Dissertação Alessandra Orfanó.pdf - ARCA – Fiocruz

Ministério da Saúde

Fundação Oswaldo Cruz

Centro de Pesquisas René Rachou

Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde

AVALIAÇÃO DO PAPEL DA MICROBIOTA INTESTINAL DO Aedes aegypti NO

DESENVOLVIMENTO ESPOROGÔNICO DO Plasmodium gallinaceum

Por

Alessandra da Silva Orfanó

Belo Horizonte

Fevereiro/ 2012

TESE MBCM-CPqRR A.S. ORFANÓ 2012

ii

Ministério da Saúde

Fundação Oswaldo Cruz

Centro de Pesquisas René Rachou

Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde

AVALIAÇÃO DO PAPEL DA MICROBIOTA INTESTINAL DO Aedes aegypti NO

DESENVOLVIMENTO ESPOROGÔNICO DO Plasmodium gallinaceum

Por


Dissertação apresentada com vistas à obtenção do Título de Mestre em Ciências na área de Concentração em Biologia Celular e Molecular.

Orientação: Dr. Paulo Filemon Paolucci Pimenta

Belo Horizonte

Fevereiro/ 2012

iii

Catalogação-na-fonte Rede de Bibliotecas da FIOCRUZ Biblioteca do CPqRR Segemar Oliveira Magalhães CRB/6 1975 O67a 2012

Orfanó, Alessandra da Silva.

Avaliação do papel da microbiota intestinal do Aedes aegypti no desenvolvimento esporogônico do Plasmodium gallinaceum / Alessandra da Silva Orfanó. – Belo Horizonte, 2012.

xvii, 62 f.: il.; 210 x 297mm. Bibliografia: f.: 70 – 79 Dissertação (Mestrado) – Dissertação para

obtenção do título de Mestre em Ciências pelo Programa de Pós - Graduação em Ciências da Saúde do Centro de Pesquisas René Rachou. Área de concentração: Biologia Celular e Molecular.

1. Malária/transmissão 2. Aedes/parasitologia 3.

Infecção/imunologia I. Título. II. Pimenta, Paulo Filemon Paolucci (Orientação).

CDD – 22. ed. – 616.936 2

iv

Ministério da Saúde Fundação Oswaldo Cruz

Centro de Pesquisas René Rachou Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde

AVALIAÇÃO DO PAPEL DA MICROBIOTA INTESTINAL DO Aedes aegypti NO DESENVOLVIMENTO ESPOROGÔNICO DO Plasmodium gallinaceum

Por


Foi avaliada pela banca examinadora composta pelos seguintes membros: Prof. Dr. Paulo Filemon Paolucci Pimenta (Presidente) Prof. Dr. Luciano Andrade Moreira Prof. Dr. Francisco José Alves Lemos Suplente: Prof. Dr. Breno de Melo Silva Dissertação defendida e aprovada em: 17/02/2012

v

"Antes que você possa alcançar o topo de uma árvore e entender os brotos e as flores, você terá de ir fundo nas raízes, porque o segredo está lá. E, quanto mais fundo vão as raízes, mais alto vai à árvore". Nietzsche

"A dificuldade em se vencer um desafio vem da maneira que você olha para ele. Olhe sempre com olhos de um gigante."

Yuri Lacerda

vi

Agradecimentos

Nesse momento, tenho uma ou não mais que duas páginas para tentar expressar o meu muito

obrigado às pessoas que me ajudaram a construir esses últimos dois anos da minha vida profissional.

Às vezes sinto que esses dois anos foram cinco, pelo conhecimento adquirido, amadurecimento com

as dificuldades, experiências vividas, desafios, alegrias. E o que mais aprendi é que ciência é paciência e isso

para mim foi uma tarefa árdua, afinal pedir a alguém que anda/corre de um lado para o outro como se o

mundo fosse acabar entender o significado de “esperar” não é tão fácil assim.

Em primeiro lugar queria agradecer a Deus, não por clichê, de jeito nenhum. Não preciso explicar

toda a história da criação para que você, leitor, entenda que, sem Deus, eu não estaria aqui. Mas meu

agradecimento vai além desse simples fato. Quando eu não acreditava mais em mim, Ele continuou

acreditando. E olha que eu dei milhões de motivos para que Ele desistisse de mim, mas Ele continuou.

Obrigada, Deus.

À família, coisa mais importante que podemos ter e que são os responsáveis pelo que eu sou hoje!

Pai, mãe, irmão obrigada pelo apoio, incentivo, brigas, puxões de orelha, alegrias, por tentarem entender as

minhas horas na frente do computador e a minha ausência e por sempre me mostrarem que vale a pena

insistir no que acreditamos! Vocês não sabem o quanto são importantes!

À minha vovó coruja que sempre torceu por mim em todas as etapas da minha vida!

Ao meu orientador, Dr. Paulo Pimenta, por todo incentivo, confiança, por todas as oportunidades,

conversas, discussões, pela liberdade que me deu no desenvolvimento desse trabalho, pela paciência com a

minha teimosia, pela incansável disposição em ajudar, por acreditar em mim e me ensinar a ser uma cientista

(acho que estou no caminho certo), só tenho a dizer obrigada mais uma vez! Minha admiração e respeito.

À Drª Nágila Secundino, por toda a ajuda, disponibilidade e boa vontade quando a solicitei.

À Drª Ana Paula Duarte por me ensinar os primeiros experimentos de biologia molecular e me fazer

acreditar que çmisturar “aguinhas” significa muito mais que o simples ato.

À Marcele Rocha, “tchuca” que me ensinou a trabalhar com malária aviária e me deu todas as dicas

para uma boa infecção, além de todas as discussões sobre experimentos e amizade.

À Drª Vanessa Freitas, Vanessão, Vanessapédia, pela ajuda nas dissecções, por sempre ler e corrigir

projetos e relatórios, pela amizade e conselhos.

Ao Bruno Guedes, marmota que me ajudou em tantos experimentos e sempre com boa vontade.

À Drª Helena Rocha, ou melhor, Heleninha, por toda a ajuda nos experimentos de padronização do

Real-time.

Ao Flávio Júnior, meu companheiro de modelo de estudo, por sempre me tirar do sufoco quando

precisava de alguma ave infectada e por todas as nossas descontraídas conversas.

À Junara Coelho pela amizade e grande ajuda quando solicitada.

vii

À Roberta Félix, Jequeline e Marcílio pelo suporte e por estarem sempre de prontidão a me ajudar e

ouvir todas as minhas reclamações.

Ao meu grande amigo Luís Eduardo Martinez, que junto comigo forma o Time Malária, e apesar

do pouco tempo já faz parte da minha vida, obrigada por todas as discussões científicas, incentivo, por me

mostrar que sou capaz, por todos os conselhos e pelos momentos divertidos!

À Carol Cunha, linda que me diverte tanto, que entrou nessa jornada comigo e me permitiu dividir

cada alegria e cada angústia nesses anos, obrigada por deixar compartilhar as emoções, que foram muitas

não é mesmo, afinal a vida sem essas tais emoções não teria graça e que venha tantas mais no doutorado, é

muito bom saber que posso contar com você!

À sociedade do Anel (Ana Paula, Carol Cunha, Bruno, Fernanda, Izabela, Junara, Marcele,

Paula, Rafa, Vanessa) e todos os agregados pelos ótimos momentos no CDF e em outras ocasiões, vocês

fizeram tudo caminhar mais fácil!

A todos os colegas que pertencem ou já pertenceram ao Laboratório de Entomologia Médica (Ana

Bahia, Ana Carolina, Ana Cristina, Ana Flávia, Ana Paula, Andrezza, Bárbara, Belinha, Breno, Bruna,

Bruno, Caroline, Carol Cunha, Carol Dantas, Cláudia, Cris, Dani Zile, Erika, Felipe, Fernanda Gambogi,

Fernanda Rezende, Grace, Gustavo Martins, Gustavo Freitas, Helena, Igor Castro, Igor Soares, Izabela

Barros, Izabela Ibraim, Janes, Jequeline, Juliana, Junara, Klívia, Kênia, Lili, Luís Eduardo, Luciana,

Luiza, Maíra, Marcele, Marcílio, Maria Angélica, Neide, Paula, Pollyana, Sabrina, Rafael Gonçalves,

Rafael Pimenta, Rafael Ramiro, Roberta e Tati) pela convivência durante esses anos.

As amigas da PUC Juliana, Ana Flávia, Fernanda, Klívia, Layla e Camilinha por fazerem parte

da minha vida.

À toda turma de mestrado de 2010 pelo convívio durante esse tempo, e a todos os alunos do curso

pelas horas de descontração com os nossos Encontrões!

À plataforma de sequenciamento de DNA (PDTIS –FIOCRUZ).

Ao Jaci, Moisés, Thiago e a todo o pessoal do biotério pelas horas de trabalho disponibilizadas para

que esse estudo pudesse ser realizado.

Ao Programa de Pós-graduação em Ciência da Saúde do Centro de Pesquisas René Rachou

(FIOCRUZ), além das secretárias Andréia e Cristiane pela oportunidade e auxílio recebido.

Ao Dr. Breno de Mello Silva, Dr. Francisco José Alves Lemos e Dr. Luciano Andrade Moreira por

aceitarem participar da banca examinadora.

Ao Centro de Pesquisas René Rachou-Fiocruz pelo apoio estrutural e financeiro.

À Biblioteca do CPqRR em prover acesso gratuito local e remoto à informação técnico-científica em

saúde custeada com recursos públicos federais, integrante do rol de referências desta tese, também pela

catalogação e normalização da mesma.

À FAPEMIG pelo apoio financeiro.

viii

Sumário

Lista de figuras ......................................................................................................................... x

Lista de tabelas ...................................................................................................................... xiii

Lista de abreviaturas e símbolos ......................................................................................... xiv

Resumo ................................................................................................................................... xvi

Abstract ................................................................................................................................. xvii

1. Introdução .......................................................................................................................... 18

1.1 Aspectos gerais da biologia do Aedes aegypti ................................................................... 18

1.2 Aspectos gerais da Malária .............................................................................................. 19

1.3 Ciclo da Malária.............................................................................................................. 21

1.4 Malária experimental ...................................................................................................... 23

1.5 Aparelho digestivo dos mosquitos .................................................................................... 23

1.6 Sistema imune em mosquitos ........................................................................................... 25

1.6.1 Peptídeos Antimicrobianos (AMPs) ................................................................................................... 28

1.7 Bactérias simbiontes ........................................................................................................ 29

2 Objetivos .............................................................................................................................. 31

2.1 Objetivo geral.................................................................................................................. 31

2.2 Objetivos específicos........................................................................................................ 31

3 Materiais e Métodos ............................................................................................................ 32

3.1 Manutenção da cepa P. gallinaceum ................................................................................ 32

3.2 Obtenção e manutenção dos mosquitos ........................................................................... 32

3.3 Tratamento dos mosquitos com antibiótico ..................................................................... 33

3.4 Infecção dos mosquitos .................................................................................................... 33

3.5 Dissecção dos intestinos dos mosquitos ............................................................................ 33

3.6 Análise estatística ............................................................................................................ 34

3.7 Plaqueamento das amostras ............................................................................................ 34

3.8 Isolamento e estocagem das bactérias intestinais de A. aegypti ........................................ 34

3.9 Extração de DNA genômico ............................................................................................. 35

3.10 Amplificação do gene 16S DNAr ................................................................................... 35

ix

3.11 Eletroforese de DNA ...................................................................................................... 36

3.12 Purificação dos produtos da PCR .................................................................................. 36

3.13 Reação de sequenciamento do gene 16S ......................................................................... 36

3.14 Alinhamento das sequências .......................................................................................... 37

3.15 Análises da expressão gênica do mosquito ..................................................................... 37

3.16 Extração de RNA .......................................................................................................... 38

3.17 Tratamento do RNA com DNase ................................................................................... 38

3.18 Síntese de cDNA ............................................................................................................ 39

3.19 Reação da polimerase em cadeia em tempo real (Real-time PCR) utilizando o método comparativo .......................................................................................................................... 39

3.20 Reação da polimerase em cadeia em tempo real (Real-time PCR) utilizando o método da curva padrão ........................................................................................................................ 40

4 Resultados ............................................................................................................................ 42

4.1 Crescimento bacteriano diferencial após o plaqueamento dos intestinos ......................... 42

4.2 Isolamento e identificação das bactérias presentes no intestino de A. aegypti ................... 45

4.3 Efeito do tratamento com antibióticos na infecção por P. gallinaceum ............................ 48

4.4 Quantificação do DNA bacteriano Total ......................................................................... 53

4.5 Análises da expressão dos genes de peptídeos antimicrobianos no A. aegypti ................... 54

5 Discussão .............................................................................................................................. 61

5.1 Isolamento e identificação da microbiota intestinal de A. aegypti .................................... 61

5.2 Análise do impacto da administração de antibióticos na infecção de A. aegypti por P. gallinaceum ........................................................................................................................... 63

5.3 Análise do perfil de expressão de AMPs .......................................................................... 66

6 Conclusões ........................................................................................................................... 69

x

Lista de figuras

Figura 1:Áreas de risco de malária no mundo em 2009. Fonte: WHO (2010). ...................... 20

Figura 2: Distribuição geográfica de casos confirmados de malária por 1000 hab. em 2009.

Fonte: WHO (2010) ................................................................................................................. 20

Figura 3: Ciclo de vida do Plasmodium spp. Fonte: Su et al (2007). ..................................... 22

Figura 4: Esquema da anatomia interna dos mosquitos. Fonte: modificado de Jobling (1987).

.................................................................................................................................................. 24

Figura 5: Desenho esquemático da resposta imune em insetos. Fonte: Beckage (2008). ...... 26

Figura 6: Perda de parasitos ao longo da infecção no inseto e hospedeiro vertebrado. Fonte:

Amino (não publicado). (mz: meozoíto; tz: trofozoíto; ez: esquizonte; gcm: gametócito

masculino; gcf: gametócito feminino; zg: zigoto; ook: oocineto; ooc: oocisto; sz int:

esporozoítos no intestino; sz gs: esporozoíto na glândula salivar; mz hep: merozoítos no

hepatócito; *: tubo digestivo; #: glândula salivar; ^ : eritrócitos). ......................................... 27

Figura 7: Crescimento bacteriano após a incubação do macerado de intestinos. (A)

Crescimento de bactérias no intestino não tratado concentrado. (B) Crescimento de bactérias

no intestino não tratado diluído 10X. (C) Crescimento de bactérias no intestino tratado com

gentamicina concentrado. (D) Crescimento de bactérias no intestino tratado com gentamicina

diluído 10X. (E) Crescimento de bactérias no intestino não tratado concentrado (1X). (F)

Crescimento de bactérias no intestino tratado com tetraciclina concentrado (1X). (G)

Crescimento de bactérias no intestino não tratado diluído 10X. (H) Crescimento de bactérias

no intestino tratado com tetraciclina diluído 10X. ................................................................... 43

Figura 8: Crescimento bacteriano após a incubação do macerado de intestinos. (A)

Crescimento de bactérias no intestino tratado com espectinomicina concentrado (1X). (B)

Crescimento de bactérias no intestino tratado com espectinomicina diluído 10X. (C)

Crescimento de bactérias no intestino tratado com carbenicilina concentrado (1X). (D)

Crescimento de bactérias no intestino tratado com carbenicilina diluído 10X. (E) Crescimento

de bactérias no intestino tratado com canamicina concentrado (1X). (F) Crescimento de

bactérias no intestino tratado com canamicina diluído 10X. ................................................... 44

Figura 9: Visualização da banda de 1500pb do gene 16S DNAr dos isolados bacterianos do

intestino de A. aegypti. ............................................................................................................ 45

Figura 10: Porcentagem dos isolados bacterianos classificados em filos. ............................. 46

xi

Figura 11: Efeito do tratamento com gentamicina na infecção do A. aegypti por P.

gallinaceum. Cada ponto representa a quantidade de oocistos por intestino do mosquito. ..... 49

Figura 12: Efeito do tratamento com espectinomicina na infecção do A. aegypti por P.


Figura 13: Efeito do tratamento com tetraciclina na infecção do A. aegypti por P.


Figura 14: Efeito do tratamento com canamicina na infecção do A. aegypti por P.

gallinaceum. Cada ponto representa a quantidade de oocistos por intestino do mosquito. (***

= P<0,0001). ............................................................................................................................ 51

Figura 15: Efeito do tratamento com carbenicilina na infecção do A. aegypti por P.

gallinaceum. Cada ponto representa a quantidade de oocistos por intestino do mosquito. (***

= P<0,0001). ............................................................................................................................ 51

Figura 16: Efeito do tratamento com mistura de carbenicilina e canamicina na infecção do A.

aegypti por P. gallinaceum. Cada ponto representa a quantidade de oocistos por intestino do

mosquito. .................................................................................................................................. 52

Figura 17: Quantidade total de DNA bacteriano no intestino dos insetos. O teste Mann

Whitney foi utilizado (* = P> 0,05). ........................................................................................ 53

Figura 18: Níveis de mRNA de defensina em mosquitos inteiros alimentados com açúcar

tratados (KNSF, CBSF) e não tratados (SF-Ctr). P= 0,01 quando testado por One- way

ANOVA com múltiplas comparações de Tukey. .................................................................... 54

Figura 19: Perfil de expressão de defensina em insetos inteiros infectados (BFI-Ctr, KNBFI)

em diferentes tempos. Teste 2way Anova com correções de Bonferroni. (***= p< 0,001). ... 55

Figura 20: Perfil de expressão de defensina em insetos não infectados (BF-Ctr, KNBF) em

diferentes tempos. Teste 2way Anova com correções de Bonferroni. (***= p< 0,001). ... 56

Figura 21: Níveis de mRNA de gambicina em mosquitos inteiros alimentados com açúcar

tratados (KNSF, CBSF) e não tratados(SF-Ctr). Teste One- way ANOVA com múltiplas

comparações de Tukey. (* = P<0,05; ** = P< 0,03; *** = P<0,0001). ............................... 56

Figura 22: Perfil de expressão gambicina em insetos inteiros infectados (BFI-Ctr, KNBFI)

em diferentes tempos. Teste 2way Anova com correções de Bonferroni. (***= p< 0,001). ... 57

Figura 23: Perfil de expressão de gambicina em insetos não infectados (BF-Ctr, KNBF) em

diferentes tempos. Teste 2way Anova com correções de Bonferroni. (*= P<0,05; ***= p<

0,001). ...................................................................................................................................... 58

Figura 24: Perfil de expressão defensina em insetos inteiros infectados (BFI-Ctr, CBBFI) em

diferentes tempos. Teste 2way Anova com correções de Bonferroni. (***= p< 0,001). ........ 59

xii


diferentes tempos. Teste 2way Anova com correções de Bonferroni. (***= p< 0,001). ....... 59

Figura 26: Perfil de expressão gambicina em insetos inteiros infectados (BFI-Ctr, CBBFI)

em diferentes tempos. Teste 2way Anova com correções de Bonferroni. (*=P<0,05; ***= p<

0,001). ....................................................................................... Erro! Indicador não definido.


diferentes tempos. Teste 2way Anova com correções de Bonferroni. (***= p< 0,001). . Erro!

Indicador não definido.

xiii

Lista de tabelas

Tabela 1: Sequências dos oligonucleotídeos utilizados nos ensaios de PCR em tempo Real.

.................................................................................................................................................. 39

Tabela 2: Sequência dos oligonucleotídeos utilizados nos ensaios de PCR em tempo Real.. 41

Tabela 3: Estimativa das UFCs do intestino de A. aegypti antes e após o tratamento com

antibióticos. .............................................................................................................................. 42

Tabela 4: Identificação dos isolados bacterianos de acordo com o banco de dados GenBank.

.................................................................................................................................................. 47

xiv

Lista de abreviaturas e símbolos

AMP = peptídeos antimicrobianos (antimicrobial peptides)

BF-Ctr = controle alimentado com sangue (normal blood fed control group)

BFI = alimentado com sangue infectado (blood fed infected group)

CBSF= tratado com carbenicilina alimentado com açucar (carbenicilin treated sugar fed

group)

CBBF= tratado com carbenicilina alimentado com sangue (carbenicilin treated normal blood

fed group)

CBBFI= tratado com carbenicilina alimentado com sangue infectado (carbenicilin treated

blood fed infected group)

Ct = limiar do ciclo (cycle threshold)

cDNA = DNA complementar

DEPC = Dietil-pirocarbonato

DNA = ácido desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic acid)

DNAr = ácido desoxirribonucleico ribosomal (ribosomal deoxyribonucleic acid)

dNTP = desoxirribonucleotídeos fosfatados (deoxynucleotide triphosphates)

EDTA = ácido etileno diamono tetracético

Est = estimado

G = constante gravitacional

GNBP = proteínas que se ligam a bactérias Gram-negativas (Gram-negative bacteria-binding proteins)

HCl = ácido clorídrico

Imd = deficiência immune (Immune Deficiency)

KNSF= tratado com canamicina alimentado com açúcar (kanamicin treated sugar fed group)

KNBF= tratado com canamicina alimentado com sangue (kanamicin treated normal blood

fed group)

KNBFI= tratado com canamicina alimentado com sangue infectado (kanamicin treated blood

fed infected group)

LPS = lipopolisacáride (Lipopolysaccharide)

MgCl2 = cloreto de magnésio

MgSO4 = sulfato de magnésio

xv

ml = mililitro

mM = milimolar

M-MLV = vírus da leucemia de murinos Moloney (Moloney Murine Leukemia Virus)

nM = nanomolar

PAMP = padrões moleculares associados a patógenos (Pathogen-associated molecular pattern)

Pb = pares de base

PBS = Tampão fosfato salina (Phosphate buffer saline)

PCA = ágar padrão para contagem (Plate count agar)

PCR = reação em cadeia da polimerase (Polymerase chain reaction)

PGRP = proteínas que reconhecem peptidoglicanos (peptidoglycan recognition proteins)

pH = Potencial de Hidrogênio

pmol = picomol

PRR = receptores de reconhecimento padrão (pattern recognition receptor)

qPCR = PCR quantitativo (quantitative pcr)

RNA = ácido desoxirribonucléico (ribonucleic acid)

Rpm = rotações por minuto

SF-Ctr = controle não tratado alimentado com açúcar (sugar fed non-treated control group)

TBE = tampão Tris-Borato-EDTA

UFC = unidades formadoras de colônia (colony forming units)

V = volts

v/v = volume por volume

°C = graus Celsius

∆Ct = variação do limiar do ciclo

µg = microlitro

xvi

Resumo

A malária é responsável por cerca de 350 a 500 milhões de casos clínicos anuais,

permanecendo como um dos maiores problemas de saúde mundial. Estudos sobre a influência

da microbiota intestinal do vetor no desenvolvimento do ciclo de vida dos parasitos vêm

sendo desenvolvidos. Em mosquitos, as pesquisas vêm mostrando que infecções por bactérias

do intestino podem inibir o desenvolvimento esporogônico dos parasitas da malária. No

presente trabalho, o papel da microbiota intestinal do Aedes aegytpi infectado com

Plasmodium gallinaceum foi avaliado. Os insetos foram submetidos a cinco diferentes

antibióticos (canamicina, carbenicilina, espectinomicina, gentamicina e tetraciclina). Somente

canamicina e carbenicilina tiveram efeito sob a infecção com o parasito. Para esses dois

antibióticos e o controle, técnicas de cultivo bacteriano de isolamento e sequenciamento do

DNA ribossomal 16S foram feitas. Asaia bogorensis, Asaia krungthepensis, Asaia siamensis,

Bacillus licheniformis e Chryseobacterium meningosepticum foram identificadas para o

grupo controle. No grupo tratado com carbenicilina foram identificadas Chryseobacterium

meningosepticum e uma bactéria da família Microbacteriaceae, e para o grupo com

canamicina Microbacterium lacticum. Este trabalho sugere que a interação entre espécies de

Asaia e C. meningosepticum são relevantes na resistência/suscetibilidade do A. aegypti ao P.

gallinaceum. Para observar o efeito do tratamento com os dois antibióticos que mostraram

efeito na infecção na expressão de peptídeos antimicrobianos, os níveis de gambicina e

defensina foram medidos utilizando-se a técnica de Real-time PCR. Os níveis de defensina se

mostraram super-expressos quando os mosquitos foram submetidos aos tratamentos com

canamicina e carbenicilina, enquanto gambicina se mostrou super-expressa nos mosquitos

tratados com canamicina e sub-expressa naqueles com carbenicilina. A expressão desses dois

AMPs também foi medida quando esses grupos de insetos se alimentaram com sangue e com

sangue infectado. Nossos resultados mostraram que a expressão de defensina e gambicina no

grupo tratado com carbenicilina alimentado com sangue apresentou um aumento de 24h para

36h, e uma queda no grupo controle alimentado com sangue. Insetos tratados com

canamicina infectados aumentaram a expressão de defensina 24h e 36h após a alimentação,

diminuídas nos tratados com carbenicilina. É observada uma inibição do mRNA de

gambicina no grupo carbenicilina infectado sugerindo assim que a ativação desse peptídeo

não ocorre somente pelo parasita e necessita da ação da microbiota. Estes resultados indicam

que as bactérias associadas ao intestino do A. aegypti tem um papel importante na infecção e

resposta imune ao parasito.

xvii

Abstract

Malaria is responsible for about 350 to 500 million clinical cases annually, remaining as one

of the largest health problems worldwide. Studies on the influence of the vector gut

microbiota in the life cycle of the parasites are being performed. In mosquitoes, studies have

shown that infection with midgut microbiota may inhibit the sporogonic development of

malaria parasites. Here, the role of intestinal microbiota of Aedes aegytpi infected with

Plasmodium gallinaceum was assessed. The insects were subjected to five different

antibiotics (kanamycin, carbenicillin, spectinomycin, gentamicin and tetracycline). Only

kanamycin and carbenicillin had effect over the infection process. The response of treated

groups and control was analyzed by: bacterial culture techniques of isolation and sequencing

of 16S ribosomal DNA. Asaia bogorensis, Asaia krungthepensis, Asaia siamensis, Bacillus

licheniformis and Chryseobacterium meningosepticum were identified for the control group.

In the carbenicillin treated group Chryseobacterium meningosepticum and Microbacteriaceae

family bacterium were identified. In the kanamycin treated group Lacticum microbacterium

was found. This work suggests that the interaction between C. meningosepticum and Asaia

species is relevant in the resistance/susceptibility balance in the A. aegypti/P. gallinaceum

model. To observe the effect of treatment over the expression of antimicrobial peptides,

gambicin and defensin levels were measured by Real-time PCR. Levels of defensin proved to

be up-regulated when the mosquitoes were subjected to treatment with kanamycin and

carbenicillin. Gambicin levels were be up-regulated in mosquitoes treated with kanamycin

and down-regulated in those treated with carbenicillin. The expression of these two AMPs

was also measured when these groups of insects were fed with blood and infected blood. Our

results showed that the expression of defensin and gambicin in carbenicillin treated blood fed

group increased between 24 to 36 hours, and decreased in the blood fed control group.

Infected insects treated with kanamycin increased the expression of defensin between 24 to

36 hours after feeding, while it decreased in those treated with carbenicillin. An inhibition in

the expression of gambicin in the infected group treated with carbenicillin was observed,

suggesting that activation of these peptides does not occur only by the parasite, or microbial

action, but by both. These results indicate that the microbiota associated with A. aegypti has

an important role in infection and immune response to the parasite.

Alessandra da Silva Orfanó Introdução

18

1. Introdução

1.1 Aspectos gerais da biologia do Aedes aegypti

Os mosquitos são insetos dípteros, da Subordem Nematocera, da família Culicidae, da

subfamília Culicinae. São conhecidos também como pernilongos, muriçocas e carapanãs. A

subfamília Culicinae é a maior da família Culicidae e o gênero Aedes é o principal

representante dessa subfamília, sendo o Aedes aegypti um vetor de grande importância na

transmissão de dengue e febre amarela (Consoli & Oliveira, 1994; Foratini, 2002).

Os adultos são alados, possuem pernas e antenas longas e na grande maioria são

hematófagos, enquanto as fases imaturas são de vida livre, vivendo no ambiente aquático.

Seu ciclo biológico compreende as fases de ovo, larvas, pupa e adulto. Na fase de pupa,

ocorre a metamorfose no mosquito, e durante essa fase, o inseto não se alimenta, e se

transforma no adulto, o qual por sua vez possui aparelho bucal picador-sugador, tem asas,

pernas e genitálias completamente formadas (Consoli & Oliveira, 1994; Foratini, 2002). Seu

corpo é dividido em cabeça, tórax e abdome. Na cabeça encontram-se os principais órgãos

dos sentidos, como os olhos, as antenas e os palpos. No tórax estão os apêndices

especializados na locomoção, como as pernas e as asas. O abdome inclui a maior parte dos

órgãos internos do aparelho reprodutor, digestivo e excretor (Consoli & Oliveira, 1994).

A grande maioria dos mosquitos depende da ingestão de carboidratos, usualmente

provenientes de seivas, flores e frutos. Somente as fêmeas dos mosquitos são hematófagas e o

repasto sanguíneo está relacionado ao desenvolvimento dos ovos (Consoli & Oliveira, 1994).

No momento do repasto sanguíneo, o mosquito injeta sua saliva no vertebrado, a qual pode

conter patógenos.

Em 1881, Carlos Finlay, um médico cubano, identificou o Aedes aegypti como vetor

de febre amarela. Atualmente, sabe-se que os insetos são capazes de transmitir uma ampla

variedade de patógenos como vírus, bactérias, protozoários e helmintos. Dengue e malária

são consideradas as mais importantes causas de morbidade e mortalidade no mundo

transmitidas por insetos (Tolle et al., 2009, WHO, 2010).


19

1.2 Aspectos gerais da Malária

O termo malária, proveniente da expressão “mau ar”, teve sua origem na Itália, onde

se acreditava que a causa da doença era os vapores vindos dos pântanos. A doença também é

conhecida como paludismo, impaludismo, sezão, tremedeira e febre palustre (Garnham,

1966; Sherman, 1998a; Neves et al., 2000). Os sintomas clássicos da malária são febre

intensa, calafrios e sudorese. Os calafrios são frequentemente acompanhados por dor de

cabeça, náuseas e fadiga. Nos casos mais graves, os pacientes podem apresentar

complicações respiratórias e neurológicas, bem como intensa anemia e insuficiência renal. Os

casos de malária cerebral são complicações raras observadas principalmente em crianças

(Neves et al., 2000; Augustine et al., 2009).

Em relação às doenças infecciosas transmitidas por insetos, a malária é responsável

por cerca de 350 a 500 milhões de casos clínicos anuais, permanecendo como um dos

maiores problemas de saúde mundial, afetando a saúde e a economia, principalmente nas

comunidades mais pobres do globo. Cerca de metade da população mundial está sob risco de

contrair a doença, sobretudo crianças menores de cinco anos e mulheres grávidas. Apesar do

sucesso da erradicação da doença em diversos países, em 2009, a malária esteve presente em

108 países e territórios e estima-se que 655.000 pessoas morreram de malária em 2010

(Figura 1) (WHO, 2011), no entanto, um recente trabalho, (Murray et al., 2012) demonstrou

que esse número poderia ser pelo menos o dobro do estimado pela WHO.

No Brasil, a malária é um grave problema de saúde pública, e a predominância dos

casos ocorre na área da Amazônia Legal, e segundo o Ministério da Saúde, em 2009,

aproximadamente 97% dos casos de malária se concentraram nos sete estados da região

amazônica: Acre, Amapá, Amazonas, Mato Grosso, Pará, Rondônia e Roraima (Figura 2)

(MS, 2011).

Os agentes etiológicos da malária são protozoários pertencentes ao filo Apicomplexa,

família Plasmodiidae e gênero Plasmodium. Em humanos, a doença pode ser causada por

cinco espécies: Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malarie, Plasmodium

falciparum e Plasmodium knowlesi. Os protozoários do gênero Plasmodium são transmitidos

ao homem pela picada de fêmeas de mosquitos do gênero Anopheles, família Culicidae

(Consoli & Oliveira, 1998).

Dentre as espécies de Plasmodium que causam malária em humanos P. falciparum é o

responsável pela doença mais severa, devido a sua capacidade de aderir ao epitélio dos capilares,

podendo ocasionar falha renal aguda, malária cerebral e edema pulmonar. P.vivax é menos letal


20

que P. falciparum, porém, pode causar grande debilidade ao paciente (Greenwood et al.,2008).

Áreas onde ocorre transmissão de malária Áreas com transmissão limitada de malária

Figura 1:Áreas de risco de malária no mundo em 2009. Fonte: WHO (2010).

Figura 2:Distribuição geográfica de casos confirmados de malária por 1000 hab. em 2009. Fonte: WHO (2010)


21

1.3 Ciclo da Malária

O ciclo de vida do Plasmodium (Figura 3) é constituído por uma fase sexual exógena

(esporogônica), na qual ocorre a multiplicação dos parasitos no mosquito e uma fase

assexuada endógena (esquizogônica), onde ocorre a multiplicação no hospedeiro vertebrado

em células parenquimatosas do fígado (esquizogonia hepática) ou nos eritrócitos

(esquizogonia eritrocitária) (Sinnis & Coppi, 2007). Essa dinâmica do ciclo demonstra sua

grande complexidade que está relacionada à habilidade do parasito em alterar suas

características celulares e moleculares e em desenvolver-se nos ambientes intra e extracelular,

tanto do hospedeiro vertebrado quanto do mosquito vetor.

Quando as fêmeas de mosquitos Anopheles picam um hospedeiro infectado elas

ingerem, juntamente com o sangue, as formas gametocíticas do parasito. No lúmen do

intestino, essas formas sofrem maturação e originam micro e macrogametócitos que, após a

fecundação, formarão um zigoto diplóide (Sinden, 1999). O zigoto amadurece e diferencia-se

em oocineto, uma forma móvel do parasito. Dependendo das espécies de Plasmodium, esse

processo pode durar de 16 a 24 horas (Ghosh et al., 2000; Dinglasan et al., 2009). O oocineto

atravessa a matriz peritrófica do intestino e atinge a parede do epitélio intestinal onde se

transforma em oocisto. Para atravessar o epitélio, estudos demonstraram que dependendo do

modelo utilizado, A. aegypti com Plasmodium gallinaceum ou Anopheles stephensi com P.

berghei, esse processo de invasão ocorre de forma diferenciada (Shahabuddin & Pimenta

1998, Kumar et al., 2004) e pode ou não induzir a expressão de oxido nítrico sintase (NOS) (

Gupta et al., 2005). Após 10 a 15 dias de incubação ocorre o rompimento do oocisto e a

liberação de esporozoítos na hemolinfa (Hillyer et al., 2007). Esses esporozoítos invadem a

glândula salivar (Pimenta et al.,1994) e podem ser transmitidos a um hospedeiro vertebrado

pela picada do vetor. Após um repasto sanguíneo infectante, os esporozoítos liberados pelo

mosquito alcançam a corrente sanguínea do hospedeiro vertebrado, migram para células do

fígado e atingem os hepatócitos, dando início assim ao ciclo exoeritrocítico (Meis &

Verhave, 1988; Amino et al., 2006). Uma vez dentro dos hepatócitos, os esporozoítos se

diferenciam em trofozoítos que, após várias divisões por esquizogonia, formam os

esquizontes. Krotoski e colaboradores (1982) descreveram que em P. vivax alguns

esporozoítos podem permanecer latentes no hepatócito e eles seriam responsáveis pelos

episódios de recaída tardia da doença. Essas formas latentes, denominadas hipnozoítos, são

resistentes aos fármacos utilizados (Wells et al., 2010) e representam um fator agravante no


22

controle da doença. No momento em que os esquizontes amadurecem, eles se rompem e

liberam milhares de merozoítos, formas invasivas que parasitam as hemácias circulantes. Eles

também podem ser encontrados em vesículas denominadas merossomos, capazes de

transportar centenas de merozoítos para a corrente sanguínea e de protegê-los do ataque das

células de Kupfer do fígado (Sturm et al., 2006). Estudos recentes têm mostrado que em

mamíferos roedores infectados com Plasmodium berghei aproximadamente 10% dos

parasitos permanecem ativos na pele e são capazes de formar merossomos (Gueirard et al.,

2010). Após invadirem as hemácias, os merozoítos se desenvolvem em trofozoítos e estes

dão origem a esquizontes por meio de múltiplas divisões nucleares. Novos merozoítos são

formados no interior dos esquizontes e são liberados pela ruptura destes, dando início a uma

nova etapa de invasões de eritrócitos e completando-se o ciclo assexuado do parasito (Miller

et al., 2002). Alguns merozoítos sanguíneos passam por um desenvolvimento diferencial

resultando na formação de células sexuais especializadas, os gametócitos masculino

(microgametócito) e o feminino (macrogametócito), que ao serem ingeridos pelos mosquitos

seguirão seu desenvolvimento sexuado no vetor (Deepak et al., 2004).

Figura 3: Ciclo de vida do Plasmodium spp. Fonte: Su et al (2007).


23

1.4 Malária experimental

A susceptibilidade dos mosquitos à invasão pelo Plasmodium é um fator determinante

na eficiência dos vetores na transmissão da malária. Sabe-se que algumas espécies de

mosquitos podem se infectar com a malária enquanto outros não, e que, dentro da mesma

população de mosquitos, alguns são mais susceptíveis do que outros. Essa susceptibilidade

depende de fatores genéticos como variação entre espécies e cepas da mesma espécie,

fenotípicos tais como: tamanho do mosquito, digestão sanguínea e nutrição e fatores externos

como, por exemplo: temperatura, umidade, inseticida e drogas (Ichimori, 1989).

A malária animal tem sido usada como modelo para estudos em laboratório. Contudo,

para isso é necessário que se encontrem bons vetores experimentais para o parasito. Dessa

forma, o A. aegypti é uma espécie utilizada na transmissão e manutenção do P. gallinaceum

em laboratório, com um índice de susceptibilidade próximo a 100% (Ludsdem & Bertram,

1940; Eyles, 1951), resultando em um excelente sistema de interação parasita-hospedeiro

para estudos de malária.

1.5 Aparelho digestivo dos mosquitos

O intestino dos mosquitos além de digerir e absorver nutrientes também atua como

entrada de patógenos, sendo, portanto, o primeiro local de contato entre esses e o vetor.

Composto por uma monocamada de células epiteliais que forma um tubo se estendendo da

parte anterior até a porção posterior. É comumente dividido em 3 regiões: intestino anterior,

médio e posterior (Figura 4).

O intestino anterior está envolvido principalmente com a ingestão, condução e

armazenamento do alimento. O intestino médio é o local onde o sangue fica estocado e onde

ocorre todo o processo digestivo. O intestino posterior é responsável por uma parte da

absorção dos nutrientes e pela excreção das dejeções da alimentação (Graf et al., 1986;

Billingsley & Lehane, 1996).

No intestino médio, após a ingestão de sangue, as fêmeas de mosquitos darão início a

vários eventos fisiológicos que resultarão na maturação dos ovócitos e posterior oviposição

(Telang et al., 2006). Essa ingestão de sangue torna o intestino um ambiente altamente

nutritivo e propicio ao crescimento de patógenos, sendo esse, portanto, o local de maior


24

vulnerabilidade dos vetores, uma vez que é desprovido de quitina devido a sua origem

endodérmica possibilitando a invasão desses patógenos nas células epiteliais.

Para minimizar essa falta de quitina, os mosquitos após o estímulo da alimentação

sanguínea, sintetizam a formação de uma matriz acelular constituída de quitina, proteínas e

proteoglicanos que envolve o bolo de sangue ingerido, conhecida como matriz peritrófica

(Ghosh et al., 2000; Filho et al.,2002; Devenport, Fujioka & Jacobs-Lorena, 2004).

Importantes fatores como fonte sanguínea, pH, situação nutricional e hormonal do

hospedeiro (Nguu et al., 1996; Feder et al., 1997; Sinden & Billingsley, 2001), ação de

enzimas digestivas (Kaplan et al., 2001), receptores de superfície presentes no intestino

(Wilkins & Billingsley, 2001), presença de bactérias simbiontes (Dale & Welburn, 2001) e a

ativação de genes do sistema imune e peptídeos antimicrobianos (Dimopoulos et al., 1998;

Lehane et al., 2003), podem influenciar a entrada de patógenos no aparelho digestivo.

Figura 4: Esquema da anatomia interna dos mosquitos. Fonte: modificado de Jobling (1987).


25

1.6 Sistema imune em mosquitos

Os insetos são expostos a uma grande variedade de agentes infecciosos no ambiente

em que vivem. Com o intuito de diminuir o risco de infecção a diferentes patógenos, os

insetos, desenvolveram barreiras físicas e um mecanismo de defesa celular e humoral bem

eficientes.

A primeira linha de defesa contra microrganismos são as barreiras físicas compostas

pelo exoesqueleto, matriz peritrófica do intestino e um revestimento quitinoso da traquéia. O

exoesqueleto protege os órgãos do inseto e a hemolinfa da exposição direta aos

microrganismos do ambiente (Söderhäll and Cerenius, 1998; Theopold et al., 2002). A matrix

peritrófica é uma estrutura quitinosa que facilita a digestão além de proteger o epitélio

intestinal do contato direto com o sangue e a flora microbiana que pode aumentar em até 16

vezes depois da alimentação sanguínea em alguns insetos hematófagos (DeMaio et al., 1996;

Pimenta et al., 1997; Shao et al., 2001; Secundino et al., 2005). Parasitas da malária

desenvolveram um mecanismo específico de secreção de quitinase para atravessar a matriz

peritrófica antes da invasão do epitélio intestinal do mosquito (Shahabuddin et al., 1993; Tsai

et al., 2001).

Quando o patógeno escapa das barreiras físicas ele se depara ainda com um robusto

sistema imune que apresenta uma capacidade de defesa humoral e celular direcionada a alvos

específicos de uma variedade de micro-organismos e macroparasitas (Figura 5) (Richman &

Kafatos, 1995). Respostas celulares como fagocitose, encapsulação celular e indução de

apoptose também podem ser iniciadas através de interações inseto-patógeno, como ocorre na

resposta imune humoral e ainda, uma reação de profenoloxidases que depositam melanina em

volta dos microorganismos (Horton & Ratcliffe, 2001; Kumar et al., 2004; Michael &

Kafatos, 2005; Molina-Cruz et al., 2007; Kumar et al., 2010).

A imunidade humoral dos mosquitos pode ser dividida em quatro etapas:

reconhecimento de moléculas não-próprias através de receptores de reconhecimento padrão

(PRRs); modulação, que leva à amplificação e distribuição do sinal de reconhecimento;

ativação de um conjunto de moléculas efetoras (AMPs) e cascatas de coagulação; e

reabastecimento das moléculas de imunidade pela ativação das vias de transdução de sinal

como Toll e Imd (Michael & Kafatos, 2005; Christophides et al., 2002).

PRRs reconhecem e se ligam a PAMPs. Os PAMPs são compartilhados por vários

microorganismos, são essenciais para a fisiologia do micróbio e ausentes na maioria dos

organismos superiores. Como exemplo de PAMPs tem-se peptidoglicanos,


26

lipopolissacarídeos (LPS), que são componentes das paredes e membranas de bactérias. Os

PPRs mais bem estudados são as proteínas que reconhecem peptidoglicanos (PGRPs) e

proteínas que se ligam a bactérias Gram negativas (GNBPs), eles podem estar ligados às

células ou circulantes na hemolinfa (Osta et al., 2004).

O reconhecimento do não próprio ativa a cascata proteolítica de serino proteases que

amplificam o sinal e acionam a resposta efetora. Os componentes chave dessa cascata são

serino proteases com domínio CLIPs, que ativam as vias de sinalização que levam à síntese

de AMPs.

O tecido epitelial protege o inseto contra infecções atuando tanto como barreira física

quanto por meio de sua competência imunológica produzindo componentes de defesa. A

invasão do epitélio intestinal pelos oocinetos aumenta a expressão de muitos genes de

imunidade (Dimopoulos et al., 1997; 1998; Luckhart et al., 1998, Bahia et al., 2011). A

glândula salivar juntamente com o corpo gorduroso é outro importante órgão imune que é

capaz de produzir diferentes peptídeos de imunidade (Dimopoulos et al., 1997; 1998;

Richman et al., 1997).

Durante o desenvolvimento esporogônico, no caso do Plasmodium, um grande

número de parasitos morre. Apenas um pequeno número de gametócitos que são ingeridos se

Figura 5: Desenho esquemático da resposta imune em insetos. Fonte: Beckage (2008).

Patógeno

Receptores de reconhecimento padrão

Fagocitose

Via de transdução de sinal

Melanização

Amplificação do sinal na via

Genes efetores Morte


27

desenvolverá em oocinetos e desses, somente uma fração atingirá o estágio de oocisto (Figura

6). Nos estágios tardios de infecção, mais de 80% dos esporozoítos da hemocele são

rapidamente eliminados (Korochkina et al., 2006; Hillyer et al., 2007). A magnitude dessa

perda pode diferir entre infecções com diferentes parasitos e mosquitos (Beier, 1998; Ghosh

et al., 2000; Dimopoulos et al., 2002b). A eliminação do Plasmodium no mosquito está

relacionada ao sistema imune inato que é crucial para o sucesso na transmissão da malária

(Luckhart et al., 1998; Lowenberger et al., 1999).

A reação humoral melhor caracterizada nos insetos é a produção de AMPs. Em geral,

são pequenos, catiônicos e estruturalmente diversos, são secretados na hemolinfa após a

invasão de um patógeno (Bulet et al., 1999).

Figura 6: Perda de parasitos ao longo da infecção no inseto e hospedeiro vertebrado. Fonte: Amino (não publicado). (mz: meozoíto; tz: trofozoíto; ez: esquizonte; gcm: gametócito masculino; gcf: gametócito feminino; zg: zigoto; ook: oocineto; ooc: oocisto; sz int: esporozoítos no intestino; sz gs: esporozoíto na glândula salivar; mz hep: merozoítos no hepatócito; *: tubo digestivo; #: glândula salivar; ^ : eritrócitos).


28

1.6.1 Peptídeos Antimicrobianos (AMPs)

São principalmente produzidos pelo corpo gorduroso, hemócitos e por estruturas que

representam barreiras físicas como intestino médio, túbulos de malpighi, traquéia e glândula

salivar (Tzou et al., 2000; Levashina 2004). Podem ser detectados na hemolinfa do inseto

entre 2-4 horas após uma lesão séptica (Meister et al., 1997). A produção de um AMP é

quase 130 vezes mais rápida que IgM (imunoglobulina M) em vertebrados (Boman, 1991), a

primeira a aparecer, e cerca de 3 vezes mais rápida que a reprodução de bactérias. Um inseto

produz aproximadamente 10-15 AMPs (Hoffmann et al., 1993), cada peptídeo exibindo um

espectro de ação diferente (Bulet et al., 1999). No entanto, em geral, os AMPs atuam na

membrana do patógeno por permeabilização ou formando canais dependente de voltagem

(Bulet et al., 1999).

Existem sete distintas famílias de AMPs identificadas em Drosophila, com diferentes

alvos específicos (Hetru et al., 2003). Defensinas (Dimarcq et al., 1994) que são a familia

mais generalizada de AMPs em insetos e outros invertebrados atuando principalmente contra

bactérias Gram-positivas, enquanto Cecropinas (Kylsten et al. 1990), apesar de apresentarem

um espectro mais amplo, são mais eficazes contra bactérias Gram-negativas. Outras famílias

incluem Drosomicina (Fehlbaum et al., 1994), Drosocina (Bulet et al., 1993), Atacina (Asling

et al., 1995), Diptericina (Wicker et al., 1990), e Metchnikowina (Levashina et al., 1995)

com o último sendo o único antifúngico. Esses AMPs são ativados por duas importantes vias

Toll e Imd.

A Defensina foi o primeiro imunopeptídeo isolado de A. aegypti (Chalk et al., 1995a;

Chalk et al., 1995b; Lowenberger et al., 1995). Ela também já foi isolada de linhagens

celulares de A. aegypti e A. albopictus (Gao et al., 1999) e do mosquito A. gambiae

(Dimopoulos et al., 1997; 1998; Richman et al., 1996). Seu espectro de atividade em

mosquitos é dado primeiramente contra bactérias gram-positivas (Lowenberger et al., 1995),

embora alguns fungos e bactérias gram-negativas também ativem sua transcrição (Aguilar et

al., 2005; Lamberty et al., 1999). Acredita-se que seu modo de ação ocorre pela formação de

canais dependentes de voltagem na membrana citoplasmática (Hoffmann & Hetru, 1992).

Gambicina foi identificada em A. aegypti e A. gambiae, no entanto, não foi

identificada em D. melanogaster (Dimopoulos et al., 2000; Vizioli et al., 2001; Christophides

et al., 2002). Acredita-se que a Gambicina tenha evoluído especificamente para combater a

flora microbiana ou os parasitas da malária já que é fortemente expressa em infecções por

bactéria ou Plasmodium (Dimopoulos et al., 1997; Richman et al., 1997; Dimopoulos, 2003).


29

1.7 Bactérias simbiontes

Associações simbiônticas entre microbiota e insetos podem ser benéficas para o

hospedeiro de muitas formas, incluindo suplementação da dieta, tolerância a variações do

ambiente, e/ou manutenção da homeostase no sistema imune do hospedeiro (Weiss & Aksoy,

2001). Essa microbiota suplementa o seu hospedeiro com nutrientes que são limitados ou

ausentes na dieta ou que não podem ser produzidos por ele próprio.

De acordo com Zook (1998), simbiose é definida como uma relação entre dois micro-

organismo resultando em novas estruturas ou metabolismo. No entanto, essa definição não

assume que a simbiose é uma relação benéfica. Uma interação positiva entre micro-

organismo e inseto é identificada como comensalismo e mutualismo. No comensalismo, o

micro-organismo beneficia o inseto enquanto o habita. No mutualismo, inseto e

microrganismos se beneficiam mutuamente (Smith & Douglas, 1987; Bignell, 2000).

A complexidade entre a simbiose de insetos com micro-organismos levou muitos

pesquisadores a ignorar o impacto da microbiota intestinal na biologia do hospedeiro (Dillon

& Dillon, 2004). Primariamente, simbiontes são verticalmente transmitidos da mãe para a

prole com alta fidelidade, simbiontes secundários podem ser adquiridos horizontalmente ou

pelo ambiente.

Enquanto insetos com uma dieta nutricional limitada estabelecem associações com

simbiontes primários e secundários, insetos com uma ampla dieta podem abrigar uma

variedade de micro-organismos adquiridos do ambiente. Tanto linhagens de campo como de

laboratório de mosquitos possuem uma robusta associação da microbiota com o intestino que

consiste principalmente de bactérias Gram-negativas membros da família Enterobacteriaceae.

Foi identificado em populações de campo de A. gambiae e A. funestus 16 espécies de

bactérias de 14 gêneros (Lindh et al., 2005). Em populações de laboratório de A. gambiae e

A. stephensi foi indentificado uma ampla variedade de bactérias, principalmente dos gêneros

Asaia, Enterobacter, Mycobacterium, Sphingomonas, Serratia e Chryseobacterium (Favia et

al., 2007; Dong et al., 2009).

Estudos sobre a influência da microbiota intestinal do vetor no desenvolvimento do

ciclo de vida dos parasitos vêm sendo desenvolvidos. Em mosquitos, as pesquisas vêm

mostrando que infecções por bactérias do intestino podem inibir o desenvolvimento

esporogônico dos parasitas da malária (Pumpuni et al., 1993; 1996; Gonzalez-Ceron et al.,

2003; Dong et al., 2009; Cirimotich et al., 2011). Pumpuni e colaboradores, (1993, 1996),


30

demonstraram que bactérias Gram-negativas inibem a formação de oocistos total ou

parcialmente, sendo que a mesma ação não foi observada com bactérias Gram-positivas.

Evidências dessa influência da microbiota intestinal no ciclo de vida de parasitas têm

sido demonstradas para outros insetos como flebotomíneos e moscas tsé-tsé (Schlein et al.,

1985; Welburn & Maldlin, 1999).

Esses estudos indicam que a microbiota intestinal possivelmente contribui para a

modulação da competência vetorial do inseto, mas na maioria dos casos os mecanismos

envolvidos ainda são desconhecidos. Essa influência pode ser por uma interação direta com

o parasita, que pode ocorrer pela atividade inibitória de enzimas ou toxinas, ou indiretamente

pela indução da atividade do sistema imune do hospedeiro.

Estudos recentes sugerem que a presença de espécies de Enterobacter no intestino do

A. arabiensis originados de uma população de Zâmbia agem diretamente no P. falciparum

bloqueando o desenvolvimento do parasito, tornando essa população refrataria a infecção.

Essa refratariedade foi associada à geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) que

interferem com o desenvolvimento do parasito e o mata antes da sua invasão no epitélio

intestinal (Cirimotich et al., 2011).

Já estudos anteriores sugerem que bactérias no lúmen do intestino modificam o

ambiente intestinal e inibem o desenvolvimento de parasitas pela ação do sistema imune por

meio da super expressão de genes de imunidade culminando no aumento da taxa de produção

de peptídeos antimicrobiano (Pumpuni et al.,1996; Ratcliffe & Whitten, 2004; Michel &

Kafatos, 2005). Esses peptídeos provavelmente possuem um papel chave não somente no

controle de bactérias patogênicas ou simbiontes, mas também no desenvolvimento de

infecções por parasitos (Beard et al., 2001; Boulanger et al., 2004). Interessantemente, o

sistema imune do mosquito age contra a proliferação de bactérias e também elimina um

grande número de parasitos, modulando a intensidade da infecção no mosquito quando

infectado com P. berghei ou com P. falciparum (Meister et al., 2009).

Existem ainda muitas dificuldades em definir a microbiota indígena em comparação a

bactérias transientes. A realização de projetos de genoma de insetos e a introdução de

técnicas moleculares novas como ferramenta estão auxiliando estudos detalhados da

microbiota de insetos (Dillon & Dillon, 2004).

Alessandra da Silva Orfanó Objetivos

31

2 Objetivos

2.1 Objetivo geral

Avaliar o papel da microbiota intestinal do Aedes aegypti no desenvolvimento esporogônico

do Plasmodium gallinaceum.

2.2 Objetivos específicos

a) Avaliar a eficiência da infecção dos mosquitos por P. gallinaceum quando submetidos ao

tratamento com diferentes antibióticos

b) Avaliar a eficiência da infecção dos mosquitos por P. gallinaceum quando tratados com

uma combinação dos antibióticos que apresentarem maior eficiência na diminuição da

microbiota, avaliado no item anterior.

c) Identificar as bactérias presentes no intestino do A. aegypti antes e após o uso dos

antibióticos que se apresentaram mais eficientes.

d) Avaliar os efeitos do tratamento com antibióticos e da infecção por P. gallinaceum na

expressão de genes relacionados com o sistema imune em A. aegypti.

Alessandra da Silva Orfanó Materiais e Métodos

32

3 Materiais e Métodos

3.1 Manutenção da cepa P. gallinaceum

Aproximadamente 200µl de sangue contendo trofozoítos de P. gallinaceum (20%-

30%) foi inoculado via intramuscular em pintos híbridos (Gallus gallus domesticus) de três

dias de vida.

O estabelecimento da infecção, que ocorre em média 5 dias após a inoculação, foi

acompanhado pela análise do esfregaço, colhida a partir do corte da extremidade da unha, de

uma gota de sangue de todas as aves infectadas. A lâmina foi fixada e corada com soluções

de Panótico Rápido® (Laboclin). O número de células parasitadas foi contado em

microscópio óptico, usando aumento de 1000X para a estimativa da parasitemia. Quando a

parasitemia encontrava-se em ascensão (4-10%) e as aves apresentavam uma porcentagem de

gametócitos entre 1-2%, as mesmas foram colocadas sobre as gaiolas para a alimentação de

mosquitos.

A passagem da cepa em aves foi feita semanalmente por no máximo sete vezes. Após

esse período é necessário restabelecer a infectividade do parasito pela picada direta de

mosquitos infectados em aves sadias.

3.2 Obtenção e manutenção dos mosquitos

Os mosquitos A. aegypti originados da região administrativa de Barreiro de Belo

Horizonte, Minas Gerais - foram obtidos a partir de ovos coletados pela Secretaria Municipal

de Saúde de Belo Horizonte e mantidos no insetário do Laboratório de Entomologia Médica

do Centro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ e a terceira geração utilizada nos

experimentos.

O insetário é climatizado com uma variação média de temperatura de 26-28ºC e

umidade relativa do ar em torno de 70-80% em ciclos de 12 horas de claridade e 12 horas de

escuridão. As larvas foram mantidas em uma cuba plástica contendo água sem cloro, duas

gotas de solução de iodo (2%) e uma de Gonol (após reconstituição com água filtrada para 60

ml: ampicilina 3,5 g e probenecida 1,0 g), e foram alimentadas diariamente com ração de

peixe (Goldfish Colour®). Após a mudança de fase de larva para pupa, estas foram coletas e


33

transferidas para gaiolas próprias, até o surgimento dos adultos que foram utilizados nos

experimentos.

3.3 Tratamento dos mosquitos com antibiótico

As gaiolas utilizadas foram previamente lavadas e limpas com álcool 70% antes da

introdução das pupas. Os mosquitos adultos que emergiram foram alimentados ad libitum,

por cinco dias consecutivos em algodões estéreis umedecidos contendo solução de glicose

10% estéril acrescida com um dos seguintes antibióticos (Sigma Chemical Co)

separadamente: tetraciclina, gentamicina e canamicina que possuem ação contra bactérias

Gram negativas e positivas, e carbenicilina e espectinomicina que apresentam ação contra

bactérias gram-negativas, todos na concentração de 200µg/mL. Fêmeas do grupo controle

foram alimentadas com solução de glicose 10% estéril sem antibiótico.

3.4 Infecção dos mosquitos

Foi oferecido, por cinco dias, para cerca de 150 fêmeas de A. aegypti de cada grupo

(controle e tratado com antibiótico), solução de glicose 10% e após esse período, esses

insetos foram colocados para se alimentarem, ao mesmo tempo em ave infectada por P.

gallinaceum. As fêmeas foram anestesiadas em CO2 para separação das ingurgitadas e

mantidas a 27°C. O tratamento com antibiótico continuou sendo administrado até o 7º dia

após a infecção, quando um total de 30 insetos para cada grupo foram dissecados e o intestino

retirado. Os experimentos de infecção foram feitos em três repetições independentes, com

insetos da mesma geração, porém, podem ter sido criados em épocas diferentes.

3.5 Dissecção dos intestinos dos mosquitos

As fêmeas foram anestesiadas no freezer por 5 min e transferidas para uma placa de

Petri sobre gelo para imobilização dos insetos. O intestino foi dissecado com o auxílio de

estiletes sobre uma lâmina contendo solução de tampão fosfato salina (PBS), pH 7.2, e

transferido para outra lâmina contendo solução de merbromina (mercurocromo) a 0,2% e


34

coberto por uma lamínula para visualização e contagem dos oocistos ao microscópio. Os

dados foram submetidos a análise estatística para verificação de diferenças significativas.

3.6 Análise estatística

Análises estatísticas foram feitas usando o software GraphPad Prism (Prism 5.01;

GraphPad Software Inc.). Foi utilizado o Teste Shapiro-Wilk para verificar a normalidade da

distribuição. Em caso positivo foi feito o teste T-Student não pareado paramétrico, quando

não era possível fazer esse teste, foi feito o teste Mann-Whitney não pareado e não

paramétrico.

3.7 Plaqueamento das amostras

Mosquitos fêmeas do grupo controle e do grupo tratado, após cinco dias de vida,

tiveram suas superfícies esterilizadas com lavagens rápidas em uma sequência de soluções

antissépticas: hipoclorito de sódio 1%, álcool 70% e PBS estéril (pH 7.2), por um minuto

cada. A seguir, os mosquitos foram dissecados em condições estéreis, com o auxílio de

estiletes estéreis sobre uma lâmina contendo solução de PBS. Dez intestinos foram

transferidos para tubos de 1,5ml contendo 50µl de PBS, macerados com o auxilio de um

pistilo e diluídos em 150µl de PBS. Uma alíquota de 100µl foi transferida para uma placa de

Petri contendo meio PCA (Plate Count Ágar) (0,5% peptona, 0,25% extrato de levedura,

0,1% dextrose, 1% ágar), um meio não seletivo, e outra alíquota 10 vezes diluída também foi

transferida para uma nova placa, sendo utilizado o método de semeadura por espalhamento.

As placas foram incubadas a 27°C por 24-48h, e as colônias contadas e descritas como

unidades formadoras de colônia (UFC/mL). O plaqueamento foi feito em duplicata.

3.8 Isolamento e estocagem das bactérias intestinais de A. aegypti

Após o crescimento bacteriano por 48 h, as colônias que apresentavam características

distintas foram selecionadas para identificação. Cada colônia diferente foi submetida a 3

ciclos de repique para garantir a obtenção de cultura pura. Após, essas colônias foram

colocadas em meio PCA liquido, para permitir seu crescimento, incubados em estufa na

temperatura de 27ºC por até no máximo 18 horas.


35

Posteriormente, amostras da cultura foram utilizadas para realização da coloração de

Gram. O restante foi separado para extração de DNA e para congelamento. Para o

armazenamento, as alíquotas foram transferidas para tubos de 1,5 ml contendo solução de

congelamento (Tris-HCl 25mM, pH 8,0; MgSO4 0,1M; glicerol 65%), na proporção de 1:2.

As amostras foram estocadas em freezer -70ºC.

3.9 Extração de DNA genômico

Para a extração de DNA genômico, cada isolado bacteriano foi cultivado em meio

PCA liquido sob agitação de 200 rpm a temperatura de 27º C por até 16h. As culturas foram

centrifugadas por 5 min a 10.000 x g em temperatura ambiente. A extração de DNA foi feita

utilizando-se DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen®) seguindo as instruções do fabricante e

armazenado a –20º C para posterior uso. A concentração e qualidade do DNA obtido foram

determinadas em espectrofotômetro (Nanodrop ND-1000 Thermo Scientific) e por meio de

eletroforese em gel de agarose 1% (w/v). O DNA obtido apresentando valor de absorbância

(A) A260/280 acima de 1,8 foi armazenado a -20ºC.

O DNA do intestino das fêmeas também foi extraído de acordo com o descrito acima,

com a finalidade de comparar a quantidade total de DNA bacteriano entre o inseto tratado e

não tratado.

3.10 Amplificação do gene 16S DNAr

O DNA genômico extraído dos isolados bacterianos foi utilizado como molde para a

reação em cadeia da polimerase (PCR- “Polymerase chain reaction”) visando a amplificação

do gene 16S DNAr. Para a realização da PCR foi utilizado: tampão da reação GoTaq®

(1,5mM MgCl2; Mix dNTPs (10mM); primer foward 27F 10 (pmol); primer reverse 1492R

(10pmol); GoTaq® DNA polimerase (Promega) (5,0u/µl); cDNA (20% v/v); água livre de

nuclease para um volume final de 75µl.

O material foi misturado em vórtex, centrifugado e os tubos levados ao termociclador

Gene AMP® PCR System 9700 (Applied Biosystems), com os seguintes parâmetros: 95ºC

por 2 min, 10 ciclo de 95ºC por 1 min, 50ºC por 1 min, 72ºC 10 min, seguido por 25 ciclos de

95ºC por 1 min, 50ºC por 1 min, 72ºC por 3 min e um ciclo de 72ºC por 7 minutos.


36

Os seguintes iniciadores universais da sequência 16S DNAr (Polz e Cavanaugh, 1998)

foram utilizados: 27F 5´-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´ e 1492R 5´-

TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3´.

3.11 Eletroforese de DNA

O produto das amplificações foi analisado em gel de poliacrilamida 6%, corado com

nitrato de prata 6%. O gel foi submetido a uma corrente de 100 V com tampão TBE (Tris-

Borato-EDTA) (Tris 90mM, ácido bórico 90 mM, EDTA 50 mM, pH 8,0) por 90 minutos.

Como padrão de massa molecular utilizou-se 3µl de Orange Blue Dye (Promega®). A

imagem foi digitalizada utilizando um scanner.

3.12 Purificação dos produtos da PCR

Após verificar pelo gel de poliacrilamida a ocorrência da amplificação das amostras

com tamanho correspondente a 1.500 pb, os produtos obtidos dos isolados foram purificados

utilizando o Wizard® Gel and Clean up System Kit (Promega), segundo orientações do

fabricante.

3.13 Reação de sequenciamento do gene 16S

As reações de sequenciamento foram realizadas utilizando-se o kit DyeNamicTMET

Terminator (GE Healthcare, UK) seguindo as instruções do fabricante. Os oligonucleotídeos

iniciadores, 27F e 1492R, foram utilizados separadamente, e adicionado 100ng do DNA

molde. As condições de PCR foram as seguintes: 1) desnaturação inicial a 95ºC por 2 min; 2)

desnaturação a 96 ºC por 20 seg; 3) anelamento a 50ºC por 15 seg; 4) extensão a 60ºC por 1

min; 7) 25 ciclos das etapas de 2 a 4. Após, o DNA foi precipitado adicionando 1uL de

acetato de amônio 7,5 M, 2X o volume da reação de etanol 95% gelado em cada cavidade da

placa. O material foi submetido à agitação e mantido a temperatura ambiente por 15 min

protegido da luz; e a seguir centrifugado à temperatura ambiente por 45 min a 3.700 rpm. O

sobrenadante foi removido invertendo-se a placa e foi adicionado 100uL de etanol 70%

gelado em cada cavidade e centrifugado novamente à temperatura ambiente por 15 min a

3.700 rpm. O sobrenadante foi removido e a placa invertida foi submetida à centrifugação a


37

800 rpm por 5 segundos. O pellet foi eluído em 10uL da solução de eluição do kit de

sequenciamento e centrifugado brevemente e guardado no -20ºC e protegido da luz até o

momento de colocar na máquina.

O sequenciamento foi realizado utilizando-se o sequenciador automático MegaBace

1000 (Amersham Biosciences) da plataforma de sequenciamento do Centro de Pesquisas

René Rachou da Fundação Oswaldo Cruz – MG.

3.14 Alinhamento das sequências

Cada sequência foi submetidas à consulta no banco de dados público mundial,

GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) (Altschul et al., 1990) para comparação

com sequências homólogas ali depositadas. O resultado obtido de cada isolado contém

valores de identidade e “e-value” das mesmas.

As sequencias obtidas foram também foram comparadas a outro programa

MULTALIN (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html) (Corpet, 1988).

3.15 Análises da expressão gênica do mosquito

Para a análise da expressão de defensina e gambicina, foram utilizados os seguintes

grupos: fêmeas SF-Ctr = controle não tratado alimentado com açúcar. (sugar fed non-treated

control group), BF-Ctr = controle alimentado com sangue (normal blood fed control group),

BFI = alimentado com sangue infectado (blood fed infected group), KNSF= tratado com

canamicina alimentado com açúcar (kanamicin treated sugar fed group), KNBF= tratado com

canamicina alimentado com sangue (kanamicin treated normal blood fed group), KNBFI=

tratado com canamicina alimentado com sangue infectado (kanamicin treated blood fed

infected group), CBSF= tratado com carbenicilina alimentado com açúcar (carbenicilin

treated sugar fed group), CBBF= tratado com carbenicilina alimentado com sangue

(carbenicilin treated normal blood fed group), CBBFI= tratado com carbenicilina alimentado

com sangue infectado (carbenicilin treated blood fed infected group). As amostras com

sangue foram retiradas em diferentes tempos (0h, 12, 24h, 36h). Seguiu-se, portanto, as

etapas de extração e tratamento do RNA, síntese do cDNA, e qPCR (Reação em cadeia da

polimerase quantitativa.


38

3.16 Extração de RNA

A extração do RNA total das fêmeas de A. aegypti foi realizada através do método

TRIZOL® (Invitrogen), utilizando-se inicialmente para cada amostra 500 µl da substância e

macerando-se o conteúdo com o auxilio de um pistilo, após macerar, foi adicionado 500µl da

mesma substância totalizando 1ml.

As amostras foram centrifugadas até 12.000 G por 10 min a 4ºC. O sobrenadante

transferido para um novo tubo e adicionado 200µl de clorofórmio e misturado invertendo o

tubo por 15 segundos e incubado a temperatura ambiente por 3 minutos. Após, a amostra foi

centrifugada a 12.000 x g por 10 min a 4ºC para separação de fase.

A porção aquosa foi transferida para um novo tubo e a esse adicionado 500µl de

álcool isopropílico para precipitação do RNA, incubado a temperatura ambiente por 10 min e

feita uma nova centrifugação em 12.000G por 10 min a 4ºC e todo sobrenadante resultante

foi retirado para a lavagem do “pellet” com 1 ml de etanol 70%, centrifugando-se mais uma

vez a 7500 x g por 5 minutos. Após a retirada do sobrenadante e do “pellet” já estar

totalmente seco, este foi eluído em 30 µl de água TE (Tris-EDTA) A esse volume foi

adicionado 1µl de inibidor de rnase RNasin® Plus RNase Inhibitor (Promega).

A qualidade e concentração de RNA obtido foram determinadas em espectrofotômetro

(Nanodrop ND-1000).

3.17 Tratamento do RNA com DNase

Para o tratamento do RNA foi utilizado o kit turbo DNA-free® (Applied Biosystems).

O RNA foi diluído em um volume final de 8 µl afim de se obter 1µg de RNA num tubo de

1,5 ml. Em seguida, foi adicionado 1µl do tampão e 1µl da enzima DNAse, homogeneizado e

incubado a 37ºC por 20 minutos. Após, foi adicionado 1µl do reagente DNase Inactivation

para inativação da enzima, incubado a temperatura ambiente por 5 min e centrifugado a

10.000 x g por 90 segundos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo livre de

DNase/RNase.


39

3.18 Síntese de cDNA

Ao tubo da reação anterior foi adicionada 0,5µl do oligonucleotídeo randômico

(Invitrogen) (300µg), e água DEPC (Dietilopirocarbonato) para um volume final de 15µl e

incubado a 70ºC por 5 minutos. O tubo foi resfriado por 5 min e acrescentado 5µl do tampão

M-MLV 5X, 1,5µl dNTPs (desoxirribonucleotídeos fosfatados - “deoxynucleotide

triphosphates”) (10µM) e 1µl da enzima M-MLV (Promega) (200U/µl) e 17,5µl de água

DEPC. Após a homogeneização, a reação foi incubada a 37ºC por 60 minutos.

O produto da reação foi acondicionado a – 20°C até o momento de sua utilização para

a PCR em Tempo Real.

3.19 Reação da polimerase em cadeia em tempo real (Real-time PCR) utilizando o método comparativo

A determinação da expressão dos genes escolhidos foi realizada através de reações em

triplicatas em placas de 96 poços (Applied Biosystems). As reações de qPCR foram feitas em

volume final de 15µl, 0,35µl de cada um dos oligonucleotídeos (senso e antisenso) (10µM),

3µl de cDNA (diluídos 3 vezes) e 7,5µl do SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems).

Foram utilizados iniciadores específicos (tabela 1) dos genes de interesse, gambicina e

defensina (Xi et al.,2008), e como controle interno os iniciadores do gene S7. Como controle

negativo foi utilizado poços sem amostra, mas com par de oligonucleotídeos e o mix de

SYBR Green.

Tabela 1: Sequências dos oligonucleotídeos utilizados nos ensaios de PCR em tempo Real.

Oligonucleotídeo Sequência 5’-3’

Defensina - F GAT TCG GCG TTG GTG ATA GT

Defensina - R TTA TTC AAT TCC GGC AGA CG

Gambicina - F GCC AAA ACC TGT TCC TCT TG

Gambicina - R CGA TGT AGC ATT CGG TGA TG

Proteína Ribossomal S7 - F ACCGCCGTCTACGATGCCA

Proteína Ribossomal S7 - R ATGGTGGTCTGCTGGTTCTT


40

O ensaio de Real-Time PCR foi realizado no aparelho 7500 Fast Real-Time PCR

System (Applied Biosystems) nas seguintes condições: um ciclo de 48ºC por 10 min, 1 ciclo

de 95ºC por 10 min, 40 ciclos de 95ºC por 15s e 60ºC por 1 minuto.

Para a análise da expressão gênica empregando a técnica de Real-Time PCR foi

utilizado o método de Delta-DeltaCt (∆∆Ct) (Livak & Schmittgen, 2001). Calcula-se

inicialmente o ∆Ct de cada amostra, subtraindo os valores de CT (Threshold cycle ou limiar

do ciclo) do gene controle (S7) dos valores do Ct do gene alvo. Após a determinação do ∆Ct

da amostra, escolhe-se a amostra normalizadora. Para o cálculo do ∆∆Ct é utilizado a

seguinte fórmula: [∆Ct (amostra) – ∆Ct (amostra normalizadora)]. Uma vez determinado o

∆∆Ct, aplica-se a fórmula 2-∆∆Ct, que resulta no valor da expressão relativa.

Para a utilização do método comparativo, foi necessário determinar inicialmente a

eficiência de amplificação do gene alvo e do controle interno. Para tanto, foram feitas curvas

com diluições seriadas do cDNA para cada gene de interesse. Para comparar a eficiência de

amplificação de dois genes os valores de Ct do gene alvo foram subtraídos dos valores de Ct

do gene controle. Caso a inclinação da reta seja menor que 0,1 a eficiência da amplificação é

comparável e o método pode ser utilizado.

3.20 Reação da polimerase em cadeia em tempo real (Real-time PCR) utilizando o método da curva padrão

A determinação da quantidade de DNA bacteriano correspondente ao gene 16S foi

quantificado entre os grupos sem tratamento e tratado com antibiótico (carbenicilina ou

canamicina) utilizando o 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). As

amostras foram feitas em triplicata em placas de 96 poços. As reações de PCR foi utilizado

um volume total de 25µl, usando o TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied

Biosystems), contendo 100nM de cada oligonucleotídeo universal e para a sonda. As

sequências dos oligonucleotídeos e da sonda estão na tabela 2.

As condições da reação foram 50ºC por 2 min, 95ºC por 10 min, 40 ciclos de 95ºC por

15 segundos e 60ºC por 1 minuto.

A curva padrão foi construída a partir do DNA de uma cultura de Bacillus

licheniformis em diluições seriadas e comparadas com as amostras de intestino dos insetos.


41

Tabela 2: Sequência dos oligonucleotídeos utilizados nos ensaios de PCR em tempo Real para quantificação bacteriana no intestino do mosquito

Oligonucleotídeo Sequência 5’-3’ Tm

16S F TCCTACGGGAGGCAGCAGT 59±4 °C

16S R GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT 58±1 °C

Sonda (FAM)CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC(TAMRA) 69±9 °C

Alessandra da Silva Orfanó Resultados

42

4 Resultados

4.1 Crescimento bacteriano diferencial após o plaqueamento dos intestinos Para observar se houve um crescimento diferencial de bactérias cultiváveis como

resultado do efeito dos antibióticos na microbiota intestinal foi feito, o cultivo em meio PCA

do macerado de intestinos.

As placas contendo o macerado de intestinos sem tratamento (figura 7A e 7B)

resultaram em 5,4 x 103 est. UFC/ml (tabela 3). No tratamento com gentamicina (figura 7C e

7D), não houve crescimento de UFCs. Nas placas contendo os intestinos tratados com

espectinomicina (figura 8A e 8B) houve um crescimento de 7 x 10 UFC/ml.

Após o plaqueamento dos intestinos tratados com tetraciclina (figura 7F e 7H) foi

observado um crescimento de 1,5 x 102 UFC/ml, enquanto no tratamento com carbenicilina

(figura 8E e 8F) observou-se uma média de 6,2 x 102 UFC/ml,) e no tratamento com

canamicina o crescimento bacteriano foi de 2,9 x 102 UFC/ml.

Tabela 3: Estimativa das UFCs do intestino de A. aegypti antes e após o tratamento com antibióticos.

Amostras Quantidade bacteriana (UFC/ml)

Sem tratamento 5,4 x 103 est

Tetraciclina 1,5 x 102

Gentamicina Sem crescimento

Espectinomicina 7 x 10

Carbenicilina 6,2 x 102

Canamicina 2,9 x 102

A

A

A


43

Figura 7: Crescimento bacteriano após a incubação do macerado de intestinos. (A) Crescimento de bactérias no intestino não tratado concentrado. (B) Crescimento de bactérias no intestino não tratado diluído 10X. (C) Crescimento de bactérias no intestino tratado com gentamicina concentrado. (D) Crescimento de bactérias no intestino tratado com gentamicina diluído 10X. (E) Crescimento de bactérias no intestino não tratado concentrado (1X). (F) Crescimento de bactérias no intestino tratado com tetraciclina concentrado (1X). (G) Crescimento de bactérias no intestino não tratado diluído 10X. (H) Crescimento de bactérias no intestino tratado com tetraciclina diluído 10X.


44

Figura 8: Crescimento bacteriano após a incubação do macerado de intestinos. (A) Crescimento de bactérias no intestino tratado com espectinomicina concentrado (1X). (B) Crescimento de bactérias no intestino tratado com espectinomicina diluído 10X. (C) Crescimento de bactérias no intestino tratado com carbenicilina concentrado (1X). (D) Crescimento de bactérias no intestino tratado com carbenicilina diluído 10X. (E) Crescimento de bactérias no intestino tratado com canamicina concentrado (1X). (F) Crescimento de bactérias no intestino tratado com canamicina diluído 10X.

F


45

4.2 Isolamento e identificação das bactérias presentes no intestino de A. aegypti

Com o intuito de identificar as bactérias presentes na flora intestinal do A. aegypti,

bactérias dos intestinos sem tratamento e tratados com carbenicilina e canamicina foram

isoladas de acordo com as características da colônia, tais como cor, forma, formato da

margem.

Foram obtidos 13 isolados utilizando a técnica de semeadura por estrias. Desses, 7

isolados foram dos insetos não tratados, 4 isolados após o tratamento com carbenicilina e 2

após o tratamento com canamicina.

Para a identificação das espécies presentes nos isolados bacterianos, o DNA genômico

foi extraído e o gene 16S DNAr foi amplificado por PCR. Na figura 9 observa-se o gel com a

amplificação de 1500 pb correspondente ao gene 16S DNAr presente nos isolados.

Figura 9: Visualização da banda de 1500pb do gene 16S DNAr dos isolados bacterianos do intestino de A. aegypti.

Após a confirmação da banda correspondente ao gene 16S, o produto de PCR foi

purificado e enviado para a plataforma de sequenciamento. As sequências obtidas na

plataforma foram comparadas às sequências do banco de dados do GenBank utilizando a

ferramenta BLASTn.

Dos 13 isolados foi possível encontrar similaridade para 11 sequências. Uma

sequência apresentou similaridade com uma bactéria não cultivável e uma outra não

apresentou similaridade com as sequências do banco de dados utilizado. Na tabela 4 pode ser

observada a porcentagem de similaridade dos isolados com as sequências do GenBank.

Os isolados provenientes da microbiota de insetos SF-Ctr apresentaram filos como

Firmicutes (15%), Bacterioidetes (28%) e Proteobactéria (57%) (figura 10). Nos isolados

desse grupo foram identificadas 3 espécies de Asaia sendo elas: Asaia bogorensis, Asaia

krungthepensis e Asaia siamensis.


46

Os isolados bacterianos oriundos de insetos CBSF observa-se a presença de espécies

do filo Bacterioidetes (65%), e também identificado espécies de Actinobacterias (35%)

(figura 10).

Nos isolados do KNSF foi identificado somente Microbacterium lacticum um

representante do filo Actinobacteria (figura 10).

Figura 10: Porcentagem dos isolados bacterianos classificados em filos.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Sem tratamento Trat. Carbenicilina Trat. Canamicina

Actinobacteria

Firmicutes

Bacterioidetes

Proteobactéria


47

Tabela 4: Identificação dos isolados bacterianos de acordo com o banco de dados GenBank.

Tratamento Isolado Espécie próxima Max identidade Valor de E Nº genbank

1 Asaia siamensis 95% 2e-171 AB682005.

1

2 Chryseobacterium meningosepticum

95% 3e-171 FJ608002.1

Sem

tratamento

3

Asaia bogorensis 94% R 0.0

AB681076.1

4 Asaia krungthepensis 94% 0.0 AB681142.

1

5 Asaia siamensis 95% AB682005.

1

6 Bacillus

licheniformis 92% 0.0

HM753625.1

7 Chryseobacterium meningosepticum

93% 0.0 HQ154560.

1

8 Uncultured bacterium

83% GU647071.

1

Tratamento com

Carbenicilina 9

Chryseobacterium meningosepticum

92% 0.0 HQ154560.

1

10 Uncultured

Microbacteriaceae bacterium

83% 3e-10 JN865459.1

Tratamento com

Canamicina

11 Sem similaridade

12 Microbacterium

lacticum 84% 8e-71

EU573788.1

Sem tratamento

13

Chryseobacterium meningosepticum

95% 0.0

AF207071.1


48

4.3 Efeito do tratamento com antibióticos na infecção por P. gallinaceum

Foi avaliado o impacto da microbiota natural do mosquito na capacidade do P.

gallinaceum em estabelecer a infecção quando as bactérias foram removidas utilizando-se o

tratamento com antibióticos. Os ensaios foram realizados sete dias após a alimentação em ave

infectada, que permitiu determinar a porcentagem de infecção e o número de oocistos de cada

intestino. Os gráficos mostram a mediana com intervalo interquartil (percentis de 25 e 75). O

tratamento com gentamicina reduziu a presença de bactérias no intestino do inseto (figura 7C

e 7D), com um número médio de oocistos foi de 72±10 e e mediana de 58, 77±10 com

mediana 68 para o grupo controle e para o tratado com gentamicina respectivamente (figura

11) não apresentando diferenças significativas (p> 0,05) quando submetido ao teste Mann

Whitney.

Resultados semelhantes a esses podem ser observados quando os insetos foram

tratados com espectinomicina (figura 12) e tetraciclina (figura 13).

O número médio de oocistos no tratamento com espectinomicina foi 26±2,6 com

mediana 23 e para o grupo controle 32±4,4 com mediana 29 (figura 12) sem diferenças

significativas (p> 0,05).

Insetos tratados com tetraciclina apresentaram um número médio de 31±3 oocistos,

mediana 29,5 enquanto o grupo controle apresentou uma média de 45±7 oocistos e mediana

33,5, com um p=0,4375, ou seja, sem diferenças significativas (figura 13) quando avaliado

pelo teste estatístico.


49

Figura 11: Efeito do tratamento com gentamicina na infecção do A. aegypti por P. gallinaceum. Cada ponto representa a quantidade de oocistos por intestino do mosquito.

Figura 12: Efeito do tratamento com espectinomicina na infecção do A. aegypti por P. gallinaceum. Cada ponto representa a quantidade de oocistos por intestino do mosquito.


50

Figura 13: Efeito do tratamento com tetraciclina na infecção do A. aegypti por P. gallinaceum. Cada ponto representa a quantidade de oocistos por intestino do mosquito.

No tratamento com canamicina a média do número de oocistos foi de 39 ±3,8 e

mediana 42, enquanto o grupo controle resultou em uma média de 73±4,3 oocistos com

mediana 72,5 (figura 14). Essa redução se mostrou significativa quando submetido ao teste

estatístico Mann Whitiney (p<0,0001)

Quando os insetos receberam carbenicilina na dieta, o número médio de oocistos foi

de 79,10 ± 5,4, mediana 47, enquanto o grupo controle apresentou 43 ±4,6 (figura 15) e

mediana 28, essa diferença apresentou significância estatística (p<0,0001).

Quando uma mistura contendo os dois antibióticos que alteraram o número médio de

oocistos (carbenicilina/canamicina) foi adicionada à solução de açúcar não foi observada

diferença significativa (p>0,05) entre a média de oocistos de 41±4 e mediana 44 para o grupo

não tratado e 45,2 ±4,3 com mediana 41,5 para o grupo tratado (figura 16).


51

Figura 14: Efeito do tratamento com canamicina na infecção do A. aegypti por P. gallinaceum. Cada ponto representa a quantidade de oocistos por intestino do mosquito. (*** = P<0,0001).

Figura 15: Efeito do tratamento com carbenicilina na infecção do A. aegypti por P. gallinaceum. Cada ponto representa a quantidade de oocistos por intestino do mosquito. (*** = P<0,0001).


52

Figura 16: Efeito do tratamento com mistura de carbenicilina e canamicina na infecção do A. aegypti por P. gallinaceum. Cada ponto representa a quantidade de oocistos por intestino do mosquito.


53

4.4 Quantificação do DNA bacteriano Total Para verificar a quantidade total de bactérias, tanto cultiváveis quanto não cultiváveis,

no intestino após os tratamentos com os antibióticos carbenicilina e canamicina (os que

alteraram a infecção), os DNAs foram extraídos e quantificados por q-PCR utilizando uma

sonda específica para a região conservada do gene ribossomal 16S.

A figura 17 mostra que CBSF apresentaram uma quantidade média de DNA

bacteriano no intestino de 0,007 µg/µl, apresentando diferença significativa comparada ao

controle (p> 0,05). Os intestinos dos insetos KNSF um total de 0,024 µg/µl. Os insetos SF-

Ctr continham no intestino uma quantidade média de 0,036 µg/µl.

Quantidade de DNAr 16S no intestino

Sem tratamento Carbenicilina Canamicina0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

* *

Qua

ntid

ade

abso

luta

de

DN

A (µ

g/µl

)

Figura 17: Quantidade total de DNA bacteriano no intestino dos insetos. O teste Mann Whitney foi utilizado (* = P> 0,05).


54

4.5 Análises da expressão dos genes de peptídeos antimicrobianos no A. aegypti

Para investigar a possibilidade de a microbiota endógena atuar na ativação de genes

regulados pela via Toll e Imd, foi comparado o nível de expressão de mRNAs gambicina e

defensina dos CBSF e KNSF, visto que esses antibióticos afetaram significativamente a

infecção dos A. aegypti pelo P. gallinaceum

A análise de expressão desses alvos foram estudadas considerando 3 grupos de insetos:

não alimentado (somente com açúcar), alimentado com sangue normal e com sangue infectado.

As análises foram feitas em diferentes tempos por qPCR como descrito no item 3.19 de Materiais

e Métodos.

Os níveis de mRNA relativos de defensina nos mosquitos CBSF e KNSF (gráfico 9)

foram respectivamente 3,08 e 1,46 vezes maiores que o grupo controle (inseto não tratado) .

Níveis de mRNA de defensina

SF-Ctr KNSF CBSF0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

* *

expr

essã

o re

lativ

a

Figura 18: Níveis de mRNA de defensina em mosquitos inteiros alimentados com açúcar tratados (KNSF, CBSF) e não tratados (SF-Ctr). P= 0,01 quando testado por One- way ANOVA com múltiplas comparações de Tukey.

A expressão dos níveis de defensina também foi quantificada nos insetos alimentados

com sangue e com sangue infectado nos tempos de 0h, 12h, 24h e 36h pós-alimentação. O

tempo 0h corresponde a 30 minutos após a alimentação sanguínea, quando as fêmeas se

encontravam totalmente ingurgitadas.


55

Para avaliar o nível de expressão diferencial de defensina todas as amostras foram

normalizadas considerando a amostra não tratada não alimentada. Pode ser observada nas

figuras 19 e 20 no tempo 0h após alimentação um pico de expressão desse peptídeo no inseto

BF-Ctr, se mostrando 66,73 vezes mais expresso. O inseto BFI apresentou um pico de

expressão 12h pós-infecção, enquanto o inseto KNBFI apresentou maior expressão de

defensina 24h pós-infecção. Os insetos infectados exibiram um perfil de expressão menor

36h pós-alimentação se comparado com os insetos não infectados.


0.5 h 12 h 24 h 36h 0

20

40

60

80

100 Controle infectado (BFI-Ctr)

Canamicina infectado (KNBFI)

***

Amostras

Exp

ress

ão R

elat

iva

Figura 19: Perfil de expressão de defensina em insetos inteiros infectados (BFI-Ctr, KNBFI) em diferentes tempos. Teste 2way Anova com correções de Bonferroni. (***= p< 0,001).


56


0.5 h 12 h 24 h 36h 0

20

40

60

80

100Controle sangue (BF- Ctr)

Canamicina sangue (KNBF)***

Amostras

Exp

ress

ão R

elat

iva

Figura 20: Perfil de expressão de defensina em insetos não infectados (BF-Ctr, KNBF) em diferentes tempos. Teste 2way Anova com correções de Bonferroni. (***= p< 0,001).

O nível de gambicina em insetos KNSF (figura 21) foi 2,49 vezes mais expresso nesse

grupo comparando com o inseto SF-Ctr, enquanto o mosquito CBSF apresentou um nível de

expressão 1,40 vezes menor comparando com SF-Ctr.

Níveis de mRNA de gambicina

SF-Ctr KNSF CBSF0

1

2

3

4

**

*

***

Amostras

Exp

ress

ão R

elat

iva

Figura 21: Níveis de mRNA de gambicina em mosquitos inteiros alimentados com açúcar tratados (KNSF, CBSF) e não tratados(SF-Ctr). Teste One- way ANOVA com múltiplas comparações de Tukey. (* = P<0,05; ** = P< 0,03; *** = P<0,0001).


57

A expressão relativa de gambicina também foi medida em mosquitos alimentados

com sangue e com sangue infectado (figuras 22 e 23).

No tempo de 0h pós-alimentação os níveis de mRNA de gambicina (figuras 22 e

23) em insetos BF-Ctr e BFI-Ctr foram iguais a 1, sem aumento de expressão comparado ao

inseto controle. No inseto KNBFI a expressão de gambicina mostrou-se aumentada 1,6 vezes,

e o inseto KNBF mostrou uma expressão de gambicina 0.6 vezes diminuída.

Doze horas pós-alimentação (figura 22) os resultados mostraram que o nível de

gambicina no inseto BFI-Ctr teve um aumento de 1,6 vezes enquanto o inseto BF-Ctr foi 1,8

vezes maior comparando ao controle( SF-Ctr). Insetos KNBFI (figura 22) tiveram os níveis

de expressão de mRNA 3,1 vezes aumentada enquanto o inseto KNBF (figura 23) não sofreu

aumento nessa expressão.

No tempo de 24h gambicina se mostrou diminuída em insetos BFI-Ctr e KNBF

respectivamente 0,63 e 0,6 vezes. Nesse tempo, houve um aumento desse peptídeo 1,27 e 2,2

vezes respectivamente para os mosquitos KNBFI e BF-Ctr.

Com 36h é observado um pico de gambicina para mosquitos KNBF (7 vezes

maior), um aumento de 2,9 vezes foi observado para o BF-Ctr, enquanto o BFI-Ctr foi 0.1

vezes menor, já os insetos KNBFI sofreram um aumento de 1,6 vezes.


0.5 h 12 h 24 h 36h 0

1

2

3

4Controle infectado (BFI-Ctr)

Canamicina infectado (KNBFI)

***

***

*** ***

Amostras

Exp

ress

ão R

elat

iva

Figura 22: Perfil de expressão gambicina em insetos inteiros infectados (BFI-Ctr, KNBFI) em diferentes tempos. Teste 2way Anova com correções de Bonferroni. (***= p< 0,001).


58


0.5 h 12 h 24 h 36h 0

2

4

6

8

10 Controle sangue (BF-Ctr)

Canamicina sangue (KNBF)

*

*

***

Amostras

Exp

ress

ão R

elat

iva

Figura 23: Perfil de expressão de gambicina em insetos não infectados (BF-Ctr, KNBF) em diferentes tempos. Teste 2way Anova com correções de Bonferroni. (*= P<0,05; ***= p< 0,001).

Com relação ao grupo CBBFI (figura 24), os níveis de expressão de defensina se

mostraram 19,6 vezes mais expresso após 12h, 2,66 vezes maior após 24h e 16,08 vezes

maior após 36h em relação ao SF-Ctr, o BFI-Ctr apresentou expressão de defensina em torno

de 30 vezes maior 24h após a alimentação e 78,3 vezes mais expressão de mRNA desse

peptídeo após 36h.

Insetos BF-Ctr apresentaram uma expressão desse AMP 92,5 vezes maior 12h pós-

alimentação, seguidos por 6,4 vezes e 2,2 vezes maior após 24h e 36h respectivamente

(figura 25).

Os insetos CBBF mostrou níveis de mRNA 8 vezes maior após 12h, 4,57 vezes

maior após 24h e 7,65 mais expressão após 36h (figura 25).


59


0.5 h 12 h 24 h 36h 0

20

40

60

80

100

Controle infectado (BFI-Ctr)

Carbenicilina infectado(CBBFI)

******

***

Amostras

Exp

ress

ão R

elat

iva

Figura 24: Perfil de expressão defensina em insetos inteiros infectados (BFI-Ctr, CBBFI) em diferentes tempos. Teste 2way Anova com correções de Bonferroni. (***= p< 0,001).


0.5 h 12 h 24 h 36h 0

20

40

60

80

100Controle sangue (BF-Ctr)

Carbenicilina sangue (CBBF)

***

Amostras

Exp

ress

ão R

elat

iva

Figura 25: Perfil de expressão de gambicina em insetos não infectados (BF-Ctr, CBBF) em diferentes tempos. Teste 2way Anova com correções de Bonferroni. (***= p< 0,001).

Os níveis de gambicina nos insetos CBBFI foi 0,4 vezes menor no tempo 0h, seguido de 0,7 vezes menor nos tempos de 12h, 24h e 36h (figura 26).

Os insetos BFI-Ctr apresentaram expressão do mRNA de gambicina em torno de

0,4 vezes menor 12h após a alimentação, 0,5 vezes menos expressão de mRNA desse

peptídeo após 24h seguido por 0,4 vezes menos após 36h (figura 26).


60

Insetos BF-Ctr apresentaram uma expressão desse AMP 5,33 vezes maior 12h pós-

alimentação, seguidos por 1,24 vezes maior e 1 vez menor após 24h e 36h respectivamente

(figura 27).

O CBBF apresentou níveis de mRNA 22 vezes maior após 24h, 24,25 vezes maior

após 36h (figura 27).


0.5 h 12 h 24 h 36h 0.0

0.5

1.0

1.5Controle infectado (BFI-Ctr)

Carbenicilina infectado(CBBFI)***

*

*

Amostras

Exp

ress

ão R

elat

iva

Figura 26: Perfil de expressão gambicina em insetos inteiros infectados (BFI-Ctr, CBBFI) em diferentes tempos. Teste 2way Anova com correções de Bonferroni. (*=P<0,05; ***= p< 0,001).


0.5 h 12 h 24 h 36h 0

5

10

15

20

25

30Controle sangue (BF-Ctr)

Carbenicilina sangue (CBBF)

******

*** ***

Amostras

Exp

ress

ão R

elat

iva

Figura 27: Perfil de expressão de gambicina em insetos não infectados (BF-Ctr, CBBF) em diferentes tempos. Teste 2way Anova com correções de Bonferroni. (***= p< 0,001).

Alessandra da Silva Orfanó Discussão

61

5 Discussão

5.1 Isolamento e identificação da microbiota intestinal de A. aegypti

Muitos insetos contêm grandes comunidades de diversos micro-organismos que

provavelmente excedem seu número de células. Em humanos e outros mamíferos a

microbiota intestinal tem um papel vital em um processo chamado “resistência à colônia” que

funciona para prevenir a colonização do intestino por patógenos (Dillon & Dillon, 2004).

A composição da microbiota intestinal do mosquito é muito menos complicada que a

microbiota intestinal de mamíferos, e isso permite estudar a dinâmica do sistema imune do

hospedeiro, microbiota natural e o micro-organismo patogênico.

Nesse estudo, para verificar a relação da microbiota intestinal do A. aegypti e a

infecção pelo P. gallinaceum, esses insetos foram submetidos ao tratamento por cinco

diferentes antibióticos, como descrito no item 3.3 de Materiais e Métodos.

O fornecimento de antibiótico na solução de açúcar diminuiu efetivamente a

quantidade de bactérias do intestino dos mosquitos na presença de todos os antibióticos

utilizados quando comparada a placa dos intestinos dos mosquitos que não foram submetidos

a qualquer um dos tratamentos.

Os antibióticos, espectinomicina, gentamicina e tetraciclina, se mostraram os mais

eficientes na eliminação de bactérias cultiváveis, no entanto, não apresentaram relação no

processo de infecção pelo parasito, apesar de alguns trabalhos observarem efeitos na infecção

utilizando gentamicina ou tetracilina no tratamento de alguns mosquitos (Beier et al., 1994;

Dong et al., 2009).

Visando a importância dessa relação entre bactéria simbionte e o inseto vetor, esse

estudo isolou e identificou a microbiota intestinal de mosquitos A. aegypti antes e após o

tratamento com canamicina e carbenicilina.

Os isolados provenientes de insetos SF-Ctr, como esperado, apresentaram uma maior

diversidade de espécies, englobando filos como Firmicutes, Bacterioidetes e Proteobactéria

(figura 10), sendo o último o mais abundante, com similaridade para 3 espécies de Asaia,

havendo uma predominância de isolados Gram-negativos. Bactérias intestinais tanto de

populações de campo como de laboratório de espécies de mosquitos tem sido identificadas

em muitos estudos, mostrando a presença de muitas espécies Gram-negativas, apesar da


62

identificação de algumas espécies Gram-positivas (Chao & Wistreich, 1959; 1960; Ferguson

et al., 1961; DeMaio et al., 1996; Pumpuni et al., 1996; Gonzalez-Ceron et al., 2003;

Pidiyar et al., 2004; Dong et al., 2009; Gusmão et al., 2010; Chavshin et al., 2011;

Cirimotich et al., 2011; Rani et al., 2011).

Alguns gêneros bacterianos desse estudo também foram relatados em outros estudos.

Bacillus foi observado em A aegypti (Gusmão et al., 2010), em A. gambiae (Lindh et al.,

2005), em larvas de Culex quinquefasciatus (Pidiyar et al., 2002) e de A. stephensi (Rani et

al., 2009). Chryseobacterium foi anteriormente associado ao intestino médio de C.

quinquefasciatus, A. gambiae, A. stephensi (Dong et al., 2009; Rani et al., 2009; Chavshin et

al., 2011).

Interessantemente, quando os insetos receberam o tratamento com carbenicilina

Chryseobacterium meningosepticum se tornou dominante e outras espécies tiveram seu

crescimento limitado, sugerindo que essa bactéria possa ter alguma vantagem competitiva no

intestino do mosquito ou o seu crescimento favorecido pelo meio de cultura utilizado.

Observações semelhantes a essa, utilizando outros antibióticos, foram feitas em A. gambiae

por Dong e colaboradores (2009). Quando tratados com canamicina não foi possível

identificar essa espécie após o plaqueamento.

Três espécies do gênero Asaia foram identificadas nesse trabalho, sendo o filo mais

abundante (proteobacteria). Trabalhos de Pidiyar e colaboradores, (2004), Rani e

colaboradores (2009) e do nosso grupo (Gaio e colaboradores, 2011), mostraram uma alta

porcentagem de bactérias desse filo colonizando o trato digestivo de mosquitos. As

sequências obtidas por nós mostraram 94%, 94% e 95% de similaridade respectivamente para

Asaia bogorensis, Asaia krungthepensis e Asaia siamensis, espécies isoladas de flores

tropicais (Yamada et al., 2000; Katsura et al., 2001; Yukphan et al., 2004). Além do trato

digestivo, estudos demonstraram que espécies desse gênero também são capazes de colonizar

a glândula salivar e ovário de mosquitos e são geralmente adquiridas por transmissão vertical

(Favia et al., 2007).

Sob o tratamento com carbenicilina, houve uma média de 6,2 x 102 UFC/ml e como

dito anteriormente, com uma predominância de C. meningosepticum. Uma espécie Gram-

positiva da família Microbacteriaceae também foi identificada, no entanto não foi possível

encontrar similaridade em nível de gênero. Espécies da família Microbacteriaceae foram

encontradas também em A.stephensi, C. quinquefasciatus, A. gambiae (Pidiyar et al., 2004;

Dong et al., 2009; Chavshin et al., 2011).


63

No tratamento com KNSF a média de UFC/ml foi de 2,9 x 102, a sequência obtida

encontrou semelhança para Microbacterium lacticum, uma espécie Gram-positiva. Além

dessa sequência, uma outra não apresentou similaridade para nenhuma sequência presente no

banco de dados que utilizamos, podendo ser, portanto, uma sequência bacteriana ainda

desconhecida, por isso, faz-se necessário mais experimentos a fim de elucidar essa questão.

A diversidade de bactérias identificadas nesse estudo não foi tão alta como descrito

em outros trabalhos que encontraram gêneros principais como Serratia, Enterobacter,

Klebsiella (Pumpuni et al., 1996; Gonzalez-Ceron et al., 2003; Pidiyar et al., 2004; Dong et

al., 2009; Gusmão et al., 2010; Chavshin et al., 2011), talvez isso tenha ocorrido porque o

isolamento foi feito a partir de mosquitos da terceira geração, seguramente mais homogênea e

não diretamente da população de campo, além disso a utilização de solução de glicose sem

adição de antibióticos porém estéril certamente diminuiu a fonte de contaminação por

bactérias já que é sabido que os mosquitos podem adquiri-las do estágio larval ou podem ou a

partir da alimentação rica em açúcares (Briegel e Kaiser, 1973). Gaio e colaboradores (2011)

mostraram uma menor variabilidade de espécies bacterianas presentes no intestino do A.

aegypti provenientes da cidade de Recife-PE em relação às cidades de Campos dos

Goytacazes-RJ e Manaus-AM.

Sabe-se que a maioria dos microrganismos não são cultiváveis ou são de difícil

cultivo (Vartoukian et al., 2010), Contudo, somente a microbiota cultivável do intestino

médio foi investigada nesse trabalho. E esse estudo, demonstra claramente, tanto nas placas

de cultivo quanto na quantificação total de DNA bacteriano uma diminuição da microbiota

revelando assim, sucesso na metodologia utilizada para diminuir bactérias do intestino do A.

aegypti.

5.2 Análise do impacto da administração de antibióticos na infecção de A. aegypti por P.

gallinaceum

A malária é a mais importante doença causada por vetores no mundo (WHO, 2011). O

controle da transmissão dessa doença é principalmente focado no controle do vetor. Contudo,

as medidas de controle atuais com base em mosquiteiros tratados com inseticidas e “sprays”

residuais não são capazes de interromper a transmissão da malária nas grandes áreas

endêmicas principalmente da África e do Pacífico. Com isso, existe um aumento no interesse

de estudos com finalidade de controle biológico, mas essas abordagens focadas no controle

do vetor ainda são pouco exploradas. (Ferguson et al., 2010).


64

Inseticidas não químicos vêem ganhando a atenção principalmente por causa do

impacto ambiental dos inseticidas químicos e a inevitável resistência a eles (Scholte et al.,

2004a; French-Constant, 2005). Dessa forma, faz-se necessário o desenvolvimento de

alternativas aos inseticidas convencionais (Zaim and Guillet, 2002; Cirimotich et al., 2011a).

Por isso, o uso de micro-organismos é o grande foco como alternativa a tais produtos por

causa da sua toxicidade seletiva e segurança ambiental (Mohanty and Prakash, 2004).

Sabe-se que os mosquitos tem sua própria flora microbiana intestinal. Antigamente,

acreditava-se que os insetos eram vetores passivos e podiam transmitir micro-organismos por

meio de três interações não específicas: carregando no corpo, regurgitando e defecando.

Entretanto, hoje em dia, pesquisadores acreditam que a disseminação de patógenos

por vetores envolve interações específicas entre o hospedeiro e a bactéria.

Dessa forma, acredita-se que a microbiota tem um importante papel na interação

parasito vetor e poderá contribuir para o desenvolvimento de ferramentas seguras de controle

de doenças tropicais, sobretudo a malária.

Estudos vêm mostrando que a microbiota intestinal pode afetar a capacidade do vetor

de várias maneiras. Essa associação com o inseto tem um importante papel na sua fisiologia

como nutrição, digestão, produção de ovos (Dillon & Dillon, 2004; Gusmão et al., 2010;

Gaio et al., 2011b) até mesmo na ativação da imunidade inata (Weiss et al., 2011). Muitas

vezes, a capacidade do vetor em estabelecer a infecção é diminuída (Cirimotich et al., 2011a)

porque o desenvolvimento do parasito é dificultado por essa microbiota (Dong et al., 2009).

Dong e colaboradores (2009) observaram que a microbiota intestinal influencia na

formação de oocistos do Plasmodium. Mosquitos que foram tratados com antibióticos e

posteriormente desafiados com P. falciparum foram mais susceptíveis a essa infecção,

todavia, a reconstituição da flora bacteriana resultou em um nível de infecção semelhante aos

insetos não tratados.

O presente trabalho avaliou a resposta de A. aegypti à infecção por P. gallinaceum

quando esses insetos foram tratados por cinco antibióticos, e dependendo do antibiótico

utilizado os mosquitos responderam positivamente, negativamente ou não apresentaram

diferenças na infecção pelo Plasmodium quando comparados ao grupo controle. Nesta

avaliação foi interessante observar que tanto carbenicilina quanto canamicina atuaram

alterando a infecção no inseto. Canamicina inibiu parcialmente o desenvolvimento

esporogônico do P. gallinaceum, enquanto carbenicilina tornou o inseto significativamente

mais susceptível à infecção. Apesar de ambos os antibióticos serem efetivos contra bactérias

gram-negativas, a carbenicilina também afeta bactérias Gram-positivas. Possivelmente um


65

antibiótico, a canamicina, eliminou certas bactérias e favoreceu o crescimento e colonização

de outras, provavelmente bactérias não cultiváveis. O gráfico 8 mostra que a quantidade total

de bactérias no intestino, apresenta uma maior quantidade de DNA bacteriano nas amostras

tratadas com canamicina em relação às com carbenicilina; porém o contrário é observado

quando são analisadas as placas contendo as bactérias cultiváveis. Relacionando esse

crescimento bacteriano diferencial com a infecção por Plasmodium, conclui-se que insetos

que tiveram carbenicilina adicionados à dieta apresentaram uma quantidade menor de

bactérias, e uma maior suscetibilidade ao parasito. Por outro lado, o grupo tratado com

canamicina teve uma parcial inibição da infecção e observando o gráfico de quantidade total

de bactérias é visto que há um aumento dessa microbiota comparado ao outro tratamento.

Esse fato demonstra que a microbiota intestinal do A. aegypti tem um papel importante no

desenvolvimento do P. gallinaceum. Resultados semelhantes a esses foram relatados quando

A. gambiae e A. stephensi foram tratados com gentamicina e infectados com P. falciparum

(Beier et al., 1994; Dong et al., 2009). Em Culex bitaeniorhynchus o tratamento com

tetraciclina resultou em uma maior suscetibilidade ao vírus da encefalite japonesa (Mourya

et al., 1985) assim como A. aegypti com o vírus dengue após uma combinação de penicilina,

estreptomicina e gentamicina (Xi et al., 2008).

A inibição da esporogonia no intestino dos mosquitos vem sendo observada em

muitos trabalhos devido à ação de bactérias Gram-negativas (Pumpuni et al., 1993; Straif et

al., 1998; Gonzalez-Ceron et al., 2003; Dong et al., 2006; Cirimotich et al., 2011a). Pumpuni

e colaboradores (1993) avaliaram o efeito de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas no

desenvolvimento do P. falciparum no mosquito A. stephensi. Uma parcial ou completa

inibição na formação do oocisto ocorreu quando esses insetos foram co-alimentados com

diferentes concentrações de bactérias Gram-negativas utilizadas, mas esse efeito inibitório

não foi observado com bactérias Gram-positivas.

Estudos vêm discutindo a utilização de espécies do gênero Asaia como

paratransgenese (Favia et al., 2007; Damiani et al., 2008; 2010; Rani et al., 2009; Chavshin

et al., 2011; Djadid et al., 2011), que é a manipulação genética de um micro-organismo

simbionte para controle de doenças transmitidas por vetores. Um candidato à paratransgênese

necessita ter uma relação simbiôntica com o vetor, ser facilmente propagado e possuir

estabilidade para expressar o gene de interesse sem comprometer seu fitness (Riehle et al.,

2007), fazendo assim dessa espécie um forte candidato ao controle de malária. No entanto, no

presente estudo, a relação entre Asaia sp. e Chryseobacterium se mostrou relevante na

resistência/suscetibilidade do A. aegypti ao P. gallinaceum. Asaia e Chryseobacterium estão


66

presentes na microbiota normal desses mosquitos, porém o tratamento com carbenicilina

elimina Asaia, predomina C. meningosepticum e ocorre um aumento da infecção pelo

Plasmodium. Todavia, distintamente, o tratamento com canamicina elimina ambas as

espécies e como consequência ocorre inibição parcial na formação de oocistos. Experimentos

de co-alimentação devem ser feitos para elucidar o possível papel dessas bactérias com a

infecção de A. aegypti por P. gallinaceum.

5.3 Análise do perfil de expressão de AMPs

Patógenos são reconhecidos por receptores de reconhecimento de padrão que ativam

vias de sinalização imune (Toll e Imd) bem caracterizadas em Drosophila. Como resultado

dessa sinalização, ocorre a ativação de um fator de ativação nuclear específico-kB (NF-kB)

que é translocado para o núcleo e induz a transcrição de genes que codificam moléculas

imune efetoras. Dentre essas, os peptídeos antimicrobianos (AMPs) que causam lise ao

micro-organismo alvo são um dos genes mais induzidos após uma infecção (De Gregorio et

al., 2001; Irving et al., 2001).

Este nosso estudo demonstra que o sistema imune responde a uma supressão da

microbiota. Os níveis de defensina se mostraram super-expressos quando os mosquitos foram

submetidos aos tratamentos com antibióticos canamicina e carbenecilina (KNSF e CBSF).

Distintamente, a gambicina se mostrou super-expressa nos mosquitos KNSF e sub-expressa

naqueles CBSF. Estes dados fortemente sugerem que insetos tratados com canamicina

apresentam um sistema imune mais ativo apesar da diminuição da microbiota, e que,

provavelmente, esses dois AMPs apresentam uma especificidade para bactérias Gram-

positivas como demonstrado em Drosophila (Kaneko & Silverman, 2005), visto que este

antibiótico possui espectro de ação para bactérias Gram-negativas. Curiosamente, a taxa de

sobrevivência de A. gambiae que tiveram o gene da defensina silenciado, foi medida após a

injeção com bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. Verificou-se que a sobrevivência

dos mosquitos foi diminuída apenas com a injeção de bactérias Gram-positivas e não se

alterou com as Gram-negativas (Blandin et al., 2002). Considerando os nossos dados e estes

verificados em A. gambiae, será interessante avaliar a expressão e silenciar genes precursores

de ativação da via Toll e Imd nos A. aegypti tratados como os antibióticos que utilizamos para

confirmar tal hipótese.


67

A expressão desses dois AMPs também foi medida quando esses grupos de insetos se

alimentaram com sangue e com sangue infectado.

É sabido que, a alimentação sanguínea fornece nutrientes para a maturação de

ovócitos, para isso, o corpo gorduroso da fêmea ativa a expressão do gene da vitelogenina,

enquanto genes relacionados à imunidade, como defensinas, tendem a ficar sub expressos

para diminuição do gasto energético (Raikhel, 1992; Romans et al., 1995; Hoffmann et

al.,1999; Kokoza et al., 2000). De acordo com a literatura, a expressão de vitelogenina,

principal proteína produzida pelas fêmeas para a maturação dos ovócitos, atinge seu pico em

24h e se mantem até 36h-48h após alimentação sanguínea (Attardo et al., 2006). Trabalhos

de Gaio e colaboradores (2011) demonstraram claramente uma diminuição no número de

ovócitos após a administração de carbenicilina, indicando que bactérias possuem um

importante papel nesse evento. Nossos resultados mostraram que a expressão de defensina e

gambicina no CBBF apresentou um aumento de 24h para 36h, e uma queda nesses tempos no

grupo BF-Ctr corroborando com a literatura (figuras 25 e 27).

Experimentos de Kokoza e colaboradores (2000) produziram um mosquito

transgênico para expressar vitelogenina e defensina simultaneamente, e com isso foi

observado um aumento de expressão de ambos os genes. Esse inseto foi infectado com P.

falciparum e a inibição na produção de oocistos foi observada (Kokoza et al., 2010). Um

trabalho recente utilizando o mesmo princípio de produção de transgênico em A. stephensi, A.

gambiae e A. albimanus, porém ativo para vitelogenina e Rel2 (um importante componente

da via Imd ativadora de AMPs), mostrou resultados semelhantes possuindo atividade anti- P.

falciparum (Dong et al., 2011). Essa abordagem transgênica se mostrou eficiente em três

modelos, indicando que essa via de controle da resposta imune é altamente conservada em

mosquitos, dessa forma, pode ser uma eficiente ferramenta para controle da doença.

Insetos KNBFI aumentam a expressão de defensina 24h e 36h após a alimentação

comparada ao BFI-Ctr, momento em que o oocineto começa a invadir o epitélio intestinal,

diminuindo a infecção. Resultados semelhantes são observados quando A. gambiae se infecta

com P. berghei apresentando um pico de expressão 26h após a infecção em insetos

previamente tratados por antibióticos (Richman et al., 1997).

O CBBFI apresentou níveis de expressão de defensina menores comparada ao

controle infectado 24h e 36h após a alimentação revelando um sistema imune menos ativo o

que provavelmente propiciou uma maior suscetibilidade ao parasito.

Avaliando os níveis de expressão de gambicina do KNBFI pode se concluir que se

mostrou mais ativa que o BFI-Ctr determinando uma inibição parcial do numero de oocistos.


68

Quando se avalia os níveis de gambicina do grupo que apresentou maior

suscetibilidade ao P. gallinaceum (carbenicilina) é observado uma inibição do mRNA

sugerindo assim que a ativação desse peptídeo não ocorre somente pelo parasita e necessita

da ação da microbiota, talvez uma classe específica de bactérias diferente das presentes no

KNSF ou SF-Ctr, pois quando essa expressão é avaliada no inseto BF-Ctr o perfil também

muda.

Estudos feitos por Welburn e colaboradores (1993) mostraram que o simbionte

intestinal da mosca Tsé-tsé, Sodalis glossinidius, produz açúcar que neutraliza a atividade da

lectina anti-tripanossomal no intestino do inseto, aumentando assim o desenvolvimento do

Tripanossoma brucei, mecanismos semelhantes a esse pode estar ocorrendo no modelo

avaliado e interferindo nas vias do sistema imune ativando-as ou inibindo-as, o qual poderia

explicar as flutuações observadas no inseto quando está infectado ou somente alimentado

com sangue

Alessandra da Silva Orfanó Conclusões

69

6 Conclusões

- Todos os antibióticos utilizados eliminaram efetivamente a quantidade de bactérias

cultiváveis do intestino do A. aegypti.

- A variabilidade de espécies de bactéria constante da microbiota intestinal após o tratamento

com carbenicilina e canamicina foi diminuída.

- O tratamento com carbenicilina e canamicina influenciaram na resistência/suscetibilidade

do A. aegypti ao P. gallinaceum.

- Os experimentos de infecção e sequenciamento de DNA bacteriano sugerem que a presença

concomitante de Asaia e C.meningosepticum é importante no estabelecimento da infecção por

P. gallinaceum.

- A expressão de defensina se mostrou maior 24h e 36h pós-infecção e gambicina em todos

os tempos em insetos KNBFI comparado ao grupo SF-Ctr.

- A expressão de defensina se mostrou menor 24h e 36h pós-infecção e gambicina em todos

os tempos em CBBFI comparado ao grupo SF-Ctr.

- A carbenicilina atua na microbiota intestinal do A. aegytpi, e possivelmente causa um

desequilíbrio na ativação das vias de imunidade aumentando os níveis de expressão de

gambicina e defensina nos insetos CBBF.

Alessandra da Silva Orfanó Referências Bibliográficas

70

7 Referências Bibliográficas

Aguilar R, Jedlicka AE, Mintz M, Mahairaki V, Scott AL, Dimopoulos G. Global gene expression analysis of Anopheles gambiae responses to microbial challenge. Insect Biochemistry Molecular Biology, 2005; 35:709-719.

Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. Journal of molecular biology, 1990; 215: 403–410.

Amino R, Thiberge S, Martin B, Celli S, Shorte S, Frischknecht F, et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nature medicine, 2006; 12: 220-4.

Asling B, Dushay MS, Hultmark D. Identification of early genes in the Drosophila immune response by PCR-based differential display: the Attacin A gene and the evolution of attacin-like proteins. Insect Biochemistry Molecular Biology, 1995; 25: 511–518.

Augustine AD, Hall BF, Leitner WW. NIAID workshop on immunity to malaria: addressing immunological challenges. Nature Immunology, 2009; 10: 673-8.

Bahia AC, Kubota MS, Tempone AJ, Araújo HRC, Guedes BAM, Orfanó AS, et al. The JAK-STAT Pathway Controls Plasmodium vivax Load in Early Stages of Anopheles aquasalis Infection. PLoS Neglected Tropical Diseases, 2011; 11:e1317.

Beard CB, Dotson EM, Pennington PM, Eichler S, Cordon-Rosales C, Durvasula RV. Bacterial symbiosis and paratransgenic control of vector-borne Chagas disease. International Journal for Parasitology, 2001; 31: 621-627.

Beckage NE. Insect Immunology. Academic Press/Elsevier. San Diego, CA, 2008.

Beier JC. Malaria parasite development in mosquitoes. Annual Review of Entomology, 1998; 43: 519-543.

Beier MS. Effects of para-aminobenzoic acid, insulin and gentamycin on Plasmodium falciparum development in anopheline mosquitoes (Diptera:Culicidae). Journal of Medical Entomology, 1994; 31:561-565.

Bignell DE. Introduction to symbiosis, 2000; 189–208. In Abe T, Bignell DE, Higashi M, eds, 2000. Termites: Evolution, Sociality, Symbiosis, Ecology. Dordrecht, Neth.: Kluwer.

Billingsley PF, Lehane MJ. Structure and Ultra- structure of the Insect Midgut. London: Chapman & Hall, 1996.

Blandin S, Moita LF, Köcher T, Wilm M, Kafatos FC, Levashina EA. Reverse genetics in the mosquito Anopheles gambiae: targeted disruption of the Defensin gene. EMBO reports, 2002; 9:852–6.

Boman HG. Antibacterial peptides: Key components needed in immunity. Cell, 1991; 2:205-207.

Boulanger N, Lowenberger C, Volf P, Sigutova L, Sabatier L, Beverley SM, et al. Characterization of a Defensin from the Sand Fly Phlebotomus duboscqi Induced by


71

Challenge with Bacteria or the Protozoan Parasite Leishmania major. Infection and. Immunity, 2004; 12: 7140-7146.

Briegel H, Kaiser C. Lifespan of mosquitoes. (Culicidae, Diptera) under laboratory conditions. Gerontologia, 1973; 19: 240-249.

Bulet P, Hetru C, Dimarcq JL, Hoffmann D. Antimicrobial peptides in insects; structure and function. Developmental and comparative immunology, 1999; 23:329-44.

Bulet P, Dimarcq JL, Hetru C, Lagueux M, Charlet M, Hegy G, Van Dorsselaer A, Hoffmann JA. A novel inducible antibacterial peptide of Drosophila carries an O-glycosylated substitution. The Journal of Biological Chemistry, 1993; 268:14893–14897.

Chalk R, Albuquerque CMR, Ham PJ, Townson H. Full sequence and characterization of two insect defensins: Immune peptides from the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the Royal Society of London, Biology, 1995a; 261: 217–221.

Chao J, Wistreich GA. Microorganisms from the midgut of larval and adult Culex quinquefasciatus Say. Journal of Insect Pathology, 1960; 2: 220–224

Chalk R, Townson H, Ham PJ. Brugia pahangi: the effects of cecropins on microfilariae in vitro and in Aedes aegypti. Experimental Parasitology, 1995b; 3: 401- 406.

Chao J, Wistreich GA. Microbial isolations from the midgut of Culex tarsalis Coquillett. Journal of Insect Pathology, 1959; 1: 311–318

Chavshin AR, Oshaghi MA, Vatandoost H, Pourmand MR, Raeisi A, Enayati AA, et al. Identification of bacterial microflora in the midgut of the larvae and adult of wild caught Anopheles stephensi: A step toward finding suitable paratransgenesis candidates. Acta tropica, 2011; 2:129-134.

Christophides G, Zdobnov EM, Barillas-Mury C, Birney E, Blandin S, Blass C, et al. Immunity-related genes and gene families in Anopheles gambiae. Science, 2002; 298: 159–165.

Consoli RAG, B Oliveira, R.L. Principais mosquitos de importância sanitária no Brasil. Editora Fundação Instituto Oswaldo Cruz, 1994. Rio de Janeiro, Brasil.

Corpet F. Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic Acids Research, 1988; 16:10881-90.

Dale C, Welburn SC. The endosymbionts of tsetse flies: manipulating host-parasite interactions. International journal for parasitology, 2001; 31:628–31.

Damiani C, Ricci I, Crotti E, Rossi P, Rizzi A, Scuppa P, et al. Mosquito-bacteria symbiosis: the case of Anopheles gambiae and Asaia. Microbial ecology, 2010 ; 3:644-54.

Damiani C, Ricci I, Crotti E, Rossi P, Rizzi A, Scuppa P, et al. Paternal transmission of symbiotic bacteria in malaria vectors. Current biology , 2008; 23:R1087-8.


72

Deepak G, Ghislaine MDC, Miller LH. Parasite ligand-host receptor interactions during invasion of erytrocytes by Plasmodium merozoites. International Journal for Parasitology, 2004; 34:1413-29.

De Gregorio E, Spellman PT, Rubin GM, Lemaitre B. Genome-wide analysis of the Drosophila immune response by using oligonucleotide microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001; 98:(22).

DeMaio J, Pumpuni CB, Kent M, Beier JC. The midgut bacterial flora of wild Aedes triseriatus, Culex pipiens, and Psophora columbiae mosquitoes. American Journal Tropical Medicine and Hygiene, 1996; 54: 219-223.

Devenport M, Fujioka H, Jacobs-Lorena M. Storage and secretion of the peritrophic matrix protein Ag-Aper1 and trypsin in the midgut of Anopheles gambiae. Insect Molecular Biology, 2004; 13: 349–358.

Dillon RJ, Dillon VM. The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions. Annual Review of Entomology, 2004; 98:71–92.

Dimarcq JL, Hoffmann D, Meister M, Bulet P, Lanot R, Reichhart JM, Hoffmann JA. Characterization and transcriptional profiles of a Drosophila gene encoding an insect defensin. A study in insect immunity. European Journal of Biochemistry, 1994; 221: 201–209.

Dimopoulos G. Microreview Insect immunity and its implication in mosquito – malaria. Cellular Microbiology, 2003; 5: 3–14.

Dimopoulos G, Christophides GK, Meister S, Schultz J, White KP, Barillas-Mury C, Kafatos FC. Genome expression analysis of Anopheles gambiae: Responses to injury, bacterial challenge and malaria infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002; 99: 8814-8819.

Dimopoulos G, Casavant L, Chang S, Scheetz T, Roberts C, Donohue M. et al. Anopheles gambie pilot gene discovery project: Identification of novel mosquito innate immunity genes from ESTs generated from immune competent cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000; 97: 6619–6624.

Dimopoulos G, Seeley D, Wolf A, Kafatos FC. Malaria infection of the mosquito Anopheles gambiae activates immune-responsive genes during critical transition stages of the parasite life cycle, 1998; 21:6115–23.

Dimopoulos G, Richman a, Müller HM, Kafatos FC. Molecular immune responses of the mosquito Anopheles gambiae to bacteria and malaria parasites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1997; 94: 11508-13.

Dinglasan RR, Devenport M, Florens L, Johnson JR, Mchugh CA, Carucci DJ, et al. NIH Public Access. Insect Biochemistry, 2009; 2:125-134.

Djadid ND, Jazayeri H, Raz A, Favia G, Ricci I, Zakeri S. Identification of the Midgut Microbiota of An . stephensi and An . maculipennis for Their Application as a Paratransgenic Tool against Malaria. Flora, 2011; 12:6-12.


73

Dong Y, Manfredini F, Dimopoulos G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. PLoS pathogens, 2009; 5:e1000423.

Eyles DE. Studies on Plasmodium gallinaceum. Characteristics of the infection in the mosquito, Aedes aegypt. American Journal of Hygiene, 1951; 54:101-112.

Favia G, Ricci I, Damiani C, Raddadi N, Crotti E, Marzorati M, et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007; 21: 9047-51.

Feder ME, Blair N, Figueras H. Natural thermal stress and heat-shock protein expression in Drosophila larvae and pupae. Functional Ecology, 1997; 11: 90–100.

Fehlbaum P, Bulet P, Michaut L, Lagueux M, Broekaert WF, Hetru C, Hoffmann JA. Insect immunity. Septic injury of Drosophila induces the synthesis of a potent antifungal peptide with sequence homology to plant antifungal peptides. The Journal of Biological Chemistry, 1994; 269: 33159–33163.

Ferguson HM, Dornhaus A, Beeche A, Borgemeister C, Gottlieb M, Mulla MS, et al. Ecology: a prerequisite for malaria elimination and eradication. PLoS medicine, 2010; 7:8.

Ferguson MJ, Micks DW. Microorganisms associated with mosquitoes: bacteria isolated from adult Culex fratigans Wiedemann. Journal of Insect Pathology, 1961; 3: 112–119.

Ffrench-Constant RH. Something old, something transgenic, or something fungal for mosquito control? Trends in Ecology & Evolution, 2005; 20: 577–579.

Filho BPD, Lemos FJA, Secundino NFC, Pascoa V, Pereira ST, Pimenta PFP. Presence of chitinase and beta-N-acetylglucosaminidase in the Aedes aegypti A chitinolytic system involving peritrophic matrix formation and degradation. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2002; 32:1723-1729.

Foratini OP. Culicidologia Médica. Vol. 2. Edusp. São Paulo, 2002.

Gaio ADO, Gusmão DS, Santos AV, Berbert-Molina MA, Pimenta PFP, Lemos FJA. Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae) (L.). Parasites & vectors, 2011; 4:105.

Gao Y, Hernandez VP, Fallon AM. Immunity proteins from mosquito cell lines include three defensin A isoforms from Aedes aegypti and a defensin D from Aedes albopictus. Insect Molecular Biology, 1999; 8: 311-318.

Garnham PCC. Malaria Parasites and Other Haemospiridia. Blackwell Scientific Publications, Oxford, UK, 1966.

Ghosh A, Edwards MJ, Jacobs-Lorena M. The journey of the malaria parasite in the mosquito: hopes for the new century. Parasitology today, 2000; 5:196-201.

Gonzalez-Ceron L, Santillan F, Rodriguez MH, Mendez D, Hernandez-Avila JE. Bacteria in midguts of field-collected Anopheles albimanus block Plasmodium vivax sporogonic development. Journal of Medical Entomology, 2003; 3:371-4.


74

Graf R, Raikhel AS, Brown MR, Lea AO, Briegel H. Mosquito trypsin: immunocytochemical localization in the midgut of blood-fed Aedes aegypti (L.). Cell and Tissue Research, 1986; 245: 19–27.

Greenwood BM, Fidock DA, Kyle DE, Kappe SH, Alonso PL, Collins FH, Duffy PE. Malaria: progress, perils, and prospects for eradication. The Journal of Clinical Investigation, 2008; 4:1266-1276.

Gueirard P, Tavares J, Thiberge S, Bernex F, Ishino, T, Milon G. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America, 2010; 107: 18640–18645.

Gupta L, Kumar S, Han YS, Pimenta PFP, Barillas-Mury C. Midgut epithelial responses of different mosquito-Plasmodium combinations: the actin cone zipper repair mechanism in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005; 11:4010-5.

Gusmão DS, Santos AV, Marini DC, Bacci M, Berbert-Molina M a, Lemos FJ a. Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut. Acta tropica, 2010; 3: 275–81.

Hillyer JF, Barreau C, Vernick KD. Efficiency of salivary gland invasion by malaria sporozoites is controlled by rapid sporozoite destruction in the mosquito haemocoel. International journal for parasitology, 2007; 6: 673-81.

Hoffmann JA, Hetru C, Reichhart JM. The humoral antibacterial response of Drosophila FEBS Letters, 1993; 325: 63-66.

Hoffmann JA, Hetru C. Insect defensins: inducible antibacterial peptides. Immunology Today, 1992; 10: 411-5.

Horton J, Ratcliffe NA, 2001 Evolution of Immunity In I. Roitt J, Brostoff, D Male, Immunology 6th ed. Toronto, ON: Mosby.

Ichimori K. Susceptibility of Anopheles stephensi and other Anopheles strains to Plasmodium yoelii negeriensis. Japanese Journal of Parasitology, 1989; 38: 150–151.

Irving P, Troxler L, Heuer TS, Belvin M, Kopczynski C, Reichhart JM, et al. A genome-wide analysis of immune responses in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001; 98: 15119–15124.

Jobling B. Anatomical drawing of biting flies. London: British Museum (Natural History) and the Wellcome Trust Publisher, 1987; 119p.

Kaneko T, Silverman N. Bacterial recognition and signalling by the Drosophila IMD pathway. Cellular microbiology, 2005; 4:461-9.

Kaplan RA, Zwiers SH, Yan G. Plasmodium gallinaceum: ookinete formation and proteolytic enzyme dynamics in highly refractory Aedes aegypti populations. Experimental Parasitology, 2001; 98: 115–122.


75

Katsura K, Kawasaki H, Potacharoen W, Saono S, Seki T, Yamada Y, et al. Asaia siamensis sp. nov., an acetic acid bacterium in the alpha-proteobacteria. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 2001; 51:559-63.

Korochkina S, Barreau C, Pradel G, Jeffery E, Li J, Natarajan R, Shabanowitz J, Hunt D, Frevert U, Vernick KD. A mosquito- specific protein family includes a candidate receptor for malaria sporozoite invasion of salivary glands. Cellular Microbiology, 2006; 8:163–175.

Krotoski WA, Collins WE, Bray RS. Demonstration of hypnozoites in sporozoite-transmitted Plasmodium vivax infection. The American journal of tropical medicine and hygiene, 1982; 6: 1291–3.

Kumar S, Molina-Cruz A, Gupta L, Rodrigues J, Barillas-Mury C. A peroxidase/dual oxidase system modulates midgut epithelial immunity in Anopheles gambiae. Science (New York, N.Y.), 2010; 5973:1644-8.

Kumar S, Gupta L, Han YS, Barillas-Mury C. Inducible peroxidases mediate nitration of anopheles midgut cells undergoing apoptosis in response to Plasmodium invasion. The Journal of biological chemistry, 2004; 51:53475-82.

Kylsten P, Samakovlis C, Hultmark D. The cecropin locus in Drosophila; a compact gene cluster involved in the response to infection. European Journal of Biochemistry, 1990; 9: 217–224.

Lamberty M, Ades S, Uttenweiler-Joseph S, Brookhart G, Bushey D, Hoffmann JA, et al.. Insect immunity: Isolation from the lepidopteran Heliothis virescens of a novel insect defensin with potent antifungal activity. Insect Immunity Biochemistry, 1999; 14: 9320 6.

Lehane MJ, Aksoy S, Gibson W, Kerhornou a, Berriman M, Hamilton J, et al. Adult midgut expressed sequence tags from the tsetse fly Glossina morsitans morsitans and expression analysis of putative immune response genes. Genome biology, 2003; 10: R63.

Levashina EA, Ohresser S, Bulet P, Reichhart JM, Hetru C, Hoffmann JA. Metchnikowin, a Novel Immune-Inducible Proline-Rich Peptide from Drosophila with Antibacterial and Antifungal Properties. European Journal of Biochemistry, 1995; 233: 694–700.

Levashina EA. Immune responses in Anopheles gambiae. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2004; 7: 673-678.

Lindh JM, Terenius O, Faye I. 16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts. Appl. Environ. Microbiol, 2005; 71:7217-7223.

Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 2001; 25: 402–408.

Lowenberger CA, Kamal S, Chiles J, Paskewitz S, Bulet P, Hoffmann JA, et al. Mosquito-Plasmodium interactions in response to immune activation of the vector. Experimental Parasitology, 1999; 1:59-69.


76

Lowenberger C, Bulet P, Charlet M, Hetru C, Hodgeman B,, Christensen BM, Hoffmann JA. Insect immunity: Isolation of three novel inducible antibacterial defensins from the vector mosquito, Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 1995; 7: 867-873.

Luckhart S, Vodovotz Y, Cui L, Rosenberg R. The mosquito Anopheles stephensi limits malaria parasite development with inducible synthesis of nitric oxide. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1998; 10: 5700-5.

Lumsden WHR, Bertram DS. Observations on the biology of Plasmodium gallinaceum Brumpt, 1935, in the domestic fowl, with special reference to the production of gametocytes and their development in Aedes aegypti (L.). Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 1940; 34: 135

Meis JFGM, Verhave JP. Exoerythrocytic development of malaria parasites. Advances in Parasitology, 1988; 27: 1– 61.

Meister S, Agianian B, Turlure F, Relógio A, Morlais I, Kafatos FC, et al. Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites. PLoS pathogens, 2009; 8: e1000542.

Meister MB Lemaitre, JA Hoffmann. Antimicrobial peptide defense in Drosophila. BioEssays news and reviews in molecular cellular and developmental biology, 1997; 11: 1019-1026.

Michel K, Kafatos FC. Mosquito immunity against Plasmodium. Insect Biochemistry Molecular Biology, 2005; 35: 677–689

Miller LH, Baruch DI, Marsh K, Doumbo OK. The pathogenic basis of malaria. Nature, 2002; 415: 673-679.

Ministério da Saúde, 2011. Situação Epidemiológica da Malária no Brasil. Secretaria de Vigilância em Saúde. Diretoria Técnica de Gestão. Disponível em: http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/situacao_da_malaria_site_svs_28_12.pdf. Acesso em 05 out 2011.

Mohanty SS, Prakash S. Extracellular metabolites of Trichophyton ajelloi against Anopheles stephensi and Culex quinquefasciatus larvae. Current Science, 2004; 86: 323–325.

Molina-Cruz A, DeJong RJ, Charles B, Gupta L, Kumar S, Jaramillo-Gutierrez G, et al. Reactive oxygen species modulate Anopheles gambiae immunity against bacteria and Plasmodium. The Journal of biological chemistry, 2007; 6: 3217–23.

Mourya DT, Soman RS. Effect of gregarine parasite, Ascogregarina culicis & tetracycline on the susceptibility of Culex bitaeniorhynchus to JE virus. The Indian Journal of Medical Research, 1985; 81: 247–250.

Neves DP. et. al. Parasitologia Humana, 2000 10.ed. São Paulo: Atheneu.

Nguu EK, Osir EO, Imbuga MO, Olembo NK.The effect of host blood in the in vitro transformation of bloodstream trypanosomes by tsetse midgut homogenates.Medical and Veterinary Entomology, 1996; 4: 317-22.


77

Osta MA, Christophides GK, Vlachou D, Kafatos FC. Innate immunity in the malaria vector Anopheles gambiae: comparative and functional genomics. The Journal of experimental biology, 2004; 15: 2551-63.

Pidiyar VJ, Jangid K, Patole MS, Shouche YS. Studies on cultured and uncultured microbiota of wild Culex quinquefasciatus mosquito midgut based on 16s ribosomal RNA gene analysis. The American journal of tropical medicine and hygiene, 2004; 6: 597–603.

Pimenta PFP, Modi GB, Pereira ST, Shahabuddin M, Sacks DL. A novel role for the peritrophic matrix in protecting Leishmania from the hydrolytic activiites of the sand fly midgut. Parasitology, 1997; 115: 359–369.

Pimenta PF, Touray M, Miller L. The journey of malaria sporozoites in the mosquito salivary gland. The Journal of Eukaryotic Microbiology, 1994; 41: 608 -624.

Polz MF, Cavanaugh CM. Bias in template-to-product ratios in multitemplate PCR. Applied and Environmental Microbiology, 1998; 64: 3724-3730.

Pumpuni CB, Beier MS, Nataro JP, Guers LD, Davis JR. Plasmodium falciparum: inhibition of sporogonic development in Anopheles stephensi by gram-negative bacteria. Experimental Parasitology, 1993; 77: 195.

Pumpuni CB, DeMaio J, Kent M, Davis JR, Beber JC. Bacterial population dynamics in three anopheline species: the impact on Plasmodium sporogonic development. The American journal of tropical medicine and hygiene, 1996; 54: 214-218.

Rani A, Sharma A, Adak T, Bhatnagar RK. Pseudoxanthomonas icgebensis sp. nov., isolated from the midgut of Anopheles stephensi field-collected larvae. Journal of microbiology Seoul Korea, 2010; 5: 601-606.

Rani A, Sharma A, Rajagopal R, Adak T, Bhatnagar RK. Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector. BMC microbiology, 2009; 9:96.

Ratcliffe NA, Whitten MMA. Vector immunity. In: Gillespie, S.H., Smith, G.L., Osbourn, A. (Eds.), Microbe-vector Interactions in Vector-borne Diseases. Cambridge University Press, Cambridge, 2004; 199–262.

Richman AM, Dimopoulos G, Seeley D, Kafatos FC. Plasmodium activates the innate immune response of Anopheles gambiae mosquitoes. The EMBO journal, 1997; 20: 6114-9.

Richman AM, Bulet P, Hetru C, Barillas-Mury C, Hoffmann JA, Kafatos FC. Inducible immune factors of the vector mosquito Anopheles gambiae: biochemical purification of a defensin antibacterial peptide and molecular cloning of preprodefensin cDNA. Insect Molecular Biology, 1996; 5: 203–210.

Richman AM, Kafatos FC. Immunity to eukaryotic parasites in vector insects. Current Opinions in Immunology, 1995; 8: 14– 19.


78

Riehle MA, Moreira CK. Lampe D, Lauzon C, Jacobs-Lorena M. Using bacteria to express and display anti-Plasmodium molecules in the mosquito midgut. International Journal For Parasitology, 2007; 37: 595–603.

Schlein Y, Polacheck I, Yuval B. Mycoses, bacterial infections and antibacterial activity in sandflies (Psychodidae) and their possible role in the transmission of leishmaniasis. Parasitology, 1985; 90: 57-66.

Scholte EJ, Knols BG, Samson, R.A., Takken, W. Entomopathogenic fungi for mosquito control: a review. Journal Insect Science, 2004ª; 4: 19.

Secundino NFC, Eger-Mangrich I, Braga EM, Santoro MM, Pimenta, PFP. Lutzomyia longipalpis Peritrophic matrix: formation, structure and chemical composition. Journal of Medical Entomology, 2005; 42: 928-38.

Sherman IW. Carbohydrate metabolism of asexual stages. In Malaria: parasite biology, pathogenesis and protection (ed. I. W. Sherman), 1998a; 135–143. Washington, DC: ASM Press.

Shahabuddin M, Pimenta, PFP. Plasmodium gallinaceum preferentially invades vesicular ATPase-expressing cells in Aedes aegypti midgut. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America, 1998; 95: 3385–3389.

Shahabuddin M, Toyoshima T, Aikawa M, Kaslow DC. Transmission-blocking activity of a chitinase inhibitor and activation of malarial parasite chitinase by mosquito protease. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America, 1993; 90: 4266– 4270.

Shao L, Devenport M, Jacobs-Lorena M. The peritrophic matrix of hematophagous insects. Archives of insect biochemistry and physiology, 2001; 2:1 19-25.

Sinden RE. Plasmodium differentiation in the mosquito. Parassitologia, 1999; 41: 139–148.

Sinden RE, Billingsley PF. Plasmodium invasion of mosquito cells: Hawk or dove? Trends in Parasitology, 2001; 17: 209-211.

Sinnis P, Coppi A. A long and winding road: The Plasmodium sporozoite's journey in the mammalian host Parasitology International, 2007; 3: 171-178.

Smith DC, Douglas AE. The Biology of Symbiosis. London: Arnold, 1987; 302 pp.

Soderhall K, Cerenius L. Role of the prophenoloxidase-activating system in invertebrate immunity. Current Opinion in Immunology, 1998; 10: 23-28.

Straif SC, Mbogo CN, Toure AM, Walker ED, Kaufman M, Toure YT, Beier JC. Midgut bacteria in Anopheles gambiae and An. funestus (Diptera: Culicidae) from Kenya and Mali. Journal of Medical Entomology, 1998; 35: 222–226.

Sturm A, Amino R, Van de Sand C, Regen T, Retzlaff S, Rennenberg A, et al. Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids. Science (New York, N.Y.), 2006; 5791: 1287-90.


79

Su X, Hayton K, Wellems TE.Genetic linkage and association analyses for trait mapping in Plasmodium falciparum. Nat Rev Genet, 2007; 7: 497-506.

Telang A, Li Y, Noriega FG, Brown MR. Effects of larval nutrition on the endocrinology of mosquito egg development. The Journal of experimental biology, 2006; 209: 645–55.

Theopold U, Li D, Fabbri M, Scherfer C, Schmidt O. The coagulation of insect hemolymph. Cell and Molecular Life Sciences, 2002; 59: 363–372.

Tolle MA. Mosquito-borne Diseases. Current Problems in Pediatric and Adolescent. Health Care, 2009; 39: 97-140.

Tsai YL, Hayward RE, Langer RC, Fidock D a, Vinetz JM. Disruption of Plasmodium falciparum chitinase markedly impairs parasite invasion of mosquito midgut. Infection and immunity, 2001; 6: 4048–54.

Tzou P, Ohresser S, Ferrandon D, Capovilla M, Reichhart JM, Lemaitre B, Hoffmann JA, Imler JL. Tissue-specific inducible expression of antimicrobial peptide genes in Drosophila surface epithelia. Immunity, 2000; 13: 737–748.

Vartoukian SR, Palmer RM, Wade WG. Strategies for culture of “unculturable” bacteria. FEMS microbiology letters, 2010; 30: 1–7.

Vizioli J, Catteruccia F, Della Torre A, Reckmann I, Muller HM. Blood digestion in the malaria mosquito Anopheles gambiae: molecular cloning and biochemical characterization of two inducible chymotrypsins. European Journal of Biochemistry, 2001; 268: 4027.

Weiss B, Aksoy S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in parasitology, 2011; 20: 1–9.

Welburn SC, Maudlin I. Tsetse–trypanosome interactions: rites of passage. Parasitology Today, 1999; 15: 399–403.

Welburn SC, Arnold K, Maudlin I, Gooday GW. Rickettsia-like organisms and chitinase production in relation to transmission of trypanosomes by tsetse flies. Parasitology, 1993; 107: 141-145.

Wells TN, Burrows JN, Baird JK. Targeting the hypnozoite reservoir of Plasmodium vivax: the hidden obstacle to malaria elimination. Trends in Parasitology, 2010; 3: 145-51.

Wicker C, Reichhart JM, Hoffmann D, Hultmark D, Samakovlis C, Hoffmann JA. Insect immunity. Characterization of a Drosophila cDNA encoding a novel member of the diptericin family of immune peptides. The Journal of. Biological Chemistry, 1990; 265: 22493–22498.

Wilkins S, Billingsley PF. Oligosaccharides on midgut micro- villar glycoproteins of the mosquito, Anopheles stephensi Liston. Insect Biochemistry Molecular Biology, 2001; 31: 937–948.

World Health Organization, 2011; Malaria. Fat sheet Nº 94 April, 2010. World Health Organization, Geneva


80

Xi Z, Ramirez JL, Dimopoulos G. The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection. PLoS pathogens, 2008; 7: e1000098.

Yamada Y, Katsura K, Kawasaki H, Widyastuti Y, Saono S, Seki T, et al. Asaia bogorensis gen . nov ., sp . nov ., an α-Proteobacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2000; 823–9.

Yukphan P. Asaia krungthepensis sp. nov., an acetic acid bacterium in the -Proteobacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2004; 2: 313-316.

Zaim M, Guillet P. Alternative insecticides: an urgent need. Trends in Parasitology, 2002; 18: 161–163.

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