Brito Fernández, A. R. (2018). Tesis Doctoral.pdf - Saber UCV

UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA EXPERTICIA

TOXICOLÓGICA FORENSE


FACULTAD DE FARMACIA


TOXICOLÓGICA FORENSE IN VIVO DE FLUIDOS BIOLÓGICOS

HUMANOS EN VENEZUELA

AUTOR:

LIC. ANGELINA BRITO

CARACAS, MAYO 2018



DE FLUIDOS BIOLÓGICOS

MANUAL DE

TOXICOLÓGICA FORENSE

LIC

Trabajo presentado ante la Ilustre Universidad Cent ral de Venezuela para

optar al Título de Especialis


POSTGRADO DE




AUTOR:

LICENCIADA EN QUÍMICA ANGELINA BRITO


optar al Título de Especialis ta en Aseguramiento de la Calidad

TUTORES:

MSc. GLADYS ROMERO DE GALÍ

MSc. YENYS GIMÓN


FACULTAD DE FARMACIA

POSTGRADO DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD

PROCEDIMIENTOS PARA LA EXPERTICIA

DE FLUIDOS BIOLÓGICOS

ANGELINA BRITO


ta en Aseguramiento de la Calidad


GURAMIENTO DE LA CALIDAD

IV

Dedicatoria

A mi madre y mi hermana por estar siempre a

mi lado, apoyándome para alcanzar cada una

de las metas que me he propuesto y a mi

hermana Andreina por cuidarme y guiar mis

pasos desde el cielo.

V

AGRADECIMIENTOS

A Dios, por guiarme y fortalecerme en todos los momentos de mi vida.

A mi madre y mi hermana, por enseñarme y brindarme todo su amor, confianza

y dedicación, alentando mí deseo de superación.

A la Universidad Central de Venezuela, Magna casa de estudio que me abrió

sus puertas para culminar un nivel más en la etapa académica de mi vida.

A mis tutoras MSc. Gladys Romero de Galí y MSc. Yenys Gimón, por guiarme y

brindarme la ayuda y tiempo necesario, agradeciéndoles su amistad e

incondicional apoyo para culminar con éxito el presente estudio.

Al prof. Jesús Gómez y las prof.as: Elsa Castejón, Maritza Padrón y Gladys

Venegas, por brindarme su ayuda y orientarme en las áreas de su especialidad.

A mis compañeros de estudio y amigos, quienes con su apoyo y amistad

hicieron más fácil el día a día durante el transcurso del postgrado.

A mis compañeros de trabajo, quienes de una u otra forma brindaron su ayuda

durante la realización de mi tesis.

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA EXPERTICIA TOXICOL ÓGICA FORENSE IN VIVO DE FLUIDOS BIOLÓGICOS HUMANOS EN VE NEZUELA

Autor: Lic . Angelina Brito, Yenys Gimón. Facultad de Farmacia, Universidad Central de Venezu ela,

Los laboratorios de toxicología forense desempeñan un papel importante para dar celeridad y esclarcumplir con parámetros de calidad realizan; garantizando así, que todos los actualizados, documentados y accesibles trabajo se realizó experticia toxicológica forense los procedimientos 9001:2008 e ISO/IEC 17025:2005 utilizadas para acreditar este tipo de laboratorio. Para la elaboración del manual se utilizaron diferrecolección de información y revisión bibliográfica, permitienorma ISO/TR 10013:2001 procedimientos realizadorecepción y el almacenamiento de las muestrascualitativos y cuantitativos mediante diferentes técnicas analíticas determinación de alcohol etílico, cocaína, cannabinoides, opiáceos, benzodiacepinas y anfetaminas en las muestras biológicas, la elaboración de la experticia toxicológicPermitiendo así unificar y controlar los procedimientos que se realizan en el laboratorio de toxicología forensecalidad establecidos internacionalmente

Palabras claves: Toxicología; Forense;



VI


. Angelina Brito, Tutores: MSc. Gladys Romero de Galí., MSc. Facultad de Farmacia, Universidad Central de Venezu ela,

Caracas, Venezuela

RESUMEN

laboratorios de toxicología forense desempeñan un papel importante dar celeridad y esclarecer casos en el ámbito legal, es por ello que deben

cumplir con parámetros de calidad que normen los procesos que allí se realizan; garantizando así, que todos los procedimientos

documentados y accesibles para todo el personalrealizó un manual de procedimiento para la elaboración de la

experticia toxicológica forense in vivo en Venezuela con el fin de estandarizar los procedimientos que se realizan y así dar cumplimiento a las normas ISO

08 e ISO/IEC 17025:2005 utilizadas para acreditar este tipo de laboratorio. Para la elaboración del manual se utilizaron difer

información tales como observación de campo, entrevista directa y revisión bibliográfica, permitiendo mediante las directrices establecidas en la norma ISO/TR 10013:2001 estructurar los POEs que conformaronprocedimientos realizado. Los procedimientos fueron establecidos para recepción y el almacenamiento de las muestras biológicascualitativos y cuantitativos mediante diferentes técnicas analíticas determinación de alcohol etílico, cocaína, cannabinoides, opiáceos, benzodiacepinas y anfetaminas en las muestras biológicas, la elaboración de la experticia toxicológica forense in vivo y el registro y respaldo de la información.Permitiendo así unificar y controlar los procedimientos que se realizan en el laboratorio de toxicología forense y dar cumplimiento a los

establecidos internacionalmente.

Toxicología; Forense; Experticia; Manual; Procedimientos.

UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELAFACULTAD DE FARMACIA



Tutores: MSc. Gladys Romero de Galí., MSc. Facultad de Farmacia, Universidad Central de Venezu ela,

laboratorios de toxicología forense desempeñan un papel importante el ámbito legal, es por ello que deben

que normen los procesos que allí se estén establecidos, sonal. En el presente

un manual de procedimiento para la elaboración de la en Venezuela con el fin de estandarizar

dar cumplimiento a las normas ISO 08 e ISO/IEC 17025:2005 utilizadas para acreditar este tipo de

laboratorio. Para la elaboración del manual se utilizaron diferentes métodos de tales como observación de campo, entrevista directa

ediante las directrices establecidas en la conformaron el manual de

fueron establecidos para la biológicas, los análisis

cualitativos y cuantitativos mediante diferentes técnicas analíticas para la determinación de alcohol etílico, cocaína, cannabinoides, opiáceos, benzodiacepinas y anfetaminas en las muestras biológicas, la elaboración de la

y el registro y respaldo de la información. Permitiendo así unificar y controlar los procedimientos que se realizan en el

y dar cumplimiento a los estándares de

; Procedimientos.



MANUAL OF PROCEDURES FOR THE REPORT OF

Author: B.Sc . Angelina Brito;Yenys Gimón. School of Pharmacy

Forensic Toxicology labs play an important role in order to the legal field. That is why forensic toxicologists must comply with quality parameters that norm processes carried out in this field.procedures are established, updated, documented and accessible to all personnel as a guarantee that the work in progress is controlled and complies with the quality standardsorder to standardize procedures carried out in the toxicology lab and to comply with ISO 9001:2008 and ISO/IEC 17025:2005 norms used to certify this type of laboratory. For elaboration of the manual different methinformation were used: a) Bibliography review, allowing the guidelines established in ISO/to structure POEs Procedures were established for the reception and storage of biological samples, qualitative and quantitative analyses using different analytical techniques for ethyl alcohol, cocaine, benzodiazepines and amphetamines determination inBesides, forms for lab reports on designed. Also, procedures for information registration and control were written. If used properly, this manual may allow complying with the quality standarinternationally established.

Keywords: Forensic

CENTRAL UNIVERSITY OF VENEZUELA

POST-

VII

MANUAL OF PROCEDURES FOR THE IN VIVO FORENSIC TOXICOLOGY OF HUMAN BEINGS BODY FLUIDS IN VENEZUELA

. Angelina Brito; Tutors: MSc. Gladys Romero de Galí., MSSchool of Pharmacy , Universidad Central de Venezuela,

Caracas, Venezuela

ABSTRAC

Forensic Toxicology labs play an important role in order to . That is why forensic toxicologists must comply with quality

eters that norm processes carried out in this field.procedures are established, updated, documented and accessible to all personnel as a guarantee that the work in progress is controlled and complies with the quality standards. In this paper, a procedures manual was designed in order to standardize procedures carried out in the toxicology lab and to comply with ISO 9001:2008 and ISO/IEC 17025:2005 norms used to certify this type of laboratory. For elaboration of the manual different methinformation were used: a) Field observation, b) Lab personnel interview and c)

ibliography review, allowing the guidelines established in ISO/to structure POEs making possible carrying out of procedures established.

edures were established for the reception and storage of biological samples, qualitative and quantitative analyses using different analytical

ues for ethyl alcohol, cocaine, cannabinoids and opiates, benzodiazepines and amphetamines determination in the biological samples. Besides, forms for lab reports on in vivo toxicology forensic results were designed. Also, procedures for information registration and control were written. If used properly, this manual may allow complying with the quality standarinternationally established.

Forensic; Toxicology; in vivo Results Report; Procedures; M

CENTRAL UNIVERSITY OF VENEZUELA FACULTY OF PHARMACY

- DEGREE: INSURANCE OF THE QUALITY

FORENSIC TOXICOLOGY IN VENEZUELA

Gladys Romero de Galí., MS c. , Universidad Central de Venezuela,

Forensic Toxicology labs play an important role in order to clarify cases in . That is why forensic toxicologists must comply with quality

eters that norm processes carried out in this field. Ensuring that, all procedures are established, updated, documented and accessible to all personnel as a guarantee that the work in progress is controlled and complies

paper, a procedures manual was designed in order to standardize procedures carried out in the toxicology lab and to comply with ISO 9001:2008 and ISO/IEC 17025:2005 norms used to certify this type of laboratory. For elaboration of the manual different methods of collection of

ab personnel interview and c) ibliography review, allowing the guidelines established in ISO/TR 10013:2001

g out of procedures established. edures were established for the reception and storage of biological

samples, qualitative and quantitative analyses using different analytical cannabinoids and opiates,

the biological samples. toxicology forensic results were

designed. Also, procedures for information registration and control were written. If used properly, this manual may allow complying with the quality standards

Results Report; Procedures; Manual.

INSURANCE OF THE QUALITY

VIII

INDICE DE CONTENIDO

DEDICATORIA .................................................................................................. IV

AGRADECIMIENTOS ......................................................................................... V

ABSTRAC ......................................................................................................... VII

LISTA DE FIGURAS ........................................................................................... X

LISTA DE TABLAS ............................................................................................ XI

LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................. XII

GLOSARIO DE TÉRMINOS ............................................................................. XV

1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 1

2. MARCO TEÓRICO ....................................................................................... 4

2.1 Marco Legal: ............................................................................................. 4

2.2 Toxicología Forense: ................................................................................ 7

2.3 Muestras biológicas más comunes a emplear en los laboratorios de toxicología forense in vivo: .............................................................................. 8

2.4 Drogas más comunes a determinar en los laboratorios de toxicología forense: .......................................................................................................... 10

2.4.1 Drogas estimulantes del SNC: cocaína y anfetaminas: ................... 11

2.4.2 Drogas depresoras del SNC: Alcohol etílico, opiáceos y benzodiacepinas: ....................................................................................... 17

2.4.3 Drogas Alucinógenas: ...................................................................... 23

2.5 Proceso Sistemático Analítico Toxicológico (SAT) utilizado para extraer e identificar las sustancias presentes en la muestra de interés: ....................... 26

2.6 Procedimientos analíticos más utilizados en los laboratorios de toxicología forense:........................................................................................ 31

2.6.1 Pruebas de inmunoensayos: ............................................................ 32

2.6.2 Microdifusión en cámara de Conway: .............................................. 35

2.6.3 Cromatografía: ................................................................................. 37

2.7 Calibración de instrumentos y equipos analíticos: .................................. 51

2.8 Patrones de referencia y reactivos: ........................................................ 54

3. OBJETIVOS ............................................................................................... 55

4. METODOLOGIA ......................................................................................... 57

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................... 63

6. CONCLUSIONES ..................................................................................... 114

IX

7. RECOMENDACIONES ............................................................................ 116

8. REFERENCIAS ........................................................................................ 117

9. ANEXOS .................................................................................................. .124

ANEXO A. Cuestionario aplicado al personal experto del laboratorio de toxicología forense in vivo ........................................................................ 124

ANEXO B. Cartas de certificación por parte de expertos del cuestionario aplicado .................................................................................................... 131

ANEXO C. Resultados obtenidos del análisis estadístico de las respuestas dadas por los expertos al cuestionario aplicado mediante la prueba exacta de Fisher................................................................................................... 134 ANEXO D. Manual de procedimientos para la experticia Toxicológica Forense in vivo de fluidos biológicos humanos en Venezuela.................. 137

X

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estructura química de la cocaína ....................................................... 11

Figura 2. Metabolitos de la cocaína ................................................................. 13

Figura 3. Estructura química de las anfetaminas. ............................................. 14

Figura 4. Metabolitos de las anfetaminas. ........................................................ 16

Figura 5. Metabolitos de las metanfetaminas.................................................... 17

Figura 6. Estructura química del alcohol etílico. ................................................ 18

Figura 7. Metabolitos del alcohol etílico ............................................................ 19

Figura 8. Metabolitos de los opiáceos. .............................................................. 20

Figura 9. Metabolitos de algunos tipos de benzodiacepinas. ............................ 22

Figura 10. Metabolitos del ∆9-THC. ................................................................... 23

Figura 11. Estructuras químicas de los cannabinoides más comunes. ............. 25

Figura 12. Cámara de Conway. ........................................................................ 36

Figura 13. Etapas en el empleo de la técnica de CCF. ..................................... 42

Figura 14. Diagrama esquemático de un cromatográfo de gases..................... 45

Figura 15. Esquema de un HPLC. .................................................................... 50

Figura 16. Valores promedios, límites de control inferior y superior para un 95% de confianza de las respuestas dadas por los expertos en cada tópico. .......... 72 Figura 17. Resultados de la encuesta aplicada sobre los procedimientos que se llevan a cabo para el análisis cualitativo (Tópico 4) y cuantitativo (Tópico 5). .. 97 Figura 18. Respuestas obtenidas de la encuesta aplicada sobre la documentación que dispone el laboratorio de toxicología forense.................. 106

XI

LISTA DE TABLAS

Tabla I. Ventajas y desventajas de los Inmunoensayos. .................................. 35 Tabla II. Resultados obtenidos de la observación de campo realizada en el área de estudio ......................................................................................................... 64 Tabla III. Valores Promedio (�), Error desviación estándar (σ) para cada sujetos y tópico planteado en la encuesta. .................................................................... 71 Tabla IV. Valores de media de la media (�), límite inferior y límite superior para un nivel de confiabilidad del 95% obtenidos de las respuestas dadas por los expertos. ........................................................................................................... 71 Tabla V. Resultados para el Tópico 1. Estructura del laboratorio, del cuestionario aplicado al personal experto del laboratorio de toxicología forense in vivo. ............................................................................................................... 73 Tabla VI. Resultados para el Tópico 2. Prácticas y procedimientos para la recepción de las muestras, del cuestionario aplicado al personal experto del laboratorio de toxicología forense in vivo. ......................................................... 75 Tabla VII. Resultados para el Tópico 3. Prácticas y procedimientos para el almacenamiento de las muestras, del cuestionario aplicado al personal experto del laboratorio de toxicología forense in vivo. ................................................... 81 Tabla VIII. Resultados de los Tópicos 4 y 5. Prácticas y procedimientos para la determinación cualitativa y cuantitativa de opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las muestras biológicas, del cuestionario aplicado al personal experto del laboratorio de toxicología forense in vivo. ..... 85 Tabla IX. Resultados para el Tópico 6. Elaboración de la experticia toxicológica forense in vivo, del cuestionario aplicado al personal experto. ......................... 98 Tabla X. Resultados para el Tópico 7. Procedimientos para el registro y respaldo de la información de los resultados obtenidos, del cuestionario aplicado al personal experto del laboratorio de toxicología forense in vivo. ... 101

XII

LISTA DE ABREVIATURAS

ADH Alcohol deshidrogenasa

AED Atomic Emission Detector (Detectores de emisión atómica)

ALDH Aldehído deshidrogenasa

CBCh Cannabicromeno

CBD Cannabidiol

CBN Cannabinol

CCF Cromatografía de Capa Fina

CEDIA Cloned Enzyme Donor Immunoassay (Inmunoensayo de enzima

donante clonada)

CG Cromatografía de Gases

CGL Cromatografía de Gas- Líquido

CGS Cromatografía de Gas- Sólido

COOP Código Orgánico Procesal Penal

CPC Código de Procedimiento Civil

ECD Electron Capture Detector (Detectores de captura de electrones)

EIA Enzyme Immunoassay (Inmunoensayo enzimático)

XIII

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Ensayo por inmunoabsorción

ligado a enzimas)

EMIT Enzyme - Multiplied Immunoassay (Inmunoanálisis de multiplicación

enzimática)

FID Flame Ionisation Detector (Detectores de ionización de llama)

FPIA Fluorescence polarization immunoassay (Inmunoensayo por

Polarización de Fluorescencia)

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Cromatografía Líquida de

Alta Eficacia)

HS Automuestreador “Headspace”

IE Impacto electrónico

IEC International Electrotechnical Commission (Comisión Electrotécnica

Internacional)

ISO International Society of Normalization (Organización Internacional de

Normalización)

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry (Unión

Internacional de Química Pura y Aplicada)

LSD Lysergic acid diethylamide (Dietilamida de ácido lisérgico)

MDA 3,4-metilendioxianfetamina

MDE 3,4-etilendioxietilanfetamina

MDMA 3,4-metilendioximetanfetamina

MP Ministerio Público

XIV

MS Mass Spectrometry (Espectrometría de masas)

OMS Organización Mundial de la Salud

PCP Phencyclidine (Fenciclidina)

POE Procedimiento Operativo Estandarizado

PVC Polyvinyl chloride (Policloruro de vinilo)

Rf Retention Factors (Factor de retención)

RIA Radioimmunoassay (Radioinmunoensayo)

SAT Sistemática analítica Toxicológica

SCD Sulfur Chemiluminescence Detector (Detectores de

quimioluminiscencia del azufre)

SNC Sistema Nervioso Central

TCD Thermal conductivity detector (Detectores de conductividad térmica)

THC Tetrahidrocannabinol

TID Thermionic Ionization Detector (Detectores termoiónicos)

TMB Tetrametilbenzidina

UCV Universidad Central de Venezuela

UNODC United Nations Office on Drugs and Crime (Oficina de las Naciones

Unidas contra la droga y el delito)

XV

GLOSARIO DE TÉRMINOS

Drogas: En farmacología se refiere a toda sustancia química que modifica los

procesos fisiológicos y bioquímicos de los tejidos o los organismos y

coloquialmente puede referirse a sustancias psicoactivas. Las drogas pueden

ser lícitas o ilícitas. [1]

Drogas ilícitas: Son sustancias psicoactivas cuya producción, venta o

consumo están prohibido. [1]

Drogas lícitas: Son drogas que están legalmente disponibles mediante

prescripción médica. [1]

Experticia: Es el documento emitido del examen de una persona u objeto para

descubrir o valorar elementos de convicción. [2]

Experto ó Perito: Persona especialmente cualificada en virtud de sus

conocimientos especializados en la ciencia, arte, técnica ó práctica. [3]

Sangre pura o completa: Fluido que circula a través de las arterias, capilares y

venas. Compuesta de plasma, células rojas (eritrocitos) y células blancas

(linfocitos, leucocitos, plaquetas, etc.) [4]

Sustancia psicoactiva: Sustancia que cuando se ingiere afecta a los procesos

mentales. Ejemplo: afecta a la cognición o afectividad. [1]

Sustancia tóxica, tóxico ó veneno: Sustancia o agente físico que es capaz de

producir efectos adversos sobre los organismos vivos. Toda radiación física ó

XVI

agente químico que tras generarse internamente o entrar en contacto, penetrar

o ser absorbido por un organismo vivo, en dosis suficientemente alta, puede

producir un efecto adverso o indirecto en el mismo. [5]

Toxicología: Es la ciencia que estudia las sustancias químicas y los agentes

físicos que son capaces de producir alteraciones patológicas a los seres vivos.

[5]

Xenobióticos: Sustancia extraña o ajena al organismo. [6] Cualquier sustancia

que ingresa al organismo y que no es uno de sus componentes naturales. [5]

1

1. INTRODUCCIÓN

El creciente uso de los sistemas de gestión de calidad ha producido un

aumento en la necesidad de asegurar que los laboratorios, puedan funcionar de

acuerdo con un sistema de gestión que cumplan con las Normas de la

Organización Internacional de Normalización ISO 9001:2008 [7] y la Norma

Internacional ISO/IEC (Organización Internacional de Normalización/Comisión

Electrotécnica Internacional) 17025:2005 que establecen los requisitos

generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibración.

[8] Para dar cumplimiento a las normas antes mencionadas, los sistemas de

calidad deben ser aplicables en diferentes procesos como son: la obtención de

las muestras, el traslado, el almacenamiento, los análisis, la utilización de

equipos, la evaluación e interpretación de resultados; así como la presentación

de informes. Por lo tanto, los métodos y procedimientos en los laboratorios

deben estar establecidos, actualizados, documentados y accesibles para todo el

personal como garantía que el trabajo en ejecución está controlado y cumplen

con las normas de calidad internacionales. [9,10].

En tal sentido, las guías emanadas por la ISO, Sociedad de

Toxicólogos Forenses y la Academia Americana de Ciencias [11], Oficina de las

Naciones Unidas contra la droga y el delito (UNODC) y Organización Mundial

de la Salud (OMS); así como el Manual Único de Procedimientos en Materia de

Cadenas de Custodia de Evidencias Físicas [12], pueden servir como

normativas referenciales en los laboratorios de toxicología forense de

2

Venezuela para el análisis de fluidos biológicos en vivos* y así lograr la

acreditación que certifiquen la calidad de los resultados que estos laboratorios

emiten.

En Venezuela es el Ministerio Público (MP) quien puede ordenar la

práctica de la experticia de acuerdo a lo establecido en el artículo 223 del

Código Orgánico Procesal Penal (COPP). De acuerdo al artículo 225 del COPP

y artículo Nᵒ 467 del Código de Procedimiento Civil (CPC) expresan que los

resultados emitidos por los expertos deben rendirse por escrito ante el juez y los

mismos deben contener: La descripción detallada de lo que fue objeto la

experticia, los métodos o sistemas utilizados en el examen y las conclusiones a

las que se llegó. [13,14]

En base a esto cuando el MP realiza la solicitud de la experticia

toxicológica son los laboratorios de toxicología forense los encargados de emitir

dichos informes periciales. Los laboratorios constituyen un elemento importante

para el conocimiento de diferentes procesos como son: el diagnóstico de

intoxicaciones accidentales o voluntarias, la evaluación de exposición

profesional a sustancias tóxicas, el consumo de sustancias lícitas o ilícitas,

entre otras.

La aplicación de normas y criterios rigurosos en los laboratorios de

toxicología forense deben tomar en cuenta desde la calidad de los patrones y

reactivos utilizados hasta la obtención de resultados mediante el uso de

_________________

* El termino fluidos biológicos en vivos fue tomado del Manual Único de Procedimientos en Materia de Cadena de Custodia. [12]

3

pruebas confirmatorias. Para el cumplimiento de esto, es necesario contar con

profesionales especializados, equipos e instrumental adecuado, procedimientos

estandarizados y actualizados, que en conjunto configuran el perfil de eficiencia

y credibilidad que un laboratorio toxicológico forense amerita. [15]

Para realizar los procedimientos estandarizados deben seguirse las

directrices para la documentación de sistemas de gestión de la calidad

establecidas en la Norma ISO/TR 10013:2001, en la sección 4.5 describe la

estructura y el formato de los procedimientos documentados. Los

procedimientos deben contener: Titulo, propósito, alcance, responsabilidad y

autoridad, descripción de actividades, registros y anexos necesarios. [16]

Actualmente los laboratorios de Toxicología Forense en Venezuela carecen

de documentos que contengan organigramas de la estructura organizativa y

jerárquica del personal, manuales y procedimientos operativos estandarizados

que permitan normalizar las actividades que allí se realizan, tal como lo

establecen las normas ISO 9001:2008 e ISO/IEC 17025:2005, las cuales

especifican que todos los procedimientos en el área de trabajo deben estar

normalizados. Surgiendo así, la necesidad de realizar e implementar un manual

de procedimientos que describa todos los procesos que se realicen en el área,

con el fin de tener a disposición del personal un documento de consulta que

indique las actividades que deba realizar, manteniendo uniformidad en los

procedimientos para mejor calidad y confiabilidad de los resultados reportados.

Debido a la importancia que tienen estos laboratorios, para ayudar a los entes

de justicia a esclarecer y dar celeridad a casos que ameriten la investigación

toxicológica en el ámbito legal.

4

2. MARCO TEÓRICO

2.1 Marco Legal:

El consumo de drogas se ha intensificado en varios países en los últimos

años, aumentando también su accesibilidad, sus implicancias en el

comportamiento social y la importancia de su determinación clínica y forense.

[17]

En Venezuela en el ámbito penal es el MP quien solicita la evaluación de

la persona u objeto y exige la emisión de la experticia al ente correspondiente,

la experticia es considerada un medio de prueba contentiva de un dictamen e

informe de personas con conocimientos especiales en una materia

determinada, sobre personas, cosas o situaciones relacionadas sobre los

hechos del proceso, con el fin de cooperar en la apreciación técnica de la

misma. El documento contiene la descripción de la persona u objeto a estudiar,

la relación detallada de todas las operaciones practicadas, los métodos

científicos o técnicos utilizados para emitir el dictamen y las conclusiones

alcanzadas. [18]

La experticia es realizada por un perito en el área de su especialidad,

siendo la figura del Experto o Perito una persona con conocimientos científicos

o artísticos que pueda mediante el uso de sus conocimientos y habilidades

ayudar a esclarecer casos en el ámbito legal. [2,18,19]

De acuerdo a la Constitución de la República Bolivariana de Venezuela en

su artículo 285 el cuál enuncia:

5

Art. 285. “ Son atribuciones del Ministerio Público: Ordenar y dirigir la

investigación penal de la perpetración de los hechos punibles para hacer

constar su comisión con todas las circunstancias que puedan influir en la

calificación y responsabilidad de los autores o las autoras y demás

participantes, así como el aseguramiento de los objetos activos y pasivos

relacionados con la perpetración”. [20]

También en el COPP se establecen los lineamientos necesarios para

solicitar una experticia, los cuales se indican en sus artículos 223, 225 y 265

que enuncian:

Art. 223. “El Ministerio Público realizará u ordenará la práctica de experticias

cuando para el examen de una persona u objeto, o para descubrir o valorar un

elemento de convicción, se requieran conocimiento o habilidades especiales en

alguna ciencia, arte u oficio. El o la fiscal del Ministerio Público, podrá señalarle

a los o las peritos asignados, los aspectos más relevantes que deben ser objeto

de la peritación, sin que esto sea limitativo, y el plazo dentro del cual

presentarán su dictamen”.

Art. 225. “El dictamen pericial deberá contener; de manera clara y precisa, el

motivo por el cual se practica, la descripción de la persona o cosa que sea

objeto del mismo, en el estado o del modo en que se halle, la relación detallada

de los exámenes practicados, los resultados obtenidos y las conclusiones que

se formulen respecto del peritaje realizado, conforme a los principios o reglas

6

de su ciencia o arte. El dictamen se presentará por escrito, firmado y sellado,

sin perjuicio del informe oral en la audiencia”.

Art. 265. “El Ministerio Público, cuando de cualquier modo tenga conocimiento

de la perpetración de un hecho punible de acción pública, dispondrá que se

practiquen las diligencias tendientes a investigar y hacer constar su comisión,

con todas las circunstancias que puedan influir en su calificación y la

responsabilidad de los autores o autoras y demás partícipes, y el

aseguramiento de los objetos activos y pasivos relacionados con la

perpetración”. [13]

Los artículos antes mencionados expresan la necesidad de realizar una

experticia de manera rápida y con resultados confiables debido a la repercusión

que tienen éstas para dar celeridad y esclarecer casos en el ámbito legal. Una

vez que el MP solicita la experticia toxicológica obedeciendo a los artículos

dispuestos en el COPP, son los laboratorios de toxicología forense los

encargados de emitir dicho informe, requiriendo como paso principal para la

recepción y resguardo de las muestras biológicas, el cumplimiento del Manual

Único de Procedimientos en Materia de Cadena de Custodia de Evidencias

Físicas. [12]

El cumplimiento de la cadena de custodia de las muestras es de suma

importancia para garantizar la preservación de las mismas, dicho instrumento

contiene los pasos o procedimientos legales que van dirigidos a vigilar la

correcta manipulación de las evidencias físicas con el fin de proteger y

garantizar su originalidad. [19]

7

De acuerdo al MP la cadena de custodia garantiza el manejo idóneo de las

evidencias, con el objeto de evitar su modificación, alteración o contaminación,

desde el momento de su ubicación en el sitio del suceso, su trayectoria por las

distintas dependencias de investigaciones penales, la consignación de los

resultados ante la autoridad competente, hasta la culminación del proceso

penal. [12] En los laboratorios toxicológicos forenses el cumplimiento de la

cadena de custodia por parte de las personas que manipulen las muestras es

fundamental ya que garantiza el resguardo de las mismas desde el momento de

la toma, transporte y preparación para realizar los análisis correspondientes.

[21]

En cuanto a la protección de evidencias físicas de las muestras tomadas a

personas vivas dicho manual indica que se les tomará determinadas muestras

de fluidos biológicos en laboratorios bioanalíticos, toxicológicos, hospitales,

clínicas, servicio médico-forense, entre otros, por personal calificado y

entrenado para tal fin, donde se aplicarán las medidas de bioseguridad

pertinentes (identificación de la muestra para evitar el intercambio de una

muestra por otra, uso de tapabocas, guantes e instrumentos esterilizados). [12]

2.2 Toxicología Forense:

En general la toxicología estudia las sustancias químicas y los agentes

físicos capaces de producir alteraciones patológicas a los seres vivos. También

estudia los mecanismos de producción de tales alteraciones y los medios para

8

contrarrestarlas; así como los procedimientos para detectar, identificar y

determinar tales agentes y prevenir el riesgo que representan. [5]

La toxicología forense pertenece a una unidad forense, siendo ésta una

entidad legal o parte definida de una entidad jurídica que realiza cualquier parte

del proceso de la ciencia forense. [22] Esta rama de la toxicología se ocupa de

los aspectos médicos-legales de las intoxicaciones, incluyendo la detección y

cuantificación en muestras biológicas o de otro origen. [6]

Mediante la investigación de los expertos en los laboratorios de toxicología

forense se realiza la identificación y cuantificación de sustancias que produzcan

alteraciones a nivel de órganos y sistemas como el sistema nervioso central

(SNC), tracto gastrointestinal, riñón, hígado entre otros.

Para determinar la presencia de las sustancias en diferentes fluidos

biológicos, es importante conocer el tipo de muestra biológica a utilizar, las

diferentes sustancias a determinar; conociendo sus propiedades físicas y

químicas, su metabolismo y excreción del organismo, así como; los

procedimientos analíticos y técnicas instrumentales a utilizar para la

identificación y cuantificación de las mismas.

2.3 Muestras biológicas más comunes a emplear en los laboratorios de

toxicología forense in vivo:

Las drogas son detectadas en el organismo en diferentes muestras

biológicas: sangre u otro fluido biológico, obteniéndose así, pistas sobre la

historia clínica de la víctima o el acusado, incluso cuando son incapaces o

reacios a proporcionar esta información por sí mismos. [23]

9

La sustancia tóxica entra al sistema sanguíneo mediante el mecanismo de

absorción dado por el paso de un xenobiótico desde el exterior por las

diferentes rutas de entrada tales como: a través del tracto gastrointestinal

mediante la vía de administración enteral que incluyen todas las vías del canal

de alimentación como: sublingual, oral y rectal; por vía pulmonar a través de la

administración inhalatoria; por vía dérmica ó por vía de administración

parenteral que incluyen: intravascular (intra-arterial, intravenosa), intraperitoneal

e intramuscular; así como a través de las mucosas (sublingual, vaginal, nasal,

ocular), pasando luego de administrarse la sustancia a los fluidos biológicos.

La sangre es uno de los principales fluidos biológicos que distribuye los

xenobióticos por todos los tejidos del organismo, que de acuerdo a sus

afinidades fisicoquímicas son retenidos en mayor o menor grado en los distintos

órganos. [5,24]

La sangre, el suero o el plasma, son las muestras de elección en general

para la investigación; sin embargo esto no quiere decir que sea la muestra más

informativa, ya que muchos tóxicos desaparecen pronto de ella. Al igual que la

muestra de sangre la muestra de orina es de relevancia no solo para investigar

el consumo de drogas en individuos sino también por ser la forma de eliminarse

de un alto porcentaje de sustancias, al excretarse en ella diferentes principios

activos y/o sus metabolitos. [21]

Las drogas son eliminadas del organismo por el proceso de excreción sin

cambios o por conversión a sus metabolitos, los órganos excretores excluido el

pulmón, eliminan compuestos polares más eficientemente que sustancias con

alta solubilidad en lípidos, las drogas liposolubles en su mayoría no son

10

rápidamente eliminadas sino hasta ser metabolizadas a compuestos más

polares. [25]

La excreción de los tóxicos se efectúa por medio de la orina, bilis, heces y

una proporción de los compuestos volátiles son eliminados por el aire expirado,

siendo la excreción renal el mejor sistema de eliminación ya que por él se

excretan numerosos xenobióticos como lo son: sustancias hidrosolubles de bajo

peso molecular, sales metálicas, ácidos, bases, alcohol, cianatos, etc. [5]

2.4 Drogas más comunes a determinar en los laboratorios de toxicología

forense:

Las drogas actúan de forma diferente en el organismo ocasionando

reacciones en diferentes sistemas en especial en el Sistema Nervioso Central

del individuo, actuando de manera específica si solo afectan las células que

actúan por un mecanismo molecular único las cuales poseen receptores para

esa droga modificando selectivamente las funciones del SNC ó no específica

cuando producen efectos en diferentes células y actúan por diversos

mecanismos moleculares, las drogas no específicas pueden actuar como

depresores o estimulantes del SNC. [25]

A continuación se describen las drogas más comunes a determinar en los

laboratorios de toxicología forense clasificadas por el efecto que producen en el

SNC:

2.4.1 Drogas estimulantes del

Los estimulantes

actividad neuronal en el SNC. Estas sustancias tienen numerosos efectos

fisiológicos tales como: alteración de la frecuencia cardiaca, dilatación de

pupilas, elevación de la presión sanguínea, aumento de la transpiración y puede

provocar náuseas

agitación y alteraciones del juicio. Entre las sustancias que generan estos

efectos se encuentran: las anfetaminas, la cocaína, la cafeína, la nicotina y

supresores sintéticos del apetito

A continuación se describen las sustancias estimulantes del SNC de

mayor relevancia a ser investigadas en los laboratorios de toxicología forense:

2.4.1.1 Cocaína:

Es un alcaloide obtenido de

especies de Erythroxylum (Erythroxylaceae) o por síntesis de ecgonina, cuya

fórmula química se

Figura 1. [23]

11

Drogas estimulantes del SNC: cocaína y anfetaminas:

Los estimulantes son agentes que activan, potencian o au




provocar náuseas y vómitos. También pueden inducir el estado de alerta, la



supresores sintéticos del apetito. [9]



aloide obtenido de las hojas secas de Erythroxylum coca


ca se observa en la

Figura 1. Estructura química de la cocaína [23]

cocaína y anfetaminas:

son agentes que activan, potencian o aumentan la




y vómitos. También pueden inducir el estado de alerta, la





las hojas secas de Erythroxylum coca y otras


]

12

La cocaína es una droga estimulante administrada tradicionalmente por

esnifado, inyectado por vía intravenosa o por inhalación nasal, esta sustancia

administrada por inhalación pasa rápidamente a la circulación sistémica

alcanzando los tejidos en segundos, en los líquidos acuosos se hidroliza a

benzoilecgonina. El proceso de hidrólisis se da en la sangre donde la

colinesterasa presente en ella, hidroliza la cocaína para dar metilecgonina

(éster) y benzoilecgonina, hidrolizados posteriormente vía enzimática a

ecgonina, los metabolitos de la cocaína pueden observarse en la Figura 2.

La excreción vía urinaria de la cocaína y sus metabolitos dependerá del

pH urinario, entre 1-9% de una dosis intravenosa de cocaína consumida es

excretada dentro de las 24 - 48 horas posterior a la dosificación, siendo los

productos de mayor excreción la benzoilecgonina (35-54%) y éster

metilecgonina (32-49%).

La dosis letal mínima estimada es de 1,2 g pero personas susceptibles

han muerto con dosis de 30 mg cuando se aplica en las mucosas; los adictos

puede ser capaz de tolerar hasta 5 g al día. Los efectos tóxicos se han

observado con concentraciones en sangre en el rango de 0,25 a 5 mg/L y las

muertes se han producido con concentraciones de 1 mg/L o más. [23, 26]

13

Figura 2. Metabolitos de la cocaína [27]

La cocaína luego de su consumo puede producir diferentes alteraciones

clínicas en el individuo entre las cuales se encuentran:

• Fase I. Estimulación inicial: Síntomas observables para niveles de

cocaína en sangre superior a 0,4 mg/L presentándose efecto anestésico

local por absorción nasal entre 1 a 3 minutos luego del contacto con la

sustancia. Causando: euforia, aumento del pulso, taquicardia y

movimientos involuntarios de los músculos pequeños de la cara.

• Fase II. Estimulación avanzada: Se presenta entre 30 a 60 minutos luego

del consumo, observándose: aumento de la taquicardia, dificultades

respiratorias y aumento de la hipertensión. Los efectos se presentan para

niveles de cocaína en sangre entre 1

de coma en algunos casos.

• Fase III. Depresión: Fase más severa de la intoxica

presentarse luego de 1 a 2 horas después del consumo, causando grave

dificultad respiratoria, disminución de las funciones vitales, parálisis

muscular, inconsciencia y hasta la muerte. Estos efectos se pueden

observar en niveles de cocaína en

2.4.1.2 Anfetaminas y

Las anfetaminas son un líquido incoloro, poco volátil,

agua, etanol, cloroformo,

puede observarse en la

Figura

Las anfetaminas y sus derivados son utilizadas en terapéutica para el

tratamientos de desorden de hiperactividad y déficit

tratamientos cortos de depresión y para el

debido a sus efectos estimulantes y efectos

incrementado el abuso en e

Estas sustancias

generalmente administradas por vía oral, son liposolubles y se absorben

14

niveles de cocaína en sangre entre 1-2 mg/L, presentándose un estado

de coma en algunos casos.

Fase III. Depresión: Fase más severa de la intoxica




rvar en niveles de cocaína en sangre mayores a 3 mg/L.

Anfetaminas y Metanfetaminas:

Las anfetaminas son un líquido incoloro, poco volátil,

agua, etanol, cloroformo, éter, y muy soluble en ácidos, su estructura química

en la Figura 3. [23]

Figura 3. Estructura química de las anfetaminas. [


mientos de desorden de hiperactividad y déficit de atención, narcolepsia,

tratamientos cortos de depresión y para el control de la obesidad. Sin embargo

debido a sus efectos estimulantes y efectos de euforia en el individuo

incrementado el abuso en el uso de estas sustancias. [29]

Estas sustancias pertenecen al grupo de drogas estimulantes que son


2 mg/L, presentándose un estado

Fase III. Depresión: Fase más severa de la intoxicación puede




ngre mayores a 3 mg/L. [28]

Las anfetaminas son un líquido incoloro, poco volátil, soluble 1 en 50 en

éter, y muy soluble en ácidos, su estructura química

[23]


de atención, narcolepsia,

control de la obesidad. Sin embargo

en el individuo se ha

pertenecen al grupo de drogas estimulantes que son


15

rápidamente por el intestino y pueden ser detectadas en la orina luego de 20

minutos del consumo, a pH 6-7 de la orina aproximadamente 30% de la dosis

consumida es excretada de forma inalterada. La anfetamina sufre una

desaminación a fenilacetona y una oxidación a ácido benzoico, siendo el

producto final de excreción el benzoilglucurónido (ácido hipúrico) el cual

aparece como consecuencia de la conjugación del ácido benzoico con la glicina

y una pequeña cantidad es oxidada al norefedrina como se observa en la Figura

4.

Las metanfetaminas son bases fuertes y son administradas en dosis

orales de 10-15 mg aunque en casos de adicción la persona ingiere aprox. 2000

mg cada día, sus metabolitos pueden observarse en la Figura 5. [26] 44% de

las metanfetaminas se excretan sin cambios en forma de sus principales

metabolitos: anfetamina (6-20%) y 4-hidroximetanfetamina (10%).

Derivados de las anfetaminas y metanfetaminas son utilizados en la

actualidad debido a que presentan propiedades químicas y farmacológicas

diferentes a las de sus precursores. Algunos de estos derivados son: 3,4-

metilendioxianfetamina (MDA), 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA)

conocida por sus efectos alucinógenos y la 3,4-etilendioxietilanfetamina

(MDEA). [27]

16

Figura 4. Metabolitos de las anfetaminas. [27]

17

Figura 5. Metabolitos de las metanfetaminas. [27]

2.4.2 Drogas depresoras del SNC: Alcohol etílico, opiáceos y benzodiacepinas:

Los depresores son agentes que reprimen, inhiben o disminuyen la

actividad del SNC. Entre estas sustancias se encuentran: sedantes/hipnóticos,

opiáceos y neurolépticos, estas drogas hacen que las personas estén más

relajadas y menos conscientes de su entorno. Sus usos médicos incluyen la

sedación, inducción de sueño, hipnosis y anestesia general. Algunas sustancias

depresoras son: el alcohol, los anestésicos, las pastillas para dormir y los

fármacos opiáceos como la heroína, la morfina y la metadona. [9]

18

2.4.2.1 Alcohol etílico:

En terminología química, los alcoholes constituyen un amplio grupo de

compuestos orgánicos derivados de los hidrocarburos que contienen uno o

varios grupos hidroxilo (-OH). Siendo el etanol cuya estructura química puede

observarse en la Figura 6 uno de los compuestos de este grupo [1]. El etanol es

una molécula de hidrocarburo alifático incoloro, polar, soluble en agua y lípidos.

Figura 6. Estructura química del alcohol etílico [23].

En el organismo el etanol luego de ser ingerido se difunde rápidamente

por el torrente sanguíneo a través de las membranas celulares, absorbiéndose

en el tracto gastrointestinal (GI). El volumen promedio de distribución (Vd) del

etanol es de 0,6 L/kg, casi equivalente a la del agua.

Esta sustancia es capaz de distribuirse en todo el organismo penetrando

la barrera hematoencefálica y la placenta, ejerciendo sus efectos en la mayoría

de los órganos del sistema. La absorción del etanol a partir del tracto

gastrointestinal ocurre entre 30 a 60 minutos después de su ingestión y puede

ser retrasada por diversos factores como la presencia de: alimentos,

medicamentos ó condiciones médicas que inhiban el vaciamiento gástrico. El

estómago absorbe alrededor del 20% del alcohol ingerido y el resto de la

absorción se produce en el intestino delgado.

19

El etanol ingerido es metabolizado oxidándose más del 90%

primeramente a acetaldehído en el hígado y las células de la mucosa gástricas

por acción del alcohol deshidrogenasa (ADH) y luego a ácido acético por acción

del aldehído deshidrogenasa (ALDH) (ver Figura 7) y entre 5 a 10% es

excretado sin cambios por los riñones, los pulmones (aire expirado) y el sudor.

[25,29]

Figura 7. Metabolitos del alcohol etílico [29]

2.4.2.2 Opiáceos:

Los opiáceos son sustancias naturales o sintéticas con propiedades

farmacológicas similares a las de los derivados del opio. El opio es una

sustancia obtenida de Papaver somniferum que contiene diversos alcaloides

naturales como morfina, papaverina y codeína. Mediante la sustitución de 2

grupos acetilo de la morfina se obtiene su derivado diacetilmorfina conocida

como heroína. Los opiáceos y sus principales metabolitos se pueden observar

en la Figura 8. En general los opiáceos se absorben mal en el tubo digestivo,

estas sustancias se administran principalmente por vía intravenosa, rectal

aunque también pueden ser esnifados (absorción a través de la mucosa nasal)

ó administrado por vía oral como analgésico (Ej. la codeína).

20

La heroína se excreta por vía renal en forma de morfina, 6-

monoacetilmorfina, glucurónidos, heroína inalterada y normorfina. En sangre se

puede detectar glucurónido de morfina hasta 12-24 horas luego de la

administración de la heroína. [30]

Figura 8. Metabolitos de los opiáceos. [27]

21

2.4.2.3 Benzodiacepinas:

Las benzodiacepinas y sus derivados son utilizados como sedantes,

ansiolíticos y anti-convulsionantes. Sin embargo, han sido extensamente

utilizadas como sustancia de abuso. Son extensamente metabolizadas por el

hígado por N-alquilación y procesos de hidroxilación; y la mayor parte de la

dosis es eliminada en la orina. [26] Se han sintetizado más de 50 tipos de

benzodiacepinas, siendo las más utilizadas el diazepam, lorazepam,

alprazolam, temazapam, nitrazepam, triazolam, flunitrazepam, clonazepam,

lormetazepam, entre otras. Las benzodiacepinas más utilizadas y sus derivados

pueden observarse en la Figura 9.

Las benzodiacepinas pueden clasificarse mediante su tiempo de acción

entre las que se encuentran: acción corta (tiempo de vida media menor a 10

horas como: alprazolam, clotiazepam, loprazolam, Brotizolam, Midazolam, etc.);

acción intermedia (10 - 24 horas como: Clonazepam, Bromazepam,

Delorazepam, Flunitrazepam, etc.) y acción larga (mayor a 24 horas como:

Clordiazepam, Clobazam, Diazepam, flurazepam, Ketazolam, Nitrazepam, etc.).

[31]

22

Figura 9. Metabolitos de algunos tipos de benzodiacepinas. [31]

23

2.4.3 Drogas Alucinógenas:

Los alucinógenos son agentes químicos que alteran la percepción,

pensamientos, sentimientos, el sentido del tiempo y lugar, inducen delirios,

alucinaciones y paranoia. Los efectos adversos son frecuentes e incluyen

experiencias desagradables, atemorizantes y alucinatorias; ocasionando

trastornos en el estado de ánimo (ansiedad, depresión o manía). Las drogas

alucinógenas incluyen: la mezcalina, la ketamina, la dietilamida del ácido

lisérgico (LSD), y la psilocibina (la sustancia alucinógena del hongo Psilocybe),

fenciclidina (PCP), algunas anfetaminas e incluso la marihuana (∆9-THC) y el

hachís. [9]

Uno de los alucinógenos más utilizados es el ∆9-THC, siendo éste en

particular el principal responsable por la mayoría de los efectos psicológicos de

los productos del cannabis, el ∆9-THC y sus principales metabolitos pueden

observarse en la Figura 10.

Figura 10. Metabolitos del ∆9-THC. [27]

24

El cannabis contiene una compleja mezcla de muchos compuestos

llamados cannabinoides, cuyas estructuras químicas pueden observarse en la

Figura 11. Los cannabinoides están constituidos en su mayoría por: ∆-9-

tetrahidrocannabinol (THC), cannabinol (CBN), cannabidiol (CBD), ácido ∆-9-

tetrahidrocannabinolico, entre otros. La vía principal de administración del

cannabis se realiza por vía inhalatoria, siendo el ∆9-THC extensamente

metabolizado en el organismo por vía hepática y solo el 1% del cannabis

consumido es excretado por vía urinaria sin cambios.

Luego de 72 horas de fumar el cannabis aproximadamente el 50% de

la marihuana inhalada es excretada como metabolitos y el otro 50% es

distribuido a través del organismo fijándose en el tejido adiposo, excretándose

lentamente durante los días continuos. La mayor parte de esta sustancia es

excretada vía urinaria (25%) y fecal (65%).

La concentración de THC en plasma disminuye rápidamente debido al

almacenamiento de los metabolitos en el tejido adiposo, sin embargo su tiempo

de vida media es usualmente mayor a las 20 horas, incrementándose el tiempo

de excreción en consumidores crónicos. [23,27]

Figura 11. Estructuras

25

Estructuras químicas de los cannabinoides más comunes.

químicas de los cannabinoides más comunes. [32]

26

2.5 Proceso Sistemático Analítico Toxicológico (SAT) utilizado para extraer e

identificar las sustancias presentes en la muestra de interés:

Es necesario aplicar a las muestras el proceso SAT, el cual es un conjunto

de procedimientos analíticos, puntuales y bien planeados para determinar la

presencia o ausencia de sustancias de relevancia toxicológica, en una muestra

determinada. Son procedimientos metódicos o sistemáticos que mediante una

programación lógica, permitan aislar y detectar la presencia de grupos de

sustancias que posean características físico – químicas similares. Dicho SAT

debe comprender varias etapas:

1. Pre-tratamiento de las muestras: Aplicación de técnicas como la

homogenización, la desproteinización, la hidrólisis de conjugados, etc. Es

necesario realizar el pre-tratamiento debido a que en las muestras biológicas

los xenobióticos y sus metabolitos pueden encontrarse unidos a grasas y

proteínas celulares, o bien disueltos en el plasma y líquidos intra y

extracelulares, tanto en forma libre como en forma de conjugados. Cuando la

muestras es plasma u orina antes de efectuar las extracciones se realiza la

hidrólisis de los conjugados por vía química (ácida o alcalina) o enzimática;

aumentan así, el rendimiento de la extracción de tóxicos como los opiáceos,

fenotiazinas, cannabinóides, etc.

2. Extracción/Purificación: Realización de extracciones líquido-líquido, líquido-

sólido, micro extracción en fase sólida, etc. La separación o extracción de un

compuesto presente en una muestra líquida o sólida se realiza con disolventes

capaces de arrastrarlo y de separarlo de la muestra, tomando en consideración

27

que la solubilidad de un producto es función de su polaridad, de forma tal que

las sustancias iónicas o polares se disuelven en disolventes polares, y las no-

iónicas, no-polares o lipídicas lo hacen en disolventes apolares o lipófilos

tomando en cuenta también el carácter ácido o básico de la sustancia.

Las drogas en fluidos biológicos pueden separarse mediante extracciones

líquido-líquido, líquido-sólido ó sólido-líquido. En los casos donde la muestra

biológica sea líquida tal como la orina, el plasma ó la sangre se utiliza la

extracción líquido-líquido, agitando dicha muestra en embudos de decantación

ó mediante un extractor continuo líquido-líquido en caliente con el disolvente

orgánico apropiado.

Los extractos obtenidos de muestras biológicas suelen ser impuros debido

a que contienen una gran proporción de grasas, proteínas o albúminas, así

como pigmentos que son necesarios separar mediante la purificación. Para la

purificación de los extractos se han planteados numerosas fórmulas entre las

más útiles y con carácter general se encuentran:

• La precipitación de las albúminas con diferentes reactivos: Sulfato de

amonio, tungstato de sodio, ácido tricloroacético ó cloruro de aluminio.

• La precipitación de las albúminas con etanol o acetona con el fin de

eliminar la mayor cantidad de proteínas así como las grasas.

• Técnicas cromatográficas: cromatografía de columna, capa fina o

gaseosa preparativa.

• Técnicas basadas en el reparto diferencial en mezclas de disolventes

como agua-hexano, agua-acetonitrilo-hexano, entre otros.

28

• Digestión enzimática proteolítica.

En los laboratorios de toxicología forense es ideal que la muestra

hemática recibida sea la sangre total para realizar los estudios, y será el

analista el que decida de acuerdo al análisis que vaya a realizar si trabaja con la

sangre total o si separa por medio de centrifugación el plasma libre de

pigmentos.

Tomando en consideración que los xenobióticos son distribuidos por la

sangre a todos los tejidos del organismo y la mayor parte de ellos van disueltos

en el plasma o unidos a las proteínas y lipoproteínas séricas, al coagular la

sangre y separarse el suero puede presentarse pérdidas por arrastre por lo que

no es recomendable utilizar el suero para estos estudios.

La sangre total recibida debe estar sin coagular y sin hemolizar,

adicionada con fluoruro sódico sólido (5mg/mL) que al reaccionar con el calcio

presente en la sangre forma fluoruro cálcico insoluble, el cual impide la

coagulación y por ser inhibidor enzimático evita la fermentación y la

putrefacción. [5]

La presencia de proteínas en el plasma puede causar dificultades en la

extracción líquido – líquido de la droga, formándose emulsiones y precipitación

parcial que puede causar una confusa interfaz entre las dos capas formadas

durante la extracción. Por lo que las proteínas pueden ser precipitadas por

adición de ácido tricloroacético 10-20% o cinco volúmenes de un solvente

miscible con agua como acetonitrilo. [33]

Al utilizar orina para los estudios, hay que considerar que muchos

xenobióticos se eliminan mal por esta vía, por lo que el análisis puede o no ser

29

representativo, las ventajas es que este tipo de muestra no precisa la adición de

conservadores y es una matriz fácil de trabajar con pocas interferencias. [5]

Las muestras de orina puede requerir un tratamiento previo, a menudo

debe diluirse con agua o con un buffer antes de realizar el análisis. En algunos

casos, la hidrólisis ácida (para compuestos básicos) o hidrólisis base (para

compuestos ácidos) se utilizan para asegurar que los compuestos de interés

estén solvatados en la muestra, generalmente un ácido fuerte (por ejemplo

ácido clorhídrico concentrado) o base (por ejemplo 10M KOH) se agrega a la

orina. La orina se calienta por 15-20 minutos, luego se enfría y diluye con un

buffer, ajustando el pH apropiadamente para el análisis. También puede

utilizarse la hidrólisis enzimática que liberan compuestos enlazados. [33]

3. Análisis para la detección, identificación, confirmación y cuantificación de

sustancias:

Los análisis químicos realizados en los laboratorios de toxicología forense

pueden ser cualitativos o cuantitativos, el análisis químico cualitativo no sólo

tiene por finalidad conocer cuáles son los elementos que constituyen los

compuestos a analizar, sino también conocer como están ligados entre ellos los

átomos que forman las moléculas de dichos compuestos, individualizando los

grupos funcionales de las mismas. [34]

La identificación cualitativa de una droga o los metabolitos debería

basarse en la comparación directa de los datos analíticos del espécimen, con

los datos correspondientes de un patrón de referencia analizados al mismo

tiempo y en las mismas condiciones. [35]

30

Para realizar este tipo de análisis se pueden realizar técnicas orientativas

que sirven sólo de tamizado, como son los inmunoensayos, espectrofotometría

ultravioleta-visible, cromatografía sobre papel o capa fina, etc. [1,5]

En los análisis químicos cuantitativos se determina la cantidad de cada

elemento, presente en una sustancia o mezcla. Para efectuar el análisis

cuantitativo, es necesario conocer la composición cualitativa de las sustancias,

para obtener información sobre los grupos funcionales que se encuentran

presentes. [34]

Al realizar los análisis cuantitativos si la concentración del analito en una

muestra sobrepasa la concentración máxima de la curva de calibración, el

compuesto deberá diluirse y volver a analizarse.[35] Las técnicas confirmatorias

a utilizarse comprenden la cromatografía de gases (gas-líquido), cromatografía

de líquidos (líquido- líquido) de alta presión o resolución, espectrofotometría

infrarroja y los sistemas integrados de cromatografía de gases o líquido con

espectrometría de masas.

Es deseable que los procedimientos sean compatibles con un elevado

número de sustancias, en los laboratorios de nivel superior para abordar el

análisis de sustancias de diversa naturaleza como: medicamentos, drogas de

abuso, metales, plaguicidas, alcoholes, entre otros; se debe realizar más de un

SAT, debido a que existen muchas sustancias no detectables mediante un

único procedimiento. [1,5]

31

2.6 Procedimientos analíticos más utilizados en los laboratorios de toxicología

forense:

Los laboratorios toxicológicos deben disponer recursos instrumentales

variados para detectar diferentes sustancias en los fluidos biológicos. De

acuerdo a la Federación Mundial de Asociaciones de Centros Clínico-

Toxicológicos y de Centros de Control de Tóxicos, así como la Organización

Mundial de la Salud, sugieren clasificar los laboratorios de acuerdo a los

siguientes niveles de complejidad: nivel primario, intermedio y superior. Los

laboratorios toxicológicos son clasificados de nivel superior los cuales deben

contar con la mejor instrumentación científica y deben estar capacitados para

realizar los análisis toxicológicos de forma sistemática. [5,21,36]

Los laboratorios de toxicología forense al ser de nivel superior deben

implementar la Norma Internacional ISO/ IEC 17025:2005 “Requisitos generales

para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración” para

acompañar la gestión administrativa y técnica; permitiendo así, asegurar la

correcta identificación de las sustancias, garantizando la calidad de los

resultados emitidos. [37]

Los laboratorios toxicológicos forense para realizar los procedimientos,

deben seguir los parámetros establecidos en la norma ISO/IEC 17025:2005, la

norma indica que deben existir manuales de procedimientos que posean: a) la

teoría y principios del método, b) instrucciones para la preparación de los

reactivos, c) procedimientos analíticos detallados, d) instrucciones para la

calibración y control de los equipos, e) información sobre la seguridad que debe

32

tenerse al manipular los reactivos; así como procedimientos para la colección,

análisis y emisión de informes en el estudio de una muestra. [38]

Técnicas analíticas utilizadas en laboratorios de toxicología forense in vivo:

2.6.1 Pruebas de inmunoensayos:

Las pruebas de inmunoensayos son métodos de rutina para el análisis de

sustancias en fluidos biológicos y otras matrices. En los laboratorios se utilizan

pruebas de uso individual para el análisis de una muestra, así como sistemas

automatizados para analizar gran cantidad de muestras por día. En el análisis

de drogas la técnica de inmunoensayo utiliza un anticuerpo específico para la

droga o drogas que están siendo analizadas. [23]

Un inmunoensayo se basa en la interacción entre un antígeno con su

anticuerpo correspondiente. Existen pruebas de inmunoensayo donde el tóxico

presente en la muestra (antígeno) es marcado realizando su unión con su

anticuerpo correspondiente dando origen a la formación de un complejo, al

estar uno de los dos componentes de este complejo marcado, puede ser

detectado y cuantificado cuando se libere del complejo. Un esquema general de

los inmunoensayos puede ser:

T* + anticuerpo → [T* - anticuerpo]

[T* - anticuerpo] + Tóxico problema → [anticuerpo - tóxico] + T*

Donde T* es el tóxico marcado y dicho “tóxico” es la misma sustancia que

la muestra problema.

33

La naturaleza de la marca y luego la forma de detectarla, promueven

diferentes clases de inmunoensayo, cuya exactitud y sensibilidad estarán

limitadas por dos factores: la especificidad del anticuerpo y la sensibilidad del

detector utilizado. Los métodos donde se determina el compuesto marcado en

la propia mezcla de reacción se denominan inmunoensayos homogéneos

(EMIT, CEDIA, FPIA, etc.) mientras que aquellos donde se precisa la

separación del antígeno, para evitar interferencia con la marca del complejo se

denominan inmunoensayos heterogéneos (EIA, ELISA, RIA, etc.). [5,39]

El análisis mediante inmunoensayo enzimático heterogéneo (ELISA)

consiste en el enlace del anticuerpo a un microplato y el antígeno es marcado

con una enzima. La preparación del microplato consiste en colocar una cantidad

de la solución anticuerpo en buffer de bicarbonato, pH 9,0 y añadirlo a cada

pocillo del microplato dejándolo incubar usualmente 4 horas a temperatura

ambiente o toda la noche a 4 °C. Una vez el anticuerpo está fijo, el plato es

lavado y secado. Los microplatos pueden adquirirse como Kits los cuales

vienen secos y pre-revestidos con el anticuerpo.

Los ensayos mediante el uso de ELISA requieren de una separación

previa del antígeno-anticuerpo antes de la medida, el cual puede ser realizado

mediante el uso de microplacas de poliestireno o policloruro de vinilo (PVC)

contentivas de 96 formas tipo pocillos. Para el análisis la muestra (10-50 µL) es

añadida en el pocillo del microplato previamente revestido con el anticuerpo y

seguidamente se añade la solución buffer contentiva del analito marcado con la

enzima, se deja incubar el microplato a temperatura ambiente hasta permitir el

34

equilibrio entre el analito marcado con la enzima, el analito de interés y el

anticuerpo.

Luego del período de incubación el plato es lavado con buffer (paso de

separación) hasta remover la enzimas no enlazadas, quedando en el microplato

las enzimas y el antígeno enlazado. Posteriormente se añade al microplato

incubado una solución de peróxido de hidrógeno/TMB (Tetrametilbenzidina)

para desarrollar el color.

La principal ventaja de este tipo de inmunoensayo radica en que algunas

sustancias interferentes incluyendo los pigmentos de las muestras biológicas

pueden ser lavados del plato antes de la aparición del color en la reacción. [4]

Por su sencillez y rapidez, los inmunoensayos se han introducido en la

mayoría de los laboratorios clínicos y toxicológicos, aunque su utilidad es

innegable no deben tomarse como resultados definitivos, confirmando los

resultados obtenidos por otras técnicas instrumentales. Los inmunoensayos

toxicológicos pueden tener utilidad en operaciones masivas de detección de uso

de drogas, en la investigación del dopaje deportivo, entre otros. [5,39]

Las pruebas para la determinación de drogas han sido ampliamente

utilizadas en el análisis de las muestras de orinas y otras matrices biológicas

(sangre completa, suero, extracto de pelo, saliva y sudor) debido a su inherente

sensibilidad que proporciona los más bajos límites de detección requeridos para

el uso forense y la capacidad que ésta técnica tiene para afrontar los efectos de

la matriz. [23]

Entre las ventajas y desventajas de utilizar pruebas de inmunoensayos se

tienen (Tabla I):

35

Tabla I. Ventajas y desventajas de los Inmunoensayos. [5]

Ventajas Desventajas

Rapidez Poca especificidad

Poca manipulación de las muestras No distingue homólogos

Sensibilidad Posibilidad falsos positivos y

negativos

------ Poca aplicación cuantitativa

------ Inactivación de antisueros por pH,

detergentes, etc.

2.6.2 Microdifusión en cámara de Conway:

La microdifusión es un método de aislamiento del o los analitos, basado

en la liberación de un compuesto volátil de una muestra mediante un reactivo

liberador colocado en el compartimiento exterior de la cámara de Conway

(Figura 12).

Este método permite identificar los tóxicos volátiles, requiere poca

cantidad de muestra y no necesita purificación previa de la muestra u otros

tratamientos especiales. El compuesto volátil liberado es atrapado por el

reactivo fijador colocado en el compartimiento interno de la cámara. Una vez

añadidos a la cámara los reactivos y la muestra problema en los diferentes

compartimientos, se tapa y se deja incubar por un tiempo a temperatura

adecuada (2-5 horas a temperatura ambiente o menor tiempo a 37 ºC) hasta

completar la difusión del analito a investigar desde el compartimiento externo al

interno.

36

La concentración del compuesto se calcula en la mayoría de los casos por

espectrofotometría, mediante comparación de la absorbancia con las curvas de

calibración previamente preparadas con estándares de concentración conocida.

La cámara de conway puede ser de vidrio, de porcelana o de plástico,

aunque para el caso de los fluoruros debe usarse policarbonato ya que los

fluoruros corroen el vidrio. La tapa y el borde de la cámara se untan con

vaselina o vaselina siliconada para asegurar un cierre hermético. [40,41]

Figura 12. Cámara de Conway. [41]

Como premisa fundamental en las áreas científicas y forenses, la

detección o identificación inicial de una droga o sustancia tóxica debe ser

confirmada por varias técnicas combinando pruebas de orientación como las

descritas anteriormente (inmunoensayo, microdifusión de conway) como

pruebas de certeza basadas en un principio físico-químico diferente como son

los métodos cromatográficos.

Las técnicas de confirmación por excelencia son las cromatografías de

gases (CG) o la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), la

espectrofotometría de masas (MS), entre otras. Siendo ellas herramientas

37

fundamentales para el análisis toxicológico orgánico y deben contar a su vez

con detectores idóneos para realizar la cuantificación de los distintos tipos de

compuestos. [21]

A continuación se describen las técnicas analíticas más utilizadas en los

laboratorios de toxicología forense:

2.6.3 Cromatografía:

La Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) describe la

cromatografía como un método físico de separación, los componentes a

separar se distribuyen entre dos fases, una que permanece inmóvil (fase

estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección

determinada a través de la primera. [42,43] La cromatografía agrupa un

conjunto importante y diverso de métodos, que permiten separar componentes

estrechamente relacionados en mezclas complejas, lo que en muchas

ocasiones resulta imposible por otros métodos.

En todas las separaciones cromatográficas, la muestra se desplaza en

una fase móvil, que puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico el cuál

es una sustancia que posee temperaturas y presiones por encima de sus

puntos críticos. La fase móvil se hace pasar por una fase estacionaria con la

que es inmiscible, y que se fija a una columna o a una superficie sólida. Los

componentes de la muestra se van a distribuir de manera diferente entre las

dos fases dependiendo de la afinidad que tengan con una u otra fase. Como

consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se

38

separan en bandas las cuales pueden analizarse cualitativa y/o

cuantitativamente. [44]

La cromatografía se divide en varías categorías en función del mecanismo

de interacción del soluto con la fase estacionaria y se pueden definir como:

1) Cromatografía de adsorción: Usa una fase estacionaria sólida y una fase

móvil líquida o gaseosa. El soluto se adsorbe en la superficie de las

partículas sólidas, cuanto más fuertemente se adsorbe un soluto, más

lentamente atraviesa la columna.

2) Cromatografía de reparto: Utiliza una fase estacionaria líquida, en forma de

una fina película de alto punto de ebullición sobre la superficie de un

solvente sólido, que en cromatografía de gases es típicamente la cara

interna de la columna de cromatografía (sílice). El soluto está en equilibrio

entre el líquido estacionario y la fase móvil.

3) Cromatografía de intercambio iónico: En este tipo de cromatografía existen

aniones como –SO3- o cationes como –N(CH3)3

+ , covalentemente unidos a

la fase estacionaria sólida (resina). Los iones en disolución de carga

opuesta son atraídos a la fase estacionaria por fuerzas electrostáticas. La

fase móvil es un líquido.

4) Cromatografía de exclusión molecular: La técnica también llamada

cromatografía de filtración por gel o permeación por gel, separa moléculas

por su tamaño. Las moléculas de mayor tamaño pasan más rápidamente

que las de menor tamaño, sin existir interacción entre la fase estacionaria y

el soluto. En éste caso la fase móvil, líquida o gaseosa pasa a través del gel

39

poroso, las moléculas grandes pasan sin entrar en los poros por lo que

salen más rápido y las más pequeñas tardan más tiempo en pasar a través

de la columna porque penetran dentro del gel y por consiguiente deben

atravesar más volumen antes de abandonar la columna.

5) Cromatografía de afinidad: Emplea interacciones específicas entre una

clase de moléculas de soluto y una segunda molécula que está unida

covalentemente (inmovilizada) en la fase estacionaria. Por ejemplo, la

molécula inmovilizada podría ser un anticuerpo unido a una proteína

determinada, si se pasa a través de la columna una mezcla que contiene un

millar de proteínas, sólo la proteína que reacciona con el anticuerpo se fija a

la columna. Después de lavar los demás solutos de la columna, se libera la

proteína deseada modificando el pH o la fuerza iónica. [45]

Es importante mencionar que el tiempo que tarda un componente desde la

inyección de una mezcla hasta que el mismo llega al detector se denomina

tiempo de retención (tr), y el volumen de fase móvil necesario para eluir un

soluto determinado de una columna cromatográfica se denomina volumen de

retención (Vr). En una columna cromatográfica la fase móvil no retenida

atraviesa la columna en el mínimo tiempo posible, este tiempo se denomina

tiempo muerto identificado con el símbolo tm.

Todos estos parámetros son decisivos a la hora de elucidar un compuesto

mediante el uso de algunas de las técnicas cromatográficas, ya sea de manera

cualitativa y/o cuantitativamente. [45] En las secciones siguientes se definirán

40

las técnicas cromatográficas más utilizadas en los laboratorios de toxicología

forense.

2.6.3.1 Cromatografía de Capa Fina (CCF):

Se emplea una capa plana y relativamente delgada de un material

adherente de partículas finamente divididas que recubre una superficie de

vidrio, plástico o metal; esta capa constituye la fase estacionaria. [44] El

material adherente puede ser de alúmina (Al2O3) o gel de sílice (ácido silícico,

SiO2xH2O) ambos adsorbentes aunque son diferentes actúan esencialmente del

mismo modo efectuando la separación por retención de los componentes sobre

la superficie, la acción capilar del absorbente hace subir el disolvente desde un

depósito situado en la parte inferior de la placa. [46]

La fase móvil en CCF consiste en un solvente o una mezcla de solventes,

debido a la gran variedad de fases móviles o estacionarias que se pueden

utilizar, ésta técnica puede ser una herramienta versátil para resolver sistemas

con varios tipos de compuestos. [47]

La fase móvil se mueve a través de la fase estacionaria por capilaridad, a

veces ayudada por gravedad o por aplicación de un potencial eléctrico. Las

ventajas de utilizar este procedimiento son la rapidez y el bajo costo de los

ensayos experimentales. [44]

El procedimiento básico en CCF consiste en seguir los siguientes pasos:

1) La solución contentiva de la muestra se aplica en la placa con un diámetro

de punto pequeño.

41

2) Se deja evaporar sobre la placa cromatográfica, el solvente utilizado para

retomar la muestra mediante la aplicación de pequeños puntos de muestras

aplicados con un capilar o microcapilar.

3) La placa se coloca en una cámara cerrada contentiva de la fase móvil en su

parte inferior.

4) La fase móvil asciende por capilaridad a través del punto aplicado.

5) Se continúa el desarrollo hasta el frente de solvente. El frente de solvente

estará a 10-15 cm del origen de la placa.

6) Se retira la placa de la cámara y se marca el frente del solvente.

7) Se elimina la fase móvil de la placa por secado al aire o aplicando calor.

8) Si los compuestos no se colorean naturalmente o son fluorescentes, se

aplica un reactivo de detección para visualizar las manchas.

9) Las posiciones de las manchas se utilizan para la identificación cualitativa

de compuestos y el tamaño e intensidad de las mismas pueden servir para

la cuantificación.

En la Figura 13 se ejemplifica la técnica de CCF donde se muestra en (a)

La aplicación de las disoluciones en la placa, (b) El desarrollo de la placa y en

(c) La determinación del Rf.

42

Figura 13. Etapas en el empleo de la técnica de CCF. [46]

La cromatografía de capa fina puede ser en fase normal donde la capa

(sílica o alúmina) es más polar que la fase móvil, entonces los compuestos

polares se unen más fuertemente cerca del origen de la placa ó en fase reversa

donde la capa de sílica gel se impregna con un aceite mineral o con

hidrocarburos de C2-C18, siendo menos polares que la fase móvil reteniéndose

más fuertemente los solutos no polares.

Las placas de CCF son generalmente de 20 x 20 o 20 x 10 cm, y el grosor

de la misma para propósitos analíticos son de 0.1- 0.3 mm y más comúnmente

de 0.2-0.25 mm. Para la activación de la placa de sílica gel se recomienda

calentarla por 30 minutos a 120°C con el fin de remover el agua adsorbida de la

atmósfera. Si la placa es de alúmina se debe calentar por 30 minutos a 75-

110°C para activarla para la adsorción. [41, 47]

Una vez localizadas las sustancias de interés sobre la placa, debe medirse la

distancia del o los compuestos desde la posición que ocupan hasta el origen de

43

la placa, de esta manera se compara la distancia recorrida por la muestra con la

distancia recorrida por el disolvente. Dicha diferencia es conocida como el factor

de retención y viene dado por la ecuación n° 1.

�� = �� (�� )�� (�� )

El valor de Rf que se obtiene depende del disolvente empleado, del

espesor del adsorbente, del tipo de capa (gel de sílice, alúmina, etc.), y en

menor extensión de la temperatura. [46]

Luego de desarrollar la placa cromatográfica y secado el solvente utilizado

para desarrollarla se examina debajo de la luz ultravioleta a 254 y 366 nm, se

observa la presencia de algún componente fluorescente y luego se pueden

utilizar reactivos de detección química que generalmente proporcionan

información más útil en la toxicología analítica. [41] Los datos de un solo

cromatograma no proporcionan la información suficiente para poder identificar

las distintas especies presentes en una mezcla. Además, siempre existe la

posibilidad de que dos solutos diferentes puedan presentar valores de Rf

idénticos o casi idénticos en unas condiciones determinadas.

Uno de los métodos que a menudo proporciona una identificación

experimental de los componentes de la muestra, consiste en aplicar a la placa

la muestra desconocida y disoluciones de muestras purificadas de las especies

que probablemente puede estar presente en la muestra desconocida. [44] Si se

aplica directamente una muestra con un patrón sobre la misma placa de CCF y

(1)

44

se obtuvieran los mismos valores de Rf para ambos compuestos con dos o más

sistemas de disolventes, resultaría un buen indicio de evidencia de que ambos

compuestos poseen la misma estructura. [46]

2.6.3.2 Cromatografía de gases (GC):

La cromatografía de gases (CG) es la técnica analítica de separación que

ha experimentado un desarrollo vertiginoso desde sus inicios en los años

cincuenta. La técnica cromatográfica ofrece mejor poder de resolución para

compuestos orgánicos volátiles, su principal limitación se encuentra en la

labilidad térmica de los solutos, los mismos deben ser estables a la temperatura

requerida para su volatilización.

En cromatografía de gases la fase móvil es un gas, mientras que la fase

estacionaria puede ser un sólido adsorbente o un líquido retenido en un soporte

sólido (columna empaquetada) o impregnando las paredes de una columna

capilar (columna abierta). Se pueden distinguir 2 tipos generales de CG:

Cromatografía gas-sólido (CGS) el cuál se basa en la cromatografía de

adsorción donde el analito se adsorbe directamente sobre las partículas sólidas

de la fase estacionaria y la cromatografía gas-líquido (CGL) basada en la

cromatografía de partición, la fase estacionaria es un líquido no volátil que

recubre la pared interior de una columna o un soporte sólido. [45,48]

Como se puede observar en el diagrama de la Figura 14 en un

cromatógrafo de gases la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una

columna cromatográfica, la elución se produce por el flujo de una fase móvil de

gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografía la fase móvil no

interacciona con las moléculas del analito; su única función es la de transportar

el analito a través de la columna.

Figura 14

Uno de los pasos básicos para realizar un análisis por CG es la

preparación de la muestra

una matriz compleja, la pre

obtener una concentración suficiente para ser medida, la eliminación o

enmascaramiento de especies interferentes

una forma que pueda ser más fácilmente dete

transformación química del analito es la derivatización donde se transforman

químicamente compuestos no volátiles en volátiles para poder ser detectado

mediante la CG. [45

Para el análisis mediante CG

éstos no solo sirve

final de la columna, si

45

con las moléculas del analito; su única función es la de transportar

el analito a través de la columna.

14. Diagrama esquemático de un cromatográfo de gases


preparación de la muestra los cuales puede incluir la extracción de un analito de

iz compleja, la pre-concentración de analitos muy diluidos hasta


enmascaramiento de especies interferentes o la transformación del analito en

una forma que pueda ser más fácilmente detectable. Un ejemplo de



45]

Para el análisis mediante CG la escogencia del detector

no solo sirven para detectar la aparición de los picos de los analitos al

final de la columna, sino también para identificarlos. Los

con las moléculas del analito; su única función es la de transportar

esquemático de un cromatográfo de gases. [45]


puede incluir la extracción de un analito de

concentración de analitos muy diluidos hasta


o la transformación del analito en

ctable. Un ejemplo de



a escogencia del detector es fundamental,

para detectar la aparición de los picos de los analitos al

no también para identificarlos. Los detectores deben

46

cumplir con: una adecuada sensibilidad, buena estabilidad y reproducibilidad,

repuesta lineal para los solutos que se extiendan a varios órdenes de magnitud,

tiempo de respuesta corto e independiente del caudal, alta fiabilidad, manejo

sencillo, entre otros. Entre los diferentes tipos de detectores se encuentran:

1) Detectores de ionización de llama (FID)

2) Detectores de conductividad térmica (TCD)

3) Detectores de quimioluminiscencia del azufre (SCD)

4) Detectores de captura de electrones (ECD)

5) Detectores de emisión atómica (AED)

6) Detectores termoiónicos (TID), entre otros.

El detector FID es uno de los más utilizados en análisis toxicológicos

debido a que poseen una elevada sensibilidad (aprox. 10-13 g/s), un gran

intervalo de respuesta lineal (aprox. 107) y un bajo ruido. Este tipo de detector

consta de un quemador en donde el efluente de la columna se mezcla con

hidrógeno y con aire para luego encenderse eléctricamente.

La mayoría de los compuestos orgánicos cuando se pirolizan a la

temperatura de una llama de hidrógeno/aire, producen iones y electrones que

pueden conducir la electricidad a través de la llama, al aplicar una diferencia de

potencial entre los extremos del quemador y un electrodo colector situado por

encima de la llama, la corriente que resulta se dirige para su medida hacia un

amplificador operacional de alta impedancia.

La CG puede utilizarse para la purificación de compuestos orgánicos,

observándose la presencia de contaminantes por la aparición de picos

47

adicionales; las áreas de estos picos proporcionan un estimado del grado de

contaminación. También es un medio excelente para confirmar la presencia o

ausencia de un componente en una mezcla, siempre que se disponga de un

patrón. [44]

En el análisis forense la cromatografía de gases es ampliamente utilizada

debido a su alta sensibilidad, selectividad, resolución, rapidez y precisión. Las

áreas de mayor aplicación en ciencias forenses incluyen análisis de drogas

incautadas, detección de drogas de muestras biológicas, toxicología

postmorten, análisis de evidencias de trazas, análisis de explosivos, entre otros.

[49]

2.6.3.3 Cromatografía de gases (CG) acoplada a espectrometría de masas

(MS):

La cromatografía de gases a menudo se combina con otras técnicas

selectivas como la espectrometría de masas para la identificación de cientos de

componentes que están presentes en matrices naturales y biológicas. [44]

El acoplamiento de la CG con la espectrometría de masas se utiliza para

mejorar la resolución de muestras problemas. El acoplamiento tiene como

ventaja la identificación de picos cromatográficos en tiempo real haciendo

coincidir el espectro de masa desconocida contra un archivo de referencia.

[50,51]

Para realizar un análisis tanto el sistema cromatográfico como el

espectroscópico requieren de compuestos en estado gaseoso, altas

temperaturas, pequeños volúmenes de muestra (micro o nano gramos) y la

48

presión atmosférica en la salida del CG debe ser reducida a vacio de 1 a 10-6

torr antes de entrar al MS. En el sistema CG-MS las moléculas del analito

deben ser primero ionizadas para ser atraídas (o repelidas) por un apropiado

campo magnético o eléctrico. Existen numerosas técnicas de ionización, siendo

la de impacto electrónico (IE) la más utilizada debido a que la mayoría de las

muestras son vaporizadas y posteriormente ionizadas por ésta técnica. [43]

2.6.3.4 Cromatografía de gases con autoanalizador “headspace”:

El término “headspace” en cromatografía de gases se expresa como la

fase de vapor dentro de un contenedor sellado el cuál contiene un líquido o un

sólido. Usualmente el vapor esta encima del líquido o sólido en el tope del

contenedor, por lo que la extracción con dicho instrumento se refiere a la

recolección y análisis de esa fase vapor contenida. Típicamente la muestra

líquida o sólida es colocada en viales sellados y calentados a temperaturas

predeterminadas hasta alcanzar el equilibrio entre las fases, produciéndose una

mezcla de gases en la fase de vapor, luego una alícuota de éste es tomada y

transferida al cromatógrafo de gases para su separación y análisis de los

componentes. Este tipo de extracción es realizada a compuestos volátiles que

se encuentren dentro de matrices poco volátiles. [49,51]

2.6.3.5 Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC):

La cromatografía de líquidos de alta eficiencia es una de las técnicas

analíticas de separación ampliamente utilizada, la fase móvil es un líquido y se

requiere una instrumentación sofisticada para poder trabajar a altas presiones.

49

Esta técnica presenta alta sensibilidad y es de gran utilidad para la separación

de especies no volátiles o termolábiles. [44]

El sistema utiliza una presión elevada que fuerza al disolvente a pasar por

una columna que contiene partículas muy finas; consiguiendo así, separaciones

de gran resolución. El HPLC como se observa en la Figura 15 consta de un

sistema de suministro de disolvente, una válvula de inyección de muestra, una

columna de alta presión, un detector y un ordenador para controlar el equipo y

visualizar los resultados.

Las columnas utilizadas para la técnica son de acero o de plástico de

longitud 5-30 cm y poseen diámetros internos de 1-5 mm. Debido al alto costo

de las columnas y su fácil degradación por el polvo, partículas de la muestra o

del disolvente; se protege la entrada de la columna con una columna corta

denominada pre columna la cual contiene la misma fase estacionaria, quedando

retenidas en ella partículas finas y solutos impidiendo el paso de éstas a la

columna principal. [45]

Existen principalmente dos formas básicas

normal y HPLC en

en su polaridad. En HPLC fase normal la columna es empacada con un material

adsorbente de naturaleza polar por lo general

polar, por ejemplo: n

comúnmente para separar compuestos no polares o moderadamente polares. Y

el HPLC en fase reversa consiste en una fase

utiliza una fase móvil po

El HPLC es utilizado

termolábiles o de alto

tiene prácticas ventajas

50

Figura 15. Esquema de un HPLC. [44]

Existen principalmente dos formas básicas de HPLC

HPLC en fase reversa, ambas separan los componentes basándose


adsorbente de naturaleza polar por lo general de sílice, y la fase móvil es no

polar, por ejemplo: n-hexano o tetrahidrofurano. Este tipo de fase es utilizada


el HPLC en fase reversa consiste en una fase no polar soportada en la sílica y

utiliza una fase móvil polar como metanol y acetonitrilo. [52]

El HPLC es utilizado para el análisis de compuestos

alto peso molecular. En el análisis de drogas y otros venenos

prácticas ventajas debido a una gama de detectores

de HPLC: HPLC en fase

ambas separan los componentes basándose


sílice, y la fase móvil es no

xano o tetrahidrofurano. Este tipo de fase es utilizada


no polar soportada en la sílica y

]

para el análisis de compuestos hidrofílicos,

. En el análisis de drogas y otros venenos

tores que generalmente

51

puede conectarse en serie al equipo para facilitar el análisis de varios

compuestos. [4] Con el uso de esta técnica se eliminan problemas asociados al

uso de CG como la estabilidad térmica, masa molecular, polaridad de los

compuestos, etc. [36] La mayor ventaja de HPLC para el análisis forense es que

la muestra no necesita ser vaporizada, siendo entonces una técnica adecuada

para el análisis de explosivos orgánicos, LSD, entre otros. [52]

2.7 Calibración de instrumentos y equipos analíticos:

Los laboratorios deben cerciorarse del buen funcionamiento de los

equipos e instrumentos utilizados tales como: refrigeradores y congeladores,

hornos, balanzas, pH meter, equipos analíticos (CG, HPLC), etc. Así como

disponer de un registro escrito de información sobre el uso y mantenimiento

realizado al equipo. El funcionamiento de los equipos e instrumentos deben ser

comprobados regularmente, empleando procedimientos documentados. [35]

La calibración y funcionamiento de los instrumentos y equipos de

laboratorio pueden verse afectados por factores como: el paso del tiempo,

cambios en el entorno, envejecimiento de los componentes mecánicos, ópticos

o electrónicos, remplazo de piezas por reparaciones, etc. Afectando así los

resultados que se generen de ellos, por lo que deben implementarse en la

organización, verificaciones continuas del funcionamiento y calibración del

instrumental analítico utilizado tales como: balanzas, termómetros,

espectrómetros, CG, HPLC, entre otros.

52

Las calibraciones deben realizarse mediante la aplicación de métodos

validados, utilizando calibradores y patrones certificados. Generalmente los

procedimientos de calibración de equipos analíticos son descritos por el propio

fabricante, aportando también información sobre el mantenimiento y la

frecuencia con que deba realizarse.

Entre los parámetros de calibración para algunos instrumentos y equipos

de uso común en los laboratorios se tienen:

a) Refrigeradores y congeladores: Parámetro a calibrar: Temperatura.

Método: Uso de termómetro de precisión, manteniéndose la

temperatura dentro de una banda máxima de +5 grados de la

temperatura requerida. Intervalo de calibración: Continuamente.

b) Balanzas: Deben ser comprobadas para asegurar que estén limpias y

equilibradas en la superficie en que se encuentren. Parámetro a

calibrar: Exactitud. Método: Utilizar los pesos de referencia, siguiendo

una secuencia típica controlando el punto cero de la balanza con el

platillo vacío y a continuación poner en éste el peso de referencia

ajustando la lectura para que refleje el valor correcto en caso de

balanzas manuales y para el uso de balanzas automáticas

frecuentemente disponen de sistemas internos de calibrado de peso

realizando el control y ajuste al peso de referencia de forma

automática. Intervalo de calibración: diario, si no se utiliza diariamente

se debe controlar cada vez que se utilice.

c) Cromatógrafo de gases: Se deben realizar mantenimientos continuos

en: el septum, sistema de inyección, presión y filtros internos de

53

entrada del gas, nivel de la señal base y ruido de fondo. Parámetro a

calibrar y método: Temperatura del horno (Controlar la temperatura

colocando un termómetro de precisión lo más cerca posible del sensor

de temperatura del horno. Intervalo de calibración: Anual); Calidad de

la columna (Analizar estándares de uso cotidiano. Intervalo de

calibración: Mensual); Sensibilidad del detector, señal de base y ruido

de fondo (Analizar grupo de patrones de uso común y comparar con

resultados de controles anteriores. Intervalo de calibración: Mensual).

d) Cromatógrafo líquido de alta eficiencia (HPLC): Realizar

mantenimiento continuo que incluye cambio periódico de filtros

internos, en las líneas y en las columnas de almacenaje. Comprobar

exactitud de parámetros como la velocidad de flujo, la temperatura de

la columna y la composición del eluyente. Parámetro a calibrar y

método: Exactitud del flujo (Recoger en una probeta o frasco

volumétrico los efluyentes de la columna durante un tiempo adecuado.

Intervalo de calibración: antes de realizar un método estándar, oficial o

recomendado); Repetibilidad del flujo y precisión volumétrica del

inyector (Inyectar tres veces o más un grupo de estándares de uso

ordinario y medir precisión de los tiempo de retención y áreas de los

picos. Intervalo de calibración: Mensual o diaria dependiendo de la

necesidad del laboratorio); Coeficiente señal del detector/ruido

(Analizar grupo de patrones de uso común y comparar con resultados

de controles anteriores. Intervalo de calibración: Mensual). [53]

54

2.8 Patrones de referencia y reactivos:

Los patrones de referencias y reactivos utilizados en el laboratorio deben

cumplir con especificaciones de calidad y ser los adecuados para el

procedimiento que se ejecute. Deben estar debidamente rotulados indicando:

nombre, concentración, fecha de preparación y de caducidad, condiciones de

almacenamiento y avisos de peligro cuando sea necesario. Se deben

almacenar correctamente de acuerdo a las especificaciones que dispongan, con

el fin de garantizar su estabilidad e integridad; así como, ser manipulados

evitando contaminación del patrón o reactivo al utilizarse.

Los patrones de referencia adquiridos por el laboratorio deben estar

certificados (concentraciones de analitos certificadas mediante análisis) por un

órgano certificador. Si se carece de los patrones referenciales certificados

deberían utilizarse patrones de referencia comercial que contengan descripción

de su identidad química, pureza y concentración. De igual manera el laboratorio

deberá verificar la identidad y pureza de los materiales antes de utilizarlos. [35]

55

3. OBJETIVOS

Objetivo General:

Elaborar un Manual de Procedimientos para el desarrollo de una

experticia toxicológica forense en fluidos biológicos sangre y orina desde la

recepción hasta la emisión de los resultados en un laboratorio de toxicología

forense de Venezuela.

Objetivos Específicos:

1. Diseñar la estructura del manual con los procedimientos necesarios para el

cumplimiento de las solicitudes de experticias in vivo realizadas al

laboratorio de toxicología forense.

2. Desarrollar los procedimientos operativos estandarizados (POEs) para la

recepción y almacenamiento de muestras biológicas sangre y orina en los

laboratorios de toxicología forense.

3. Desarrollar el POE para la determinación cuantitativa de alcohol etílico en

muestras de sangre.

4. Desarrollar el POE para la determinación cualitativa de: opiáceos,

benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides y/o sus

metabolitos en muestras de orina.

56

5. Desarrollar los POEs para la determinación cuantitativa de: opiáceos

(codeína, morfina y su derivado diacetilmorfina (heroína)), benzodiacepinas,

cocaína, anfetaminas (3,4-metilenodioxianfetamina (MDA), 3,4-

metilelenodioximetanfetamina (MDMA) y 3,4-etilenodioxietilanfetamina

(MDEA)) y cannabinoides y/o sus metabolitos en muestras de sangre y/o

orina.

6. Desarrollar los procedimientos para la emisión de resultados de los análisis

obtenidos en los laboratorios de toxicología forense.

57

4. METODOLOGIA

El presente estudio correspondió a una investigación documental basada

principalmente en la indagación y recopilación bibliográfica de diferentes

normas y procedimientos establecidos por entes nacionales e internacionales,

con el fin de unificar los procedimientos que se realizan en los laboratorios de

toxicología forense en Venezuela para asegurar la calidad de los resultados que

se emiten.

Para elaborar el manual objeto de estudio se plantearon dos etapas

fundamentales: en la primera etapa se definió el área de estudio, población y

muestra y en la segunda etapa se realizó la elaboración del manual mediante el

diseño, desarrollo y organización final del mismo. A continuación se señalan

cada una de ellas:

4.1. Etapa 1. Determinación y definición del área de estudio, población y

muestra:

El área de estudio seleccionada para la elaboración del presente manual

fue el Laboratorio de Toxicología Forense, específicamente el área donde se

realiza la recepción, el análisis de muestras biológicas (sangre y orina)

provenientes de personas vivas y el desarrollo de las experticias.

Esta área fue escogida debido a la importancia que tienen estos

laboratorios, para ayudar a los entes de justicia a esclarecer y dar celeridad a

casos que ameriten la investigación toxicológica en el ámbito legal.

58

Para el presente estudio se trabajó con el 100% de la población constituida

por un total de 09 expertos.

4.2. Etapa 2. Elaboración del Manual:

Se realizó el diseño, desarrollo, organización y presentación final del

manual, cumpliendo los pasos siguientes:

4.2.1. Diseño y desarrollo del Manual:

El diseño y desarrollo del manual fue realizado mediante la ejecución de:

a) la revisión y diagnóstico del área de estudio y b) el diseño de los

Procedimientos Operativos Estandarizados (POEs) que estarían contenidos en

el manual elaborado. Una vez obtenidos los procedimientos que se realizarían

en el laboratorio de toxicología forense; y diseñados los respectivos POEs, se

procedió a redactar y organizar la información de cada uno de los aspectos que

conformaron el manual de procedimientos.

a) Revisión y diagnóstico:

Se realizó el levantamiento de información por diferentes técnicas e

instrumentos de recolección de datos, con el fin de obtener información de

utilidad para la elaboración de los POEs y formularios para el control de las

actividades que se realizaban en el área de estudio, para ello se utilizaron

técnicas como:

59

a.1) Observación de campo:

Se visitó el laboratorio de toxicología forense específicamente al área de

tratamiento de muestras de personas vivas, mediante el cual se observarían la

organización del laboratorio, los procedimientos realizados, la documentación

existente y las necesidades que presenta el área que deben ser solventadas.

a.2) Entrevista directa:

Se elaboró un cuestionario, el cual fue aplicado al personal experto de los

laboratorios de toxicología forense, a fin de obtener información completa y

directa de los procedimientos que se realizan para: la recepción, el

almacenamiento, el análisis de las muestras y la emisión de los resultados; así

como, la existencia de manuales de procedimientos, documentos o registros

que garanticen la conformidad de los procesos que allí realizan.

El cuestionario se sometió a la validación por parte de expertos y validación

estadística con el fin de certificar su contenido; permitiendo así, garantizar que

cada pregunta planteada contribuyera al logro de los objetivos establecidos en

la investigación.

El análisis de los resultados obtenidos en la encuesta fue realizado

mediante el uso de un método estadístico básico, calculando la frecuencia de

aparición de las respuestas expresadas en porcentaje (%), para cada pregunta

planteada. También fue realizado el análisis estadístico mediante el cálculo de:

el promedio de las respuestas obtenidas, media de la media y evaluación de las

respuestas mediante el uso de límites de control al 95% de confianza, entre

60

otros. Con el fin de observar la uniformidad de las respuestas dadas por los

encuestados para cada tópico contemplado en la encuesta.

El cuestionario diseñado (ver Anexo A) constó de 7 tópicos principales

permitiendo al entrevistado seleccionar: Si o No y observaciones para

complementar las respuestas en caso de ser necesario. El cuestionario abarcó

aspectos relacionados a la parte organizativa del laboratorio, las

responsabilidades del personal, los procedimientos y las técnicas analíticas

utilizadas para el análisis de las muestras.

El instrumento de medición se elaboró considerando los aspectos

nombrados a continuación:

1. Estructura del laboratorio.

2. Prácticas y procedimientos para la recepción de las muestras biológicas.

3. Prácticas y procedimientos para el almacenamiento de las muestras.

4. Prácticas y procedimientos para la determinación cualitativa de sustancias

en las muestras biológicas.

5. Prácticas y procedimientos para la determinación cuantitativa de sustancias

en las muestras biológicas.

6. Elaboración de la experticia toxicológica forense in vivo.

7. Procedimientos para el registro y respaldo de la información de los

resultados obtenidos.

El cuestionario fue entregado al personal de expertos que trabajan en el

área de estudio, y la información obtenida se analizó para detectar las

61

necesidades de infraestructura, recursos, equipos analíticos e instructivos de

trabajo que requieren los laboratorios de toxicología forense in vivo; conocer los

procedimientos que se realizaban y determinar los aspectos que serían

contemplados en el manual.

a.3) Investigación documental:

Se revisaron documentos contentivos de datos de interés para realizar los

procedimientos que conformaron el manual, tales como: documentos jurídicos,

normas ISO, guía para la elaboración de manuales de procedimientos,

manuales de procedimientos Nacionales e Internacionales, libros, revistas

científicas, documentos de recomendación de técnicas analíticas emanados por

diferentes organismos.

b) Diseño de los POEs:

Se diseñó la estructura de los diferentes POEs de acuerdo a la norma

ISO/TR 10013:2001, para el control de las actividades que se realizarían en el

área de estudio.

4.2.2. Organización del manual y presentación final:

Una vez seleccionados los organigramas de la institución, establecido el

marco legal y elaborado los POEs, se definió la estructura final del mismo

contemplando las siguientes secciones:

1. Introducción

62

2. Objetivo del manual

3. Área de aplicación y alcance de los procedimientos

4. Responsables

5. Normas de uso del manual

6. Definiciones

7. Organigramas propuestos

8. Marco Legal

9. Diagrama de flujo del proceso

10. POEs para:

• Procedimientos para la recepción y almacenamiento de las muestras.

• Procedimientos para el análisis cualitativo y cuantitativo de diferentes

sustancias en las muestras biológicas.

• Procedimientos para la elaboración de la experticia toxicológica in vivo.

• Procedimientos para el registro y respaldo de la información.

• Procedimiento de verificación de la calibración de equipos e instrumentos

de laboratorio.

11. Sistema de control de la documentación

12. Formularios

13. Apéndice

63

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1. Elaboración del Manual:

Para la elaboración del manual se realizaron los pasos descritos a

continuación:

5.1.1. Diseño y desarrollo del Manual:

Se recopiló y organizó la información necesaria que conformó el manual

de procedimientos y una vez diseñados los respectivos procedimientos

operativos estandarizados de acuerdo a las directrices dadas por la norma

ISO/TR 10013:2001, se procedió a redactar y organizar la información.

Se llevó a cabo como paso inicial la revisión y diagnóstico del área de

estudio, así como el diseño de los POEs, los cuales se detallan a continuación:

a) Revisión y diagnóstico:

Se realizó el levantamiento de información con el fin de obtener la

información necesaria para la elaboración del manual, para ello se aplicaron

diferentes técnicas e instrumentos de recolección de datos como son:

a.1) Observación de campo:

En la Tabla II se muestran los resultados obtenidos de la observación de

campo realizada al área de estudio, detallando las principales actividades tanto

analíticas como administrativas ejecutadas por el personal de expertos, la

documentación existente, la estructura organizativa del laboratorio; así como las

necesidades que presentan.

64

Tabla II. Resultados obtenidos de la observación de campo realizada en el área de estudio

Observación Descripción

Recepción de las

muestras biológicas

� Verificación del estado de la muestras. � Verificación de los rótulos. � Verificación del volumen de muestra recibida. � Concordancia de la información del rótulo de

la muestra con la documentación que la acompaña (oficio de solicitud del análisis, encuesta y planilla de cadena de custodia).

� Asignación del número de control a la muestra y documento para su fácil ubicación.

� Registro de los datos del oficio en el sistema digital del laboratorio.

Almacenamiento de las

muestras

� Organización de las muestras en cavas y gradillas dentro de refrigeradores evitando pérdidas o derrames.

� Verificación ocasional de la temperatura de refrigeración entre 2 - 8 °C.

� El remanente de las muestras se almacenan temporalmente mientras son analizadas, una vez se emite la experticia de quedar remanente de muestra las mismas son descartadas.

Análisis cualitativos y

cuantitativo de las

muestras

� Sustancias comunes a determinar: alcohol etílico, cocaína, opiáceos, anfetaminas, cannabinoides y benzodiacepinas, entre otras.

� Extracción líquido – líquido de las muestras variando solventes y pH de acuerdo a la sustancia a determinar.

� Técnicas analíticas cualitativas y cuantitativas utilizadas: CCF, microdifusión en cámara de Conway, Prueba rápida de un solo paso, espectroscopia UV-Visible, CG-FID y CG-MS.

� Reporte de los resultados obtenidos

65

anotándolos en el oficio de solicitud del análisis.

Emisión de la experticia

Toxicológica Forense in

vivo

� Registro por parte del experto de los resultados en los libros de control los cuales contienen: datos de la persona solicitante, procedencia, resultados obtenidos, fechas de entrega de la experticia para su transcripción, entre otros.

� Ingreso al sistema digital del laboratorio para anotar la fecha e iníciales del nombre y apellido del experto que va a asignar el oficio al personal de secretaría para su transcripción.

� Entrega al personal de secretaría del oficio de solicitud del análisis con los resultados reportados en él para su transcripción en el formato de experticia final que disponen para ello.

� Impresión de la experticia para su revisión por parte del experto.

� Firma de los expertos actuantes y sello de los 2 ó 3 folios de la experticia final.

� Resguardo de la documentación de la muestra (folio firmado de la experticia original, oficio, encuesta y cadena de custodia) en los archivos del laboratorio.

� Entrega de la experticia al ente correspondiente solicitándole documento de identidad u oficio emitido por el ente solicitante donde nombra a la persona que acude a retirar la experticia como correo especial.

Documentación existente

en el laboratorio

� Uso de libros de referencias como guías para realizar los análisis de las muestras.

� Uso de apuntes personales de los expertos para realizar las actividades.

� Uso de metodologías analíticas establecidas en el laboratorio por expertos antiguos

66

durante el transcurso de los años.

Necesidades del

laboratorio

� Falta de manuales de procedimientos para las diferentes actividades que se realizan.

� Falta de organigramas visibles en el laboratorio.

� Carencia de equipos instrumentales necesarios para garantizar la calidad de los resultados que se emiten.

� Carencia de espacios físicos adecuados para el almacenamiento de las muestras.

Los procedimientos realizados en el laboratorio objeto de estudio, que van

desde la recepción, el almacenamiento, el análisis de las muestras, hasta

redactar y entregar la experticia final al ente correspondiente; son llevados a

cabo por los analistas siguiendo en su mayoría directrices impartidas por

expertos de mayor antigüedad en el momento de inducción del personal al

ingresar a trabajar en el área, por apuntes personales del experto; así como se

observó utilizan libros de referencias afines al área y para algunos de los

procedimientos siguen las directrices generales establecidas por el Ministerio

Público para garantizar la cadena de custodia de la muestra en el laboratorio.

El manual único de procedimientos en materia de cadena de custodia y

evidencias físicas [12] específica que las muestras deben recolectarse en

recipientes preferiblemente de vidrio, herméticos, esterilizados, rotulados y en

cantidad suficiente de muestra para realizar los análisis; así como almacenarse

en un área adecuada prevista para ello. También establece de forma general el

uso de diferentes técnicas analíticas para la búsqueda de sustancias, las cuales

indica serán seleccionadas de acuerdo a la naturaleza de la muestra y

sustancias a analizar.

67

En cuanto a la cantidad de muestra el manual solo específica la cantidad

de sangre que se debe tomar, reflejando que debe ser mínimo 15ml. Manuales

de procedimientos internacionales como el emitido por el departamento de

Virginia – EEUU [54] sugiere se tome como mínimo 10ml de sangre indicando

que con menor cantidad de muestra no se podrían cubrir todos los análisis

requeridos por el ente solicitante. En cuanto a la cantidad óptima de orina el

manual único en materia de cadena de custodia [12] no hace referencia de una

cantidad en particular, por lo que otras organizaciones tal como la SOFT/AAFS

[11] sugiere que se tome un mínimo de 30ml de éste fluido.

De acuerdo a SOFT/AAFS [11], García-Rodríguez S y col. [21], Biancucci

y col. [40], Munich P y col. [55]; indican que los laboratorios de análisis tal como

lo es el laboratorio de toxicología forense, para emitir resultados confiables y

certeros deben tener entre otras cosas: personal calificado, conocer la

estructura de cargos y organizativa del laboratorio, contar con manuales que

normen los procedimientos que se realizan, tomar las muestras en recipientes

apropiados, almacenarlas refrigeradas y conservar el remanente de las mismas

por un período de 2 años.

También sugieren se aplique un tratamiento analítico sistemático

toxicológico (SAT) en donde se realice el pre-tratamiento de las muestras, la

extracción / purificación del analito y el análisis instrumental; los autores indican

que el laboratorio debe contar con técnicas e instrumentos analíticos capaces

de determinar de manera cualitativa y cuantitativa la sustancia de interés tales

como: reacciones químicas, pruebas rápidas, CCF, cámaras de Conway,

68

equipos de alta eficiencia como CG y HPLC con diferentes detectores para

realizar los análisis, entre otros.

Dada la importancia que tiene la experticia toxicológica forense in vivo en

diferentes ámbitos legales, los expertos realizan una serie de controles para

resguardar los resultados que obtienen hasta emitir la experticia final. De

acuerdo a la SOFT/AAFS [11] cada laboratorio debe establecer los controles a

seguir para el resguardo de la información obtenida las cuales deben ser

tratadas de manera confidencial hasta el momento de la entrega de los

resultados al ente correspondiente.

El método de recolección de información mediante la observación de

campo fue efectivo ya que permitió identificar los procedimientos que se

realizaban. Confirmó la necesidad de contar con procedimientos operativos

estandarizados y equipos analíticos instrumentales que permitieran cumplir con

los parámetros de calidad establecidos en las normas ISO 9001:2008 e ISO/IEC

17025:2005, las cuales son utilizadas para certificar estos laboratorios.

a.2) Entrevista directa:

Se diseñó el cuestionario para explorar las actividades que se realizaban,

las técnicas analíticas utilizadas y la disponibilidad de documentación con que

contaba el área de investigación. Obteniéndose así, el enfoque y los objetivos

que debían alcanzarse en el manual de procedimientos realizado.

De acuerdo a Hernández R y colaboradores [56] un instrumento de

recolección de datos permite registrar información o datos sobre las variables

69

que se tienen en mente y el mismo debe cumplir con tres requisitos esenciales:

la validez (grado en que un instrumento realmente mide la variable que

pretende medir), confiabilidad (grado en que un instrumento aplicado a un

mismo sujeto de manera repetida obtiene resultados iguales) y objetividad

(grado en que el instrumento es permeable a la influencia de los sesgos y

tendencias de los investigadores que lo administran).

El cuestionario realizado fue validado mediante la certificación por parte de

expertos, los cuales fueron seleccionados tomando en cuenta sus

conocimientos en el área de estudio; con el fin de obtener la opinión de

personas con trayectoria en el tema. De acuerdo a Escobar- Pérez y

colaboradores [57] la opinión de los expertos permitirá mediante sus

comentarios la validez y objetividad del contenido.

La certificación obtenida por parte de expertos (ver Anexo B) fue llevada

a cabo por tres profesionales de la Universidad Central de Venezuela

específicamente profesoras con conocimientos en: el área de la metodología de

la investigación, el aseguramiento de la calidad y la toxicología,

respectivamente. Mediante los comentarios aportados por las expertas durante

la validación, se garantizó que las preguntas contribuyeran a:

� Cumplir los objetivos planteados en la investigación.

� Preguntas con redacción clara, sin inducir al sesgo.

� Preguntas objetivas sin influencia de la opinión de la persona que las

diseño.

70

� Estructura del cuestionario cuidando la continuidad de las ideas mediante

el orden de aparición de las preguntas.

Logrando así que las preguntas planteadas fueran relevantes,

representativas y cumplieran con el propósito evaluativo para el cuál fue

diseñado el cuestionario.

La encuesta fue aplicada por duplicado en tiempos diferentes a los 09

trabajadores del área en estudio, con el fin de obtener la confiabilidad del

instrumento. Cabe destacar que no fue posible realizar la confirmación de la

confiabilidad del instrumento estadísticamente por el método test- retest

(método que permite medir la estabilidad del instrumento aplicando el

cuestionario a un mismo grupo de personas en 2 tiempos diferentes [56]),

debido a que la población de trabajo resultó ser pequeña y no estadísticamente

significativa.

Sin embargo se utilizó la prueba exacta de Fisher aplicada para

poblaciones pequeñas (ver Anexo C), la cual permitió conocer que no había

diferencias estadísticamente significativas, entre el número de respuestas

afirmativas dadas por los sujetos para cada tópico planteado en los 2 tiempos

de aplicación de la encuesta. Confirmando que independientemente del tiempo

de aplicación del cuestionario los sujetos respondieron consistentemente cada

tópico planteado corroborando así la confiabilidad del instrumento.

En la Tabla III y Tabla IV se expresan los parámetros estadísticos

calculados a partir de los resultados obtenidos de la encuesta, con el fin de

71

observar de manera general el comportamiento de las respuestas de los sujetos

en cada tópico planteado, para ello se calcularon: valores promedio de

respuestas por sujeto, media de la media, límites de control inferior y superior

para un 95% de confiabilidad.

En promedio los sujetos tenían la misma cantidad de respuestas

afirmativas para cada tópico planteado. Encontrándose uniformidad entre los

sujetos al dar sus respuestas y ubicándose éstas dentro de los límites de

control determinados. Demostrando que el instrumento diseñado permitió

indagar de manera efectiva sobre los objetivos planteados.

Tabla III. Valores Promedio (��), Error desviación estándar (σ) para cada sujetos y tópico planteado en la encuesta.

Sujetos Tópicos

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 �� Σ Error σ 1 0,75 0,80 0,33 0,46 0,13 0,56 0,50 0,504 0,233 0,088 2 0,25 0,80 0,33 0,31 0,25 0,67 0,57 0,454 0,223 0,084 3 0,50 0,80 0,22 0,46 0,13 0,56 0,64 0,472 0,234 0,088 4 0,50 0,87 0,22 0,46 0,13 0,56 0,64 0,482 0,250 0,094 5 0,50 0,80 0,22 0,46 0,13 0,56 0,64 0,472 0,234 0,088 6 0,50 0,80 0,22 0,46 0,13 0,56 0,64 0,472 0,234 0,088 7 0,50 0,80 0,22 0,46 0,13 0,56 0,64 0,472 0,234 0,088 8 0,50 0,80 0,22 0,46 0,13 0,56 0,64 0,472 0,234 0,088 9 0,50 0,80 0,22 0,46 0,13 0,56 0,64 0,472 0,234 0,088

Tabla IV. Valores de media de la media (��), límite inferior y límite superior para un nivel de confiabilidad del 95% obtenidos de las respuestas dadas por los expertos.

Parámetros Resultados

�� 0,47

Límite Inferior 0,34 Límite Superior 0,61 Límite de confiabilidad (%) 95

72

En la Figura 16 se muestra de manera gráfica las respuestas dadas por

cada experto en la encuesta, observándose uniformidad entre las respuestas

obtenidas y ratificando que el instrumento fue un medio de recolección de

información eficiente, fiable e importante para el estudio.

Éste método permitió recopilar información confiable sobre las

necesidades, las actividades y los procedimientos que se realizaban en los

laboratorios de toxicología forense. Permitiendo establecer los puntos que

fueron tratados en el manual diseñado objeto de este estudio

Figura 16. Valores promedios, límites de control inferior y superior para un 95% de confianza de las respuestas dadas por los expertos en cada tópico.

A continuación se presentan los resultados obtenidos de la encuesta por

tópico planteado, utilizándose para el tratamiento de los resultados un método

estadístico elemental, basado en el cálculo de la frecuencia de aparición de una

respuesta para cada pregunta y el porcentaje que ésta representaba.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Prom

edio

de

resp

uest

as

N° de expertos

Expertos

Promedio

Límite Inferior

Límite superior

73

En la Tabla V se pueden observar los resultados obtenidos de la encuesta

aplicada para el tópico 1.

Tabla V. Resultados para el Tópico 1. Estructura del laboratorio, del cuestionario aplicado al personal experto del laboratorio de toxicología forense in vivo.

1. ESTRUCTURA DEL LABORATORIO

N° Preguntas Si No OBSERVACIONES N° % N° %

1.1

Existe un organigrama del Laboratorio de Toxicología Forense (LTF). (De ser positiva su respuesta por favor indique en cual documento).

9 100

Existe el organigrama pero se desconoce el

documento que lo contiene

1.2

En caso de ser positivo, el organigrama del laboratorio se encuentra disponible para el personal que allí labora.

1 11,1 8 88,9

1.3

Se encuentra definida en algún documento la estructura de cargos que jerarquice la responsabilidad del personal en el LTF. De ser positiva su respuesta por favor indique en cual documento.

9 100

Se conoce la jerarquía por

sentido común pero no se sabe

de la existencia de un documento que

lo contenga

1.4

El personal experto conoce las funciones que debe realizar de acuerdo a su cargo

8 88,9 1 11,1 Se conocen de

forma verbal

El tópico indagó sobre la parte organizativa del laboratorio (preguntas n° 1.1

y 1.2), encontrándose que el 100% de los encuestados afirman, que debe existir

un organigrama del laboratorio de toxicología forense y el 88,9% de los

analistas desconocen cual documento lo contiene, lo que refleja la necesidad de

establecer como paso principal el organigrama de la institución en un

documento de trabajo de fácil acceso para el personal. De acuerdo a la

UNODC [35] para implementar un sistema de gestión de calidad en una

74

institución tal como lo es el laboratorio de toxicología forense debe estar

definida y establecerse en el manual de calidad, la estructura organizativa y

Directiva del laboratorio.

En cuanto a la estructura de cargos del personal y el conocimiento de las

funciones que debe realizar cada experto de acuerdo a su cargo (preguntas n°

1.3 y 1.4), el 100% del personal indicó que no conoce ningún documento donde

se muestre la jerarquía de cargos dentro del laboratorio de toxicología forense.

Señalando, que se conoce de forma informal la jerarquía de cargos respetando

la antigüedad entre los expertos. Así mismo, el 88,9% del personal indicó que

las funciones del cargo son conocidas de forma verbal mediante la divulgación

de la información entre los expertos.

Las respuestas indican la necesidad de establecer y divulgar entre el

personal experto la jerarquía de los cargos y establecer las funciones de cada

empleado, tal como lo sugieren diferentes organizaciones como la Oficina de

las Naciones Unidas contra la droga y el delito [35], la Sociedad de Toxicología

Forense (SOFT/AAFS) [11] y la Cooperativa Internacional para Acreditación de

Laboratorios (ILAC) [58] indicando que la Dirección es responsable de asignar

al personal las actividades a realizar de acuerdo a sus conocimientos y

habilidades particulares que le permitan desempeñarse correctamente en la

actividad que le corresponda.

La norma ISO 9001:2008 [7] en el punto 6.2 establece definir las funciones

de cargo del personal con el fin de asignar a cada experto actividades tomando

75

en cuenta su formación profesional y habilidades. Garantizando así, la calidad

de las actividades que se realicen en el área de estudio. También, la norma

ISO/IEC 17025:2005 [8] específicamente el punto 5.2.4, establece mantener

actualizados los perfiles de cargo de todo el personal.

A continuación en la Tabla VI se pueden observar los resultados obtenidos

de la encuesta aplicada para el tópico 2.

Tabla VI. Resultados para el Tópico 2. Prácticas y procedimientos para la recepción de las muestras, del cuestionario aplicado al personal experto del laboratorio de toxicología forense in vivo.

2. PRÁCTICAS Y PROCEDIMIENTOS PARA LA RECEPCIÓN DE LAS MUESTRAS


2.1

Posee el laboratorio de toxicología forense in vivo un manual de procedimientos donde se describan los pasos para la recepción de las muestras biológicas.

9 100

2.2

El manual de procedimientos se encuentra disponible para el personal.

9 100

2.3

Si no dispone de un manual de procedimientos, existe algún documento, guía de trabajo ó procedimientos escritos disponibles, donde estén contenidas las directrices a seguir para la recepción de las muestras.

2 22,2 7 77,8

Cada experto lleva sus

anotaciones, las instrucciones son dadas de forma

oral de experto a experto.

2.4

El personal cumple las medidas de seguridad dentro del laboratorio (equipos de protección personal) para la recepción de las muestras.

9 100

Bata, tapa boca y guantes. Equipos

de protección especial

inexistentes

76

N° Preguntas Si No OBSERVACIONES

N° % N° %

2.5

Las muestras son recibidas en el LTF junto al oficio, la encuesta, el consentimiento informado y la cadena de custodia para la realización del examen.

9 100

Se reciben los documentos

mencionados, excepto el

consentimiento informado.

2.6 Se revisa el estado de las muestras antes de recibirlas.

9 100

2.7

Se verifica que las muestran biológicas hayan sido tomadas en los recipientes adecuados (limpios y secos) que provee el laboratorio: envase de vidrio o plástico para orina ó tubos colectores de sangre.

9 100

2.8

Se verifica que las muestras se encuentren cerradas herméticamente, antes de recibirlas en el laboratorio.

9 100

2.9

Se verifica que las muestras estén rotuladas, con la siguiente información: • Nombre y apellido de la persona muestreada. • Número de registro de cadena de custodia. • Número de documento de identidad. • Fecha de colección de la muestra. • Tipo de muestra. • Cantidad. • Nombre de anticoagulante o conservante. • Nombre y firma de la enfermera (o) que colecto o custodio la toma de la muestra.

8 88,9 1 11,1

Se verifican pero no siempre

contienen toda la información

requerida en el rotulo

2.10

Se revisa la información dada en el oficio de solicitud del análisis y en la cadena de custodia concuerde con los datos del rotulo de la muestra.

9 100

77


N° % N° %

2.11

El personal recibe capacitación para cumplir con los requerimientos que amerita la recepción de las muestras.

9 100

Inducción recibida al comenzar a trabajar en el

laboratorio

2.12

Se firma y sella el oficio y la cadena de custodia una vez recibida la muestra.

9 100

2.13

Se asigna a la muestra recibida el número de control interno del laboratorio.

9 100

2.14 La muestra y oficio recibido son identificados con el número de control interno del laboratorio.

9 100

2.15

La documentación recibida es colocada en el archivo de oficios nuevos de secretaria para su registro y asignación del número de control.

9 100

Al indagar en el presente tópico sobre la documentación existente y los

procedimientos que se realizan para llevar a cabo la recepción en el laboratorio

de las muestras biológicas (preguntas n° 2.1 y 2.2), el 100% del personal indicó

que el laboratorio no cuenta con un manual de procedimientos para llevar a

cabo ésta actividad, que permita garantizar la cadena de custodia de la

evidencia en ésta etapa del proceso, tal como lo expresa el Manual Único de

procedimientos emanado por el Ministerio Público [12].

En relación a la existencia de algún documento, guía de trabajo ó

procedimientos escritos disponibles para realizar el proceso de recepción de la

muestra (pregunta n° 2.3), el 77,8% del personal indicó que no poseen y el

22,2% de los entrevistados expresaron que para realizar este paso se transmite

la información de forma oral entre los expertos y cada uno es responsable de

78

realizar sus propias anotaciones. Esta observación ratifica la necesidad de

disponer de un manual para dar cumplimiento a los parámetros de calidad

dictados por las diferentes normas ISO, como son la ISO 9001:2008 e ISO/IEC

17025:2005.

Las preguntas n° 2.4, 3.4, 4.5 y 5.5 correspondientes a los tópicos

siguientes 2, 3, 4 y 5 respectivamente que indagan sobre el uso de medidas de

protección personal, el 100% del personal encuestado afirmó en todas ellas que

sí utilizan tapa boca, guantes y bata de laboratorio. El personal indicó que

conocen el tipo de equipos de protección personal que deben utilizar para el

manejo de reactivos, pero los mismos no siempre se encuentran disponibles.

De acuerdo a la información obtenida es necesario establecer un manual

de procedimientos en materia de bioseguridad y manejo de reactivos para que

el personal conozca claramente el tipo de vestimenta y los equipos de

protección que deben utilizar para realizar una actividad en particular.

Respecto a la pregunta n° 2.5 relacionada con la documentación requerida

para recibir una muestra, el 100% de los analistas afirmó que sí reciben junto

con la muestra: el oficio de solicitud del análisis, la encuesta y la planilla de

cadena de custodia, excepto el consentimiento informado. La respuesta

obtenida indica la necesidad de implementar el consentimiento informado para

dar cumplimiento al código de bioética y bioseguridad emitido por el Fondo

Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (Fonacit) [59] el cual expresa, el

uso del consentimiento informado para todo tipo de investigación científica;

79

permitiendo al sujeto dar voluntariamente su aprobación para realizar el estudio,

tal como lo es el examen toxicológico solicitado al sujeto durante el proceso

legal en el cual este incurso.

En las preguntas n° 2.6, 2.7 y 2.8 con respecto a procedimientos para la

recepción de las muestras como son: revisar su estado antes de recibirlas, si

fueron tomadas en recipientes adecuados y si se encuentran cerradas

herméticamente para poder recibirlas; el 100% del personal respondió que sí

realizan estos pasos, lo que indica que las actividades son realizadas de

manera consistente por el personal. De igual manera, es necesario contar con

un manual de procedimientos tal como lo sugiere la norma ISO 9001:2008 [7] e

ISO/IEC 17025:2005 [8] para garantizar la calidad de los procedimientos que se

realizan.

En cuanto a la identificación de la muestra (pregunta n° 2.9), el 88,9% del

personal respondió que verifican la información del rótulo de la muestra y el

11,1% de los encuestados colocó como negativa la respuesta, indicando que

aunque se revisa la información del rótulo, la misma no siempre tiene todos los

datos indicados en la pregunta. En base a esto, es preciso establecer

reglamentos que normen la información que debe contener el rótulo de la

muestra, para dar cumplimiento al manual único de procedimientos en materia

de cadena de custodia [12]; en el punto de rotulado y etiquetado de la evidencia

física en el laboratorio de toxicología forense, el cual establece que las

muestras deben poseer como mínimo datos de identificación del sujeto,

80

números de registro de cadena de custodia, tipo de fluido, cantidad y datos del

funcionario que colecta o médico actuante, entre otros.

En relación a revisar la concordancia de los datos colocados en la muestra

con los reflejados en el oficio y cadena de custodia (pregunta n° 2.10), el 100%

de los expertos afirman realizar este punto.

En cuanto a capacitar al personal para cumplir con el proceso de

recepción de la muestra, el 100% de los expertos colocó afirmativa la respuesta

indicando que se recibe una inducción dada por los expertos de más

antigüedad al ingresar a trabajar en el laboratorio, pero la misma no es

continua. Las respuestas obtenidas manifiestan la necesidad de tener

procedimientos escritos que el personal pueda consultar cada vez realice un

procedimiento.

De acuerdo al 100% de los entrevistados afirman realizar los pasos

correspondientes al tratamiento que debe darse al oficio y la muestra, una vez

aceptada la información que éstas presentan (preguntas n° 2.11, 2.12, 2.13,

2.14 y 2.15), pasos relacionados con: la firma y el sello del oficio, la asignación

e identificación de la muestra y el oficio con el número de control interno; y por

último el resguardo de los documentos en el archivo de oficios nuevos del área

de secretaría para la asignación del número de control.

En la Tabla VII se pueden observar los resultados obtenidos de la encuesta


81

Tabla VII. Resultados para el Tópico 3. Prácticas y procedimientos para el almacenamiento de las muestras, del cuestionario aplicado al personal experto del laboratorio de toxicología forense in vivo.

3. PRÁCTICAS Y PROCEDIMIENTOS PARA EL ALMACENAMIENT O DE LAS MUESTRAS


N° % N° %

3.1

Posee el laboratorio de toxicología forense in vivo un manual de procedimientos donde se describan los pasos a seguir para el almacenamiento de las muestras biológicas.

9 100

3.2 El manual de procedimientos se encuentra disponible para el personal.

9 100

3.3

Si no dispone de un manual de procedimientos, existe algún documento, guía de trabajo ó procedimientos escritos disponible donde estén contenidas las directrices a seguir para el almacenamiento de las muestras.

1 11,1 8 88,9

Se busca la información en

libros especializados

3.4

El personal cumple con las medidas de seguridad dentro del laboratorio (equipos de protección personal) para el almacenamiento de las muestras.

9 100

Se utiliza bata, tapa boca y

guantes. Equipos de protección

especial inexistentes

3.5 Se almacenan las muestras en gradillas o recipiente de forma vertical (evitando derrames).

9 100

3.6

La temperatura del refrigerador para el almacenamiento está entre 2-8 °C

1 11,1 8 88,9 Dependiendo del

tipo de refrigerador

3.7 Se controla y registra la temperatura diariamente

9 100 Ocasionalmente

3.8 Se almacena el remanente de la muestra original por 2 años.

9 100 No existe espacio físico disponible

3.9 Existe un procedimiento escrito para el descarte de las muestras.

9 100

82

Al estudiar la información de la tabla, se encontró que el 100% del

personal en la pregunta n° 3.1 reportó que no cuenta con un manual de

procedimientos para realizar el almacenamiento de las muestras y que el mismo

no se encuentra disponible para el personal (pregunta n° 3.2), aunque indicaron

que la actividad es realizada con instrucciones dadas de forma verbal en el

proceso de inducción impartido al experto cuando ingresa a trabajar en el

laboratorio. La información obtenida refleja la falta de documentación existente

en el laboratorio que indique como realizar este tipo de procedimientos para

garantizar el resguardo de la muestra y cumplir con la cadena de custodia de la

misma.

En relación a disponer de algún documento que indique las directrices a

seguir para realizar el almacenamiento de las muestras (preguntas n° 3.3), el

88,9% de los expertos respondieron que no poseen instrucciones escritas en

algún documento en particular y el 11,1% del personal afirmó contar con

anotaciones propias de los expertos. Todos los expertos entrevistados indicaron

que utilizan libros especializados para obtener información de cómo almacenar

las muestras. Debido a esto, se deben establecer instrucciones fijas a cumplir

por parte de los expertos para unificar este tipo de procedimientos y mantener

la calidad del servicio que se presta.

Respecto al almacenamiento de la muestra para evitar derrame y perdidas

(pregunta n° 3.5), el 100% del personal afirmó que si almacenan las muestras

de forma vertical.

83

Referente a la temperatura del refrigerador entre 2-8 °C (pregunta n° 3.6), el

88,9% de los encuestados negó que éste parámetro se cumpla, indicando que

sí se mantienen refrigeradas pero no siempre en ese rango de temperatura, el

11,1% del personal afirmó que sí las refrigera indicando que dependiendo del

tipo de refrigerador la temperatura puede variar. Es necesario establecer

parámetros fijos a cumplirse por el personal de expertos que estandaricen ésta

actividad dentro del laboratorio, tal como lo sugiere la Organización Mundial de

la Salud la cual indica que toda muestra biológica debe almacenarse a 4°C

previo a su análisis [41]. También manuales de toxicología forense

internacionales, tales como el emitido por el departamento de Virginia de EEUU,

sugiere se almacene la muestra a temperaturas entre 2-8°C para su mejor

conservación [60].

El 100% de los entrevistados respondieron no controlar y registrar la

temperatura diariamente (pregunta n° 3.7), indicando que lo realizan de manera

ocasional. De acuerdo a la UNODC [53] la Temperatura del refrigerador debe

verificarse continuamente, registrando las medidas obtenidas en un formato

dispuesto para ello.

La información suministrada para este tópico revela que no se cumplen

con procedimientos estandarizados para el almacenamiento de las muestras

que repercuten en la calidad de los resultados que se emiten. La norma

ISO/IEC 17025:2005 [8] en los puntos 5.4 y 5.8 establece que todo laboratorio

de análisis debe disponer de procedimientos específicos para el transporte,

recepción, manipulación, protección, almacenamiento y conservación de las

84

muestras; y que los mismos deben mantenerse actualizados y a disposición del

personal.

En relación a la pregunta n° 3.8 acerca del almacenamiento de la muestra

por un periodo mínimo de 2 años, el 100% del personal indicó que no se realiza,

haciendo referencia que no disponen del espacio físico suficiente para

almacenar la muestra por este periodo de tiempo. La respuesta obtenida refleja

la necesidad de establecer un área de almacenamiento apto con espacio

suficiente para almacenar las muestras el tiempo necesario. De acuerdo a

Munich P y colaboradores [55] indican que las muestras deben ser

almacenadas por un periodo de 2 años con el fin de atender necesidades

legales posteriores. El periodo de tiempo de almacenamiento del remanente de

las muestras debe cumplirse para garantizar el debido proceso en caso de

necesitar realizar: otros análisis a la muestra una vez emitida la experticia, se

solicite una nueva experticia de la muestra ó se requiera remitir la muestra a

otros despachos siempre y cuando se conserve la cadena de custodia de la

misma, tal como se indica en el manual único de procedimientos en materia de

cadena de custodia [12]

En relación a la pregunta n° 3.9, el 100% de los expertos indicaron que no

existen procedimientos escritos para el descarte de las muestras biológicas. Es

importante establecer procedimientos para realizar la disposición final de los

desechos. Disminuyendo así, los riesgos de contaminación al ambiente, al

laboratorio y a las personas q los manipulen.

85

Respecto a los tópico 4 y tópico 5 en la Tabla VIII se pueden observar los

resultados obtenidos de la encuesta aplicada.

Tabla VIII. Resultados de los Tópicos 4 y 5. Prácticas y procedimientos para la determinación cualitativa y cuantitativa de opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las muestras biológicas, del cuestionario aplicado al personal experto del laboratorio de toxicología forense in vivo.

4. PRÁCTICAS Y PROCEDIMIENTOS PARA LA DETERMINACIÓN CU ALITATIVA DE OPIÁCEOS, BENZODIACEPINAS, COCAÍNA, ANFETAMINAS Y C ANNABINOIDES EN LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS


N° % N° %

4.1

Posee el laboratorio de toxicología forense in vivo un manual de procedimientos donde se describan los pasos a seguir para la determinación cualitativa de opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las muestras biológicas.

9 100

4.2


9 100

4.3

Si no dispone de un manual de procedimientos, existe algún documento, guía de trabajo ó procedimientos escritos disponible donde estén contenidas las directrices a seguir para la determinación cualitativa de opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides.

1 11,1 8 88,9

Información obtenida en libros

especializados Ej: Clarke´s

Analysis of Drugs and Poisons ó por

apuntes de expertos más

antiguos

4.4

El personal experto recibe capacitación continua sobre los procedimientos a seguir para la determinación cualitativa de diferentes tipos de sustancias.

9 100

4.5

El personal cumple con las medidas de seguridad dentro del laboratorio (equipos de protección personal)

9 100

Uso de bata, tapa boca y guantes.

Protección especial

inexistentes

86


N° % N° %

4.6

Se realiza la determinación cualitativa de alcohol etílico mediante microdifusión en cámara de Conway.

9 100

4.7

Se utilizan pruebas de inmunoensayo con dispositivo (Prueba rápida de un solo paso) para la determinación de opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las muestras biológicas.

8 88,9 1 11,1 No siempre se

cuenta con este tipo de pruebas

4.8

Se utilizan pruebas de inmunoensayo enzimático heterogéneo (E.L.I.S.A) para la determinación de opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las muestras biológicas.

9 100

4.9

Existe un método para la determinación de opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides mediante CCF.

9 100

4.10

Está disponible algún documento que contenga la descripción de los sistemas para el desarrollo de las placas cromatográficas en CCF para la determinación de diferentes tipos de sustancias.

8 88,9 1 11,1

Libros especializados, apuntes de los

expertos

4.11

Está disponible algún documento que contenga la descripción de los reveladores más comunes a utilizar para la visualización de los diferentes tipos de sustancias en las placas cromatográficas.

8 88,9 1 11,1 En libros

especializados

87


N° % N° %

4.12

Están validadas las diferentes técnicas analíticas (pruebas de inmunoensayo, E.L.I.S.A, CCF, microdifusión en cámara de Conway) para las determinaciones cualitativas de alcohol etílico, opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides.

9 100

Se conocen valores mínimos y

máximos de concentración

detectable mediante

bibliografías de referencias.

4.13

Se dispone de una hoja de reporte específica para anotar los resultados cualitativos obtenidos de los análisis realizados a la muestra.

9 100 Se reporta en el

oficio

5. PRÁCTICAS Y PROCEDIMIENTOS PAR A LA DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ALCOHOL ETÍLICO, OPIÁCEOS, BENZODIACEPINAS, COCAÍNA , ANFETAMINAS Y CANNABINOIDES EN LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS


N° % N° %

5.1

Posee el laboratorio de toxicología forense in vivo un manual de procedimientos donde se describan los pasos a seguir para la determinación cuantitativa de alcohol etílico, opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las muestras biológicas.

9 100

5.2


9 100

5.3

Si no dispone de un manual de procedimientos, existe algún documento, guía de trabajo ó procedimientos escritos disponibles donde estén contenidas las directrices a seguir para la determinación cuantitativa de alcohol etílico, opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las muestras.

1 11,1 8 88,9

Se dispone de instrucciones dadas de un

experto a otro y por indicaciones

en libros especializados.

Ej: Clarke´s Analysis of Drugs

and Poisons.

88


N° % N° %

5.4

El personal experto recibe capacitación continua sobre los procedimientos a seguir para la determinación cuantitativa de los diferentes tipos de sustancias.

9 100

5.5

El personal cumple con las medidas de seguridad dentro del laboratorio (equipos de protección personal) para la determinación cuantitativa de sustancias.

9 100

Se utiliza bata, tapa boca y

guantes. Equipos de protección

especial inexistentes

5.6

Se realiza la determinación cuantitativa de alcohol etílico mediante microdifusión en cámara de Conway.

9 100 Comparación con

curva de calibración

5.7

Se realiza la determinación cuantitativa de alcohol etílico mediante cromatografía de gases con autoanalizador de espacio en cabeza (CG-HS).

9 100 Equipo en mantenimiento

5.8

Están establecidos los valores mínimos y máximos de concentración que deben contener las curvas de calibración para la determinación de alcohol etílico, opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en la muestra.

1 11,1 8 88,9 Para algunas de las sustancias

5.9

Se toma en cuenta la sensibilidad de los instrumentos analíticos utilizados, para realizar las curvas de calibración de las diferentes sustancias.

9 100

5.10

Se preparan por triplicado los estándares para las curvas de calibración para la cuantificación de las sustancias en las muestras biológicas por las diferentes técnicas.

9 100

89


N° % N° %

5.11

Se realiza la cuantificación de las diferentes sustancias por el método del estándar externo.

9 100

5.12

Se utiliza la técnica analítica de cromatografía de gases (CG-FID) para los análisis cuantitativos de sustancias como opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las muestras biológicas.

9 100 No se encuentra

en funcionamiento

5.13

Se utiliza la técnica analítica de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (CG-MS) para el análisis cuantitativo de sustancias como opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las muestras biológicas.

9 100 No se encuentra

en funcionamiento

5.14

Se realiza la determinación cuantitativa de sustancias: opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las muestras biológicas mediante el uso de Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC).

9 100 No se dispone por

su alto costo de adquisición

5.15

Están validadas las diferentes técnicas analíticas (microdifusión en cámara de Conway, CG-HS, CG-FID, CG-MS, HPLC) para las determinaciones cuantitativas de alcohol etílico, opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides.

9 100

5.16

Se dispone de una hoja de reporte específica para anotar los resultados cuantitativos obtenidos de los análisis realizados a la muestra.

9 100 Se reporta en el

oficio

90

De acuerdo a las respuestas obtenidas para ambos tópicos, el 100% del

personal entrevistado respondió en las preguntas n° 4.1, 4.2, 5.1 y 5.2 que no

existe, ni se encuentra disponible un manual de procedimiento escrito para

realizar la determinación cualitativa y cuantitativa de las diferentes sustancias

en las muestras biológicas. En base a esto es importante cumplir con las

directrices emitidas por las normas ISO 9001:2008 e ISO/IEC 17025:2005 las

cuales son utilizadas como normas guías para certificar este tipo de laboratorio.

Las normas establecen que todos los procedimientos adoptados deben

encontrarse establecidos, disponibles para el personal y ser revisados de forma

periódica para el correcto funcionamiento del laboratorio. Garantizando así, la

calidad de los resultados que se emiten mediante la uniformidad de las

actividades que se realizan. [7,8]

En respuesta a las preguntas n° 4.3 y 5.3 que indagó sobre cuales

documentos disponen para realizar los análisis tanto cualitativos como

cuantitativo, el 88,9% del personal indicó en ambas preguntas que no poseen

instrucciones escritas en algún documento específico y el 11,1% de los

encuestados afirmó que se dispone de anotaciones propias de cada experto.

Los expertos indicaron que los análisis son realizados mediante el uso de

los conocimientos adquiridos como profesionales químicos o farmacéuticos,

pasos realizados de forma repetitiva de generación en generación y por medio

de la revisión de libros especializados afines al área. Debido a esto, es

importante establecer los procedimientos que se realizan para garantizar la

calidad de los resultados y dar cumplimientos a la norma ISO/IEC 17025:2005.

91

Referente a si el personal experto recibe capacitación continua sobre los

procedimientos a seguir para la determinación cualitativa (pregunta n° 4.4) y

cuantitativa (pregunta n° 5.4) de diferentes tipos de sustancias, el 100% del

personal indicaron que no la reciben. La norma ISO/IEC 17025:2005 [8]

establece que la Dirección del laboratorio debe formular las metas con respecto

a la educación y formación continua del personal.

En cuanto a la búsqueda de información sobre las diferentes técnicas

analíticas que utilizan en el LTF se encontró:

Para la determinación cualitativa y cuantitativa de alcohol etílico mediante

la técnica de microdifusión en cámara de Conway (pregunta n° 4.6 y 5.6), el

100% de los expertos indicaron realizar este método. Autores como Bianccuci G

y col. [40], Flanagan R y col. [41] consideran la microdifusión en cámara de

Conway una técnica aceptable para la determinación cualitativa y cuantitativa

de tóxicos volátiles requiriendo poca cantidad de muestra y sin realizar

purificación previa de la misma ni otros tratamientos especiales.

La determinación de alcohol etílico en muestras de sangre por esta técnica

es aceptable, permitiendo determinar concentraciones en el rango de 0,5 - 3

g/L. Moffat A y col. [23] recomienda técnicas para la cuantificación de mayor

sensibilidad tales como CG-FID, CG-MS ó HPLC. Los efectos tóxicos del

alcohol etílico en sangre son observados en el rango de concentración entre 0,8

- 2,4 g/L y las letalidades se encuentran con concentraciones entre 2,5 - 3,0 g/L

en consumidores ocasionales.

92

La pregunta n° 4.7 investigó sobre las pruebas de inmunoensayo con

dispositivo (Prueba rápida de un solo paso) para la determinación cualitativa de

opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las

muestras biológicas, el 88,9% del personal indicó que sí los utiliza como método

de análisis y el 11,1% de los encuestados negó utilizarlos de manera continua

señalando que no siempre se disponen de las pruebas rápidas de un solo paso.

Moffat A y col. [23] indican que el uso de la prueba rápida es un método

efectivo para determinar cualitativamente una sustancia debido a su rapidez y

sensibilidad, proporcionando bajos límites de detección requeridos para el uso

forense y también la capacidad de afrontar los efectos de la matriz en las

muestras biológicas. Sin embargo deben ser corroborados los resultados

obtenidos por esta técnica con métodos de mayor sensibilidad.

Referente al uso de pruebas de inmunoensayo enzimático heterogéneo

(E.L.I.S.A) indicado en la pregunta n° 4.8, el 100% del personal negó utilizar

esta técnica. Flanagan R y col. [4] indican que los laboratorios de toxicología

forense deben utilizar esta técnica debido a que permite eliminar sustancias

interferentes incluyendo los pigmentos de las muestras biológicas, así como

proporcionar altos niveles de sensibilidad, de igual manera sugieren confirmar

los resultados obtenidos con técnicas instrumentales más sofisticadas.

En cuanto al uso de la Cromatografía de Capa Fina (pregunta n° 4.9), el

100% del personal indicó realizar el análisis cualitativo de las diferentes

sustancias por este método. Respecto a las preguntas n° 4.10 y 4.11, el 88,9%

93

de los expertos afirmó disponer de documentos contentivos de la descripción de

los sistemas y reveladores a utilizar para el desarrollo y visualización de las

placas cromatográficas en CCF para la determinación de diferentes tipos de

sustancias y el 11,1% de los encuestados niega disponer de un documento en

particular contentivo de ésta información. Todo el personal encuestado reflejó

en las observaciones que utilizaban para realizar esta actividad libros

especializados afines al tema y apuntes de expertos existentes en el LTF.

De acuerdo a la UNIDCP [27] la CCF es una de las técnicas ampliamente

utilizadas en este tipo de laboratorios debido a su bajo costo y resultados

óptimos. Esta técnica es recomendada para confirmación de las pruebas de

inmunoensayos y como método inicial para la determinación de drogas

confirmando sus resultados posteriormente con equipos de mayor sensibilidad.

Los resultados obtenidos indicaron que no existen directrices que

estandaricen el uso de la CCF, influyendo en la calidad de los resultados que se

obtienen e incumpliendo con los estándares de calidad dados en el norma

ISO/IEC 17025:2005 [8] la cual establece que todo procedimiento debe estar

bien documentado. La Norma ISO/TR 10013:2001 [16] serviría como guía para

realizar los procedimientos escritos de todas las actividades que se llevan a

cabo dentro del laboratorio.

Las preguntas n° 4.12 y 5.15 referidas a la validación de las técnicas

analíticas utilizadas para el análisis cualitativo y cuantitativo, el 100% del

personal manifestó que las técnicas utilizadas en el laboratorio no se

94

encontraban validadas experimentalmente y que los valores mínimos y

máximos de concentración detectables en las muestras se encontraban

establecidos en bibliografías de referencias. La norma ISO/IEC 17025:2005 [8]

establece en el punto 5.4 que todos los métodos analíticos desarrollados ó

adoptados por el laboratorio deben ser apropiados para el análisis que se vaya

a realizar y deben estar validados.

En los laboratorios de toxicología forense surge la necesidad de validar los

métodos analíticos como parte de los parámetros de calidad que deben

cumplirse, comprobando que los métodos utilizados son confiables y que

emiten resultados certeros. De acuerdo a la Oficina de las Naciones Unidas

contra la Droga y el Delito (UNODC) [53] la validación debe realizarse mediante

una serie de pruebas experimentales normalizadas para obtener datos sobre su

exactitud, precisión, especificidad, límites de detección, estabilidad, entre otros.

Respecto a la disponibilidad de una hoja de reporte específica para anotar

los resultados cualitativos (pregunta n° 4.13) y cuantitativos (pregunta n° 5.16)

obtenidos de los análisis realizados, el 100% del personal respondió que no se

dispone y expresaron que los resultados de los análisis son anotados

directamente en el oficio de solicitud del análisis. Se debe establecer el uso de

una hoja única de reporte de resultados con el fin de mantener el control de los

resultados que se obtienen de cada análisis realizado. La UNODC [35] indica

que los resultados de los análisis deberían presentarse en informes exactos,

claros, inequívocos y objetivos.

95

En cuanto al uso de técnicas cromatográficas preguntas n° 5.7, 5.12, 5.13

que indagaron sobre la utilización de técnicas como: CG-HS, CG-FID, CG-MS

para los análisis cuantitativos de sustancias como alcohol etílico, opiáceos,

benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides; el 100% del personal

respondió no realizaban estas técnicas para el momento de aplicación de la

encuesta debido a que los equipos analíticos se encontraban en mantenimiento,

indicando que cuando los equipos están operativos si son utilizados. Los

expertos hicieron referencia en utilizar la técnica de espectrofotometría UV-

visible para realizar la cuantificación utilizando curvas de calibración realizadas

con patrones certificados de cada sustancia que se determine.

Respecto al HPLC (pregunta n° 5.14) indicaron que no disponen de este

equipo por su alto costo de adquisición. La norma ISO/IEC 17025:2005 [8]

punto 5.5 establece que el laboratorio debe disponer de todos los equipos para

el muestreo, medición y ensayos requeridos para la correcta ejecución de los

análisis.

Autores como Repetto M y col [5] y García – Rodríguez S y col. [21]

consideran que los laboratorios toxicológicos al ser de nivel superior deben

contar con la mejor instrumentación científica para emitir resultados con altos

niveles de certeza. Surgiendo así, la necesidad de adquirir u optimizar los

equipos analíticos disponibles en el laboratorio, debido a que las técnicas antes

mencionadas son por excelencia utilizadas como herramienta fundamental para

la confirmación de sustancias en el análisis toxicológico y deben contar a su vez

96

con detectores idóneos que permitan realizar la cuantificación de los distintos

compuestos.

El 88,9% del personal respondió en la pregunta n° 5.8 que no está

establecido en ningún documento los valores mínimos y máximos de

concentración que deben contener las curvas de calibración, para la

determinación de: alcohol etílico, opiáceos, benzodiacepinas, cocaína,

anfetaminas y cannabinoides en la muestra biológica. En cambio el 11,1% de

los expertos señalaron que disponen de rangos de concentración establecidos

para algunas sustancias.

Los resultados indicaron que existe discrepancia entre los analistas con

respecto a la utilización de técnicas y parámetros que deben de estar

normalizados para dar cumplimiento a la norma ISO/IEC 17025:2005, así como

también, cumplir con las directrices emitidas por entes internacionales en el

área. De acuerdo a la UNODC [53] para todo método utilizado deben

establecerse parámetros que permitan su validación, tales como: límites de

detección, precisión, exactitud, estabilidad, especificidad, entre otros.

Respecto a los aspectos a considerar para asegurar la calidad de los

resultados y cumplir con la norma ISO/IEC 17025:2005, mediante la aplicación

de procedimientos como: Tomar en cuenta la sensibilidad de los instrumentos

analíticos utilizados para realizar las curvas de calibración de las diferentes

sustancias (pregunta n° 5.9), preparar por triplicado los estándares para las

curvas de calibración para la cuantificación de las sustancias por las diferentes

97

técnicas (pregunta n° 5.10) y realizar la cuantificación de las diferentes

sustancias por el método del estándar externo (pregunta n° 5.11). El 100% del

personal respondió que no realizaban estos aspectos, reflejándose la falta de

normas que unifiquen y garanticen la calidad de los procedimientos que se

realizaban. La norma ISO 9001:2008 [7] establece en cuanto a la producción y

prestación del servicio (punto 7.5) el uso de métodos y procedimientos

específicos, el uso de equipos apropiados y la validación de los procesos que

se realizan, entre otros.

La Figura 17 muestra los resultados obtenidos de la encuesta en cuanto a

los tópicos 4 y 5 correspondientes a los análisis cualitativos y cuantitativos.

Figura 17. Resultados de la encuesta aplicada sobre los procedimientos que se llevan a cabo para el análisis cualitativo (Tópico 4) y cuantitativo (Tópico 5).

En el gráfico se puede apreciar en las preguntas 4.6, 4.7, 4.9, 4.10 y 4.11

referentes a los análisis cualitativos que los expertos afirman realizarlos a pesar

de no contar con un manual de procedimiento establecido. En cuanto a los

análisis cuantitativos las preguntas n° 5.7 a la 5.16 fueron respondidas de

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

4.6

4.7

4.8

4.9

4.10

4.11

4.12 5.

7

5.8

5.9

5.10

5.11

5.12

5.13

5.14

5.15

5.16

Si

No

N° de Preguntas

Frec

uenc

ia(%

)

98

manera negativa, reflejando que para el momento de aplicación de la encuesta

los expertos no realizaban las determinaciones cuantitativas de las sustancias,

debido a que no estaban operativos los equipos y no disponían de recursos

necesarios para realizar los análisis.

En la Tabla IX se pueden observar los resultados obtenidos de la encuesta


Tabla IX. Resultados para el Tópico 6. Elaboración de la experticia toxicológica forense in vivo, del cuestionario aplicado al personal experto.

6. ELABORACIÓN DE LA EXPERTICIA TOXICOLÓGICA FORENS E IN VIVO


N° % N° %

6.1

Posee el laboratorio de toxicología forense un manual de procedimientos donde se describan los pasos a seguir para la elaboración de la experticia toxicológica forense in vivo.

9 100

6.2


9 100

6.3

Si no dispone de un manual de procedimientos, existe algún documento, guía de trabajo ó procedimientos escritos disponibles donde estén contenidas las directrices a seguir para la elaboración de la experticia toxicológica forense in vivo.

9 100

Se realiza este procedimiento

mediante el seguimiento de instrucciones verbales de

expertos antiguos a expertos

nuevos.

6.4 El o los expertos llenan la hoja de reporte de resultado final.

1 11,1 8 88,9 Se reporta en

oficio

6.5

Se dispone de un formato para redactar la experticia toxicológica forense in vivo.

9 100

99


N° % N° %

6.6

¿Se anota en el sistema digital del laboratorio la fecha y las iníciales del nombre y apellido del experto que elaboró la experticia?

9 100

6.7 Se imprimen y firman 3 folios de la experticia final.

9 100

6.8

Se archiva una experticia en el laboratorio junto al oficio, encuesta, consentimiento informado y cadena de custodia de la muestra.

9 100

Todos menos el consentimiento

informado que no se realiza

6.9 Se entrega la experticia al ente solicitante.

9 100

En este tópico se investigó sobre los procedimientos que se llevan a cabo

en relación a la redacción y emisión de la experticia, las preguntas n° 6.1 y 6.2

indagaron sobre la existencia y disponibilidad de un manual de procedimientos

para la elaboración de la experticia toxicológica forense in vivo, el 100% del

personal indicó que no se disponen. Las respuestas obtenidas reflejan la

necesidad de controlar este tipo de procedimientos mediante la existencia de un

documento escrito que sea de uso obligatorio por todo el personal, debido a la

importancia que tiene la experticia por ser el documento legal que se entrega a

los entes administradores de justicia en respuesta a sus solicitudes.

La pregunta n° 6.3 indagó a la existencia de algún documento, guía de

trabajo ó procedimientos escritos disponibles para realizar éste paso, el 100%

de los expertos indicaron que no disponen y refirieron realizar la elaboración de

la experticia mediante instrucciones dadas verbalmente de generación en

100

generación entre los expertos. Incumpliéndose así, la norma ISO/IEC

17025:2005 [8] que establece que todo procedimiento debe estar establecido y

debe ser de fácil acceso para el personal.

En relación a si el o los expertos llenan la hoja de reporte de resultados

final (pregunta n° 6.4), el 88,9% del personal indicaron que no la llenan y el

11,1% de los encuestados reflejo que sí, indicando que reportan sus resultados

en el oficio de solicitud del análisis. Se debe adoptar el uso de la hoja de reporte

de resultados final con el fin de tener en un solo documento, toda la información

necesaria para su posterior transcripción en la experticia final.

En base a los procedimientos a realizar para la redacción, emisión y

resguardo de la experticia, se evaluaron los siguientes aspectos: Disponer de

un formato para redactar la experticia toxicológica forense in vivo (pregunta n°

6.5), anotar en el sistema digital del laboratorio la fecha e iníciales del nombre y

apellido del experto que elaboró la experticia (pregunta n° 6.6), imprimen y

firman 3 folios de la experticia final (pregunta n° 6.7), archivar una experticia en

el laboratorio junto al oficio, encuesta, consentimiento informado y cadena de

custodia de la muestra para su resguardo (pregunta n° 6.8), entregar la

experticia al ente solicitante (pregunta n° 6.9). El 100% de los entrevistados

afirmaron realizar los aspectos antes mencionados e indicaron que para la

pregunta n° 6.8 se archivan todos los documentos mencionados excepto el

consentimiento informado.

101

Los resultados obtenidos en este tópico indicaron que el personal realiza

las actividades siguiendo instrucciones verbales impartidas entre los expertos

de más antigüedad durante el periodo de entrenamiento del personal. Las

respuestas indicaron la necesidad de desarrollar los procedimientos operativos

estandarizados que contengan las instrucciones a seguir para realizar estos

pasos. El punto 5.10 de la norma ISO/IEC 17025:2005 [8] establece que todo

resultado debe reportarse en forma exacta, clara y objetiva e incluir toda la

información requerida que facilite su interpretación.

En la Tabla X se pueden observar los resultados obtenidos de la encuesta


Tabla X. Resultados para el Tópico 7. Procedimientos para el registro y respaldo de la información de los resultados obtenidos, del cuestionario aplicado al personal experto del laboratorio de toxicología forense in vivo.

7. PROCEDIMIENTOS PARA EL REGISTRO Y RESPALDO DE LA INFORMACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS


7.1

Posee el laboratorio de toxicología forense in vivo un manual de procedimientos que describa los pasos a seguir para el registro y respaldo de la información de los resultados obtenidos.

9 100


9 100

7.3

Si no dispone de un manual, existe algún documento, guía de trabajo ó procedimientos escritos donde estén contenidas las directrices a seguir para el registro y respaldo de la información de los resultados obtenidos.

9 100

102


N° % N° %

7.4 Se dispone de un libro para el registro de los resultados.

9 100

7.5 Se dispone de un registro digital para el respaldo de los resultados.

8 88,9 1 11,1 No siempre se llena el registro

7.6

El jefe del laboratorio resguarda los respaldos de información realizados (digital y libro) en un sitio seguro.

8 88,9 1 11,1 Algunos refieren desconocer este

paso

7.7

Existe una base de datos digital del laboratorio para el registro de la información de los oficios que ingresan al laboratorio.

9 100

7.8 Se asigna un número de control en la base de datos digital para el seguimiento de la muestra.

9 100

7.9 Se anota el número de control en el oficio. 9 100

7.10 Existe un CD ó disco duro externo donde se respalde la información digital del laboratorio.

9 100 Resguardada en la computadora

7.11 Se respalda diariamente la información digital del laboratorio.

9 100 Ocasionalmente

7.12 Dispone el laboratorio de un libro para el registro de entrega de las experticias.

9 100

7.13

Se solicita un oficio de autorización de retiro de la experticia del laboratorio y documento de identidad a la persona que acude a retirarla.

8 88,9 1 11,1

No siempre se solicita oficio, solo

documento de identidad

7.14

Se solicita a la persona que retira la experticia que firme y llene sus datos en el libro de entrega de experticia.

9 100

Si posee comentarios, observaciones ó sugerencias adicionales por favor indíquelas: • En los procedimientos que se realizan en el laboratorio prevalece la ética, valores y

profesionalismo de los expertos para desempeñar sus actividades. • Necesario instrucciones para el manejo de desechos en el laboratorio. • Implementar sistema de control de calidad en el laboratorio.

103

Las preguntas n° 7.1 y 7.2 indagaron sobre la existencia y disponibilidad

en el laboratorio de un manual de procedimientos donde se describieran los

pasos a seguir para el registro y el respaldo de la información de los resultados

obtenidos, así como determinar en cuál documento estarían contenidas las

directrices a seguir (pregunta n° 7.3). El 100% del personal respondió que no

disponen de instructivos o documentos. Las normas ISO 9001:2008 [7] e

ISO/IEC 17025:2005 [8] exigen que todo procedimiento debe estar establecido

y disponible para el personal.

En cuanto a los controles a considerar para el respaldo de los resultados

obtenidos, como son: disponer de un libro para el registro de los resultados

(pregunta n° 7.4), el 100% de los expertos afirmaron contar el libro de registro.

Disponer de un registro digital para el respaldo de los resultados (pregunta n°

7.5), el 88,9% del personal afirmó tenerlo y el 11,1% de los expertos

encuestados lo negó, indicando que el mismo existe pero no siempre se llena.

Para el resguardo de los respaldos de información realizados (digital y

libro) en un sitio seguro (pregunta n° 7.6). El 88,9% del personal indicaron que

sí se realiza y el 11,1% del personal lo negó, indicaron que desconocen si esta

actividad es llevada a cabo por el jefe del laboratorio.

En relación al control de los registros la norma ISO/IEC 17025:2005 [8]

establece en el punto 4.13, que el laboratorio debe guardar por un periodo

determinado, los registros de las observaciones originales, los datos derivados

de los análisis, copia de los informes de ensayos, entre otros. También

104

establece que deben existir procedimientos para proteger y salvaguardar los

registros almacenados para evitar el acceso no autorizado o la modificación de

los registros.

La pregunta n° 7.7 investigó sobre la existencia de una base de datos

digital del laboratorio para el registro de la información de los oficios. El 100%

del personal manifestó que sí dispone de la base de datos digital.

La pregunta n° 7.8 indagó si se asigna un número de control en la base de

datos digital para el seguimiento de la muestra y si el número de control se

anota en el oficio de solicitud del análisis (pregunta n° 7.9). El 100% del

personal indicó que sí se asigna y anota en el oficio el número de control. Los

pasos mencionados anteriormente son utilizados para el control de los oficios

que ingresan al laboratorio, para facilitar su ubicación.

Respecto a los controles realizados para el respaldo de los datos del

sistema digital del laboratorio: la pregunta n° 7.10 investigó la existencia de un

CD ó disco duro externo donde se respalde la información digital del laboratorio

y la pregunta n° 7.11 indagó si la información se respalda diariamente. El 100%

del personal afirman realizar las actividades antes mencionadas, indicando que

los respaldos de la información de los oficios como de los resultados se

realizaban en la computadora y de manera ocasional. Los respaldo deben

realizarse de forma continua indicando así que la falta de normalización de los

procedimientos que se llevan a cabo dentro del laboratorio incumplen con las

105

normas que garantizarían la calidad en el laboratorio como lo son las normas

ISO 9001:2008 e ISO/IEC 17025:2005.

Para la entrega de la experticia al ente correspondiente se preguntó si se

dispone en el laboratorio de un libro para el registro de entrega de las

experticias (pregunta n° 7.12). El 100% del personal afirmaron disponerlo.

En relación a solicitar un oficio de autorización de retiro de la experticia del

laboratorio y documento de identidad a la persona que acude a retirarla

(pregunta n° 7.13). El 88,9% del personal afirmaron realizar este paso y el

11,1% de los encuestados negaron realizarlo indicando que en ocasiones solo

se solicita el documento de identidad.

Se solicita a la persona que retira la experticia firmar y llenar sus datos en

el libro de entrega de experticia (pregunta n° 7.14), el 100% del personal

afirmaron realizar este paso.

De acuerdo a las respuestas obtenidas para este tópico a pesar de no

disponer de procedimientos escritos para esta actividad, el personal realiza los

controles planteados para la protección y resguardo de la información emitida

en la experticia hasta que la misma es entregada al ente solicitante siguiendo

instrucciones verbales dadas entre los expertos. La SOFT/AAFS [11] establece

que los resultados emitidos por los laboratorios de toxicología deben ser

tratados confidencialmente, por lo que se deben tomar todos los controles

necesarios para garantizar el resguardo de los resultados durante todo el

proceso incluyendo el momento de entrega de la experticia al ente solicitante.

106

En base a los resultados obtenidos de la encuesta se puede observar en

la Figura 18 que los expertos entrevistados indicaron que el laboratorio no

cuenta con la documentación necesaria para realizar los procedimientos de

manera estandarizada. Observándose con las respuestas emitidas, la falta de

procedimientos operativos estándares, manuales o instructivos, que permitieran

normar las actividades que se realizan en el área de estudio.

Figura 18. Respuestas obtenidas de la encuesta aplicada sobre la documentación que dispone el laboratorio de toxicología forense.

a.3) Investigación documental:

En este punto se seleccionaron y revisaron los diferentes documentos que

contenían datos de interés respecto a los procedimientos que se desarrollan en

el manual: documentos jurídicos tales como la Constitución y los Códigos

Orgánicos y Civiles que permitieran sustentar la parte legal del manual; la guía

técnica para la elaboración de manuales de procedimientos [61], las normas

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1.2

1.3

2.1

2.2

2.3

3.1

3.2

3.3

3.9

4.1

4.2

4.3

5.1

5.2

5.3

6.1

6.2

6.3

7.1

7.2

7.3

Si

No

Fre

cue

nci

a d

e r

esp

ue

sta

(%)

N° de Pregunta

107

ISO específicamente: ISO 9001:2008, ISO/IEC 17025:2005 e ISO/TR

10013:2001.

Revisión de manuales de procedimientos afines al tema en cuestión:

Nacionales tal como el Manual Único de Procedimientos en Materia de Cadena

de Custodia de Evidencias Físicas emitido por el Ministerio Público e

Internacionales como manuales de procedimientos de laboratorios de países

como: Argentina, Ecuador, EEUU, entre otros. Revisión de libros, revistas

científicas, documentos de recomendación de métodos emanados por

organismos tales como la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Oficina

de las Naciones Unidas contra la droga y el delito (UNODC), etc. Los

documentos antes mencionados permitieron obtener información de los

procedimientos y métodos analíticos utilizados para desarrollar los POEs y

formularios establecidos en el manual.

b) Diseño de los Procedimientos Operativos Estandarizados (POEs):

Una vez analizada la información obtenida mediante las técnicas de

recolección de información antes descritas, se procedió a definir los POEs para

el control de las actividades que conformaron el manual de procedimientos. Se

realizó una lista de las diferentes actividades del área de estudio y se agruparon

quedando categorizados de la siguiente manera:

• Organigramas propuestos para la institución: Se diseñó el

organigrama correspondiente a la estructura del laboratorio de

108

toxicología forense indicando las áreas que dispone el laboratorio de

toxicología forense y el organigrama de responsabilidad del personal

que trabaja específicamente en área de toxicología forense in vivo.

• POEs propuestos para las diferentes actividades que se realizaban

en el laboratorio de toxicología forense in vivo para un total de

veintiuno (21) POEs, los cuales se mencionan a continuación:

1. POE para la recepción de las muestras biológicas en el

laboratorio de toxicología forense.

2. POE para el almacenamiento de las muestras.

3. POEs relacionados con la determinación cualitativa y cuantitativa

de sustancias en las muestras biológicas: En este punto se

realizaron quince (15) POEs para el análisis de sustancias tales

como: alcohol etílico, cocaína, cannabinoides, opiáceos,

anfetaminas y benzodiacepinas.

4. POE para la elaboración de la experticia toxicológica forense in

vivo.

5. POE relacionado con el registro y respaldo de la información.

6. POE para la verificación de la calibración de equipos e

instrumentos de laboratorio.

7. POE para el control de la documentación.

La estructura de los POEs fueron diseñados siguiendo los requerimientos

descritos en la Norma ISO/TR 10013:2001 [16], cada POE estuvo conformado

por: Propósito, alcance, responsabilidad, medidas de seguridad del personal,

109

definiciones a considerarse en el procedimiento, descripción del proceso,

anexos y documentación de referencia.

5.1.2. Organización del manual y presentación final:

Se definió la estructura final del manual código: MPT01-01 contemplando

diferentes secciones descritas a continuación:

1. Introducción:

En esta sección se describió el propósito del manual de procedimientos

elaborado y se describió de manera general la conformación del contenido del

mismo.

2. Objetivo del manual:

Se presentó el objetivo del manual establecido para realizar los

procedimientos en el laboratorio de toxicología forense.

3. Área de aplicación y alcance de los procedimientos:

Sección en donde se describe el alcance del procedimiento

documentado, mencionando las áreas que estarán involucradas.

4. Responsables:

Se definió el personal responsable de la ejecución, actualización y

divulgación del manual de procedimiento, así como sus interrelaciones

asociadas al proceso.

110

5. Normas de uso del manual:

Se presentaron los lineamientos generales de acción y guía para el uso

del manual.

6. Definiciones:

Sección donde se presentan palabras o términos empleados en los

procedimientos que requieren de su explicación.

7. Organigramas propuestos para la institución:

Se diseñaron dos (2) organigramas de la institución. Mostrando de forma

gráfica la estructura del laboratorio de toxicología forense indicando cada una

de las áreas que lo constituyen y la jerarquización de la responsabilidad del

personal dentro del área de toxicología forense in vivo.

8. Marco legal:

En esta sección se presentaron los artículos de diferentes documentos

legales que sirvieron para sustentar la legalidad de la experticia toxicológica

forense in vivo. Entre los documentos legales que se mencionaron se

encuentran: La Constitución de la República Bolivariana de Venezuela y el

Código Orgánico Procesal Penal.

9. Diagrama de flujo del proceso:

Se presentó la representación gráfica del proceso que se realiza en los

laboratorios de toxicología forense para dar cumplimiento a la experticia

toxicológica forense in vivo solicitada. El diagrama de flujo del proceso se

mostró en el procedimiento código: PCT00-01.

111

10. Procedimientos operacionales escritos (POEs):

En esta sección se presentaron los procedimientos escritos

estandarizados propuestos para realizar las diferentes actividades en el

laboratorio que permitan obtener la experticia toxicológica in vivo solicitada. Los

POEs contemplados en el manual son:

• Procedimiento de verificación de la calibración de equipos e instrumentos

de laboratorio, código: POC00-01.

• Procedimiento para la recepción de muestras biológicas en el laboratorio

de toxicología forense, código: POR00-01.

• Procedimiento para el almacenamiento de muestras biológicas en el

laboratorio de toxicología forense, código: POA00-01.

• Procedimiento para la determinación de alcohol etílico mediante

microdifusión en cámara de Conway, código: POQ00-01.

• Procedimiento para la determinación de alcohol etílico en sangre

mediante CG-HS, código: POQ01-01.

• Procedimiento para la determinación cualitativa de sustancias mediante

prueba de inmunoensayo con dispositivo, código: POQ02-01.


prueba de inmunoensayo E.L.I.S.A, código: POQ03-01.


cromatografía de capa fina (CCF), código: POQ04-01.

• Procedimiento para la determinación de cocaina mediante cromatografía

de capa fina (CCF), código: POQ05-01.

112

• Procedimiento para la determinación de cocaina mediante CG-MS,

código: POQ06-01.

• Procedimiento para la determinación de opiaceos mediante


• Procedimiento para la determinación de opiáceos mediante CG-MS,

código: POQ08-01.

• Procedimiento para la determinación de benzodiacepinas mediante


• Procedimiento para la determinación de benzodiacepinas mediante CG-

MS, código: POQ10-01.

• Procedimiento para la determinación de anfetaminas mediante


• Procedimiento para la determinación de anfetaminas mediante CG-MS,

código: POQ12-01.

• Procedimiento para la determinación de cannabinoides mediante


• Procedimiento para la determinación de cannabinoides mediante CG-MS,

código: POQ14-01.

• Procedimiento para la elaboración de la experticia toxicologíca forense in

vivo, código: POE00-01.

• Procedimiento para el registro y respaldo de la información, código:

POD00-01.

11. Sistema de control de la documentación:

113

En la sección se presenta el procedimiento de control de documentos del

área de código: POG00-01.

12. Formularios:

En la sección se presenta el índice maestro de documentos que servirá de

guía para la utilización del manual y los formularios relacionados a los POEs

contenidos en el manual. Se presentaron un total de 15 formularios

relacionados a los POEs estructurados.

13. Apéndice:

En esta sección se dejó el espacio para uso futuro del manual, cuando se

requiera colocar información complementaria relacionada con los POEs

incluidos en el manual.

El Manual de procedimiento para la elaboración de la Experticia

Toxicológica Forense in vivo se encuentra en el Anexo D del presente trabajo.

114

6. CONCLUSIONES

Una vez finalizada la investigación y analizado los resultados se pueden

indicar las siguientes conclusiones:

1. El laboratorio de toxicología forense no cuenta con un manual de

procedimiento para la elaboración de la experticia toxicológica forense in

vivo que brinden las directrices a seguir para realizar todos los

procedimientos que allí se ejecutan desde la recepción hasta la emisión de

la experticia.

2. La falta de procedimientos escritos para las actividades que se realizan en

el laboratorio de toxicología forense, incumplen con las directrices de

calidad emitidas por las normas ISO 9001:2008 e ISO/IEC 17025:2005,

utilizadas para garantizar la calidad en éste tipo de laboratorios de nivel

superior.

3. El manual de procedimientos realizado en la investigación atiende la

necesidad expresada por los expertos del laboratorio de toxicología forense

para organizar, unificar y establecer correctamente los procedimientos que

allí se realizan.

4. La estructura de los POEs que constituyen el manual de procedimientos,

fueron diseñados siguiendo la norma ISO/TR 10013:2001, esto con el fin de

comenzar a normar la documentación en los laboratorios de toxicología

forense, como paso inicial para establecer sistemas de calidad que logren la

115

acreditación internacional del laboratorio garantizando la calidad de los

resultados que se emiten.

5. Los métodos analíticos planteados en el manual de procedimientos para las

determinaciones tanto cualitativas como cuantitativas, permitirán al analista

realizar dos o más técnicas para el análisis de las muestras, asegurando así

la emisión de resultados certeros en la experticia toxicológica.

116

7. RECOMENDACIONES

1. Una vez implementado el manual de procedimientos planteado para el área

de toxicológicos in vivo, se recomienda que el mismo sea revisado

anualmente y actualizado cada vez que se realicen cambios en los

procedimientos.

2. Se recomienda validar cada uno de los procedimientos operativos

estándares planteados para mayor confiabilidad, reproducibilidad y calidad

de los resultados, demostrando que efectivamente cumplen con los

objetivos para los cuales fueron diseñados.

3. Implementar y capacitar al personal del laboratorio de manera continua

acerca del uso del manual y los procedimientos que lo constituyen.

4. Implementar sistemas de gestión en el laboratorio para asegurar la calidad

de los procesos que se realizan.

5. Desarrollar e implementar un manual para el manejo de los desechos del

laboratorio debido a la gran cantidad y variedad de ellos que se generan.

6. Desarrollar e implementar un manual de bioseguridad para el laboratorio de

toxicología forense con el fin de proteger al personal de los diferentes

riesgos a los que se encuentran expuestos.

117

8. REFERENCIAS

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[50] Gohlke R, McLafferty F. Early gas chromatography/ Mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 1993; 4: 367-371.

[51] Hans-Joachim H. Handbook of GC/MS. 2nd ed. Alemania; Wiley-VHC; 2009.

[52] Tilstone W, Savage K, Clark L. Forensic science: An encyclopedia of history, methods, and techniques. California; ABC-CLIO; 2006.

[53] Oficina de las Naciones Unidas contra la Droga y el Delito (UNODC). Directrices para la validación de métodos analíticos y la calibración del equipo utilizado para el análisis de drogas ilícitas en materiales incautados y especímenes biológicos. Manual de las Naciones Unidas. ST/NAR/41. New York. 2010; p. 1-67.

[54] Toxicology Procedures Manual. Virginia Department of Forensic Science. EEUU; 2016. p. 1-214.

[55] Munich P, Bonn M, et al. “Guideline for quality control in forensic-toxicological analyses”. Scientific Committee Quality Control; 2009. Consultada en Mayo 2017.Disponible en: https://www.gtfch.org/cms/index.php/en/guidelines

123

[56] Hernández R, Collado C, Baptista P. Metodología de la investigación. 4th ed. México; McGraw-Hill; 2006.p. 275-289.

[57] Escobar-Pérez J, Cuervo-Martínez A. Validez de contenido y juicio de expertos: una aproximación a su utilización. Avances en Medición. 2008; 6: 27-36.

[58] International Laboratory Accreditation Cooperation, ILAC-G19:2002. Guidelines for Forensic science Laboratories. Australia. p. 1-13

[59] Ministerio del Poder Popular para Ciencia y Tecnología. Código de Bioética y Bioseguridad. Venezuela: Fonacit; 2008. p. 22-32.

[60] Toxicology Procedures Manual. Virginia Department of Forensic Science. 2016

[61] Secretaria de Relaciones Exteriores (SRE). Guía técnica para la elaboración de manuales de procedimientos. México; 2004.

124

9. ANEXOS

ANEXO A. CUESTIONARIO APLICADO AL PERSONAL EXPERTO DEL LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA FORENSE IN VIVO

Instrucciones: El presente cuestionario fue realizado siguiendo como guía las normas ISO/IEC 17025:2005 (Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibración) e ISO 9001:2008 (Sistema de gestión de la calidad) y tiene como objetivo conocer su opinión como experto en el área de toxicología forense sobre los procedimientos que se realizan para la recepción, el análisis de las muestras y la emisión de los resultados, así como la existencia de manuales de procedimientos, documentos y registros que garanticen la conformidad de los procesos que allí se realizan. A continuación se presentan una serie de preguntas distribuidas en 07 tópicos principales las cuales solicito responder marcando con una X el espacio Si ó No que más se acerque a su opinión y de poseer algún comentario con respecto al ítems por favor escribirlo en el espació marcado como OBSERVACIONES para cada pregunta expuesta.

1. ESTRUCTURA DEL LABORATORIO N° Preguntas Si No OBSERVACIONES

1.1

Existe un organigrama del Laboratorio de Toxicología Forense (LTF). (De ser positiva su respuesta por favor indique en cual documento).

1.2

En caso de ser positivo, el organigrama del laboratorio se encuentra disponible para el personal que allí labora.

1.3

Se encuentra definida en algún documento la estructura de cargos que jerarquice la responsabilidad del personal en el LTF. De ser positiva su respuesta por favor indique en cual documento.

1.4 El personal experto conoce las funciones que debe realizar de acuerdo a su cargo.

125

2. PRÁCTICAS Y PROCEDIMIENTOS PARA LA RECEPCIÓN DE LAS MUESTRAS N° Preguntas Si No OBSERVACIONES

2.1

Posee el laboratorio de toxicología forense in vivo un manual de procedimientos donde se describan los pasos para la recepción de las muestras biológicas.


2.3

Si no dispone de un manual de procedimientos, existe algún documento, guía de trabajo ó procedimientos escritos disponibles, donde estén contenidas las directrices a seguir para la recepción de las muestras.

2.4

El personal cumple las medidas de seguridad dentro del laboratorio (equipos de protección personal) para la recepción de las muestras.

2.5

Las muestras son recibidas en el LTF junto al oficio, la encuesta, el consentimiento informado y la cadena de custodia para la realización del examen.

2.6 Se revisa el estado de las muestras antes de recibirlas.

2.7

Se verifica que las muestran biológicas hayan sido tomadas en los recipientes adecuados (limpios y secos) que provee el laboratorio: envase de vidrio o plástico para orina ó tubos colectores de sangre.

2.8 Se verifica que las muestras se encuentren cerradas herméticamente, antes de recibirlas en el laboratorio.

2.9

Se verifica que las muestras estén debidamente rotuladas, portando la siguiente información: • Nombre y apellido de la persona muestreada. • Número de registro de cadena de custodia. • Número de documento de identidad. • Fecha de colección de la muestra. • Tipo de muestra.

126


• Cantidad. • Nombre de anticoagulante o conservante. • Nombre y firma de la enfermera (o) que colecto o custodio la toma de la muestra.

2.10

Se revisa que la información dada en el oficio de solicitud del análisis y en la cadena de custodia concuerde con los datos marcados en el rotulo de las muestras.

2.11 El personal recibe capacitación para cumplir con los requerimientos que amerita la recepción de las muestras.

2.12 Se firma y sella el oficio y la cadena de custodia una vez recibida la muestra.

2.13 Se asigna a la muestra recibida el número de control interno del laboratorio.

2.14 La muestra y oficio recibido son identificados con el número de control interno del laboratorio.

2.15

La documentación recibida es colocada en el archivo de oficios nuevos de secretaria para su registro y asignación del número de control.

3. PRÁCTICAS Y PROCEDIMIENTOS PARA EL ALMACENAMIENT O DE LAS MUESTRAS N° Preguntas Si No OBSERVACIONES

3.1

Posee el laboratorio de toxicología forense in vivo un manual de procedimientos donde se describan los pasos a seguir para el almacenamiento de las muestras biológicas.


3.3

Si no dispone de un manual de procedimientos, existe algún documento, guía de trabajo ó procedimientos escritos disponible donde estén contenidas las directrices a seguir para el almacenamiento de las muestras.

127


3.4

El personal cumple con las medidas de seguridad dentro del laboratorio (equipos de protección personal) para el almacenamiento de las muestras.

3.5 Se almacenan las muestras en gradillas o recipiente de forma vertical (evitando derrames).

3.6 La temperatura del refrigerador para el almacenamiento está entre 2-8 °C.

3.7 Se controla y registra la temperatura diariamente

3.8 Se almacena el remanente de la muestra original como mínimo 2 años.

3.9 Existe un procedimiento escrito para el descarte de las muestras.

4. PRÁCTICAS Y PROCEDIMIENTOS PARA LA DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE OPIÁCEOS, BENZODIACEPINAS, COCAÍNA, ANFETAMINAS Y CANNABINOIDES EN LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS N° Preguntas Si No OBSERVACIONES

4.1

Posee el laboratorio de toxicología forense in vivo un manual de procedimientos donde se describan los pasos a seguir para la determinación cualitativa de opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las muestras biológicas.


4.3

Si no dispone de un manual de procedimientos, existe algún documento, guía de trabajo ó procedimientos escritos disponible donde estén contenidas las directrices a seguir para la determinación cualitativa de opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las muestras biológicas.

4.4

El personal experto recibe capacitación continua sobre los procedimientos a seguir para la determinación cualitativa de diferentes tipos de sustancias.

128


4.5

El personal cumple con las medidas de seguridad dentro del laboratorio (equipos de protección personal) para la determinación cualitativa de sustancias.

4.6 Se realiza la determinación cualitativa de alcohol etílico mediante microdifusión en cámara de Conway.

4.7

Se utilizan pruebas de inmunoensayo con dispositivo (Prueba rápida de un solo paso) para la determinación de opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las muestras biológicas.

4.8

Se utilizan pruebas de inmunoensayo enzimático heterogéneo (E.L.I.S.A) para la determinación de opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las muestras biológicas.

4.9

Existe un método para la determinación de opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides mediante Cromatografía de Capa Fina (CCF).

4.10

Está disponible algún documento que contenga la descripción de los sistemas para el desarrollo de las placas cromatográficas en CCF para la determinación de diferentes tipos de sustancias.

4.11

Está disponible algún documento que contenga la descripción de los reveladores más comunes a utilizar para la visualización de los diferentes tipos de sustancias en las placas cromatográficas.

4.12

Están validadas las diferentes técnicas analíticas (pruebas de inmunoensayo, E.L.I.S.A, CCF, microdifusión en cámara de Conway) para las determinaciones cualitativas de alcohol etílico, opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides.

4.13

Se dispone de una hoja de reporte específica para anotar los resultados cualitativos obtenidos de los análisis realizados a la muestra.

129

5. PRÁCTICAS Y PROCEDIMIENTOS PARA LA DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ALCOHOL ETÍLICO, OPIÁCEOS, BENZODIA CEPINAS, COCAÍNA, ANFETAMINAS Y CANNABINOIDES EN LAS MUESTRA S BIOLÓGICAS N° Pregun tas Si No OBSERVACIONES

5.1

Posee el laboratorio de toxicología forense in vivo un manual de procedimientos donde se describan los pasos a seguir para la determinación cuantitativa de alcohol etílico, opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las muestras biológicas.


5.3

Si no dispone de un manual de procedimientos, existe algún documento, guía de trabajo ó procedimientos escritos disponibles donde estén contenidas las directrices a seguir para la determinación cuantitativa de alcohol etílico, opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las muestras biológicas.

5.4

El personal experto recibe capacitación continua sobre los procedimientos a seguir para la determinación cuantitativa de los diferentes tipos de sustancias.

5.5

El personal cumple con las medidas de seguridad dentro del laboratorio (equipos de protección personal) para la determinación cuantitativa de sustancias.

5.6 Se realiza la determinación cuantitativa de alcohol etílico mediante microdifusión en cámara de Conway.

5.7

Se realiza la determinación cuantitativa de alcohol etílico mediante cromatografía de gases con autoanalizador de espacio en cabeza (CG-HS).

5.8

Están establecidos los valores mínimos y máximos de concentración que deben contener las curvas de calibración para la determinación de alcohol etílico, opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en la muestra biológica.

130


5.9

Se toma en cuenta la sensibilidad de los instrumentos analíticos utilizados, para realizar las curvas de calibración de las diferentes sustancias.

5.10

Se preparan por triplicado los estándares para las curvas de calibración para la cuantificación de las sustancias en las muestras biológicas por las diferentes técnicas.

5.11 Se realiza la cuantificación de las diferentes sustancias por el método del estándar externo.

5.12

Se utiliza la técnica analítica de cromatografía de gases con detector de ionización de llama (CG-FID) para los análisis cuantitativos de sustancias como opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las muestras biológicas.

5.13

Se utiliza la técnica analítica de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (CG-MS) para el análisis cuantitativo de sustancias como opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las muestras biológicas.

5.14

Se realiza la determinación cuantitativa de sustancias como opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en las muestras biológicas mediante el uso de Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC).

5.15

Están validadas las diferentes técnicas analíticas (microdifusión en cámara de Conway, CG-HS, CG-FID, CG-MS, HPLC) para las determinaciones cuantitativas de alcohol etílico, opiáceas, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides.

5.16

Se dispone de una hoja de reporte específica para anotar los resultados cuantitativos obtenidos de los análisis realizados a la muestra.

131

6. ELABORACIÓN DE LA EXPERTICIA TOXICOLÓGICA FORENS E IN VIVO N° Preguntas Si No OBSERVACIONES

6.1

Posee el laboratorio de toxicología forense un manual de procedimientos donde se describan los pasos a seguir para la elaboración de la experticia toxicológica forense in vivo.


6.3

Si no dispone de un manual de procedimientos, existe algún documento, guía de trabajo ó procedimientos escritos disponibles donde estén contenidas las directrices a seguir para la elaboración de la experticia toxicológica forense In vivo.

6.4 El o los expertos llenan la hoja de reporte de resultado final.

6.5 Se dispone de un formato para redactar la experticia toxicológica forense In vivo.

6.6

¿Se anota en el sistema digital del laboratorio la fecha y las iníciales del nombre y apellido del experto que elaboró la experticia?

6.7 Se imprimen y firman 3 folios de la experticia final.

6.8

Se archiva una experticia en el laboratorio junto al oficio, encuesta, consentimiento informado y cadena de custodia de la muestra para su resguardo.

6.9 Se entrega la experticia al ente solicitante. 7. PROCEDIMIENTOS PARA EL RE GISTRO Y RESPALDO DE LA INFORMACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS N° Preguntas Si No OBSERVACIONES

7.1

Posee el laboratorio de toxicología forense in vivo un manual de procedimientos donde se describan los pasos a seguir para el registro y respaldo de la información de los resultados obtenidos.

7.2


132


7.3

Si no dispone de un manual de procedimientos, existe algún documento, guía de trabajo ó procedimientos escritos disponible donde estén contenidas las directrices a seguir para el registro y respaldo de la información de los resultados obtenidos.

7.4 Se dispone de un libro para el registro de los resultados.

7.5 Se dispone de un registro digital para el respaldo de los resultados.

7.6 El jefe del laboratorio resguarda los respaldos de información realizados (digital y libro) en un sitio seguro.

7.7

Existe una base de datos digital del laboratorio para el registro de la información de los oficios que ingresan al laboratorio.

7.8 Se asigna un número de control en la base de datos digital para el seguimiento de la muestra.

7.9 Se anota el número de control en el oficio.

7.10 Existe un CD ó disco duro externo donde se respalde la información digital del laboratorio.

7.11 Se respalda diariamente la información digital del laboratorio.

7.12 Dispone el laboratorio de un libro para el registro de entrega de las experticias.

7.13

Se solicita un oficio de autorización de retiro de la experticia del laboratorio y documento de identidad a la persona que acude a retirarla.

7.14 Se solicita a la persona que retira la experticia que firme y llene sus datos en el libro de entrega de experticia.

Si posee comentarios, observaciones ó sugerencias adicionales por favor indíquelas:

133

ANEXO B.

CARTAS DE CERTIFICACIÓN POR PARTE DE EXPERTOS DEL CUESTIONARIO APLICADO

ANEXO C. RESULTADOS OBTENIDOS DEL ANÁLISIS ESTADÍST ICO DE LAS RESPUESTAS DADAS POR LOS EXPERTOS ALAPLICADO MEDIANTE LA PRUEBA EXACTA DE FISHER.

136

ANEXO C. RESULTADOS OBTENIDOS DEL ANÁLISIS ESTADÍST ICO DE LAS RESPUESTAS DADAS POR LOS EXPERTOS ALAPLICADO MEDIANTE LA PRUEBA EXACTA DE FISHER.

ANEXO C. RESULTADOS OBTENIDOS DEL ANÁLISIS ESTADÍST ICO DE LAS RESPUESTAS DADAS POR LOS EXPERTOS AL CUESTIONARIO APLICADO MEDIANTE LA PRUEBA EXACTA DE FISHER.

139

ANEXO D.

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTANDARES PARA LA EXPERTICIA TOXICOLÓGICA FORENSE IN VIVO DE FLUIDOS

BIOLÓGICOS HUMANOS EN VENEZUELA

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA EXPERTICIA TOXICOLÓGICA FORENSE IN VIVO

CÓDIGO: MPT01-01

Redactado por: Revisado por: Aprobado por: Angelina Brito Fecha: Febrero 2017

Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018

Versión original: Actualización N°: Fecha de vigencia: Marzo 2018 Fecha de vigencia:

Logo

de la





CÓDIGO: MPT01-01 Página 1 de 8


Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


Logo de la

Institución

TABLA DE CONTENIDO

1. Introducción

2. Objetivo del manual

3. Área de aplicación y alcance de los procedimientos

4. Responsables

5. Normas de uso del manual

6. Definiciones

7. Organigramas propuestos

8. Marco Legal

9. Diagrama de flujo del proceso

10. Procedimientos operativos estandarizados

11. Sistema de control de la documentación

12. Formularios

13. Apéndice




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


Logo de la

Institución

1. INTRODUCCIÓN:

El presente manual ha sido realizado para proporcionar un documento de

consulta que garantice la uniformidad de los procedimientos que se realizan

para llevar a cabo la experticia toxicológica forense in vivo en los laboratorios de

toxicología forense en Venezuela, permitiendo así que el personal experto

disponga de una herramienta que les permita realizar los diferentes

procedimientos como son: la recepción y el almacenamiento de las muestras, el

análisis de las diferentes sustancias, la interpretación de los resultados y la

emisión de la experticia final a ser entregada a las autoridades competentes.

Adicionalmente es una herramienta de ayuda para la inducción y entrenamiento

del personal, para el control interno de las actividades que se realizan en el

laboratorio unificando criterios de ejecución del trabajo. Reduciendo así, los

errores y las omisiones en los diferentes procedimientos que pongan en riesgo

la credibilidad y certeza de los resultados que se emiten.

El manual consta de 13 secciones donde se describen la introducción, el

objetivo del manual, el área de aplicación y alcance de los procedimientos,

responsabilidades del personal, las normas de uso del manual, definiciones de

interés, los organigramas propuestos para el laboratorio de toxicología forense,

el marco legal, el diagrama de flujo del proceso, los procedimientos operativos

estandarizados de las diferentes etapas que se realizan para emitir una

experticia toxicológica forense in vivo, el sistema de control de la

documentación, formularios y apéndice.




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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2. OBJETIVO DEL MANUAL:

Proporcionar un manual de procedimientos operativos estandarizados a

utilizar para el desarrollo de una experticia toxicológica forense in vivo que

norme los procedimientos realizados por el personal experto de los laboratorios

de toxicología forense en Venezuela.

3. ÁREA DE APLICACIÓN Y ALCANCE DE LOS PROCEDIMIENT OS:

El manual se establece como documento de referencia de los

laboratorios de toxicología forense en Venezuela, específicamente para el área

de Toxicológicos Forense in vivo a utilizarse para:

• Ejecución de los procedimientos operativos estándar para la recepción,

almacenamiento y análisis de las muestras biológicas recibidas; así

como, el registro y respaldo de la información en el laboratorio y la

emisión de la Experticia toxicológica forense in vivo.

• Entrenamiento y capacitación del personal.

• Requerimientos necesarios y personal responsable para la ejecución de

las diferentes actividades en el área.

• Control, actualización y modificación de la documentación.

4. RESPONSABLES:

El Jefe del Laboratorio de Toxicología Forense es el responsable de velar

por la ejecución, mantenimiento y actualización del manual, podrá en caso de

ser necesario solicitar la colaboración del personal profesional y administrativo

para la elaboración documentos. Es responsabilidad del personal experto que




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Institución

labora en el área cumplir con los requerimientos establecidos en el presente

manual.

5. NORMAS DE USO DEL MANUAL:

Las normas de actuación general a cumplirse por el personal

responsable de ejecutar los procedimientos incluidos en el manual son descritas

a continuación:

• Uso del presente manual como documento de referencia obligatoria para

el personal que se desempeña en el área de toxicológicos forense in

vivo, cada vez que realizen un procedimiento dentro del área.

• Uso del presente manual como documento de referencia para

entrenamiento y capacitación del personal.

• Es responsabilidad del Jefe del Laboratorio actualizar y divulgar el

contenido del manual.

• Sólo con la autorización del Jefe del Laboratorio se pueden realizar

modificaciones de los procedimientos e instrucciones incluidos en el

manual, realizando el control de cambio de procedimiento respectivo en

la documentación.

6. DEFINICIONES:

a) Formulario: Formas impresas o instructivos empleados para el

desarrollo de los procedimientos, los cuales se intercalan dentro de los

procedimientos o se adjuntan como complementos.

b) Manual de procedimientos: Documento de apoyo administrativo que

agrupa procedimientos precisos con un objetivo común, describiendo en

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA EXPERTICIA TOXICOLÓGICA FORENSE

Redactado por: Angelina Brito Fecha: Febrero 2017Versión original: Actualización N°:Fecha de vigencia: Marzo 201

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forma secuencial, ordenada y sistemática las i

distintas actividades que componen cada uno de los procedimientos que

lo integran.

c) Procedimiento:

presentadas por escrito, en forma narrativa para la realización de una

actividad o tarea

aplicación.

d) Procedimiento Operativo Estándar (POE):

escritas que documentan una actividad realizada por una organización.

7. ORGANIGRAMA

7.1. Organigrama

LABORATORIO TOXICOLOGIA FORENSE

DEPARTAMENTOS TOXICOLÓGICOS POST- MORTEN

DEPARTAMENTO POST-MORTEN

MUERTES VIOLENTAS

DEPARTAMENTO POST- MORTEN

CAUSAS DE MUERTES A

DETERMINAR


Revisado por: Aprobado por:

Febrero 2017 Fecha: Marzo 2018

Fecha:


forma secuencial, ordenada y sistemática las instrucciones de las


Procedimiento: Sucesión cronológica o secuencial de operaciones


actividad o tarea específica dentro de un ámbito predeterminado de

Procedimiento Operativo Estándar (POE): Conjunto de instrucciones


ORGANIGRAMA S PROPUESTOS:

Organigrama administrativo del laboratorio de toxicología forense:


DEPARTAMENTOS TOXICOLÓGICOS

DEPARTAMENTO MORTEN

MUERTES VIOLENTAS

DEPARTAMENTO MORTEN

CAUSAS DE MUERTES A

DETERMINAR

DEPARTAMENTO TOXICOLÓGICO

IN VIVO

DEPARTAMENTO SUSTANCIAS

LÍCITAS Ó ILÍCITAS

IN VIVO


Aprobado por:

Fecha: Marzo 2018

nstrucciones de las


Sucesión cronológica o secuencial de operaciones


específica dentro de un ámbito predeterminado de

Conjunto de instrucciones


laboratorio de toxicología forense:


DEPARTAMENTO SUSTANCIAS

LÍCITAS Ó SECRETARÍA

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA EXPERTICIA TOXICOLÓGICA FORENSE

Redactado por: Angelina Brito Fecha: Febrero 2017Versión original: Actualización N°:Fecha de vigencia: Marzo 201

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7.2. Organigrama de Toxicología

8. MARCO LEGAL

El presente manual de procedimientos para la experticia toxicológica forense

in vivo se sustenta en l

CONSTITUCIÓN DE LA REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUE LA

Título III. De los derechos humanos y garantías, y de los deberes

Art. 49. El debido proceso se aplicará a toda

administrativas.

QUÍMICOS Ó FARMACEUTICOS


Revisado por: Aprobado por:

Febrero 2017 Fecha: Marzo 2018

Fecha:


Organigrama de jerarquía de cargos del personal en el oxicología Forense in vivo:

MARCO LEGAL :


se sustenta en los ordenamientos jurídicos enunciados a continuación:



Capítulo I. Disposiciones Generales

El debido proceso se aplicará a todas las actuaciones judiciales y

Capítulo IV. Del Poder Ciudadano

Sección tercera. Del Ministerio Público

JEFE LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA FORENSE

JEFE DEPARTAMENTOÁREA DE TOXICOLÓGICOS

IN VIVO

EXPERTOS PROFESIONALESQUÍMICOS Ó FARMACEUTICOS

IN VIVO


Aprobado por:

Fecha: Marzo 2018

de jerarquía de cargos del personal en el Laboratorio


os ordenamientos jurídicos enunciados a continuación:



s las actuaciones judiciales y

Sección tercera. Del Ministerio Público




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Institución

Art. 285. Son atribuciones del Ministerio Público:

1. Ordenar y dirigir la investigación penal de la perpetración de los hechos

punibles para hacer constar su comisión con todas las circunstancias que

puedan influir en la calificación y responsabilidad de los autores o las autoras y

demás participantes, así como el aseguramiento de los objetos activos y

pasivos relacionados con la perpetración.

CÓDIGO ORGÁNICO PROCESAL PENAL (COPP)

Capítulo II. De los Requisitos de la Actividad Prob atoria

Sección sexta. De la experticia

Experticias

Art. 223. El Ministerio Público realizará u ordenará la práctica de experticias

cuando para el examen de una persona u objeto, o para descubrir o valorar un

elemento de convicción, se requieran conocimiento o habilidades especiales en

alguna ciencia, arte u oficio. El o la Fiscal del Ministerio Público, podrá señalarle

a los o las peritos asignados, los aspectos más relevantes que deben ser objeto

de la peritación, sin que esto sea limitativo, y el plazo dentro del cual

presentarán su dictamen.

Dictamen Pericial

Art. 225. El dictamen pericial deberá contener; de manera clara y precisa, el

motivo por el cual se practica, la descripción de la persona o cosa que sea

objeto del mismo, en el estado o del modo en que se halle, la relación detallada

de los exámenes practicados, los resultados obtenidos y las conclusiones que




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


Logo de la

Institución

se formulen respecto del peritaje realizado, conforme a los principios o reglas

de su ciencia o arte. El dictamen se presentará por escrito, firmado y sellado,

sin perjuicio del informe oral en la audiencia.

LIBRO SEGUNDO DEL PROCEDIMIENTO ORDINARIO

TÍTULO I. FASE PREPARATORIA

Capítulo II. Del Inicio del Proceso

Sección Primera. De la Investigación de Oficio

Investigación del Ministerio Público

Art. 265. El Ministerio Público, cuando de cualquier modo tenga conocimiento

de la perpetración de un hecho punible de acción pública, dispondrá que se

practiquen las diligencias tendientes a investigar y hacer constar su comisión,

con todas las circunstancias que puedan influir en su calificación y la

responsabilidad de los autores o autoras y demás partícipes, y el

aseguramiento de los objetos activos y pasivos relacionados con la

perpetración.


CÓDIGO: MPT01-01


Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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9. DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO:


CÓDIGO: MPT01-01


Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Diagrama de flujo de proceso del área de toxicología Forense in vivo

Cliente Recepción Almacenamiento / control de calidad

Análisis Redacción Experticia

Dirección

Inicio

Solicitud del análisis a persona por ente judicial

Entrega de muestra biológica

Entrega de documentos

Revisión condiciones

de la muestra

Registro de documentos en sistema

digital

Asignación de N° de control y

anotarlo en el oficio

Toma de muestra por

parte del personal de enfermería adscrito al laboratorio

Muestra aceptada

Si

Almacenar muestra en nevera y/o

congelador en gradillas evitando

derrames

No

Solicitud al personal de enfermería nueva toma

de muestra o solicitud de documentos al ente de

justicia solicitante del análisis

Registro de control de temperatura de

nevera y/ o congelador

Retirar muestra área de

almacenamiento

Análisis químico cualitativo y

cuantitativo de las muestras por

diferentes técnicas, hasta

obtener resultados de certeza

Anotar resultados obtenidos en hoja

de resultados para cada muestra

Organizar resultados finales con discusión en hoja de resultados

finales

Control de documentos

Almacenar respaldo de resultados

obtenidos de los análisis en

documento físico y digital (disco duro)

Registro resultados

en documento

físico y sistema

digital del área

Secretaria

Transcripción y revisiónla experticia

Imprimir folios de la experticia

Firma experticia por los

Registro en documento

físico y digital de entrega

de experticia

Entrega de experticia

solicitante

Secretaria

Transcripción y revisión de la experticia

Imprimir folios de la experticia

Firma de la experticia por los expertos

Registro en documento

físico y digital de entrega

de experticia

Entrega de experticia

al ente solicitante

Fin


CÓDIGO: MPT01-01


Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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10. PROCEDMIENTOS OPERATIVOS ESTANDARIZADOS (POEs):

PROCEDIMIENTO DE VERIFICACIÓN DE LA CALIBRACIÓN DE EQUIPOS E INSTRUMENTOS

DE LABORATORIO

CÓDIGO: POC00-01 Página 1 de 7


Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir en los laboratorios de toxicología forense para la

verificación de la calibración de los equipos usados en el área de Toxicología

Forense in vivo.

2. ALCANCE/CAMPO DE APLICACIÓN:

El presente procedimiento se establece como instructivo único a seguir en los

laboratorios de Toxicología Forense en Venezuela, cada vez que se requiera

realizar la verificación de la calibración de los siguientes equipos e

instrumentos:

• Baños de maría y/o planchas eléctricas

• Neveras y congeladores

• Balanzas

• Centrífugas

• Cromatógrafo de gases (CG)

3. RESPONSABLES:

• Este procedimiento es de obligatorio cumplimiento por todo el personal

de expertos profesionales Farmacéuticos y Químicos que laboran en el

área. Es responsabilidad del jefe del Laboratorio de Toxicología Forense

divulgar, actualizar y controlar el cumplimiento de este procedimiento.

• Es responsabilidad de todo el personal experto del laboratorio de

toxicología mantener la integridad de la evidencia mientras permanezca

en su custodia, protegiéndola de pérdida, cambio ó contaminación.


DE LABORATORIO



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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4. MEDIDAS DE SEGURIDAD DEL PERSONAL:

Todo el personal experto que trabaja en los laboratorios de toxicología forense

debe conocer y cumplir con las medidas de bioseguridad, manejo de reactivos y

utilizar equipos de protección personal tales como: bata de laboratorio, guantes

desechables, lentes de protección y mascarilla (dependiendo del reactivo o

solvente a manipular), calzado cerrado y ropa adecuada para trabajar dentro de

un laboratorio.

5. DEFINICIONES:

a) Calibración: Serie de operaciones que sirven para determinar, en

condiciones específicas, la relación existente entre los valores indicados por

un instrumento o un sistema de medición y los valores mensurados o

correspondientes a un material de referencia.

b) Equipo: En general son todos los aparatos necesarios para realizar una

operación.

c) Instrumento: Dispositivo para hacer una medición por sí solo o en

combinación con otro equipo.

d) Verificación: Confirmación mediante el examen y la aportación de pruebas

objetivas de que se han cumplido los requisitos especificados.

e) Procedimiento Operativo Estándar (POE): Conjunto de instrucciones



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Fecha: Marzo 2018

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6. DESCRIPCIÓN DEL PROCESO:

6.1. Condiciones generales:

• El laboratorio deberá estar provisto del equipamiento necesario,

incluyendo materiales de referencia que permitan realizar las

calibraciones que se requieran de los equipos.

• Los patrones y materiales certificados deberán conservarse siguiendo las

instrucciones del fabricante con el fin de mantener su estado de

calibración.

• Todos los equipos deben estar identificados para ello ver etiqueta en

formulario código: FCT00-01.

• Se deben llevar registros de todos los equipos que incluyan:

o Nombre del equipo

o Nombre del fabricante, modelo, número de serie u otro dato de

identificación tal como lo es el número asignado por la institución

como bien nacional.

o Fecha de adquisición y puesta en servicio.

o Área donde estará el equipo.

o Instrucciones de uso y mantenimiento del fabricante.

o Informe de todas las calibraciones o verificaciones realizadas.

o Fecha en que debe realizarse la próxima verificación

o Historial de verificaciones y/ o calibraciones.

6.2. Verificación del equipo / Instrumento:

6.2.1. Baño de María y/o plancha eléctrica:

• Establecer el criterio de exactitud o rango de temperatura en el que

deberá funcionar cada baño de María y/o plancha eléctrica.


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• No sobrecargar la capacidad de los equipos.

• Controlar que el baño de María siempre tenga el nivel adecuado de

agua.

• Verificar la temperatura del baño de María y /o plancha 2 veces al día

cuando se encuentren en uso, comprobando que se encuentren dentro

del rango de temperatura establecido para el instrumento.

• Registrar en el cuaderno de registro del equipo la temperatura obtenida.

• El operador de ser necesario puede variar la temperatura de operación

del baño de María y/o plancha eléctrica, registrando la operación.

• Limpiar el instrumento de acuerdo a las recomendaciones del fabricante

una vez por semana.

• Registrar las operaciones de mantenimiento, calibración, reparación y

acciones correctivas realizadas al equipo.

6.2.2. Neveras y/o congeladores:

• Verificar la temperatura de funcionamiento se encuentre en el rango

establecido.

• No sobrecargar la capacidad del equipo.

• Registrar la temperatura del equipo diariamente anotándola en el

formulario de control de la temperatura de neveras y congeladores

(código: FCA00-01).

• El personal responsable deberá ajustar la temperatura de ser necesario y

registrarla.

• Realizar la limpieza de las neveras y/o congeladores una vez por

semana de acuerdo a las especificaciones del fabricante.


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6.2.3. Balanzas:

• Ubicar las balanzas en mesones estables y anti-vibratorios.

• No sobrecargar la capacidad de las balanzas.

• Diariamente chequear el punto cero de la balanza antes y después de su

uso.

• Verificar la calibración de las balanzas una vez al mes y registrar los

datos obtenidos en el cuaderno de calibración dispuesto para el equipo.

• Realizar la calibración mediante el uso de pesas certificadas trazables a

estándares nacionales o internacionales.

• Limpiar la balanza superficialmente una vez por semana o cada vez que

se requiera por derrames o salpicaduras, realizar la limpieza de acuerdo

a las especificaciones del fabricante.



6.2.4. Centrífugas:

• Ubicar las centrífugas en mesones estables.

• No sobrecargar la capacidad de la centrífuga.

• Verificar el funcionamiento de la centrífuga mediante el monitoreo de la

separación de las fases en las muestras.

• Limpiar de manera superficial la centrífuga una vez por semana o cada

vez que se requiera por derrames o salpicaduras, realizar la limpieza de

acuerdo a las especificaciones del fabricante.


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• Verificar el funcionamiento inspeccionando las revoluciones por minuto

(rpm) con un tacómetro mecánico o electrónico.



6.2.5. Cromatógrafo de gases:

• Ubicar el cromatógrafo de gases en mesones estables.

• Realizar la limpieza de la columna y sistema de inyección diariamente

antes y después de utilizar el equipo mediante el pase de solventes

orgánicos que remuevan impurezas de las sustancias analizadas.

• Mantenimiento mensual o cuando se requiera de septum, sistema de

inyección, presión del gas y filtros internos de acuerdo a especificaciones

del fabricante.

• Verificar la calidad y condición de la columna mensualmente, mediante la

inyección de estándares certificados verificando el tiempo de retención

en la columna.

• Verificar la sensibilidad del detector, señal de base y ruido de fondo

mensualmente mediante el análisis de patrones y su comparación con

verificaciones anteriores.

• Calibrar anualmente la temperatura del horno, mediante el uso de un

pirómetro portátil de referencia o un termómetro de precisión situándolo

lo más cerca posible al sensor de temperatura del horno.




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7. FORMULARIOS:

• FCT00-01: Etiqueta para identificación de equipos e instrumentos de

laboratorio.

• FCA00-01: Formulario de control de la temperatura de neveras y

congeladores.

8. DOCUMENTACIÓN DE REFERENCIA:

• Gotelli C. Manual práctico para el control de calidad interno en el

Laboratorio Toxicológico. Metepec: ECO/OPS/OM; 1993.

• Oficina de las Naciones Unidas contra la Droga y el Delito (UNODC).

Directrices para la validación de métodos analíticos y la calibración del

equipo utilizado para el análisis de drogas ilícitas en materiales

incautados y especímenes biológicos. Manual de las Naciones Unidas.

ST/NAR/41. New York. 2010.

• Oficina de las Naciones Unidas contra la droga y del delito. Glosario de

términos sobre garantía de calidad y buenas prácticas de laboratorio.

Manual de las Naciones Unidas UNODC. ST/NAR/26/Rev.1. New York.

2012.

9. ANEXOS:

No aplica.

PROCEDIMIENTO PARA LA RECEPCIÓN DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS EN EL LABORATORIO

DE TOXICOLOGÍA FORENSE

CÓDIGO: POR00-01 Página 1 de 10


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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir en los laboratorios de toxicología forense para la

recepción de muestras biológicas: orina y sangre provenientes de personas

vivas incursas en procesos legales, a fin de estandarizar y optimizar el proceso

de recepción, para dar cumplimiento a las experticias toxicológicas forense in

vivo solicitadas por los entes administradores de justicia.



laboratorios de toxicología forense en Venezuela, cada vez que se requiera

realizar la recepción de muestras biológicas provenientes de personas vivas.

3. RESPONSABLES:
















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un laboratorio.

5. DEFINICIONES:

a) Muestra: Parte representativa de la totalidad del material que ha de

someterse a ensayo.

b) Fluido biológico / Matriz biológica: Material de origen biológico que

contiene el analito.

c) Sangre / Sangre completa: Fluido que circula a través de las arterias,

capilares y venas. Compuesta de plasma, células rojas (eritrocitos) y células

blancas (linfocitos, leucocitos, plaquetas, etc.).

d) Orina: Fluido de excreción generado por los riñones.

e) Oficio de solicitud de análisis: Documento emitido por el ente u

organismo solicitante el cual es remitido al laboratorio para solicitar la

realización de los análisis.

f) Planilla de registro de cadena de custodia: Planilla de registro que

mediante su llenado permitirá garantizar el manejo idóneo de las evidencias

durante todas las etapas del proceso penal. Permitirá conocer los datos

identificativos de todas las personas que manipulen, procesen o almacenen

la evidencia física.





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g) Encuesta: Estudio realizado a personas u organizaciones para reunir

información sobre sus actividades o su funcionamiento.

h) Consentimiento informado: Documento informativo que permite al sujeto

dar voluntariamente su aprobación para realizar un estudio.

i) Número de control: Numeración obtenida por el sistema digital del

laboratorio al ingresar los datos del oficio de solicitud de análisis,

permitiendo identificar una muestra con respecto al número total de

muestras que ingresan en el laboratorio por mes y año.

j) Número de control interno: Numeración consecutiva asignada a las

muestras y oficios que ingresan a un área específica del laboratorio que

permite identificar la muestra entre todas las muestras que ingresen al área

por mes.

k) Procedimiento Operativo Estándar (POE): Conjunto de instrucciones



6.1. Parámetros de aceptación de la muestra biológi ca: ver anexo N° 1

1) Recepción de muestra de orina:

a. Verificar que la muestra esté colectada en recipientes de vidrio o plástico, de

boca ancha y tapa a rosca, con diámetro y altura acorde a la cantidad de

muestra que posea y se encuentren cerrados herméticamente evitando

derrames y pérdidas.





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b. La muestra no debe poseer conservantes cuando son remitidas el mismo día

de su toma al laboratorio.

c. Verificar la cantidad de muestra a recibir (cantidad ideal a recibir entre 5-50

mL) y anotar el volumen de muestra en la parte superior del oficio de solicitud

del análisis con tinta indeleble y letra legible.

Nota: En caso de recibir menor cantidad de las muestras biológicas a las

sugeridas, el analista podrá priorizar los análisis a realizar de modo de cubrir la

mayor cantidad de sustancias a determinar de acuerdo al caso, pudiendo no

completar el total de los análisis requeridos. Quedando esta información

señalada en la experticia final (FET01-01).

2) Recepción de muestra de sangre:

a. Verificar que se encuentre en un recipiente de vidrio o plástico (tubos

colectores de sangre) cerrado herméticamente evitando derrames y

pérdidas, sin cámaras de aire, la muestra no debe poseer anticoagulantes o

conservantes cuando son remitidas el mismo día de su toma al laboratorio.

b. En caso de no remitirse la muestra inmediatamente al laboratorio, podrá

contener anticoagulantes tipo heparinoides o de pasar un plazo mayor a 24

horas antes de llevarse al laboratorio se deberá añadir una pequeña cantidad

de NaF al 1%.

c. Verificar la cantidad de muestra a recibir (cantidad ideal a recibir entre 5-15

mL) y anotar la cantidad en la parte superior del oficio de solicitud del análisis

con tinta indeleble y letra legible.

Nota: En caso de recibir menor cantidad de las muestras biológicas a las

sugeridas, el analista podrá priorizar los análisis a realizar de modo de cubrir la

mayor cantidad de sustancias a determinar de acuerdo al caso, pudiendo no





Fecha: Marzo 2018

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completar el total de los análisis requeridos. Quedando esta información

señalada en la experticia final (FET01-01).

3) Verificar que el o los envases se encuentren rotulados con tinta indeleble y

letra legible en su parte externa mediante una etiqueta que contenga (Ver

anexo N° 2):

• Nombre y apellido de la persona muestreada.

• Número de registro de cadena de custodia

• Número de cédula de identidad o documento de identidad

• Fecha de colección de la muestra

• Tipo de muestra

• Cantidad de muestra (mL)

• Nombre de anticoagulante o conservante (Si posee)

• Nombre y firma de la enfermera (o) que colecto o custodio la toma de la

muestra.

4) Verificar que los datos del rótulo estén en concordancia con los datos

aportados en el oficio de solicitud del examen toxicológico, registro de

cadena de custodia, encuesta aplicada y consentimiento informado.

5) En caso de no cumplirse los parámetros antes mencionados las muestras no

se recibirán en el laboratorio.

6.2. Parámetros de aceptación de los documentos que deben entregarse

en el laboratorio junto con las muestras biológicas :

1) Recibir oficio de solicitud del examen toxicológico emitido por el organismo

correspondiente (ver formulario código: FRT00-01), el cual debe poseer:

Nombre del organismo solicitante del análisis, datos personales del individuo

de quien se obtuvo las muestras: nombres y apellidos, N° de C.I o pasaporte





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y edad, solicitud del examen toxicológico, firma y sello del responsable de

emitir dicho oficio y la fecha.

2) Recibir encuesta para la toma de la muestra aplicada a la persona a quien se

le realizará el estudio, firmada y llenada por la enfermera (o) que realizó la

toma de la muestra. (ver formulario código: FRT01-01).

3) Recibir registro de cadena de custodia debidamente llenada (formulario

código: FRT02-01).

4) Recibir consentimiento informado para realizar el examen debidamente

llenado y firmado por la persona a la que se le realizará el examen, en caso

de ser menor de edad ó persona con discapacidad deberá estar firmado por

su representante legal. (ver formulario código: FRT03-01).

5) Engrapar todos los documentos antes mencionado.

6) Se debe aceptar la muestra sólo si son entregados todos los documentos

antes mencionados, si se encuentran debidamente llenados y sin enmiendas.

7) En caso de no cumplirse los parámetros antes mencionados las muestras y

documentación no serán recibirán en el laboratorio.

6.3. Trámites administrativos:

Si la muestra y los documentos recibidos cumplen con todos los parámetros de

aceptación antes mencionados se procederá a:

1) Registrar los datos que correspondan en la planilla de registro de cadena de

custodia (FRT02-01), incluyendo firma de responsabilidad y sello de la

institución.

2) Se firmará el oficio de solicitud del examen toxicológico (FRT00-01) en la

parte inferior derecha y se colocará fecha de recepción, iníciales del nombre





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y apellido del experto que está recibiendo las muestras, N° de documento de

identidad o credencial (de poseerla) y sello del laboratorio.

3) Asignar el número de control interno del laboratorio anotándolo de forma

legible e inequívoca, marcador permanente o lápiz graso en el rótulo de la

muestra y con tinta indeleble en el oficio de solicitud del examen toxicológico.

4) Almacenar la muestra para resguardarla hasta el momento de su análisis.

(Ver POE código: POA00-01).

5) Colocar en el archivo del área de secretaría designado como “Archivo para

oficios nuevos”, los documentos solicitados en el punto 6.2 del presente POE

debidamente engrapados, para su ingreso y registro en el sistema

digitalizado del laboratorio para asignar el número de control. (ver POE

código: POD00-01).

7. FORMULARIOS:

• FRT00-01: Formato de oficio de solicitud del examen toxicológico.

• FRT01-01: Formato de encuesta para la toma de la muestra aplicada a la

persona a quien se le realizará el estudio.

• FRT02-01: Planilla de registro de cadena de custodia.

• FRT03-01: Formato de consentimiento informado.

• FET01-01 Formato de Experticia Toxicológica Forense in vivo.


• Flanagan R, Taylor A, Watson I, Whelpton R. Fundamentals of analytical

toxicology. England; John wiley & Sons Ltd; 2007.

• Manual de química y toxicología forense. Fiscalía General del Estado

Ecuador. 2014.





Fecha: Marzo 2018

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• Ministerio Público. Manual Único de Procedimientos en Materia de

Cadena de Custodia de Evidencias Físicas. Venezuela: MP; 2012.




2012.

• Oficina de las Naciones Unidas contra la droga y del delito. Orientaciones

para la implantación de un sistema de gestión de la calidad en los

laboratorios de análisis de drogas. Manual de las Naciones Unidas

UNODC. ST/NAR/37. New York. 2009.

• Society of Forensic Toxicologists/ American Academy of Forensic

Sciences. Forensic Toxicology Laboratory Guidelines. SOFT/AAFS;

2006.

• Toxicology Procedures Manual. Virginia Department of Forensic Science.

2016.





Fecha: Marzo 2018

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9. ANEXOS:

Anexo N° 1. Diagrama de flujo para la recepción de muestras en los laboratorios

de toxicología forense

Si

No

Recibir muestras y respectiva documentación

¿Cumplen?

Verificar el rótulo de los envases

Rechazar muestra

Revisar documentos: oficio, cadena de custodia, consentimiento informado y entrevista

Revisar la integridad de las muestras y sus contenedores

Anotar en la muestra y el oficio el número de control interno del laboratorio

Anotar en el oficio tipo y cantidad de muestra recibida

Almacenar las muestras

Firmar, llenar los datos requeridos, sellar y archivar la documentación para su registro en secretaría





Fecha: Marzo 2018

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Anexo N° 2. Modelo de rótulo y ubicación en el recipiente.

Rótulo

Nombre y Apellido: ________________

N° C.I o pasaporte: ________________

N° cadena de custodia: _____________

Fecha: __________________________

Tipo de muestra: __________________

Cantidad (mL): ___________________

Anticoagulante o conservante: _______

Enfermera (o):________ Firma:_______

Rótulo

PROCEDIMIENTO PARA EL ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS EN EL

LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA FORENSE

CÓDIGO: POA00-01 Página 1 de 8


Fecha: Marzo 2018

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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir para el almacenamiento de las muestras biológicas:

orina y sangre provenientes de personas vivas que ingresen al laboratorio de

toxicología forense, a fin de estandarizar y optimizar las condiciones de

almacenamiento, para dar cumplimiento a las experticias toxicológicas forense

in vivo solicitadas por los entes administradores de justicia.




realizar el almacenamiento de muestras biológicas provenientes de personas

vivas.

3. RESPONSABLES:















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un laboratorio.

5. DEFINICIONES:

a) Congelador: Equipo de refrigeración empleado para el mantenimiento de

productos que requieran temperatura controlada de refrigeración por debajo

de los 0 °C.



c) Muestra: Parte representativa de la totalidad del material que ha de

someterse a ensayo.

d) Nevera: Equipo de refrigeración empleado para el mantenimiento de

productos que requieran de una temperatura controlada.

e) Orina: Fluido de excreción generado por los riñones.

f) Plasma: Parte líquida de la sangre libre de células.

g) Procedimiento Operativo Estándar (POE): Conjunto de instrucciones






Fecha: Marzo 2018

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h) Sangre / Sangre completa: Fluido que circula a través de las arterias,




6.1. Materiales y equipos requeridos:

• Nevera y/o congelador

• Gradillas para tubos de ensayos

• Cavas o recipientes para almacenamiento vertical de las muestras

• Centrifuga para tubos de ensayos (opcional: solo en caso de requerir

almacenar muestras de sangre)

• Tubo de ensayo con tapa a rosca (opcional: solo en caso de requerir

almacenar muestras de sangre)

6.2. Condiciones del área de almacenamiento, nevera s y congeladores:

1) Colocar la muestra en un área segura del laboratorio, la cual posea neveras

y/o congeladores, el área será de acceso restringido para personas no

autorizadas (solo acceso personal experto del laboratorio de toxicología

forense in vivo), evitando que la misma puedan ser robadas, cambiadas o

manipuladas.

2) La nevera destinada para el almacenamiento debe estar a temperatura entre

2-8 °C (preferiblemente 4 °C).

3) Registrar la temperatura de la nevera diariamente, anotándola en el

formulario de control de la temperatura de neveras y congeladores (código:

FCA00-01).





Fecha: Marzo 2018

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4) El personal responsable debe ajustar la temperatura de ser necesario y

registrarla.

5) No sobrecargar las unidades de refrigeración.

6.3. Almacenamiento de las muestras biológicas pre- análisis:

Pasos a seguir para almacenar las muestras biológicas de no realizar los

análisis inmediatamente a su recepción (ver anexo N° 1):

1) Ordenar las muestras biológicas recibidas en el POE código: POR00-01, por

orden de llegada de acuerdo al número de control interno asignado y el tipo

de muestra, colocándolas en gradillas o recipientes de manera vertical.

2) Colocar las gradillas o recipientes contentivos de las muestras dentro de la

nevera evitando pérdida o derrame (ver anexo N°2).

6.4. Almacenamiento de las muestras biológicas post - análisis:

Pasos a seguir para almacenar el remanente de las muestras biológicas una

vez tomada la alícuota para realizar los análisis:

1) Muestra de orina:

El remanente de muestra de orina deberá conservarse en su envase original

rotulado y cerrado herméticamente, colocándolo dentro del congelador a

temperaturas entre -15 a -20 °C por un periodo de 2 años.

2) Muestra de sangre:

• Colocar el remanente de la muestra de sangre completa en su

contenedor dentro de la centrifuga y centrifugarlo a 2000-3000 r/min

hasta separar el plasma de la sangre completa (se observaran 2 fases

siendo el plasma la fase más líquida y de color amarillento).





Fecha: Marzo 2018

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• Retirar el plasma del envase mediante el uso de una pipeta limpia y

seca; y colocarla en un tubo de ensayo limpio y seco. Cerrarlo

herméticamente.

• Rotular el tubo de ensayo contentivo del plasma con la información

aportada en el rótulo de la muestra de sangre original, colocándole una

etiqueta escrita con tinta indeleble y letra legible en su parte externa, el

rótulo debe contener datos como: Nombre y apellido de la persona

muestreada, número de registro de cadena de custodia, número de

cédula de identidad o documento de identidad, fecha de colección de la

muestra, tipo de muestra, cantidad de muestra (mL) y nombre de

anticoagulante o conservante (Si posee).

• Almacenar tanto la sangre y el plasma debidamente rotulados, dentro de

un congelador a temperaturas entre -15 a -20 °C por un periodo de 2

años.

Nota: Los remanentes de las muestras originales almacenadas debidamente

rotuladas, pueden ser utilizados para realizar una nueva experticia de ser

solicitada por algún ente competente o para un posterior análisis

complementario.

7. FORMULARIOS:

• FCA00-01: Formulario de control de la temperatura de neveras y

congeladores.





Fecha: Marzo 2018

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• Flanagan R, Braithwaite R, Brown S, Widdop B, Wolf F. Basic analytical

toxicology. Inglaterra; World Health Organization:1995.




Ecuador. 2014.

• Munich P, Bonn M, et al. “Guideline for quality control in forensic-

toxicological analyses”. Scientific Committee Quality Control; 2009.

Consultada en Mayo 2017. Disponible en:

https://www.gtfch.org/cms/index.php/en/guidelines


2016





Fecha: Marzo 2018

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9. ANEXOS:

Anexo N° 1. Diagrama de flujo para el almacenamiento de muestras biológicas

en los laboratorios de toxicología forense

Si

No

Las muestras recibidas manipularlas con cuidado, evitando daños o derrames

¿Requiere confirmar un

análisis?

Guardar por 2 años remanente de las muestras biológica en sus envases debidamente rotulados y cerrados en un congelador a T= -15 a -20 °C para nueva experticia o análisis futuro. Separa plasma de la sangre previamente.

Descartar la muestra

Colocar las muestras en gradillas ordenadas de acuerdo al número de control interno asignado y el tipo de muestra dentro del refrigerador a T= 2-8 °C

Utilice la muestra original almacenada





Fecha: Marzo 2018

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Anexo N° 2. Almacenamiento de las muestras en el refrigerador debidamente

rotuladas

T= 4°C

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE ALCOHOL ETÍLICO MEDIANTE MICRODIFUSIÓN

EN CÁMARA DE CONWAY

CÓDIGO: POQ00-01 Página 1 de 16


Fecha: Marzo 2018

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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir para la determinación cualitativa y cuantitativa de

alcohol etílico en muestras de sangre provenientes de personas vivas incursas

en procesos legales mediante la técnica de microdifusión en cámara de

Conway, a fin de estandarizar y optimizar los procedimientos a realizar para dar

cumplimiento a las experticias toxicológicas forense in vivo solicitadas por los

entes administradores de justicia.




realizar la determinación de alcohol etílico en muestras de sangre provenientes

de personas vivas, mediante la técnica de microdifusión en cámara de Conway.

3. RESPONSABLES:












Fecha: Marzo 2018

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un laboratorio.

5. DEFINICIONES:

a) Alcohol etílico: Compuesto orgánico de fórmula química C2H5OH,

molécula de hidrocarburo alifático, incoloro, polar, soluble en agua y lípidos.

b) Analito: Sustancia que debe identificarse o medirse.

c) Calibrador: Analito puro en un disolvente o matriz apropiados que se utiliza

para preparar la curva de calibración.

d) Curva de calibración: Relación gráfica realizada entre la respuesta de las

señales del instrumento y diversas concentraciones del analito en un

disolvente o matriz apropiados.

e) Material de referencia certificada (Patrón de re ferencia certificado):

Material de referencia que ha sido certificado por un procedimiento técnico

los valores de una o más propiedades, se declara el tiempo de expiración y

se acompaña de un certificado u otra documentación expedidos por un

organismo de certificación.





Fecha: Marzo 2018

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f) Microdifusión en cámara de Conway: Método de aislamiento del o los

analitos, basado en la liberación de un compuesto volátil de una muestra

mediante un reactivo liberador colocado en el compartimiento exterior de la

cámara de Conway.

g) Muestra en blanco: Muestra que no contiene el analito.

h) Patrón o estándar: Muestra de una fuente identificada adquirido para ser

comparado con una muestra problema.

i) Procedimiento Operativo Estándar (POE): Conjunto de instrucciones


j) Solución Estándar: Solución de concentración conocida.

k) Solución Madre: Solución estándar concentrada que se prepara a partir de

un material caracterizado, utilizado para preparar calibradores.


6.1. Consideraciones del proceso:

El alcohol etílico es administrado vía oral difundiéndose a través de las

membranas celulares, siendo rápidamente absorbido por el tracto

gastrointestinal (GI) distribuyéndose a todo el organismo. Más del 90 % del

etanol ingerido es metabolizado por el hígado a acetaldehído por acción del

alcohol deshidrogenasa y adicionalmente es oxidado a acetato y dióxido de

carbono. Entre 5 a 10 % es excretado sin cambios por los riñones, los pulmones

y el sudor.





Fecha: Marzo 2018

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6.2. Fundamento o principio del ensayo:

Determinación del analito mediante la técnica de microdifusión en cámara de

Conway, el analito se libera de la matriz biológica mediante la acción de un

agente liberador solución concentrada de carbonato de potasio (K2CO3),

colocándolos ambos en el compartimiento intermedio de la cámara de Conway.

La cámara se tapa y se deja incubar a temperatura ambiente hasta completar la

difusión del analito desde el compartimiento intermedio al interno el cual

contiene un reactivo fijador solución ácida de dicromato de potasio (K2Cr2O7 +

H2SO4) que atrapa al analito liberado. En el proceso se lleva a cabo una

reacción de oxido-reducción, el Cromo del reactivo fijador es reducido pasando

su estado de oxidación de Cr VI (color anaranjado) a Cr III (color verde) y el

alcohol presente en la muestra es oxidado a aldehído (Etanal) y posteriormente

de forma más lenta continúa la oxidación del aldehído a ácido acético,

observándose un cambio de coloración de naranja a verde- azul, como se

representa en la siguiente reacción general:

3C2H5OH + 2K2Cr2O7 + 8H2SO4 3CH3COOH + 2Cr2(SO4)3 + 2K2SO4 + 11H2O

2CrO4

-2 + 2H+ Cr2O7-2 + H2O

2 [Cr2O7-2 + 14H+ + 6e- 2Cr3+ + 7H2O]

3 [C2H5OH + H2O CH3COOH + 4H+ + 4e-]

2Cr2O7-2 + 16H+ + 3C2H5OH 4Cr+3 + 3CH3COOH + 11H2O


• Cámara de Conway

• Balón aforado: 10 mL , 20 mL y 100 mL





Fecha: Marzo 2018

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• Beacker: 200 mL, 1 L

• Cilindro graduado de 200 mL

• Pipeta Pasteur: 0,5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 5 mL y 10 mL

• Equipo de Espectrofotómetro UV – Visible

• Envase para baño de hielo

6.4. Reactivos Requeridos:

• Dicromato de potasio

• Carbonato de potasio

• Alcohol Etílico (99,7 % pureza ) (grado analítico)

• Ácido sulfúrico concentrado

• Agua destilada

• Hielo

6.5. Preparación de los reactivos a utilizar:

6.5.1. Solución ácida de Dicromato de Potasio:

1) En un beacker de 200 mL pesar 3,75 g de Dicromato de potasio y añadir 150

mL de agua destilada previamente medido en un cilindro graduado.

2) Trasvasar cuantitativamente la solución anterior a un beacker de aprox. 1 L

de capacidad y colocarlo dentro de un baño de hielo para bajar la

temperatura de la reacción exotérmica que se llevará a cabo.

3) Agregar 280 mL de ácido sulfúrico concentrado en forma lenta y agitando

continuamente.

4) Retirar la solución del baño de hielo y una vez que adquiera la temperatura

ambiente completar a un volumen de 650 mL con agua destilada.





Fecha: Marzo 2018

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5) Guardar la solución en un envase de 1 L de capacidad color ámbar, rotular y

almacenar a temperatura ambiente para su uso.

6.5.2. Solución saturada de Carbonato de Potasio:

1) Pesar 540 g de carbonato de potasio anhidro en un beacker de 1 L de

capacidad y disolver con 600 mL de agua destilada mediante agitación

continua.

2) Dejar reposar a temperatura ambiente por unos minutos y llevar a un

volumen de 1 L con agua destilada.

3) Trasvasar la solución a un envase de 1 L de capacidad color ámbar, rotular y

almacenar a temperatura ambiente para su uso.

6.6. Curva de calibración alcohol etílico:

6.6.1. Preparación solución Madre de etanol al 4%:

Tomar con una pipeta volumétrica 5,1 mL de etanol puro (99,7 %) y llevarlo a

100 mL en un balón aforado.

6.6.2. Preparación soluciones estándares:

Preparar los estándares tomando para cada estándar el volumen (V) respectivo

de alícuota de la solución madre y llevarlo al balón aforado señalado

previamente rotulado. Llevar a aforo con agua destilada:





Fecha: Marzo 2018

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Tabla 1. Preparación de las soluciones estándar de etanol. Estándar Concentración (g/L) V alícuota solución madre (mL) V balón aforado (mL)

1 0,5 2,5 20

2 0,7 3,5 20

3 1,0 5 20

4 1,5 7,5 20

5 2,0 5 10

6 3,0 15 20

Nota: El límite de detección del alcohol etílico por este método es de 0,5 g/L.

6.7. Tratamiento previo de la muestra:

1) Sacar del área de almacenamiento la muestra de sangre recibida en el

laboratorio y dejar reposar a temperatura ambiente por aproximadamente 30

min antes de realizar el análisis.

2) Tomar con cuidado el recipiente contentivo de la muestra de sangre el cuál

debe estar cerrado herméticamente, sin cámara de aire dentro del mismo y

agitar de forma manual suavemente, inclinando el recipiente contentivo de la

muestra de sangre de un lado a otro por unos segundos para homogenizar.

3) Realizar la determinación de alcohol etílico en la muestra de sangre

mediante la técnica de Microdifusión en cámara de Conway.

6.8. Ejecución del ensayo para la determinación del alcohol etílico

mediante microdifusión en cámara de Conway:

El procedimiento debe realizarse para la muestra y el blanco de manera

simultánea:





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1) Colocar en el mesón de trabajo la cámara de Conway destapada. Ver anexo

N° 1.

2) Añadir en:

• Compartimiento interno (A): 2 mL de la solución ácida de dicromato de

potasio (K2Cr2O7 en ácido sulfúrico)

• Compartimiento intermedio (B):1 mL de solución saturada de carbonato

de potasio (K2CO3) en un lado de la cámara y al frente colocar 1 mL de

sangre (Las soluciones colocadas en B no deben ponerse en contacto

hasta que la cámara esté totalmente cerrada).

• Compartimiento externo (C): colocar 1 mL de carbonato de potasio

(K2CO3) distribuido en diferentes puntos de la cámara para que la misma

quede totalmente sellada al taparla.

3) Tapar inmediatamente la cámara al agregar la muestra de sangre y hacerla

girar cuidadosamente de forma circular sobre su mismo eje en el mesón de

trabajo para poner en contacto la muestra con el reactivo del compartimiento

intermedio (B).

Nota: En caso de contaminarse la solución del compartimiento interno (A) con

la solución del compartimento intermedio (B), se debe descartar la celda y

comenzar de nuevo el procedimiento en una celda nueva evitando

contaminación.

4) Dejar a temperatura ambiente por 1 hora para que se produzca la

microdifusión.

5) Destapar la cámara y proceder a realizar el análisis cualitativo y cuantitativo,

ver anexo N° 2.





Fecha: Marzo 2018

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Nota: Método no específico para etanol, las sustancias volátiles tales como:

metanol, isopropanol, acetona u otras sustancias volátiles podrían generar

cambios de coloración en el reactivo de Conway.

6.8.1. Para prueba cualitativa:

1) Destapar y observar la coloración del compartimiento interno (A) de la

cámara de Conway que contiene la muestra blanco, la cual debe estar de

color anaranjado.

2) Observar la coloración del compartimiento interno (A) de la cámara de

Conway que contiene la muestra a analizar y compararla con la coloración

observada de la muestra blanco, si la solución contenida en el

compartimiento interno (A) presenta cambio de color original anaranjado a

verde ó celeste indica resultado positivo (ver anexo N°3).

3) Reportar resultado cualitativo en formulario de reporte de resultados

(FQT00-01), colocando POSITIVO si se observo cambio de coloración en el

compartimiento interno (A) y NEGATIVO si no se observa cambio de

coloración en el compartimiento interno (A).

6.8.2. Para prueba cuantitativa:

1) Si observa cambio de color en el compartimiento interno y requiere

cuantificar la cantidad de etanol presente en la sangre, tomar con una pipeta

Pasteur toda la solución del compartimiento interno (A) de manera

cuantitativa y colocarla en un balón aforado de 10 mL.

2) Enjuagar varias veces con pequeños volúmenes de agua destilada el

compartimiento interno de la cámara hasta completar el volumen de aforo del

balón y mezclar por inversión.





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3) Preparación del Blanco: Con una pipeta volumétrica colocar 2 mL de

solución sulfúrica de dicromato de potasio en un balón aforado de 10 mL y

aforar con agua destilada, mezclar por inversión.

4) Preparación del Estándar: Para una solución de etanol 2 % tomar con una

pipeta volumétrica 2,5 mL de etanol puro y trasvasarlo cuantitativamente a un

balón aforado de 100 mL llevándolo a aforo con agua destilada.

5) Leer de manera independiente las soluciones muestra, blanco y estándar en

el espectrofotómetro a 450 nm utilizando como cero agua destilada y anotar

en hoja de resultados (FQT00-01).

Nota: Para el uso del espectrofotómetro UV-Visible consultar el manual de

operación propio del equipo.

6) Realizar la curva de calibración del etanol a partir de las lecturas obtenidas

de absorbancia por los estándares analizados con el programa propio del

equipo de espectrofotometría UV- Visible.

Nota: Cuando se realiza la curva de calibración el valor de absorbancia dado

por el blanco no debe ser restado a las otras lecturas, sino tomado como punto

correspondiente a la concentración cero (C=0).

7) Calcular la concentración de alcohol etílico presente en la muestra mediante

cálculos de regresión lineal a partir de la ecuación de la recta (ver

ecuaciones n° 1 y 2):

• Ecuación n°1. Ecuación de la recta:

� = �� ± �

• Ecuación n°2. Despeje de la variable x





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� = � ± �� × �

Donde x es la concentración del analito en la muestra; y es la absorbancia;

m es la pendiente de la curva (Factor de calibración); b es la intercepción del

valor de la Absorbancia (eje y) y FD es el factor de dilución en caso que la

muestra requiera ser diluida.

8) Reportar resultado de concentración de alcohol etílico en sangre expresado

en g/L en el formulario de reporte de resultados (FQT00-01).

9) Para la interpretación de los resultados obtenidos ver correlación de

concentración de alcohol etílico y síntomas clínicos asociados en formulario

código: FQT01-01.

7. FORMULARIOS:

• FQT00-01: Formulario de reporte de resultados para cada muestra.

• FQT01-01: Lista de correlación de concentración de alcohol etílico y

síntomas clínicos asociados.


• Barile F. Clinical toxicology principles and mechanisms. Florida; CRC

Press LLC; 2004.

• Biancucci G, González D, Pérez A, Ridolfi A, Strobl A. Manual de

Procedimientos Analíticos Toxicológicos para Laboratorios de Baja

Complejidad. Asociación Toxicológica Argentina. 2007. Basado en: Basic

Analytical Toxicology. Flanagan R, Braichwaite R, Brown S, Widdop B,

de Wolf F. United Nations Environment Programme, International Labour





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Organization. WHO. International Programne on chemical safety. Geneva

1995.


toxicology. Inglaterra;World Health Organization;1995.




Ecuador. 2014.




2012.

• Organización Mundial de la Salud. Glosario de términos de alcohol y

drogas. Publicación de la Organización Mundial de la Salud. 1994.

• Repetto M. Toxicología avanzada. Madrid; Díaz de Santos; 1995.





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9. ANEXOS:

Anexo N° 1. Disposición de los reactivos y muestra en la cámara de Conway

B: Compartimiento Intermedio

A: Compartimiento Interno

(Solución ácida de dicromato de potasio)

C: Compartimiento Externo (1 mL K2CO3)

K2Cr2O7 + H2SO4

K2CO3

Sangre





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Anexo N° 2. Diagrama de flujo para la determinación de alcohol etílico en la

muestra de sangre mediante microdifusión en cámara de Conway.

No Si No

Si

Tomar la muestra de sangre recibida

Agitar para homogeneizar

Realizar análisis mediante microdifusión en cámara

de Conway

¿La muestra se refrigeró?

Retirar la muestra del frío y esperar que alcance la temperatura ambiente

1

Corroborar las condiciones de la muestra y su rótulo

¿Muestra a t ambiente?





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Si

No

Calcular la concentración de etanol y reportarlo en g/L

¿Cambió el color de la

soluc. en A?

1

Colocar en la cámara de conway compartimiento interno (A): 2 mL de solución ácida de K2Cr2O7, compartimiento externo (C): 1 mL de K2CO3

en diferentes puntos, compartimiento intermedio (B): 1 mL de solución de K2CO3 + 1 mL de sangre en lados opuestos y tapar la cámara.

Girar la cámara cuidadosamente en su mismo eje y dejar difundir a T ambiente por 1 hora

Reportar resultado Negativo de alcohol etílico en sangre

Cuantifique la cantidad de etanol: tomar la solución de A, colocarla en un balón aforado de 10 mL, enjuagar con pequeños volúmenes de H2O(d) el compartimiento A y con la misma completar hasta el aforo. Procedimiento a realizarse para la muestra y el blanco.

Prepare un estándar de solución de etanol al 2 % .

Leer independiente las soluciones muestra, blanco y estándar en el espectrofotómetro a 450 nm utilizando como cero agua destilada.

Anotar resultados en formulario código: FQT00-01





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Anexo N° 3. Resultados mediante microdifusión en cámara de Conway:

Donde A es el blanco; B es la prueba negativa; C, D, E y F son pruebas positivas donde F (color verde - celeste) es indicativo de niveles máximos de etanol en sangre.

A B C

D E F

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE ALCOHOL ETÍLICO EN SANGRE

MEDIANTE CG-HS



Fecha: Marzo 2018

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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir para la determinación cuantitativa de alcohol etílico

en muestras de sangre provenientes de personas vivas incursas en procesos

legales mediante la técnica de cromatografía de gases con autoanalizador

Headspace (CG-HS), a fin de estandarizar y optimizar los procedimientos a

realizar para dar cumplimiento a las experticias toxicológicas forense in vivo

solicitadas por los entes administradores de justicia.




realizar la determinación de alcohol etílico en muestras de sangre provenientes

de personas vivas, mediante la técnica de CG-HS.

3. RESPONSABLES:









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un laboratorio.

5. DEFINICIONES:

a) Alcohol etílico: Compuesto orgánico de fórmula química C2H5OH,

molécula de hidrocarburo alifático, incoloro, polar, soluble en agua y lípidos.

b) Analito: Sustancia que debe identificarse o medirse.

c) Calibrador: Analito puro en un disolvente o matriz apropiados que se utiliza


d) Cromatografía de gases (CG): Técnica analítica de separación, donde la

fase móvil es un gas y la fase estacionaria un sólido adsorbente o un líquido

retenido en un soporte sólido o impregnando las paredes de una columna

capilar.

e) Curva de calibración: Relación gráfica realizada entre la respuesta de las

señales del instrumento y diversas concentraciones del analito en un

disolvente o matriz apropiados.


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f) Estándar interno: Compuesto que se añade a una muestra en una

concentración conocida para facilitar la identificación cualitativa y/o

cuantitativa de los componentes de la muestra. Su composición debe ser de

estructura similar a la del analito.

g) Headspace: Dispositivo automatizado que se acopla al CG el cual recolecta

la fase de vapor contenida dentro de un contenedor sellado el cuál contiene

una muestra líquida o sólida para su análisis.

h) Material de referencia certificada (Patrón de re ferencia certificado):





i) Muestra en blanco: Muestra que no contiene el analito.

j) Patrón o estándar: Muestra de una fuente identificada adquirido para ser


k) Procedimiento Operativo Estándar (POE): Conjunto de instrucciones


l) Solución Estándar: Solución de concentración conocida.

m) Solución Madre: Solución estándar concentrada que se prepara a partir de



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El alcohol etílico es administrado vía oral difundiéndose a través de las

membranas celulares, siendo rápidamente absorbido por el tracto

gastrointestinal (GI) distribuyéndose a todo el organismo. Más del 90 % del

etanol ingerido es metabolizado por el hígado a acetaldehído por acción del

alcohol deshidrogenasa y adicionalmente es oxidado a acetato y dióxido de

carbono. Entre 5 a 10 % es excretado sin cambios por los riñones, los pulmones

y el sudor.


Determinación del analito mediante la técnica de cromatografía de gases

acoplada a autoanalizador de headspace (CG-HS), el analito es liberado de la

muestra líquida o sólida colocándolo en un vial sellado, el cual es calentado a

temperatura predeterminada hasta alcanzar el equilibrio entre las fases,

produciéndose una mezcla de gases en la fase de vapor. Luego una alícuota de

la fase de vapor generada es tomada y transferida al cromatógrafo de gases

para su separación y análisis de los componentes.


• Equipo de cromatógrafo de gases con autoanalizador Headspace (CG-

HS)

• Gases Hidrógeno y Helio

• Balón aforado: 100 mL


• Micropipetas de 100 µL.


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• Viales 2mL con tapa de goma y aluminio para sellar


• Alcohol Etílico (99,7 % pureza) (grado analítico)

• Alcohol Isopropílico (99 % pureza) (grado analítico)

• Agua destilada

6.5. Curva de calibración alcohol etílico:

6.5.1. Preparación solución Madre de etanol al 4%:

Tomar con una pipeta volumétrica 5,1 mL de etanol puro (99,7 %) y llevarlo a

100 mL en un balón aforado.



de alícuota de la solución madre y llevarlo al balón aforado señalado


Tabla 1. Preparación de las soluciones estándar de etanol. Estándar Concentración (g/L) V alícuota solución madre (mL) V balón aforado (mL)

1 0,5 2,5 20

2 0,7 3,5 20

3 1,0 5 20

4 1,5 7,5 20

5 2,0 5 10

6 3,0 15 20

Nota: El límite de detección del alcohol etílico por este método es de 0,5 g/L.


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1) Sacar del área de almacenamiento la muestra de sangre recibida en el

laboratorio y dejar reposar a temperatura ambiente por aproximadamente 30

min antes de realizar el análisis.

2) Tomar con cuidado el recipiente contentivo de la muestra el cuál debe estar

cerrado herméticamente, sin cámara de aire dentro del mismo y agitar de

forma manual suavemente, inclinando el recipiente contentivo de la muestra

de sangre de un lado a otro por unos segundos para homogenizar.

3) Realizar la determinación de alcohol etílico en la muestra de sangre

mediante la técnica de CG-HS. Ver anexo N° 1.

6.7. Ejecución del ensayo para la determinación del alcohol etílico

mediante CG-HS:

6.7.1. Preparar el estándar interno Alcohol Isoprop ílico 1 %:

Tomar 1,3 mL de alcohol Isopropílico puro (99 %) con una pipeta volumétrica y

trasvasarlo cuantitativamente a un balón aforado de 100 mL llevándolo a aforo

con agua destilada.

6.7.2. Preparación muestras patrones:

Rotular 3 viales de 2 mL con el nombre: Muestra patrón 1, Muestra patrón 2 y

Muestra patrón 3, indicando la concentración de etanol que contenga cada vial

respectivamente:

• Muestra patrón 1: En un vial de 2 mL añadir 100 µL de una muestra de

sangre libre del analito de interés, 100 µL del estándar interno de alcohol

Isopropílico 1 % y contaminar con 100 µL de solución estándar de


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alcohol etílico 0,5 g/L, tapar el vial mediante el uso de un tapón de goma,

un precinto de aluminio y sellar herméticamente con el uso del sellador.




alcohol etílico 1,5 g/L, tapar el vial mediante el uso de un tapón de goma,





alcohol etílico 3 g/L, tapar el vial mediante el uso de un tapón de goma,


6.7.3. Preparación soluciones estándares con adició n del estándar

interno:

1) Tomar viales limpios y secos de 2 mL de capacidad e identificarlos con las

diferentes concentraciones de los estándares (Realizar este paso por

triplicado para cada estándar para un total de 18 viales): 0,5; 0,7; 1,0; 1,5; 2,0

y 3,0 g/L de etanol respectivamente para realizar la curva de calibración.

2) Colocar en cada vial mediante el uso de la micro pipeta una alícuota de 100

µL de las soluciones estándar de 0,5; 0,7; 1,0; 1,5; 2,0 y 3,0 g/L

respectivamente y adicionar a cada uno de ellos 100 µL del estándar interno

de alcohol isopropílico 1 %, tapar cada uno de los viales con un tapón de

goma, un precinto de aluminio y sellar herméticamente con el uso de un

sellador. (ver anexo N° 2)


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6.7.4. Preparación Muestra problema con adición del estándar interno:

Realizar el procedimiento descrito a continuación para cada muestra que desee

analizar cuidando de rotular adecuadamente cada uno de los viales:

1) Tomar un vial de 2 mL de capacidad limpio y seco e identificarlo con el

número de la muestra problema.

2) Colocar una alícuota de 100 µL de estándar interno de utilizando la

micropipeta, adicionar 100 µL de muestra y cerrar con el tapón de goma

sellando herméticamente con el precinto de aluminio mediante el uso de un

sellador.

6.7.5. Secuencia de viales a ser colocados en el CG -HS:

1) Colocar los 18 viales contentivos de las soluciones estándares en el

muestreador, ordenados de menor a mayor concentración por triplicado para

realizar la curva de calibración.

2) Colocar el set de viales de muestras problemas a analizar de acuerdo a la

secuencia descrita a continuación:

• Muestra patrón 1

• Muestras problemas (lote 1: 10 muestras)





6.7.6. Lectura en el cromatógrafo de gases acoplado a un autoanalizador

de espacio en cabeza con detector FID:

1) Encender el CG-HS-FID


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2) Colocar las condiciones de operación del equipo dadas a continuación:

Tabla 2. Condiciones de operación del CG-HS.

Inyector Columna

Modo: Automático Columna:

Rtx-BAC1 ó Rtx-BAC2

Longitud (m): 30

Temperatura Inyección (°C): 100

Diámetro interno (mm): 0.32

Modo: Presión constante

Purga: Off Presión (psi): 10

Flujo inicial (mL/min): 2,4

Detector Horno (rampa de Temperatura)

Detector: FID Temperatura inicial (°C):

30 por 1min

Tipo de Gas: Helio Velocidad (°C/min): 10

Velocidad de datos (Hz):

20.000

Temperatura final (°C): 100

Unidad Headspace

Modo HS:

Temperatura Horno (°C):

Temperatura aguja (°C):

Temperatura transferencia (°C):

Tiempo inyección (min):

Tiempo presurización (min):

Presión gas arrastre (psi):

Constante

60

65

80

0.04

0.5

27


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Fecha: Marzo 2018

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Nota: Las condiciones de operación del equipo pueden ser ajustadas para

mejorar el desempeño del equipo, las mismas pueden variar de acuerdo al

modelo del CG-HS y condiciones ambientales para esto se recomienda

consultar el manual de operación propio del equipo.

3) Dejar que el instrumento alcance las condiciones de operación establecidas.

4) Realizar dos inyecciones de estándares: Concentraciones de 0,5 g/L y 3,0g/L

para identificar el tiempo de retención de los analitos a determinar y permitir

un acondicionamiento óptimo del sistema.

5) Inyectar las soluciones estándares programando el software del equipo

siguiendo las indicaciones del fabricante.

6) Realizar mediante el sistema de integración propio del software del equipo el

cálculo del promedio de las 3 réplicas de estándar inyectada para cada

concentración, realizar la curva y guardar en una carpeta del programa

interno del equipo.

7) Antes de iniciar la corrida de las muestras, anotar cuidadosamente en el

software del equipo el número de identificación de cada muestra y la posición

en la que se encuentre en el plato muestreador.

8) Inyectar la secuencia de muestras problemas y muestras de patrón

colocadas en el muestreador.

9) Calcular la concentración de cada muestra problema expresada en unidad de

g/L mediante el software de integración propio del equipo, usando el método

del estándar externo e interpolación de áreas utilizando la curva de

calibración realizada y almacenada en la memoria del equipo.

10) Una vez finalice el análisis realizar el acondicionamiento del equipo siguiendo

las condiciones indicadas por el fabricante y posteriormente apagar el

equipo.


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Fecha: Marzo 2018

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11) Reportar el resultado obtenido de la concentración de alcohol etílico en la

muestra problema en la hoja de reporte de resultados (FQT00-01).

12) Para la interpretación de los resultados obtenidos ver correlación de

concentración de alcohol etílico y síntomas clínicos asociados en formulario

código: FQT01-01.

7. FORMULARIOS:


• FQT01-01: Lista de correlación de concentración de alcohol etílico y

síntomas clínicos asociados.


• Barile F. Clinical toxicology principles and mechanisms. Florida; CRC

Press LLC; 2004.

• Ferrari L. Análisis toxicológico de etanol y su interpretación forense. Rev.

Ciencia Forense Latinoamericana. 2008; 2 (1-2) 20-35.





• Forensic Toxicology Quality Manual. Arkansas State Crime Laboratory.

2009.




MEDIANTE CG-HS



Fecha: Marzo 2018

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2012.

• Organización Mundial de la Salud. Glosario de términos de alcohol y

drogas. Publicación de la Organización Mundial de la Salud. 1994.

• Repetto M. Toxicología avanzada. Madrid; Díaz de Santos; 1995.

9. ANEXOS:

Anexo N° 1. Diagrama de flujo para la determinación de alcohol etílico en la

muestra de sangre mediante CG-HS.

No Si No

Si

Tomar la muestra de sangre recibida


Realizar análisis mediante CG-HS

¿La muestra se refrigeró?

Retirar la muestra del frío y esperar que alcance la temperatura ambiente

1

Revisar las condiciones de la muestra y su rótulo

¿Muestra a t ambiente?


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Fecha: Marzo 2018

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Anotar resultados en formulario código FQT00-01

Si

No

Calcular la concentración de etanol y reportarlo en g/L

¿Preparó las

soluciones?

1

Preparar estándar interno de alcohol isopropílico 1%

Preparar 3 muestras control añadiendo: 100 µL de la muestra, 100 µL estándar interno y 100 µL del patrón (utilizar una concentración del patrón diferente para cada muestra control)

Colocar las condiciones de trabajo en el CG- HS y leer las soluciones colocando los viales en la siguiente secuencia: 2 inyecciones de estándar (alta y baja concentración), patrones para la curva de calibración, Lote 1 de muestras problemas (aprox. 10 muestras), Muestra control 1, alternar lote de muestra con muestras control.

Preparar por triplicado estándares para la curva de calibración: 0,5; 0,7; 1,0; 1,5; 2,0 y 3,0 g/L de etanol añadiendo a cada vial 100 µL del patrón y 100 µL estándar interno.

Preparar la muestra problema añadiendo en un vial de 2 mL: 100 µL de la muestra y 100 µL estándar interno, cerrar herméticamente.


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Fecha: Marzo 2018

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Anexo N° 2. Preparación de los estándares para la curva de calibración:

100 µL Solución patrón [g/L] +

100 µL Solución estándar interno alcohol isopropílico 1 %

Estándar 1: [0.5g/L]

E1 E1

E1

E2 E2

E2

E3 E3

E3

Estándar 2: [0.7g/L] Estándar 3: [1.0g/L]

E4 E4

E4


E5 E5

E5


E6 E6

E6


PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE SUSTANCIAS MEDIANTE

PRUEBA DE INMUNOENSAYO CON DISPOSITIVO



Fecha: Marzo 2018

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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir para la determinación cualitativa de sustancias, tales

como: opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas, cannabinoides, entre

otras; en muestra de orina provenientes de personas vivas incursas en

procesos legales mediante prueba de inmunoensayo con dispositivo (prueba

rápida de un solo paso), a fin de estandarizar y optimizar los procedimientos a

realizar para dar cumplimiento a las experticias toxicológicas forense in vivo

solicitadas por los entes administradores de justicia.




realizar la determinación de diferentes sustancias en muestra de orina

provenientes de personas vivas, mediante prueba de inmunoensayo con

dispositivo (prueba rápida de un solo paso).

3. RESPONSABLES:












Fecha: Marzo 2018

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un laboratorio.

5. DEFINICIONES:

a) Analito: Sustancia que debe identificarse o medirse.



c) Inmunoensayo: Prueba que usa la formación de complejos antígeno-

anticuerpo para generar resultados perceptibles.

d) Metabolitos: Compuesto producido en el cuerpo humano como resultado

de procesos bioquímicos.

e) Orina: Fluido de excreción generado por los riñones.

f) Procedimiento Operativo Estándar (POE): Conjunto de instrucciones






Fecha: Marzo 2018

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g) Prueba de inmunoensayo con dispositivo: Prueba rápida de un solo

paso, en donde se da la unión entre un antígeno (tóxico presente en la

muestra) y su anticuerpo correspondiente.



Determinación cualitativa del analito mediante prueba de inmunoensayo con

dispositivo (prueba rápida de un solo paso), el dispositivo es sumergido hasta la

marca correspondiente en la muestra biológica, ascendiendo la muestra por

capilaridad a través de la tira absorbente del dispositivo de modo que el analito

y/o metabolitos presentes en la muestra biológica compite con el conjugado de

la droga del dispositivo por unirse a los sitios de unión del anticuerpo presente

también en el dispositivo, observándose una línea de color en la región de

control y otra línea de color en la región de prueba si el analito de interés está

presente en la muestra biológica estudiada.


• Dispositivo de inmunoensayo: la prueba rápida de un solo paso viene

lista para ser utilizada. Cada prueba es específica para una sustancia en

particular, seleccione el dispositivo específico de acuerdo a la sustancia

que requiera identificar.


1) Sacar del área de almacenamiento la muestra de orina recibida en el

laboratorio, dejar reposar la muestra por aproximadamente 30 min a

temperatura ambiente antes de realizar el análisis.





Fecha: Marzo 2018

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2) Tomar con cuidado el recipiente contentivo de la muestra de orina el cuál

debe estar cerrado herméticamente y agitar de forma manual suavemente,

inclinando el recipiente contentivo de la muestra de un lado a otro por unos

segundos para homogenizar.

3) Realizar la determinación cualitativa de las diferentes sustancias en la

muestra biológica de orina mediante la prueba de inmunoensayo con

dispositivo (prueba rápida de un solo paso). Ver anexo N° 1.

6.4. Ejecución del ensayo para la determinación cua litativa de sustancias

mediante prueba de inmunoensayo con dispositivo (pr ueba rápida de

un solo paso):

Los modelos de dispositivos, tipos de sustancias que detectan, interferencia de

otras sustancias y la sensibilidad de los dispositivos son variables por lo que se

recomienda leer las instrucciones dadas por el fabricante antes de su uso. A

continuación se describen los pasos generales para su uso:

1) Seleccionar el tipo de sustancia a determinar y escoger la prueba de

inmunoensayo correspondiente para ello.

Nota: En caso de requerir analizar varias sustancias puede escoger una prueba

múltiple, la cual consta de varias tiras rápidas agrupadas en un solo dispositivo.

2) Las bolsas contentivas de las tiras reactivas deben estar selladas y solo

abrirse en el momento de realizar el análisis.

3) Retire el dispositivo de prueba del empaque. Ver anexo N° 2.

4) Identificar el dispositivo con el número de control de la muestra a analizar y

fecha.

5) Tomar una alícuota de aproximadamente 1 mL de orina y colocarla en un vial

limpio y seco.





Fecha: Marzo 2018

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6) Sumergir en el envase contentivo de la alícuota de orina el dispositivo de

forma vertical con las flechas del mismo señalando la muestra de orina hasta

la línea máxima (MAX). Si el dispositivo posee una tapa retirar la tapa antes

de sumergir.

7) Mantener sumergido en posición vertical el dispositivo por un lapso de 10 a

15 segundos hasta que la orina ascienda por capilaridad.

8) Retirar el dispositivo de la muestra de orina (si posee tapa cerrarlo) y

colocarlo de manera horizontal sobre una superficie no absorbente limpia,

seca y plana.

9) Tapar la muestra de orina y colocarla en una gradilla para evitar pérdidas o

derramamiento de la misma, si no se va a realizar otro análisis de manera

inmediata almacenar.

10) Leer los resultados a los 5 min una vez se observe la línea o líneas de

tonalidad rosa-roja en la ventana de los resultados. No interpretar los

resultados pasados 10 min. Para interpretar los resultados, ver anexo N° 3:

• Resultado Negativo: se observan dos líneas paralelas en la ventana de

resultados una en la zona de control (C) y la otra adyacente en la zona

de prueba (T), indica que el nivel de droga se encuentra por debajo del

límite de detección o que no hay presencia de la droga en la orina.

• Resultado Positivo: se observa una línea en tono rosa – rojo en la zona

de control (C) y ninguna línea en la zona de prueba (T), indica que hay

un resultado positivo preliminar para la droga correspondiente. Dicho

resultado positivo no es conclusivo y debe ser confirmado por otra

técnica analítica.

• Resultado invalido: Si no se observa ninguna línea en la zona de

control (C) es indicativo de un volumen insuficiente de la muestra, daño





Fecha: Marzo 2018

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del dispositivo o inadecuada ejecución de la técnica. Se debe revisar el

procedimiento realizado y repetir la prueba utilizando un nuevo

dispositivo.

Nota: La intensidad o grosor de las líneas no son significativos, cualquier línea

por muy débil que ésta sea debe ser considerada.

11) Anotar los resultados en la hoja de reporte de resultados de la muestra.

(Formulario código: FQT00-01)

Nota: Los límites de detección pueden variar de acuerdo al fabricante del

dispositivo, en general los límites de detección referenciales para algunas

sustancias pueden encontrarse en: 300 ng/mL para cocaína, benzodiacepinas y

opiáceos, 50 ng/mL para cannabinoles (THC) y 1000 ng/mL para anfetaminas.

7. FORMULARIOS:





Complejidad. Asociación Toxicológica Argentina. 2007; p.1-184. Basado

en: Basic Analytical Toxicology. Flanagan R, Braichwaite R, Brown S,

Widdop B, de Wolf F. United Nations Environment Programme,

International Labour Organization. WHO. International Programne on

chemical safety. Geneva 1995.







Fecha: Marzo 2018

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• Manual de Métodos Analíticos Toxicológicos. Universidad autónoma de

Chiapas.2010.

9. ANEXOS:

Anexo N° 1. Diagrama de flujo para la determinación de sustancias mediante

prueba de inmunoensayo con dispositivo.

Retirar la muestra de orina del frío y dejar reposar aprox. 30 min temperatura ambiente

Sumergir el dispositivo verticalmente en la orina hasta la línea máxima (MAX) por 10-15 segundos

Anotar el resultado en la hoja de reporte (FQT00-01)

Agitar la muestra de orina para homogeneizar

Retirar el dispositivo de inmunoensayo del empaque y rotularlo con el número de control de la muestra y fecha

Retirar el dispositivo de la orina y colocarlo de manera horizontal en una superficie limpia y plana

Interpretar los resultados luego de 5 a 10 min





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Anexo N° 2. Dispositivo para prueba de inmunoensayo

Donde (1) es el área de identificación y manejo del dispositivo; (2) sustancia a

determinar; (3) zona de control (C); (4) zona de prueba (T); (5) línea máxima y

(6) área de aplicación de la muestra

Anexo N° 3. Interpretación de los resultados obtenidos mediante la prueba de

inmunoensayo

1

COC

THC

N°:

____

____

__

Nom

bre:

____

____

____

____

___

C T

C T

Max

M

ax

2 3 4 6 5

C

T

C

T

C

T

Resultado Negativo

Resultado Positivo

Resultado Inválido


PRUEBA DE INMUNOENSAYO E.L.I.S.A



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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir para la determinación cualitativa de sustancias, tales

como: opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y cannabinoides en

muestra de orina y/o sangre provenientes de personas vivas incursas en

procesos legales mediante prueba de inmunoensayo enzimático heterogéneo

(siglas en ingles E.L.I.S.A: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), a fin de

estandarizar y optimizar los procedimientos a realizar para dar cumplimiento a

las experticias toxicológicas forense in vivo solicitadas por los entes

administradores de justicia.




realizar la determinación de diferentes sustancias en muestra de orina y/o

sangre provenientes de personas vivas, mediante prueba de inmunoensayo

enzimático heterogéneo (E.L.I.S.A).

3. RESPONSABLES:












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un laboratorio.

5. DEFINICIONES:




c) Inmunoensayo: Prueba que usa la formación de complejos antígeno-

anticuerpo para generar resultados perceptibles.

d) Metabolitos: Compuesto producido en el cuerpo humano como resultado


e) Muestra Control Positiva (MCP): Muestra contentiva de la matriz biológica

libre del analito fortificada con patrón certificado similar al analito.

f) Muestra Control Negativa (MCN): Muestra contentiva de una matriz

biológica libre de analito.

g) Orina: Fluido de excreción generado por los riñones.





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h) Patrón o estándar: Muestra de una fuente identificada adquirido para ser




j) Prueba de inmunoensayo enzimático heterogéneo: Prueba de

inmunoensayo donde se precisa la separación del antígeno marcado con

una enzima, para evitar interferencia con la marca del complejo.

k) Sangre / Sangre completa: Fluido que circula a través de las arterias,





Determinación cualitativa del analito mediante prueba de inmunoensayo

enzimático heterogéneo (E.L.I.S.A), el cual consiste en enlazar el anticuerpo a

un microplato y marcar el antígeno con una enzima. Para ello se prepara el

microplato colocando en cada espacio una cantidad de solución anticuerpo en

buffer de bicarbonato, pH 9,0, se deja incubar a temperatura ambiente y una

vez el anticuerpo está fijo, el plato es lavado y secado. La muestra problema es

añadida en el pocillo del microplato previamente revestido con el anticuerpo y

seguidamente se añade la solución buffer contentiva del analito marcado con la

enzima, se deja incubar el microplato a temperatura ambiente hasta permitir el

equilibrio entre el analito marcado con la enzima, el analito de interés y el

anticuerpo. Luego del período de incubación el plato es lavado con buffer (paso





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de separación) hasta remover la enzimas no enlazadas, quedando en el

microplato las enzimas y el antígeno enlazado. Posteriormente se añade al

microplato incubado una solución de peróxido de hidrógeno/TMB

(Tetrametilbenzidina) para desarrollar el color y se procede a leer en el equipo

de espectrofotometría.


• Prueba de inmunoensayo enzimático heterogéneo E.L.I.S.A. Los kits de

E.L.I.S.A comerciales poseen microplatos pre-empacados con el

anticuerpo listo para ser utilizado. Puede encontrarse un Kit específico

para cada sustancia que se desee analizar.

• Micropipeta volumen ajustable 1-100 µL; 100-1000 µL

• Cilindro graduado 100 mL

• Balón aforado 25 mL, 250 mL

• Equipo de Espectrofotómetro UV – Visible para microplato

• Filtro Millipore 2 µm

• Viales 2 mL


• Ácido clorhídrico concentrado

• Metanol (grado analítico)

• Enzima conjugada específica para cada sustancia (reactivo dado en el kit

específico para cada droga).

• Solución cromogénica de 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) en buffer de

urea peroxidasa (Conservar en frasco color ámbar alejado de la luz y el

calor). Adquirido directamente de proveedor comercial.





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• Agua destilada previamente filtrada en filtro Millipore 2 µm

• Estándar certificado de sangre y/o orina 1mg/mL en metanol.

• De acuerdo a la sustancia a analizar debe disponer de patrón certificado

de la sustancia:

o Patrón certificado de 11-nor-9-carboxy-9-tetrahidrocannabinol

o Patrón certificado de benzoilecgonina

o Patrón certificado de metanfetamina

o Patrón certificado de anfetamina

o Patrón certificado de benzodiacepina

o Patrón certificado de diacetilmorfina

o Patrón certificado de morfina


6.4.1. Solución ácido clorhídrico (HCl) 3 M:

1) Medir 60,5 mL de ácido clorhídrico concentrado 38% en un cilindro graduado.

2) Trasvasar cuantitativamente el contenido medido a un balón aforado de 250

mL de capacidad.

3) Enrazar el balón con H2O(d) hasta el aforo.

6.5. Preparación de estándares y muestras control:

6.5.1. Solución del patrón certificado de concentra ción 1 mg/mL:

1) Para cada patrón certificado que disponga prepare una solución de 1mg/mL

ajustando la cantidad de la sustancia a pesar, de acuerdo a la pureza del

patrón certificado que disponga, de acuerdo a la siguiente fórmula:





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!�� ó�� (��) =

#�� ó �$�� %��&' × (�� (�&) ×100

+� �,��

2) Pese la masa de patrón certificado a tomar calculada.

3) Disolver con metanol llevando a aforo en un balón aforado de acuerdo a la

cantidad de solución de patrón a preparar.

Nota: Se recomienda preparar 10mL de cada solución patrón.

6.5.2. Muestra Control Positiva (MCP):

1) En un vial de 2 mL añadir 1950 µL del estándar certificado de sangre y/o

orina 1mg /mL en metanol.

2) Añadir 50 µL de la solución patrón 1mg/mL de la sustancia.

6.5.3. Muestra Control Negativa (MCN):

Utilizar Estándar certificado de sangre y/o orina 1mg / mL en metanol.


1) Sacar del área de almacenamiento la muestra de orina y/o sangre recibida

en el laboratorio y dejar reposar a temperatura ambiente por

aproximadamente 30 min antes de realizar el análisis.

2) Tomar con cuidado el recipiente contentivo de la muestra de orina y/o sangre

el cuál debe estar cerrado herméticamente y agitar de forma manual

suavemente, inclinando el recipiente contentivo de la muestra de un lado a

otro por unos segundos para homogenizar.


muestra biológica de orina y/o sangre mediante la prueba de inmunoensayo

enzimático heterogéneo (E.L.I.S.A). Ver anexo N° 1.





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6.7. Ejecución del ensayo para la determinación cua litativa de sustancias

mediante prueba de inmunoensayo enzimático heterogé neo

(E.L.I.S.A):

Los modelos de espectrofotómetros y kits de microplatos comerciales son

variables por lo que se recomienda leer previamente las instrucciones propias

del fabricante antes de su uso. A continuación se describen los pasos generales

para su uso:

1) Agregar 30 µL de una muestra control positiva (MCP) en uno de los

depósitos del microplato.

2) Agregar 30 µL de una muestra control negativa (MCN) en uno de los

depósitos del microplato.

3) Agregar 30 µL de la muestra problema en cada deposito del microplato

(Agregar en cada deposito una muestra diferente que se desee analizar).

4) Agregar en cada microtubo 75 µL de la enzima conjugada (reactivo dado en

el kit específico para cada droga).

5) De cuidadosamente pequeños golpecitos con el dedo por un lado del plato

para mezclar.

6) Dejar incubar el plato por 30 min a temperatura ambiente.

7) Descartar el líquido contenido en los depósitos invirtiendo y agitando el plato

sobre un recipiente dispuesto para el descarte de los residuos.

8) Enjuagar los tubos 3 veces con agua destilada previamente filtrada en filtro

Millipore, llenando los depósitos e invirtiendo y agitando el microplato en

cada lavada.

9) Sacudir el plato invertido sobre una toalla seca de papel para asegurar que

no quede ningún residuo de líquido dentro de los depósitos del microplato.





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10) Añadir 100 µL de la solución TMB en cada depósito y dar pequeños toques

suavemente en los lados del microplato para mezclar.

11) Dejar incubar por 15 min a temperatura ambiente.

Nota: Aparecerá un coloración amarilla donde se dé la reacción enzimática del

antígeno - anticuerpo indicando la presencia de la sustancia a estudiar.

12) Añadir 50 µL de ácido clorhídrico 3 M en cada depósito y dar pequeños

toques suavemente en los lados del microplato para mezclar.

13) Leer dentro de los 5 min luego de añadido el ácido clorhídrico a 450 nm en el

espectrofotómetro de microplatos.



Nota: Los límites de detección pueden variar de acuerdo al fabricante de los

kits, en general los límites de detección referenciales para algunas sustancias

pueden encontrarse para muestra de sangre: 50 ng/mL para cocaína y

benzodiacepinas, 20 ng/mL para anfetaminas y opiáceos, 10 ng/mL para

cannabinoles. En muestra de orina: 300 ng/mL para cocaína, 100 ng/mL para

benzodiacepinas, 200 ng/mL para anfetaminas y opiáceos, 20 ng/mL para

cannabinoles.

7. FORMULARIOS:









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2009.

• Toxicology Analytical Manual. Houston forensic Science Center. 2015.


2016.





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9. ANEXOS:


prueba de inmunoensayo enzimático E.L.I.S.A

Retirar la muestra de orina del frío y dejar reposar aproximadamente 30 min temperatura ambiente

Dar pequeños golpecitos en los alrededores del plato para mezclar y dejar incubar por 30 min

Anotar el resultado en la hoja de reporte (FQT00-01)

Agitar la muestra suavemente para homogeneizar

Agregar 30 µL de la MCP y MCN en 2 de los depósitos del microplato

Agregar 30 µL de la muestra a analizar en uno de los depósitos del microplato

Agregar 75 µL de la enzima conjugada en los depósitos del microplato

Descartar el líquido contenido en los depósitos y enjuagar 3 veces con H2O(d)

Sacudir el plato invertido en una toalla de papel y agregar 100 µL de la solución TMB en cada depósito y dejar incubar por 15 min

Añadir 50 µL de HCl 3M y leer dentro de los 5 min luego de añadido el HCl en el espectrofotómetro de microplatos a 450 nm


CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA (CCF)



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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir para la determinación cualitativa simultánea de

sustancias, tales como: opiáceos, benzodiacepinas, cocaína, anfetaminas y

cannabinoides en muestra de orina y/o sangre provenientes de personas vivas

incursas en procesos legales mediante la técnica de cromatografía de capa fina

(CCF), a fin de estandarizar y optimizar los procedimientos a realizar para dar






realizar la determinación simultánea de diferentes sustancias en muestra de

orina y/o sangre provenientes de personas vivas, mediante la técnica de

cromatografía de capa fina (CCF).

3. RESPONSABLES:












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un laboratorio.

5. DEFINICIONES:


b) Cromatografía de capa fina: Técnica de separación cromatográfica que

utiliza como fase estacionaria una capa plana y relativamente delgada de

un material adherente de partículas finamente divididas que recubre una

superficie de vidrio, plástico o metal. Y como fase móvil un líquido.

c) Desproteinización: Remoción de proteínas para reducir interferencias y

evitar formación de espuma, turbidez y precipitados en la extracción del

analito.

d) Fluido biológico / Matriz biológica: Material de origen biológico que


e) Metabolitos: Compuesto producido en el cuerpo humano como resultado


f) Orina: Fluido de excreción generado por los riñones.





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g) Patrón o estándar: Muestra de una fuente identificada adquirido para ser


h) Plasma: Parte líquida de la sangre libre de células.



j) Sangre / Sangre completa: Fluido que circula a través de las arterias,





Determinación cualitativa del analito mediante la técnica de cromatografía de

capa fina (CCF), el o los analitos son extraídos de la matriz biológica mediante

extracción líquido – líquido y luego son separados mediante la CCF

considerando la afinidad que tengan los mismos con la fase estacionaria de la

placa cromatográfica o con la fase móvil que se utilice.


• Placas de sílica gel para cromatografía en capa fina (CCF)

• Cápsulas de porcelana

• Capilares de vidrio 80 µL

• Tubos de ensayos 20 mL con tapa a rosca

• Pipeta volumétrica 1, 2, 5 y 10 mL






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• Balón aforado 100 mL, 1 L

• Beacker 100 mL

• Viales 2mL

• Tanque o cubeta para desarrollo de la placa cromatográfica

• Papel de filtro

• Papel pH

• Sistema de aspersor ó pulverizador de gota y fiola ajustable para

visualización de la placa cromatográfica.

• Equipo de luz ultravioleta con longitudes de onda a 254 y 366 nm

(opcional)

• Balanza analítica

• Agitador para tubos de ensayo

• Centrifuga para tubo de ensayo

• Estufa

• Plancha eléctrica


• Cloroformo

• Hidróxido de amonio concentrado

• Sulfato de sodio anhidro

• Agua destilada


• Acetato de etilo (grado analítico)

• Tolueno (grado analítico)

• Sulfato de sodio





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• Subnitrato de bismuto

• Ioduro de potasio

• Sal de Azul rápido B (o-dianisidina)

• Etanol (grado analítico)

• Ácido acético (grado analítico)

• Sales de sulfato de amonio ó tungstato de amonio, ácidos como el ácido

tricloroacético o solventes orgánicos tales como acetona, acetonitrilo,

metanol ó etanol. (Solo en caso que la muestra sea sangre para

desproteinizar)

• Reactivos a utilizar en los sistemas para el desarrollo de las

cromatoplacas. Ver FQT02-01

• Reactivos para el revelado de las cromatoplacas. Ver FQT03-01

• De acuerdo a la sustancia a analizar debe disponer de patrón certificado

de la sustancia:








o Patrón certificado de codeína


6.4.1. Solución NaOH 1M:





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Pesar en un beacker 40 g de NaOH, trasvasar cuantitativamente el contenido

pesado a un balón aforado de 1 L de capacidad mediante el uso de un embudo

y enrazar con H2O(d) hasta el aforo.

6.4.2. Reactivo de o-dianisidina tetrazotizada (spr ay de Azul rápido B) 1%:

Disolver una pizca de sal de Azul rápido B (o-dianisidina) en 2 gotas de agua

destilada y añadir etanol hasta obtener una coloración anaranjado- rojiza.

6.4.3. Reactivo Spray de Dragendorff:

• Preparar solución A: Mezclar 2g de subnitrato de bismuto, 25mL de ácido

acético y 100mL de agua.

• Preparar solución B: Disolver 40g de Ioduro de potasio en 100mL de

agua.

• Mezclar 10mL de soluc. A, 10mL soluc. B, 20mL ácido acético y 100mL

agua destilada.













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muestra biológica de orina y/o sangre mediante la técnica de cromatografía

de capa fina (CCF). Ver anexo N° 1.

6.6. Tratamiento previo de la placa cromatográfica de silicagel:

1) Sacar de su empaque la placa cromatográfica de silicagel base de aluminio

(tamaño de partícula promedio 20 µm, grosor capa de silicagel: 0,25 mm) de

20 x 20 cm.

2) Activar la placa cromatográfica colocándola dentro de una estufa a 120 °C

por 30 min. Mediante la activación se retira la humedad presente en la sílica.

3) Retirar cuidadosamente la placa de la estufa y colocarla sobre una superficie

limpia, seca y plana.

4) Medir con una regla 10 cm y marcar suavemente la placa mediante el uso de

un lápiz de grafito, cuidando de no romper la sílica.

5) Cortar cuidadosamente la placa por el área marcada mediante el uso de un

cutter (exacto) para obtener una cromatoplaca final de 10 x 10 cm.

Nota: Valores de Rf óptimos e ideales son los comprendidos entre 0,25 y 0,75

por lo que luego de realizar el proceso de desarrollo y visualización de la placa

cromatográfica. Si la(s) mancha(s) se encuentra en el límite superior de la placa

(Frente de solvente) se deberá realizar el mismo procedimiento desde el

principio nuevamente pero con una placa de TLC de mayor longitud 20 x 20 cm

para garantizar mayor separación de las sustancias presentes en la muestra.

6) Rotular cuidadosamente la placa de manera horizontal utilizando el lápiz de

grafito trazando una línea a 1 cm de la parte superior (Frente del solvente) y

1 cm en la parte inferior (Línea de siembra) y en la parte inferior realizar





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pequeños puntos encima de la línea a 1 cm de distancia entre punto y punto

los cuales servirán de guía para realizar la siembra de las muestras, cuidar

de no despegar o romper la sílica de la base durante el proceso de rotulado.

(ver anexo N° 2)

7) Guardar en la estufa hasta el momento de sembrado.

6.7. Ejecución del ensayo para la determinación cua litativa simultánea de

cocaína, opiáceos, benzodiacepinas, anfetamina y ca nnabinoides

mediante la técnica de cromatografía de capa fina ( CCF):

6.7.1. Extracción líquido - líquido de la muestra b iológica (orina y/o

sangre):

Este procedimiento debe realizarse dentro de una campana de extracción.

1) Tomar un tubo de ensayo, esterilizado por calor seco ó húmedo (autoclave)

y libre de contaminantes con tapa a rosca, rotularlo con el número de control

de la muestra problema.

Nota: Puede utilizar también para la extracción un embudo de separación.

2) Tomar el envase contentivo de la muestra (tapada herméticamente), agitarlo

suavemente y de manera manual antes de comenzar el análisis, realizando

movimientos sucesivos del envase colocándolo de manera horizontal y luego

vertical hasta homogeneizar la muestra. Una vez agitada dejarla reposar

unos minutos.

3) Tomar alícuota de la muestra mediante el uso de una pipeta volumétrica:

• Si la muestra es de orina: Tomar alícuota de 6 mL del envase de

muestra original previamente agitada.





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• Si la muestra es de sangre o plasma: Tomar 2-3 mL de la muestra

original se recomienda previamente realizar la desproteinización

agregando pequeñas cantidades de: sales (sulfato de amonio ó tungstato

de amonio), ácidos como el ácido tricloroacético o solventes orgánicos

tales como acetona, acetonitrilo, metanol ó etanol.

4) Colocar la alícuota tomada en un tubo de ensayo evitando derramamiento.

5) Para análisis simultáneo de: cocaína, opiáceos, anfetaminas,

benzodiacepinas y cannabinoides ajustar a pH 8-9 añadir al tubo de ensayo

contentivo de la alícuota 1 mL de Hidróxido de amonio concentrado.

6) Para análisis específico de sustancias, ajustar pH:

• Para determinación de cocaína, opiáceos, benzodiace pinas: Ajustar

a pH 8-9 con Hidróxido de amonio concentrado.

• Para determinación de cannabinoides: Hidrolizar previamente la

muestra añadiendo a la alícuota de orina o sangre tomada, 2 mL de

Hidróxido de sodio 1M tapar el tubo, calentar por 20 min a 50 °C agitando

ocasionalmente. Luego añadir al extracto 20 mL de ciclohexano: acetato

de etilo (7:1) ó 0.5 mL de ácido acético más 2 mL de hexano: acetato de

etilo (9:1), tapar el tubo de ensayo y agitar por 10 min. Dejar enfriar la

extracción y ajustar a pH 2 lentamente y agitando suavemente mientras

se añade HCl ó H2SO4 2M, tapar el tubo de ensayo y agitar por 10 min.

• Para determinación de anfetaminas: Ajustar pH 11 con Hidróxido de

sodio 1M.

Nota: De requerir la determinación de todas las sustancias descritas

anteriormente tomar 3 alícuotas de la muestra biológica original en diferentes

tubos de ensayos, previamente rotulados y ajustar a cada tubo de ensayo el pH





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de acuerdo a la sustancia a determinar, continuar con los pasos descritos a

continuación para cada tubo de ensayo que se tengan de manera individual.

7) Añadir 6 mL de cloroformo al tubo de ensayo y taparlo.

Nota: Si no se dispone cantidad suficiente de la muestra original de orina y/o

sangre puede realizar este ensayo disminuyendo la cantidad de la muestra a la

mitad y manteniendo la relación de la misma 1:1 con el solvente.

8) Agitar por 2 horas el tubo de ensayo mediante el uso de un agitador. (ver

anexo N° 3)

9) Retirar el tubo del agitador y centrifugarlo a 2000 – 3000 r/min a temperatura

ambiente hasta observar la separación adecuada de las dos fases formadas

(Fase acuosa y Fase orgánica). Dejar reposar por al menos 10 min para

mejor separación de las capas.

10) Colocar un papel de filtro sobre un embudo pequeño y añadir una pequeña

cantidad de sulfato de sodio anhidro (Na2SO4) agregando 1 – 2 mL del

solvente de extracción para humedecer.

11) Disponer el sistema de filtrado encima de una capsula de porcelana

preferiblemente de 30 mL de capacidad previamente identificada con el

número de control de la muestra.

12) Retirar la fase superior (Fase acuosa) de la extracción si fue realizada en

tubo de ensayo mediante el uso de una pipeta y verterla en otro tubo de

ensayo limpio y seco.

Nota: Si se utilizó para la extracción un embudo de separación disponer el

embudo sobre el sistema de filtrado y dejar caer directamente la fase orgánica

(Fase inferior) rotando con cuidado la manilla del embudo.





Fecha: Marzo 2018

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13) Realizar la separación de la fase orgánica mediante el uso de una pipeta y

verterla con cuidado y evitando derrame sobre el papel de filtro. Realizar al

menos dos lavados de la fase acuosa separada contenida en el tubo de

ensayo con 6mL de cloroformo cada vez y repetir el paso anterior de

extracción de la fase acuosa en cada lavado.

14) Verter todas las fases orgánicas obtenidas de los lavados sobre el papel de

filtro dispuesto encima de la cápsula de porcelana, con el fin de unir en una

sola capsula todos los extractos orgánicos realizados a la muestra.

15) Tomar la capsula de porcelana contentiva de todos los extractos de la fase

orgánica y dejar evaporar a temperatura ambiente dentro de la campana de

extracción o puede utilizar una plancha eléctrica a baja temperatura entre 30

- 50 °C.

16) Una vez evaporado el extracto en la cápsula de porcelana se procederá a

realizar el análisis mediante CCF.

6.7.2. Proceso de siembra de la muestra y patrones en la placa

cromatográfica:

1) En cada punto marcado en la placa, aplicar una muestra diferente cuidando

de identificar en la parte superior el número de control que corresponda a la

muestra. Se recomienda intercalar los patrones con las muestras en los

puntos del comienzo, parte media y final de la placa cromatográfica.

2) Añadir a la cápsula de porcelana aproximadamente 0,5 mL de un solvente

orgánico adecuado y retomarlo con un capilar de 80 µL de capacidad.

Nota: El solvente orgánico utilizado debe disolver el analito de interés y debe

ser preferiblemente volátil. Puede utilizar para la determinación de cocaína,





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benzodiacepinas, anfetaminas, cannabinoides y opiáceos el etanol

(recomendado), metanol, éter de petróleo, etc.

3) Colocar pequeñas cantidades (microgotas) con el capilar de la solución

muestra-solvente de manera sucesiva en el punto marcado en la

cromatoplaca, evaporando el solvente entre cada microgota añadida dejando

la placa secar a temperatura ambiente o con ayuda de un secador hasta

sembrar todo la solución contenida en el capilar.

4) Añadir nuevamente a la cápsula de porcelana aproximadamente 0,5 mL del

solvente, se retoma con el capilar y se continua el proceso de aplicación de

la solución muestra-solvente sobre la placa cromatográfica, cuidando que el

diámetro del punto no supere los 4 mm. Se recomienda aplicar 6 capilares

por cada muestra para un diámetro de punto entre 3 y 4 mm.

Nota: Se puede acelerar el proceso de sembrado, secando los puntos

aplicados de muestra – solvente en la cromatoplaca utilizando un secador ya

sea con aire frío o caliente.

5) Para la siembra de los patrones:

• Escoger los patrones certificados a utilizar de acuerdo a la sustancia a

determinar, los mismos deben ser similares al analito a determinar:












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o Patrón certificado de codeína

• Colocar en un vial de 2 mL una pequeña cantidad del patrón (Tomar con

la punta de un capilar una pequeña cantidad del patrón).

• Agregar 1 mL del solvente utilizado para la siembra de la muestra y

disolver el patrón.

• Retomar la solución patrón – solvente antes preparada con el capilar.

• Colocar en el punto marcado para la siembra del patrón 2 o 3 microgotas

del patrón.

• Repetir este procedimiento para cada patrón que se tenga, aplicando

cada uno en diferentes puntos de la cromatoplaca previamente

identificado con el nombre del patrón.

6) En la placa se deben sembrar las muestras y los patrones de las diferentes

sustancias que se quieren identificar.

7) Proceder al desarrollo de la placa.

6.7.3. Proceso de desarrollo de la placa cromatográ fica:

Procedimiento a ser realizado dentro de campana de extracción.

1) Tomar un tanque de vidrio con tapa (medida aprox. 24 cm x 20 cm x 10 cm)

dispuesto para el desarrollo de la cromatoplaca.

2) Agregar el o los solventes de elección de acuerdo a la sustancia que se

desee determinar. Para seleccionar el sistema ver lista en formulario código:

FQT02-01.

• Para la determinación simultánea de: cocaína, opiáceos, cannabinoides y

benzodiacepinas se recomienda añadir en un tanque grande (medida





Fecha: Marzo 2018

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aprox. 24 cm x 20 cm x 10 cm): 23 mL de acetato de etilo, 20 mL de

tolueno, 6 mL de metanol y 1 mL de hidróxido de amonio.

• Si requiere determinar una sustancia específica, se recomienda:

o Para determinación de cocaína y/o metabolitos utilizar sistemas

para bases nitrogenadas. Ver POE código: POQ05-01

o Para determinación de opiáceos y/o metabolitos utilizar sistemas

para bases nitrogenadas. Ver POE código: POQ07-01

o Para determinación de benzodiacepinas y/o metabolitos utilizar

sistemas para bases nitrogenadas ó drogas ácidas y neutras. Ver

POE código: POQ09-01

o Para determinación de anfetaminas y/o metabolitos utilizar

sistemas para bases nitrogenadas ó drogas ácidas y neutras

tanques. Ver POE código: POQ11-01

o Para determinación de cannabinoides y/o metabolitos utilizar

sistemas para drogas ácidas y neutras o sistemas de drogas en

general. Ver POE código: POQ13-01

Nota: Es fundamental que los solventes utilizados sean puros, anhidro, miscible

y las cantidades de los solventes deben ser ajustadas manteniendo la relación

de los reactivos de acuerdo al tamaño del tanque, de modo que el solvente o

mezcla de solventes no alcancen el nivel en el tanque mayor a 1 cm.

3) Tapar el tanque y dejarlo saturar por al menos 1 hora.

4) Colocar con cuidando la cromatoplaca dentro del tanque de manera que la

parte inferior de la línea de siembra toque el solvente sin que alcance los

puntos de siembra y tapar el tanque.





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5) Esperar a que se desarrolle la cromatoplaca, el solvente ascenderá por

capilaridad y hasta alcanzar la línea de frente del solvente, retirar la

cromatoplaca y dejarla secar dentro de la campana de extracción.

6.7.4. Proceso de visualización de la placa cromato gráfica:


1) Si dispone de equipo de luz ultravioleta coloque la placa debajo de la luz

ultravioleta a 254 y 366 nm y observe si existe fluorescencia en las muestras.

Nota: De observar fluorescencia marcar la mancha cuidadosamente con un

lápiz de grafito. (Las benzodiacepinas y sus metabolitos pueden aparecer como

una luz verde o punto amarillo a la luz de 366 nm).

2) Seleccione uno a varios reveladores mediante el uso de un pulverizador de

gota para cromatografía de acuerdo a las sustancias que desee determinar.

Para seleccionar el revelador ver formulario código: FQT03-01. Para

visualizar en una misma cromatoplaca diferentes compuestos se puede

realizar el revelado con más de un revelador, siempre y cuando estos no

sean destructivos de la cromatoplaca.

• Para la determinación simultánea de: cocaína, opiáceos, cannabinoides y

benzodiacepinas se recomienda revelar con sal de azul rápido B (o-

dianisidina tetrazotizada) para cannabinoides anotar resultado, y luego

rociar la misma cromatoplaca con reactivo de Dragendorff para

compuestos de base nitrogenada tales como los alcaloides y las

benzodiacepinas.

• Si requiere determinar una sustancia específica, se recomienda:

o Para determinación de cocaína y/o metabolitos. Ver POQ05-01





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o Para determinación de opiáceos y/o metabolitos. Ver POQ07-01

o Para determinación de benzodiacepinas y/o metabolitos. Ver

POQ09-01

o Para determinación de anfetaminas y/o metabolitos. Ver POQ11-

01

o Para determinación de cannabinoides y/o metabolitos. Ver

POQ13-01

3) Coloque una cantidad del revelador seleccionado en la fiola del sistema del

pulverizador e introduzca en la fiola la base del pulverizador.

4) Coloque la placa cromatográfica dentro de la campana de extracción de

forma vertical y con la base de sílica hacia el frente de la campana.

5) Rocíe la parte frontal de la placa cromatográfica (parte con sílica adherida)

de manera uniforme con el revelador mediante el uso del aspersor hasta

observar la aparición de las manchas que indican la separación de los

componentes de la muestra.

6) Dejar que la placa seque a temperatura ambiente dentro de la campaña de

extracción.

7) Lavar con agua destilada el aspersor y dejar secar dentro de la campana.

Nota: Si requiere revelar con más de un revelador asegúrese de lavar el

aspersor y la fiola cada vez que cambie de revelador para evitar contaminación

entre los reactivos.

8) Medir el Rf a las manchas observadas de la muestra problema y compararlas

con los patrones empleados.





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9) Realizar la evaluación de los resultados obtenidos calculando el factor de

retención (Rf) para cada compuesto obtenido comparándolo con los Rf de los

diferentes patrones.

Nota: También se debe tomar en cuenta la coloración que tome el compuesto

de la muestra y el patrón con el revelador, aunque los colores obtenidos para un

compuesto en particular pueden variar dependiendo de la concentración e

incluso dicha coloración puede variar con el tiempo, es importante tomarla en

cuenta durante el proceso de comparación.

10) Calcular el factor de retención (Rf) definido por:



Nota: Para cocaína, anfetaminas, benzodiacepinas, opiáceos y cannabinoides

la cromatografía de capa fina tiene un límite de detección referencial de

1µg/mL.

7. FORMULARIOS:


• FQT02-01: Formulario Lista de sistemas para el desarrollo de la placa

cromatográfica.

• FQT03-01: Formulario Lista de reveladores para la visualización de la

placa cromatográfica.

�� = ��

��





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Ecuador. 2014.




2012.





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9. ANEXOS:


cromatografía de capa fina.

No

Si

Activar la cromatoplaca colocándola en la estufa a 70 °C por aprox. 6 horas

¿Posee muestra de orina?

Cortar la placa a 10cm x 20cm y rotular la placa con un lápiz de grafito marcando el frente de solvente, línea de siembra y puntos para la siembra de las muestras

Tomar la Mx de sangre y desproteinizar agregando pequeñas cantidades de: sales, ácidos ó solventes orgánicos


Agitar el tubo de ensayo contentivo de la extracción por 2 horas y luego separar la capa orgánica

1

Filtrar la fase orgánica sobre una cápsula de porcelana a través de un papel de filtro contentivo de Na2SO4 previamente humedecido con el solvente de extracción y evaporar el filtrado a sequedad

Realizar la extracción líquido-líquido de la muestra añadiendo 6mL de muestra, ajustar pH 8-9 con hidróxido de amonio y añadir solvente de extracción





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Anotar en la hoja de reporte los resultados obtenidos (FQT00-01)

1

Retomar utilizando un capilar la fase orgánica evaporada añadiendo gotas de un solvente orgánico adecuado

Sembrar los patrones y la muestra en la placa realizando toques sucesivos con el capilar que lo contiene en el punto de siembra de la cromatoplaca. Sembrar aprox. 6 capilares por muestras para un diámetro de punto entre 2 a 4 mm

Desarrollar la placa cromatográfica

Preparar el sistema para el desarrollo de la placa de acuerdo a la sustancia a determinar y dejarlo saturar por 1 hora

Observar la placa en la luz UV a 254 y 366 nm de observar fluorescencia marcar la mancha cuidadosamente con un lápiz de grafito, anotar color y Rf en hoja de resultados. Comparar Rf con los patrones sembrados

Calcular el Rf de cada punto y compararlo con los diferentes patrones. Tomar en cuenta también la coloración de la mancha

Añadir diferentes reveladores de acuerdo a la sustancia a determinar

Sacar la placa del sistema y dejarla secar dentro de la campana de extracción





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Anexo N° 2. Rotulación de placa para análisis por cromatografía de capa fina

Anexo N° 3. Modelo de agitador para tubos de ensayo

20cm

10cm

1cm Frente del Solvente

1cm Línea de siembra

1cm 1cm

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE COCAINA MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE

CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir para la determinación cualitativa de cocaína y/o

metabolitos en muestra de orina y/o sangre provenientes de personas vivas








realizar la determinación de cocaína y/o metabolitos en muestra de orina y/o

sangre provenientes de personas vivas, mediante la técnica de cromatografía

de capa fina (CCF).

3. RESPONSABLES:









CAPA FINA (CCF)



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un laboratorio.

5. DEFINICIONES:








analito.







CAPA FINA (CCF)



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• Tubos de ensayo con tapa a rosca


• Capilares de vidrio 80 µL de capacidad.


• Pipeta volumétrica 2 mL, 5 y 10 mL


CAPA FINA (CCF)



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• Cilindro graduado 50, 100 mL


• Beacker 100 mL

• Viales 2 mL

• Papel pH





• Estufa






• Acetato de Etilo (grado analítico)

• Cloroformo (grado analítico)



• Agua destilada






CAPA FINA (CCF)



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• Tolueno (grado analítico)




desproteinizar)



• Reactivos para el revelado Spray de Dragendorff

• Patrón certificado de cocaína

• Patrón certificado de benzoilecgonina






agua.


agua destilada.








CAPA FINA (CCF)



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3) Realizar la determinación cualitativa de cocaína y/o metabolitos en la






20 x 20 cm.
















CAPA FINA (CCF)



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(ver anexo N° 2)


6.7. Ejecución del ensayo para la determinación cua litativa de cocaína y/o

metabolitos mediante la técnica de cromatografía de capa fina (CCF):


sangre):










unos minutos.



CAPA FINA (CCF)



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4) Colocar la alícuota tomada en un tubo de ensayo evitando derramamiento y

ajustar a pH 8-9 con Hidróxido de amonio concentrado.






anexo N° 3)








9) Disponer el sistema de filtrado encima de una cápsula de porcelana




CAPA FINA (CCF)



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13) Tomar la cápsula de porcelana contentiva de todos los extractos de la fase



- 50 °C.




cromatográfica:




CAPA FINA (CCF)



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2) Añadir a la cápsula de porcelana aproximadamente 0,5 mL de etanol y

retomarlo con un capilar de 80 µL de capacidad.



cromatoplaca, debe esperar que se evapore el solvente entre cada microgota

añadida hasta sembrar todo la solución contenida en el capilar.

4) Añadir nuevamente a la cápsula de porcelana aproximadamente 0,5 mL de

etanol, se retoma con el capilar y se continua el proceso de aplicación de la

solución muestra-solvente sobre la placa cromatográfica, cuidando que el






5) Para sembrar los patrones:

• En 2 viales de 2mL de capacidad añadir en cada uno de ellos una

pequeña cantidad del patrón certificado de cocaína y de benzoilecgonina

respectivamente (Tomar con la punta de un capilar una pequeña

cantidad del patrón).

• Agregar 1 mL de etanol en cada vial y disolver los patrones.



del patrón.


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6) En la placa se deben sembrar en cada punto las muestras y los patrones de

las diferentes sustancias que se quieren identificar.






2) Agregar 23 mL de acetato de etilo, 20 mL de tolueno, 6 mL de metanol y 1

mL de hidróxido de amonio. También puede utilizar cualquier sistema para

bases nitrogenadas, para ello ver lista de sistemas para el desarrollo de las

cromatoplacas en formulario código: FQT02-01

Nota: Es fundamental que los solventes utilizados sean puros, anhidro,

miscibles y las cantidades de los solventes deben ser ajustadas manteniendo la

relación de los reactivos de acuerdo al tamaño del tanque, de modo que el

solvente o mezcla de solventes no alcancen el nivel en el tanque mayor a 1 cm.






CAPA FINA (CCF)



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5) Esperar a que se desarrolle la cromatoplaca hasta que el solvente ascienda

por capilaridad y alcance la línea de frente del solvente de la placa, retirar la






2) Coloque una cantidad del reactivo de Dragendorff en la fiola del sistema del









extracción.








CAPA FINA (CCF)



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Nota: Límite de detección referencial para cocaína 1 µg/mL.

7. FORMULARIOS:



cromatográfica.




�� = ��

��


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Ecuador. 2014.

• Moffat A, Osselton M, Widdop B. Clarke's Analysis of Drugs and Poisons.

3era edición. Pharmaceutical Press; 2004.




2012.

• United Nations International Drug Control Programme (UNIDCP).

Recommended methods for the detection and assay of heroin,

cannabinoids, cocaine, amphetamine, methamphetamine and ring-

substituted amphetamine derivatives in biological specimens. Manual for

use by National laboratories. ST/NAR/27. United Nations. 1995.


CAPA FINA (CCF)



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9. ANEXOS:

Anexo N° 1. Diagrama de flujo para la determinación de cocaína y/o metabolitos

mediante cromatografía de capa fina.

No

Si


¿Posee muestra

de orina?





1


Realizar la extracción líquido-líquido de la muestra añadiendo 6mL de muestra, ajustar pH 8-9 con hidróxido de amonio y añadir solvente de extracción


CAPA FINA (CCF)



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1







Añadir revelador spray de dragendorff



CAPA FINA (CCF)



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20cm

10cm



1cm 1cm

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE COCAINA MEDIANTE CG-MS



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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir para la determinación cuantitativa de cocaína y/o


incursas en procesos legales mediante CG-MS, a fin de estandarizar y optimizar

los procedimientos a realizar para dar cumplimiento a las experticias

toxicológicas forense in vivo solicitadas por los entes administradores de

justicia.




realizar la determinación de cocaína y/o metabolitos en muestra de orina y/o

sangre provenientes de personas vivas, mediante CG-MS.

3. RESPONSABLES:











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un laboratorio.

5. DEFINICIONES:


b) Calibrador: Analito puro en un disolvente o matriz apropiados que se utiliza


c) Cromatografía de gases (CG): Técnica analítica de separación, donde la



capilar.

d) Desproteinización: Remoción de proteínas para reducir interferencias y


analito.

e) Espectrometría de masas (MS siglas en ingles Mas s Spectrometry):

Instrumento que permite medir moléculas por su peso (masa), mide razones

masa/carga de iones, calentando un haz de material del compuesto a

analizar hasta vaporizarlo e ionizar los diferentes átomos.




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f) Material de referencia certificada (Patrón de re ferencia certificado):







h) Procedimiento Operativo Estándar (POE): Conjunto de instrucciones


n) Solución Estándar: Solución de concentración conocida.

i) Solución Madre: Solución estándar concentrada que se prepara a partir de




La cocaína es un alcaloide obtenido de las hojas secas de Erythroxylum

coca y otras especies de Erythroxylum (Erythroxylaceae), es una droga

estimulante administrada tradicionalmente por esnifado, inyectada por vía

intravenosa o por inhalación nasal. Los estimulantes son agentes que activan,

potencian o aumentan la actividad neuronal en el SNC, en el caso de la

cocaína, se genera pérdida del apetito, euforia, dilatación de las pupilas,

sudoración, comportamiento errático y en algunos casos violento, alucinación,




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en dosis excesivas puede ocasionar convulsiones, hemorragia cerebral y hasta

la muerte.

La cocaína y sus metabolitos pueden ser detectados en diferentes

matrices biológicas, siendo las más relevantes para el análisis en personas

vivas las muestras de orina y sangre. Dichas sustancias son eliminadas

normalmente por vía urinaria dentro de las 48 horas luego de su consumo,

dependiendo del pH urinario entre 1 – 9 % de una dosis intravenosa de cocaína

es excretada en aproximadamente 24 horas, siendo los productos de mayor

excreción la benzoilecgonina (35 – 54 %) y éster metilecgonina (32 – 49 %).

También la cocaína y sus metabolitos pueden ser detectadas en plasma dentro

de las 18 a 24 horas luego de su consumo, observándose los efectos tóxicos de

esta sustancia en muestras de sangre cuando se detectan concentraciones de

0,25 a 5 mg/L y las muertes se han producido con concentraciones de 1 mg/L o

más.



acoplada a un espectrómetro de masas MS. El o los analitos son extraídos de la

matriz biológica mediante extracción líquido – líquido, son purificados y luego

separados, identificados y cuantificados mediante el uso del CG-MS. En los

sistemas de CG-MS las moléculas del analito deben ser primero ionizadas para

ser atraídas (o repelidas) por un apropiado campo magnético o eléctrico.

Existen numerosas técnicas de ionización, siendo la de impacto electrónico (IE)

la más utilizada debido a que la mayoría de las muestras son vaporizadas y

posteriormente ionizadas por ésta técnica.




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• Equipo de cromatógrafo de gases acoplado a espectrómetro de masas

(CG-MS)




• Pipetas volumétricas: 0,5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 5 mL y 10 mL



• Papel pH




• Estufa


• Patrón certificado de cocaína

• Patrón certificado de benzoilecgonina




• Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)


• BSTFA (N,O-Bis(Trimetilsilil)Trifluoroacetamida)

• TMCS (Clorotrimetilsilano) 1%




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• Agua destilada




desproteinizar)

6.5. Curva de calibración cocaína:





!�� ó�� (��) =

#�� ó �$�� %��&' × (�� (�&) ×100

+� �,��





6.5.2. Preparación solución Madre 100 µg/mL: Tomar 1 mL del patrón (1

mg/mL), trasvasarlo cuantitativamente a un balón aforado de 10 mL de

capacidad y llevarlo a aforo con metanol.

6.5.3. Preparación solución Madre 1,0 µg/mL: Tomar 100 µL de la solución

de 100 µg/mL, trasvasarlo cuantitativamente a un balón aforado de 10

mL de capacidad y llevarlo a aforo con metanol.

Nota: Realizar los procedimientos descritos anteriormente para la preparación

de las soluciones de 100 µg/mL y 1,0 µg/mL para cada patrón que se disponga.




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de alícuota de la solución madre señalada y llevarlo al balón aforado señalado


Tabla 1. Preparación de las soluciones estándar de cocaína.

Estándar Concentración final (µg/mL)

Concentración solución Madre

(µg/mL)

V alícuota solución

Madre (mL) V balón

aforado (mL)

1 0,01 1,0 0,1 10

2 0,02 1,0 0,2 10

3 0,05 1,0 0,5 10

4 0,1 1,0 1,0 10

5 0,5 1,0 5,0 10

6 1,0 100,0 1,0 100

7 2,5 100,0 2,5 100

8 4,0 100,0 4,0 100

Nota: El límite de detección de la cocaína mediante CG-MS puede variar de

acuerdo a las condiciones de operación y calibración del equipo. Valor

referencial se encuentra en 0,01 µg/mL.



laboratorio, si no se dispone de orina utilizar la sangre y dejar reposar la

muestra por aproximadamente 30 min a temperatura ambiente antes de

realizar el análisis.

2) Tomar con cuidado el recipiente contentivo de la muestra de sangre y/o orina





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3) Realizar la determinación cualitativa de cocaína y/o metabolitos en la

muestra biológica de orina y/o sangre mediante CG-MS. Ver anexo N° 1.

6.7. Ejecución del ensayo para la determinación de cocaína mediante CG-

MS:


sangre):










unos minutos.










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6) Agitar por 2 horas el tubo de ensayo mediante el uso de un agitador.








9) Disponer el sistema de filtrado encima de una cápsula de porcelana












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sola cápsula todos los extractos orgánicos realizados a la muestra.

13) Tomar la cápsula de porcelana contentiva de todos los extractos de la fase



- 50 °C.

14) Derivatizar la muestra añadiendo en la cápsula 50 µL acetato de etilo y 50 µL

BSTFA (N,O-Bis(Trimetilsilil)Trifluoroacetamida) con 1 % TMCS

(Clorotrimetilsilano)

15) Trasvasar la solución a un vial, cerrar el vial herméticamente y dejar

derivatizar por 20 min a 70 °C, retirar del calor y dejar enfriar.

Nota: Para un proceso menos selectivo de identificación de los metabolitos de

la cocaína en la orina puede retomar la solución una vez evaporada sin

derivatizar y añadir 25 µL de acetato de etilo e inyectar directamente en el CG.

6.7.2. Lectura en el cromatógrafo de gases acoplado a espectrómetro de

masas CG-MS:

1) Encender el CG-MS





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Tabla 2. Condiciones de operación del CG-MS.

Inyector Columna

Modo: Automático Columna: HP-5MS o equivalente

Longitud (m): 30

Temperatura Inyector

(°C):

250 Diámetro interno (mm): 0,25

Gas: Helio Modo: Presión constante



Detector Rampa de Temperatura

Detector: MS Temperatura inicial

(°C): 100

Temperatura fuente

del detector (°C): 230 Velocidad (°C/min): 15

Rango de masa (amu): 35-550 Temperatura final

(°C): 280 (10 min)



modelo del CG-MS y condiciones ambientales para esto se recomienda






Fecha: Marzo 2018

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4) Realizar dos inyecciones de los estándares: concentración baja (0,01 µg/mL)

y concentración alta (4,0 µg/mL) para identificar el tiempo de retención de los

analitos a determinar y permitir un acondicionamiento óptimo del sistema.

5) Lavar la columna pre-análisis inyectando 3 ciclos de Metanol y luego 3 ciclos

de Acetato de etilo.





siguiendo las indicaciones del fabricante y grabar el resultado en el software

propio del equipo.

8) Inyectar la muestra problema y grabar resultado en el software propio del

equipo.

9) Lavar el sistema post-análisis inyectando 3 ciclos de Metanol y luego 3 ciclos




equipo.

11) Proceda a analizar los picos cromatográficos obtenidos y su comparación

con la biblioteca integrada contenida en el software del equipo para la

identificación del analito.

12) Monitoree los iones dados en el anexo N° 2.




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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6.7.3. Cuantificación de las sustancias de interés por el método del

estándar externo:

1) Calcular la concentración del analito por interpolación con la curva de

calibración realizada.

Nota: También puede calcular la concentración del analito por el método del

estándar externo descrito a continuación:

• Inyectar una masa (m1) del patrón de concentración conocida C1. m1= C1

x Volumen de inyección.

• Medir el área de la señal (A1) y calcular el factor de respuesta (f)

mediante: f1= m1 / A1

• Inyectar una masa de la muestra (m2) de concentración desconocida (C2)

y medir el área de la sustancia (A2). m2= f1 x A2

• Calcular la concentración de la sustancia desconocida C2. C2 = m2 /

Volumen de inyección

Nota: Si los volúmenes de inyección son iguales tanto para la muestra como

para el patrón puede calcular la concentración de la muestra desconocida

mediante: C2= C1 x (A2 / A1)

2) Reportar el resultado obtenido de la concentración de cocaína en la muestra

problema en la hoja de reporte de resultados (FQT00-01).

7. FORMULARIOS:





Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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• Díaz J, Fernández M, Paredes F. Aspectos básicos de bioquímica

clínica. Madrid: Ediciones Díaz de Santos, S.A; 1997.






2009.





2016.





use by National laboratories, ST/NAR/27. United Nations. 1995.




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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9. ANEXOS:

Anexo N° 1. Diagrama de flujo para la determinación de cocaína mediante CG -

MS.

Retirar la muestra biológica del frío y dejar reposar 30min Tamb

Agitar la muestra para homogeneizar

Anotar en la hoja de reporte los resultados (FQT00-01)

Realizar la extracción líquido-líquido añadiendo 6 mL de la muestra (si es sangre desproteinizar previamente), ajustar pH a 8-9 con Hidróxido de amonio y 6mL de cloroformo


Derivatizar la muestra añadiendo 50 µL acetato de etilo y 50 µL BSTFA (N,O-Bis (Trimetilsilil)Trifluoroacetamida) con 1% TMCS (Clorotrimetilsilano) dejar derivatizar por 20 min a 70 °C, retirar del calor y dejar enfriar

Filtrar la fase orgánica a través de un papel de filtro contentivo de Na2SO4 en una cápsula y trasvasar el filtrado a un vial evaporándolo a sequedad

Colocar las condiciones de operación del CG - MS

Inyectar la muestra de concentración desconocida y las diferentes soluciones estándares y realizar el cálculo de la concentración




Fecha: Marzo 2018

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Anexo N° 2. Iones principales para cocaína

Sustancia m/z

Cocaína 303, 182, 272, 198

Benzoilecgonina 240,361,256, 403,282,346

Cocaetileno 82, 196, 317, 272

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE OPIACEOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE

CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir para la determinación cualitativa de opiáceos y/o









realizar la determinación de opiáceos y/o metabolitos en muestra de orina y/o

sangre provenientes de personas vivas, mediante la técnica de cromatografía

de capa fina (CCF).

3. RESPONSABLES:









CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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un laboratorio.

5. DEFINICIONES:








analito.







CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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• Capilares de vidrio 80 µL de capacidad




CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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• Viales 2mL

• Papel pH







• Estufa








• Agua destilada





• Tolueno


CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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desproteinizar)


cromatoplacas. Ver FQI02-01


• Patrón certificado de diacetilmorfina

• Patrón certificado de morfina

• Patrón certificado de codeína

• Isopropanol (opcional)

• Diclorometano (opcional)






agua.


agua destilada.






CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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3) Realizar la determinación cualitativa de opiáceos y/o metabolitos en la






20 x 20 cm.
















CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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(ver anexo N° 2)


6.7. Ejecución del ensayo para la determinación cua litativa de opiáceos

y/o metabolitos mediante la técnica de cromatografí a de capa fina

(CCF):


sangre):










unos minutos.



CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Nota: Para una mejor extracción de la morfina y diacetilmorfina también puede

utilizar como solvente: cloroformo – isopropanol (9:1); diclorometano –

isopropanol (9:1) ó acetato de etilo.


anexo N° 3)









CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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- 50 °C.




CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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cromatográfica:





















pequeña cantidad del patrón certificado de diacetilmorfina, morfina y

codeína respectivamente (Tomar con la punta de un capilar una pequeña

cantidad del patrón).


CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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del patrón.











2) Agregar 23 mL de acetato de etilo, 20 mL de tolueno, 6 mL de metanol y 1

mL de hidróxido de amonio. También puede utilizar cualquier sistema para

bases nitrogenadas, para ello ver lista de sistemas para el desarrollo de las

cromatoplacas en formulario código: FQT02-01







CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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extracción.






CAPA FINA (CCF)



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Nota: Límite de detección referencial para opiáceos 1µg/mL.

7. FORMULARIOS:



cromatográfica.

�� = ��

��


CAPA FINA (CCF)



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2012.





use by National laboratories. ST/NAR/27. United Nations. 1995


CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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9. ANEXOS:

Anexo N° 1. Diagrama de flujo para la determinación de opiáceos y/o

metabolitos mediante cromatografía de capa fina.

No

Si


¿Posee muestra

de orina?





1


Extracción líquido-líquido de la muestra añadiendo 6mL de muestra, ajustar pH 8-9 y añadir solvente de extracción


CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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1










CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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20cm

10cm



1cm 1cm

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE OPIACEOS MEDIANTE CG-MS



Fecha: Marzo 2018

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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir para la determinación cuantitativa de opiáceos y/o





justicia.




realizar la determinación de opiáceos y/o metabolitos en muestra de orina y/o

sangre provenientes de personas vivas, mediante CG-MS.

3. RESPONSABLES:











Fecha: Marzo 2018

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un laboratorio.

5. DEFINICIONES:







capilar.



analito.








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organismo de certificación





i) Solución Estándar: Solución de concentración conocida.

j) Solución Madre: Solución estándar concentrada que se prepara a partir de




Los opiáceos son sustancias naturales o sintéticas derivadas del opio. El

opio es una sustancia obtenida de las cápsulas de semillas verdes de la planta

amapola, Papaver somniferum. Contiene diversos alcaloides naturales como

morfina, papaverina y codeína; mediante la sustitución de 2 grupos acetilo de la

morfina se obtiene su derivado diacetilmorfina (Heroína).

Los opiáceos producen un efecto analgésico bloqueando la transmisión

del estimulo del dolor, la morfina es el principal alcaloide del opio utilizada como

analgésico de alto poder, es administrada principalmente por vía parenteral y es




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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excretada en un 90% por la orina de los cuales aproximadamente el 10% es

eliminada sin cambios, la codeína es utilizada como un analgésico de bajo

poder y entre el 10 – 20 % de la droga es excretada sin cambios por vía urinaria

dentro de 24 horas.

En general los opiáceos son absorbidos rápidamente luego de aplicación

subcutánea o intramuscular. La heroína posee un efecto analgésico dos o tres

veces superior a la morfina y debido a su liposolubilidad se absorbe bien por

cualquier vía de entrada, por lo que es administrada principalmente por vía

transdérmica debido a la obtención de efectos más rápidos e intensos aunque

también puede ser esnifada. La heroína se hidroliza con rapidez a 6 -

Monoacetilmorfina que a su vez se hidroliza a morfina y se excreta por vía renal

en forma de morfina, 6-monoacetilmorfina y sus correspondientes glucurónidos.















Fecha: Marzo 2018

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(CG-MS)







• Papel pH




• Estufa


• Patrón certificado de diacetilmorfina

• Patrón certificado de morfina

• Patrón certificado de codeína



• Cloroformo




• Agua destilada




Fecha: Marzo 2018

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• Isopropanol (opcional)





desproteinizar)

6.5. Curva de calibración opiáceos:





!�� ó�� (��) =

#�� ó �$�� %��&' × (�� (�&) ×100

+� �,��














Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Tabla 1. Preparación de las soluciones estándar de opiáceos



(µg/mL)


madre (mL) V balón

aforado (mL)

1 0,001 1,0 0,1 100

2 0,005 1,0 0,5 100

3 0,008 1,0 0,8 100

4 0,01 1,0 1,0 100

5 0,03 1,0 3,0 100

6 0,05 1,0 5,0 100

7 0,08 1,0 8,0 100

8 1,0 1,0 Utilizar solución 1,0 µg/mL

Nota: El límite de detección de los opiáceos mediante CG-MS puede variar de









Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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3) Realizar la determinación cualitativa de opiáceos y/o metabolitos en la


6.7. Ejecución del ensayo para la determinación de opiáceos mediante

CG-MS:


sangre):










unos minutos.







Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Nota: Para una mejor extracción de la morfina y diacetilmorfina también puede

utilizar como solvente: cloroformo – isopropanol (9:1); diclorometano –

isopropanol (9:1) ó acetato de etilo.












Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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- 50 °C.

14) Derivatizar la muestra añadiendo 20 µL BSTFA (N,O-Bis

(Trimetilsilil)Trifluoroacetamida).






Fecha: Marzo 2018

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16) Añadir 150 µL de acetato de etilo anhidro, mezclar e inyectar la mezcla en el

cromatógrafo.


masas CG-MS:




Inyector Columna

Modo: Automático Columna: HP-5MS o

equivalente

Longitud (m): 30

Temperatura Inyector (°C):

280

Diámetro interno (mm): 0,25





Detector: MS

Velocidad (°C/min)

T (°C)

Tiempo (min)

--- 100 2

Temperatura

detector (°C): 230 20 280 5

Rango de masa (amu): 35-550 30 300 4




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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4) Realizar dos inyecciones de los estándares: concentración baja (0,001

µg/mL) y concentración alta (1,0 µg/mL) para identificar el tiempo de

retención de los analitos a determinar y permitir un acondicionamiento óptimo

del sistema.








propio del equipo.


equipo.





equipo.




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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estándar externo:
















2) Reportar el resultado obtenido de la concentración de opiáceos en la muestra

problema en la hoja de reporte de resultados (FQT00-01).




Fecha: Marzo 2018

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7. FORMULARIOS:




2009.

• Kerrigan S, Goldberger B. Opioids. In: Levine B, editor. Principles of

forensic toxicology. 2° ed. United States of America: AACCPress; 2003.








• Yaksh T, Wallace M. Opioides, analgesia y tratamiento del dolor. En:

Brunton L, Chabner B, Knollmann B editores. Goodman & Gilman Las

bases farmacológicas de la terapéutica. 12th ed. México: McGraw-Hill

Interamericana editores, S.A; 2012.




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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9. ANEXOS:

Anexo N° 1. Diagrama de flujo para la determinación de opiáceos mediante CG

-MS.



Anotar en hoja de reporte los resultados obtenidos (FQT00-01)



Derivatizar la muestra añadiendo 20 µL BSTFA (N,O-Bis (Trimetilsilil)Trifluoroacetamida), cerrar el vial herméticamente y dejar derivatizar por 15 min a 85 °C, retirar del calor y dejar enfriar

Filtrar la fase orgánica a través de un papel de filtro contentivo de Na2SO4 en una capsula y trasvasar el filtrado a un vial evaporándolo a sequedad



Añadir 150 µL de acetato de etilo anhidro y mezclar




Fecha: Marzo 2018

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Anexo N° 2. Iones principales para opiáceos

Sustancia m/z

Morfina 364, 477

6- monoacetilmorfína 364, 423, 414, 473

Codeína 371, 343, 372

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE BENZODIACEPINAS MEDIANTE




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir para la determinación cualitativa de benzodiacepinas

y/o metabolitos en muestra de orina y/o sangre provenientes de personas vivas








realizar la determinación de benzodiacepinas y/o metabolitos en muestra de

orina y/o sangre provenientes de personas vivas, mediante la técnica de


3. RESPONSABLES:












Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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un laboratorio.

5. DEFINICIONES:








analito.










Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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• Capilares de vidrio de 80 µL de capacidad







Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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• Viales 2mL

• Papel pH







• Estufa







• Agua destilada





• N-(1-naftil)etilendiamina

• Acetona (grado analítico)





Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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• Nitrito de sodio

• Hexano (opcional)





desproteinizar)



• Reactivos para el revelado Spray de Dragendorff (opcional)

• Patrón certificado de Clonazepam

• Patrón certificado de Oxazepam

• Patrón certificado de Alprazolam

• Patrón certificado de Diazepam


6.4.1. Ácido sulfúrico 1.9 M: Medir 190 mL de H2SO4(c) 98 %, trasvasar a un

balón aforado de 1 L de capacidad y enrazar hasta el aforo con H2O(d).

6.4.2. Reactivo de Bratton-Marshall: Pesar 1 g de N-(1-naftil)etilendiamina en

agua- acetona (8,7:2).

6.4.3. Nitrito de sodio acuoso 1 %: Pesar 1 g NaNO2 y llevar a 100 mL con

H2O(d)





Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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agua.

• Mezclar 10mL de solución A, 10mL solución B, 20mL ácido acético y

100mL agua destilada.









3) Realizar la determinación cualitativa de benzodiacepinas y/o metabolitos en

la muestra biológica de orina y/o sangre mediante la técnica de

cromatografía de capa fina (CCF). Ver anexo N° 1.




20 x 20 cm.







Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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(ver anexo N° 2)


6.7. Ejecución del ensayo para la determinación cua litativa de

benzodiacepinas y/o metabolitos mediante la técnica de

cromatografía de capa fina (CCF):





Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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sangre):










unos minutos.


















Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Nota: Para una mejor extracción de las benzodiacepinas también puede utilizar

como solvente: Hexano – Diclorometano (70:30).


anexo N° 3)
























Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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- 50 °C.




cromatográfica:

















Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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pequeña cantidad del patrón certificado de clonazepam, oxazepam,

alprazolam y diazepam respectivamente (Tomar con la punta de un

capilar una pequeña cantidad del patrón).




del patrón.













Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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2) Agregar 100 mL de Metanol y 1,5 mL de Hidróxido de amonio (sistema TA).

También puede utilizar sistema TB para bases nitrogenadas o TD, TE para

drogas ácidas y neutras, para ello ver lista de sistemas para el desarrollo de

las cromatoplacas en formulario código: FQT02-01.






















Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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3) Como revelador rocíe en secuencia: ácido sulfúrico 1.9 M, solución recién

preparada de nitrito de sodio acuoso 1 %, secar y rociar con solución de

amidosulfonato de amonio 5 % (H2NSO3NH4) y por ultimo rociar con el

reactivo de Bratton-Marshall. Tomar en cuenta que el método de revelado es

destructivo de la placa cromatográfica.

Nota: Puede utilizar también como revelador el reactivo Spray de dragendorff

tomando en cuenta que no es destructivo de la placa cromatográfica pero es

menos específico para la visualización de las benzodiacepinas.









extracción.











Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Nota: Límite de detección referencial para benzodiacepinas 1µg/mL.

7. FORMULARIOS:



cromatográfica.







�� = ��

��





Fecha: Marzo 2018

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2012.


Recommended methods for the detection and assay of barbiturates and

benzodiazepines in biological specimens. Manual for use by National

laboratories, ST/NAR/28. United Nations. 1997.





Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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9. ANEXOS:

Anexo N° 1. Diagrama de flujo para la determinación de benzodiacepinas y/o


No

Si


¿Posee muestra de orina?





1


Extracción líquido-líquido de la muestra añadiendo 6mL de muestra, ajustar pH 8-9 y añadir solvente de extracción





Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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1







Añadir revelador ácido sulfúrico 1.9 M, solución recién preparada de nitrito de sodio acuoso 1 %, secar y rociar con solución de amidosulfonato de amonio 5 % (H2NSO3NH4) y por ultimo rociar con el reactivo de Bratton-Marshall.






Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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20cm

10cm



1cm 1cm

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE BENZODIACEPINAS MEDIANTE CG-MS



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir para la determinación cuantitativa de

benzodiacepinas y/o metabolitos en muestra de orina y/o sangre provenientes

de personas vivas incursas en procesos legales mediante CG-MS, a fin de

estandarizar y optimizar los procedimientos a realizar para dar cumplimiento a

las experticias toxicológicas forense in vivo solicitadas por los entes

administradores de justicia.




realizar la determinación de benzodiacepinas y/o metabolitos en muestra de

orina y/o sangre provenientes de personas vivas, mediante CG-MS.

3. RESPONSABLES:











Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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un laboratorio.

5. DEFINICIONES:







capilar.



analito.








Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Las benzodiacepinas son sustancias utilizadas en terapéutica como

sedantes - hipnóticos, ansiolíticos y anticonvulsionantes. Estas pueden

clasificarse mediante su tiempo de acción, entre las que se encuentran acción

corta (tiempo de vida media menor a 10 horas como: alprazolam, clotiazepam,

loprazolam, Brotizolam, Midazolam, etc.), acción intermedia (10-24 horas como:

Clonazepam, Bromazepam, Delorazepam, Flunitrazepam, etc.) y acción larga

(mayor a 24 horas como: Clordiazepam, Clobazam, Diazepam, flurazepam,

Ketazolam, Nitrazepam, etc).




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Pueden ser administradas por vía oral o intravenosa siendo metabolizadas

principalmente por el hígado y excretada en su mayoría por vía urinaria. Las

benzodiacepinas pueden ser detectadas en la orina entre 24 a 48 horas para

las de acción de corto tiempo y por más de 7 días para las de acción media y

larga.













(CG-MS)










Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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• Papel pH




• Estufa


• Patrón certificado de Clonazepam

• Patrón certificado de Oxazepam

• Patrón certificado de Alprazolam

• Patrón certificado de Diazepam



• Cloroformo




• Agua destilada






desproteinizar)




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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6.5. Curva de calibración benzodiacepinas:





!�� ó�� (��) =

#�� ó �$�� %��&' × (�� (�&) ×100

+� �,��




















Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Tabla 1. Preparación de las soluciones estándar de benzodiacepinas



(µg/mL)


madre (mL) V balón

aforado (mL)

1 0,01 1,0 0,1 10

2 0,03 1,0 0,3 10

3 0,05 1,0 0,5 10

4 0,08 1,0 0,8 10


6 1,5 100,0 1,5 100

7 1,8 100,0 1,8 100

8 2,0 100,0 2,0 100

Nota: El límite de detección de benzodiacepinas mediante CG-MS puede variar

de acuerdo a las condiciones de operación y calibración del equipo. Valor











3) Realizar la determinación cualitativa de benzodiacepinas y/o metabolitos en

la muestra biológica de orina y/o sangre mediante CG-MS. Ver anexo N° 1.




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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6.7. Ejecución del ensayo para la determinación de benzodiacepinas

mediante CG-MS:


sangre):










unos minutos.














Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Nota: Para una mejor extracción de las benzodiacepinas también puede utilizar

como solvente: Hexano – Diclorometano (70:30).





















Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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- 50 °C.

14) Derivatizar la muestra añadiendo 25 µL BSTFA (N,O-Bis

(Trimetilsilil)Trifluoroacetamida) con 1 % TMCS (Clorotrimetilsilano).




masas CG-MS:






Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Inyector Columna


equivalente

Longitud (m): 30


250



Purga: Off

Presión (psi): 10

Flujo inicial (mL/min):

1,5


Detector: MS

Velocidad (°C/min)

T (°C)

tiempo (min)

Inicio 140 1

Temperatura

detector (°C): 300 30 260 5

Rango de masa (amu): 35-550 50 320 ---








Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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propio del equipo.


equipo.





equipo.




12) Monitoree los iones mostrados en el anexo N° 2.




Fecha: Marzo 2018

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estándar externo:
















2) Reportar el resultado obtenido de la concentración de benzodiacepinas en la


7. FORMULARIOS:





Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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2016.


Recommended methods for the detection and assay of barbiturates and

benzodiazepines in biological specimens. Manual for use by National

laboratories, ST/NAR/28. United Nations. 1997




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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9. ANEXOS:

Anexo N° 1. Diagrama de flujo para la determinación de benzodiacepinas

mediante CG -MS.






Derivatizar añadiendo 25 µL BSTFA (N,O-Bis (Trimetilsilil)Trifluoroacetamida) con 1% TMCS (Clorotrimetilsilano), cerrar el vial herméticamente y derivatizar por 10 min a 60 °C, retirar del calor y dejar enfriar

Filtrar la fase orgánica a través de un papel de filtro contentivo de Na2SO4 en una capsula y trasvasar el filtrado a un vial evaporándolo a sequedad






Fecha: Marzo 2018

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Anexo N° 2. Iones principales para benzodiacepinas

Benzodiacepina Pico base

m/z

Iones abundantes

m/z

Alprazolam 308 279, 204, 273, 77, 307

Bromazepam 236 317, 315, 208, 286, 78

Clonazepam 280 314, 286, 234, 240, 288

Diazepam 256 283, 255, 284, 285, 257

Flunitrazepam 285 312, 313, 238, 266, 284

Midazolam 310 312, 311, 163, 325, 75

Oxazepam 257 77, 205, 233, 259, 268

Triazolam 313 238, 342, 315, 75, 137

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE ANFETAMINAS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE

CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir para la determinación cualitativa de anfetaminas y/o









realizar la determinación de anfetaminas y/o metabolitos en muestra de orina

y/o sangre provenientes de personas vivas, mediante la técnica de


3. RESPONSABLES:









CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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un laboratorio.

5. DEFINICIONES:








analito.







CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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• Viales 2mL

• Papel pH







• Estufa






• Hidróxido de sodio


• Agua destilada




• Ácido clorhídrico concentrado



CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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• Tolueno

• N- clorobutano




desproteinizar)




• Patrones certificados de anfetamina

• Patrones certificados de metanfetamina

• Patrones certificados de 3,4-metilenodioxianfetamina (MDA)

• Patrones certificados de 3,4-metilelenodioximetanfetamina (MDMA)

• Patrones certificados de 3,4-etilenodioxietilanfetamina (MDEA)

• Ninhidrina (opcional)

• Acetona (opcional)






agua.


agua destilada.


CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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6.4.2. Reactivo Spray de Ninhidrina (opcional): Añadir 0.5g de Ninhidrina a

10 mL de ácido clorhídrico (c) y diluir a 100mL con acetona.

6.4.3. Solución metanólica de ácido clorhídrico: Agregar en un vial 9 mL de

metanol y 1 mL de ácido clorhídrico concentrado.









3) Realizar la determinación cualitativa de anfetaminas y/o metabolitos en la






20 x 20 cm.






CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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(ver anexo N° 2)



anfetaminas y/o metabolitos mediante la técnica de cromatografía de

capa fina (CCF):


sangre):



CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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unos minutos.










ajustar a pH 11 añadiendo 1 - 2 mL de Hidróxido de sodio 1 M.




5) Añadir 5 mL de n- clorobutano al tubo de ensayo y taparlo. Puede sustituir

también el n-clorobutano por diclorometano.


CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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anexo N° 3)




















ensayo con 6mL de n-clorobutano cada vez y repetir el paso anterior de


Nota: Si utilizó diclorometano realizar los lavados de la fase orgánica con este

solvente.


CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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13) Añadir al extracto 50 µL de una solución metanólica de ácido clorhídrico.




- 50 °C.




cromatográfica:















CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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pequeña cantidad del patrón certificado de anfetamina, metanfetamina,

3,4-metilenodioxianfetamina (MDA), 3,4-metilelenodioximetanfetamina

(MDMA) y 3,4-etilenodioxietilanfetamina (MDEA) respectivamente

(Tomar con la punta de un capilar una pequeña cantidad del patrón).




del patrón.










CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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2) Agregar 100 mL de Metanol y 1,5 mL de Hidróxido de amonio (sistema TA).

También puede utilizar sistema TE para drogas ácidas y neutras, para ello

ver lista de sistemas para el desarrollo de las cromatoplacas en formulario

código: FQT02-01.


















Nota: También puede utilizar reactivo de Ninhidrina como revelador.


CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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extracción.
















CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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Nota: Límite de detección referencial para anfetaminas 1µg/mL.

7. FORMULARIOS:



cromatográfica.













�� = ��

��


CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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2009.






2012.







CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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9. ANEXOS:

Anexo N° 1. Diagrama de flujo para la determinación de anfetaminas y/o


No

Si


¿Posee muestra

de orina?





1


Realizar la extracción líquido-líquido de la muestra añadiendo 6mL de muestra, ajustar pH 11 y añadir solvente de extracción


CAPA FINA (CCF)



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1










CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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20cm

10cm



1cm 1cm

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE ANFETAMINAS MEDIANTE CG-MS



Fecha: Marzo 2018

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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir para la determinación cuantitativa de anfetaminas





justicia.




realizar la determinación de anfetaminas y/o metabolitos en muestra de orina

y/o sangre provenientes de personas vivas, mediante CG-MS.

3. RESPONSABLES:











Fecha: Marzo 2018

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un laboratorio.

5. DEFINICIONES:







capilar.



analito.








Fecha: Marzo 2018

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Las anfetaminas pertenecen al grupo de drogas estimulantes del sistema

nervioso central, son utilizadas en terapéutica para tratar problemas de

trastornos por déficit de atención, hiperactividad ó narcolepsia. Los principales

efectos psíquicos que surgen luego de una dosis oral son vigilia, alerta y menor

percepción de la fatiga, estimulación del ánimo, aumento de la confianza en sí

mismo y capacidad de concentración; aunque mejora la realización de

actividades intelectuales sencillas donde el sujeto realiza más trabajo también




Fecha: Marzo 2018

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aumenta el número de errores. Mejora el rendimiento físico de los deportistas

abusándose de este fármaco para este fin.

Las metanfetaminas guardan una relación química estructural igual al de

las anfetaminas, son estimulantes del SNC y con dosis más pequeñas que las

anfetaminas producen efectos más intensos y se acompañan de acciones

periféricas menos sobresalientes.

Las anfetaminas y metanfetaminas son generalmente administradas por

vía oral, son liposolubles y se absorben rápidamente por el intestino y pueden

ser detectadas en la orina después de 20 min del consumo. Dependiendo del

pH de la orina alrededor del 30 % de la dosis consumida es excretada de forma

inalterada en 24 horas, similares cantidades de excreción se han encontrado de

la metanfetamina y el 90 % de la dosis es excretada en 3 a 4 días, siendo

mayores los porcentajes de excreción en orinas de pH ácido que de pH alcalino.














Fecha: Marzo 2018

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(CG-MS)




• Micropipetas de 100 µL



• Papel pH




• Estufa


• Patrones certificados de anfetamina

• Patrones certificados de metanfetamina

• Patrones certificados de 3,4-metilenodioxianfetamina (MDA)

• Patrones certificados de 3,4-metilelenodioximetanfetamina (MDMA)

• Patrones certificados de 3,4-etilenodioxietilanfetamina (MDEA)


• Acetato de etilo anhidro (grado analítico)

• Cloroformo





Fecha: Marzo 2018

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• N- clorobutano

• Agua destilada






desproteinizar)


6.5.1. Solución metanólica de ácido clorhídrico: Agregar en un vial 9 mL de

metanol y 1 mL de ácido clorhídrico concentrado.

6.6. Curva de calibración anfetaminas:





!�� ó�� (��) =

#�� ó �$�� %��&' × (�� (�&) ×100

+� �,��








Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Tabla 1. Preparación de las soluciones estándar de anfetaminas



(µg/mL)


madre (mL) V balón

aforado (mL)

1 0,01 1,0 0,1 10

2 0,03 1,0 0,3 10

3 0,05 1,0 0,5 10

4 0,08 1,0 0,8 10


6 1,5 100,0 1,5 100

7 1,8 100,0 1,8 100

8 2,0 100,0 2,0 100




Fecha: Marzo 2018

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Nota: El límite de detección de anfetaminas mediante CG-MS puede variar de












3) Realizar la determinación cualitativa de anfetaminas y/o metabolitos en la


6.8. Ejecución del ensayo para la determinación de anfetaminas mediante

CG-MS:


sangre):









Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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unos minutos.










ajustar a pH 11 añadiendo 1 - 2 mL de Hidróxido de sodio 1 M.




5) Añadir 5 mL de n- clorobutano al tubo de ensayo y taparlo. Puede sustituir

también el n-clorobutano por diclorometano.









Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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ensayo con 6mL de n-clorobutano cada vez y repetir el paso anterior de


Nota: Si utilizó diclorometano realizar los lavados de la fase orgánica con este

solvente.




13) Añadir al extracto 50 µL de una solución metanólica de ácido clorhídrico.




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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- 50 °C.

15) Una vez evaporado el extracto a sequedad recuperar con 150 µL de acetato

de etilo anhidro e inyectar la mezcla en el cromatógrafo.


masas CG-MS:




Inyector Columna


equivalente

Longitud (m): 30


280



Purga:

Off

Presión (psi): 10

Flujo inicial (mL/min):

1,5




Fecha: Marzo 2018

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Detector: MS

Velocidad (°C/min)

T (°C)

Tiempo (min)

--- 70 1

Temperatura

detector (°C): 230 30 100 --

Rango de masa (amu): 35-550 10 270 --
















propio del equipo.




Fecha: Marzo 2018

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equipo.





equipo.






estándar externo:
















Fecha: Marzo 2018

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2) Reportar el resultado obtenido de la concentración de anfetaminas en la


7. FORMULARIOS:






2009.





2016.









Fecha: Marzo 2018

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• Westfall T, Westfall D. Agonistas y antagonistas adrenérgicos. En:

Brunton L, Chabner B, Knollmann B editores. Goodman & Gilman Las

bases farmacológicas de la terapéutica. 12th ed. México: McGraw-Hill

Interamericana editores, S.A; 2012.




Fecha: Marzo 2018

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9. ANEXOS:

Anexo N° 1. Diagrama de flujo para la determinación de anfetaminas mediante

CG -MS.




Realizar la extracción líquido-líquido añadiendo 6 mL de la muestra (si es sangre desproteinizar previamente), ajustar pH 11 con Hidróxido de sodio y 6mL de n-clorobutano.


Filtrar la fase orgánica a través de un papel de filtro contentivo de Na2SO4 en una capsula y añadir Añadir al extracto 50 µL de una solución metanólica de ácido clorhídrico.



Evaporar el extracto a sequedad

Recuperar con 150 µL de acetato de etilo anhidro




Fecha: Marzo 2018

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Anexo N° 2. Iones principales para anfetaminas

Sustancia m/z

Anfetaminas 44, 65, 190, 118, 91

Metanfetaminas 58, 91, 134, 204, 160, 118

3,4-metilenodi oxianfeta mina (MDA) 325, 162, 135

3,4-metilelenodioximetanfetamina (MDMA) 204, 339, 162

3,4-etilenodioxietilanfetamina (MDEA) 353, 218, 190

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE CANNABINOIDES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

DE CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir para la determinación cualitativa de cannabinoides









realizar la determinación de cannabinoides y/o metabolitos en muestra de orina

y/o sangre provenientes de personas vivas, mediante la técnica de


3. RESPONSABLES:









DE CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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un laboratorio.

5. DEFINICIONES:








analito.







DE CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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DE CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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• Viales 2mL

• Papel pH







• Estufa







• Hidróxido de potasio (opcional)


• Agua destilada




• Sal de Azul rápido B (o-dianisidina)


DE CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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• Ácido clorhídrico concentrado (opcional)



• Tolueno

• Ciclohexano (grado analítico)






desproteinizar)


cromatoplacas. Ver FQI02-01

• Reactivo o-dianisidina tetrazotizada (Azul rápido B 1%)

• Reactivo Duquenois (opcional)

• Vainillina (opcional)

• Acetaldehído (opcional)

• Patrones certificados de cannabinol

• Patrones certificados de 9 – carboxy-THC

• Patrones certificados de ∆9- THC





DE CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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6.4.2. Ácido clorhídrico 2.0 M (opcional): Medir 16,1 mL de HCl(c) 38 %,

trasvasar a un balón aforado de 100 mL de capacidad y enrazar hasta el

aforo con H2O(d).

6.4.3. Reactivo de o-dianisidina tetrazotizada (spr ay de Azul rápido B) 1%:

Disolver una pizca de sal de Azul rápido B (o-dianisidina) en 2 gotas de

agua destilada y añadir etanol hasta obtener una coloración anaranjado-

rojiza.

6.4.4. Reactivo de Duquenois (opcional): Disolver 2g de vainillina y 0.3mL de

acetaldehído en 100mL de etanol.









3) Realizar la determinación cualitativa de cannabinoides y/o metabolitos en la





DE CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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20 x 20 cm.





















(ver anexo N° 2)



DE CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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cannabinoides y/o metabolitos mediante la técnica d e cromatografía

de capa fina (CCF):


sangre):










unos minutos.









4) Colocar la alícuota tomada en un tubo de ensayo evitando derramamiento e

hidrolizar añadiendo 2 mL de Hidróxido de potasio ó sodio, tapar el tubo de


DE CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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ensayo y calentar en baño de maría por aprox. 20 min a 50 °C agitando

ocasionalmente.

5) Añadir al extracto 20 mL de ciclohexano: acetato de etilo (7:1).

Nota: También puede utilizar 0.5 mL de ácido acético más 2 mL de hexano:

acetato de etilo (9:1).

6) Tapar el tubo de ensayo y agitar por 10 min.

7) Dejar enfriar la extracción y ajustar a pH 2 lentamente y agitando

suavemente mientras se añade H2SO4 2M, tapar el tubo de ensayo. También

puede utilizar HCl 2M.





anexo N° 3)












DE CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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ensayo con 6mL de ciclohexano: acetato de etilo cada vez y repetir el paso

anterior de extracción de la fase acuosa en cada lavado.







- 50 °C.




cromatográfica:




DE CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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pequeña cantidad del patrón certificado de cannabinol, patrón certificado

de 9-carboxy-THC y de ∆9- THC respectivamente (Tomar con la punta de

un capilar una pequeña cantidad del patrón).




del patrón.


DE CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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2) Agregar 85 mL de acetato de etilo, 10 mL de metanol y 5 mL de hidróxido de

amonio (sistema TE). También puede utilizar sistema para drogas en general:

TAJ, TAK o TAL, para ello ver lista de sistemas para el desarrollo de las

cromatoplacas en formulario código: FQT02-01.










DE CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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2) Coloque una cantidad del reactivo de o-dianisidina tetrazotizada (spray de

Azul rápido B) en la fiola del sistema del pulverizador e introduzca en la fiola

la base del pulverizador.

Nota: También puede utilizar reactivo de Duquenois como revelador rociando

luego la placa de CCF con ácido clorhídrico (reactivo destructivo de la placa

cromatográfica).








extracción.



DE CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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Nota: Límite de detección referencial para cannabinoides 1µg/mL.

7. FORMULARIOS:



cromatográfica.

�� = ��

��


DE CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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Ecuador. 2014.






2012.







DE CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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9. ANEXOS:

Anexo N° 1. Diagrama de flujo para la determinación de cannabinoides y/o


No

Si


¿Posee muestra

de orina?





1


Extracción líquido-líquido de la muestra añadiendo 6mL de muestra, hidrolizar con 2 mL de NaOH 1M, calentar por 20 min a 50 °C. Añadir 20 mL de ciclohexano: acetato de etilo (7:1), agitar por 10 min. Dejar enfriar y ajustar a pH 2 con H2SO4 2M, agitar por 10 min.


DE CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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1







Añadir revelador spray o-dianisidina tetrazotizada (Azul rápido B 1%)



DE CAPA FINA (CCF)



Fecha: Marzo 2018

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20cm

10cm



1cm 1cm

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE CANNABINOIDES MEDIANTE CG-MS



Fecha: Marzo 2018

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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir para la determinación cuantitativa de cannabinoides





justicia.




realizar la determinación de cannabinoides y/o metabolitos en muestra de orina

y/o sangre provenientes de personas vivas, mediante CG-MS.

3. RESPONSABLES:











Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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un laboratorio.

5. DEFINICIONES:







capilar.



analito.








Fecha: Marzo 2018

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Los cannabinoides provienen de la planta Cannabis sativa el cual es

contentiva de diferentes compuestos conociéndose más de 60 cannabinoides

diferentes, entre los que se encuentran los cannabinol, cannabidiol y en

especial el delta-9-tetrahidrocannabinol (∆9-THC) el cual es un agente químico

con efectos alucinógenos que alteran la percepción, pensamientos,

sentimientos, el sentido del tiempo y lugar, inducen delirios, alucinaciones y

paranoia. Los efectos farmacológicos del ∆9-THC varían de acuerdo a la dosis,




Fecha: Marzo 2018

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la vía de administración, y la vulnerabilidad del individuo a los efectos

psicoactivos.

La principal forma de administración del cannabis es mediante la

inhalación, siendo el ∆-9-THC extensamente metabolizado en el organismo a

sus principales metabolitos el ácido 11-nor-∆-9-tetrahidrocannabinol-9-

carboxilico y sus conjugados glucuronidos, luego de 72 horas de fumar el

cannabis aproximadamente el 50 % de la marihuana inhalada es excretada en

forma de sus metabolitos y el otro 50 % es distribuido a través del organismo,

siendo estos acumulados en el tejido adiposo debido a su liposolubilidad y

excretados lentamente durante los días continuos. La eliminación del ∆-9-THC y

sus metabolitos se realiza en un 25 % por vía urinaria y 65 % por medio de las

heces fecales.














Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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(CG-MS)




• Micropipetas de 100 µL



• Papel pH




• Estufa


• Patrones certificados de cannabinol

• Patrones certificados de 9 – carboxy-THC

• Patrones certificados de ∆9- THC


• Acetato de etilo anhidro (grado analítico)

• Cloroformo



• N- clorobutano




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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• Agua destilada



• TMCS (Clorotrimetilsilano) 1%

• Ácido clorhídrico concentrado (opcional)






desproteinizar)




6.5.2. Ácido clorhídrico 2.0 M (opcional): Medir 16,1 mL de HCl(c) 38 %,

trasvasar a un balón aforado de 100 mL de capacidad y enrazar hasta el

aforo con H2O(d).

6.6. Curva de calibración anfetaminas:








Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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!�� ó�� (��) =

#�� ó �$�� %��&' × (�� (�&) ×100

+� �,��




















Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Tabla 1. Preparación de las soluciones estándar de cannabinoides


Concentración solución

madre (µg/mL)


madre (mL) V balón

aforado (mL)

1 0,001 1,0 0,1 100

2 0,005 1,0 0,5 100

3 0,008 1,0 0,8 100

4 0,01 1,0 1,0 100

5 0,03 1,0 3,0 100

6 0,05 1,0 5,0 100

7 0,08 1,0 8,0 100


Nota: El límite de detección de cannabinoides mediante CG-MS puede variar

de acuerdo a las condiciones de operación y calibración del equipo. Valor











3) Realizar la determinación cualitativa de cannabinoides y/o metabolitos en la





Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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6.8. Ejecución del ensayo para la determinación de cannabiboides

mediante CG-MS:


sangre):










unos minutos.














Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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ocasionalmente.














ocasionalmente.











Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Institución

ensayo con 6mL de ciclohexano: acetato de etilo cada vez y repetir el paso

anterior de extracción de la fase acuosa en cada lavado.







- 50 °C.

20) Derivatizar añadiendo 50 µL BSTFA (N,O-Bis (Trimetilsilil)Trifluoroacetamida)

con 1 % TMCS (Clorotrimetilsilano).




masas CG-MS:






Fecha: Marzo 2018

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Inyector Columna


equivalente

Longitud (m): 30


250






Detector: MS

Velocidad (°C/min)

T (°C)

Tiempo (min)

--- 180 0

Temperatura

detector (°C): 300 30 280 10

Rango de masa (amu): 35-550 30 300 2









Fecha: Marzo 2018

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4) Realizar dos inyecciones de los estándares: concentración baja (0,001

µg/mL) y concentración alta (1,0 µg/mL) para identificar el tiempo de

retención de los analitos a determinar y permitir un acondicionamiento óptimo

del sistema.








propio del equipo.


equipo.





equipo.




12) Monitoree los iones para cannabinoides mostrados en el anexo N° 2.




Fecha: Marzo 2018

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estándar externo:
















2) Reportar el resultado obtenido de la concentración de cannabinoides en la


7. FORMULARIOS:





Fecha: Marzo 2018

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2009.



• O´Brien C. Adicción y abuso de drogas. En: Brunton L, Chabner B,

Knollmann B editores. Goodman & Gilman Las bases farmacológicas de

la terapéutica. 12th ed. México: McGraw-Hill Interamericana editores, S.A;

2012.




2012.



2016.









Fecha: Marzo 2018

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9. ANEXOS:

Anexo N° 1. Diagrama de flujo para la determinación de cannabinoides

mediante CG -MS.




Realizar la extracción líquido-líquido añadiendo 6 mL de la muestra (si es sangre desproteinizar previamente), 2 mL de KOH ó NaOH tapar y calentar por aprox. 20 min a 50 °C.


Filtrar la fase orgánica a través de un papel de filtro contentivo de Na2SO4 en una capsula y añadir.



Evaporar el extracto a sequedad

Añadir 20 mL de ciclohexano:acetato de etilo (7:1), ajustar lentamente a pH 2 con HCl ó H2SO4 2M, tapar y agitar por 10 min.

Derivatizar 50 µL BSTFA con 1 % TMCS, trasvasar la solución a un vial, cerrar y dejar derivatizar por 10 min a 60 °C, retirar del calor y dejar enfriar.




Fecha: Marzo 2018

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Anexo N° 2. Iones principales de Cannabinoides

m/z Compuesto

231, 246, 314, 232, 121, 193, 74, 174 Cannabidiol

295, 296, 238, 310, 119, 43, 251, 239 Cannabinol

221, 314, 248, 261, 193, 236, 222 ∆8- THC

299, 231, 314, 43, 41, 295, 55, 271 ∆9- THC

372,357,313 9-carboxy-∆9- THC dimetil derivados

299, 43, 41, 67, 300, 69, 231, 29 11-Hidroxi-∆9- THC

PROCEDIMIENTO PARA LA ELABORACIÓN DE LA EXPERTICIA TOXICOLOGÍCA FORENSE

IN VIVO

CÓDIGO: POE00-01 Página 1 de 8


Fecha: Marzo 2018

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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir para la emisión de resultados de los análisis

realizados a las muestras biológicas recibidas en los laboratorios de toxicología

forense, a fin de estandarizar los procedimientos a realizar para redactar la

experticia toxicológica forense in vivo solicitada por los entes administradores

de justicia.




realizar la redacción de la experticia toxicológica forense in vivo.

3. RESPONSABLES:









No aplica.


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5. DEFINICIONES:

a) Experticia: Documento emitido del examen de una persona, objeto o

sustancia y se considera un medio de prueba realizada por expertos con

conocimientos técnicos científicos en una materia determinada, con el fin de

cooperar en la apreciación técnica de un hecho punible.

b) Experto ó Perito: Persona especialmente cualificada en virtud de sus

conocimientos especializados en la ciencia, arte, técnica ó práctica

c) Procedimiento: Sucesión cronológica o secuencial de operaciones



aplicación.

d) Toxicología: Es la ciencia que estudia las sustancias químicas y los

agentes físicos que son capaces de producir alteraciones patológicas a los

seres vivos.



La Experticia es un documento que debe contener la identificación y/o

descripción de la persona, objeto ó sustancia a estudiar, la relación detallada de

todas las operaciones practicadas, los métodos científicos o técnicos utilizados

para emitir el dictamen y las conclusiones a la que se llegó.


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Fecha: Marzo 2018

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6.2. Procedimiento para el reporte final de los res ultados:

1) Engrapar la hoja de reporte de resultados de la muestra (FQT00-01) la cual

contiene los resultados tanto cualitativos como cuantitativos obtenidos de los

diferentes análisis, a la documentación de la muestra que se muestra a

continuación:

• Oficio de solicitud del análisis (FRT00-01)

• Encuesta (FRT01-01)

• Registro de cadena de custodia (FRT02-01)

• Consentimiento informado (FRT03-01)

2) Llenar para cada muestra mediante la información recaudada en la

documentación antes mencionada la hoja de reporte de resultado final

(Formulario código: FET00-01) a partir de la hoja de reporte de resultados

realizada durante los diferentes análisis de la muestra. La hoja de reporte de

resultado final contendrá:

• Lugar: Nombre del estado ó ciudad donde se esté realizando la

experticia.

• Fecha: Día, mes y año en que se estén reportando los resultados en la

hoja resumen de resultados finales.

• Folio: Número de hojas resumen de resultados finales que se llenen

para reportar la totalidad de los resultados de una muestra.

• Apellidos y nombres: Datos de la persona a la que se le realizó el

análisis.

• Número de control: Número otorgado a la muestra por el sistema digital

del laboratorio cuando la misma fue recibida. (ver POE código: POD00-

01)


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Fecha: Marzo 2018

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• Cantidad de las muestras recibidas: Cantidad en unidad de volumen

(mL) de la muestra recibida de sangre, orina u otra (especifique tipo y

cantidad).

• Sustancias analizadas: Especificar el tipo de sustancia y/o metabolitos

obtenidos, los resultados obtenidos de la cuantificación expresada en

unidad de concentración p/v y las observaciones (información opcional

que considere de relevancia para la sustancia y/o metabolitos obtenidos).

• Observaciones: Espacio designado para expresar las observaciones

que se tengan acerca de: si una sustancia solo pudo ser encontrada de

manera cualitativa, también si la cantidad de muestra resultó exigua para

un análisis en particular dificultando la búsqueda de una ó más

sustancias o anotar observaciones que el experto considere pertinente y

que deba aparecer en la experticia final para mayor claridad en la

interpretación de la misma.

• Técnicas analíticas utilizadas: Marcar con una X las técnicas utilizadas

para la identificación y cuantificación de las sustancias obtenidas.

• Nombres y apellidos del ó los experto (s): Datos del o los expertos

que realizaron los análisis.

3) Realizar el respaldo de información mediante el registro de los resultados

obtenidos de los análisis de las muestras tanto en el libro de control de

resultados como en el registro digital del departamento para esto ver POE

código: POD00-01.

4) Ingresar a la base de datos digital del laboratorio mediante el número de

control otorgado a la muestra y anotar en el mismo la fecha en que se está

sacando los resultados para transcribir la experticia e iníciales del experto

que proceso la muestra.


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Fecha: Marzo 2018

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6.3. Procedimiento para la redacción y entrega de l a Experticia

Toxicológica Forense In vivo :

1) Redactar la experticia toxicológica forense siguiendo el formulario código:

FET01-01 a partir de los documentos que se tienen de la muestra. La

experticia contendrá:

• Número de control: Número otorgado a la muestra por el sistema digital

del laboratorio cuando la misma fue recibida (código: POD00-01).

• Número de registro: Número asignado a la experticia final para esto ver

procedimiento código: POD00-01.

• Información de la persona a la que se le realizó el análisis: Datos

personales del individuo de quien se obtuvo las muestras: nombres y

apellidos, N° de documento de identidad: Cédula de identidad ó

pasaporte, sexo, edad, ocupación, dirección de vivienda.

• Información del ente que solicita la experticia: Datos obtenidos del

oficio de solicitud de la experticia: Procedencia, fecha del oficio,

expediente (opcional), N° de oficio, Fiscalía (opcional).

• Descripción de la muestra: Tipo de muestra biológica recibida, cantidad

de muestra recibida g ó mL, fecha de toma de la muestra, fecha de

recepción de la muestra en el laboratorio.

• Metodología empleada: Técnicas analíticas utilizadas para la detección,

identificación, confirmación y cuantificación de las sustancias.

• Resultados cualitativos obtenidos: Resultados de los análisis

cualitativos (reportar resultados colocando POSITIVO ó NEGATIVO).

• Resultados cuantitativos obtenidos: Resultados de los análisis

cuantitativos expresando los mismos en concentración (p/v: g/L ó

µg/mL).


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Fecha: Marzo 2018

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• Conclusiones: Breves conclusiones dadas por el ó los expertos en

relación a los resultados obtenidos de los análisis.

Nota: En las conclusiones puede mencionar algunos de los efectos en el

individuo que reportan las literaturas para una sustancia en particular de

acuerdo a la concentración obtenida, breve descripción del uso de las

sustancias obtenidas, relación de la concentración obtenida de una sustancia

en particular con las dosis reportadas en las literaturas como terapéuticas,

entre otros.

• Observaciones (opcional): Observaciones que el experto considere de

relevancia para una mejor interpretación de la experticia. En este renglón

se puede reflejar información respecto a si la cantidad de muestra era

exigua para realizar un análisis, si una sustancia solo pudo ser

determinada de manera cualitativa por estar en forma de trazas ó por

debajo de los límites de cuantificación, si no se pudo realizar un análisis

en particular, entre otros.

• Objetivo de la experticia: Motivo por el cual se practica.

• Información de los expertos: Nombre y apellido, firma, cargo,

profesión.

• Sello del laboratorio: sello húmedo del laboratorio colocado en todos

los folios de la experticia al momento de ser entregada al ente

correspondiente.

• Lugar: Ciudad y estado de Venezuela donde se está realizando la

experticia.

• Fecha: Fecha en que se realizó la experticia.

• Iníciales de nombre y Apellido: Iníciales del nombre y apellido del jefe

del laboratorio de Toxicología Forense / iníciales del nombre y apellido


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Fecha: Marzo 2018

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del secretario ó experto que transcribe la experticia. (Información a

colocarse en la parte inferior derecha de la experticia en el lugar marcado

como ___/___).

2) Realizar el proceso de transcripción de la experticia en el formulario código:

FET01-01 la cual puede ser transcrita por un secretario adscrito al laboratorio

ó por el experto que realizó la experticia.

3) Imprimir tres (3) copias originales de la experticia las cuales deben ser

revisadas por los expertos, confirmando que la información escrita se

corresponda con los datos del oficio de la muestra y con los resultados

obtenidos y reportados en la hoja resumen de resultados finales.

4) Una vez el o los expertos han revisado los datos contentivos en la experticia

asegurándose que estén todos correctos, firmar las tres experticias originales

y colocar el sello del laboratorio.

5) Engrapar una de las experticias a la documentación de la muestra para ser

archivada en el laboratorio, quedando en resguardo: el oficio, la encuesta, el

consentimiento informado, la cadena de custodia, la hoja resumen de

resultados finales y la experticia original.

6) Entregar las otras experticias originales al ó los ente (s) ó persona (s)

solicitante (s). para realizar éste paso ver POE código: POD00-01.

7. FORMULARIOS:


• FRT01-01: Formato de encuesta para la toma de la muestra aplicada a la

persona a quien se le realizará el estudio.

• FRT02-01: Planilla de registro de cadena de custodia.

• FRT03-01: Formato de consentimiento informado.


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Fecha: Marzo 2018

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• FQT00-01: Formato de reporte de resultados de la muestra.

• FET00-01: Formato para el reporte del resultado final.

• FET01-01: Formato de Experticia Toxicológica Forense In vivo.


• Código Orgánico Procesal Penal. Decreto N° 9.042. COPP, 2012.

• Montoya R. Influencia de la manipulación de la experticia como

herramienta principal en la resolución de una investigación. [Tesis].

Carabobo. Universidad José Antonio Páez. Disponible en:

https://bibliovirtualujap.wordpress.com/ciencias-juridicas/. Consultada el

20 de Noviembre del 2014.

• Vásquez M. Derecho Procesal Penal venezolano. Caracas; Editorial

Texto C.A; 2008.

9. ANEXOS:

No aplica.

PROCEDIMIENTO PARA EL REGISTRO Y RESPALDO DE LA INFORMACIÓN

CÓDIGO: POD00-01 Página 1 de 9


Fecha: Marzo 2018

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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir para el registro y el respaldo de la información de los

resultados obtenidos en los análisis realizados a las muestras biológicas

recibidas en los laboratorios de toxicología forense, a fin de estandarizar los

procedimientos a realizar para respaldar y resguardar la información de la

experticia toxicológica forense in vivo solicitada por los entes administradores

de justicia.




realizar el registro y el respaldo de la información de los resultados obtenidos de

los análisis realizados a las muestras biológicas recibidas en los laboratorios de

toxicología forense.

3. RESPONSABLES:











Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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No aplica.

5. DEFINICIONES:

a) Base de datos: Sistema de archivos electrónicos en donde la información

es organizada de forma que un programa de ordenador pueda seleccionar

rápidamente los fragmentos de datos que necesite.

b) Experticia: Documento emitido del examen de una persona, objeto o

sustancia y se considera un medio de prueba realizada por expertos con

conocimientos técnicos científicos en una materia determinada, con el fin de

cooperar en la apreciación técnica de un hecho punible.

c) Experto ó Perito: Persona especialmente cualificada en virtud de sus

conocimientos especializados en la ciencia, arte, técnica ó práctica

d) Procedimiento: Sucesión cronológica o secuencial de operaciones



aplicación.

e) Registro: Documento que proporciona pruebas objetivas de las actividades

realizadas o de los resultados logrados.

f) Respaldo de información: Resguardo realizado de ciertos datos de

manera digital a través de disco duro de computadora o en un documento

físico.




Fecha: Marzo 2018

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6.1. Respaldo digital y físico de información de lo s resultados obtenidos:

1) Llenar el libro de registro de resultados (Libro foliado dispuesto para el

registro de los resultados) con tinta indeleble y letra legible sin enmiendas ni

tachaduras, así como el registro digital de resultados del departamento

(formato Excel realizado en la computadora del área de toxicológicos In vivo)

con la información reportada en la hoja de reporte de resultados finales

(FET00-01) y el oficio de solicitud del análisis, el cual debe contener:

• Nombres y Apellidos de la persona incursa en el proceso legal

• Sexo de la persona incursa en el proceso legal

• Edad de la persona incursa en el proceso legal

• Encuesta (Tipo de drogas que consume de acuerdo a encuesta)

• N° de expediente

• N° de oficio

• N° de la Fiscalía solicitante del análisis (opcional)

• Procedencia (Ente u órgano policial que emite la solicitud de la experticia

toxicológica)

• Fecha del oficio

• Fecha de recepción del oficio y la muestra en el laboratorio

• Fecha de salida del oficio con los resultados para ser transcrita la

experticia

• Resultados encontrados

• Iníciales del Nombre y Apellido del ó los expertos que realizan la

experticia.




Fecha: Marzo 2018

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• Fecha de entrega de la experticia transcrita al experto para su lectura y

posterior firma (opcional solo aplica si la experticia fue transcrita por un

secretario).

• Iníciales del secretario (a) que recibe la experticia final ya firmada y lista

para ser entregada al ente solicitante.

• Fecha en la que el secretario (a) recibe la experticia final por parte del

experto.

• Firma del secretario (solo aplica para el libro de registro de resultados)

2) Respaldar la información digital en un CD ó disco duro externo del

laboratorio.

3) Realizar el respaldo digital diariamente.

4) Resguardar el libro de registro de resultados y el registro digital en un sitio

seguro por los jefes del laboratorio.

6.2. Registro digital inicial del oficio de solicit ud de análisis:

1) Abrir el programa de nombre “Base de datos” en la computadora central del

laboratorio, la cual se encuentra en el área de secretaria.

2) Ingresar a la opción de registro de oficios nuevos.

3) Registrar los datos del oficio de solicitud de análisis (FRT00-01) en la base

de datos digital el cual debe contener la siguiente información:

• Nombres y Apellidos de la persona incursa en el proceso legal

• N° de documento de identificación C.I ó pasaporte (Si posee)

• N° de expediente

• N° de oficio

• N° de la Fiscalía solicitante del análisis (opcional)




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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• Procedencia (Ente u órgano policial que emite la solicitud de la experticia

toxicológica)

• Fecha del oficio

• Fecha de recepción del oficio y la muestra en el laboratorio

• Fecha de ingreso del oficio en el sistema digital

• Iníciales del nombre y apellido del experto que recibió el oficio y la

muestra en el laboratorio.

• Iníciales del nombre y apellido de la persona que ingresa el oficio en el

sistema digitalizado.

• Tipo de experticia solicitada colocando: Toxicológico in vivo

• Tipo de muestra recibida: Sangre, orina u otra.

• Número de registro (espacio llenado solo al momento de entregar la

experticia al ente competente)

• Fecha de entrega de la experticia al ente competente

• Iníciales del secretario que entrega la experticia.

4) Aceptar el ingreso de la información presionando tecla F10 del computador.

5) Esperar que el sistema arroje el número de control identificativo del oficio.

Nota: El número de control está compuesto por los últimos 2 dígitos del año en

curso – Número del Mes en el cual ingresa el oficio al laboratorio - los últimos

cuatro dígitos corresponden al número de oficios que ingresan al laboratorio por

mes comenzando cada mes por 0000. Ver anexo n° 1

6) Anotar el número de control en la parte superior del oficio con tinta indeleble

de manera clara y legible.

7) Cerrar el programa de base de datos

8) Apagar el computador.




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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6.3. Registro para la entrega de la experticia fina l (FET01-01) al ente

competente:

6.3.1. Registro en documento físico:

Llenar el libro de entrega de experticia el cuál debe contener en cada línea:

• Número de registro el cuál se le asignara a cada experticia al momento

de darle salida.

Nota: El número de registro está conformado por el número de la institución (n°

fijo en todas las experticias) – número del laboratorio (n° fijo en todas las

experticias) - número consecutivo asignado a la experticia final de acuerdo a la

numeración que se vaya registrando en el libro de entrega de experticia

comenzando por 000, el cual identifica a la experticia entre todas las sacadas

durante un (1) año. Ver anexo n° 2.

• Número de registro (anotarlo en todos los folios de la experticia en el

espacio designado para ello, mediante el uso de un bolígrafo de tinta

indeleble de color negro de manera clara y legible).

• Número de control de la experticia.

• Tipo de experticia: Toxicológica In vivo.

• Nombre y Apellido del secretario o persona que entrega la experticia.

• Nombre y Apellido de la persona autorizada a retirar la experticia, cédula

de identidad, firma y fecha de retiro de la misma.

6.3.2. Registro en base de datos digital:

1) Abrir el programa de nombre “Base de datos” en la computadora central del

laboratorio, la cual se encuentra en el área de secretaria.

2) Ingresar a la opción “Búsqueda de oficio”.




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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3) Colocar el número de control de la experticia en el campo designado para

ello.

4) Aceptar el ingreso del número de control introducido presionando la tecla F10

del computador. Esperar que el sistema arroje la información

correspondiente al oficio.

5) Verificar que la información dada por el sistema sea la misma a la contenida

en el oficio de solicitud del análisis.

6) Llenar los campos correspondientes a:

• Colocar el número de registro asignado a la experticia.

• Colocar las iníciales del nombre y apellido del secretario (a) que entrega

la experticia final al ente competente.

• Colocar fecha en la que se entrega la experticia.

• Colocar sello húmedo del laboratorio en todos los folios de las experticias

en la parte inferior de la misma.

7) Aceptar la nueva información añadida presionando la tecla F10 del

computador.

6.4. Entrega de la experticia al ente correspondien te:

1) Solicitar a la persona que acude al laboratorio a retirar la experticia el oficio

de remisión de la experticia emitido por el ente correspondiente donde sea

nombrado por el ente competente como persona autorizada para retirar la

misma.

Nota: La información del oficio de remisión debe ser corroborada con la cédula

o documento de identidad de la persona, revisando nombres y apellidos, C.I ó

pasaporte, si proviene de algún ente solicitar el carnet que lo identifique como

empleado del mismo.




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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2) Buscar la experticia en el archivo del área de secretaria dispuesto para

experticias a ser entregadas.

3) Colocar la experticia en un sobre, cerrarlo y entregarlo a la persona

autorizada para su retiro.

4) Solicitar a la persona autorizada para el retiro de la experticia que llene los

espacios del libro de entrega de experticias en los espacios correspondientes

a:

• Nombre y apellido de la persona autorizada a retirar la experticia

• Cédula de identidad ó pasaporte

• Firma de la persona que retira

• Fecha de retiro de la experticia

7. FORMULARIOS:


• FET00-01: Formato para el reporte del resultado final.

• FET01-01: Formato de Experticia Toxicológica Forense in vivo.





2012.




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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9. ANEXOS:

Anexo N° 1. Número de control asignado a los oficios

Donde A son los últimos 2 dígitos del año en curso (Ej: año en curso 2016 se

coloca 16), B el número del mes en el cual ingresa el oficio al laboratorio (Ej:

Mes octubre se coloca 10) y por último C son los últimos cuatro dígitos

asignados al oficio que ingresan al laboratorio por mes comenzando cada mes

por 0000.

Anexo N° 2. Número de registro asignado a la experticia.

Donde A es el número de la institución (n° fijo en todas las experticias, Ej: 9700

N° asignado al Cuerpo de Investigaciones Científicas, Penales y Criminalísticas

(C.I.C.P.C)), B corresponde al número del laboratorio (n° fijo en todas las

experticias, Ej: 133 número asignado al laboratorio de toxicología Forense del

C.I.C.P.C) y C es un número consecutivo asignado a la experticia final de

acuerdo a la numeración que se vaya registrando en el libro de entrega de

experticia comenzando por 000, el cual identifica a la experticia entre todas las

sacadas durante un (1) año.

16100001

A B C

9700-133-001

A B C


CÓDIGO: MPT01-01


Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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11. SISTEMA DE CONTROL DE LA DOCUMENTACIÓN

SISTEMA DE CONTROL DE LA DOCUMENTACIÓN

CÓDIGO: POG00-01 Página 1 de 10


Fecha: Marzo 2018

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1. PROPÓSITO:

Proveer los pasos a seguir para la elaboración, codificación y control de los

cambios de los documentos del área de toxicológicos in vivo del laboratorio de

toxicología forense.




realizar la elaboración, codificación y control de los cambios de los documentos

del área de toxicológicos in vivo del laboratorio de toxicología forense.

3. RESPONSABLES:

Es responsabilidad del jefe del Laboratorio de Toxicología Forense divulgar,

actualizar y controlar el cumplimiento de este procedimiento. Podrá solicitar la

colaboración del personal profesional o administrativo para la elaboración de

documentos.


No aplica.

5. DEFINICIONES:

a) Copia controlada: Representa la única copia oficial de un documento con

que cuenta un área.




Fecha: Marzo 2018

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b) Copia no controlada: Representa la copia de un documento de la cual no

se puede garantizar el origen ni su distribución.

c) Documento: Información escrita u en otro soporte que permite conocer los

sucesos a través del tiempo.

d) Formulario: Formas impresas o instructivos empleados para el desarrollo

de los procedimientos, los cuales se intercalan dentro de los procedimientos

o se adjuntan como complementos.

e) Índice maestro: Listado de todos los documentos que se utilizan en una

organización.

f) Procedimiento: Sucesión cronológica o secuencial de operaciones



aplicación.

g) Procedimiento Operativo Estándar (POE): Conjunto de instrucciones


h) Registro: Documento que proporciona pruebas objetivas de las actividades

realizadas o de los resultados logrados.


6.1. Parámetros generales de los documentos:

• Redactar los documentos de forma clara y precisa.




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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• La estructura general de los documentos deberán ser realizados de

acuerdo a lo establecido en este procedimiento.

• Los documentos deberán contener el logo de la institución en la parte

superior izquierda del encabezado.

• El título de los documentos serán colocados en la parte superior central

del encabezado en letra mayúscula y negrita tamaño 11.

• Codificar todos los documentos colocando el código asignado en la parte

superior derecha del encabezado en letra mayúscula y negrita tamaño

11.

• Se colocará en la parte superior derecha del encabezado, debajo del

código identificativo del documento el número de páginas y el número

total de páginas del mismo en letra minúscula y negrita tamaño 11.

• Se colocará en todos los documentos en la parte inferior de cada página

la información correspondiente a por quien (es) fue redactado, revisado y

aprobado el documento, así como fecha de redacción, revisión y

aprobación del documento, N° y fecha de la versión original y N° y fecha

de actualización en letra minúscula y negrita tamaño 11.

• Todo documento deberá escribirse en letra “Arial”, color negro, tamaño

12.

• Los subtítulos dentro de la estructura del documento deberán ser escrito

en letra mayúscula, negrilla, cursiva y tamaño 12.

• Todo documento estará incluido en el Índice maestro de código: IMG00-

01.

• Hacer referencia en los documentos a los formularios y procedimientos

escritos relacionados.




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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• Todas las copias de los documentos deberán llevar un sello que lo

identifique como “COPIA CONTROLADA” o como “COPIA NO

CONTROLADA”.

6.2. Codificación de los documentos:

Todos los documentos llevarán una identificación alfanumérica de 7 dígitos que

constará de las siguientes partes:

• TIPO: Define el tipo de documento y se designará con letras mayúsculas:

MP Manual de Procedimientos

PC Proceso

PO Procedimiento operativo estándar

F Formulario

IM Índice maestro

• ÁREA: Define el área involucrada y se designará con una letra mayúscula:

R Recepción

T Toxicología Forense in vivo

A Almacenamiento

Q Análisis químico

E Redacción de experticias

D Secretaría

C Control de calidad

G Dirección y gerencia

• NÚMERO: Identifica el número consecutivo y correlativo del documento.




Fecha: Marzo 2018

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Nota: En el caso de los formularios de existir varios formularios para un mismo

proceso deberá colocarse una letra luego del número para su identificación.

Ejemplo: 01A

• VERSIÓN: Se identifica con números que van precedidos por una barra o

guión.

Ejemplo de codificación alfanumérica para identificar documentos:

POR01-01 donde, PO: Procedimiento operativo estándar

R: Área de recepción

01: Documento n° 01

-01: Primera versión

FQT02-01 donde, F: Formulario

Q: Área de análisis químico

T: Área de Toxicología forense

02: Documento n° 02

-01: Primera versión

6.3. Elaboración y codificación de los documentos:

1) Recopilar la información requerida por parte del personal autorizado para la

elaboración y / o codificación un documento.

2) Elaborar y transcribir la información en el formato “Hoja de documentos” de

código: FGT00-01.




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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3) Asigna el código correspondiente tomando en cuenta el tipo de documento,

el o las área (s) involucradas, número correlativo y versión, de acuerdo a lo

señalado en el presente procedimiento.

4) El personal autorizado revisa la codificación y el contenido del documento

elaborado.

5) Si el documento cumple con las pautas del presente procedimiento se

continúa con el proceso siguiente, en caso contrario devolver el documento

para su corrección indicando las causas del rechazo para que se realicen las

modificaciones pertinentes.

6) El personal autorizado imprime el documento en hojas blancas.

7) El documento es firmado por la persona que lo elabora, por la persona que lo

revisa y por el encargado de dar su aprobación.

8) Se entregara el documento firmado al responsable del área involucrada para

su resguardo.

6.4. Estructura de los documentos:

Estructura a seguir para la elaboración de los procedimientos operativos

estandarizados:

• Título del procedimiento: Describe el nombre del documento.

• Propósito: Define el tema y propósito del procedimiento.

• Alcance / Campo de aplicación: Define a quien y que procedimientos

afecta el POE.

• Responsables: Identifica a los responsables del cumplimiento del POE,

así como responsables de la elaboración, emisión, control y vigilancia del

documento.




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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• Medidas de seguridad del Personal: Refiere las medidas de seguridad

que deberán tener las personas para realizar los procedimientos en caso

de que el procedimiento lo amerite.

• Definiciones: Términos de uso frecuente que se emplean con sentido

específico dentro del POE.

• Descripción del proceso: En éste espacio se especifican fundamentos y

principios del POE, materiales y equipos, e instrucciones detalladas para

llevar a cabo el procedimiento.

• Formularios: Indican los formularios y formatos requeridos para realizar

una actividad y para registrar los resultados de los ensayos.

• Documentación de referencia: Documentos y normas en las que se basa

el procedimiento.

• Anexo: Espacio designado para adjuntar información que complemente

el POE.

6.5. Estructura de los Formularios:

1) Estructura y parámetros a seguir para la elaboración de los formularios:

• Titulo del formulario: Se debe indicar el titulo que identifica al formulario

colocándolo en la parte superior central del encabezado del documento

colocándolo en letra tipo Arial, mayúscula y negrilla tamaño 11.

• Código del formulario: Indicar la codificación alfanumérica

correspondiente el extremo superior derecho del encabezado.

• Páginas: Se colocará en la parte superior derecha del encabezado,

debajo del código identificativo del documento el número de páginas y el

número total de páginas del mismo.




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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2) Las copias de los formularios de uso diario deberán mantenerse en el

tamaño original del mismo.

6.6. Estructura de los diagramas de flujo:

1) Graficar los procesos o procedimientos en las figuras que correspondan del

Flujograma.

2) La información contenida en cada figura debe ser clara y resumida.

3) Las figuras a utilizar para la elaboración del Flujograma serán las siguientes

(no limitativo):

Indica el inicio y el fin del proceso

Indica una toma de decisión donde se plantearan 2 posibles opciones Si o No.

Indica una acción simple o un subproceso.

Indica tarea alternativa que no forma parte del proceso.

Indica la presencia de un documento en formato de papel.

Indica la generación de documentos múltiples en formato de papel.

Indica la conexión entre páginas o actividades.

Indica el sentido del flujo o secuencia del proceso.




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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4) Los conectores entre páginas o actividades deberán representarse con letras

y deberán seguir una secuencia de aparición para evitar duplicidad de los

mismos.

6.7. Control de los cambios:

Procedimientos a aplicar cuando sea requerido una modificación, actualización

y/ o revisión de cualquier documento:

1) El personal autorizado para la modificación, actualización y/o revisión del

documento detecta la necesidad del cambio y recopila la información

requerida.

2) Llenar el formulario de “Control de los cambios” de código: FGT01-01.

3) Indicar en el formulario cuál es el nombre del documento a modificar y su

código, la descripción del cambio, la justificación para llevarlo a cabo, la lista

de procedimientos y formularios relacionados afectados, indicar si hubo

modificación de la validación del método y si es requerido la capacitación del

personal involucrado.

4) Firmar el formulario y entregarlo al coordinador del área afectada.

5) El coordinador revisará la información contenida en el formulario y si la

modificación cumple con las pautas del presente se aprueba el cambio y se

procede a modificar el documento cumpliendo con las pautas del presente

procedimiento.

6) Luego de la elaboración del nuevo documento, sacar la versión anterior de

circulación colocándolo en el archivo de documentos obsoletos, se sella cada

hoja con sello “DOCUMENTOS OBSOLETOS” y se resguarda bajo custodia

de la dirección del laboratorio.




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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7) Cada 3 meses el personal autorizado revisará el archivo de documentos

obsoletos procediendo a destruir aquellos documentos con un tiempo de

permanencia superior a seis meses.

7. FORMULARIOS:

• IMG00-01: Índice maestro de código.

• FGT00-01: Formulario hoja para documentos.

• FGT01-01: Formulario de control de los cambios.


• Norma ISO/TR 10013:2001. Directrices para la documentación de

sistemas de gestión de la calidad. ISO; 2001.




2012.

• Secretaria de Relaciones Exteriores (SRE). Guía técnica para la

elaboración de manuales de procedimientos. México; 2004.

9. ANEXOS:

No aplica.


CÓDIGO: MPT01-01


Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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12. FORMULARIOS

FORMULARIO:

INDICE MAESTRO DE DOCUMENTOS

CÓDIGO: IMG00-01 Página 1 de 6


Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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I. MANUALES:

CÓDIGO Y VERSIÓN DEL DOCUMENTO

TITULO DEL DOCUMENTO

UBICACIÓN DE COPIAS

CONTROLADAS

FECHA DE VIGENCIA

MPT01-01

Manual de procedimientos para la experticia toxicológica

forense in vivo

Área de toxicológicos in

vivo Marzo 2018

II. PROCESOS:




CONTROLADAS

FECHA DE VIGENCIA

PCT00-01

Diagrama de flujo de proceso del área de

Toxicología forense in vivo

Área de toxicológicos in

vivo Marzo 2018

III. PROCEDIMIENTOS:




CONTROLADAS

FECHA DE VIGENCIA

POG00-01 Sistema de control de la documentación

Dirección del laboratorio

Marzo 2018

POC00-01

Procedimiento de verificación de la

calibración de equipos e instrumentos de

laboratorio

Control de calidad

Marzo 2018

FORMULARIO:




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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CONTROLADAS

FECHA DE VIGENCIA

POR00-01

Procedimiento para la recepción de muestras

biológicas en el laboratorio de

toxicología forense

Recepción Marzo 2018

POA00-01

Procedimiento para el almacenamiento de

muestras biológicas en el laboratorio de

toxicología forense

Almacenamiento Marzo 2018

POQ00-01

Procedimiento para la determinación de alcohol

etílico mediante microdifusión en cámara

de Conway

Análisis químico Marzo 2018

POQ01-01

Procedimiento para la determinación de alcohol

etílico en sangre mediante CG-HS


POQ02-01

Procedimiento para la determinación cualitativa de sustancias mediante

prueba de inmunoensayo con

dispositivo


POQ03-01

Procedimiento para la determinación cualitativa de sustancias mediante

prueba de inmunoensayo E.L.I.S.A


POQ04-01

Procedimiento para la determinación cualitativa de sustancias mediante cromatografía de capa

fina (CCF)


FORMULARIO:




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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CONTROLADAS

FECHA DE VIGENCIA

POQ05-01

Procedimiento para la determinación de cocaina mediante

cromatografía de capa fina (CCF)


POQ06-01

Procedimiento para la determinación de cocaina mediante

CG-MS


POQ07-01

Procedimiento para la determinación de

opiaceos mediante cromatografía de capa

fina (CCF)


POQ08-01


opiáceos mediante CG-MS


POQ09-01

Procedimiento para la determinación de benzodiacepinas

mediante cromatografía de capa fina (CCF)


POQ10-01

Procedimiento para la determinación de benzodiacepinas mediante CG-MS


POQ11-01


anfetaminas mediante cromatografía de capa

fina (CCF)


FORMULARIO:




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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CONTROLADAS

FECHA DE VIGENCIA

POQ12-01


anfetaminas mediante CG-MS


POQ13-01


cannabinoides mediante cromatografía de capa

fina (CCF)


POQ14-01


cannabinoides mediante CG-MS


POE00-01

Procedimiento para la elaboración de la

experticia toxicologíca forense in vivo

Redacción de experticias Marzo 2018

POD00-01 Procedimiento para el

registro y respaldo de la información

Redacción de experticias / Secretaría

Marzo 2018

IV. FORMULARIOS:




CONTROLADAS

FECHA DE VIGENCIA

IMG00-01 Índice maestro de documentos

Dirección Marzo 2018

FGT00-01 Hoja para Documentos


FGT01-01 Control de los Cambios


FORMULARIO:




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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CONTROLADAS

FECHA DE VIGENCIA

FCT00-01 Etiqueta para

identificación de equipos e instrumentos de

laboratorio

Control de calidad

Marzo 2018

FRT00-01 Oficio de solicitud del examen toxicológico


FRT01-01 Encuesta para toma de muestra


FRT02-01 Registro de cadena de custodia


FRT03-01 Consentimiento informado Recepción Marzo 2018

FCA00-01 Registro y control de

temperatura de neveras y congeladores

Control de calidad / Análisis

químico Marzo 2018

FQT00-01 Reporte de resultados obtenidos para cada

muestra

Análisis químico / Toxicología

Forense Marzo 2018

FQT01-01 Lista de correlación de

concentración de alcohol etílico y síntomas

clínicos


Forense Marzo 2018

FQT02-01 Lista de sistemas para el

desarrollo de la cromatoplaca en CCF


Forense Marzo 2018

FQT03-01 Lista de reveladores

para la visualización de la cromatoplaca en CCF


Forense Marzo 2018

FET00-01 Reporte de resultado final para cada muestra

Redacción de experticias / Toxicología

Forense

Marzo 2018

FORMULARIO:




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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CONTROLADAS

FECHA DE VIGENCIA

FET01-01 Experticia Toxicológica Forense in vivo

Redacción de experticias / Toxicología

Forense

Marzo 2018

FORMULARIO:

HOJA PARA DOCUMENTOS

CÓDIGO: FGT00-01 Página 1 de 1


Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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NOMBRE DEL DOCUMENTO CÓDIGO: Páginas

1. PROPOSITO

2. ALCANCE/CAMPO DE APLICACIÓN

3. RESPONSABLES

4. MEDIDAS DE SEGURIDAD DEL PERSONAL

5. DEFINICIONES

6. DESCRIPCIÓN DEL PROCESO

7. FORMULARIOS

8. DOCUMENTACIÓN DE REFERENCIA

9. ANEXOS

Redactado por: Revisado por: Aprobado por:

Fecha: Fecha:

Fecha:

Versión original: Actualización N°: Fecha de vigencia: Fecha de vigencia:

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FORMULARIO:

CONTROL DE LOS CAMBIOS

CÓDIGO: FGT01-01 Página 1 de 1


Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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N° de cambio:

FORMULARIO DE CONTROL DE LOS CAMBIOS

Documento a modificar:

Código del documento:

Descripción del cambio:

Justificación del cambio:

Lista de Procedimientos relacionados afectados:

Lista de Formularios relacionados afectados:

Se afectó la validación: Si ____ No_____

Comente:

Es necesaria la capacitación del personal: Si_____ No_____

Comente:

Solicitado por: Fecha:

Autor del cambio: Fecha:

Coordinador del área: Fecha:

Jefe del laboratorio: Fecha:

Fecha de aprobación: Fecha de vigencia:

FORMULARIO: ETIQUETA PARA IDENTIFICACIÓN DE EQUIPOS

E INSTRUMENTOS DE LABORATORIO

CÓDIGO: FCT00-01 Página 1 de 1


Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Equipo/Instrumento: _________________________________

N° de código/N° de Bien Nacional: _____________________

Marca: _____________________________________________

Modelo: ____________________________________________

N° de serial: ________________________________________

Ubicación: _________________________________________

Fecha de puesta en marcha: __________________________

Condiciones de operación: ____________________________

FORMULARIO: OFICIO DE SOLICITUD DEL EXAMEN

TOXICOLÓGICO

CÓDIGO: FRT00-01 Página 1 de 1


Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Membrete del organismo solicitante

N° de oficio: (Si aplica)

Para: Laboratorio de toxicología forense

Se solicita realizar examen toxicológico al ciudadano (a):_____

portador (a) del documento de identidad: __________, edad: _____

quien figura como ____________ en el expediente N° ______ (si aplica)

con conocimiento de la fiscalía N° _____ del Estado: ____ (si posee).

Firma y sello organismo solicitante

Lugar y Fecha

FORMULARIO:

ENCUESTA PARA TOMA DE MUESTRA



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Enfermera (o) que toma las muestras:

Tipos de muestras tomadas :

Apellidos y Nombres :

Document o de identidad:

Ocupación:

Edad: Sexo:

Lugar y Fecha: D M A

Hora:

Motivo del examen:

Consume o consumió:

Sustancia: Si No Consumió última vez:

Alcohol etílico

Consume desde:

________________ _____________________

Cigarrillo ________________ _____________________

________________ _____________________ Cocaína

Marihuana ________________ _____________________

Heroína ________________ _____________________

________________ _____________________ Anfetaminas

Otros :

Consume algún medicamento :

V E

___________________________________ Firma :

Sangre Orina Otras: _______________

FORMULARIO:

REGISTRO DE CADENA DE CUSTODIA



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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FORMULARIO:




Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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FORMULARIO:

CONSENTIMIENTO INFORMADO



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA REALIZACIÓN DEL EX AMEN TOXICOLÓGICO Y PROCEDIMIENTOS RELACIONADOS, EN PERS ONAS

INCURSAS EN PROCESOS LEGALES.

Fecha y hora: ____ / ____ / ____. ______

Día Mes Año Hora

Nombres y Apellidos de la persona a examinar:__________________________

� Nombres y Apellidos del representante legal (en caso de examen de menores

de edad ó personas discapacitadas):__________________________________

I. Yo, ____________________ una vez informado sobre los procedimientos que se llevarán a cabo, de la importancia de los mismos para la investigación judicial y las consecuencias posibles que se derivarían de la imposibilidad de practicarlos, otorgo en forma libre mi consentimiento: SI NO

a:____________________________________________________________ (Nombre de la entidad que realiza el examen)

para la realización del examen toxicológico, solicitado por:_______________

II. Como parte de la realización de este examen legal autorizo a efectuar:

• SI NO

• SI NO

• SI NO

Hago constar que el presente documento ha sido leído y entendido por mí en su integridad, de manera libre y espontánea.

Firma: __________________________________ N° C.I y/o pasaporte: _________________________

La extracción de sangre, orina y otras muestras biológicas necesarias para la realización de análisis forenses complementarios.

El traslado a otros laboratorios y la posterior utilización de las muestras biológicas tomadas para otros análisis que amerite la investigación judicial.

La utilización de los resultados para fines judiciales y otros procesos requeridos por los entes gubernamentales tales como formar parte de estadísticas.

FORMULARIO: REGISTRO Y CONTROL DE TEMPERATURA DE

NEVERAS Y CONGELADORES

CÓDIGO: FCA00-01 Página 1 de 1


Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Área:

Nevera/ congelador: ________________ Código del equipo: ___________

Fecha Hora Temperatura (°C) Responsable Observaciones

FORMULARIO: REPORTE DE RESULTADOS OBTENIDOS PARA

CADA MUESTRA

CÓDIGO: FQT00-01 Página 1 de 1


Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Sustancia Análisis Cualitativo Análisis Cuantitativ o

Alcohol etílico

Cocaína

Opiáceos

Marihuana

Benzodiacepinas

Anfetaminas

Otras:


Lugar: Folio:

Cantidad de muestras (mL): Sangre Orina Otras:_________________ _______________

SUSTANCIAS ANALIZADAS Y TÉCNICAS

N° de control:

Nombre y Apellido experto: Nombre y Apellido experto:

Fecha: / / /

FORMULARIO: LISTA DE CORRELACIÓN DE CONCENTRACIÓN DE ALCOHOL ETÍLICO Y SÍNTOMAS CLÍNICOS



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Relación entre la concentración de alcohol etílico en sangre y los síntoma

generados en el individuo (consumidores no habituales).

Alcohol etílico en sangre (g/L) Estado

Síntomas clínicos (consumidores no habituales)

< 0,3

Sobrio � Comportamiento normal � Sin síntomas aparentes � Solo detectado por test especiales

0,3 - 0,5

Intoxicación ligera

� Color en la cara rosáceo � Euforia � Disminución de la atención � Disminución de las inhibiciones � Ligera incoordinación

0,5 - 1,0

Euforia

� Incoordinación � Defectos del discurso � Sociabilidad, hablador � Autoconfianza � Enlentecimiento de las reacciones � Brusquedad en la conducción � Ataxia

1,0 - 1,5 Excitación

Embriaguez

� Marcada incoordinación � Andar tambaleante � Midriasis � Inestabilidad emocional � Mayor disminución de las

inhibiciones � Alteración de la atención, juicio y

control � Cambios de comportamiento � Sobrevaloración capacidades

FORMULARIO: LISTA DE CORRELACIÓN DE CONCENTRACIÓN DE ALCOHOL ETÍLICO Y SÍNTOMAS CLÍNICOS



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Alcohol etílico en sangre (g/L) Estado

Síntomas clínicos (consumidores no habituales)

1,5 - 2,0 Confusión

Embriaguez

� Trastornos de memoria y

comprensión � Disturbio en percepción � Desorientación � Exageración emocional � Incoordinación muscular � Aumento tiempo reacción � Somnolencia � Falta de autocrítica

2,0 - 3,0 Estupor

� Incoordinación total � Estupor � Vómitos � Apatía, inercia, agresividad � Alteración del tiempo de reacción � Trastornos del habla

> 3,5 Intoxicación severa

Coma Posible muerte

� Inconsciencia, anestesia � Disminución de los reflejos � Dificultades cardíacas y

respiratorias � Hipotermia � Hipoglucemia � Convulsiones � Parálisis respiratorias, coma � Valores cercanos a 5 g/L se

considera muerte segura

FORMULARIO: LISTA DE SISTEMAS PARA EL DESARROLLO DE

LA CROMATOPLACA EN CCF



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Tipo de sustancias

Sistemas Solventes Compuestos de referencia

Drogas

básicas

nitrogenadas

TA Metanol : Hidróxido

de amonio (100:1,5)

Ecgonina, Morfina, Codeína,

Benzoilecgonina, Lorazepam,

Metanfetamina, Bromazepam

TB

Ciclohexano:Tolueno:

Dietilamina

(75:15:10)

Benzoilecgonina, Morfina,

Clonazepam, Bromazepam,

Hidroxianfetamina, Codeína

TC Cloroformo: Metanol

(90:10)

Anfetamina, MDA,

Metanfetamina, Nitrazepam,

Diamorfina, Cocaína

TL Acetona Morfina, Metanfetamina,

Cocaína, MDA, Anfetamina

TAE Metanol

Hidroximetanfetamina, MDA,

Metanfetamina, Morfina,

Codeína, Cocaína, Nicotina

TAF

Metanol: n-butanol

(60:40) y 0.1mol/L

NaBr

Loprazolam, Codeina,

Nicotina, Morfina, Dopamina

Drogas ácidas

y neutras

TD Cloroformo: Acetona

(80:20)

Flurazepam, Alprazolam,

Ketoprofeno, Clonazepam,

Ibuprofeno, Alobarbital

TE

Acetato de etilo:

Metanol: Hidróxido

de amonio (85:10:5)

Ibuprofeno, Fenoprofeno,

Morfina, Bromazepam, ∆9-

Terahidrocannabinol

TF Acetato de etilo Ketoprofeno, Hidrocortisona,

Clonazepam, Diazepam

TAD Cloroformo: Metanol

(90:10)

Ácido salicílico, Paracetamol,

Flurazepam, Ketoprofeno

FORMULARIO: LISTA DE SISTEMAS PARA EL DESARROLLO DE

LA CROMATOPLACA EN CCF



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Tipo de sustancias

Sistemas Solventes Compuestos de referencia

Drogas en

general

TAJ Cloroformo: Etanol

(90:10)

∆9-THC,Oxazepam, Cocaína,

Diamorfina, Ketamina

TAK

Cloroformo :

Ciclohexano: Ácido

acético (4:4:2)

Cocaína, Codeína, ∆9-THC,

Bromazepam, MDMA,

Diazepam

TAL

Cloroformo: Metanol:

Ácido propanoico

(72:18:10)

Cocaína, Ecgonina, Morfina,

Clonazepam, ∆9-THC

FORMULARIO: LISTA DE REVELADORES PARA LA

VISUALIZACIÓN DE LA CROMATOPLACA EN CCF



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Sustancias Revelador Solventes Resultados

Drogas básicas

nitrogenadas

Reactivo de Dragendorff

Solución A: Mezclar 2g de subnitrato de bismuto, 25mL de ácido acético y 100mL de agua. Solución B: Disolver 40g de ioduro de potasio en 100mL de agua. Mezclar 10mL de soluc. A, 10mL soluc. B, 20mL ácido acético y 100mL agua destilada.

Alcaloides terciarios mancha amarilla, anaranjada, rojo-

anaranjado, marrón-anaranjado

Reactivo de FPN

Mezclar 5mL de solución de cloruro de hierro, 45mL de solución de ácido perclórico 20%p/p y 50mL de solución de ácido nítrico al 50%v/v.

Grupo tiazina Mancha marrón-roja: fenotiazinas

Mancha azul: Dibenzazepinas

Spray Ninhidrina

Añadir 0.5g de Ninhidrina a 10 mL de ácido clorhídrico (c) y diluir a 100mL con acetona.

Mancha violeta o rosada: aminas primarias como

anfetaminas Mancha amarilla:

aminas secundarias

Reactivo Marquis

Mezclar 1mL de formaldehido con 9mL de ácido sulfúrico (c)

Mancha negra o violeta: alcaloides

tipo opiáceos. Nota: Reactivo

destructivo de la placa

Drogas ácidas

Reactivo Van Urk

Disolver 1g de p-dimetilaminobenzaldehído en 100mL de etanol y añadir 10mL de ácido clorhídrico (c)

Mancha amarilla: sulfonamidas Mancha azul:

alcaloides

Solución de cloruro férrico

Solución al 5% de cloruro de hierro: Pesar 5,21 g de FeCl3

(96%) en un beacker, trasvasar cuantitativamente el contenido pesado a un balón aforado de 100 mL de capacidad mediante el uso de un embudo y enrazar con H2O(d) hasta el aforo.

Mancha azul o violeta: Fenoles

FORMULARIO: LISTA DE REVELADORES PARA LA

VISUALIZACIÓN DE LA CROMATOPLACA EN CCF



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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Sustancias Revelador Solventes Resultados

Drogas neutras

Reactivo Furfuraldeh

ído

Solución A: diluir 2mL de furfuraldehído destilado en 100mL de acetona. Solución B: Diluir 4mL de ácido sulfúrico (c) en 100mL de acetona Rociar la cromatoplaca primero con la solución A y luego con la solución B.

Mancha violeta a azul oscuro ej:

carbamatos

Reactivo de sal de Azul rápido B (o-dianisidina tetrazotizad

a)

Solución 1% de sal de Azul rápido B (o-dianisidina): disolver una pizca del reactivo en 2 gotas de agua y añadir etanol hasta obtener una coloración anaranjado- rojiza

Mancha anaranjada: Cannabidiol

Mancha violeta: Cannabinol

Mancha violeta-rojiza ∆

9-THC

Reactivo Duquenois

Disolver 2g de vainillina y 0.3mL de acetaldehído en 100mL de etanol

Mancha azul a violeta:

Cannabinoides

FORMULARIO: REPORTE DE RESULTADO FINAL PARA CADA

MUESTRA

CÓDIGO: FET00-01 Página 1 de 1


Fecha: Marzo 2018

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Sustancia obtenidas Concentración (p/v) Observación


Folio:

Cantidad de muestras (mL): Sangre Orina Otras:_________________ _______________

SUSTANCIAS ANALIZADAS

N° de control:

TÉCNICAS ANALÍTICAS UTILIZADAS

Técnica: Si No

Microdifusión de Conway

Reacciones Químicas

Espectrofotometría UV

Inmunoensayo

Cromatografía en capa fina

Nombre y Apellido experto: Nombre y Apellido experto:

Técnica: Si No

Cromatografía GC-FID

Otras:

Cromatografía GC/MS

Cromatografía GC-HS-FID

Cromatografía Líquida (HPLC)

Lugar: Fecha: / / /

FORMULARIO: EXPERTICIA TOXICOLÓGICA FORENSE IN VIVO



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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___ / ___

METODOLOGÍA ANALÍTICA

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Institución

Logo del

Laboratorio

DATOS PERSONALES

EXPERTICIA TOXICOLÓGICA IN VIVO OFICIO: CONTROL:

FECHA OFICIO: / / EXPEDIENTE:

PROCEDENCIA:

FECHA RECEPCIÓN: / /

FOLIO: /

NOMBRES Y APELLIDOS: C.I ó PASAPORTE:

SEXO EDAD: OCUPACIÓN: F M

FECHA DE TOMA DE MUESTRA: / /

INVESTIGACIÓN Y RESULTADOS MUESTRAS RECIBIDAS: ORINA

SANGRE

OTRAS:

CANTIDAD g ó mL

SUSTANCIA Y/O METABOLITOS RESULTADO

CUANTITATIVO [p/v] RESULTADO

CUALITATIVO

MICRODIFUSIÓN DE CONWAY

REACCIONES QUÍMICAS

ESPECTROFOTOMETRÍA UV

INMUNOENSAYO

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

CROMATOGRAFÍA GC/MS

CROMATOGRAFÍA GC-FID

CROMATOGRAFÍA GC-HS-FID

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA HPLC

OTRAS:

CONCLUSIONES

OBSERVACIONES

OBJETIVO

INFORME QUE RENDIMOS A SOLICITUD DEL ________________________________________, CIRCUSCRIPCIÓN JUDICIAL DEL ESTADO _________, EN CUMPLIMIENTO DEL ARTICULO N°___ DEL CÓDIGO ORGÁNICO PROCESAL PENAL PARA LOS FINES QUE JUZGUE PERTINENTES.

EXPERTOS

__________FIRMA_________ NOMBRE Y APELLIDO

PROFESIÓN CARGO

LUGAR: _________________, FECHA: ____ DE ___________ DEL_____

DIRECCIÓN:

N° REGISTRO:

__________FIRMA_________ NOMBRE Y APELLIDO

PROFESIÓN CARGO

SELLO DEL LABORATORIO

FORMULARIO: EXPERTICIA TOXICOLÓGICA FORENSE IN VIVO



Fecha: Marzo 2018

Fecha: Marzo 2018


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13. APENDICE (Espacio dejado para utilización futura)

REFERENCIAS

[1] Organización Mundial de la Salud. Glosario de términos de alcohol y drogas. Publicación de la Organización Mundial de la Salud. 1994; p.1-64.

[2] Vásquez M. Derecho Procesal Penal Venezolano. Caracas; Editorial Texto C.A; 2008. p. 153.

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