se utilizan galerías API 20E y RapID 20E de la misma casa. Estas galerías se basan en una serie de reaccio-nes específicas que permiten establecer el tipo de organismo de que se trata con una fiabilidad muy ele-vada. Para testar cada medio se usan cepas de material de referencia suministradas por el BCR (Boureau Communitaire de Reference), la ATCC (American Type Culture Collection), la CECT (Colección Espa-ñola de Cultivos Tipo) y Microkit. En el estudio se consideran como organismos coliformes totales todas las colonias que crecen en medio ENDO AGAR tras incubación durante 24 horas a 37º y desarrollan coloración rojo oscuro, están nucleadas con color granate o presentan brillo metálico verde. Se conside-ran organismos coliformes fecales todas aquellas colonias de las mismas características que crecen en medio ENDO AGAR tras incubación durante 24 horas a 44ºC [10,17,19]. Las placas de medio COLI ID se incuban a 37ºC durante 24 horas, considerándose como las colonias de color morado o violáceo, co-mo organismos coliformes totales las colonias de color azul además de las anteriores y como otro tipo de



microorganismos las grisáceas y amarillas (éstas corresponden a pseudomonas según indicación del fa-bricante). Las placas de este medio contienen dos sustratos cromogénicos, uno que reacciona con la ??glucoronidasa, enzima que es producido por el 97% de las cepas de y que hidroliza el enlace o-glucoronosil de los glucorónidos conjugados, coloreando las colonias de esta bacteria de morado o viole-ta y otro que reacciona con la???-galactosidasa, enzima específico producido por los organismos colifor-mes, coloreando las colonias de éstos de azul. La combinación de ambos sustratos optimiza la detección de E. coli y coliformes.

Se han usado membranas filtrantes Millipore HAWG 047 de éster de celulosa.

5. DESARROLLO DEL ESTUDIO

Dado que el medio COLI ID se presenta en frascos de 200 ml, siendo necesario licuarlo, extenderlo sobre placa y dejarlo solidificar cabrían dos posibilidades: proceder como en una filtración de membrana típica o bien añadir una cantidad fija de agua a la placa y echar el medio sobre ella. Para mayor seguridad del estudio han seguido los dos caminos. Las muestras de agua que se han analizado proceden de un río (Río Tambre), un efluente de EDAR (EDAR de Silvouta en Santiago de Compostela) y las preparadas con las cepas de referencia. De cada muestra se han realizado tres placas por el procedimiento de MF corres-pondiendo dos a medio ENDO AGAR, incubadas durante 24 horas a 37º y 44º respectivamente y otra al medio COLI ID incubada durante 24 horas a 37ºC.. Se ha separado el estudio en dos partes, la primera relativa a cultivos puros y la segunda relativa a muestras reales.

5.1 ESTUDIO DE LOS MEDIOS USANDO CULTIVOS PUROS

Los resultados fueron analizados mediante regresión lineal y análisis de varianza usando el paquete esta-dístico Statgrafics 5.0. Además, para la comparación de los diferentes métodos de detección de E. coli en aguas se siguieron los criterios propuestos por Levin y Cabelli y por El-Shaarawi y Pipes [ver referencia 21]. Estos parámetros se definen a continuación:

1.- Eficiencia de recuento: Capacidad del medio de cultivo bajo estudio para cuantificar un microor-ganismo especifico con relación a un medio de referencia. Se puede expresar como la relación entre el recuento en el medio problema y el máximo recuento alcanzado en cualquiera de los otros medios con los que se compara.

• Eficacia relativa del recuento: relación entre el recuento en el medio problema y el máximo recuento alcanzado en cualquiera de los otros medios con los que se compara.

2.- Exactitud: se puede definir como el grado de similitud entre una medida y el valor real. En el pre-sente trabajo se calculó comparando los recuentos obtenidos en el medio problema con los conse-guidos utilizando el medio de referencia (TSA)

3.- Precisión del recuento: mide la variabilidad asociada a los valores obtenidos mediante el uso de una determinada técnica y permite comprobar si la misma se debe a una distribución al azar o está influenciada por factores adicionales.

4.- Sensibilidad: Capacidad del medio de cultivo o método para detectar un microorganismo específico presente en un determinada muestra. También se puede expresar como la capacidad del medio de cultivo para diferenciar los verdaderos positivos.

5.- Especificidad: Capacidad del medio de cultivo para diferenciar el microorganismo o grupo de mi-croorganismos problema de la flora acompañante. También se puede definir un medio como especí-



fico, cuando más del 90% de los cultivos positivos en este medio son verdaderos positivos y cuando menos del 10% de los cultivos negativos son falsos negativos.

6.- Selectividad: Se define como la capacidad de un medio para inhibir o disminuir el crecimiento de la flora acompañante. Para que un medio se considere selectivo, debe de provocar una reducción de 3 órdenes de magnitud, respecto de la flora acompañante del grupo de microorganismos que se pre-tende determinar.

7.- Precisión: Mide el grado de variabilidad asociada a los valores obtenidos mediante una determina-da técnica de detección de microorganismos. Permite comprobar si esta variabilidad se debe a una distribución al azar o está influenciada por otros factores adicionales.

Para la evaluación de la precisión del recuento en los medios se ha calculado el índice de dispersión de Fisher D2, aplicando la fórmula de Eisenhart y Wilson [ver referencia 21]. Esta fórmula se expre-sa como:

[ ] iii xxxND ∑∑−∑= /)( 222

donde xi representa el recuento obtenido para cada placa de la misma muestra y N es el número de réplicas de cada placa (5 por muestra en este caso).

5.1.1 ESTUDIO DE ESPECIFICIDAD

TABLA 1. RESULTADOS DE LA SIEMBRA DIRECTA DE DIFERENTES CEPAS BACTERIANAS EN LO S DISTINTOS MEDIOS DE CULTIVO PARA LA DETECCIÓN DE E. COLI

CEPA COLI ID ENDO AGAR

Aeromonas hydrophyla 1546 - -

Citrobacter malonaticus 863 - -

Citrobacter freundii 401 - -

Enterobacter aerogenes 684 - -

Enterobacter cloacae AQ 1 - +

Enterobacter cloacae R2 - -

Enterococcus faecalis 967 - -

Enterococcus faecium 410 - -

Escherichia coli 185 + -

Escherichia coli 405 + +






CEPA COLI ID ENDO AGAR






Escherichia coli AQ2 + +

Flavobacterium odoratum 998 - -

Klebsiella oxytoca 860 - -

Klebsiella pneumoniae AQ3 + -

Klebsiella pneumoniae 142 - -

Klebsiella pneumoniae AQ4 - -

Kluyvera ascorbata 861 - -

Kluyvera cryoscrescens 862 - -

Pseudomonas putida 845 - -

Salmonella choleraesuis 556 - -



Serratia liquefaciens 483 - -

Serratia marcescens 824 + -

Shigella sonnei 452 + -

Staphylococcus aureus 435 - -

Staphylococcus epidermis 231 - -

Yersinia enterocolitica 754 - -

El signo + significa crecimiento de la cepa bacteriana testada con desarrollo de características típicas de E. coli en ese medio. El signo - significa tanto crecimiento de la cepa bacteriana testada sin desarrollo de características típicas de E. coli en ese medio como inhibición del crecimiento de la cepa en él.

A partir de los datos mostrados en la tabla anterior se han determinado los porcentajes de falsos positivos - cepas que crecen como colonias típicas en un determinado medio y no se corresponden con el microor-ganismo investigado - y los falsos negativos - cepas de microorganismos que debiendo crecer como colo-nias típicas en los medios indicados no lo hacen - recuperados en cada uno de los medios estudiados



TABLA 2. PORCENTAJE DE FALSOS POSITIVOS (FP) Y FALSOS NEGATIVOS (FN) OBTENIDOS POR CADA UNA DE LAS TÉCNICAS EMPLEADAS PARA LA DETERMINACIÓN DE E. COLI.

METODO Nº1 FP(%) Nº2 FN(%)

COLI ID 25 12 11 0

ENDO AGAR 25 4 11 18

1 Número de cepas testadas en los diferentes medios y que corresponden a verdaderos positivos 2 Número de cepas testadas en los diferentes medios y que corresponden a falsos negativos.

Para interpretar la tabla anterior es necesario tener en cuenta que un medio o meto de detección debe ser específico para el microorganismo problema, de forma que más del 90% de los cultivos positivos en ese medio sean verdaderos positivos; es decir, menos de un 10% de falsos positivos y que menos de un 10% sean falsos negativos.

5.1.2 ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD , EFICIENCIA , EXACTITUD Y PRECISION DE RECUENTO DE LOS METODOS DE DETECCIÓN DE E. COLI EVALUADOS .

Para determinar las variables definidas en el apartado 5.1. se ha procedido a la preparación de muestras a partir de las suspensiones bacterianas de 20 a 80 células/100 ml de cada uno de los cultivos puros.

Como ya se ha indicado, como método de control y referencia se ha usado el agar tripticasa de soja. Estos análisis se han efectuado según la metodología indicada.

Los resultados que se presentan a continuación se corresponden con los obtenidos tras el análisis de las muestras preparadas a partir de cultivos puros de E. coli

TABLA 3. RECUENTOS OBTENIDOS CON LOS MÉTODOS DE DETECCIÓN DE E. COLI A PARTIR DEL ANÁLISIS DE MUESTRAS PREPARADAS A PARTIR DE CULTIVOS PUROS .

MUESTRA TSA COLI ID ENDO AGAR

Cepa 185 53.4 40 0

Cepa 405 56.8 52.4 53.4

Cepa 425 52.6 52.6 57.4

Cepa 426 46.7 30.6 35.0

Cepa 434 21.6 16.8 18.8

Cepa 515 72.8 58.4 73.4

Cepa 533 51.2 9.2 44.6

Cepa 543 80.4 61.0 79.8

Cepa 682 61.0 52.6 61.2

Cepa 683 62.2 51.6 59.4

Cepa AQ2 63.0 61.4 61.8



A partir de los datos presentados en la tabla anterior se han calculado las diferentes variables evaluadas en el presente apartado

5.1.2.1 Determinación de la sensibilidad

Los resultados presentados en la tabla anterior han permitido evaluar la sensibilidad de cada medio sobre la base del porcentaje de muestras en las que se detectó E. coli. De los medios estudiados, el COLI ID ha sido el más sensible ya que al igual que sucedió con el método de referencia (TSA) se ha detectado E. coli en las 11 muestras que se han analizado. El medio ENDO AGAR ha arrojado porcentajes algo infe-riores ya que se han detectado E. coli en 10 de las 11 muestras analizadas (90,91%)

5.1.2.2 Eficacia relativa del recuento

Los recuentos que se han obtenido han permitido, usando tests estadísticos, conocer tanto la eficacia relativa del recuento como la exactitud y la precisión del mismo. A continuación se exponen los resulta-dos correspondientes al cálculo de la eficacia relativa de recuento de los diferentes medios de cultivo que se han evaluado. Estos resultados han sido calculados a partir de la tabla 3.

TABLA 4. COMPARACIÓN DE LA EFICACIA RELATIVA DE RECUENTO DE LOS DIFERENTES MEDIOS PARA LA DETECCIÓN DE E. COLI UTILIZADOS . CÁLCULOS REALIZADOS A PARTIR DE LA TABLA 3.

MUESTRA COLI ID ENDO-AGAR

Cepa 185 74,90 0,00

Cepa 405 95,25 94,01

Cepa 425 91,63 100,00

Cepa 426 65,52 74,90

Cepa 434 77,78 87,04

Cepa 515 79,56 100,00

Cepa 533 17,97 87,11

Cepa 543 72,97 95,45

Cepa 682 85,66 99,60

Cepa 683 82,99 95,50

Cepa AQ2 97,47 98,10

PROMEDIO 76,52 84,70

Los resultados obtenidos indican que el medio ENDO AGAR presenta una mayor eficacia que el medio COLI ID. Sin embargo, deben tenerse en cuenta los resultados individuales para cada una de las mues-tras, puesto que en algunos, como los correspondientes a las cepas 185 ó 533, se han obtenido eficacias relativas muy inferiores al medio que ha dado mayores recuentos.

Para confirmar y completar los análisis de los resultados de los recuentos que se presentan el la tabla 3, se les ha aplicado un análisis estadístico basado en los test no paramétricos de Mann-Whytney y de Wil-coxon. En la tabla 5 se muestran los resultados obtenidos.



TABLA 5. RESULTADOS DEL ANÁLISIS ESTADÍSTICO APLICADO A LOS RECUENTOS OBTENID OS CON LOS DIFERENTES MEDIOS PARA LA DETECCIÓN DE E. COLI . EL CÁLCULO SE HA REALIZADO A PARTIR DE LOS DATOS QUE SE PRESENTAN EN LA TABLA 3.

MEDIOS TEST DE MANN-WHITNEY TEST DE WILCOXON

Z P Z P

TSA/COLI ID -1,67683 0,093576 2,85402 4,32 * 10 -3

TSA/ ENDO AGAR -0,49262 0,622273 1,95604 0,050460

COLI ID/ENDO AGAR 1,05094 0,293286 2,00049 0,045446

Los valores que se han obtenido en el test de Mann-Whitney indican que no existen diferencias significa-tivas entre los recuentos que se han obtenido con los diferentes medios evaluados, ni entre ellos ni con respecto al medio de control (TSA) -para un nivel de significación de 0,05-. Sin embargo, el test de Wil-coxon indica la existencia de diferencias significativas entre los recuentos obtenidos por los diferentes medios con respecto al medio de control. Estas diferencias suponen una tendencia estadísticamente signi-ficativa a obtener recuentos inferiores con respecto al TSA. Esta tendencia se puede considerar lógica si se tiene en cuenta que el medio TSA es un medio no selectivo, mientras que tanto COLI ID como ENDO AGAR incorporan agentes selectivos en su composición, que inhiben el crecimiento de los no coliformes pero que, a su vez, afectan ligeramente a la capacidad del medio para recuperar E. coli.

Por otra parte, si se utiliza el test de Wilcoxon para comparar los recuentos obtenidos entre los diferentes medios detección, se aprecian diferencias significativas entre el empleo de ENDO AGAR y el empleo de COLI ID, que indican menores recuentos de colonias en éste que en aquél.

Otra forma de comparar los recuentos que se han obtenido con los diferentes medios es utilizar un análi-sis de regresión. Este análisis, aplicado a los resultados que se han obtenido utilizando los diferentes medios, ha arrojado los siguientes resultados

TABLA 6. ANÁLISIS DE REGRESIÓN QUE SE HA OBTENIDO A PARTIR DE LOS RECUENTOS OBTENIDOS DEL ANÁLISIS DE MUESTRAS ELABORADAS A PARTIR DE CULTIVOS PUROS UTILIZANDO LOS DIFERENTES MEDIOS .

MEDIOS COEFICIENTE REGRESIÓN (R 2)

TSA/COLI ID 0,5755

TSA/ ENDO AGAR 0,523

COLI ID/ENDO AGAR 0,42

De nuevo se vuelve a observar que la el coeficiente de regresión es inferior en la comparación COLI ID-ENDO AGAR, lo que confirma el análisis anterior de la determinación de eficacia relativa de que en el medio COLI ID se obtienen recuentos menores que en el ENDO AGAR

5.1.2.3 Determinación de la exactitud del recuento.

Los resultados que se han presentado en el apartado anterior referentes a la similitud en la eficacia relati-va del ENDO AGAR y el COLI ID se presentan de nuevo con el cálculo de la exactitud del recuento de los medios de cultivo para la detección de E. coli.



TABLA 7. COMPARACIÓN DE LA EXACTITUD DE LOS DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO PA RA RECUPERACIÓN DE E. COLI A PARTIR DE MUESTRAS PREPARADAS CON CULTIVOS PUROS Y USANDO TSA COMO MEDIO DE CONTROL .

MEDIO EXACTITUD (%)

COLI ID 77,37

ENDO AGAR 86,02

Como se puede observar, al igual que ha ocurrido en el apartado anterior, del cálculo de la exactitud resultan cifras similares a las obtenidas para la eficacia relativa del recuento, siendo el medio COLI ID el menos exacto.

5.1.2.4 Determinación de la precisión del recuento.

Usando los datos que se muestran en la tabla 3, se ha calculado la precisión del recuento de los medios utilizados en el presente trabajo.

Para la evaluación de la precisión del recuento en los medios se ha calculado, como ya se ha citado, el índice de dispersión de Fisher D2, aplicando la fórmula de Eisenhart y Wilson [30]. Esta fórmula se ex-presa como:

[ ] iii xxxND ∑∑−∑= /)( 222

donde xi representa el recuento obtenido para cada placa de la misma muestra y N es el número de répli-cas de cada placa (5 por muestra en este caso).

El resultado D2 para cada muestra y cada uno de los medios que se ha evaluado así como el promedio de los resultados individuales se muestra en la tabla 8.

TABLA 8. COMPARACIÓN DE LA PRECISIÓN DE LOS DIFERENTES MEDIOS PARA LA RECUPERACIÓN DE E. COLI A PARTIR DE MUESTRAS PREPARADAS CON CULTIVOS PUROS .

MUESTRA TSA COLI ID ENDO AGAR

Cepa 185 5,60 22,85 ND

Cepa 405 3,85 6,10 2,31

Cepa 425 4,97 3,63 1,21

Cepa 426 2,27 3,76 0,46

Cepa 434 0,61 7,43 8,45

Cepa 515 0,86 0,16 0,83

Cepa 533 2,75 0,74 3,88

Cepa 543 1,31 1,11 2,22



Cepa 682 9,97 3,98 4,75

Cepa 683 1,40 2,74 6,42

Cepa AQ2 1,69 1,69 5,94

PROMEDIO 3,21 4,93 3,65

Los datos dela tabla 8 permiten comparar la precisión del recuento de los medios que se han usado en este trabajo. Para hacerlo se han tomado el número de muestras con valores de D2 dentro de los límites de ρ= 0,5; 0,05; 0,025 y 0,005 [30] representados en la tabla 9 y en los valores de D2 que se presentan en la tabla 8. Según estos últimos, el medio ENDO AGAR es el que ha dado un menor índice de dispersión, mientras que el COLI ID ha presentado un valor mucho más elevado.

TABLA 9. PORCENTAJE DE MUESTRAS CON VALORES DE D2 DENTRO DE LOS LÍMITES ρρρρ= 0,5; 0,05; 0,025 Y 0,005 PARA LOS MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS .

LIMITE TSA COLI ID ENDO AGAR

0,5 90,91 72,73 80

0,05 90,91 90,91 100

0,025 100 90,91 100

0,005 100 90,91 100

5.2 ESTUDIO DE LOS MEDIOS USANDO MUESTRAS REALES

Tras el estudio inicial trabajando con cultivos puros se ha procedido al estudio con muestras reales, tanto con aguas superficiales como con aguas tratadas. A estas muestras se les ha realizado un análisis pareci-do al que se ha realizado en el caso de los cultivos puros. Los resultados que se han obtenido son:

TABLA 10. DISTINTOS PARÁMETROS EMPLEADOS EN LA EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD D E DETECCIÓN TY ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TOTALES QUE SE HAN OBTENIDO A PARTIR DEL ANÁLISIS DE AGUA SUPERFICIAL . (VALORES PROMEDIO DE 38 MUESTRAS ANALIZADAS )

PARÁMETRO ENDO AGAR COLI ID

Eficacia de recuperación relativa1 (%) 76,3 89.5

Factor de reducción de flora acompañante2 164 313

Reducción logarítmica de la flora acompañante 1.39 1,59

1 El porcentaje de recuperación relativa se ha calculado aplicando la ecuación: Porcentaje de recuperación relativa del medio a evaluar = Recuento en el medio a evaluar/Recuento máximo en cualquier medio)*100

2 Relación entre recuento de bacterias heterótrofas a 37ºC realizados sobre R2A agra y recuentos totales obtenidos en cada uno de los medios evaluados.



TABLA 11. DISTINTOS PARÁMETROS EMPLEADOS EN LA EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE E. COLI QUE SE HAN OBTENIDO A PARTIR DEL ANÁLISIS DE AGUA SUPERFICIAL . (VALORES PROMEDIO DE 62 MUESTRAS ANALIZADAS )

PARÁMETRO ENDO AGAR COLI ID

Eficacia de recuperación relativa1 (%) 70,20 64,64

Factor de reducción de flora acompañante2 1363,08 397.21

Reducción logarítmica de la flora acompañante 2,42 1,60

Precisión3 3.13 3.42 1 El porcentaje de recuperación relativa se ha calculado aplicando la ecuación: Porcentaje de recuperación relativa del medio a evaluar = Recuento en el medio a evaluar/Recuento máximo en cualquier medio)*100 2 Relación entre recuento de bacterias heterótrofas a 37ºC realizados sobre R2A agra y recuentos totales obtenidos en cada uno de los medios evaluados. 3 La precisión se ha obtenido calculando el índice de dispersión de Fisher, D2.

5.3 ESTUDIOS ESTADÍSTICOS

A la hora de presentar los resultados se diferencia entre coliformes totales y E. coli, cuando lo estricta-mente correcto sería diferenciar entre coliformes totales y coliformes fecales . Esto no se ha hecho debi-do a que, como ya se ha mencionado, más del 90% de los coliformes fecales y además, como se demos-trará más adelante -concretamente al estudiar las identificaciones- alguna colonia típica no corresponde a E. coli . Al hacer esta aproximación se incrementa el error.

Los resultados que se han encontrado, tras realizar análisis muestras de agua superficial durante el perío-do comprendido entre Febrero y Septiembre de 1.999 y realizar un número representativo de experien-cias, ofrecen los siguientes valores:

TABLA 11. VALORES MÁXIMOS , MÍNIMOS Y MEDIOS DE COLIFORMES TOTALES Y COLIFORMES Y E. COLI OBTENIDOS AL ANALIZAR MUESTRAS DE AGUA SUPERFICIAL

PARÁMETRO MEDIO VALOR MÁXIMO VALOR MINIMO VALOR MEDIO

Coliformes Totales ENDO AGAR 2670 340 970

E. coli COLI ID 1100 70 431

Coliformes fecales ENDO AGAR 920 150 389

E. coli COLI ID 980 50 349

En una aproximación estadística: dividiendo el número de coliformes totales obtenidas al incubar en medio ENDO AGAR entre el número de coliformes totales obtenidas al incubar en medio COLI ID y procediendo de igual forma para las E. coli y, calculando la desviación estándar, la correlación y el chi cuadrado para cada uno de los casos, se obtiene:



TABLA 12. PARÁMETROS ESTADÍSTICOS QUE SE OBTIENEN AL COMPARAR LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LOS RECUENTOS DE LOS DIFERENTES MEDIOS AL DIFERENCIAR ENTRE COLIFORMES TOTALES Y E. COLI.

σσσσn MEDIA CORRELACION χχχχ2

Colifor. totales(ENDO AGAR)/Colifor. totales (COLI ID)

0,77 2,31 0,94 5,2

E. coli (ENDO AGAR)/ E. coli (COLI ID)

0,71 1,78 0,88 6,3

De la anterior tabla es fácil deducir que existe una cierta paridad entre los datos correspondientes a los organismos E. coli encontrados en cada caso, puesto que la media de los cocientes entre los números de colonias incubadas en ambos se aproxima a la unidad (que sería el caso ideal). En cambio, para los orga-nismos coliformes totales la paridad es mala ya que el mismo cociente se separa bastante de la unidad. Sin embargo, la correlación individual de cada uno de los datos es mejor en el caso de los coliformes totales, como indica el coeficiente de correlación calculado en la gráfica resultante de representar los valores obtenidos en cada medio en cada uno de los casos. De la tabla del chi cuadrado se puede concluir

que para P= 0.05 y 5 grados de libertad, (χ2 = 11,1) que no se puede rechazar la hipótesis de que los re-sultados sean independientes del medio utilizado.

Si se representan las curvas de dispersión de los valores encontrados en las experiencias realizadas para ambos medios, se encuentra que los puntos guardan una relación bastante próxima a la linealidad –como era de esperar en función del valor de correlación de la anterior tabla-, volviéndose a encontrar una mejor relación en el caso de coliformes totales que en el de E. coli..

Correlación entre medios. Colif. totales

y = 0,4537x + 25,526R2 = 0,8793

0200400600800

100012001400

0 1000 2000 3000Medio Endo-Gelose

Med

io C

oli I

D

Serie1

Lineal (Serie1)



FIGURA 1: ANÁLISIS DE REGRESIÓN REALIZADO A PARTIR DE LOS RECUENTOS OBTENIDOS PARA

COLIFORMES TOTALES EN EL ANÁLISIS DE MUESTRAS DE AGUA SUPERFICIAL EMP LEANDO LOS

MEDIOS OBJETO DE ESTUDIO

Correlación entre medios. E. coli

y = 0,7559x - 25,371 R 2 = 0,7732

0

200

400

600

800

1000

1200

0 500 1000 1500

Medio Endo-Gelose

Med

io C

oli I

D

Serie1

Lineal (Serie1)

FIGURA 2: ANÁLISIS DE REGRESIÓN REALIZADO A PARTIR DE LOS RECUENTOS OBTENI DOS PARA E. COLI EN EL ANÁLISIS DE MUESTRAS DE AGUA SUPERFICIAL EMPLEANDO LOS MEDI OS OBJETO DE ESTUDIO

Finalmente, si se realiza un análisis de varianza para cada uno de los casos se tiene:

ANOVA PARA COLIFORMES TOTALES

Fuente de variación Suma de cuadrados Grados de libertad Media F

Regresión 2035041,667 1 2035041,667 10,373

Residuo 11379256,667 58 196194,080

Total 13414298,333 59

ANOVA PARA E. COLI

Fuente de variación Suma de cuadrados Grados de libertad Media F

Regresión 244737,067 1 244737,067 3,698



Residuo 3839009,867 58 66189,825

Total 4083746,933 59

En este caso, se observa que F<F0,05 (4,00) sólo en el caso de los E. coli. Es decir, únicamente en el caso de estos microorganismos se puede concluir que no existen razones para sospechar que exista falta de ajuste, es decir, que ambos medios representan estimaciones de la misma varianza y, por tanto, el modelo no parece ser inadecuado.

En el caso de los coliformes totales existe falta de ajuste, de forma que puede concluirse que el modelo es inadecuado.

6. IDENTIFICACIÓN DE COLONIAS

La última experiencia que se ha realizado ha sido la comprobación del crecimiento en el medio a estudiar de cepas de microorganismos ya conocidos y la identificación de las colonias que han crecido en los ca-sos anteriores. Para la identificación se han usado los medios ya mencionados -API 20 E y RapID 20- que en la bibliografía [17,19-20,22] se reconocen como idóneos y están basados en una serie de reacciones específicas que dan una probabilidad de acierto en la identificación superior al 99,5%. Aquí sí que el medio COLI ID ha dado unos resultados mucho más ajustados a la definición que el medio ENDO AGAR. En las identificaciones correspondientes a las experiencias anteriores, mientras en las placas de medio ENDO AGAR incubadas a 44ºC se han identificado muchos tipos de bacterias en las colonias que por morfología debieran corresponder a coliformes fecales: , K. ornithinolytica, K. pneumoniae, Serratia Odorifera, E. cloacae, Kluyvera spp; en las placas correspondientes a COLI ID todas las colonias mora-das o violáceas identificadas han correspondido a E. coli, excepto algunas que han correspondido a K. Pneumoniae y una que se ha identificado como Citrobacter freundii.

Estas identificaciones confirman los resultados de sensibilidad y especificidad que se citan al inicio del apartado 5.2 y también la afirmación de que aunque no sea estrictamente correcto diferenciar entre coli-formes totales y E. coli (como se ha citado en el apartado anterior debería diferenciarse entre coliformes totales y coliformes fecales) el error que se comete no es apreciable.

TABLA 13. ESPECIFICIDAD DEL MEDIO COLI ID EN EL ANÁLISIS DE MUESTRAS DE AGUA SUPERFICIAL

METODO ESPECIFICIDAD PARA COLIFORMES TOTALES

ESPECIFICIDAD PARA E. COLI

FP1 (%) FN2(%) FP (%) FN(%)

COLI ID 4/121 (3,3) 5/41 (12,2) 0/40 (0,0) 6/97(6,2) 1.Falsos Positivos. (número de colonias que no se han confirmado como coliformes totales o E. coli/número total de colonias típicas examinadas). 2 Falsos negativos (número de colonias no típicas confirmadas como coliformes totales o E. coli/número total de colonias no típicas examinadas)

7. CONCLUSIONES

De los resultados mencionados en los capítulos anteriores pueden sacarse algunas conclusiones importan-tes:



1.- No se han encontrado diferencias significativas entre los recuentos obtenidos con los diferentes medios utilizados, ni entre ellos, ni con respecto a un medio de referencia. Sin embargo, sí se ha apreciado una tendencia estadísticamente significativa a obtener menores recuentos cundo se han empleado los medios COLI ID y ENDO AGAR con respecto al medio de referencia. Esta tendencia es lógica ya que debe considerarse que se están comparando medios selectivos con un medio no se-lectivo como es el TSA

2.- El medio estudiado, COLI ID es muy adecuado para la determinación de E. coli mejor que el tradi-cional medio ENDO AGAR. Es decir, en caso de tener que diferenciar las E. coli del resto de coli-formes termotolerantes es un medio idóneo. El número de falsos positivos, como se deduce de las identificaciones realizadas -coincidentes por las realizadas por bioMérieux en las especificaciones técnicas-se reduce significativamente.

3.- La relación de resultados entre las colonias que corresponden a coliformes totales en el medio ENDO AGAR y las colonias que corresponden a coliformes totales en el medio COLI ID incubado a 37ºC durante 24 horas no es bueno, sino que tiende a ser casi el doble en el primer medio. La rela-ción es incluso inferior que la que se encuentra entre el método NMP y el método MF -usando me-dio ENDO AGAR- o entre el propio método MF usando diferentes medios y recogido en múltiple bibliografía [10,17,19,22,23,25,32,33,34]. Lo mismo puede deducirse del análisis de varianza, que predice que el modelo sólo es bueno en el caso de E. coli. El que los demás parámetros estadísticos estudiados indiquen que la correspondencia de resultados en ambos medios es buena, tanto su corre-lación (coeficiente próximo a 0,9) como la independencia de los resultados con respecto al medio (test del chi cuadrado) se debe a que se está trabajando con un ratio (coliformes en un medio repecto a coliformes en otro medio) y se desvirtúa le resultado comparativo. De todas formas estos resulta-dos son mejores que en muchos de las experiencias que se mencionan en los trabajos referenciados.

4.- El número de falsos positivos en las colonias que debieran corresponder a coliformes termotoleran-tes se reduce mucho cuando se usa el medio COLI ID siendo, por tanto, un método mucho más es-pecífico y selectivo para la enumeración de este tipo de microorganismos. Aquí debe hacerse la si-guiente consideración: no se han usado cepas de Shigella ni de Salmonella, que por similitud con la -presencia del enzima β−glucoronidasa- podrían dar colonias típicas

5.- Como conclusión final del objetivo que se buscaba con este trabajo, se puede decir que el medio cromogénico ensayado es más eficaz para la determinación de la E. coli que el método tradicional, como se desprende de los diferentes estudios estadísticos, que los tradicionales métodos empleados para su control. Es decir, que ya se dispone de una forma relativamente rápida y sencilla de detectar a tan peligroso microorganismo y cumplir con la nueva Directiva comunitaria

1.3. LA DIRECTIVA 98/83 Y METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DE E. COLI

La próxima entrada en vigor de la Directiva 98/83 [12], sobre la calidad de las aguas destinadas al con-

sumo público, que obliga a la determinación individual de la E. coli, además de las coliformes totales

supone, para las empresas suministradoras de agua, la adopción de nuevas estrategias de medida de di-

chas bacterias. Esta nueva reglamentación modifica a las nacionales de diversos países de la CEE y USA

[13-17], que hasta este momento exigían sólo la determinación de coliformes fecales y coliformes totales

y, se adapta a las nuevas recomendaciones que la OMS [13] dio para la calidad bacteriológica de aguas

potables en 1993. Estas directrices, se enmarcan dentro de nuevos criterios de contaminación, según los

cuales los organismos coliformes se analizan solo como señalizadores de la eficacia del tratamiento y la

integridad del sistema de distribución no como indicadores de la presencia de patógenos, mientras que

los organismos coliformes termotolerantes, en este caso E. coli se analizan como indicadores de polu-

ción fecal.



Para la enumeración de E. coli en agua potable, los métodos estándar (principalmente Fermentación en Tubo, basado en la técnica de enumeración del Número Más Probable, y Filtración sobre Membrana) aplicados tradicionalmente en la mayoría de los países presentan, entre otros, los inconvenientes de que son laboriosos, complejos y que requieren la realización de pruebas adicionales de confirmación que pueden alargar hasta 4 días la obtención del resultado final [18]. Estas limitaciones condicionan el núme-ro de muestras que se pueden procesar simultáneamente y hacen que estas técnicas sean cuestionadas sobre la base de su complejidad, precisión y coste [19].

Por todo ello, la investigación en el campo del análisis microbiológico de aguas se ha orientado en gran medida hacia el desarrollo de métodos alternativos que permitan reducir el tiempo, trabajo y costes nece-sarios para obtener resultados fiables. Entre las nuevas técnicas de determinación y detección de E. coli, destacan las basadas en la hidrólisis de determinados sustratos o compuestos cromogénicos (tecnología de sustratos definidos) como el 4-metilumbeliferil-ß-D-glucurónido (MUG) o el o-nitrofenil-ß-D-galactopiranósido (ONPG) y, mucho más recientemente, la aplicación de métodos impedimétricos basa-dos en la conductimetría directa o indirecta.

Las ventajas de las nuevas técnicas de detección de E. coli las hacen de gran interés para las empresas de producción de agua destinada al consumo público; más si cabe, teniendo en cuenta que, como ya se men-cionó anteriormente, éstas están obligadas por la legislación comunitaria a implantar la determinación de este parámetro. Sin embargo, la aplicación de estas nuevas metodologías de un modo rutinario se ve limi-tada debido a que el funcionamiento y exactitud de algunos de los nuevos medios o métodos que surgen actualmente y que están basados en estas técnicas, no están validados de un modo experimental. Esta limitación se agrava en el caso de empresas suministradoras de aguas destinadas al consumo público de poblaciones importantes, debido al gran volumen de agua suministrado y a la necesidad de asegurar de forma rápida y eficaz su calidad.

En consecuencia, para determinar la capacidad de nuevos medios y métodos de detección y recuento de E. coli en aguas, es necesario diseñar un estudio que permita evaluarla de un modo fiable, no sólo para cada método individualmente, sino con relación a métodos estándar, oficiales o ya contrastados.

8. OBJETIVOS

8.1 OBJETIVO PRINCIPAL

Evaluar la capacidad de diferentes medios de cultivo basados en la tecnología de sustratos definidos para detectar E. coli en aguas destinadas al consumo público, con respecto a los métodos estándar o de refe-rencia. Con ello, se pretende seleccionar el más adecuado para emplearlo de forma rutinaria en los análi-sis bacteriológicos de las muestras de agua destinadas al consumo público en la Comunidad Autónoma de Galicia.

8.2 OBJETIVOS INTERMEDIOS

Evaluar la capacidad de dos medios de cultivo cromogénicos (agar coli ID y agar MUG Plus) y un medio de cultivo fluorogénico (ColitagTM) para el recuento de E. coli en aguas superficiales.

Analizar la eficacia de estos medios de cultivo, basados en la tecnología de sustratos definidos, para de-tectar E. coli en aguas sometidas a diferentes tipos de tratamiento de desinfección con cloro.

Determinar las propiedades (sensibilidad, especificidad, selectividad) de los medios de cultivo seleccio-nados para detectar coliformes y E. coli en aguas subterráneas.



Investigar la influencia de altas concentraciones de bacterias acompañantes sobre la capacidad de estos medios de cultivo para detectar E. coli en diferentes tipos de aguas.

9. MATERIAL Y MÉTODOS

9.1 MUESTRAS DE AGUA

Para este trabajo se emplearon diferentes tipos de muestras de agua representativas de las diferentes fuen-tes de agua que pueden emplearse para el consumo público: aguas superficiales, aguas sometidas a trata-miento de desinfección y aguas subterráneas.

9.1.1 AGUAS SUPERFICIALES

Las muestras de agua superficial se recogieron en diversos cauces de la Comunidad Autónoma de Galicia que se emplean para la producción de agua potable. Las muestras se recogieron en botellas estériles de 2 litros de capacidad, que se trasladaron inmediatamente al laboratorio en condiciones de refrigeración. Los análisis se llevaron a cabo inmediatamente después de su llegada al laboratorio.

9.1.2 AGUAS SOMETIDAS A DIFERENTES TIPOS DE TRATAMIENTO

9.1.2.1 Muestras de agua tratada preparadas en el laboratorio

1. Muestras de agua superficial o efluentes de alta calidad mezcladas con agua tratada. Diferentes muestras de agua natural (agua superficial y efluentes de alta calidad) con diferentes niveles de E. co-li se mezclaron con agua tratada y, posteriormente sometidas a tratamiento con cloro para conseguir una concentración inicial de cloro libre de 1.5 a 2 ppm. Tras su homogenización con continua agita-ción durante 25 min., se tomaron alícuotas a intervalos de tiempo a partir de los 10 minutos para su análisis mediante las diferentes técnicas.

2. Muestras de agua marginalmente cloradas

• Muestras de agua superficial refrigeradas durante 24 horas. Diferentes muestras de agua super-ficial recogidas de la misma forma que las anteriores y mantenidas en refrigeración durante 24 horas, se sometieron a cloración con hipoclorito sódico y cloruro amónico para alcanzar un nivel de cloro residual total de 0.6 - 0.8 mg Cl2/l. Tras su agitación durante 15 minutos, se neutraliza-ron con tiosulfato sódico y se analizaron mediante las diferentes técnicas.

• Muestras de agua superficial clorada. Diferentes muestras de agua superficial recogidas de la misma forma que las anteriores se sometieron a cloración con hipoclorito sódico para alcanzar un nivel de cloro residual total de 0.6 - 0.8 mg Cl2/l. Tras su homogenización con continua agi-tación, se tomaron alícuotas a los 2, 3, 5, 7, 10 y 15 min. estas submuestras se neutralizaron con tiosulfato sódico antes de su análisis mediante las diferentes técnicas.

9.1.2.2 Muestras de agua sometida a procesos de potabilización

Las muestras sometidas a un proceso de potabilización se recogieron en la planta potabilizadora, tras su tratamiento y filtración por filtros de arena, y a lo largo de diversos sistemas de distribución de agua po-table. Las muestras se recogieron en botellas estériles de 2 litros de capacidad, que se trasladaron inme-



diatamente al laboratorio en condiciones de refrigeración. Los análisis se llevaron a cabo inmediatamente después de su llegada al laboratorio.

9.1.3 AGUAS SUBTERRÁNEAS

Las muestras de agua subterránea se recogieron en diferentes fuentes públicas del área rural y urbana de Santiago de Compostela. Las muestras se recogieron en botellas estériles de 2 litros de capacidad, que se trasladaron inmediatamente al laboratorio en condiciones de refrigeración. Los análisis se llevaron a cabo antes de 24 h después de su llegada al laboratorio.

9.2 ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS MEDIANTE MÉTODOS CROMOGÉNI COS

Los análisis de los diferentes tipos de aguas se llevaron a cabo mediante la técnica estándar de filtración sobre membrana a partir de alícuotas de 100 ml de agua filtradas a través de filtros de 47 mm Whatman WCN y 0.45 µm de diámetro de poro. Duplicados de estas alícuotas fueron colocados sobre los dos me-dios de cultivo cromogénicos: Placas preparadas de medio Coli ID (ID) (suministrado por bioMérieux) y de medio Mug Plus cefsulodin (MP) suministrado por Laboratorios Microkit, S.L., y previamente vertido en placas de Petri. Todas las placas se incubaron en aerobiosis a 35ºC ± 0.5ºC/24 ± 2h. Las colonias ro-sa/violetas en ID se contaron como E. coli (β-glucuronidasa positivo) y todas las colonias azul/grisáceas como otros coliformes (β-galactosidasa positivo). En MP, las colonias azul-oscuro a violeta se contaron como E. coli y todas las colonias salmón a rojo se contaron como otros coliformes.

9.3 ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS MEDIANTE MÉTODOS FLUOROGÉN ICOS

Los análisis de los diferentes tipos de aguas se llevaron a cabo mediante la técnica estándar de número más probable empleando como medio de cultivo fluorogénico ColitagTM (CPI International) (método CT). Para las muestras de agua tratada se utilizaron series de 10 tubos inoculados con 10 ml de muestra cada uno. Con las muestras de agua superficial se emplearon series de 3 tubos con diferentes diluciones decimales de las muestras. Tras la incubación de los tubos inoculados a 35ºC ± 0.5ºC/24 ± 2h, los que viraron a amarillo se consideraron positivos para coliformes (β-galactosidasa positivo), y los que además manifestaron emisión de fluorescencia azul al exponerlos a luz UV de onda larga (366 nm) se considera-ron como E. coli (β-glucuronidasa positivo).

9.4 ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS MEDIANTE LOS MÉTODOS DE RE FERENCIA

Los diferentes tipos de aguas se analizaron también de acuerdo con el método ISO 9308-1 [20], emplean-do placas preparadas de agar Endo (bioMerieux), para el recuento de coliformes totales (method ISO-CT) y de E. coli (method ISO-EC). Los recuentos de E. coli también fueron determinados sobre agar m-TEC (Difco, Detroit MI, USA) según se describe en el manual “Standard Methods for the examination of water and wastewater” [18].

9.5 RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFAS

El recuento de bacterias heterótrofas se llevó a cabo mediante la técnica de siembra por extensión sobre la superficie de agar R2A. Las placas, inoculadas por duplicado, se incubaron a 35°C/48 h, tras lo cual se contabilizo el número de UFC/ml de muestra.



9.6 VERIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE COLONIAS

De los medios evaluados se seleccionaron cepas bacterianas a partir de colonias típicas y atípicas (en el caso de los métodos ID y MP) y de tubos positivos y negativos (en el caso del CT), con objeto de evaluar su especificidad. Las cepas bacterianas aisladas a partir de colonias o tubos positivos para coliformes se confirmaron por la producción de gas en caldo lactosa do tras su incubación a 35AC/48h [20]. Las cepas bacterianas aisladas a partir de colonias o tubos positivos para E. coli se confirmaron por la producción de gas en caldo lactosado y producción de indol en agua de triptona tras su incubación a 44°C/24h [20]. Los aislados fueron posteriormente identificados mediante el sistema API 20 E o el API RapiD 20 E (bioMérieux) o mediante BIOLOG.

9.7 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS DATOS

Los resultados fueron analizados, como ya se ha citado en el apartado 5.1, mediante regresión lineal y análisis de varianza usando el paquete estadístico Statgrafics 5.0. Además, para la comparación de los diferentes métodos de detección de E. coli en aguas se siguieron los criterios propuestos por Levin y Cabelli y por El-Shaarawi y Pipes [ver referencia 21].

10. RESULTADOS

10.1 3.1. MUESTRAS DE AGUA SUPERFICIAL

10.1.1 ANÁLISIS DE LA CAPACIDAD DE LOS MÉTODOS ID, MP Y CT PARA DETECTAR E. COLI EN AGUAS SUPERFICIALES

El análisis de regresión obtenido entre los recuentos de E. coli observados con los medios cromogénicos y fluorogénicos con respecto a los métodos de referencia (ISO-EC y m-TEC) se muestra en las Figuras 1 y 2. Como puede observarse en ambas figuras, se obtuvo una excelente correlación entre los recuentos obtenidos en los dos medios cromogénicos (ID y MP) y los dos métodos de refencia empleados en este trabajo. Esta correlación fue inferior cuando se comparan los resultados obtenidos con el medio fluoro-génico. En este caso, los recuentos obtenidos con el la técnica CT fueron inferiores a los determinados mediante los métodos estándar, como lo demuestra el desplazamiento de los puntos hacia el eje en el que se representan los datos observados con los métodos de referencia ISO-EC (Figura 1) y m-TEC (Figura 2).



FIGURA 1. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS MÉTODOS I D, MP Y CT Y EL MÉT ODO DE REFERENCIA (ISO-EC) PARA LA ENUMERACIÓN DE E. COLI EN AGUAS SUPERFICIALES

�� ID (R2 = 0.96)

�� MP (R2 = 0.95)

�� CT (R2 = 0.74)

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

Log UFC/100 ml (ISO-EC)

Log

UF

C/1

00 m

l (ID

y M

P);

Log

NM

P/1

00 m

l (C

T)



FIGURA 2. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS MÉTODOS I D, MP Y CT Y EL MÉT ODO DE REFERENCIA (M -TEC) PARA LA ENUMERACIÓN DE E. COLI EN AGUAS SUPERFICIALES.

�� ID (R2 = 0.98)

�� MP (R2 = 0.98)�� CT (R2 = 0.75)

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

Log UFC/100 ml (m-TEC)

Log

UF

C/1

00 m

l (ID

y M

P);

Log

NM

P/1

00 m

l (C

T)

La buena correlación entre los métodos cromogénicos y fluorogénicos y los métodos de referencia para determinar E. coli en aguas superficiales se ha confirmado cuando se llevó a cabo el análisis de varianza de los resultados obtenidos. La evaluación de los datos obtenidos demostró la ausencia de diferencias significativas (p < 0.05).

La sensibilidad, eficacia de recuperación relativa, selectividad y precisión de los diferentes métodos para detectar E. coli en aguas superficiales se presentan en la Tabla 1.

De acuerdo con la Tabla 1, el medio MP es que que ha permitido una mayor eficacia de recuperación relativa de E. coli en aguas superficiales. No obstante, cuando se tienen en cuenta los demás parámetros las diferencias con respecto al ID apenas existen. Esta ausencia de diferencias también puede observarse cuando se calcula la especificidad de los métodos ensayados. Como puede observarse en la Tabla 2, los tres métodos basados en la tecnología de sustratos definidos son altamente específicos para determinar E. coli en este tipo de aguas.

TABLA 1. DISTINTOS PARÁMETROS EMPLEADOS EN LA EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE E. COLI OBTENIDOS A PARTIR DEL ANÁLISIS DE MUESTRAS DE AGUA SUPERFICIAL (VALORES PROMEDIO ).

PARÁMETRO MÉTODO

ISO-CT m-TEC ID MP CT

Sensibilidad (%) 100 100 97,3 100 94,6



Eficacia de recuperación relativa(1)

72,20 72,20 64,65 84,81 59,61

Factor de reducción de flora acompañante(2)

1363,08 1056,00 174,16 397,21 ND

Reducción logarítmica de la flora acompañante

2,42 2,52 1,60 0,87 ND

Precisión (3) 3,13 4,75 3,42 3,46 ND (1)El porcentaje de recuperación relativa se calculó aplicando la ecuación: Porcentaje de recuperación relativa medio a evaluar = (Recuento en el medio a evaluar/Recuento máximo en cualquier medio) x 100. (2)Selectividad: Relación entre recuentos de bacterias heterotrofas a 35 ºC realizados sobre R2A y recuentos totales obtenidos en cada uno de los métodos evaluados. (3)La precisión se determinó calculando el índice de dispersión de Fisher D2. ND: No determinado.

Un aspecto que destaca de la Tabla 1 es la baja selectividad de los dos métodos cromogénicos, especial-mente en el caso de la técnica MP, en comparación con la de los métodos de referencia ISO-EC y m-TEC. Esto puede ser debido a la mayor temperatura de incubación utilizada con éstos últimos, que actúa como agente selectivo. El incremento de la temperatura de incubación, por tanto, podría mejorar la selec-tividad del método; sin embargo la controversia acerca del efecto de este incremento sobre la especifici-dad de los medios basados en la detección de la actividad del enzima ß-glucuronidasa de E. coli [ver refe-rencia 5] nos lleva a señalar la necesidad de valorar este aspecto antes de proponer estos métodos, en particular, el método MP como alternativa a los métodos de referencia.

Por otra parte, cuando se comparan entre sí los recuentos de E. coli obtenidos con los dos métodos cro-mogénicos ID y MP, el análisis de regresión demuestra que en estos dos métodos se da una muy buena relación a la hora de llevar a cabo la detección y recuento de E. coli en aguas superificiales (Figura 3).

TABLA 2. PORCENTAJE DE FALSOS POSITIVOS (FP) Y NEGATIVOS (FN) OBTENIDOS POR CADA UNA DE LAS TÉCNICAS EMPLEADAS PARA DETERMINACIÓN DE E. COLI EN AGUAS SUPERFICIALES.

MÉTODOS

Nº (1) FP (3) (%) Nº (2) FN (4) (%)

ID 64 4,7 29 0

MP 75 0 37 5,9

CT 80 3,75 28 0 (1)Número de colonias típicas de E. coli testadas en los diferentes medios. (2)Número de colonias atípicas de E. coli testadas en los diferentes medios. (3)Falsos positivos (número de colonias que no se han confirmado como E. coli/número total de colonias típicas examinadas). (4)Falsos negativos (número de colonias no típicas confirmadas como E. coli/número total de colonias no típicas examinadas).



FIGURA 3. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS MÉTODOS ID Y MP PARA LA ENUMERACIÓN DE E. COLI EN AGUAS SUPERFICIALES.

R2 = 0.99

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

Método ID (Log UFC/100 ml)

Mét

odo

MP

(Lo

g U

FC

/100

ml)

10.1.2 ANÁLISIS DE LA CAPACIDAD DEL MÉTODO ID PARA DETECTAR COLIFORMES TOTALES Y E. COLI EN AGUAS SUPERFICIALES

Además de evaluar la capacidad de los diferentes métodos cromogénicos y fluorogénicos para detectar E. coli en aguas superficiales, también se llevó a cabo una análisis de la capacidad de uno de los métodos (ID) para detectar coliformes totales en comparación con el método de referencia ISO-CT. Los datos de eficacia de recuperación relativa y de selectividad se muestran en la Tabla 3. Según puede observarse, el método ID, en términos de eficacia y selectividad, es más adecuado que el método de referencia para el recuento de coliformes en aguas superficiales.

TABLA 3. DISTINTOS PARÁMETROS EMPLEADOS EN LA EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TOTALES QUE SE HAN OBTENIDO A PARTIR DEL ANÁLISIS DE AGUA SUPERFICIAL (VALORES PROMEDIO ).

PARÁMETRO ISO-CT ID

Eficacia de recuperación relativa1 (%) 76,3 89,5

Factor de reducción de flora acompañante2 164 313

Reducción logarítmica de la flora acompañante 1,39 1,59



1 El porcentaje de recuperación relativa se ha calculado aplicando la ecuación: Porcentaje de recupe-ración relativa del medio a evaluar = Recuento en el medio a evaluar/Recuento máximo en cualquier medio) x 100 2 Relación entre recuento de bacterias heterótrofas a 35ºC realizados sobre R2A y recuentos totales obtenidos en cada uno de los medios evaluados.

La identificación de colonias típicas y atípicas para coliformes totales aisladas a partir del medio ID ha demostrado una alta especificidad de este medio para la detección de estos microorganismos en aguas superficiales, tal como se pone de manifiesto en la Tabla 4.

TABLA 4. PORCENTAJE DE FALSOS POSITIVOS (FP) Y NEGATIVOS (FN) OBTENIDOS CON EL MÉTODO ID PARA LA DETERMINACIÓN DE COLIFORMES EN AGUAS SUPERFICIALES .

PARÁMETRO VALOR NUMÉRICO PORCENTAJE

Falsos positivos1 4/121 3,3

Falsos negativos2 5/41 12,2

1Falsos positivos (número de colonias que no se han confirmado como coliformes tota-les/número total de colonias típicas examinadas). 2Falsos negativos (número de colonias no típicas confirmadas como coliformes totales/número total de colonias no típicas examinadas).

10.2 AGUAS SOMETIDAS A DIFERENTES TIPOS DE TRATAMIENTO

10.2.1 MUESTRAS DE AGUA SUPERFICIAL O EFLUENTES DE ALTA CALIDAD MEZCLADAS CON AGUA TRATADA .

El análisis de varianza de los datos obtenidos con este tipo de muestras de agua preparadas en el labora-torio demostró la ausencia de diferencias significativas entre los recuentos de E. coli sobre ID, CT y MP y los obtenidos con los métodos de referencia empleados (ISO-EC y m-TEC). De acuerdo con este análi-sis, cualquiera de los métodos alternativos podría emplearse, a priori, con garantías para la detección de estos microorganismos en aguas, a pesar de que hayan podido sufrir algún tipo de daño por la acción del desinfectante. Si no es así, al menos su capacidad para detectar estos microorganismos sería equivalente a la de los métodos de referencia. No obstante, cuando se hace otro tipo de análisis se obtienen resultados diferentes, particularmente cuando éstos se comparan con los obtenidos con las muestras de agua margi-nalmente cloradas.

Los valores de sensibilidad, eficacia de recuperación relativa y selectividad obtenidos con los diferentes métodos de recuento de E. coli en muestras de agua preparadas en el laboratorio a partir de mezclas de agua superficial y agua tratada se muestran en la Tabla 5.

TABLA 5. DISTINTOS PARÁMETROS EMPLEADOS EN LA EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE E. COLI OBTENIDOS A PARTIR DEL ANÁLISIS DE MUESTRAS DE AGUA PREPARADAS EN EL LABORATORIO A PARTIR DE MEZCLAS DE AGUA SUPER FICIAL Y AGUA TRATADA (VALORES PROMEDIO ).

PARÁMETRO MÉTODO

ISO-EC m-TEC ID MP CT

Sensibilidad (%) 62,5 62,5 65,6 68,8 71,9




51,6 47,2 53,6 68,6 50,9


219 267 131 11 ND


2,20 2,34 1,95 0,86 ND

(1)El porcentaje de recuperación relativa se calculó aplicando la ecuación: Porcentaje de recuperación relativa medio a evaluar = (Recuento en el medio a evaluar/Recuento máximo en cualquier medio) x 100. (2)Selectividad: Relación entre recuentos de bacterias heterotrofas a 35 ºC realizados sobre R2A y recuentos totales obtenidos en cada uno de los métodos evaluados. ND: No determinado.

Como puede constatarse en la Tabla 5, en este tipo de aguas, la mayor eficacia de recuperación relativa de E. coli se obtuvo con el medio MP. El análisis de varianza demostró que la eficacia de recuperación relativa de E. coli con el medio MP fue significativamente superior a la obtenida con los dos métodos de referencia y con el medio fluorogénico CT. Por su parte, entre los dos métodos fluorogénicos no se en-contraron diferencias significativas en lo que a eficacia de recuperación relativa de E. coli se refiere.

El análisis de regresión lineal entre los recuentos de E. coli con los métodos de referencia y los obtenidos con las técnicas basadas en la tecnología de sustratos definidos se muestra en las Figuras 4 y 5. En ambas figuras, se puede comprobar que los recuentos más elevados de E. coli se obtuvieron cuando se emplea el método MP. No obstante, las diferencias con respecto al otro método cromogénico (ID) son mínimas. En la Figura 6 se puede observar la gran homogeneidad que se dio entre los recuentos obtenidos con ambas técnicas de recuento.



FIGURA 4. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE E. COLI OBTENIDOS CON LOS MÉTODOS ID, MP Y CT Y EL MÉTODO DE REFERENCIA (ISO-EC) EN AGUAS PREPARADAS A PARTIR DE MEZCLAS DE AGUA POTABLE Y SUPERFICIAL .

�� ID (R2 = 0.98)�� MP (R2 = 0.95)�� CT (R2 = 0.87)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0


Log

UF

C/1

00 m

l (ID

y M

P);

Log

NM

P/1

00 m

l (C

T)



FIGURA 5. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE E. COLI OBTENIDOS CON LOS MÉTODOS ID, MP Y CT Y EL MÉTODO DE REFERENCIA (M -TEC) EN AGUAS PREPARADAS A PARTIR DE MEZCLAS DE AGUA POTABLE Y SUPERFICIAL .

�� ID (R2 = 0.95)�� MP (R2 = 0.95)�� CT (R2 = 0.85)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0


Log

UF

C/1

00 m

l (ID

y M

P);

Log

NM

P/1

00 m

l (C

T)



FIGURA 6. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE E. COLI OBTENIDOS CON LOS MÉTODOS ID Y MP EN AGUAS PREPARADAS A PARTIR DE MEZCLAS DE AGUA POTABLE Y SUPERFICIAL .

R2 = 0.93

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

Método MP (Log UFC/100 ml)

Mét

odo

ID (

Log

UF

C/1

00 m

l)

10.2.2 MUESTRAS DE AGUA MARGINALMENTE CLORADA

Al igual que el anterior tipo de agua clorada, las muestras de agua marginalmente cloradas se prepararon en el laboratorio siguiendo dos procedimientos diferentes para obtener microorganismos sometidos a distintos grados de daño tras el tratamiento con un desinfectante, como el cloro. Estos dos procedimien-tos ya fueron descritos en el apartado de materiales y métodos. A continuación se exponen los resultados de la comparación de los diferentes métodos a partir de este tipo de aguas.

El análisis de varianza de los datos obtenidos con estas muestras de agua también demostró la ausencia de diferencias significativas entre los recuentos de E. coli sobre ID, CT y MP y los obtenidos con los métodos de referencia empleados (ISO-EC y m-TEC). De la misma forma que ocurre con las anteriores muestras de agua, cualquiera de los métodos alternativos podría emplearse, a priori, con garantías para la detección de E. coli dañado por la acción del cloro. Sin embargo, cuando se analiza la sensibilidad y efi-ciencia de recuperación relativa E. coli de los diferentes métodos, se puede comprobar que los valores obtenidos con el método MP son inferiores a los hallados con las técnicas ISO-EC e ID (Tabla 6). Estos valores fueron significativamente inferiores (p < 0.05), cuando se comparan con el método de referencia (ISO-EC).

TABLA 6. DISTINTOS PARÁMETROS EMPLEADOS EN LA EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE E. COLI OBTENIDOS A PARTIR DEL ANÁLISIS DE MUESTRAS DE AGUA MARGINALMENTE CLORADA (VALORES PROMEDIO ).

PARÁMETRO MÉTODO

ISO-EC m-TEC ID MP CT



Sensibilidad (%) 65,7 77,1 77,1 71,4 42,9


55,8 69,5 54,8 45,6 20,7


1666 2315 124 6 ND


3,17 3,32 2.03 0,46 ND

(1)El porcentaje de recuperación relativa se calculó aplicando la ecuación: Porcentaje de recuperación relativa medio a evaluar = (Recuento en el medio a evaluar/Recuento máximo en cualquier medio) x 100. (2)Selectividad: Relación entre recuentos de bacterias heterotrofas a 35 ºC realizados sobre R2A y recuentos totales obtenidos en cada uno de los métodos evaluados. ND: No determinado.

En la Tabla 6 también puede observarse que, al igual que sucede con las aguas preparadas en el laborato-rio a partir de mezclas de agua superficial y tratada, la baja sensibilidad y eficiencia del método fluoro-génico para detectar E. coli. Los valores obtenidos con este método fueron siempre significativamente inferiores (p < 0.05) a los observados con los otros métodos.

Todos estos aspectos se confirman cuando se lleva a cabo el análisis de regresión de los recuentos de E. coli, tal como se pone de manifiesto en las figuras 7 y 8. En ambas figuras, se puede comprobar que los recuentos más elevados de E. coli se obtuvieron cuando se emplea el método ID, tanto si se comparan con los recuentos hallados con los métodos de referencia, como si se hace con los otros dos métodos (MP y CT).



FIGURA 7. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE E. COLI OBTENIDOS CON LOS MÉTODOS ID, MP Y CT Y LA TÉCNICA DE REFERENCIA ISO-EC EN MUESTRAS DE AGUA MARGINALMENTE CLORADA .

�� MP (R2 = 0.59)�� CT (R2 = 0.57)

�� ID (R2 = 0.72)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0


Log

UF

C/1

00 m

l (ID

y M

P);

Log

NM

P/1

00 m

l (C

T)

FIGURA 8. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE E. COLI OBTENIDOS CON LOS MÉTODOS ID, MP Y CT Y LA TÉCNICA DE REFERENCIA ISO-EC EN MUESTRAS DE AGUA MARGINALMENTE CLORADA .



�� ID (R2 = 0.89)�� MP (R2 = 0.84)�� CT (R2 = 0.61)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0


Log

UF

C/1

00 m

l (ID

y M

P);

Log

NM

P/1

00 m

l (C

T)

Tal como se pone de manifiesto en las anteriores Figuras (7 y 8), de los tres métodos basados en la tecno-logía de sustratos definidos, el método cromogénico ID es el que permite un mayor nivel de detección de E. coli en muestras de agua marginalmente clorada. Las diferencias entre estos tres métodos se da en la sensibilidad y eficiencia de recuento, pues la especificidad para detectar E. coli por los tres métodos ba-sados en la tecnología de sustratos definidos es, además de alta, muy similar entre ellos (Tabla 7).

TABLA 7. PORCENTAJE DE FALSOS POSITIVOS (FP) Y NEGATIVOS (FN) OBTENIDOS POR CADA UNA DE LAS TÉCNICAS EMPLEADAS PARA DETERMINACIÓN DE E. COLI EN AGUAS CLORADAS EN EL LABORATORIO .

MÉTODOS

Nº (1) FP (%) Nº (2) FN (%)

ID 70 6,4 28 0

MP 85 2,0 43 0

CT 40 3,8 30 0 (1)Número de colonias típicas de E. coli testadas en los diferentes medios. (2)Número de colonias atípicas de E. coli testadas en los diferentes medios.



FIGURA 9. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE E. COLI OBTENIDOS CON EL MÉTODO ID Y MP EN MUESTRAS DE AGUA MARGINALMENTE CLORADA .

R2 = 0.92

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Método MP (Log UFC/100 ml)

Mét

odo

ID (

Log

UF

C/1

00 m

l)

Si se comparan los resultados obtenidos con los dos métodos cromogénicos (ID y MP) a partir de las aguas preparadas en el laboratorio con mezclas de agua superficial y tratada y las marginalmente cloradas (Tablas 5 y 6, y Figuras 6 y 9), se observa una clara diferencia en la capacidad de detección de E. coli en los dos tipos de aguas; mientras, en las primeras muestras, apenas hay diferencias entre los dos métodos (incluso, la capacidad de detección de MP es mayor), en las segundas, la eficiencia de recuento de E. coli con el método MP es claramente inferior. Esto probablemente sea debido a la baja selectividad del medio MP, que permite el desarrollo de abundante flora acompañante, cuyo efecto inhibidos sobre E. coli será mayor en aquellas aguas en las que haya una población más dañada. El nivel de daño de los organismos en las aguas marginalmente cloradas es mayor que en las aguas preparadas a partir de mezclas de agua superficial y tratada.

10.3 MUESTRAS DE AGUA SOMETIDA A PROCESOS DE POTABILIZAC IÓN

En este trabajo también se llevaron a cabo análisis con los diferentes métodos de recuento de muestras de agua recogidas en diferentes redes de distribución de agua potable. Las 43 muestras de agua analizadas dieron resultados negativos para E. coli con los 5 métodos empleados. Desde este punto de vista, se pue-de deducir que los métodos basados en la tecnología de sustratos definidos dieron resultados equivalentes a los obtenidos con los métodos de referencia. No obstante, el recuento de la población total de bacterias que creció en los diferentes medios de cultivo (Tabla 8), permite confirmar lo obtenido con otras mues-tras, en el sentido de que el medio MP es muy poco selectivo, al contrario de lo que sucede con los otros medios de cultivo.



TABLA 8. RECUENTOS MEDIOS DE BACTERIAS , VALORES MÁXIMOS Y MÍNIMOS Y PORCENTAJE DE MUESTRAS CON VALORES DE BACTERIAS SUPERIORES 80 UFC.

PARÁMETRO MÉTODO

ISO-EC m-TEC ID MP R2A

Media aritmétrica 3,0 10,0 3,8 71,2 1058,5

Media geométrica 1,7 1,7 1,4 30,4 374,1

Valor mínimo 0 0 0 0 10

Valor máximo 18 131 50 200 8600

% de valores > 80 UFC 0 7,1 0 35,7

En la Tabla 8 puede observarse que, en el medio MP, la media geométrica de colonias bacterianas des-arrolladas no pertenecientes a E. coli fue de 30,4 y que el porcentaje de muestras que dieron valores de colonias en el medio MP superiores a 80 UFC fue de casi un 36 %. Todos estos valores fueron muy supe-riores a los obtenidos con los otros métodos de recuento de E. coli. Ello significa, que en una alta propor-ción de muestras (muestras con niveles de colonias en MP superior a 80) habría dificultades para distin-guir colonias de E. coli en el medio MP, dada la gran cantidad de flora acompañante. Este resultado per-mite desaconsejar este medio de cultivo para emplearlo en la detección de E. coli en este tipo de aguas.

10.4 MUESTRAS DE AGUA SUBTERRÁNEA

El estudio con las muestras de agua subterráneas consistió en evaluar la capacidad de los dos métodos cromogénicos (ID y MP) para detectar coliformes totales y E. coli en comparación con los métodos de referencia para determinar coliformes totales (ISO-CT) y E. coli (ISO-EC y m-TEC).

De todas las muestras analizadas (38 para coliformes totales y 62 para E. coli), el 100% y 50% de las muestras fueron respectivamente positivas para coliformes totales y 62 para E. coli, por alguno de los métodos empleados en el trabajo. Los recuentos en estas muestras oscilaron entre 1 a 200 coliformes totales y entre 0 y 200 E. coli por 100 ml de muestra.

El análisis de regresión de los recuentos de coliformes totales obtenidos con los dos métodos cromogéni-cos (ID y MP) en comparación con el método ISO (ISO-CT) se muestra en la Figura 9. Este análisis dio como resultado valores de coeficiente de correlación de 0,74 para ID y 0,76 para MP. Estos relativamente bajos coeficientes de correlación se deben a que los mayores recuentos de coliformes totales con respecto al método ISO-CT se obtuvieron con los dos métodos cromogénicos (ID y MP), principalmente en las muestras con bajos niveles de coliformes (Figura 10).

El análisis de varianza de los datos obtenidos demostró la ausencia de diferencias significativas entre los recuentos de coliformes obtenidos con los métodos ID y MP y el método empleado como referencia. Sin embargo, la evaluación de la sensibilidad y eficacia de recuperación relativa de ambos medios de cultivo cromogénicos dio como resultado que estos dos medios de cultivo son más sensibles y significativamente más eficientes (p < 0,05) que el método ISO-CT para detectar coliformes en aguas subterráneas (Tabla 9).



FIGURA 10. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE COLIFORMES TOTALES OBTENID OS CON LOS MÉTODOS ID Y MP Y EL MÉTODO DE REFERENCIA ISO-CT EN MUESTRAS DE AGUA SUBTERRÁNEA.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

Log UFC/100 ml (ISO-CT)

Log

UF

C/1

00 m

l (ID

y M

P)

�� ID (R2 = 0,74)

�� MP (R2 = 0,76)

TABLA 9. DISTINTOS PARÁMETROS EMPLEADOS EN LA EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TOTALES OBTENIDOS A PARTIR D EL ANÁLISIS DE MUESTRAS DE AGUA SUBTERRÁNEA (VALORES PROMEDIO ).

PARÁMETRO MÉTODO

ISO-CT m-TEC ID

Sensibilidad (%) 100 100 97,3


72,20 72,20 64,65


1363,08 1056,00 174,16


2,42 2,52 1,60

(1)El porcentaje de recuperación relativa se calculó aplicando la ecuación: Porcentaje de recupera-ción relativa medio a evaluar = (Recuento en el medio a evaluar/Recuento máximo en cualquier medio) x 100. (2)Selectividad: Relación entre recuentos de bacterias heterotrofas a 35 ºC realizados sobre R2A y recuentos totales obtenidos en cada uno de los métodos evaluados.

Por otra parte, el análisis de regresión entre los recuentos de coliformes obtenidos con los dos métodos cromogénicos permite comprobar que ambos medios de cultivo se comportan de forma similar a la hora de detectar coliformes en aguas subterráneas, como lo demuestra el alto coeficiente de correlación (Figu-ra 11) y la ausencia de diferencias significativos entre los mismos en lo que a eficiencia de recuento y sensibilidad se refiere (Tabla 9).



FIGURA 11. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE COLIFORMES TOTALES OBTENID OS CON LOS DOS MÉTODOS CROMOGÉNICOS, ID Y MP, EN MUESTRAS DE AGUA SUBTERRÁNEA.

R2 = 0.89

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5


Mét

odo

MP

(Lo

g U

FC

/100

ml)

Por lo que respecta a la evaluación de los dos métodos cromogénicos para detectar E. coli en aguas subte-rráneas, el análisis de regresión llevado a cabo ha demostrado una buena correlación entre estos dos mé-todos y las técnicas de referencia. Como puede constatarse en las figuras 12 y 13, el valor de los coefi-cientes de correlación obtenidos fueron altamente positivos, con el más alto coeficiente de correlación entre ID y m-TEC (R2 = 0.92) y el más bajo entre MP y m-TEC (R2 = 0.87). El análisis de varianza de los datos demostró la ausencia de diferencias significativas entre los recuentos de E. coli con los métodos ID y MP y con los métodos de referencia empleados.



FIGURA 12. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE E. COLI OBTENIDOS CON LOS DOS MÉTODOS ID Y MP Y EL MÉTODO DE REFERENCIA ISO-EC EN MUESTRAS DE AGUA SUBTERRÁNEA.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5


Log

UF

C/1

00 m

l (ID

y M

UG

)

�� ID (R2 = 0,90)

�� MUG (R2 = 0,88)

FIGURA 13. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE E. COLI OBTENIDOS CON LOS DOS MÉTODOS ID Y MP Y EL MÉTODO DE REFERENCIA M -TEC EN MUESTRAS DE AGUA SUBTERRÁNEA.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5


Log

UF

C/1

00 m

l (ID

y M

P)

�� ID (R2 = 0,92)

�� MP (R2 = 0,87)



TABLA 10. DISTINTOS PARÁMETROS EMPLEADOS EN LA EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD D E DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE E. COLI OBTENIDOS A PARTIR DEL ANÁLISIS DE MUESTRAS DE AGUA SUBTERRÁNEA (VALORES PROMEDIO ).

PARÁMETRO MÉTODO

ISO-EC m-TEC ID MP

Sensibilidad (%) 35,5 33,9 33,4 40,3


55,0 45,8 44,8 67,7


2838 2047 261 99,5


2,87 2,78 1,62 1,34

(1)El porcentaje de recuperación relativa se calculó aplicando la ecuación: Porcentaje de recupe-ración relativa medio a evaluar = (Recuento en el medio a evaluar/Recuento máximo en cual-quier medio) x 100. (2)Selectividad: Relación entre recuentos de bacterias heterotrofas a 35 ºC realizados sobre R2A y recuentos totales obtenidos en cada uno de los métodos evaluados.

Los valores de sensibilidad, eficiencia relativa de recuento de E. coli y selectividad de los diferentes me-dios de cultivo analizados se muestra en la Tabla 10. En esta tabla puede observarse que el medio MP fue el medio más sensible para la detección de E. coli y significativamente más eficiente (p < 0,05) que los métodos m-TEC e ID. Por el contrario, el medio MP resultó ser el menos selectivo para detectar E. coli de los cuatro métodos empleados en este trabajo. En todo caso, la comparación de los recuentos obteni-dos con los dos métodos cromogénicos, permite deducir un alto grado de correlación entre ellos, como lo demuestra el análisis de regresión mostrado en la Figura 14, en la que puede verse un elevado coeficiente de correlación.



FIGURA 14. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE E. COLI OBTENIDOS CON LOS DOS MÉTODOS CROMOGÉNICOS , ID Y MP, EN MUESTRAS DE AGUA SUBTERRÁNEA.

R2 = 0.93

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5


Mét

odo

MP

(Lo

g U

FC

/100

ml)

Los datos obtenidos han demostrado que la capacidad de los dos métodos cromogénicos ensayados para enumerar coliformes y E. coli en aguas subterráneas es comparable o superior a los métodos estándar o de referencia. En este sentido, los dos medios de cultivo cromogénicos evaluados son similares a otros métodos enzimáticos desarrollados para la detección simultánea de coliformes totales y E. coli en agua [22-25].

Finalmente, la identificación de 400 colonias típicas y atípicas a partir de los medios ID y MP, ha demos-trado una alta especificidad del agar ID para coliformes totales y E. coli (Tabla 11). En otras palabras, se detectó un alto porcentaje de falsos positivos para ambos grupos de indicadores con el método MP. Una alta tasa de falsos positivos para coliformes es coincidente con la tasa de confirmación hallada en otros estudios para los medios cromogénicos y fluorogénicos [23]. Sin embargo, el porcentaje de falsos positi-vos para E. coli obtenido con el medio MP es mayor que el valor normal para este tipo de medios de cul-tivo [25]. Este resultado puede deberse a la baja selectividad del agar MP (Tablas 9 y 10) que permite el crecimiento de una gran cantidad de flora acompañante. Muchas de las cepas falso positivas en este me-dio fueron gram-negativas, oxidasa positivas, incapaces de crecer a 44°C, de la misma forma, por ejem-plo, que las flavobacterias productoras de β-glucuronidasa [25].

TABLA 11. ESPECIFICIDAD DE LOS MEDIOS CROMOGÉNICOS ID Y MP PARA EL RECUENTO DE E. COLI Y COLIFORMES TOTALES EN AGUAS SUBTERRÁNEAS .

Método 10.4.1.1.1.1 Especificidad para coliformes totales

10.4.1.2 ESPECIFICIDAD PARA E. COLI

FP1 (%) FN2 (%) FP (%) FN (%)

ID 4/121 (3.3) 5/41 (12.2) 0/40 (0.0) 6/97 (6.2)

MP 17/138 (12.3) 3/66 (4.6) 7/48 (14.6) 3/129 (2.3)



1Falsos positivos (número de colonias que no se han confirmado como coliformes totales o E. coli/número total de colonias típicas examinadas). 2Falsos negativos (número de colonias no típicas confirmadas como coliformes totales o E. coli/número total de colonias no típicas examinadas).

En resumen, los dos métodos evaluados basados en la tecnología de los sustratos definidos, son una al-ternativa viable a los procedimientos de referencia para la detección y recuento de coliformes en aguas subterráneas. Además, tienen la ventaja de que los resultados pueden obtenerse de una forma más senci-lla y rápida.

La comparación de los resultados obtenidos con estos dos medios cromogénicos indicaron que el agar MP fue más sensible y eficiente que el agar ID, mientras este último fue más específico y selectivo que el primero.

10.5 MUESTRAS DE AGUA CON ELEVADOS NIVELES DE BACTERIAS HETEROTROFAS

Otro de los aspectos importantes a la hora de evaluar la capacidad de un determinado método para detec-tar la presencia de un determinado indicador de contaminación es investigar la interferencia, que la flora acompañante, puede tener sobre el desarrollo de los microorganismos específicos en ese medio de culti-vo.

Con el objeto de evaluar la influencia de la flora acompañante sobre la capacidad de detección de E. coli por los medios de cultivo cromogénicos y fluorogénicos con respecto a los de refencia, se han analizado muestras con un alto contenido de bacterias heterotrofas, entre 103 y 106 bacterias/100 ml.

El análisis de regresión entre los recuentos obtenidos con los métodos basados en la tecnología de sustra-tos y los métodos de referencia se muestra en las Figuras 15 y 16. Los resultados de este análisis demues-tran una alta correlación entre los resultados obtenidos con los métodos ensayados y los de referencia. De acuerdo con estos datos, podemos indicar que la capacidad de los métodos basados en la tecnología de sustratos para detectar E. coli es equivalente a la de los métodos de referencia empleados en presencia de altos niveles de bacterias heterotrofas.



FIGURA 15. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE E. COLI OBTENIDOS CON LOS MÉTODOS ID, MP Y CT Y EL MÉTODO DE REFERENCIA ISO-EC EN MUESTRAS CON ALTOS NIVELES DE BACTERIAS HETERÓTROFAS .

�� ID (R2 = 0.98)�� MUG (R2 = 0.97)�� MP (R2 = 0.91)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5


Log

UF

C/1

00 m

l (ID

y M

P);

Log

NM

P/1

00 m

l (C

T)



FIGURA 16. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ENTRE LOS RECUENTOS DE E. COLI OBTENIDOS CON LOS MÉTODOS ID, MP Y CT Y EL MÉTODO DE REFERENCIA M -TEC EN MUESTRAS CON ALTOS NIVELES DE BACTERIAS HETERÓTROFAS .

�� ID (R2 = 0.84)�� MUG (R2 = 0.86)�� MP (R2 = 0.65)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5


Log

UF

C/1

00 m

l (ID

y M

P);

Log

NM

P/1

00 m

l (C

T)

11. CONCLUSIONES

1.- El análisis de regresión obtenido entre los recuentos de E. coli observados con los medios cromogé-nicos y fluorogénicos con respecto a los métodos de referencia permite concluir que se dio una ex-celente correlación entre los recuentos obtenidos en los dos medios cromogénicos (ID y MP) y los dos métodos de referencia empleados en este trabajo. Esta correlación fue inferior cuando se com-paran los resultados obtenidos con el medio fluorogénico.

2.- El medio MP es el que ha permitido una mayor eficacia de recuperación relativa de E. coli en aguas superficiales. No obstante, cuando se tienen en cuenta los demás parámetros (sensibilidad, selectivi-dad y especificidad) las diferencias con respecto al ID apenas existen.

3.- El método ID, en términos de eficacia y selectividad, es más adecuado que el método de referencia ISO-CT para el recuento de coliformes totales en aguas superficiales.

4.- El análisis de varianza de los datos obtenidos con las muestras de agua preparadas en el laboratorio a partir de mezclas de agua superficial y tratada demostró la ausencia de diferencias significativas entre los recuentos de E. coli sobre ID, CT y MP y los obtenidos con los métodos de referencia em-pleados (ISO-EC y m-TEC).

5.- La mayor eficacia de recuperación relativa de E. coli en las muestras de agua preparadas a partir de mezclas de agua superficial y tratada se obtuvo con el medio MP. El análisis de varianza demostró que la eficacia de recuperación relativa de E. coli con este medio fue significativamente superior a la obtenida con los dos métodos de referencia y con el medio fluorogénico CT. Por su parte, entre



los dos métodos fluorogénicos no se encontraron diferencias significativas en lo que a eficacia de recuperación relativa de E. coli se refiere.

6.- El análisis de varianza de los datos obtenidos con las muestras de agua marginalmente clorada tam-bién demostró la ausencia de diferencias significativas entre los recuentos de E. coli sobre ID, CT y MP y los obtenidos con los métodos de referencia empleados (ISO-EC y m-TEC). Sin embargo, cuando se analiza la sensibilidad y eficiencia de recuperación relativa E. coli de los diferentes mé-todos, se puede comprobar que los valores obtenidos con el método MP son inferiores a los hallados con las técnicas ISO-EC e ID. Estos valores fueron significativamente inferiores (p < 0.05), cuando se comparan con el método de referencia (ISO-EC).

7.- Al igual que sucede con las aguas preparadas en el laboratorio a partir de mezclas de agua superfi-cial y tratada, en las muestras de agua marginalmente clorada también se observó una baja sensibili-dad y eficiencia del método fluorogénico (CT) para detectar E. coli. Los valores obtenidos con este método fueron siempre significativamente inferiores (p < 0.05) a los observados con los otros méto-dos.

8.- De los tres métodos basados en la tecnología de sustratos definidos, el método cromogénico ID es el que permite un mayor nivel de detección de E. coli en muestras de agua marginalmente clorada. Las diferencias entre estos tres métodos se da en la sensibilidad y eficiencia de recuento, pues la especi-ficidad para detectar E. coli por los tres métodos basados en la tecnología de sustratos definidos es, además de alta, muy similar entre ellos.

9.- Del análisis de las muestras de agua tratada, se puede deducir que los métodos basados en la tecno-logía de sustratos definidos dieron resultados equivalentes a los obtenidos con los métodos de refe-rencia. No obstante, el recuento de la población total de bacterias que creció en los diferentes me-dios de cultivo, permite confirmar lo obtenido con otras muestras, en el sentido de que el medio MP es muy poco selectivo, al contrario de lo que sucede con los otros medios de cultivo.

10.- Los dos métodos evaluados, basados en la tecnología de los sustratos definidos, constituyen una alternativa viable a los procedimientos de referencia para la detección y recuento de coliformes tota-les y E. coli en aguas subterráneas. Además, tienen la ventaja de que los resultados pueden obtener-se de una forma más sencilla y rápida.

11.- La comparación de los resultados obtenidos en las muestras de agua subterránea con estos dos me-dios cromogénicos indicaron que el agar MP fue más sensible y eficiente que el agar ID, mientras este último fue más específico y selectivo que el primero.

12.- Los resultados del análisis de muestras de agua con elevados niveles de bacterias heterotrofas de-mostraron una alta correlación entre los resultados obtenidos con los métodos ensayados y los de re-ferencia. De acuerdo con estos datos, podemos indicar que la capacidad de los métodos basados en la tecnología de sustratos para detectar E. coli es equivalente a la de los métodos de referencia em-pleados en presencia de altos niveles de bacterias heterotrofas.

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ESTUDIO DE UN MÉTODO EFICAZ PARA LA DETECCIÓN DE ESCHERICHIA COLI EN AGUAS

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