Cultura de células da granulosa humanas com fenótipo defase folicular: influência do sistema...

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Reprodução & Climatério

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rtigo original

ultura de células da granulosa humanas com fenótipo dease folicular: influência do sistema quimicamente definidoa morfologia, ultraestrutura, secrecão de esteroides

relaxina

lessandra Aparecida Vireque, Jacira Ribeiro Campos, Carolina Oliveira Campos,arcelo Picinin Bernuci, Rui Alberto Ferriani, Ana Carolina Japur de Sá Rosa

Silva e Marcos Felipe Silva de Sá ∗

epartamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo (USP), Ribeirão Preto, SP,rasil

nformações sobre o artigo

istórico do artigo:

ecebido em 19 de novembro

e 2012

ceito em 14 de dezembro de 2012

n-line em xxx

alavras-chave:

élulas da granulosa

istema quimicamente definido

uteinizacão

ltraestrutura

steroides

elaxina

aturacão in vitro

écnicas de reproducão assistida

r e s u m o

Está bem descrito na literatura o padrão de cultivo de células da granulosa (CG) humanas

que perpetua a luteinizacão e simula a fase lútea do ciclo. Nesse sistema, há reducão na

secrecão de estradiol (E2) e aumento na síntese de progesterona (P4) e relaxina (Rln). Objeti-

vamos padronizar um sistema de cultura livre de soro, com o intuito de reverter o processo

de luteinizacão de CG obtidas em ciclos de FIV, pré-luteinizadas pelo hCG, para aplicacão na

maturacão in vitro de folículos ovarianos pré-antrais. Foi feito estudo experimental com GC

obtidas de 10 mulheres em tratamento de reproducão assistida. As CG foram cultivadas em

�-MEM, que continha IGF-I, ITS, androstenediona e PVP-40 (meio quimicamente definido),

ou em TCM-199, que continha FSH/soro. Após 48, 96 e 144 horas, foram avaliadas: morfo-

logia das culturas, concentracões de E2, P4 (quimioluminescência/Immulite) e Rln (Elisa) e

ultraestrutura (microscopia eletrônica). Os dados foram analisados por Anova e regressão

linear com efeitos mistos (SAS versão 9.0). Células cultivadas em �-MEM apresentam capaci-

dade estrogênica e padrão de producão hormonal característico da fase folicular e mantêm

características morfológicas/ultraestruturais semelhantes a células in vivo. No sistema de

cultura padronizado, as CG não completam in vitro o processo de luteinizacão deflagrado

pelo hCG e assumem fenótipo de fase folicular.

© 2012 Sociedade Brasileira de Reproducão Humana. Publicado por Elsevier Editora Ltda.

Todos os direitos reservados.

Como citar este artigo: Vireque AA, et al. Cultura de células da granulosa humanas com fenótipo de fase folicular: influência do sistema quimica-mente definido na morfologia, ultraestrutura, secrecão de esteroides e relaxina. Reprod Clim. 2013. http://dx.doi.org/10.1016/j.recli.2012.12.002

∗ Autor para correspondência.E-mail: [email protected] (M.F.S. Sá).

413-2087/$ – see front matter © 2012 Sociedade Brasileira de Reproducão Humana. Publicado por Elsevier Editora Ltda. Todos os direitos reservados.ttp://dx.doi.org/10.1016/j.recli.2012.12.002

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mailto:[email protected]

dx.doi.org/10.1016/j.recli.2012.12.002

ARTICLE IN PRESSRECLI-2; No. of Pages 14

2 r e p r o d c l i m . 2 0 1 3;x x x(x x):xxx–xxx

Culture of human granulosa cells with follicular phase phenotype:Influence of chemically defined system on morphology, ultrastructure,secretion of steroids and relaxin

Keyword:

Granulosa cells

Chemically defined system

Luteinization

Ultrastructure

Steroids

Relaxin

In vitro maturation

Assisted reproduction

techniques

a b s t r a c t

It is well described in the literature the granulosa cells (GC) culture pattern that perpetu-

ates human luteinizing simulating the luteal phase of the cycle. In this system, there is

a reduction in the secretion of estradiol (E2) and increased synthesis of progesterone (P4)

and relaxin (RLN). We aim to standardize a serum-free culture system, in order to reverse

the luteinization process of GC obtained in IVF cycles, pre-luteinized by hCG, for use in

in vitro maturation of preantral ovarian follicles. An experimental study was conducted

with GC obtained from 10 women undergoing treatment for assisted reproduction. The GC

were cultured in �-MEM containing IGF-I, STI, androstenedione, PVP-40 (chemically defi-

ned medium) or TCM-199 containing FSH/serum. After 48, 96 and 144 h were analyzed:

culturemorphology, concentrations of E2, P4 (Chemioluminescence/IMMULITE) and RLN

(ELISA), and ultrastructure (Electron Microscopy). Data were analyzed by ANOVA and linear

mixed-effects regression (SAS version 9.0). Cells cultured in �-MEM present estrogenic capa-

city and pattern of hormone production characteristic of the follicular phase, maintaining

morphological/ultrastructuralfeatures similar that in vivo cell. In standard culture system,

the CG not completes in vitro luteinization process triggered by hCG, assuming follicular

phasephenotype.

© 2012 Sociedade Brasileira de Reproducão Humana. Published by Elsevier Editora Ltda.

Introducão

As células da granulosa sofrem profundas alteracões morfo-lógicas e funcionais ao longo do desenvolvimento folicular,por causa da complexa dinâmica do folículo, e apresentamdistintos graus de diferenciacão de acordo com a localizacãofolicular, o estágio de crescimento do folículo ovariano e a fasedo ciclo menstrual. Os primeiros eventos de diferenciacão dasCG incluem mobilizacão de colesterol (COL), reorganizacão doComplexo de Golgi, lisossomos, gotas lipídicas e retículo endo-plasmático liso e rugoso,1,2 os quais promovem o transportee o armazenamento intracelular do COL para sua conversão ahormônios esteroides.1 Essas mudancas ultraestruturais sãoacompanhadas pela expressão das enzimas P450 aromatasee P450 scc.3 Os últimos eventos associam-se diretamente aoestabelecimento do processo de esteroidogênese e consistemem mudancas estáveis na estrutura e na forma das CG (formapoliédrica, com baixa razão citoplasma/núcleo), formacãoabundante de juncões do tipo Gap e formacão de cristas trabe-culares dispostas nas mitocôndrias.2,4 Após a ovulacão, as CGdo folículo pré-ovulatório transformam-se em CG luteínicas eoriginam o corpo lúteo. Essas células tornam-se hipertrofia-das, sofrem modificacões ultraestruturais e secretam grandesquantidades de progesterona, típicas da fase lútea do ciclo. AsCG luteínicas apresentam ultraestrutura típica de células este-roidogênicas, com retículo endoplasmático liso abundante,mitocôndrias com cristas tubulares, ribossomos, acúmulo denumerosas gotas lipídicas que contêm ésteres de colesterolno citoplasma e superfície celular com numerosas expansõese protuberâncias.5 Além de haver um rearranjo do citoesque-

Como citar este artigo: Vireque AA, et al. Cultura de células da granulosa humente definido na morfologia, ultraestrutura, secrecão de esteroides e rel

leto, há uma diminuicão das juncões Gap.6,7

Culturas de células da granulosa têm sido rotineiramenteusadas para estudo da diferenciacão in vitro de células

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ovarianas e para aplicacões na TRA como suporte para amaturacão in vitro (MIV) de oócitos e cultivo embrionário.8

Contudo, os sistemas de cultura de CG desenvolvidos nasúltimas duas décadas têm sido caracterizados por um con-sistente declínio na producão de estradiol com o tempo decultura,9,10 enquanto a síntese de progesterona aumenta, oque sugere início de luteinizacão. Além disso, as CG só res-pondem a concentracões farmacológicas de FSH. Quanto àsuplementacão proteica nesses sistemas de cultura, a práticausual tem sido a adicão de soro ao meio. Como o soro pro-move a adesão das CG à superfície da placa de cultura, váriosestudos adicionaram-no ao meio nas primeiras horas de cul-tura ou durante todo o período, em baixas concentracões,11–14

para recobrir a placa de cultura antes de semear as células.Células da granulosa humanas obtidas nos procedimentos defertilizacão in vitro (FIV) e cultivadas em meio suplementadocom soro têm mostrado luteinizacão em cultura14 e, conse-quentemente, têm sido usadas como modelo para simularcélulas granulosas luteínicas do corpo lúteo.15 Vale ressal-tar que essas células são obtidas após o uso do hCG parasimulacão do pico de LH e inducão da maturacão oocitária. Aproducão endócrina dessas culturas, portanto, é característicada segunda fase do ciclo e não pode ser comparada à funcãoendócrina da fase folicular.

Sistemas de cultura de CG livres de soro foram descritospela primeira vez por Campbell e Webb em 1996, com CGovinas16 e, posteriormente, bovinas.13 Nesses sistemas de cul-tura a producão de estradiol pode ser induzida e mantidaem resposta a concentracões fisiológicas de FSH, IGF-I e/ouinsulina, com aumento das respostas proliferativa e estrogê-nica até 144 horas de cultura. Além da capacidade estrogênica

manas com fenótipo de fase folicular: influência do sistema quimica-axina. Reprod Clim. 2013. http://dx.doi.org/10.1016/j.recli.2012.12.002

das CG e do padrão normal de producão hormonal carac-terístico da fase folicular do ciclo, as CG mantêm in vitrocaracterísticas ultraestruturais semelhantes a células in vivo


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se agregam em cachos (clusters) sustentados por CG alonga-as com aspecto semelhante a fibroblastos.2 O mecanismo decão pelo qual as células de cocultura atuam na maturacão ea capacitacão do oócito in vitro e no desenvolvimento dosmbriões é ainda discutível, mas nos sistemas de cultivombrionário inclui a possibilidade de desintoxicacão do meioela remocão de íons de metais pesados, hipoxantina ou radi-ais livres e pela secrecão de substâncias embriotróficas comoatores de crescimento.17,18

O tema central deste estudo é a aquisicão de conhe-imentos sobre a diferenciacão in vitro de CG humanas,

determinacão do perfil esteroidogênico das CG cultiva-as em meio livre de soro e proteína e o estabelecimentoe um modelo de cultura de CG suporte para a MIV deócitos humanos em estágio de vesícula germinativa nosrocedimentos de reproducão assistida (RA) e de folícu-

os ovarianos pré-antrais para aplicacão em programas dereservacão de fertilidade. Para tal, os resultados pretendi-os devem ser gerados a partir da comparacão de estudos

n vivo e in vitro e mimetizacão da fisiologia endócrina repro-utiva. In vivo, em resposta ao pico ovulatório de LH, asélulas do folículo pré-ovulatório são submetidas à sua etapanal de diferenciacão e luteinizam. O comportamento deegunda fase não é adequado para a MIV, uma vez que atélcancar a maturidade o oócito secreta fatores inibidorese luteinizacão, a fim de evitar a luteinizacão precoce doolículo.19,20

A recuperacão de oócitos imaturos para subsequenteaturacão in vitro e fertilizacão é no momento uma opcão

iável para as técnicas de RA. Com o uso de menores dosese gonadotrofinas para a estimulacão ovariana, a MIV evitas efeitos colaterais e minimiza custos para os pacientes.ecentemente, foi proposta a combinacão entre ciclo natu-al de FIV e MIV de oócitos imaturos como um enfoquem potencial para o tratamento da infertilidade. Mais recen-emente, com as modalidades propostas para preservacãoe fertilidade em pacientes com risco de falência ovarianarecoce ou portadoras de doencas neoplásicas e que serãoubmetidas à quimioterapia, desenvolveu-se a técnica deongelamento de tecido ovariano. Nesses casos, quando daemissão da doenca, há a possibilidade de se reimplantar

tecido congelado (autoenxerto) ou proceder-se à extracãoe folículos desse tecido, os quais certamente são imatu-os, e maturá-los in vitro para posterior procedimento deA.

As técnicas atualmente disponíveis para a feitura de MIVão ainda bastante limitadas. Acreditamos que o desenvolvi-ento de um sistema de cocultivo de células da granulosa e

ócitos possa mimetizar o estado fisiológico do microambi-nte ovariano e melhorar os resultados de MIV. Para tal, osadrões de cultivo de células da granulosa humanas atual-ente descritos trabalham com células granuloso-luteínicas,

u seja, que já sofreram acão do LH e têm perfil de producãoormonal desfavorável para o crescimento de folículos nosstágios mais precoces do seu desenvolvimento. Assim, estestudo propôs padronizar um método de cultivar células daranulosa humanas em meio sem soro e proteína, ou seja,


eio quimicamente definido, que acreditamos ter a capaci-ade de promover a reversão dessa luteinizacão ao menosarcialmente.

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O propósito do presente estudo foi investigar a funcão este-roidogênica pós-hCG das CG antrais de aspirados de fluidofolicular de pacientes submetidas à RA em meio de culturalivre de soro e proteína (quimicamente definido) e padroni-zar um modelo de cultura de CG humanas cuja producãoendócrina seja representativa da fase folicular ou estrogênicado ciclo menstrual, com producão mantida de E2 e P4 e altarelacão E2/T ou E2/P4. Portanto, para comprovar essa rever-são, total ou parcial, semeamos as células da granulosa emdois meios de cultivo, o meio padrão (TCM-199 suplementadocom soro) e o novo meio proposto (quimicamente definido–�-MEM), analisamos comparativamente o comportamento delase determinamos a morfologia celular após o cultivo, as carac-terísticas ultraestruturais das CG por microscopia eletrônicade transmissão, o perfil de producão hormonal (proporcões deestradiol e progesterona) e a secrecão de relaxina, um polipep-tídeo produzido pelo corpo lúteo.

Materiais e métodos

Pacientes

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital dasClínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Uni-versidade de São Paulo (Processo n◦ 7474/2008). Foi feito umestudo experimental com CG humanas obtidas de aspira-dos de fluido folicular destinados ao descarte, resultantes dacaptacão de oócitos em ciclos de reproducão assistida de paci-entes tratadas no Servico de Reproducão Humana do hospital.

As pacientes foram incluídas neste estudo de acordo comseguintes critérios de inclusão: idade entre 18 a 40 anos; ciclosovulatórios; FSH menor do que 12 UI; inducão de ovulacão comFSH em associacão com LH ou hCG; indicacão de reproducãoassistida por fator de infertilidade masculino ou tubário e assi-natura do TCLE (Termo de Concordância Livre e Esclarecido).Os critérios de exclusão foram: presenca de endocrinopa-tias, como hiperplasia adrenal congênita, hiperprolactinemiae doencas tireoideanas, ainda que compensadas, e pacien-tes com endometriose ou com falhas de fertilizacão em ciclosanteriores. Dentre outros critérios de exclusão considerou-seo uso de medicamentos que sabidamente afetam a funcãoreprodutiva ou metabólica, como tratamento com glicocorti-coides ou antiandrogênios por um período mínimo de 60 diasantecedentes ao início da inducão.

Hipestimulacão ovariana controlada

As pacientes receberam anticoncepcional oral de baixa dosa-gem (Etinilestradiol 20 + Gestodeno 75), iniciado entre o pri-meiro e o quinto dia do ciclo precedente ao ciclo de inducão eaté cinco dias antes da data programada para iniciar a inducãocom gonadotrofina no ciclo anterior para programacão damenstruacão.

O bloqueio hipofisário foi feito com análogo do hormô-nio liberador das gonadotrofinas (GnRHa) (acetato de

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fada a cada 12 horas, iniciado na fase lútea do ciclo anterior(10 dias antes do início da inducão) e mantido até o dia daadministracão da gonadotrofina coriônica humana (hCG).



Figura 1 – Células da granulosa humanas observadas durante procedimento de contagem em câmara de Newbauer. Célulasvivas em (a-b) e célula não viável corada em azul (seta). Coloracão: azul de Trypan. Microscópio óptico comum, aumentos
600X (A) e 400X (B).
No dia programado para o início da inducão da ovulacão,a paciente foi submetida a exame de ultrassonografia,com a finalidade de avaliar os ovários e a anatomia ute-rina. Para a inducão foi administrado FSH recombinante(Gonal®–Laboratório Serono ou Puregon®–Laboratório Orga-non) em doses variáveis, de acordo com a resposta da paciente,por via subcutânea, sempre às 18 h. O ajuste de dose foi feitocom base no recrutamento e no crescimento folicular acompa-nhado pela ultrassonografia transvaginal seriada. Na presencade pelo menos dois folículos com diâmetro superior a 17 milí-metros (mm) foi administrado hCG recombinante (Ovidrel®)na dose de 250 �g às 22 h. Após um intervalo de 34 a 36 horas,os oócitos foram captados.

Coleta do fluido folicular

Todos os folículos com diâmetro superior a 14 mm foram pun-cionados e aspirados. A aspiracão dos folículos foi obtida poruma pressão constante de 100 milímetros de mercúrio (mmHg) com controle eletrônico (LabotectGmbH, modelo 3014).O fluido aspirado foi coletado em tubos estéreis de polipropi-leno (tubos Falcon–Costar) previamente aquecidos e mantidosa temperatura de 37 ◦C e em seguida identificados e levadospara a sala em anexo (Laboratório de Fertilizacão in vitro),aos cuidados de uma embriologista, para identificacão e reti-rada dos oócitos. O aspirado folicular contendo as CG foilevado imediatamente para os procedimentos preparatóriospara o cultivo celular.

Recuperacão das células da granulosa do aspirado folicular

O aspirado folicular total de cada paciente foi transferido paratubo Falcon de 15 mL que continha 2 mL de PBS acrescidosde antibiótico/antimicótico e mantido em gelo. Em seguida,o conteúdo folicular foi vertido para placa de Petri esté-ril de 60 mm e após sedimentacão das células sanguíneas


recuperaram-se rapidamente os grumos de CG com auxíliode micropipeta e microscópio estereoscópio. Finalmente, asCG foram transferidas para tubo Falcon de 15 mL e centrifuga-das a 1.500 rpm por 10 minutos a 4 ◦C. Após a centrifugacão, o

pellet foi ressuspendido em 1 mL de meio �-MEM e as CG foramcuidadosamente depositadas sobre a coluna de Histopaque ecentrifugadas a 2.000 rpm por 20 min a 4 ◦C. A camada de CGvisível na interface foi isolada lentamente por pipetagem e asCG foram lavadas em 2 mL de PBS e centrifugadas a 2.000 rpmpor 10 min a 4 ◦C. Em seguida, o pellet foi ressuspendido em100 �L de meio �-MEM ou TCM previamente equilibradoem incubadora de CO2. Foi retirada amostra da suspensãocelular para determinacão da concentracão e do número decélulas viáveis.

Determinacão da concentracão e viabilidade das célulasda granulosa

A concentracão celular e o índice de viabilidade foramdeterminados pelo método de exclusão do azul de Try-pan. Resumidamente, uma amostra da suspensão celular foidiluída (1:10) em solucão a 0,2% de azul de Trypan (Trypanblau,Merck, Alemanha) e analisada em câmara de Newbauer (fig. 1).A viabilidade foi estimada dividindo-se o número de célulasviáveis pelo número total de células. De acordo com os prin-cípios da técnica, as células mortas mostram-se coradas peloazul de Trypan, enquanto as células vivas permanecem nãocoradas, com aspecto refringente à visualizacão em micros-cópio óptico.

Cultivo das células da granulosa

Meios de culturaForam usados dois sistemas de cultura:

1) TCM 199 (sistema convencional–controle): meio TCM-199 (Invitrogen-Gibco BRL), suplementado com 10% desoro fetal bovino inativado a 56◦ C durante 30 minutos,0,5 �g/mL de FSH (Folltropin–Bioniche Canadá, London, ON,Canadá) e 2 mM de glutamina (Sigma Chemical Co., St.


Louis, MO, USA).2) �-MEM (sistema quimicamente definido): meio �-MEM

(Invitrogen-Gibco BRL) suplementado com bicarbonatode sódio, hepes, antibiótico, PVP, androstenediona, FSHr,


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IGF-I, insulina e Transferrinae selenium, na ausência de soro.As células foram cultivadas a 37 ◦C em atmosfera úmidacom 5% de CO2 durante 144 horas. A cada 48 horas, osmeios de cultura foram renovados e coletados para as dosa-gens de estradiol, progesterona e relaxina.

ondicões de culturas células foram plaqueadas nas concentracões de 20 mil ou0 mil células viáveis em cada poco da placa de cultura con-endo 200 �L de meio previamente equilibrado, em duplicataara cada concentracão celular e tratamento (meio de cultura).s células foram cultivadas em placas de cultura de 96 pocosm meio TCM-199 ou �-MEM a 37 ◦C em atmosfera úmida com% de CO2 durante 144 horas. A cada 48 horas, os meios deultura foram renovados.2

valiacão morfológica e ultraestruturalara a fixacão das células para a microscopia eletrônica deransmissão, os meios de cultura foram substituídos por meioecém-preparado com 120 horas de cultivo e as células fixa-as após 24 horas. Foram feitas primeiramente as etapas de

avagens com PBS e tampão cacodilato 0,1 M (pH 7,4) e logom seguida a fixacão das células com 2% de glutaraldeído,% de formaldeído e 0,05% de CaCl2 em PBS com Ca2+/Mg2+.m seguida a amostras foram pós-fixadas com tetróxido desmio 1% feito em tampão cacodilato 0,1 M (pH 7,4), contras-adas com acetato de uranila 0,5%, desidratadas em sériesrescentes de etanol PA (Merck) e incluídas em resina. Foramontados os blocos e confeccionadas lâminas com cortes deeio micra e coradas com azul de Toluidina. Após exame das

élulas em microscopia de luz, as amostras emblocadas e bemreservadas foram processadas. Foram feitos cortes ultrafinos

60 nm) para montagem das grades de cobre e contrastadasom acetato de uranila 0,5% e citrato de chumbo para posteriornálise da ultraestrutura.

osagens hormonaispós 48, 96 e 144 horas de cultivo, os meios de cultura foramoletados e mantidos a −20 ◦C até a análise. A concentracãoe estradiol e progesterona nas amostras dos meios de cul-ura foi determinada pelo método de quimioluminescência,om o uso de kit comercial (DPC, Immulite System, Los Ange-es, CA, USA), de acordo com instrucões do fabricante. Asnálises foram feitas em duplicata, sem extracão, e cada este-oide foi analisado em um único ensaio, para evitar variacãontre-ensaios. Os coeficientes de variacão intraensaio foramenores do que 15% para o estradiol e 10% para a proges-

erona. As sensibilidades analíticas dos kits de estradiol e derogesterona foram de 15 pg/mL e 0,1 ng/mL, respectivamente.

relaxina foi dosada por Elisa, com o uso de kit comercialEnzime-linked Immunosorbent Assay Kit for Humanrelaxin,SCN Life Science, USA). Os ensaios foram feitos no Labora-

ório de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas daaculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade deão Paulo.


nálise estatísticas dados da concentracão de esteroides e relaxina nos meiose cultura foram analisados por Anova e teste de regressão

inear de efeitos mistos com o uso do procedimento GLM

x x(x x):xxx–xxx 5

(PROC GLM) do software SAS® 9.0. Os dados são apresentadoscomo média e desvio-padrão e o nível de significância adotadofoi de 5% (� = 0,05).

Resultados

Caracterizacão morfológica da cultura

˛-MEMNesse sistema de cultura, as células crescem em suspensãoe formam clusters de células justapostas com fenótipo seme-lhante às CG in vivo (fig. 2A). As CG desses agregados mantêma forma poliédrica e apresentam-se fortemente compactadas(fig. 2A).

TCM-199As características celulares nesse sistema de cultivo já sãobem descritas na literatura. Por causa da adicão de soro, ascélulas crescem e formam monocamadas aderentes ao fundoda placa de cultura (fig. 2B).

Análise descritiva da ultraestrutura das célulasda granulosa

Aspectos geraisCélulas da granulosa cultivadas em �-MEM apresentaramformato predominantemente poliédrico (fig. 3), extensivasjuncões gap e microvilosidades interdigitadas (pseudópodes),com alta relacão núcleo-citoplasma (fig. 3), retículo endo-plasmático liso (REL) abundante e mitocôndrias com cristastrabeculares (figs. 3B e 4A). Em contraste, as células cultiva-das em TCM 199 apresentaram formato alongado semelhantea fibroblasto (fig. 6A-D) e baixa relacão núcleo-citoplasma(fig. 6A) e continham retículo endoplasmático e mitocôn-drias (que tendem a ser arredondadas) menos desenvolvidose estruturas semelhantes a endossomos, características mor-fológicas sugestivas de início de luteinizacão (fig. 7A-B).

Características ultraestruturais das células cultivadasem meio ˛-MEMPor causa da característica de formarem clusters de célu-las fortemente compactadas e aderidas entre si, observamos,na maioria das eletromicrografias, a presenca de muitasinterdigitacões de membrana, áreas de comunicacão celulare estruturas de juncão celular responsáveis pela forte ade-são entre as células, como, por exemplo, os desmossomos(fig. 4B). Também foi possível observar no citoplasma cisternasde retículo endoplasmático rugoso (RER) dispostas em pilhasparalelas (fig. 5A). Alguns RER mostraram-se mais desenvolvi-dos, dependendo do estado funcional da célula (fig. 4A), e suascavidades apresentaram-se dilatadas por causa do acúmulode proteínas. As cisternas de Complexo de Golgi mostraram-sebem desenvolvidas, distribuídas pelo citoplasma (figs. 4A e 5B).


Além das organelas, foram observadas quantidades varia-das de gotas lipídicas que ocupavam o citoplasma das CG(figs. 3A e 5B).



Figura 2 – Padrão de crescimento de células da granulosa humanas cultivadas em sistema de cultura convencional ouquimicamente definido. Crescimento característico em suspensão (clusters) das células da granulosa cultivadas no meio�-MEM (A); monocamada de células da granulosa em cultivo no meio TCM-199 (B). Microscópio invertido acoplado a
micromanipulador Nikon Diaphot 300.200X.
Características ultraestruturais das células cultivadasem meio TCM-199Diferentemente das CG cultivadas no meio �-MEM, asCG cultivadas no meio TCM-199 apresentaram membranacitoplasmática irregular por causa de inúmeras microvilosi-dades, evaginacões e protrusões pleomórficas sugestivas deluteinizacão (figs. 6A-C; 7A-B).

Os núcleos apresentaram-se menos desenvolvidos e comformato predominantemente alongado (fig. 7C), que acom-panhava o formato da célula, e continham pelo menosum nucléolo que se mostrava como uma estrutura eno-velada e bem evidente. Havia no citoplasma das célulasmuitas gotas lipídicas predominantemente grandes e maiselétron-densas (fig. 6B e 7A). As mitocôndrias ocuparamuma parte substancial do volume citoplasmático com diâ-metros variáveis, arredondadas e eventualmente alongadase com muitas cristas, bem definidas e geralmente tubulares(fig. 6A).

Perfil hormonal: estradiol e progesterona

O perfil da secrecão de esteroides foi determinado em amos-tras de meios obtidos de culturas das CG que apresentaramalta viabilidade celular pré-cultivo e características morfoló-gicas compatíveis com os dois sistemas de cultura usados,representados pelos meios �-MEM e TCM. As células da granu-losa cultivadas em �-MEM (sistema de cultura quimicamentedefinido) secretaram progressivamente concentracões maiselevadas de estradiol durante o período de cultura, enquantoas células cultivadas em TCM-199 (controle) apresenta-ram uma producão consistentemente menor de estradiol(p < 0,01).

Relacão estradiol: progesterona


A relacão E2/P4 foi significativamente maior no �-MEM quandocomparada ao TCM, independentemente do tempo de cultivo(T48 h = 0,13 ± 0,12 vs. 0,01 ± 0,02 [p < 0,01]; 96 h = 0,12 ± 0,06 vs.0,01 ± 0,01 [p < 0,01]; 144 h = 0,90 ± 0,87 vs. 0,01 ± 0,06 [p = 0,06],respectivamente) (figs. 8 e 9).

Secrecão de relaxina

A secrecão de relaxina pelas CG não diferiu no tempo 48 horasentre os dois sistemas de cultura, porém foi significativamentemaior no meio TCM quando comparada ao meio �-MEM após96 e 144 horas de cultivo (p = 0,0095) (fig. 10).

Discussão

No presente estudo, células da granulosa humanas cultivadasem sistema quimicamente definido e estimuladas com gona-dotrofina (FSH), em associacão com fatores de crescimento(IGF-I e insulina), foram avaliadas quanto à capacidade dereverter o processo de luteinizacão deflagrado pelo hCG usadonos protocolos de hiperestimulacão ovariana controlada e desimular o perfil esteroidogênico característico da fase foliculardo ciclo menstrual.

Nosso modelo experimental in vitro foi padronizado emmeio de cultura que pode ser perfeitamente considerado comoquimicamente definido, já que usa a polivinilpirrolidona -40 (PVP-40), uma macromolécula sintética, como substitutodo soro fetal e BSA. Foram comparados dois sistemas decultivo distintos: o sistema padrão descrito na literatura,representado pelo meio TCM-199 suplementado com soro, eo sistema proposto, representado pelo meio �-MEM acres-cido de suplementacão específica para estimular a capacidadeestrogênica das CG. As características morfológicas e ultra-estruturais, bem como o perfil endócrino das culturas obtidocom o presente protocolo, são similares às CG in vivo defolículos ovarianosantrais, enquanto o sistema de culturaconvencional com soro irrefutavelmente simula o perfil mor-fológico/endócrino das células granulosas luteínicas do corpolúteo diferenciado.15

A adicão do soro durante as primeiras horas de cultura,ou a feitura de um pré-tratamento dos pocos de cultura comsoro, é uma prática comum para melhorar a adesão celular

11


na placa de cultivo. Porém, a capacidade das CG de pro-duzir esteroides in vitro pode ser potencialmente alterada.O soro pode induzir luteinizacão das CG e células da teca,caracterizada pela diminuicão da producão de estradiol e


r e p r o d c l i m . 2 0 1 3;x x x(x x):xxx–xxx 7

Figura 3 – Eletromicrografias de CG cultivadas em meio �-MEM (144 h). Notar forma poliédrica da célula com alta relacãonúcleo-citoplasma, membrana nuclear bem evidente sem dobras (A) e apresentando invaginacões (B) (setas pretas). Em (A)notar porcões de heterocromatina adjacentes à face interna da membrana nuclear. Observar na seta branca o limite celularbem definido e contínuo. N, núcleo, n, nucléolo, M, mitocôndria, GL, gota lipídica, RER, retículo endoplasmático rugoso, G,C

agdeabd

omplexo de Golgi. ME; A: 6.700X, B: 5.000X.

ndrostenediona e por um rápido aumento na secrecão de pro-esterona, com producão sustentada durante todo o períodoe cultivo.11,13,21,22 Corroborando esses achados, Gutiérrezt al.13 demonstraram os efeitos negativos da adicão do soro


o meio de cultivo na producão de esteroides in vitro por CGovinas. A proliferacão das CG cultivadas em pocos trata-os com soro aumenta no fim do período de cultura com CG

obtidas de todas as categorias de tamanho folicular. Noentanto, a producão de estradiol entre 96 e 144 horas de cul-tivo é significativamente reduzida em folículos pequenos emédios, se comparada com células cultivadas em sistemas


livres de soro.Nossos resultados também demonstram influência impor-

tante do sistema de cultivo na diferenciacão in vitro das CG.



Figura 4 – Eletromicrografias de CG cultivadas em meio �-MEM (144 h). Notar a presenca de uma populacão bem variadade mitocôndrias no citoplasma. A matriz mitocondrial mostra-se densa, com aspecto granuloso. Observar a presenca de

cão e
grânulo denso em seu interior (seta). (*) Região de comunicaA: 20.000 X, B: 27.000X.

Ao se compararem os dois sistemas testados, a morfologiadas culturas foi substancialmente distinta em 100% dos culti-vos, bem como as características ultraestruturais observadasà microscopia eletrônica de transmissão. As CG cultivadas

ntre as células. M, mitocôndria, GL, gota lipídica. ME;


no meio �-MEM, demonstraram características morfológicassimilares às CG in vivo. As células crescem em suspen-são formando clusters, os quais aumentam em número,distribuem-se por toda a área da placa de cultivo, além de



Figura 5 – Eletromicrografias de CG cultivadas em meio �-MEM (144 h). Observar cisternas de retículo endoplasmáticorugoso (RER) dispostas em pilhas paralelas, Complexo de Golgi (G), mitocôndrias (M), algumas com corpos densos na matrizm 00X,

acaprcé

itocondrial (setas). N, núcleo; GL, gota lipídica. ME; A: 14.0

umentarem em diâmetro e tornarem-se visivelmente maisompactados ao longo da cultura. Segundo Gutierrez et al.,13

formacão de clusters de CG, em sistemas livres de soro,ermite um íntimo contato físico entre elas e isso pode ser


esponsável por prevenir a luteinizacão.2 Essa morfologia derescimento típica, aliada à producão de estradiol, também

observada em outras espécies, como em ovinos,16 suínos12

B: 14.000X.

e bovinos.2 Esse íntimo contato entre as CG pode ser obser-vado por meio da presenca das comunicacões celulares emamostras analisadas por microscopia eletrônica. Observamos


a presenca de muitas juncões intercelulares, como os des-mossomos, na maioria das eletromicrografias das CG queforam cultivadas no meio �-MEM compatível com a ultraes-trutura relatada na literatura de folículos nas fases iniciais




Figura 6 – Eletromicrografias de CG cultivadas em meio TCM (144 h). Observar o formato alongado das células, a relacãonúcleo-citoplasma e as porcões de heterocromatina nos núcleos (A e D). Superfície citoplasmática irregular (setas).N, núcleo; GL, gota lipídica. ME; A: 6.700X, B: 8.000X, C: 2.700X, D: 4000X.




Figura 7 – Eletromicrografias de CG cultivadas em meio TCM (144 h). Observar superfícies citoplasmáticas irregulares devidoa microvilosidades, evaginacões e protusões pleomórficas sugestivas de luteinizacão (setas). N, núcleo; M, mitocôndria;RER, retículo endoplasmático rugoso; GL, gota lipídica. A, 5.000X; B, 10.000X.



Figura 8 – Secrecão de estradiol (pg/mL) por células da granulosa humanas (105/mL e 2 × 105/mL) cultivadas em sistemaquimicamente definido ou controle. Meio A = TCM (controle); Meio B = �-MEM. Concentracão 20 ou 40 = 20 mil ou 40 milcélulas/200 �L de meio de cultura. Os desvios-padrão referem-se à variabilidade interindivíduos estimada por modelosde efeitos mistos (n = 10).

Figura 9 – Secrecão de progesterona (ng/mL) por células da granulosa humanas (105/mL e 2 × 105/mL) cultivadas emsistema quimicamente definido ou controle. Meio A = TCM (controle); Meio B = �-MEM. Concentracão 20 ou 40 = 20 milou 40 mil células/200 �L de meio de cultura. Os desvios-padrão referem-se à variabilidade interindivíduos estimada por
modelos de efeitos mistos (n = 10).
de desenvolvimento.7 Portanto, pode-se inferir que o sis-


tema de cultivo proposto conseguiu retardar o processo deluteinizacão das células. A maturacão das células da granu-losa e a luteinizacão são processos nos quais ocorre uma

diminuicão ou até mesmo ausência das juncões Gap e das


regiões de aderência celulares no folículo.7,12

Do ponto de vista ultraestrutural, as diferencas maisproeminentes observadas foram o formato e o tamanho



Figura 10 – Secrecão de relaxina (pg/mL) por células da granulosa humanas (2 × 105/mL) cultivadas em sistema quimica-mente definido ou controle. Meio A = TCM (controle); Meio B = �-MEM. Concentracão 40 = 40 mil células/200 �L de meio dec ndiví

dmddMcm(Errmcpateaccdaddfnscm

sf

ultura. Os desvios-padrão referem-se à variabilidade interi

as células, a relacão núcleo/citoplasma, a quantidade deitocôndrias e gotas lipídicas, as áreas de RER e Complexo

e Golgi ocupadas no citoplasma da célula e característicasa superfície celular. Células da granulosa cultivadas em �-EM apresentaram formato predominantemente poliédrico

om alta relacão núcleo-citoplasma, extensivas juncões gap eicrovilosidades interdigitadas, retículo endoplasmático liso

REL) abundante e mitocôndrias com cristas trabeculares.m contraste, as células cultivadas em TCM 199 apresenta-am formato alongado semelhante a fibroblasto com baixaazão núcleo-citoplasma e continham retículo endoplas-

ático menos desenvolvido e mitocôndrias arredondadas,aracterísticas morfológicas compatíveis com instalacão dorocesso de luteinizacão. Os resultados deste estudo estão decordo com os relatos da literatura sobre as diferencas ultraes-ruturais na morfologia de CG em relacão aos seus diferentesstágios de proliferacão e luteinizacão.23 As células obtidaspós a aspiracão do fluido folicular de pacientes submetidas aiclos de reproducão assistida são comumente chamadas deélulas pré-luteinizadas, mas diferem entre si quanto ao tipoe cristas mitocondriais, à proliferacão do Complexo de Golgi,o tipo de retículo endoplasmático e ao número e ao tamanhoas gotas lipídicas.24 No presente estudo, as CG cultivadas nosois sistemas analisados partiram dos mesmos pools de fluidosoliculares, ou seja, o tamanho do folículo e a quantidade de E2a qual as CG estavam em contato foram os mesmos, poréme diferenciaram in vitro ao assumir características morfofun-ionais distintas e demonstrar um perfil de fase folicular noeio �-MEM e outro de fase lútea no meio TCM-199.


Os resultados de estudos in vitro só são significativose as células mantiverem durante a cultura característicasuncionais semelhantes às que mantêm in vivo, para que a

duos estimada por modelos de efeitos mistos (n = 10).

partir desses resultados se facam inferências a respeito dafisiologia do processo estudado. Do ponto de vista funcional,o padrão de producão hormonal de cada sistema de culturafoi bem distinto. No sistema convencional com soro (TCM-199), as CG foram predominante produtoras de progesterona(característica de fase lútea), enquanto no sistema proposto (�-MEM) as CG secretaram altas concentracões de estradiol, semo incremento de progesterona, e mantiveram alta a relacãoestradiol/progesterona, a qual indica manutencão da ativi-dade da aromatase, característica da fase folicular.

Gutierrez et al.2,13 demonstram a íntima relacão entreestrutura e funcão em sistemas de cultura de CG livres desoro. Nessas culturas, as concentracões de estradiol são man-tidas ao longo do cultivo e as CG apresentam característicasultraestruturais de células normais, semelhantes às CG in vivo.Essas células contêm RER e REL em abundância, mitocôn-drias com cristas trabeculares e uma extensiva rede de juncõesGap. Ao contrário, as CG cultivadas em placas revestidas comsoro mostram características de perda da atividade da enzimaaromatase. Essa perda de aromatizacão foi correlacionadacom a morfologia das células, que se apresentavam maisalongadas e compatíveis com os resultados obtidos no pre-sente estudo, tanto relativos ao alongamento celular quantoà reducão na atividade da aromatase no meio de cultivocom TCM199 (fase lútea). Adicionalmente, observamos quea secrecão de relaxina, um polipeptídeo sintetizado pelocorpo lúteo, foi significativamente maior no meio TCM-199quando comparada ao �-MEM. Células da granulosa humanascultivadas em sistema contendo soro secretam quantida-


des expressivas de relaxina e são capazes de simular operfil de secrecão do corpo lúteo característico do períodogestacional.7 Tais mudancas, analisadas conjuntamente, são


0 1 3;x

r

1

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14 r e p r o d c l i m . 2

indicativas da fase final de diferenciacão e de luteinizacão dasCG.2,7

Finalmente, é possível concluir que o sistema de cul-tivo proposto (�-MEM) induziu a reversão do processo deluteinizacão droga-induzida durante a hiperestimulacão ova-riana controlada, enquanto o meio padrão, como já descritona literatura, tende a completar o processo de luteinizacãoe servir como modelo in vitro de corpo lúteo. A importânciadeste estudo reside no estabelecimento de um modelo de cul-tura de CG humanas que, além do potencial de aplicacão nosprotocolos de preservacão de fertilidade, torna-se um modeloadequado para a investigacão dos efeitos das diferentes gona-dotrofinas usadas nos protocolos de estimulacão ovariana,como o FSH e HMG, na diferenciacão e na luteinizacão dasCG pós-ovulatórias. Esses conhecimentos básicos, uma vezadquiridos, serão transferidos gradativamente para a práticaclínica, visando ao aprimoramento das biotecnologias repro-dutivas.

Conclusões

Células da granulosa humanas obtidas em ciclos de FIV,pré-luteinizadas pelo hCG, quando cultivadas em meio quimi-camente definido não completam o processo de luteinizacãoin vitro e, em vez de estimular o corpo lúteo, apresentam per-fil morfológico, ultraestrutural e endócrino característicos dafase folicular do ciclo.

Conflitos de interesse

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

e f e r ê n c i a s

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Cultura de células da granulosa humanas com fenótipo defase folicular: influência do sistema...

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