UNIVERSIDAD NACIONAL ´´HERMILIO VALDIZAN´´

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

INTEGRANTES: ESPINOZA ACUÑA, Niel Haile. ESPINOZA GARGATE, Yunior

Moises. ESPINOZA REYES, Denis Hilda. ESPINOZA VILCA, Nicol Teysy. ESTACIO ROJAS, Julinho Angel. FERNANDEZ ALLPAS, Yesica Sly. GARAY MEDRANO, Kevin Gerardo. GARCÍA AGUIRRE, Ricardo.

TÉCNICAS D

E

GENÉTICA

MOLECULAR

¿QUE SON LAS TÈCNICAS DE GENÈTICA MOLECULAR?

Las técnicas de genética molecular son aquellas técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza para estudiar una proteína y para ver cual es su función ,donde se ubica y cual es su estructura.

Ingeniería Genética

TÉCNICAS DE GENÉTICA MOLECULAR

PERMITE EL NACIMIENTO DE

¿ PARA QUE SIRVEN LAS TÉCNICAS DE GENÉTICA MOLECULAR ?

Sirve para las diversas aplicaciones generalmente :

a)Para el diagnóstico de enfermedades hereditarias.b)Búsqueda de alelos más o menos frecuentes asociados a una característica que nos interesa seleccionar.c) Diagnóstico de contaminación bacteriana en alimentos.

d)Diagnóstico viral o de infección viral.

e) Selección de marcadores moleculares para asistir en el mejoramiento genético de una especie.

f)Test de paternidad.

g) Diagnóstico de identidad forense

HERRAMIENTAS UTILIZADAS PARA EL ESTUDIO DE UNA PROTEÍNA

Básicamente empleamos 3 herramientas:

A) Gen que codifica la proteína.

B)Línea celular u organismo mutante que carezca de las funciones de la

proteína .

C) Fuente de proteína purificada

Objetivo:Inferir la función de la proteína normal.

Objetivo:Producir grandes

cantidades de proteína y el diseño de sondas.

ESTRATEGIAS UTILIZADAS PARA OBTENER ESTAS HERRAMIENTAS:

GENÉTICA CLASICA:

ORGANISMO MUTANTE GEN CLONADO PROTEÍNA

Screening Genético

Diseñar sondas

Inactivar al gen

Aislar gen determinado

GENÉTICA CLÁSICA

GENÉTICA INVERSA

GENÉTICA INVERSA:

TÉRMINOS GENÉTICOS BÁSICOS

ALELOS

GENOTIPO

FENOTIPO

MUTÁGENO

GENOTECA

MUTAGÉNESIS

CÉLULAS HAPLIODES

CÉLULAS DIPLIODES

SCREENING GENÉTICO

ALELOS

GENOTIPO

FENOTIPO

ALELOS

Diferentes formas o variantes de un

gen

Pueden ser:

ALELOS DOMINANTES ALELOS RECESIVOS

Pueden expresarse fenotípicamente tanto en un organismo heterocigoto como en el homocigoto.

Pueden expresarse fenotípicamente sólo en un grupo

homocigoto.

Es el contenido genético en forma de ADN es decir todos los genes que posee un individuo constituyen su genotipo.

Es la manifestación visible u observable de un individuo. Expresión del fenotipo

GENOTIPO

GENOTIPO FENOTIPO

Se llama así a la producción de  mutación sobre  ADN, clonado o no.

Es un agente que altera o cambia la información genética de un organismo.

Es un colección de clones cada uno de los cuales contiene un vector.

MUTAGÉNESIS

GENOTECA

MUTÁGENO

CÉLULA HAPLIODE CÉLULA DIPIODE

Es aquella que contiene un solo juego de cromosomas o la mitad del número normal de cromosomas, en células diploides.

Son aquellas que poseen la dotación completa de material genético, es decir de cromosomas. A estas células se las suele nombrar con la abreviación 2n.

SCREENING GENÉTICO

Procedimientos utilizados para identificar y aislar

mutantes.Hay que tener en cuenta

TIPO DE ORGANISMO

Haploide

DiploideDominant

eRecesivo

TIPO DE MUTACIÓN

Mutaciones Letales

Mutaciones condicional

esProduce la muerte de los individuos a una edad temprana.

• Mutación Sensible a T°: se inactiva a determinada T°.

• Temperatura permisiva: No se observa fenotipo mutante

Ejm: levadura Saccharomyces cerevisiae

LA SUPRESIÓN GENÉTICA Y LA LETALIDAD SINTÉTICA PUEDEN

REVELAR PROTEÍNAS INTERACTUANTES O REDUNDANTES:

Dos tipos de análisis genéticos Mutaciones letales sintéticas:

Otro fenómeno, denominado letalidad sintética. En este caso, el efecto mortífero de una

mutación es enormemente exacerbado (en lugar de ser suprimido) por una segunda mutación en un

gen relacionado.

Mutaciones supresoras: Se basa en la supresión

genética.

LEVADURA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Hongo unicelular , un tipo de levadura

utilizada en las

industrias panificadora

s, cerveceras y de vinos.

Ciclo de vida:

haploides y diploides.Reproducen por gemaciòn

.En

condiciones muy

determinadas la forma

diploide se reproducen en forma sexual.

Su rápido crecimiento, la dispersión de las células y la facilidad

con que se replican

cultivos y aíslan

mutantes, destaca su sistema de

transformación de ADN.

La ausencia

de patogenici

dad permite su manipulación con las mínimas

precauciones

CLONACIÓ

N

DEL ADN

Permite que los investigadores prepares grandes cantidades de moléculas de DNA idénticas.

CLONACIÓN DE ADN MEDIANTE MÉTODOS DE ADN RECOMBINANTE

El DNA recombinante es simplemente cualquier molécula de DNA compuesta de secuencias derivadas de diferentes fuentesDiversas técnicas , denominadas TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE, se utilizan en la CLONACIÓN DEL ADN

Vector+ fragmento de DNA

DNA recombinante

Replicación del DNA recombinante dentro de

las células huésped

Aislamiento, secuenciación y manipulación

del fragmento de DNA purificado

Procesos para la clonación de un DNA:

CARACTERISTICAS

El objetivo de la clonación es obtener regiones separadas y pequeñas del ADN

Solo se puede clonar moléculas de ADN pequeñas, en cualquiera de los vectores.

En este proceso intervienen dos tipos de enzima: enzimas de restricción y las ADN ligasas

Mediante este proceso se forma moléculas de ADN reconbinante

Cortes de moléculas de ADN en fragmentos pequeños

LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN: Endonucleasas producidas por bacterias. Reconocen secuencias específicas llamadas sitios de restricción, y luego escinden ambas hebras de ADN.

La enzima de

restricción determinada cortará el ADN en

grupos de fragmentos

de restricción

.

ADN LIGASA: Enzima que cataliza la unión de extremo con extremo de fragmentos cortos de DNA, denominados fragmentos de okasaki.

Los fragmentos de DNA tanto con extremos adhesivos como con extremos romos pueden insertarse en vectores de DNA con la ayuda de DNA ligasas. Durante la replicación normal del DNA, la DNA ligasa cataliza la unión (ligación) de extremo con extremo de fragmentos cortos de DNA, denominados fragmentos de Okazaki.

Cortes de moléculas de ADN en fragmentos pequeños

Vectores que se emplean comúnmente para la clonación

LOS PLASMIDOS

LOS BACTERIOFAG

OS

De E. coli son vectores apropiados para la clonación de fragmentos aislados de ADN

Estos vectores permiten una construcción eficiente de grandes y extensas genotecas de DNA.

Los plásmidos como vectores:Los plásmidos son moléculas circulares de DNA bicatenario (dDNA) que están separados del DNA cromosómico de una célula. Estos DNA extracromosómicos, que se encuentran naturalmente en las bacterias y en las células eucariontes inferiores (p. ej., las levaduras), existen en una relación parasitaria y simbólica con sus células huésped. Al igual que el DNA cromosómico de la célula huésped, el DNA plasmídico es duplicado antes de cada división celular. Durante la división celular, se segregan copias del DNA plasmídico a cada célula hija, lo cual asegura la propagación continua del plásmido a través de generaciones sucesivas de la célula huésped.

contienen tres regiones esenciales para la clonación del DNA: un origen de replicación; un marcador que permite la selección, casi siempre un gen de resistencia a fármacos; y una región en la cual se pueden insertar los fragmentos exógenos de DNA. Las enzimas de la célula huésped replican un plásmido comenzando en el origen de replicación (ORI), una secuencia de DNA específica de 50-100 pares de bases. Las enzimas de la

célula huésped replican un plásmido comenzando en el origen de replicación (ORI), una secuencia de DNA específica de 50-100 pares de bases.

Los Bacteriófagos λ como vectores:

Cuando un virión λ infecta una célula de E. coli, puede realizar un ciclo de crecimiento lítico durante el cual el DNA del fago se replica y se ensambla formando una progenie de más de 100 fagos completos, que se liberan al lisarse la célula infectada. Si se coloca una muestra del fago sobre una capa de E. coli que crece en una placa de Petri, cada virión infectará una única célula. Los consiguientes ciclos de crecimiento del fago darán origen a una región visible y clara, denominada placa de lisis, donde las células se han lisado y las partículas del fago se han liberado.

PROCESO DE REPLICACIÓN DEL ADN MEDIANTE EL VECTOR

BACTERIÓFAGO

Un virión consiste en una cabeza que contiene el

genoma de DNA del fago y una cola, que funciona para

infectar las células huésped de E. coli. Los genes A. que codifican las proteínas de la cabeza y la cola, al

igual que diversas proteínas involucradas en la

replicación del DNA del fago y la lisis celular, están agrupadas en regiones

separadas del genoma viral de z50 kb . Sin embargo, la región central del genoma A contiene genes que no son esenciales para la vía lítica, que luego será

insertado en un organismo para su replicación.

FRAGMENTOS CLONADOS DE DNA

OBJETIVOS:Como los DNA clonados se caracterizan adicionalmente y las diversas maneras en que estos pueden ser utilizados.

TÈCNICAS

A. ELECTROFORESIS EN GEL

Es un método que se emplea para separar macromoléculas en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas.

El término electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico.

Muchas macromoléculas biológicas importantes

(por ejemplo, los aminoácidos, los

péptidos, las proteínas, los nucleótidos y los

ácidos nucleicos) poseen grupos ionizables y, a un pH determinado, existen en solución como especies cargadas eléctricamente,

sean cationes (+) o aniones (-). Según la naturaleza de la carga neta, las partículas

cargadas migrarán hacia el cátodo o hacia el

ánodo. En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis.

Representación del proceso de la

ELECTROFORESIS EN GEL

B. SECUENCIACIÓN DE DICHO ÁCIDO NUCLÉICO

Se ha conseguido gracias a enzimas de restricción y a la

posibilidad de obtener numerosas copias de un ácido nucléico por  las  clonación.

 MÈTODO DE LA TERMINACIÒN DE LA CADENA O MÈTODO DIDESOXI

Es el método más usado para la secuenciación es el conocido como técnica de terminación de cadena de Sanger, la cual se ha perfeccionado conociéndose actualmente como la técnica del didesoxi. Se denomina así por ser necesario los didesoxirribonucleótidos que han perdido su grupo alcohol OH del carbono 3'.

Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a secuenciar.Como "cebador" para iniciar la síntesis, se necesita un corto oligonucleótido complementario del extremo de la cadenadesoxinucleótidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP, dCMP. Didesoxinucleótidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de secuenciación.

Cuando al añadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerización en el cebador, pero cesa el incorporarse un didesoxinucleótido porque la ausencia de un hidroxilo 3’ impide el agregado del próximo nucleótido.Deben prepararse cuatro reacciones de secuenciación, cada una con un didesoxi distinto . Los fragmentos resultantes se separan por tamaño mediante electroforesis, se autorradiografían, y la sucesión de bandas de cada una de las cuatro reacciones, comparándolas entre sí,dan la secuencia del ADN.

GENÓMICA

GENÓMICAOrigen:La palabra GENOMICA fue propuesta por Thomas H. Roderick en 1986 para describir la disciplina cuyo objetivo es mapear y secuenciar el genoma.

La genómica es el campo de la genética que intenta comprender el contenido, la organización, la función y la evolución de la información genética contenidos en el genoma completo. Su principal objetivo es estudiar la caracterización molecular de los genomas completos.

Definición:

Existen muchas áreas relacionadas con la genómica que se han ido desarrollando a lo largo de los años, algunas de las más importantes por su potencial tanto económico como social y ambiental son la medicina genómica, la genómica agropecuaria, la genómica forense, la genómica ambiental, la genómica industrial, etc. La Genómica es de gran importancia en la investigación de enfermedades genéticas.

Aplicaciones de la genómica

Estudio de enfermedades genéticas:Las enfermedades genéticas en el ser humano pueden ser de dos tipos: enfermedades mendelianas o enfermedades poligénicas

Aplicaciones de la genómica

Respuesta a fármacos:El medicamento perfecto sería aquel que, siendo efectivo contra una enfermedad, no produjera efectos secundarios.

CAMPOS DE LA GENÓMICAActualmente, el campo de estudio de la genómica es muy amplio, pudiéndose distinguir los siguientes:

GENÓMICA EVOLUTIVA

GENÓMICA ESTRUCTURAL

GENÓMICA FUNCIONAL

GENÓMICA COMPARATIVA

GENÓMICA COMPATUCIONAL

La genómica estructural se ocupa de generar y analizar la secuencia de genes y proteínas.

GENÓMICA ESTRUCTURAL

La genómica funcional es la ciencia que permitirá comprender como funciona el genoma en su conjunto, a través de la expresión controlada de todos y cada uno de sus genes.

GENÓMICA FUNCIONAL.

Compara secuencias de genes y proteínas de diferentes genomas para elucidar las relaciones funcionales y evolutivas.

GENÓMICA COMPARATIVA.

La genómica computacional se encarga del desarrollo de las herramientas computacionales necesarias para el almacenamiento, recuperación y análisis de los datos genómicos: secuencias primarias de genes y proteínas, mapas genómicos de alta resolución, estructuras tridimensionales de proteínas y perfiles de expresión génica. 

GENÓMICA COMPUTACIONAL.

La genómica evolutiva se ocupa del origen y evolución de los genomas.

GENÓMICA EVOLUTIVA

Los genomas que han sido secuenciados han sido muy útiles para la humanidad, pero son una mínima parte del total de genomas existentes. La secuenciación de estos genomas aportará una información muy valiosa para el tratamiento de enfermedades, la agricultura y la biotecnología. Las secuencias genómicas completas de mamíferos ayudarán al entendimiento de la evolución y función del genoma humano. En el futuro, la información sobre la secuencia genómica completa podrá aplicarse en el tratamiento individual de pacientes, incluso en recién nacidos, dando lugar a una medicina más individualizada.

La genómica en el futuro

REACCIÓN

EN

CADENA D

E

LA

POLIMERE

SA

 Bioquímico estadounidense, conocido por la invención de la técnica PCR (Polymerase Chain Reaction) para amplificar regiones de ADN. La técnica introdujo una revolución en la investigación biológica y médica, lo que le llevó a recibir el premio Nobel de Química de 1993.

Kary Banks Mullís

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Es una técnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de ADN específicas.

CONCEPTO DESCUBRIDOR

Kary Banks Mullís

INSTRUMENTO

Termociclador

PASOS

DesnaturalizaciónHibridaciónExtención

FUNDAMENTO E IMPORTANCIA

Se basa en la propiedad de los ADN polimerasas, se emplean

ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para

separar y crear las hebras de ADN recién formadas entre si

FAVORECE

Identificar virus o bacterias Identificar personas (cadáveres)Investigación científica sobre el ADN amplificado

Detección y diagnostico de enfermedades infecciosas

Diagnostico de trastornos hereditarios, identificación de huellas genéticas.

PROCESO DE LA PCR

Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.

INICIO

DESNATURALIZACIÓN

En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95°C) de la muestra la forma más habitual. Otros métodos, raramente empleados en la técnica de la PCR, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización.

DESNATURALIZACIÓN

HIBRIDACIÓN O ALINAMIENTO

A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 60°C durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. EXTENCIÓN O ELONGACIÓN DE LA

CADENA

Actúa la ADN polimerasa. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende del ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C).

HIBRIDACIÓN Y

EXTENCIÓN

ELONGACIÓN FINAL

Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.

CONSERVACIÓN

Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a corto plazo. Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean técnicas de electroforesis.

ELONGACIÓN FINAL

En conclusión se puede resumir los pasos anteriores en solo tres pasos:

1. DESNATURALIZACIÓN

2. HIBRIDACIÓN

3. ELONGACIÓN

Para que el proceso se lleve a cabo en el tubo de reacción debemos encontrar:

ADN objetivo ( el que se quiere amplificar)ADN Polimerasa

Desoxinucleótidos

Primers

TERMOCICLADOR Automatiza la PCR

Permitiendo calentar

Y enfriar los tubos de reacción

controlando la temperatura para

cada etapa

Los tubos usados tienen una pared muy fina que favorece una buena conductividad térmica

•Los 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP)

•2 cebadores,oligonucleotidos

•Iones divalentes

• Iones monovalentes

• Una solución tampón o buffer

• ADN polimerasa• AND molde

• Termociclador

PARA LA

TECNIC

A SE

NECESI

TA

TIPOS DE PCR

PCR ANIDADA

PCR DE EXTENSIÓN SOLAPADA

PCR IN SITU

PCR MULTIPLE

PCR CON TRANSCRIPTASA INVERSA

PCR EN TIEMPO REAL