ﻣﻦ أنزيم البروتييز القاعدي إنتاج وتوصيف ﻛﻌاﻣﻞ...

وزارة التعليم العالي والبحث العلمي

للعلوم الصرفة كلية التربية - جامعة كربالء

قسم علوم الحياة

من أنزيم البروتييز القاعديإنتاج وتوصيف

كعامل Metarhizium anisopliaeالفطرعثة الشمع تجاهلحيوية امن عوامل السيطرة

Galleria mellonella الكبرى

اطروحة مقدمة

اىل جملس كلية الرتبية للعلوم الصرفة / جامعة كربالء

جزء من متطلبات نيل درجة دكتوراه فلسفة وهي

(املقاومة األحيائية ) علم احليوان /علوم احلياة

من قبل

منى ابراهيم جاسم الموسوي

) احليوان علم / حياة علوم ماجستري (

رافإش

محمد رضا عنون .د م..أ

2015 اذار ه ١٤٣٦ مجادى ثان

م

يف آإن تومي آلسف آ لقاخمار وهآلنآليل و لافخت

تقونلقوم ي تآألرض لأيو

صدق ا العلي العظيم

٦ اآلية - يونس سورة

اإلهداء

أبى الفضل إال أن يكون له أبا الذي إىل

ابو الفضل العباس عليه السالم

من أوصاني ا هبما برا واحرتاما ىل إ

رمحه ا ......... .... والدي الغايل

والدتي الغالية ............أطال ا بعمرها

واشد هبم أزرى أمري يف أشركهم من إىل

حبـا واعتـزازا ....خوتـي األعـزاء واالقربـني وا خيت ا

إىل من شاطرني أيام احملن وتعلمت منه معنى الوفاء

حبـــا واحتـــرامــا ووفـــاء .......... زوجـــي

وأملي وبسميت فلذة كبدي و قرة عيين ىل إ

..................حبا وأكرامااحلبيب ولدي

منى

اإلهداء



ىل من أوصاني ا هبما برا واحرتاما إ

والدي الغايل .............رمحه ا



حبـا واعتـزازا .... خوتـي األعـزاء واالقربـني خيت وا ا



ىل فلذة كبدي و قرة عيين وأملي وبسميت إ

..................حبا وأكراما علي احلبيب ولدي

منى

اإلهداء











علي..................حبا وأكرامااحلبيب ولدي

منى

اإلهداء




رمحه ا ..والدي الغايل .............






وأملي وبسميت ىل فلذة كبدي و قرة عيين إ

علي..................حبا وأكراما احلبيب ولدي

منى

اإلهداء










كبدي و قرة عيين وأملي وبسميت ىل فلذة إ


منى

اإلهداء












منى

شكر وتقدير

نيوالصالة والسالم على اشرف االنبياء واملرسلوال ولد ند احلمد الواحد االحد الفرد الصمد الذي مل يكن له

شكري وتقديري اىل استاذي الفاضل الدكتور بان اتقدم اطروحيت يلزمين الواجب وانا اهني . وعلى آله الطيبني الطاهرين

. وسدد خطاهالعزيز اجلليل ا وفقهالقرتاحه موضوع البحث واالشراف عليه عنون حممدرضا

ورئاسة قسم علوم احلياة فيها ملا ابدوه يل من تسهيالت للعلوم الصرفة كما يطيب يل ان اسجل شكري لعمادة كلية الرتبية

احلياة /كلية العلوم /جامعة كربالء لتسهيل اجراء والشكر واصل اىل رئاسة قسم علوم . ومتابعة سري البحث و امتامه

معلومات التجارب اخلاصة مبجال األنزميات يف خمترباهتم واخص بالذكر الدكتور علي عبد الكاظم ملا قدمه يل من

انه مسيع الدعاء . يرضاه باشر على اجراء جتاربي جزاه ا عين خريا ووفقه ملا حيبه وومساعدة واشراف م

عثة شرة يفوتين ان اشكر الدكتور ثائر طه يف كلية الرتبية للبنات /جامعة الكوفة ملنحي املزرعة اخلاصة حب ال كما

احسان والسيدملساندته يل يف مجيع مراحل اعداد األطروحة دكتور نصري مرزه محزه الزميلي اشكر والشمع الكربى

الطباعة يف اجناز املساعدهت يدة حوراء النداوي السولدراسة اخلاصة با اإلحصائيةألجرائه التحليالت الطالقاني

يف يت مريم جبار وسرور حممد علييلاسجل شكري لزم واخريا .والسيدة هبة جبار ملساعدهتا يف رسم بعض األشكال

امسه ، وا املوفق انه يذكر ومل ولكل من مد يل يد العونبعض املصادر العلمية هم توفريملساعدهتم و ياالدراسات العل

.مسيع الدعاء

مىن

Summary اخلالصة

أ

اخلالصة

عزل م محل م للف م كف تقباألول تمث ل مح ين أ أس س أ عل مل البح ا الح ل تش أ

Metarhizium anisopliae عث م ال مر الحب ف مح فح مGalleria mellonella

الب وت ز ان ز م تيص فأنت ج و بأستعم ل معلق وناشح الف المذكين ، وف المحين الث ن تم

-: مت مأ هذه العزلم وتم التيصل ال النت ئج األكع مل مأ عيامل الض او الق عدي

نسبم عل أف ادوان ح عثم ال مر الحب ، فقد بلغت تأث ا لمعلق البيغ وجد أن ل -1

قل نسبم هالكأ تغل. ب نم بمل\بيغ 107 ×1 لت ك ز ب مع ملته عند % 62.88 لب يض لهالك

و 100عل نسبم هالك )ألل ق ت فقد ك نت م ب لنسبم أ، بيغ/مل 14×10عند الت ك ز % 31.78

س عم عند 120(% ل ق ت ال ين األول وال ابر والس بر عل التيال بعد 90.97و 96.99

( % 50.86 و 58.88و 62.90)ه األوطأ وك نت ق م الج عمل /بيغ 107 ×1الت ك ز

م أ. بعد م ونالمد ذاته بيغ/ مل 4 10× 1عند الت ك ز لألطيان المذكين وعل نفس الت ت ب

واوطأ مل/بيغ 107 ×1عند الت ك ز % 54.89بخصيص العذان فقد سجلت أعل نسبم هالك

لب لغ ت فقد سببت المع ملم ل وب لنسبم. بيغ/مل 14×10عند الت ك ز % 36.85نسبم هالك

للذكين واألن ث عل التيال خالل %( 63.94و 69.95) هالكب لت ك ز األعل أقص نسب

للذكين واألن ث عل التيال % ( 43.91و 41.91س عم. ب نم ك نت أدن نسبم هالك ) 168

.بيغ / مل وب لمد ذاته 4 10×1عند مع ملته ب لت ك ز

أقص %100ذ سبب الت ك ز ا، ا ض عثم الف ادوان ح تأث ا مزنعمال اشحلوجد أن

أوطأ نسبم هالك بلغت %25، ب نم سجل الت ك ز % 60.91 بلغت نسبم هالك ف الب يض

مأ ق ت ال ين األول ( % 91.99و 97و 100هلك ) %100 وعند الت ك ز. % 26.82

و 64.96و 67.96وانخفضت نسبم الهالك إل ) . س عم 72الس بر عل التيال خالل وال ابر و

بعد م ون المد ذاته .ام %25طيان المذكين وعل نفس الت ت ب عند الت ك ز ( % لأل54.95

عند % 32.95و % 100عند الت ك ز % 50.96ك هالك نت نسبم البخصيص العذان فقد

( 58.98و 68.90م الب لغ ت فقد أوضحت النت ئج أن أعل نسبم هالك ك نت ). أ % 25الت ك ز

، ف ح أ ك نت اوطأ نسبم %100عند الت ك ز س عم 72تيال بعد واألن ث عل ال للذكين %

.%25 عند الت ك زللذكين واألن ث عل التيال وب لمد نفسه %( 32.97و 37.98)هالك

Summary اخلالصة

ب

عل ق دن اظه ت العزل م الف م الم ذكين ف تج نب التح ي عأ عيامل الض او للف -2

و . بع مض دات األح المجه م فض ال ع أانت ج انز م ت الب وت ز والح تن ز والال ب ز

ز ف وس ا الح د األدن الم دعم ب لح اائ أ اذ بلغ ت قص انت ج م ك ن ت ألن ز م الب وتأن أ وجد

بع مض دات األحأم ف م خ ج انت ج .وح د / ملغ م ب وت أ 41.12الفع ل م النيع م

لمض د األح المجه م الم أخيذ م أ وس ا ملم 5.3 هي كب ق للتثب اأن أفقد وجد المجه م

. S. aureus ضد بحت وانت ج مض دات األح المجه م

ن ز م الظ وا المثل جنت ج ا دنس أن ز م الب وت ز كع م ل ض او ب لتفص ل ، فيج د أن -3

م أ الج الت أ ب قم ه دنوج ن % 0.5المدعم ب % 0.05بنسبم عص التم ب تتمثل الب وت ز

م بس عم نج 30ف الح ض نم اله زاا بدنج م ح ان ،16% وحج م لق م مق دانه 5.5ابتدائ

س عم . 72دون / دق قم ولمد 100

م التب دل ( % ث60جزئ وقد إشتملت خ يات التنق م عل الت س ب ب ال ث نيل )اجنز م تنق م تم

س تعم لثم ب لت ش ح الهالم ب DEAE-Celluloseالمب دل ستعم لاأل ين ب قم اليجبم ب

م 28.726بل حقق ت الخ ي األخ ع دد م ات تنق م اذ، Sephadex G-150اله الم

. % 11.97بحص لم إنز م م

، أظه ت النت ئج م أت : اجنز م د تيص ف نعو

A- ق م أن ( ث ب ت م ح لسmK ) ( مل م يل ح ل 0.182و 0.179و 0.178)لألن ز م تبل

عل التيال . ف ح أ بلغ ت و اائ أ كمياد تف عل البيم أ المصل البق ي و الح والج الت أ

( ملغ م / م ل . دق ق م ح ل 0.364و 0.339و maxV( )0.465ق م الس عم القص ي )

عل التيال أ ض . ودناسم ت الثالثم المستخدمم ف الالب وت ن

-B ف ح أ ت اوم ال قم اجن ز م ه ي األمث ل لفع ل م 8.0ك ن ال قم اله دنوج ن ،

( . 9.0و 7.0اله دنوج ن للثب ت ب أ )

-C( م لمد 30-20أظه اجنز م ثب ت ح ان ب أ )دق قم . 30

-D و م المس تخدمم ف ه ذه الدناس م ف فع ل م تب أ تأث األ ين ت المعدن م والم ياد الح م

( مل م يل إل تثب ا فع ل م اجن ز م 5ب لت ك ز ) PMSFم د ال استعم ل أد ، إذ اجنز م

، ب نم ك ن لحلين د مم دل عل أن اجنز م عيد إل مجميعم الب وت ز الس ن ب لح مل

م . فع ل م اجنزف تأث ا ح ث FeCl)2( واالحد د

املختصرات الواردة يف الرسالة

Bovine serum albumin Bsa

Diethyl amino ethyl-cellulose DEAE-Cellulose

Ethylene diamine tetra acetic acid EDTA

Entomopathogenic fungi EPF

N-acetylglucosamine GlcNAc

Iodoacetamide IAA

Michaelis-Menten Constant mK

Potato dextrose agar PDA

Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride PMSF

p-Nitrophenol pNP

p-Nitrophenyl N-acetyl β-D-glucosaminide pNP-GlcNAc

Tri chloro acetic acid TCA

Maximum velocity maxV

ج

قائمة المحتويات

الصفحة الموضوع التسلسل ب -أ الخالصة

2-1 الفصل االول / المقدمة 1 42-3 الفصل الثاني / أستعراض المراجع 2

Galleria mellonella (GWM) Greater wax mothعثة الشمع الكبرى 2-1

3

.Galleria mellonella Lتصنيف وحياتية عثة الشمع الكبرى 2-1-1

3-4 12-4 األهمية االقتصادية للحشرة وطرق مكافحتها 2-1-2

12-13 (Entomopathogenic Fungi, EPFالفطريات الممرضة للحشرات ) 2-2

Metarhizium 13-15الجنس 2-3

M. anisopliae 15-16الفطر 2-4

16 النظام االنزيمي في الفطريات 2-5

18-16 انزيم البروتييز 2-5-1

إنزيم الكايتنيز 2-5-2

19-20

إنزيم الاليبيز 2-5-3

20-21 Toxinesالسموم 4- 2-5

22-25

M.anisopliae 25الظروف المثلى إلنتاج إنزيم البروتييز من الفطر 2-6

26-25 تأثير المصدر الكاربوني 2-6-1

تأثير المصدر النايتروجيني وتركيزه 2-6-2

26-28

ن تأثير مدة الحض 2-6-3

28-29

تأثير درجة الحرارة 2-6-4

29-30

30 تأثير الرقم الهيدروجيني االبتدائي لوسط اإلنتاج 2-6-5

31 تأثير حجم اللقاح 2-6-6

تأثير سرعة الرج 2-6-7

31-32

33-32 تأثير األمالح المعدنية 2-6-8

تنقية إنزيم البروتييز 2-7

33-36

د

الصفحة الموضوع التسلسل

36 توصيف إنزيم البروتييز 2-8

Vmax )( والسرعة القصوى )Kmتعيين قيم ثابت ميكالس) 2-8-1

36-37

38 تخصص اإلنزيم حيال مادة التفاعل 2-8-2

39 -38 تأثير درجة الحرارة في ثبات األنزيم 2-8-3

40 - 39 تأثير الرقم الهيدروجيني في فعالية األنزيم 2-8-4 41 -40 الهيدروجيني في ثبات اإلنزيم تأثير الرقم 2-8-5 تأثير بعض األيونات والمواد الكيميائية في فعالية األنزيم 2-8-6

41-42

72-43 المـواد و طـرائق العمـل 3 المواد واألجهزة المستخدمة 3-1

43

43 المواد الكيميائية المستخدمة والشركات المصنعة لها 3-1-1

44 دمة و الشركات المصنعة لهااألجهزة المستخ 3-1-2

45 طرائق العمل 3-2

في ادوار حشرة دودة الشمع الكبرى M. anisopliaeالتأثير الحيوي للفطر 3-2-1

G. mellonella

45

G. mellonella ( L. ) إعداد مستعمرة دودة الشمع الكبرى 3-2-1-1

45

45 العزلة الفطرية المستعملة في الدراسة 3-2-1-2

M. anisopliaeللفطر البوغيتحضير المعلق 3-2-1-3

46

M. anisopliae تحضير راشح المزرعة الخام للفطر 3-2-1-4

G. mellonellaادوار حياة دودة الشمع الكبرى

46

Bioassay 47االختبار الحيوي 3-2-1-5

A عثةادوار حياة في مختلف M. anisopliaeلفطر البوغي لمعلق للاالختبار الحيوي

G. mellonellaالشمع الكبرى

47

االختبار الحيوي في البيوض 1

47

االختبار الحيوي في األطوار اليرقية الثالثة 2

47

47 االختبار الحيوي في دور العذراء 3

االختبار الحيوي في البالغات 4

48

ه

الصفحة الموضوع التسلسل

B ادوار في مختلف M. anisopliaeلفطر لراشح المزرعة الخام لالحيوي االختبار

G. mellonellaالشمع الكبرى عثةحياة

48

في البيوض M. anisopliae الخام للفطر راشح المزرعةتاثير 1

48

في األطوار اليرقية الثالثة M. anisopliae الخام للفطر راشح المزرعةتاثير 2

48

في دور العذراء M. anisopliae الخام للفطر ير نواتج األيض الثانويةتاث 3

48

الشمع عثة في بالغات M. anisopliaeتأثير نواتج األيض الثانوية الخام للفطر 4

49

M. anisopliae 49 التحري عن عوامل الضراوة للفطر 3-2-2 Seed Calture 49تحضير اللقاح )البذرة ( 3-2-3

49 ةلمعاألوساط اإلنتاجية المست 3-2-4

3-2-5 M. anisopliaeالتحري عن األنزيمات ومضادات األحياء المجهرية المنتجة من الفطر

50

التحري عن انزيم البروتييز 1- 3-2-5

50-53

52 تقدير البروتين 2- 3-2-5

56-53 تقدير فعالية انزيم الكايتنيز 3- 3-2-5

57-56 انزيم الاليبيز فعالية تقدير 4- 3-2-5

M.anisopliaeمن الفطر الحيوية المنتجةمضادات الالتحري عن انتاج 5- 3-2-5

57-58

M.anisopliae تحديد الظروف المثلى إلنتاج إنزيم البروتييز من الفطر 3-2-6

59

المصدر الكاربوني وتركيزه 3-2-6-1

59-61

لنيتروجيني و تركيزه تأثير نوع المصدر ا 3-2-6-2

26 26 تأثير درجة الحرارة 3-2-6-3

26 تأثير سرعة الرج 3-2-6-4 26 تأثير حجم اللقاح 3-2-6-5

26 تأثير الرقم الهيدروجيني االبتدائي 3-2-6-6

63 تأثير مدة الحضن 3-2-6-7

تأثير نوع األمالح المعدنية وتركيزها 3-2-6-8

63

3-2-7

M.anisopliae البروتييز المنتج من الفطرتنقية إنزيم

63-66

و

الصفحة الموضوع التسلسل توصيف إنزيم البروتييز 3-2-8

66

66 لإلنزيم تقدير الثوابت الحركية 3-2-8-1

67 إلنزيم حيال مادة التفاعلتخصص ا 3-2-8-2

تحديد الرقم الهيدروجيني األمثل لفعالية إنزيم البروتييز 3-2-8-3

68

70-68 تحديد الرقم الهيدروجيني لثبات إنزيم البروتييز 3-2-8-4

70 تقدير الثبات الحراري لإلنزيم 3-2-8-5 72-70 تأثير بعض األيونات المعدنية والمواد الكيميائية في فعالية اإلنزيم 3-2-8-6

72 التحليل اإلحصائي 3-2-9

137-73 النتائج والمناقشة 4

في مختلف M. anisopliaeالفطر مزرعة وراشحالبوغي معلق للاالختبار الحيوي 1- 4

Galleria mellonellaادوار حياة عثة الشمع الكبرى

73

االختبار الحيوي في البيوض 4-1-1

73

75 االختبار الحيوي لألطوار اليرقية الثالثة 4-1-2

دور العذراء االختبار الحيوي في 4-1-3

82

االختبار الحيوي في البالغات 4-1-4

85

.Mالتحري عن األنزيمات ومضادات األحياء المجهرية المنتجة من الفطر 4-2

anisopliae

89

M.anisopliaeتحديد الظروف المثلى النتاج انزيم البروتييز من الفطر 4-3

95

ي تأثير تركيز المصدر الكاربون 1

95

97 تأثير نوع المصدر النيتروجيني و تركيزه 2 101 تأثير مدة الحضن 3 104 تأثير درجة الحرارة 4 106 تأثير الرقم الهيدروجيني اإلبتدائي 5

109 تأثير حجم اللقاح 6

111 تأثير سرعة الرج 7

ز

قائمة اجلداول

الصفحة نوانـالع رقم الجدول

G. mellonella 74 في بيوض عثة الشمع الكبرى M. anisopliaeلفطر ل المعلق البوغيتأثير 1

في بيوض عثة الشمع M. anisopliaeالخام للفطر راشح المزرعةمختلفة من تراكيزتأثير 2 G. mellonella 74الكبرى

3 عثة الشمع الكبرىلاالطوار اليرقية الثالث في M. anisopliae لفطر ل المعلق البوغيتأثير

G. mellonella 77

الصفحة الموضوع التسلسل 113 تأثير نوع األمالح المعدنية و تركيزها 8

116 التنقية الجزئية إلنزيم البروتييز 4-4

118 الترسيب بالكحول األثيلي 1

120 كروماتوغرافيا التبادل األيوني )طريقة الوجبة ( 2

122 الترشيح الهالمي 3

124 توصيف إنزيم البروتييز 4-5

124 ( [maxV( و السرعة القصوى )mKالثوابت الحركية لإلنزيم ] ثابت ميكالس ) 1 125 تخصص اإلنزيم حيال مواد تفاعل مختلفة 2 128 الثبات الحراري لإلنزيم 3 130 الرقم الهيدروجيني األمثل لفعالية اإلنزيم 4 132 الرقم الهيدروجيني لثبات اإلنزيم 5 134 تأثير بعض أيونات المعادن و المواد الكيمائية في فعالية اإلنزيم 6

138 اتاالستنتاجات والتوصي

179 -139 المصادر

A-B الخالصة باللغة االنكليزية

ح

الصفحة العـنوان رقم الجدول

4 عثة في االطوار اليرقية الثالث ل M. anisopliaeالخام للفطر راشح المزرعةتأثير تراكيز مختلفة من


79

G. mellonella 83 عثة الشمع الكبرىل في دور العذراء M. anisopliae المعلق البوغي للفطرتأثير 5

6 .Gعثة الشمع الكبرىل في دور العذراءالخام تراكيز مختلفة من راشح المزرعةتأثير

mellonella

83

G. mellonella 86لعثة الشمع الكبرى بالغاتفي دور ال المعلق البوغي للفطرتأثير 7

G. mellonella 86 عثة الشمع الكبرىبالغات في الخام راشح المزرعة مختلفة من تراكيزتأثير 8

M.anisopliae 93التحري عن االنزيمات في الفطر 9

M.anisopliae 95ي في الفطر التحري عن المضاد الحيو 10

M. anisopliae 119خطوات تنقية إنزيم البروتييز من الفطر 11

12 حيال مواد M. anisopliae إلنزيم البروتييز المنقى من الفطروالفعالية النسبية الثوابت الحركية تفاعل مختلفة

128

13 عالية إنزيم البروتييز المنقى من الفطر تأثير بعض األيونات المعدنية و المواد الكيميائية في ف

M. anasopliae

135

قائمة املخططات الصفحة العنوان رقم المخطط

M. anisopliae 117تنقية إنزيم البروتييز من الفطر 1

ط

قائمة األشكال

الصفحة العنوان رقم الشكل

53 المنحنى القياسي للبروتين بطريقة برادفورد 1

55 (pNP)منحنى القياسي للبارانيتروفينول ال 2

3 المنحنى القياسي لتقدير الكلوكوز )السكريات المختزلة( بطريقة

(3,5 Dinitro salicylic acid,DNSA).

61

M. anisopliaeلفطر البوغي للق علمل الثالثاليرقية األطوار استعداد 4

77

M. anisopliaeللفطر لتراكيز راشح المزرعة داد االطوار اليرقية الثالثة استع 5

79

6 لفطترالبتوغي ل معلتقالتراكيتز ل G. mellonellaعثتة الشتمع الكبترى ذكتور وانتاث استتعداد

M. anisopliae

86

7 المزرعة راشح تراكيز ل G. mellonella عثة الشمع الكبرىذكور واناث استعداد

M. anisopliae لفطرالخام ل

87

M. anisopliae 97تأثير تركيز المصدر الكاربوني في إنتاج إنزيم البروتييز من الفطر 8

anisopliae .M 98تأثير نوع المصدر النيتروجيني في إنتاج إنزيم البروتييز من الفطر 9

M.anisopliae 99فطرتأثير تركيز الجيالتين في إنتاج إنزيم البروتييز من ال 10

M.anisopliae 102الفطرتأثير مدة الحضن في إنتاج إنزيم البروتييز من 11

M. anisopliae 105 تأثير درجة الحرارة في إنتاج إنزيم البروتييز من الفطر 12

M. anisopliae 107 الفطر تأثير الرقم الهيدروجيني االبتدائي في إنتاج إنزيم البروتييز من 13

M. anisopliae 111 تأثير حجم اللقاح في إنتاج إنزيم البروتييز من الفطر 14

M. anisopliae 112تأثير سرعة الرج في إنتاج إنزيم البروتييز من الفطر 15

16 M.anisopliaeتأثير نوع األمالح المعدنية في إنتاج إنزيم البروتييز من الفطر

114

17 M. Anisopliaeديوم في إنتاج إنزيم البروتييز من الفطرتأثير تركيز كلوريد الصو

115

ي

الصفحة العنوان رقم الشكل

18

M.anisopliaeمن الفطر كروماتوغرافيا الترشيح الهالمي لتنقية إنزيم البروتييز ( سم والذي تمت موازنته 80×1.4بأبعاد ) Sephadex G -150بإستخدام عمود

مللتر 20( بسرعة جريان 8.0مولر ، برقم هيدروجيني 0.02بمحلول منظم الترس ) مل / جزء 4دقيقة وبواقع /

123

19 إلنزيم البروتييز المنقى جزئيا من الفطر maxVو mKبورك لتقدير -منحنى الينويفر

M.anisopliae 124 ين مادة تفاعل. بإستخدام الكازائ

20 إلنزيم البروتييز المنقى جزئيا maxVو mKبورك لتقدير -رمنحنى الينويف

مادة تفاعل.ين الجيالتباستخدام M. anisopliae من الفطر 126

21 إلنزيم البروتييز المنقى جزئيا من maxVو mKبورك لتقدير -منحنى الينويفر

126 باستخدام البومين المصل البقري مادة تفاعل M. anisopliaeالفطر

M. anisopliae الثبات الحراري إلنزيم البروتييز المنقى جزئيا من الفطر 22

129

23 .Mالرقم الهيدروجيني األمثل لفعالية إنزيم البروتييز المنقى جزئيا من الفطر

anisopliae 131

24 الرقم الهيدروجيني األمثل لثبات إنزيم البروتييز المنقى جزئيا من الفطر

M. anisopliae

132

قائمة الصور

الصفحة العنوان رقم الصورة G. mellonella 80يرقات عثة الشمع الكبرى في M. anisopliae الفطر تأثير معامالت 1

G. mellonella 84عثة الشمع الكبرى عذارى في M. anisopliae الفطر تأثير معامالت 2

Introduction املقدمة الفصل األول

١

املقدمة

يصاب النحل داخل الخاليا وخارجها بكثير من اآلفات الحشرية وتعد عثة الشمع Pyralidaeذات األنتشار العالمي والعائدة لعائلة Galleria mellonella ( L. ) الكــــبرى

من اآلفات االقتصادية الدائمة والمهمة التي تهاجم أقراص الشمع وحبوب اللقاح داخل خاليا نحل العسل وفي المخزن ، ويزداد خطر اإلصابة بعثة الشمع في نهاية موسم العسل وخزن إطارات

نتيجة الشمع استعدادا للموسم المقبل ويتكبد النحالون في جميع إنحاء العالم خسائر اقتصادية كبيرة لمهاجمة عثة الشمع لإلطارات المخزونة ومستعمرات النحل الضعيفة

(Warhust and Goebel, 1995) .

ان المكافحة الكيميائية من اكثر الطرائق استعماال في مكافحة هذه اآلفة ويتطلب ذلك عناية لئال تصل هذه المبيدات ا لى العسل ، ومن هذه المبيدات بروميد المثيل وفوسفات وترتيبا خاصا

) . Goodman etal., 1990األلمنيوم وسيانيد الكالسيوم (

وغيرها من الحشرات نحل العسل فيتأثيراتها السمية كمبيدات الكيميائية ال إلى مساوئنظرا و ) نوع من اآلفات الحشرية ضد ٦٠٠صفة المقاومة وألكثر من (المفيدة فضال عن ظهور

ل ـات أو على األقــذه اآلفــة هــلمكافح ة ب ـل المناسائد ـاد البـيجفأنه إمختلف المبيدات الكيميائية بوسائل أخرى تؤدي إلى الترشيد من استهالك المبيدات ة ــة الكيميائيــل المكافحـم وسائـدع

.) Ambethgar ,2009 ; Hasan et al. ,2013( الكيميائية وتقليل تأثيراتها السلبية

من اكثر عوامل الجذب لدى الباحثين للسعي في يةحيو المقاومة العوامل لذا أصبحت

ن الفطريات الممرضة للحشرات أ ال ، ا لآلفات ها في مجال السيطرة المتكاملة الم عواست هاتطوير

)Entomopathogenic fungi (EPF عوامل لعدة اسباب منها سهولة هذه التعد من اهم

روفة منها اطالقها الى الطبيعة ، وسهولة فرملتها ، والعدد الكبير من السالالت الممرضة المع

عليها ة الوراثيةتقنيات الهندس فضال عن سهولة تطبيق

) (Khan etal.,2012a .

ة في لمعمن اهم الفطريات المست Ascomycota من شعبة M. anisopliaeيعد الفطر

كونه من الفطريات اآلمنة غير الملوثة للبيئة ويمكن استعماله كبديل للمبيدات يةحيوالمقاومة ال

نوع ٢٠٠وله القدرة على اصابة عدد واسع من االفات الحشرية تقدر بـ ، الكيميائية بكفاءة تعود ا

. ) Samuels et al., 1989( فضال عن اصابته للقراد والحلم عائلة حشرية ٥٠الى

Introduction املقدمة الفصل األول

٢

هاختراقوها ما جسأجدار لسطح الخارجي لل ابواغهعن طريق مالمسة مضائفه الفطر هاجمي

مثل البروتييز والكايتنيز والاليبيز فضال عن افرازه نزيمات التحلل المائي أل هافراز من خالل

لسموم الدستروكسين والفيردوكسين داخل اجسام مضائفه محدثا القتل فيها

)Charnley , 2003( .

كأحد M. anisopliaeنظرا لعدم وجود دراسات سابقة في العراق لبيان كفاءة الفطر و

الوسائل الحيوية اآلمنة و البديلة عن المبيدات الكيميائية في مكافحة ادوار حياة عثة الشمع الكبرى

، وكذلك لعدم وجود دراسة سابقة في توصيف عوامل الضراوة لهذا الفطر وعزلها وتنقيتها فقد

- :تم وألول مرة في القطر اجراء هذه الدراسة وتضمنت المحاور التالية

تبار الحيوي لتراكيز مختلفة من المعلق البوغي للفطر في ادوار حياة الحشرة (بيضة األخ - ١ .و يرقة و عذراء و بالغة )

. في ادوار حياة الحشرة الفطراألختبار الحيوي لتراكيز مختلفة من راشح مزرعة - ٢

التحري عن عوامل الضراوة وتحديد العامل األقوى (األكفأ ) منها ، فضال عن التحري - ٣

عن بعض مضادات األحياء المجهرية .

عامل الضراوة األقوى (األكفأ ) فضال عن تنقيته بالطرائق إلنتاجتحديد الظروف المثلى -٤

. المتاحة وتوصيفه

الفصل الثاني

Literatures review استعراض املراجع الفصل الثاني

3

استعراض المراجع

Galleria mellonella Greater wax moth (GWM)عثة الشمع الكبرى 2-1

.Galleria mellonella Lتصنيف وحياتية عثة الشمع الكبرى -2-1-1

المجموعة التصنيفية ضمن Greater wax moth (GWM)تصنف عثة الشمع الكبرى

Microlepidoptera 20يكون طول أجنحتها اقل من التي تضم عوائل العث الصغير التي

( ملم في كل من الذكور 16 -13و 14 -10) عثة الشمع بالغات أجنحة ، ويبلغ طول ملم

(Shimanuki ,1981; Powell and Opler , 2009واإلناث على التوالي )

( الى السلم التصنيفي لهذه العثة وهو كما Powell and Opler , 2009وقد اشار كل من )

يلي :

Kingdom :- Animalia

Phylum :- Arthropoda

Class:- Insecta

Order :- Lepidoptera

Notaxon : - Moths

Superfamily : - Pyraloidea

(Family : Pyrallidae (Pyrallid Moths

Subfamily : - Galleriinae

Trib:- Galleriini

Genus: - Galleria

Species : mellonella

ملم ذا لون أبيي محمير بشيكل افعيات تضيم كيل 0.5تضع األنثى بيضا زيتوني الشكل طوله

بيضيية تفرزهييا مييع بعضييها الييبع لكييي تلتصييل باييوو و بييات علييى السيي و 150-50افعيية

الموضوعة عليها وتاوم األنثى بوضع البي فيي األاااييد والفجيوات بهيدع منيع وليول النحيل

ييوم ، يفاي 15بيضية اي ل 1800 -400، يصل عدا البي لألنثى الواحيدو مين إليه وتدميره

م وتزااا ميدو الحضين عنيدما تيندف ارجية 27 -24أيام عند ارجة الحرارو 8-5البي ا ل

م 16 -10يييييييييييييييوم عنييييييييييييييد ارجيييييييييييييية الحييييييييييييييرارو 35الحييييييييييييييرارو لتصييييييييييييييل إلييييييييييييييى

(Shimanuki,1981; Charriere and Imdorf, 1999) .


4

بعد فا البي تبحث اليرقة الفاقسة عن الشمع لغرض التغذية وبناء األنفاق الحريرية ، ان

غذاء اليرقة يعتمد بشكل رئيسي على الشوائب الموجواو في الشمع مثل شرانل النحل وغبار

أو على األقراص التي لم يتم ال لع إذ تفضل الشمع الداكن وال يمكنها ان تعيش على الشمع الناي

تكون ارجة الحرارو ااال األنفاق التي تعملها اليرقات أعلى ، استعمالها في تربية حضنة النحل

من ارجة الحرارو الدارجية وذلك نتيجة للدعء االيضي وبالتالي ستزااا سرعة نموها

. ( ; 1994Morse , 1978البنبي، )

أشهر وذلك اعتمااا على ارجات الحرارو وتوفر 6يوم الى 28ي تستغرق ان مدو الت ور اليرق

م ، ويتوقف النمو عند ارجة الحرارو ( 35 -29الغذاء اذ ان ارجة الحرارو المثالية للنمو تبلغ )

ملم 30ملم بعد أسبوع و 2.5ملم ويصل إلى 1م ، ان طول اليرقة الفاقسة حديثا يبلغ 5األقل من

( Charriere and Imdorf,1999 , 1997نموها )انبش و عوشان بعد إكمال

يتضاعف وزن اليرقات يوميا ا ل األيام العشر األولى من حياتها وفي اليوم الثامن عشر

لتاوم بحفر اشب هذه اإلطارات والتاسع عشر تتحرك اليرقات إلى اإلطارات الدارجية الدشبية

أيام وقد 8-7للداول في اور العذراء ، اذ تستمر فترو الدور العذريزل شراناها استعدااا غوت

. (Shimanuki, 1981; Graham , 2003تصل إلى أربعة أشهر في فصل الشتاء )

سم وعند نشر الجناحين يكون 1.9يتميز لون البالغات عموما بين اللون الرمااي والبني وطولها

ر انحف وأقل وزنا من اإلناث ويمكن تمييز الذكور ( سم. تكون الذكو3.1-2.5طولها ما بين )

عن اإلناث من ا ل النظر للحافة الدارجية للجنا األمامي إذ تكون الحافة أكثر تاعرا في

ور تكون ذات شكل اائري الذكور مما في اإلناث ، فض عن ان الجهة األمامية للرأس عند الذك

وتتباين بالغات عثة الشمع كثيرا في اللون ة رأسها ،بينما تتميز اإلناث بوجوا ا م في مادم

والحجم و يعوا ذلك الات ع الغذاء أ ناء فترو اليرقة فض عن اات ع طول فترو الت ور، اذ

أسابيع واإلناث تبدأ بوضع البي بعد التزاوج 3 يصل عمر البالغات إلى

(Shimanuki , 1981; Tew,2001. )

ق مكافحتها ائاألهمية االقتصادية للحشرة وطر -2-1-2

في الصناعات الصيدالنية وفي يستعمليعد الشمع من أكثر منتجات نحل العسل فائدو إذ

مجال طب األسنان ومواا التجميل ، يكون الشمع عرضة للكثير من اآلفات وذلك لكونه يحتوي

( وتعد عثة الشمع الكبرى من Ebadi,1975حبوب اللاا والعسل ) وعلى العديد من المغذيات

أهم اآلفات التي تهاجم اإلطارات الشمعية في ا يا النحل أو في المدازن وتؤاي إلى ه ك أعداا


5

كبيرو من طوائف النحل سنويا في العديد من أماكن تربيته ، وتسبب اسارو تادر بم يين

( Burges , 1978; Caron , 1992 ; Coggshall, 1995) الدوالرات سنويا

تاوم بحفر األنفاق في الجدار الفالل بين طباتي العيون السداسية واليرقات على الشمع ىغذتت

االة إذا كانت مصنوعة من الشمع الاديم ، فيتلف بي النحل وتموت يرقاته عند تدريب

العيون السداسية ، كما تسبب الديوط الحريرية التي تنسجها يرقات العثة إعاقة لحركة شغاالت

بين هذه الديوط من بي ويرقات للتدلص منها من جهة النحل من جهة وعدم الولول إلى ما

( ، كما ان كتل البراز التي تدلفها هذه اليرقات تسبب ا را على الية 2005أارى )رمال،

النحل بسبب احتوائها للعديد من المسببات المرضية للنحل وأن أغلب الد يا المصابة بهذه العثة

الحاوي على المسبب المرضي البكتيري يصاحبها تعفن الحضنة بسبب براز الحشرو

Paenibacillus larvae ل ، وتعد هذه البكتريا المسبب ألهم وأا ر مرض يصيب ذرية نح

إذ American Foul Brood (AFB )ة األمريكيحضنالعسل والمعروع باسم تعفن ال

تست يع ان تعيش مغ او بسبعة أغ ية و أبواغا تست يع هذه البكتريا الموجبة لصبغة كرام ان تنتج

; Bakhiet and Stahly, 1985; Charriere and Imdorf ,1999)سنة 50-30لمدو

Ashiralieva and Genersch,2006 ; Genersch et al., 2006) .

نتيجة لهذه األضرار االقتصااية التي تسببها عثة الشمع لذا وجب مكافحتها وإيجاا الوسائل

.( Burges, 1978)الناجعة في السي رو عليها

الطرائق الكيميائية -1

طرياة استعملتل الكيميائية في المكافحة إذ ائال ر استعمالاتجهت األنظار في باائ األمر إلى

ساعات في مدزن 5ولمدو %97بتركيز (CO2)التبدير بالمواا الكيميائية ومنها استعمال غاز

ولجميع أاوار الحشرو %100محكم الغلل سبب نسبة قتل وللت إلى

(Cantwell et al., 1972.)

ملغم/ لتر ماء لتعايم إطارات الدلية 18بتركيز Ethylene oxide (ETO)أما استعمال مااو

ة الشمع عثدزن فاد أات بالنهاية إلى قتل ( في المAFBاألمريكي )المصابة بتعفن الحضنة

( . Cantwell et al.,1975في مدو أقل من نصف ساعة ) %100الكبرى بنسبة تصل إلى

%100الكبرى قد أع ت نسب قتل وللت إلى الشمع عثةكما ان استعمال الكبريت في مكافحة

كغم 2المدزونة المصابة بهذه اآلفة وذلك بحرق لجميع أاوار الحشرو عدا البي على اإلطارات


6

يوم 15- 10ذه العملية بعد مرور م. كما يجب ان تعاا ه 3×5× 2 من الكبريت في مدزن أبعااه

.((Szabo and Heikel,1987اتل اليرقات الفاقسة من البي الموضوع ل

مواا كيميائية مبدرو أارى في المكافحة مثل لمتعتس

(Phostoxin) Aluminum phosphide ومااو(Paradichlorobenzene (PDCB التي

تعمل على قتل جميع أاوار الحشرو عدا البي الذي بشكل واسع في مااومة هذه اآلفة إذ لمستعت

ال يتأ ر بها لذلك يجب استعمال هذه المااو ألكثر من مرو وذلك يعني تراكم المتبايات الكيميائية

لمتبايات هذه اونتيجة لتراكم ، اإلطارات المعاملة بهذه المااو والشمع فيفي العسل السامة

الشمع الكبرى ضد المبيدات الحشريةت ور المااومة لدى عثة فض عن

(Goodman et al., 1990; Colter, 1994لذلك اتجهت األنظار إلى است )ل ائال ر المع

البديلة والناجحة كالمكافحة الفيزيائية والحيوية.

الطرائق الفيزيائية -2

ل الفيزيائية المستعملة هي التبريد الصناعي وذلك بدزن اإلطارات على ارجة حرارو ائمن ال ر

م لمدو ساعتين 15-م ولمدو ث ساعات أو الدزن على ارجة حرارو 7-

(Cantwell and Smith ,1970 .)

( م لعدو 17-0ن )ان ازن اإلطارات على ارجة حرارو ما بي Burges ((1978أكد

ساعات ولبضعة أيام سوع ياتل جميع أاوار الحشرو وبدون إحداث أي ضرر باإلطارات

المدزونة، وان تحديد ارجة الحرارو الااتلة تعتمد على كمية اإلطارات المدزونة وحجم المدزن.

لى للدزن كما ان ارجات الحرارو المرتفعة تعد طرياة فعالة أارى ضد هذه اآلفة فال رياة المث

اقياة كافية لت هير اإلطارات وال يمكن استعمال 80م ولمدو 45هي على ارجة حرارو

(.Warhust and Goebel,1995) ب شمع اإلطاراتيرجات الحرارية العالية لكونها تذالد

ارجة حرارو أعلى استعمالانه ال يمكن Flottum و Morse (1997وقد بين كل من )

اقياة فاط 40م ولمدو 49في ازن إطارات الشمع إذ ان تعري اإلطارات لدرجة م 49من

تكون كافية لاتل جميع أاوار عثة الشمع الكبرى.

األشعة المؤينة من استعمالة اذ يعد مستعملليست ارجة الحرارو هي ال رياة الفيزيائية الوحيدو ال

.ل الناجحة والفعالة في الاضاء على اآلفة ائال ر


7

(ان استعمال عدو جرعات من أشعة گاما تراوحت من1983) Merkel و Flint إذ بين

كيلو غري قد أ رت على نسبة فا البي والسلوك التنافسي التزاوجي للذكور المشععة 0-40

لعثة الشمع الكبرى.

0.15رى لجرعة الكب الشمع عثة( ان تعري ال ور اليرقي السابع ل1998وقد أكد التميمي )

ساعة 24، كما ان تعري البالغات )إنا ا و ذكورا( بعمر %100كيلوغري قد أع ى نسبة قتل

( كيلوغري قد أات إلى العام الموروث فيها عند تزاوجها مع 0.20و 0.15و 0.10للجرع )

ث سليمة( ( )ذكور مشععة : ذكور سليمة: إنا1:1:5بالغات غير مشععة ، كما ان نسبة اإلط ق )

كيلوغري إذ أات هذه 0.20كانت أفضل النسب للتناف التزاوجي للذكور المشععة بجرعة

. %20الجرعة إلى اف نسبة إلابة اإلطارات الشمعية المدزونة إلى

Male Sterile Technique ( تانية الذكور العايمة2010و جماعته ) Jafari استعملكما

(MST) گامــا إذ وجــد ان تعري العذارى الذكور لعثة الشمع إلى جرعة أشعـــة استعمالب

( )ذكور مشععة: ذكور سليمة: إناث سليمة( قد أاى إلى 1:1:4غراي وبنسبة إط ق ) 350

ف نسب تحول اليرقات إلى عذارى. وكذلك ا اف نسب فا بي عثة الشمع الكبرى

المستخلصات النباتية -3

في مكافحة عثة الشمع ل الكيميائية والفيزيائيةائال راستعمال لم ياتصر الباحثون على

المستدلصات النباتية كواحدو من البدائل ال بيعية اآلمنة عن استعمالالكبرى بل لجئوا إلى

المبيدات الكيميائية .

اآلس ر البترولي لنباتثي( ان مستدلص األ1991الحظ الجوراني )

Myrtus communis(L.) (Myrtales : Myrtaceae) المزروع والبري قد أاى إلى تاليل

الكبرى عند معاملة البي س حيا وبتراكيز مدتلفة من مستدلصي الشمع عثةنسبة فا بي

النباتين ، وبينت نتائج معاملة غذاء يرقات ال ور األول والثالث تثبيط النمو اليرقي وزيااو الفترو

التي تت لبها اليرقات إلكمال نموها اليرقي وان يرقات ال ور األول أكثر حساسية من يرقات

ع قة طراية بين تراكيز ك المستدلصين ونسبة ه ك اليرقات من ال ور الثالث ، وهناك

ال ور اليرقي الدام ولم ي حظ أي تأ ير على مدو اور العذراء في حين لوحظ تأ ير ك

المستدلصين على معدل طول عمر البالغة وعلى انتاجيتها من البي . كما ان هناك ع قة

الموضوع. عكسية بين التراكيز المستعملة والبي


8

ني )الزيتي( لنبات اليوكالبتوس اان المستدلص الهكس (2001عبد الجبار ) كما وجد

Eucalyptus camaldulensis (Dehnh) أاى إلى اف نسبة فا بي عثة الشمع

( % عند معاملة البي س حيا ماارنة بمعاملة السي رو التي كانت نسبة 7-1.33) الكبرى إلى

، أما معاملة يرقات ال ور الدام فلم تتأ ر نسبة باائها بعد % 91.66فا البي بها

%10معاملتها بالمستدلص الكحولي لنبات اليوكالبتوس بينما أات معاملة هذه اليرقات بتركيز

نسبة بااء يرقات معاملة تفي حين كان %50من المستدلص الزيتي إلى اف نسبة باائها إلى

. %100السي رو

( ان المستدلص الكحولي ألوراق و مار نبات اليوكالبتوس 2004ين لبر وآارون )في حين ب

عمر (% عند معاملة البي س حيا ب8-7أاى إلى اف نسبة فا بي عثة الشمع الكبرى إلى)

ماارنة بمعاملة السي رو التي كانت نسبة فا البي بها %10و 5و 1ساعة بالتراكيز 24

ات ال ور الثالث فاد لوحظ وجوا اندفاض معنوي في نسبة بااء أما معاملة يرق 91.66%

ولنف التراكيز أع ه في حين كانت نسبة بااء يرقات معاملة % 66.66-60اليرقات إذ بلغت

. %96.66السي رو

والماء البارا لثمار نبات ( في نتائجها إلى ان مستدلص الكحول األ يلي2013الوائلي ) أشار

ماارنة بمستدلص يرقات وعذارى عثة الشمع الكبرى وفي تأ يره على بي قد تفوق بحالسبح

. كما ان المستدلص الكحولي األ يلي والماء البارا للثمار واألوراق قد أ ر بحأوراق نبات السبح

سلبا في إنتاجية البالغات ، كما بينت ان نتائج تحديد األاوار األكثر حساسية لمستدلص الكحول

كانت تشير إلى ان 50LCماء البارا لثمار وأوراق نبات السبحبح من ا ل حساب قيم األ يلي وال

ساعة وال ور اليرقي األول هما أكثر األاوار تحسسا تجاه المستدلصات ماارنة 24البي بعمر

وار الحياو األارى للحشرو.بكل أا

منظمات النمو الحشرية -4

منظمات النمو الحشرية استعمالالنباتية فاد فضل بع الباحثين وبعيدا عن المستدلصات

(Insect growth Regulators (IGRs أو مثب ات الت ور الحشريةInsect

Developmental Inhibitors(IDIs) تين ياومنها مثبط تكوين الكMatcho50EC في

و 250 ة تراكيز هي ( 2004) وجماعته Unsal استعملمكافحة عثة الشمع الكبرى فاد

الذي يعوا لنف Diflubenzuronجزء بالمليون من مثبط تكوين الكايتين 1000و 500

الشمع عثةفي الغذاء المادم لل ور الدام ل Matcho5oEcمجموعة مثبط تكوين الكايتين


9

ة تمزقه ( مسببCuticleالكبرى وقد بينت النتائج ان جميع التراكيز أ رت على الجليد المترسب )

يوم من المعاملة ماارنة بمعاملة السي رو . 3.5بعد %50وقلة سمكه بمادار

قد أ ر معنويا في نسب C50E0Matchتين ي( فاد أشار إلى ان مثبط تكوين الكا2007أما تاي )

فا بي عثة الشمع الكبرى لتصل النسبة المئوية للفا إلى لفر % ، كما كان تأ ير هذا

بعد %100المثبط على األطوار اليرقية الث ث األولى تأ يرا إباايا إذ كانت النسبة المئوية للاتل

رقية المتأارو )من الرابع وحتى مرور يوم واحد وقبل حدوث عملية االنس خ ، أما األطوار الي

السابع( ن حظ أنها أقل حساسية وان عملية الموت تحدث بعد عملية االنس خ مما يدل على ان

للمثبط فع تثبي يا ماارنة بفعله اإلبااي تجاه األطوار الث ث األولى ، كما أ ر المثبط على

ازغة من العذارى المتباية كان نصفها من العذارى وان البالغات الب %50العذارى إذ سبب قتل

مشوها، بينما وضعت النسبة األارى من البالغات أعدااا قليلة من البي لم يفا اال نسبة قليلة

منه واليرقات الفاقسة ماتت جميعها ولم تست ع ان تكمل اورو حياتها نتيجة تأ رها بالمثبط الذي

ة من العذارى المعاملة . كما ا بت المثبط فعاليته في انتال إليها عن طريل مباي البالغات الناتج

ملوث بالمثبط قبل ان تضع %10الاضاء على بالغات الحشرو المتغذية على محلول سكري

بيضها.

الطرائق الحيوية -5

ل الت بياية ائية في مكافحة عثة الشمع الكبرى فتعد من ال رائحيل األائأما بالنسبة إلى ال ر

من السلبيات المسجلة للمواا العسل ومنتجاته والشمع المدزون للحفاظ على نحل المهمة وذلك

الكيميائية المستعملة في مكافحة الحشرو والمتمثلة بالتسمم والتلوث .

( وهو من الفيروساتGmDNVتعد يرقات عثة الشمع الكبرى من العوائل ال بيعية لفيروس )

يستعمل بنجا في المكافحة الحيوية ضد هذه اآلفة ( وهو Densonucleosis Virusالكثيفة )

(Gross et al., 1990 ; Tal and Attathom, 1993 .)

( لبكترياHD209رية )يالس لة البكت Cantwell and Lehnert (1979)استعمل كل من

Bacillus thuringiensis(Berliner) في حماية الشمع المدزون وقد حص على نتائج

( ملغم 400و 200ناجحة وجيدو في مجال مكافحة هذه اآلفة ، أما حاليا فاد ااتبرا جرعتين )

-96بشكل مسحوق ممزوج مع الماء )محلول معلل( وقد سببت الجرعة العالية نسبة قتل بلغت

مع تلف طفيف في اإلطارات % 99-89ين أما الجرعة الواطئة فاد أع ت نسبة قتل ما ب 100%


10

الشمعية لك الجرعتين بالماارنة مع اإلطارات الشمعية غير المعاملة التي حصل فيها تلف كلي

نتيجة اإللابة الشديدو بعد ستة أسابيع من معاملة اإلطارات.

احدهما B.thurinigiensis( أاوار عثة الشمع الكبرى بمعاملتين للبكتريا 2007عامل تاي )

تجاري واآلار محلي وقد أ رتا معنويا على النسبة المئوية لفا البي . وقد تميز ال ور اليرقي

الثاني بأنه أكثر األطوار حساسية تجاه معاملتي البكتريا إذ كانت الفترو الزمنية لتحايل قتل

تال حساسيتها قصيرو جدا ماارنة باألطوار اليرقية األارى فيما الحظ ان اليرقات بدأت 100%

كلما تادم عمرها ، كما ان العذارى والبالغات الناتجة من معاملة يرقات ال ور السابع كانت أقل

كما ان نسبة ، لبالغات الناتجة من يرقات سليمةحجما وظهر عليها التشوه ماارنة بالعذارى وا

وان معدل %( 75 -50) بزوغ البالغات السليمة من العذارى المعاملة بالبكتريا اندفضت إلى

عدا البي الموضوع والنسبة المئوية للفا للجيلين األول والثاني كان أقل ماارنة بمعاملة

ملوث بالبكتريا قد تأ رت من %10الماارنة . والحظ ان البالغات التي تغذت على محلول سكري

انت مندفضة ماارنة ا ل وضع كمية أقل من البي للجيلين األول والثاني وان نسبة الفا ك

بمعاملة الماارنة .

قد قللت من عدا B.thuringiensis( ان معاملة اإلطارات الشمعية ببكتريا 2011بين كريم )

يرقة من 11.83سم وكان معدل عدا اليرقات الميتة 5.20نفل وبمعدل طول 2.5األنفاق إلى

( يرقة. 15مجموع )

يســمى الكبرى هو نوع من البروتوزوا عيوجد هناك مسبب مرضي آار لعثة الشم

Coelogregarina ephestiae يسبــب عدوى مميتــة لهــذه الحشــرو فــي أوربــا

(Raw, 1954. )

بإمكانها قتل يرقات Steinernematidaeكما ان هناك بع أنواع النيماتواا التابعة لعائلة

( Mracek etal., 1997م ) 7الشمع الكبرى على ارجة حرارو عثة

تأ ير كبير في الدور Steinernema carpocapsae( ان للنيماتواا 2011كما بين كريم )

.%42.02الكبرى إذ كانت النسبة المئوية لموت اليرقات الشمع عثةاليرقي ل

( ان 2002وجماعته ) Klingen بينوفي ااتيار سمية الف ريات على عثة الشمع الكبرى فاد

106×3.6والتي استعملت بتركيز .anisopliae M( للف ر ARSEF5520العزلة الف رية )

الكبرى أما عزلة الف ر الشمع عثةليرقات %100مل قد سببت نسبة قتل /بوغ


11

Tolypocladium cylindrosporum الكبرى بنسبة الشمع عثةفاد تسببت باتل يرقات

36% .

الكبرى المصابة به الشمع عثةوالمعزول من يرقات Nomuraea rileyiكما ان الف ر

% 56.07بشكل طبيعي قد أ ر على الدور اليرقي إذ كانت النسبة المئوية لاتل اليرقات هي

(. 2011 ،)كريم

و Beauveria bassiana لف رلعزلة 90( من بين 2012وجماعته ) Husseinأاتار

ث عزالت هي األكثر ضراوو لحشرو عثة الشمع الكبرى M. anisopliaeف ر لعزلة ل 15

وعزلة BbaAUMC3263و BbaAUMC3076هما B.bassiana، عزلتان للف ر

%100وقد أع ت جميعها نسبة قتل ManAUM3085هي M.anisopliaeلف ر ل

( 106×4.8و 105×5.86و 106×5.5الكبرى عند التراكيز ) الشمع عثةليرقات العمر الرابع ل

/ مل على التوالي. بوغ

يوجد لعثة الشمع الكبرى العديد من األعداء الحيوية من ال فيليات ومنها ال فيلي

Apanteles galleriae (Wilkinson) (Hymenoptera: Braconidae) وهو من

وعثة Galleria mellonella (L.)األعداء ال بيعية المتدصصة لحشرتي الشمع الكبرى

إذ وجد ان Achroia grisella(Fabricius) (Lepidoptera: pyralidae ) الشمع الصغرى

بينما كانت نسبة ت فله على % 64نسبة ت فله على ال ور اليرقي الدام للحشرو األولى كانت

(. Zacarin etal.,2004) % 63.5رقي الدام للحشرو الثانية ال ور الي

فهو يفضل في Bracon hebetor (say)(Hymenoptera: Braconidae)أما ال فيلي

الكبرى وان النسبة الجنسية لل فيلي كانت تميل إلنتاج الشمع عثةت فله ال ور اليرقي السابع ل

. %5± 60 ورطوبة نسبة م2± 26اإلناث المدصبة بكثرو عند ارجة حرارو

(Gunduz and Gulel,2005. )

فهو يفضل بي عثة الشمع الكبرى إذ يعمل على .Trichogramma sppبينما ال فيلي

التاليل من أعداا البي الفاق بشكل ملحوظ حتى عند اإللابة الشديدو بعثة

أما ) (Bollhalder,1999حين لم ي حظ أي ت فل له على باية أاوار الحشرو الشمع الكبرى في

ع الكبرى فهو يفضل األطوار اليرقية األايرو لعثة الشم Ichneumonidaeالمت فل من عائلة

( . 2007. )تاي ، المبكرو ة يرقيأكثر من األطوار ال


12

هناك بع أنواع المفترسات التي تهاجم عثة الشمع الكبرى مثل بع

ومنها Formicidaeوعائلة Hymenopteraأنواع النمل المفترس التابع لرتبة

الذي يعد كمفترس متدصص بافتراس Pheidole megacephala (Fabricius)المفترس

. ) Flottum, Morse and 1997 الكـــــبـرى ) الشمع عثةاــة لــاألطــوار ااال الشــرن

وفي جنوب الواليات المتحدو األمريكية يعمل النحالون على تعري الد يا الحاوية على

المعروع بالنمل Solenopsis invicta(Burenاإلطارات المصابة المدزونة إلى النمل )

لمدو يوم أو اكثر لغرض الاضاء على األطوار غير البالغة لعثة Red fire antالناري األحمر

(Graham,2003الشمع الكبرى حتى ااال الد يا الضعيفة.)

Xylocoris flavipes(Reuter) ( وألول مرو في العراق المفترس2007سجل تاي )

(Himeptera : Anthocoridae) إذ شوهـــدت بالغــــات وحوريات هذا المفترس تاوم

بافتراس جميع أاوار عثة الشمع الكبرى عدا البالغات ااال المدتبر ، إال انه كانت تفضل في

افتراسها البي واألطوار اليرقية األولى.

Entomopathogenic fungi (EPF)الفطريات الممرضة للحشرات 2-2

لكونها تحتل الف ريات الممرضة للحشرات مكانة االة في مجال المكافحة الجر ومية

بسبب مبيدات الكيميائيةلبدائل واعدو لوتعد فعالة في تنظيم المجتمعات الحشرية عوامل

في مضائفها الاتل هامضائفها وسهولة انتاجها بكميات كبيرو فض عن احدا ل عاليالتدصص ال

التي تكون فعالة المكافحة الجر وميةالوحيدو من عوامل تعد المجموعة لذا الم مسةعن طريل

غمدية األجنحة التابعة لرتبة الحشرات المالة للعصارو النباتية والحيوانية والحشراتضد

والتي لم يحدا الابتها لحد االن بأي من االمراض البكتيرية والفايروسية

(Roberts,1989 ; Charnley,2003;Shahid etal.,2012)

الف ريات لنف جن وغالبا ماتكون من 85نوع تعوا الى 750عدا انواعها بـ ويادر

Entomophthorales وف ريات Hyphomycetesالناقصة

. (Samson et al.1988; McCoy etal.,1988)

اآلفات الحشرية وفي مدتلفومن أهم هذه األنواع التي أمكن توظيفها بنجا للاضاء على

Verticillium leecanii , Baeuveria bassiana, Metarhizium)البيئية نظمة مدتلف األ

anisopliae , Ashersonia aleyrodis , Hirsutella thompsonii ,Paecilomyces

lilacinus ) (McCoy &Tigano-Milani ,1992;Zayed,2003; Ambethgar ,2009) .


13

نييوع ميين الف ريييات الممرضيية للحشييرات فييي لييناعة المبيييدات الحيوييية 25 عملاسييت

(Biopesticides )بشييييكل مستحضييييرات تجاريييية فييييي االسييييواق مثييييل ومتيييوفروLaginex و

Mycotrol و (McCoy and Tigano-Milani,1992; O-Naturalis

Khetan,2001; Scholte et al.,2004) .

مميزات ال جر ومية ببع المسببات المرضية الز الف ريات الممرضة للحشرات عن باقي تامت

عن طريل جدار اما اذ ان لها الادرو على ااتراق عوائلها -:مضائفالالى داولالآلية -1ي ه

الجسم من ا ل افرازها ل نزيمات المحللة كانزيم البروتييز وال يبييز والكايتينيز

(Charnley,2003 او عن طريل الاناو الهضمية ) و الفتح( ات التنفسيةTheunis,1997 )

(.Madelin,1963فض عن الجرو التي تصيب هذه المضائف )

و B. bassianaكما يمتاز بعضها بأن له مدى واسع من المضائف الحشرية مثل -2

M. anisopliae بمضيف معين والبع منها متدصص (Thungrabeab & Tongma

,2007)

الادرو على الابة المراحل العمرية للحشرو جميعها ابتداءا من اور البيضة حتى لها -3

البالغات وذلك بسبب قدرتها على افراز االنزيمات المحللة والداول عن طريل الكيوتكل

(Charnley,2003 )

ويتمكن بعضها من االستمرار في الحياو على الــرغم من فادانها عوائلها اذ تعيـش مترممة -4

. M. anisopliae ( Muller-kogler and Stein,1976) في التربة كالف ر

اراسة و ،التانيات الورا ية المعباست هاجيناتعن طريل التحكم ب انتاج الس الت المحسنة لها -5

االات فات في التركيب الجيني مابين نويعات النوع الواحد الاتيار النويع االكفأ في مجال

( .Roberts,1989 ; Tangthirasunun et al.,2010المااومة الجر ومية )

Metarhiziumالجنس 2-3

واحدا من اكثر الف ريات الممرضة للحشرات قدرو على Metarhiziumيعد الجن

، ( Chanbary et al.,2009مهاجمة مظائفها منتجة سلسلة من مواا االي الفعالة بايولوجيا )

كل من ينتشر في كافة انحاء العالم ويتواجد طبيعيا في التربة ويعد من الف ريات الممرضة لو

Ticks والاراا mitesلمفصليات االارى كالحلم والحشرات ا

(Roberts and St.leger,2004) .


14

اذ 1879عام Elie Metschnikoffاول من ولف وشدص هذا الف ر هو العالم الروسي

ة جر وميه كأحد العوامـل العمال م اقتر است Anisoplia austriacaعزله من اناف الحن ة

( Zimmermann et al.,1995; Cloyd,1999الممرضـة للحشـرات)

-: كاألتي حديثا ف الف ر ن ص ي و

Kingdom: Fungi

Subkingdom:Dikarya

Phylum:Ascomycota

Class:Sordariomycetes

Order:Hypocreales

Family:Clavicipitaceae

Genus:Metarhizium

(Sung et al.,2007)

( وباالعتماا على الجانب الورا ي المتادم تسعة انواع 2009وجماعته ) Bischoff ميز

واسمه M. anisopliae var. anisopliae ، 2- M.guizhouense -1هي لهذا الجن

)المعــروع ساباــا M.taii ، 3- M. pingshaense ،4- M. acridumالمرااع

.M. anisopliae var)المعروع ساباا M. anisopliae ) ،5- M.majusكنويــع تابـــع

major ) ،6- M. robertsii ،7- M. globosum ،8- M. brunneum ،

9- lepidiotae M.

( Hoe et al.,2009على اوساط زرعية انتاجية مدتلفة ) Metarhiziumينمو الف ر

ف رية بيضاء اللون ذات غزول مستعمرات اائرية بشكلجميع عزالت الف ر نمووت

( ( Tanada and Kaya,1993ذات لون ااضر زيتوني عصوية الشكل لذلك األبواغ تكون و

وشكلها األبواغتباين الوان و كما تشير المصاار الى ،يسمى الف ر بف ر الموسكاراين االاضر

اللون االبي وااللفر والبني بالوانها وتنحصر اعتمااا على س الت هذا الجن ،

.( Tanada and Kaya,1993;Tangthirasunun et al.,2010واالاضر)


15

كال يبيز والبروتييز والكايتنيز االنزيمات العديد من Metarhiziumالف ر ويفرز

نوع مدتلف من المبيدات الف رية تستددم تجاريا 47 انتج منهفي اوساطه الزرعية لذا سموم وال

( .Faria and Wraight,2007في جميع مناطل العالم )

M. anisopliaeالفطر 2-4

كعامــل كبيرواهميـــة وله من اكثر انواع الف ريات الممرضة للحشرات اراسة وت بياا

لمدى واسع سي ــرو حيويـــة بســبب انتشــاره الجغرافي الواسع وامراضيته العالية والابته

فات آل( في مجتمعات اEpizooticsوهو من االنواع التي تسبب وبائية )فات الحشرية آلمن ا

ممكنة مدوألطول ان تأ يراته الااتلة تباىاذ التي تصيبها

(Zimmermann, 1993 ; Liu et al.,2007) ال ه مع المبيدات الحشرية مكنيكما

.( Toriello et al.,2006المبيد ات الكيميائية ) استعمال يلاللت االنتدابية

ابواغ ف رية الجنسية وحيدو النواو ساطةبو M. anisopliaeبالف ر اإللابةتحدث

النمو يليه االنبات وااتراق الكيوتكل م بالمضيف لبوغالتصاق اهي مراحل اربع وتشمل

استعمل . (Humber,1997)من المضيف األبواغ نشوءاعااو م والتكا ر ااال المضيف

Spittlebugsراا والف ر كثيرا في مكافحة اآلفات الحشرية من غمدية األجنحة واألرضة والج

Zimmermann, 1993) ) انفساء فاكهة الدوخ كل من مكافحة اذ استعمل في

Conotrachelus nenuphar ((Tedders et al.,1982 سوسة الموز وCosmopolites

sordidus (Kaaya et al.,1993) ، وايضا استعمل في السي رو على حشرات نائية األجنحة

Diptera تعري ذبابة الارن أنت الدراسات المدتبرية بيناذ((hornfly Haematobia

irritans ه كات عالية في كل من البيوض والعذارى والبالغات إلى أاىلف ر لهذا ا

(Angel-Sahagun et al.,2005) (2009)وبين Mahmoud ف ر سبب نسب ه ك الان

كل من (2011المحنة ) ، واستعمل Bactrocera oleaeعالية لبالغات ذبابة فاكهة الزيتون

بعوضتي حياو ااوارجميع في أ رت قد البوغيتراكيز المعلل ان العالل والراشح للف ر ووجد

An.stephensi وCx.quinquefasciatus ، و %100قد سجلت أعلى نسبة ه ك و

بوغ / مل 105×2التوالي بالتركيز عند معاملة يرقات ال ور األول لك النوعين على 93.33%

لبالغات %100أعلى نسبة ه ك وبلغتفي حين ا ر الراشح في كل من اوري اليرقة والبالغات

An. stephensi للنوع %96.66وCx. quinquefasciatus 72ا ل %100عند التركيز

حياو ااوارجميع في أ رت قد البوغيالمعلل ( ان تراكيز2014، كما أكد الياسري ) ساعة


16

93.33للذكور و % 96.66وبلغت اقصى نسبة ه ك Musca domesticaالذبابة المنزلية

اذ ا ر الراشح في كل من اوري اليرقة والبالغات كما بوغ / مل 106×2لألناث عند التركيز %

من ساعة 72 بعد %100عند التركيز ليرقات ال ور األول %100أعلى نسبة ه ك بلغت

عند نف التركيز %96.66 ناثلألبينما بلغت الذكور لبالغاتكانت النسبة نفسها لوالمعاملة

ولم ياتصر استعمال الف ر في مكافحة الحشرات بل استعمل في مكافحة الاراا . والمدو الزمنية

و Amblyomma variegatum الاراا مثل بالغات عديدو من أنواعمكافحة والحلم اذ تم

Rhipicephalus appendiculatus (Kaaya and Hassan, 2000) في عمل استكما و

ه ك ال نسباقصى وللت اذفي مستعمرات نحل العسل Varroa destructorمكافحة حلم

، (Lambert,2003)ض لألبواغ أيام من التعر 4-3 بعد

في احداث االلابة على غيره من M. anisopliaeكما تشير بع البحوث الى تفوق الف ر

( تفوق 2005وجماعته ) Jonasonاذ وجد Beauveria bassianaالف ريات مثل الف ر

في السي رو على يرقات الحشرو B. bassianaعلى الف ر M. anisopliaeف ر

Tetanops myopaeformis التي تسبب اضرارا في جذور قصب السكر .وتفوق الف ر

M.anisopliae DAT F-001 على الف رM. flavoviride والف ر B. bassiana في

احداث ه كات في يرقات وبالغات االفة الحشرية المتغذية على جذور المحاليل الحالية

Adoryphorus couloni وااتزال عدا البي الموضوع من قبلها

(Rath et al.,1995 .)

في الفطريات األنزيميالنظام 2-5

يعد انزيم البروتييز من اقدم االنزيمات المعروفة -: انزيم البروتييز 2-5-1

ي انتاج الكائنات الحية المجهرية من المصاار المفضلة ف وهو انزيم واسع االنتشار بال بيعة وتعد

المحدواو وسهولة الت عب الجيني في تركيبها هانموومساحة هانموهذا االنزيم بسبب سرعة

. (Raju et al. ,1994 ; Naidu,2011الورا ي )

يعوا انزيم البروتييز الى لنف مهم من االنزيمات تعرع بانزيمات التحلل المائي

( اذ يعمل انزيم البروتييز على التحلل Hussain et al.,2010والمحفزو لتميؤ البروتينات )

تبدي العديد من انزيمات و الى ببتيدات قصيرو واحماض امينية حرو ليجزئها لبروتينات لالمائي

( وبعضها االار يكون اكثر تفاعلالبروتييز اصولية اتجاه مجموعة من البروتينات )كمااو


17

الببتيدية الاصيرو او حتى نائية تدصصا اذ تكون متدصصة بالبروتينات الصغيرو ذات االلرو

.Dipeptides ( (Smith et al.,1997الببتيد

يتم تصنيف انزيم البروتييز اعتمااا على الموقع الذي يعمل عليه الى و

(Rao et al.,1998;Verma et al.,2011)

Exopeptidases:- الببتيدية الاريبة من النهاية لرو آلوهي االنزيمات التي تش ر ا

الكاربوكسيلية او االمينية .

Endopeptidase:- لرو الببتيدية البعيدو من النهاية آلوهي االنزيمات التي تش ر ا

الكاربوكسيلية او االمينية .

-لرو التي يعمل عليها االنزيم الى :آلاعتمااا على موقع ا Exopeptidasesوتاسم مجموعة

Aminopeptidase:- د وتحرر تيوهي التي تعمل على النهاية االمينية من سلسلة متعداو البب

ماالت االحماض االمينية المفراو او الببتيدات الثنائية او الث ية .

Carboxypeptidase :- وهي التي تعمل على النهاية الكاربوكسلية من سلسلة متعداو الببتيد

الببتيد. وتحرر احماض امينية مفراو او نائية

serineالى ة مجاميع رئيسة هي Carboxypeptidaseوتاسم مجموعة

Carboxypeptidase وMetalloCarboxypeptidase وCystine

Carboxypeptidase اما مجموعةEndopeptidase فيتم تاسيمها الى اربع مجاميع اعتمااا

-( :Rao et al.,1998) وهذه المجاميع هي تركيب الموقع الفعال لهاعلى

Serine protease (EC3.4.21):- وهي التي تتميز بوجوا الحام االمينيSerine في

الموقع الفعال وتكون هذه المجموعة متنوعة وواسعة االنتشار في الفايروسات والبكتريا وحاياية

النواو .

Cysteine/thiol protease(EC3.4.22):- يعتمد هذا االنزيم على وجوا الحام االميني

Cysteine وHistidine في الموقع الفعال ، ويوجد هذا االنزيم في كل من الد يا حاياة النواو

وبدائية النواو.


18

Aspartic protease(EC 3.4.23):- ويعرع عااو بالبروتييز الحامضي ، وتعتمد فعاليته

في الموقع الفعال وتبلغ اعلى فعالية لهذا Asparticني التحفيزية على وجوا الحام االمي

(.pH 4-3 ) االنزيم عند ارجة حموضة

Metallo protease (EC3.4.24) :- يعد هذا النوع االكثر تنوعا في فعاليته التحفيزية اذ انه

مصاار يحتاج في عمله الى وجوا ايون معدني نائي التكافؤ. وهذا النوع من االنزيمات يكون ذو

في الكائنات الراقية ،والسموم التي تحدث النزع Collgenaseمتنوعة مثل انزيم الكوالجينيز

المفرز من البكتريا . Thermolysineالموجواو في سم االفعى ،و

-وهنالك نوعين من انزيمات البروتييز تم التعرع اليها وولفها منذ وقت قريب وهما :

Theronine protease:- وهو يحوي على الحام 1995تم التعرع عليه وولفه عام

ضمن الموقع الفعال ، وتعد انزيماته العامل المساعد للمعاد Theronine (Thr)االميني

Archaeaالموجواو ااال جميع الكائنات حاياة النواو و Proteasomeب البروتيني المعروع

توي على نواو او اعضاء محاطة بأغشية ضمن )وهي مجموعة من االحياء الدقياة التي التح

ا ياها ( وبع انواع البكتريا .

Glutamic acid protease:- وهو مجموعة من االنزيمات المحللة ( م2004)تم ولفه عام

للبروتين تتواجد بصورو رئيسة في الف ريات تتميز بأستددامها لزوج من االحماض االمينية في

. Glu (Yike,2011) وGln فعلها التحفيزي وهما

االمثل لعمل االنزيم الى pHوياسم البروتييز ايضا اعتمااا على مدى الرقم الهيدروجيني

(2.0-5.0والمدى االمثل له من الرقم الهيدروجيني هو ) Acidحامضي -1

(Haq etal.,2006.) الف ريات . منبشكل رئيسي وينتج

( او مايكون قريب عليه ويوجد بصورو 7.0والرقم الهيدروجيني له هو) Naturalمتعاال -2

رئيسة في النبات )الله نباتي( ولكن بع البكتريا والف ريات ممكن ان تنتج مثل هذا االنزيم

(Haq and Mukhtar,2005.)

وينتجه( 11 0.-8.0 والمدى االمثل له من الرقم الهيدروجيني هو) -:Alkalineالااعدي -3

(.Rao et al.,1998كل من البكتريا والف ريات )


19

إنزيم الكايتنيز 2-5-2

عميل علييى التحليل المييائي لألواليير ي و أي أنييزيم يحفيز انشيي ار الكييايتينإنيزيم الكييايتنيز هيو

فيييي الكيييايتين لتحوليييه إليييى نيييواتج ذات اوزان جزيئيييية واطئييية (β-linked-1,4)الك يكوسييييدية

Annamalia etal. , 2011) ; Graham and Sticklen,1994 )الكيايتين عبيارو عين ، و

وغيير م ياط مكيون مين وحيدات سيكر متفيرع وغيير ذائيب أبيي الليون ليلبسكر متعدا غيير

مرتب ية ميع بعــــيـضها N-acetyl - D- glucosamine (GLCNAC)متجانسية مين سيكر

(β-linked-1,4نـييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييـوع.) ك يكوسيييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييدية بأوالييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييـر

(Dutta etal.,2004; Dhar and Kuar,2010)

يعتاد في الغالب انه في ال بيعة بعد السيليلوز كما ويعد اني أهم السكريات المتعداو الموجواو

االســيــــتــامــيــداته عدا انه يمتلك مـجمـوعــةمشتل من تركيب السليلوز إذ يحتوي التركيب ذ

(-NHCOCH3 عنــد مــوقــع ذرو الـكاربــون الثــانيــة) (Dutta etal.,2004وقد ) أظهرت

β- chitinsو ∝-chitinsان الكايتين يتكون من ة أشكال X أشعة استعمالالدراسات ب

والتي تدتلف فيما بينها في ترتيب الس سل الجزيئية الموجواو في تركيبه البلوري γ-chitinsو

يع ي والذي شكل الس سل غير المتوازية فيهويعد النوع األول األكثر شيوعا و بوتية بسبب .

% 20بنسبة ويتواجد في كيوتكل الحشرات قوو لآلوالر الهيدروجينية

(Bhagya et al. ,2010) كذلك يتواجد في قشرو و( السرطانCrabs) ( والروبيانShrimps )

إذ تع ي فيهأقل باتا بسبب شكل الس سل المتوازية ، اما النوع الثاني فهو ناار تاريبا ويكون

ويتواجد في الهياكل الدارجية للدايتومات ، وبالنسبةقوو ارتباط ضعيفة ما بين جزيئات السكر

.Stawski et al) يتكون من اتحاا س سل غير متوازية مع س سل متوازيةللنوع األاير ف

,2008 ; Dahiya et al. ,2006) .

فيروسات و البكتريا و الف ريات الكايتنيز في مدى واسع من الكائنات الحية تشمل ال جتني

و النباتات والحيوانات . واوره يدتلف بأات ع الكائن الحي والحشرات

(Matsumoto,2006 ; Duo-chuan,2005 ففي الف ريات.)التحلل الذاتي و يعمل على

( فض عن اوره في عملية ت فل الف ريات الممرضة Adams,2004التغذية واناسام الدلية )

( .Haran etal.,1995) مضائفهاعلى


20

يصنف انزيم الكايتنيز إلى فئتين رئيسيتين اعتمااا على آلية عملها وهما :و

(1 )(Endochitinase (EC3.2.1.14 هذا اإلنزيم بش ر األوالر الك يكوسيدية في ياوم

الكايتين بصورو عشوائية عند المواقع الداالية ليع ي وحدات من سكر

N-acetyl-D-glucoseamine لذوبان مثللواطئة الوزن الجزيئي وقابلة

diacetylchitobiose, chitotetraose, Chitotriose .

(2 )Exochitinase :- : ويتم تاسميه إلى فئتين فرعيتين هما

Chitobiosidases (EC3.2.1.29) or Chitin-1,4-β-chitobiosidases (A)

عند النهاية غير المدتزلة لس سل diacetylchitobioseوالذي يحفز اإلط ق المتكرر لسكر

اون ان تع ي أي من السكريات األحااية diacetylchitobioseتين مع ية بذلك فاط سكر يالكا

. oligosaccaridesأو قليلة السكريات

B)) β -(1,4)-N-acetyl-glucosaminidases (EC3.2.1.30) or chitobiases

وبوليمرات الكايتين العالية التي diacetylchitobioseيعمل هذا اإلنزيم على ش ر سكر

و كذلك ياوم هذا األنزيم GlcNAcإلى وحدات من chitotetraoseو Chitotrioseتتضمن

-p-nitrophenyl-N-acetyl β-Dومااو pNP -GlcNAcبش ر المااو الملونة

galactosaminide لتـحريـــرpNP 4وش ـــر سكــــر-MU-GlcNAc لتحريرMU-4

(Graham and Sticklen,1994; Dahiya etal.,2006) .

إنزيم الاليبيز 2-5-3

من Triacylglycerol acylhydrolases (EC3.1.1.3 )يعد انزيم ال يبيز أو ما يسمى

. Ghosh et al.,1996)اإلنزيمات التي تمتلك مجال واسع في ت بياات التانيات الحياتية )

مصــدرا جيدا نظرا لسهولة الحصول عليه يعد المفرز من قبل الف ريات ال يبيز نزيماوان

وراص منه ويدال في العديد من المجاالت الصناعية

(Beys da Silva et al.,2005;Hassan et al.,2006 )ان ال يبيز المفرز من فض عن

أن ال باة إذ مضيفمهما في عملية إلابة الورا قبل الف ريات الممرضة للحشرات يأاذ ا

فياوم الدهنية الموجواو في الكيوتكل الس حي تمثل الحاجز والعائل األول أمام الممرضات

بالتحلل المائي لألوالر االسترية الموجواو في الدهون والبروتينات هامن قبلالمفرز ال يبيز


21

اتالدهنية الحرو وبذلك تسهم بالتصاق الممرضالدهنية وال باة الشمعية وتحرير األحماض

. (Ali et al.,2010 ; Hasan et al.,2013 ) مضائفهاب

م 1950بدأ االهتمام بدراسة إنزيم ال يبيز المفرز من قبل الف ريات أوائل عام

Ghosh et al.,1996) واستمرت الدراسات المتعلاة بهذا اإلنزيم وبالذات المفرز من )

Verticilliumالف ريات الممرضة للحشرات ، فاد قدرت فعالية إنزيم ال يبيز للف ر الممرض

lecanii ( وعند ارجات حموضة مدتلفةHasan et al.,2013 وكذلك ااتبرت امراضية )

و ث Beauveria bassianaإنزيمات ستة من الف ريات الممرضة ث عزالت لف ر

ن الدوخ األاضر Verticillinn lecaniiعزالت للف ر ضد اآلفة االقتصااية المعروفة بـ م

اارنة بإنزيمي ووجد ان إنزيم ال يبيز المفرز من قبل هذه الف ريات أكثر أمراضية وتأ يرا م

( . Khan et al.,2012 bالبرونييز والكايتنيز )

تأ ير مااو زيت الزيتون في Hegedus and khachatourians (1988 )كما ارس كل من

إنتاج اإلنزيم وكذلك تأ ير اآليونات المعدنية نائية التكافؤ على فعاليته .

واالشعة فوق البنفسجية في إنتاج Methoxypsoraicn-8كذلك تم اراسة تأ ير المااو الم فرو

اذ وجد ان الس لة الم فرو كانت أكثر إنتاجا إلنزيم ال يبيز M.anisopliaeال يبيز من الف ر

( . Da Silva et al.,1989 بالس لة األللية ) ماارنة

( تأ ير بع أنواع الزيوت واآليونات وارجات الحموضة 2009وجماعته ) Aliكما ارس

وجماعته Beys da Silva، وبين M.anisopliaeعلى إنتاج إنزيم ال يبيز المفرز من الف ر

أهمــية أنزيم ال يبـــيز في ااتراق المضيف وزيااو عمليــة اإللــابة بالنسبة للف ر ( 2010)

M. anisopliae الف ر في مهاجمة قراا الماشية أبواغ عمالبين ذلك اوال باست إذ

Rhipicephalus (Boophilus) microplus مهاجمةأ ر إنزيم ال يبيز في زيااو وأوضح

بواغاألوعامل به ebelactone Bمثبط إلنزيم ال يبيز المعم بعد ذلك استالف ر للعائل أبواغ

المعاملة والموجواو على الاراا لم تست ع ان تكون أنبوب اإلنبات بواغف حظ ان األ

germinate tube) العائل. مهاجمة( وبالتالي لم تست ع ان تاوم ب

تتغير فاعليته بحسب طبيعة مكونات جدار M. anisoplaeان إنزيم ال يبيز المفرز من الف ر

إذ (2010) وجماعته Beys da Sliva بها ذي يهاجمه بحسب الدراسة التي قامجسم العائل ال

قامت بتجهيز الوسط المغذي للف ر بمصاار كربون متعداو ف حظت اات ع في كمية إنزيم

ال يبيز المفرز من قبل الف ر باات ع المصاار الكربونية المغذية لوسط اإلنتاج.


22

Toxinsالسموم 2-5-4

األي الثانوي السموم في الغالب مركبات ناتجة من عمليات

(Secondary Metabolism) (Graniti,1972 وتت ور بشكل جيد في النباتات الراقية )

( . ويعرع علماء األحياء المجهرية السموم على أنها مركبات (Vining,1990والف ريات

حية عندما تفرز من قبل وزان جزيئية عالية تسبب أضرارا في الكائنات الابروتينية ذات

( . أما علماء النبات فيعرفون السموم على أنها Roberts,1980الممرضات التي تصيبها )

مركبات بروتينية ذات اوزان جزيئية واطئة وهي فعالة بايولوجيا عند التراكيز الواطئة

Graniti,1972).)

اث التسمم في العائل والذي ذات وظائف عدو منها إحدتكون السموم التي تفرزها الف ريات ان

التثبيط المناعي لدفاعات العائل المناعية والتغلب عليها وتعد ويؤاي إلى موته في النهاية

كمضااات حيوية لتثبيط منافسة الممرضات األارى من األحياء المجهرية وباألاص الممرضات

والف ريات Deuteromycetesالف رية، وتمتلك الف ريات الممرضة من الف ريات الناقصة

الاابلية على إلابة مدى واسع من العوائل والسرعة في قتل تلك العوائل Ascomyceteالكيسية

ي تعمل على ااتزال نمو الف ر ااال العائل في السائل اللمفي الدموي وإفرازه للسموم التلنتيجة

( .Charnley,2003) تهقلة تغذي فض عن فيه الشللاحداث و تهفعالي

في المركبات السمية المنتجة من قبل الف ريات الممرضة للحشرات منها كبيرك تنوع لهنا

والتي يمكن إاراجها ضمن الجدول M.anisopliaeمركبات غير بروتينية تفرز من قبل الف ر

التالي :

المصدر التأثير التركيب الكيميائي اسم المركب التسلسل

1 Swainsonine Indolizine alkaloid α- Mannosidase

inhibitor

Tamerler etal.,

1998))

2 Viridoxins Diterpene derivaives of

polysubstitutedy-Y-pyrones Insecticidal

Gupta

etal.(1993a)

3 Helvolic acid Triterpenoid Antibiotic

Turner and

Aldridge

(1983)

4 .cytochalasins Perhydroindole with a

macro cyclic ring

Inhabit cell

movement

Aldridge and

Turner(1969)


23

يعد المركب الناتج من المستدلص الكحولي االيثانولي لغزل الف ر

M.anisopliae var.fluvoviride والذي يسمى بـviridoxins من أكثر المواا غير

في مكافحة انفساء كلورااو استعملالبروتينية جذبا في مجال المكافحة الحيوية للحشرات إذ

Leptinotarsa decemlineata ووجد ان هـــذا المركب شديـــد الشبــــه بالمــــركبيــــن .

Colletochin وColletotrichin ـــة من قـــــبل ممـــرض النبات المنتجـ

Colletotrichum nicotianae (Gupta et al.,1993a) .

عام M. anisopliaeوالمعزول ألول مرو من الف ر Cytochalasinsووجد ان لمركب

حركة الدلية هو ااتزال عملية البلعمة الدلوية وانتشار ا يا ( اور أار غير تثبيط 1969)

وبذلك تتداال مع االستجابة المناعية Galleria mellonelaالدم في يرقات عثة الشمع الكبرى

(.Vilcinskas et al.,1997b,c) للمضيف وتلعب اور مهم في اإللابة الف رية

المفـــرز Hydrophobinينة مثل مركب كما ان هناك سموم تكون عبارو عن مركبات بروت

Insecticidalوالذي يعـــد كمبيــــد حشـــري M.anisopliaeمـــن قـــبل الف ـــر

(St.leger et al.,1992c)

مجموعة من السموم ذات التركيب الببتيدي الحلاي والتي M.anisopliaeكذلك يفرز الف ر

نوع مدتلف من 30( وشدص لحد اآلن ضمن مزرعة هذا الف ر DTXتعرع بالدستروكسين )

هذه السموم ، إال ان التركيب األساسي لهذه السموم يتألف من امسة أحماض أمينية مرتب ة مع

Hydroxy acid (kodaria,1961; Suzuki andحام هايدروكسي

Tamura,1972;Gupta et al.,1989; Jegorov et al., 1998)

هاا ل النمو النشط ل سموم الدستروكسينتفرز الف ريات

(Amiri - Besheli etal.,2000 ) الف ر ويفرزM. anisopliae أنواع من سموم

. Eو Bو Aالدستروكسين مثل نوع

بامراضية الحشرات سواء كان M.anisopliaeيتسبب سم الدستروكسين المفرز من الف ر

تعرض الحشرات له بالم مسة أو باالبت ع أو الحان اذ انه يسبب ازالة ق بية الغشاء الدلوي من

ان ، ووجد (Amiri et al.,1999; Poprawski et al.,1994ا ل فتح قنوات الكالسيوم )

في حشرات الدروسوفي يسبب قمع تعبير الجين Aحان الجرعة النصف قاتلة من الدستروكسين

ي بمجرا فالتالي يتسبب بموت حشرات الدروسوكروبات وبيالمشفر لصنع الببتيدات المضااو للم

. E.coli (Molnάr etal.,2010)إلابتها بالبكتريا غير المؤذية من


24

األجنحية تسيبب فيورا ة وبالغات نائييةحكما وجد ان حان الدستروكسين في يرقات حرشفية األجن

يعابه ترهيل فيي العضي ت وان الجيرع (tetanic muscular paralysis)شل عضليا تكززيا

العالييييييييييييييييييييييييييييييية ميييييييييييييييييييييييييييييين الدستروكسييييييييييييييييييييييييييييييين تكييييييييييييييييييييييييييييييون قاتليييييييييييييييييييييييييييييية

(kodaira,1961;Roberts,1966b;Samules etal.,1988a,b,c )

كما ان للدستروكسين مدى واسع من التأ يرات في الحشرات منها تثبيط إفراز سائل أنابيب

. Schistocerca gregaria (James etal.,1993)مالبيجي في الجراا الصحراوي

وتثبيط إفراز سترويدات االنس خ من الغدا الصدرية لحشرو

(Sloman and Reynolds,1993) Manduca Sexta كما ان الجرع الاليلة من ،

الدستروكسين له تأ يرات مرضية في ا يا الاناو الوس ى وانابيب مالبيجي سواء كان اارج

جسم الحشرات أو في ااال جسم الحشرات مثل ظهور التجاويف في السايتوب زم والذي يسبب

الداالية ، وظهور الحويص ت على الزغيبات الدقياة وتجمع توسع في الشبكة االندوب زمية

أيضا يسبب (Quiot et al.,1985 ; Dumas et al.;1995الكروماتين في النوية )

DNAالدستروكسين تثبيط تضاعف الد يا من ا ل تأ يره على بناء األحماض النووية

. RNA ( Quiot et al.,1980;Yeh etal.,1996) و

يمكنها إنتاج سموم M. anisopliae وتجدر اإلشارو إلى ان لي جميع عزالت الف ر

حــظ فــي كــل مــنلو وهذاالدستروكسين فبعضها ينتج كميات قليلة أو ال ينتج هذه السموم

M. anisopliae var. majus وM. anisopliae var. acridum

Roberts,1986;Kershaw etal.,1999) (Kaijian and ،كما ان إنتاج الدستروكسين ال

ان إنتاجه لي شرطا لألمراضية و يتأ ر بشكل كبير بمكونات الوسط

(Roberts,1966a;Jegorov et al.,1989. )

إنزيم بع األنزيمات مثل عد الباحثون فض عن السموم التي تعد من نواتج األي الثانوي

مواا سامة إلنزيمات األارى كالفوسفواليبيز البروتييز المفرز من الف ريات الممرضة وبع ا

(Toxinsلما لها من اور فعال في اإللابة الف رية وقتل المضيف. اذ برهن ألول مرو العالم )

( Kucera (1981 على ان إنزيم البروتييز المفرز من الف رM. anisopliae جزئيا والمناى

الكبرى. الشمع عثةله تأ يرات سمية حين تم حانه في يرقات

( و 2000) وجماعته Grieschو Vilcinskas and Wedde (1997a)كما اكد الباحثين

Griesch and Vilcinskas (1998) علــى ان انزيــم البروتــيز المفــرز من قــبل


25

M. anisopliae والف رB. bassiana ياوم بفصل وإضعاع ارتباط الهيكل الدلوي بل وحتى

للد يا الب زمية في حشرو ((phagocytosisتكوينه وكذلك يثبط عملية البلعمة الدلوية

Galleria mellonella .

M. anisopliaeالظروف المثلى إلنتاج إنزيم البروتييز من الفطر 2-6

ة بيئيا عن بعضها البع في ظروفها الس الته باات فهيتميز كل كائن مجهري وحتى

( ، وان الاواعد Kumar and Takagi , 1999لتحايل اإلنتاجية الاصوى من اإلنزيمات )

العامة التي تتحكم بالظروع المثلى إلنتاج إنزيم البروتييز المايكروبي تتأ ر بالعديد من العوامل

الرقم الهيدروجيني للوسطسرعة الرج والتهوية و منها ارجة حرارو الوسط الزرعي وتأ ير

( pH ) وحجم اللاا ومصدر الكاربون وتركيزه ومصدر النايتروجين العضوي وال عضوي

مهمة والحرارو ( الرقم الهيدروجيني)وباألاص عاملي وغيرها، وان معرفة هذه العوامل

يزياإلنتاجية الاصوى النزيم البروت الظروع المزرعية لتحايل لتحفيز وت وير وتحسين

(Hesseltine , 1972; Wang and Shih, 1999 ;Rahman et al.,2005;Rani,et al.;2012)

تأثير المصدر الكاربوني -2-6-1

تعد المصاار الكاربونية ضرورية لحياو الد يا الحية بصورو عامة إذ تصل نسبة الكاربون

، ويؤاي الكاربون وظيفتين أساسيتين ( 1990، الدفاجي)من الوزن الجاع للد يا %50الى

في فسلجة الف ريات هما أوال تجهيز الكربون الضروري لتصنيع المكونات األساسية مثل

والبروتينات والدهون واألحماض النووية ، و انيا أكسدو هذه المركبات لتجهيز الكربوهيدرات

( فض Garraway and Evans,1984مصدرا لل اقة للوظائف الدالة في حياو الف ريات)

عن كون المصاار الكاربونية مصدر للتزوا باألوكسجين أو الهيدروجين

(Zabriskie et al.,1980 ; Mehta et al.2012 )

تييز من أحياء مجهرية مدتلفة ، ففي الدراسة ر كاربونية في إنتاج إنزيم البروت مصااعملاست

فيه الكازائين استعملوجد ان الوسط الذي ( 1999 ) وجماعته سنة Bragaالتي أجراها

س لتين كمصدر كاربوني أفضل من الوسط الذي يحوي كلوكوز في إنتاج أنزيم البروتييز من

. M. anisopliae var . anisopliae للف ر

%1 عمالباست المذكور( من الف ر Pr2( و )Pr1ينما لوحظت أعلى فعالية إلنزيم البروتييز )ب

( ، وحصلت Ali et al.,2011كل العث الماسي كمصدر كاربوني )توكي من كل من الكلوكوز و


26

وبفعالية نوعية B. bassiana( على أعلى انتاجية النزيم البروتيز من الف ر 2012العبااي )

من اميرو الدبز كمصدر كاربوني. %1.5 استعمالوحدو/ ملغم بروتين ب 638.2بلغت

ي من الف راعدوز األفضل إلنتاج البروتييز الاوكان الكلوك

(Tremacoldi and Carmona , 2005) Aspergillus clavatus وحصل ،Ire

فضل إلنتاج البروتييز من الف ر األى نف النتيجة إذ كان الكلوكلوز عل 2011وجماعته عام

Aspergillus carbonarius .

الفركتوز كمصدر كاربوني كان األفضل في إع اء أعلى استعمالوفي اراسة أارى وجد ان

وبالنسبة A. flavus AS2 (Rani et al.,2012)إنتاجية للبروتييز من الف ر الم فر ورا يا

ن م Rhizopus microsporus ف رلل على وسط ندالة الرز وجد ان اضافة الكازائين ىوالم

على إع اء إنتاجية للبروتييز المتعاال الف ركمصدر كاربوني قد حفز

(Sumantha etal., 2006 b )

و E.coliو Bacillus subtilusو Pseudomonas fluorescensأما البكتريا

Serratia marscens فضل إلنتاج األالتربة فاد وجد ان الكلوكوز هو والمعزولة جمعيها من

( . Palsaniya et al.,2012) المذكوروي من هذه األنواع اعدالبروتييز الا

تأثير المصدر النايتروجيني وتركيزه -2-6-2

النايتروجين من العنالر المهمة التي يحتاجها الكثير من األحياء المجهرية ا ل عملية

( . Carlile et al., 2001التدمر لبناء البروتين )

يعد النتروجين مصدرا ضروريا للنمو والت ور الف ري ، فالف ريات تحتاج إليه لصنع مدتلف

المكونات الدلوية الضرورية والتي تشمل األحماض األمينية والبروتينات واألحماض النووية

والكايتين ومدتلف الفيتامينات ، وان اغلب الف ريات قاارو على استغ ل النتروجين غير

لبسيط باإلضافة الى المصاار العضوية كاألحماض األمينية. العضوي ا

تكون مصاار النتروجين في ال بيعة على نوعين : أما ال عضوية مثل النتروجين الجوي وأم

األمونيوم والنترات أو تكون مصاار عضوية مثل الحوام األمينية والبروتينات ومشتااتها

( .1990)الدفاجي،


27

ج البروتييز في الف ريات بوجوا المصاار الكاربونية والنتروجينية، فيكون يتأ ر كثيرا إنتا

إنتاجه قلي إذا نمت الف ريات على وسط غني بالنتروجين ولكنه يفتار الى الكربوهيدرات ويكون

إنتاجه غزيرا في حالة توفر المصاار الكاربونية وقلة أو انعدام المصاار النتروجينية المعدنية

(Eaton and Ayres,2002. )

بينت العديد من الدراسات ان هنالك تباينا في تأ ير نوع المصدر النتروجيني في إنتاج إنزيم

وجد ان اإلنتاج (1999)وجماعته Bragaالبروتييز من األحياء المجهرية ، ففي اراسة أجراها

Casienالكازائين استعمال يكون ب M. anisopliaeالغزير إلنزيم البروتييز من الف ر

كمصدر نايتروجيني وكاربوني في نف الوقت.

لم يحث الف ر %1، بأن الوسط الحاوي على الكازائين Kaur ( (2010 و Dhar بينما أوضح

% 2وان الوسط الحاوي على الكايتين الغروي Pr2و Pr1بنوعيه يزلى إنتاج البروتيعالمذكور

كمصدر نايتروجيني وكاربوني كان األفضل في إنتاج هذين األنزيمين.

( ان المصدر النايتروجيني األكفأ في إنتاج إنزيم البروتييز من الف ر 2012بينت العبااي )

B.bassiana ملغم بروتين. وحدو/ 676.47هو كبريتات األمونيوم وبفعالية نوعية بلغت

فكانت أعلى إنتاجية له من أنزيم البروتييز عندما زوا الوسط المغذي له A. flavusأما الف ر

كمصدر نيتروجيني ال عضوي %3بنسبة KNO3بنترات البوتاسيوم

(Muthulakshmi et al., 2011 . )

أعلى انتاجية لألنزيم عندما زوا بالكازائين كمصدر نتيروجيني A. clavatusوكان للف ر

( Tremacoldi and Carmona , 2005) %1عضوي وبنسبة

كبريتات األمونيوم هي المصدر النتروجيني األكفأ في إنتاج إنزيم البروتييز من الف ركانت بينما

A. niger (Devi et al., 2008) .

ان الببتون كان المصدر األكفأ في إنتاج البروتييز من الف ر ( 2008وجماعته ) Haq ووجد

Penicillium chrysogenum .

( ان طحين فول الصويا هو المصدر النايتروجيني األفضل في إنتاج 2011وجماعته ) Ireأكد

. A. carbonariusإنزيم البروتييز من الف ر


28

فكان المصدر النتروجيني األفضل في حثه على Pleurotus sajor-cajuأما الف ر ال بي

( . Ravikumar et al.,2012) %0.8إنتاج إنزيم البروتييز هو نترات األمونيوم بنسبة

وكان أيضا ل حين فول الصويا المدعم بالكازائين كمصدر نتروجيني الدور

إنتاج إنزيم البروتييز على A. flavus AS2األكبر في تحفيز الف ر ال افر

(Rani et al.,2012 . )

( على أعلى إنتاجية إلنزيم البروتييز المفرز من البكتريا 2011وجماعته ) Harithaحصل

عندما زوا الوسط المغذي بمصدرين للنتروجين Streptomyces carpaticusالبحرية

األار ال عضوي هو كبريتات األمونيوم.احدهما عضوي هو طحين فول الصويا و

تأثير مدة الحضن -2-6-3

توجد ع قة و ياة ما بين إنتاج اإلنزيمات المايكروبية ومدو الحضن وذلك لوجوا ترابط ما

حضن مثلى إلنتاج االنزيمات إذ إنها إال أنه ال توجد مدو . الد يا بين بناء اإلنزيمات ونمو

Ito et al., 2007 ; Rustiguel, 2012 ;)الوسط الزرعي .نوع تدتلف بإات ع

Kaur et al., 1998 ).

( أن أعلى إنتاجية إلنزيم البروتييز المفرز من قبل أربعة 2010) Kaur و Dharالحظ

يوم من بداية الحضن. 6-4 ا لكانت M. anisopliaeعزالت للف ر

( ان اإلنتـــاجية الاصــوى إلنزيــم البروتيــيــز بنوعــيه 2002)وجماعته Tiagoوذكر

Pr1 وPr2 ساعة من حضن الف ر 48كانت بعد M. flavoviride ل ككيوت المعستأب و

وسط الحد األانى المدعم استعمالوب Pr1في حال إنتاج انزيم Schistocera pallens رااوالج

. Pr2بالنترات في حال إنتاج انزيم

من الف ر المذكورين أيام كافية إلنتاج البروتييز بنوعيه 5وكانت مدو حضن

IF28.2 M. anisopliae ــل العـــث ذو الظهـــر الماســـي ككيـــوت عمالســـتـــأب و

(Ali et al.,2011) .

( الى ان إنتاج إنزيم البروتييز الدارج الوي من الف ر2006)وجماعته Raoوأشار

B. bassiana الوسط الحاوي المعستأب و ولل أعلى مستوى بعد سبعة أيام من تنمية الف ر


29

سكروز و %0.19من مسحوق الصويا و %0.60من مسحوق قشرو الروبيان و %0.72على

ا لة الدميرو. 0.68%

أيام من حضن الف ر 6ي بعد اعدلى فعالية إلنزيم البروتييز الافي حين لوحظ أع

Tremacoldi and Carmona , 2005) A. clavatus ).

أيام من بداية الحضن 9 فسجل أعلى إنتاج إلنزيم البروتييز بعد A. carbonariusأما الف ر

(Submerged fermentation)تدمرات الحالة شبه المغمورو المعستأب و

(Ire et al, 2011. )

ف رالج البروتييز المتعاال من ( الـــى ان إنتـــــا2006a)وجماعته Sumanthaوأشار

Rhizopus sp. الف ر أيام من تنمية 3ولل أعلى مستوى له بعد .

تأثير درجة الحرارة -2-6-4

تعد ارجة الحرارو من العوامل المهمة ذات التأ ير المسي ر على نمو األحياء المجهرية

وباألاص الف ريات . كما أنها تؤ ر في معظم النشاطات األيضية لألحياء المجهرية اصولا

النشاطات األنزيمية في الدلية من ا ل تأ يرها على الصفات الفيزيائية للغشاء الدلوي، هذا وان

ت الحرارو الم ئمة لنمو الكائن المجهري قد تدتلف عن ارجات الحرارو الم ئمة إلنتاج ارجا

اإلنزيمات من قبلها إذ تكون في بع األحيان ارجة الحرارو المثلى لنمو الكائن المجهري أعلى

;Soundarapandian and Chandra , 2007)من ارجة الحرارو المثلى إلنتاجه لألنزيم

Ustariz et al.,2008 ) وان لدرجة الحرارو اور مهم في تنشيط أو تثبيط اإلنزيمات فلكل

( . Abu sayem et al.,2006إنزيم ارجة حرارو مثلى يبلغ عندها الذروو في فعاليته )

ثلى إلنتاج إنزيم البروتييز ( ان الدرجة الحرارية الم1999وجماعته ) Samarntarnأكد

وجماعته Tiago لمعبينما است ،م 45كانت A. oryzae UI521ي من الف ر اعدالا

من قبل Pr2و Pr1م في حضن الوسط الزرعي إلنتاج االنزيمين 28( ارجة الحرارو 2002)

ة في حضن الوسط الزرعي عملانت تلك الدرجة الحرارية المست، وك M. flavovirideالف ر

بين ، M. anisopliae (Dhar and Kaur,2010) من الف ر Pr2و Pr1إلنتاج االنزيمين

Ali ( ان الدرجة الحرارية المثلى إلنتاج االنزيمين 2011وجماعته )Pr1 وPr2 من الف ر

M. anisopliae م 35كانت.


30

كانت A. tamarii [EF661565.1]وفي اراسة أارى إلنتاج إنزيم البروتييز من الف ر

م 60الدرجة الحرارية التي تحال فيها أقصى إنتاج لإلنزيم هي

(Sharma and De , 2011. )

تأثير الرقم الهيدروجيني االبتدائي لوسط اإلنتاج -2-6-5

لإلنزيمات ، فالرقم يمتلك الرقم الهيدروجيني تأ يرا فاع في نمو األحياء المجهرية وإنتاجها

في الف ريات وبصورو عامة تناسم بواغري للنمو ال بيعي وإنتاج األالهيدروجيني األمثل ضرو

الف ريات الى قسمين من حيث تأ رها بالرقم الهيدروجيني فاسم منها يمتلك مدى واسع من الرقم

قم الهيدروجيني الهيدروجيني األمثل لنموه والاسم اآلار ياتصر نموه على مدى ضيل من الر

(Prosser and Tough, 1991 )

ي وذلك من ا ل تأ يره اعدعلى إنتاج إنزيم البروتييز الا ويؤ ر الرقم الهيدروجيني للوسط

ة التعبير الجيني ، ويساعد التحكم بالرقم آلياأليضية والتنظيمي في التداال مابين التفاع ت

للعديد من الجينات مما يؤاي الى الحصول على الهيدروجيني للوسط في تنظيم التعبير الجيني

(. Wang et al.,2005; Patil and Chaudhari, 2013إنتاجية عالية للبروتين )

على وسط إنتاجي ذو رقم M. anisopliaeبحضن الف ر Kaur ( (2010 و Dhar قام

كل من M. anisopliaeانتج الف ر نما يب . Pr2و Pr1لغرض إنتاج االنزيمين 8هيدروجيني

5.4عندما حضن على الوسط اإلنتاجي وبرقم هيدروجيني ابتدائي المذكوريناإلنزيمين

(Ali et al.,2011)

M.anisopliaeأعلى فعالية إلنزيم البروتييز السام المفرز من الف ر Kucera( 1981سجل )

. 6وسط اإلنتاج ذو الرقم الهيدروجيني استعمالوب 5.5عند الرقم الهيدروجيني

دى رقم م ي عنداعدألنزيم البروتييز الااعلى فعالية A. oryzae UI521حال الف ر

( . Samarntarn et al.,1999) 9 -8 هيدروجيني

( على أعلى فعالية إلنزيم البروتييز الحامضي عندما 2010وجماعته ) Abdul Raufحصل و

. 3على وسط إنتاجي ذو رقم هيدروجيني R. oligosporusتم تنمية الف ر


31

تأثير حجم اللقاح 2-6-6

ان لحجم اللاا تأ ير مهم في إنتاج وبناء اإلنزيمات إذ انه من العوامل الحيوية التي تحدا

إنتاج الكتلة الحيوية في التدمر وأن تحايل التوازن بين انتشار الكتلة الحيوية وتوفر المواا

الغذائية واألوكسجين الذائب سوع يع ي إنتاجية عالية لألنزيم لذا ألبح من األساسيات تثبيت

بد من اإلشارو الى ان حجم اللاا األمثل لكل كائن مجهري بغ النظر عن مدو الحضن ، وال

على نوع وس لة الكائن المجهري وطبيعة عملية التدمر. ا االلاا يدتلف اعتما حجم

(Nigam, 1990; Abdul- Rauf et al., 2010; Patil and Chaudhari,2013 )

المعن األحياء المجهرية فاد تم استحجوم لاا مدتلفة في إنتاج إنزيم البروتييز م المعتم است

من الف ر Pr2و Pr1/ مل إلنتاج انزيمي البروتييز بوغ 106× 1حجم لاا مادار

M.anisopliae (Dhar and Kaur,2010; Ali et al.,2011) .

/ مل إلنتاج إنزيم بوغ 106× 3وا حجم لاا ماداره لمع( فاد است2002وجماعته ) Tiagoأما

( من إنتاج 2010وجماعته ) Abdul Rauf، واست اع M. flavoviride البروتييز من الف ر

فاط . %1حجم لاا ماداره عمالستأب Rhizopus oligosporusإنزيم البروتييز من الف ر

الوسط استعمالإنزيم البروتييز الدارجي ب B. bassianaأنتجت العزلة البرازيلية من الف ر

( . 2007et alIto,./مل ) بوغ 108× 1الزرعي الم ئم لها والملاح بلاا حجم

المذكور ( ان ينتج إنزيم البروتييز من الف ر2011وجماعته ) Shankarوتمكن

. %10حجم لاا استعمالب

است اعت ان تنمو وتع ي أعلى إنتاج إلنزيم B. circulans MTCC7942وبالنسبة للبكتريا

ساعة من بداية حضنها 48بعد % 6 البروتييز عند حجم لاا ماداره

Patil and Chaudhari,2013). )

تأثير سرعة الرج 2-6-7

لزيااو إنتاج إنزيم البروتيييز مين الضيروري تزوييد األحيياء المجهريية باألوكسيجين اليذائب

إذ يعمل في بعي األحيياء بتغييرات أساسيية فيي مو وتدليل اإلنزيم لكونه من العوامل المحداو للن

لهيا ، وتعميل سيرعة اليرج عليى فعالياتها الحيوية فهيو أميا ان يكيون محفيزا لألنزيميات أو مثب يا

توزيييع المييواا الغذائييية فييي الوسييط وزيييااو كميييات األوكسييجين الييذائب ميين ايي ل مييزج تحسييين


32

مكونييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييات الوسييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييييط

( .Patil and Chaudhari,2013; Kumar and Takagi,1999 ;1980)السعد،

ح نموذجيا إذ انه ياوم بتوزيع مكونات الوسط في كل والهزازالحاضنة تعد طرياة استعمال

وجد ان تغير سرعة الرج تؤ ر في ارجة المزج في الدوارق الد يا وتجاه ويزااا معدل نمو ا

(. Bohlmann et al.,1998المهتزو )

Braga لمعاست اذة لألنزيمات ت سرع مدتلفة تتناسب واألحياء المجهرية المنتجعملاست

اورو/ اقياة إلنتاج إنزيم البروتييز من الف ر 150( سرعة الرج 1999وجماعته )

M. anisopliae .

اورو/ اقياة إلنتاج إنزيم 180سرعة الرج معفاد است Kaur (2010) و Dhar أما

. M. anisopliaeمن الف ر Pr2و Pr1البروتييز بنوعيه

اورو/ اقياة 200سرعة رج المأستعمن نف الف ر أع ه بم نزياألأنتج و

(Prakash and padmaja ,2012 . )

اورو/ اقياة إلنتاج أعلى فعالية 150ت سرعة الرج لمعفاد است B. bassainaأما بالنسبة للف ر

( .Rao et al.,2006إلنزيم البروتييز)

اورو/ اقياة هي األفضل في تحايل أعلى فعالية 120وكانت سرعة الرج

Bacillus licheniformis MZK03ي المفرز من البكتريا اعدانزيمية إلنزيم البروتييز الا

(Abu Sayem et al.,2006) .

تأثير األمالح المعدنية 2-7-8

المهمة في تنمية األحياء المجهرية وبالتالي تؤ ر في إنتاجها تعد األم أحد العوامل

( إذ ان وظيفة هذه المعاان في فعاليات األي تكون Rustiguel et al., 2012لألنزيمات )

بصورو رئيسية كمنش ات لألنزيمات كما أنها تعمل على زيااو باتية بع األنزيمات مثل

محاليل منظمة تساعد في المحافظة على الرقم الهيدروجيني للوسط فض عن كونها البروتييز.

و 2Fe+ويمكن إضافتها لألوساط الزرعية على شكل أيونات موجبة ألم غير عضوية مثل

+2Mg 2+وMn 2+وCo ن ــــان الحاجة الى هذه المعاان وتراكيزها تدتلف من كائ، وغيرها


33

د تعوض أو تتضاا أو تسرع من عمل بعضها البع مجهري آلار إذ انه من المعروع عنها ق

;Kumar and Takagi,1999 ;Sevinc and Demirkan ,2011; 1980)السعد ،

Tambekar and Tambekar,2011) .

البوتاسيوم نائية الهيدروجين و فوسفات Kaur (2010) % 0.1و Dhar كل من لمعاست

كلوريد الصوايوم في الوسط المنتج إلنزيم البروتييز %0.05كبريتات المغنسيوم و 0.05%

Pr1 ; وPr2 من الف رM. anisopliae .

غم من فوسفات البوتاسيوم احااية 0.3و NH4SO4غم من كبريتات األمونيوم 2 عملاست

غم كبريتات المغنسيوم 0.5و lCNaكلوريد الصوايوم 0.5و 4HPO2Kالهيدروجين

MgSO4 4غم فوسفات الصوايوم أحااية الهيدروجين 0.2وHPO2Na غم من كلوريد 0.1و

في الوسط اإلنتاجي إلنزيم البروتييز الحامضي من الف ر 2CaClالكالسيوم

R. oligosporus (Abdul Rauf et al., 2010) .

أعلى مستوى إلنتاجه فاد ولل الى A. carbonariusأما أنزيم البروتييز المنتج من الف ر

0.04وبنسبة % lCNaوكلوريد الصوايوم 4FeSOت أم كبريتات الحديدوز عملحينما است

( . Ire et al.,2011على التوالي في وس ه اإلنتاجي) %0.1و

فوسفات %0.5المحلول الملحي المتكون من لمع( فاد است2006عمران وجماعته ) اأم

كبريتات المغنسيوم %0.5كبريتات الحديدوز و 0.05% و البوتاسيوم أحااية الهيدروجين

. .firmus Bبكتريا ي مناعداإلنتاجي إلنزيم البروتييز الا في الوسط O2.7H4MgSOالمائية

ت إلنتاج إنزيم البروتييز واراسة لفاته لمعفاد است Bacillus sp. N-40وبالنسبة للبكتريا

بعد حضنها في ا نان من األوساط اإلنتاجية احدها يحوي على أم كبريتات المغنسيوم

4OMgS 2وكلوريد الكالسيوم %0.01وبنسبةlCCa وفوسفات البوتاسيوم %0.01وبنسبة

%0.02واألار يحوي على كلوريد المغنسيوم بنسبة %0.05أحااية الهيدروجين بنسبة

( .Sevinc and Dermirkan, 2011) %0.04بنسبة CaCl2وكلوريد الكالسيوم

تنقية إنزيم البروتييز 2-7

من اجل اراستها اإلنزيمات مدتلفضرورو عزل وتناية أشارت العديد من الدراسات الى

أو تحديد تتابع األحماض بصورو لحيحة لتوليفها بشكل كامل أو إلنتاجها ألغراض تجارية

( .Saxena et al., 2003 ; Dako et al., 2012)والتركيب ي األبعاا لألنزيم األمينية


34

والفيزيائية لألنزيم ومنها االات ع وتعتمد عملية التناية إلنزيم معين على الدواص الكيموحيوية

في الوزن الجزيئي وكثافة الشحنة وتوزيعها وذائبية األنزيم وتدصصه ل رتباط بمجموعة معينة

(. Burgess,2008واالات ع في الثبات تجاه ارجة الحرارو )

عن وتناية اإلنزيمات عبارو عن سلسلة متتابعة من ال رائل الغرض منها فصل بروتين اإلنزيم

باية بروتينات المستدلص اإلنزيمي الدام وذلك ألجل الحصول على حصيلة عالية

(High recovery( وناتج عالي النااوو )Highly purified end product فض عن )

ة في التناية مستعمل( . وان طرائل الفصل الreproducibilityتحايل اإلنتاجية التكرارية )

والفرز (Ultra centrifugationإما على الحجم متمثلة ب رائل ال را المركزي ) تعتمد

( ، أو تعتمد Gel permeation chromatography( والترشيح اله مي )(Dialysis الغشائي

( ، أو األلفة Ion exchange chromatographyعلى الشحنة كما في التباال اآليوني )

Affinity chromatography كما توجد طرائل أارى للفصل كالترسيب باألم ، ) )

والمذيبات العضوية مثل كبريتات األمونيوم واالسيتون وااليثانول

(Holme and Peck , 1998;Sumantha et al., 2006a; Ali et al., 2010. )

من الد وات المتدرجة والمدروسة والتي يفترض ان تزااا ا لها تتحال التناية عبر مجموعة

الفعالية النوعية لإلنزيم في كل ا وو ، وال يفترض ان تكون هذه الد وات ضمن ترتيب ابت

ولكن تبدأ بالترسيب بالمذيبات العضوية )الكحول اال يلي واالسيتون( أو باألم

أو التركيز بالتجفيد أو الترشيح الفائل وذلك للتدلص من أكبر كمية ممكنة )كبريتات األمونيوم(

من الماء الموجوا ضمن المستدلص اإلنزيمي الدام ومن م تاليص حجمه ورفع كفاءو التناية

( . Kornberg ,1990; 1983)االلي ،

ت العديد من ال رائل في تناية إنزيمات البروتييز من األحياء المجهرية المنتجة لها . فاد لمعاست

المنتج من الف رين Pr2و Pr1( بتناية إنزيم البروتييز بنوعيه 2010وجماعته ) Bhagyaقام

M. anisopliae و الف رB. bassiana طة الترسيب بكبريتات األمونيوم بنسبة إشباع ابوس

مرو . 2.0الديلزو لتصبح عدا مرات تناية االنزيمين استعمال م ب 90%

د ناي بسلسلة من الد وات فا Mucor pusillusاما انزيم البروتييز الحامضي من الف ر

م الترسيب بالكحول األ يلي %85ة كان أولها الترسيب بكبريتات األمونيوم بنسبة إشباع تاليالمت

اله م استعمالالترشيح اله مي بأعابها التجزئة ا ل عموا

Sephadex G-75 المباال المعستألتبـــاال األيوني بوأايرا كروماتوغرافـــيا ا


35

DEAE- Sephadex A-50 وتم الحصول من الد وو األايرو على حصيلة إنزيمية مادارها

55% (Somkuti and Babel,1968 . )

حصيلة انزيمية A. oryzaeأع ت ا وات عملية تناية إنزيم البروتييز الحامضي من الف ر

%1.0وذلك بعد ان مر اإلنزيم بالترسيب باالسيتون وبنسبة إشباع بلغت ما ياارب % 9 مادارها

المباال المعستأني بتوغرافيا التباال األيوكروما م ، جزئة بكبريتات األمونيوم بعد الت

P.cellulose المباال المأستعتوكرافيا التباال األيوني بكروما بعدهاو DEAD- cellulose

( (Davidson et al.,1975 .

( فاد عملوا على تناية إنزيم البروتييز ممن الف ر 1992وجماعته ) Shimizuأما

B.bassiana F18 بد وات متعاقبة بدأت بالترسيب بكبريتات األمونيوم م التباال األيوني

Sephacryl S-100وبعدها بالترشيح اله مي ا ل عموا CM-Toyopearlا ل عموا

. %20.5مرو بحصيلة انزيمية 87.1ليحصلوا على عدا مرات تناية مادارها

حصيلة Trichoderma harizanum ر ت عملية تناية إنزيم البروتييز من الفع وقد أ

ت طرياة لمعمرو وذلك بعد ان است 4.06وعدا مرات تناية بلغت %27إنزيمية مادارها

م طرياة كروماتوغرافيا الترشيح اله مي %60الترسيب بكبريتات األمونيوم بنسبة إشباع

. Phenyl- sepharose (Demarco and Felix,2002) ا ل عموا الفصل

عدو ا وات لتناية إنزيم البروتييز من الف ر المع( من است2002وجماعته ) Benitoتمكن

Penicillium chrysogenum اشتملت على الترسيب بكبريتات األمونيوم وكروماتوكرافيا

( HPLCالتباال اآليوني والترشيح اله مي وكروماتوكرافيا ال باة السائلة عالية الكفاءو)

كيلو االتون. 35زيم بوزن جزيئي ماداره ليحصل على االن

المعزولة من التربة فاد تم تناية أنزيم البروتييز Streptomyces microflarusأما بكتريا

اله م المعب رياة الترسيب بكبريتات االمونيوم م ب رياة الترشيح اله مي باستمنها المتعاال

Sephadex G-75 30.63لتصل عدا مرات التناية الى ( . مروRifaat et al.,2005 . )

Pseudomonasبتناية إنزيم البروتييز المنتج من بكتريا (2010)وجماعته Gaurقام

themaerum 60الترسيب بكبريتات األمونيوم بنسبة إشباع استعمالبد وتين األولى ب%

DEAD- celluloseالمباال استعمالكروماتوكرافيا التباال اآليوني بوالثانية كانت طرياة

مرو. 9.3وقد حصل على عدا مرات تناية بلغت


36

( مرات وفعالية نوعية 10( على عدا مرات تناية بلغت )2011وجماعته عام ) Ireوحصل

لبروتييز عن تنايتهم إلنزيم ا %10.3وحدو/ ملغم بروتين وحصيلة قدرت بـ 485.47مادارها

وقد تضمنت عملية التناية أربع ا وات بدأت A. carbonariusالحامضي المنتج من الف ر

موالري سكروز م كروماتوكرافيا التباال اآليوني ا ل عموا الفصل 4 استعمالبالديلزو ب

Q.Sepharose أعابها كروماتوكرافي التآ ر الهايدروفوبي ا ل عموا

PhenylSepharose Cl-4B الهــــ م استعمالوأاــــيرا الترشـــيح اله مـــــي ب

Sephadex G-100 .

طرياة الترسيب بكبريتات األمونيوم بنسبة إشباع De (2011) و Sharmaكل من استعمل

لتناية إنزيم البروتييز CM-celluloseالمباال استعمالوطرياة الكروماتوكرافيا ب 75%

26وليحص على عدا مرات تناية بلغت A. tamarii [EF661565.1]ي من الف ر اعدالا

. %50مرو وحصيلة إنزيمية بلغت

توصيف إنزيم البروتييز 8 -2

)maxV)( والسرعة القصوى mKتعيين قيم ثابت ميكالس) 2-8-1

ان من األمور المهمة بالنسبة للتفاع ت األنزيمية هو اراسة الثوابت الحركية الدالة بها ،

واحد من الثوابت الحركية المميزو لألنزيم mMichaelis constant (K(ويعد ابت ميكال

ومااو التفاعل ويعرع بأنه تركيز مااو التفاعل التي تصل عندها سرعة التفاعل الى نصف

لعظمى ويعبر عنه بوحدات التركيز . ولتعيين قيمته أهمية كبيرو وذلك ألسباب عدو السرعة ا

( .1991يمكن إاراجها بما يأتي . )الداواي،

الادرو على معرفة الايمة التاريبية لمستوى مااو التفاعل mKتع ي قيمة -1

)المااو األساس( ااال الدلية.

بت ميكال عن الم ئمة النسبية لمواا بديلة لتكون مواا أساس لألنزيم.يعبر ا -2

مادار ابت إلنزيم معين لذا فأن الايمة الرقمية له تعد وسيلة للماارنة بين mKبما أن - 3

األنزيمات من مدتلف الكائنات الحية أو حتى بين األنزيمات من األنسجة المدتلفة للكائن الحي

نفسه.

بسبب المواا العضيدو طرياة لتنظيم فعالية األنزيم. mKيعد التغير في قيم -4


37

يصبح باإلمكان السي رو على ظروع التجربة. mKعندما يتم التعرع على قيمة -5

واطئة mKوتعبر قيمة ابت ميكال عن ألفة األنزيم تجاه مااو التفاعل فاألنزيمات التي لها قيمة

عالية. mKلمااو كبيرو( تبدي نشاطا أعلى من تلك التي لها قيمة )أي األلفة نحو ا

(Holme and Peck, 1998 . )

( فتعرع بأنها أقصى سرعة يصل إليها التفاعل في maxVأما فيما يتعلل بالسرعة الاصوى )

ةمستعمللا( بكمية اإلنزيم maxVالظروع التي يجرى فيها التفاعل ، وترتبط قيمة )

(Segel, 1976. )

يمات البروتييز المنتجة من مدتلف األحياء ن الباحثين بدراسة الثوابت الحركية ألنزمقام العديد

ملي مول 0.16بلغت maxVو mK( ان قيمتي 2002وجماعته ) Barata فاد وجدالمجهرية ،

like -Trypsinإلنزيم البروتييز التربسينيعلى التوالي 1-مايكرومول )اقياة. ملغم( 0.60و

protease والمناى من الف رFusarium oxysporum المعوباست (BApNA Benzoyl-Arginyl-p-NitroAmide, ) .كمااو تفاعل

كمااو تفاعل وجد ان قيمة ابت ميكال pNA-Phe-Pro-2(Ala)-Suc الببتيد استعمالوب

mK إلنزيم البروتييز المناى من الف رClonostachys rosea ملي مولر 1.45بلغت

(Zhao et al.,2005. )

تساوي maxVفاد وجد ان قيمة sp Beauveria.وبالنسبة إلنزيم البروتييز المنتج من الف ر

الكازائين كمااو تفاعل استعمالملغم/مل وب 5.1تساوي mK وحدو/ مل وقيمة 29.67

(Shankar et al., 2011).

استعمالعلى التوالي وب( ملغم/ دقيقة ,19.9و 2.6) maxV و mKوبلغت قيمة كل من

( لتوليف b 2006وجماعته ) Sumanthaالكازائين كمااو تفاعل في الدراسة التي قام بها

قام به بحثففي ، R. microsporumإنزيم البروتييز المناى جزئيا من الف ر

Muthulakshmi ( لتوليف إنزيم البروتييز من الف ر 2011وجماعته )A. flavus بلغت

مااو ندالة استعمالوحدو / ملغم على التوالي وذلك ب maxV 60 و ملغم/مل mK 0.6 قيمة

تفاعل.الحن ة كمااو


38

تخصص اإلنزيم حيال مادة التفاعل 2-8-2

ث العلمية ابحاألالمهمة التي تاوم عليها تعد اراسة التدصص اإلنزيمي واحدا من األهداع

الدالة باألنزيمات وذلك لما له من أهمية في مجال ت بياه في المجال الصناعي

(Muthulakshmi etal., 2011 . )

التي تبديها األنزيمات مع مواا التفاعل )األساس( تكون متفاوتة ، إذ ان هناك أن ارجة التدصص

إنزيمات تكون فعالة مع مااو تفاعل واحدو أو عدا محدا من مواا تفاعل معينة بينما هنالك

إنزيمات تتفاعل مع مدى واسع من مواا التفاعل، ويبدي إنزيم البروتييز الااعدي مدى واسع من

اا التفاعل المدتلفة سواء كانت طبيعية أو لناعيةالتدصص تجاه مو

أبدى إنزيم البروتييز المناى من الف ر ( Nirmal et al.,2011; 1987)فليح ،

B. bassiana F18 فعالية فعالية ضعيفة حيال بروتين الفايبرينوجين والكلوبيولين وكانت أعلى

( .Shimizu et al.,1992له حيال بروتين االي ستين يليه الكازائين والبومين المصل الباري )

رــــــــــ( ان ألنزيــم البروتييـــز المناــى مـــن الفـــــ 2005وجماعـــته ) Zhaoوأوضـــح

Clonostachys rosea الاـــابليـــة عــلى تحــلــيل الكازائــين والجــي تين والـAzocoll

إضافة الى كيوكتل النيماتواا . Suc-Ala- Ala- Pro- Phe- pNAوالببتيد

Monacrosporiumفي اراسة لتوليف إنزيم البروتييز السيريني والمناى من الف ر و

cystosporium بينYang ( ان اإلنزيم أبدى تدصصية عالية وأحيانا 2008وجماعته )

ضعيفة تجاه بع البروتينات ال بيعية والببتيدات المتعداو اذ بلغت الفعالية النسبية حيال

ل كالكازائين والجي تين والبومين المصل الباري والكوالجين والكوالجين الممسوخ وكيوت

(% على التوالي ، أما عن بيان 8.1و 23.5و 3.8و 81.8و 17.7و 1.0النيماتواا )

تدصصيته تجاه بع الببيدات المتعداو فاد بلغت الفعالية النسبية تجاه الببيتيد

Suc-Ala- Ala- Pro- Phe- pNA والببيتيدSuc- Ala - Ala - Pro -Leu - pNA

(% على التوالي. 0.8و 63و Suc- Gly- Gly- Phe- pNA (100 والببتيد

تأثير درجة الحرارة في ثبات األنزيم 2-8-3

في تنشيط أو تثبيط اإلنزيمات وتزااا الفعالية األنزيمية كلما ا متمتلك ارجة الحرارو اورا مه


39

ازااات ارجة حرارو التفاعل وقد تصل في بع األحيان الى الدرجة الحرارية التي تسبب تغير

;denaturation) )(Abu Sayem et al.,2006 مـالة ال بيعية لألنزيـالح

Bisswanger,2008) .

يمتلك كل إنزيم ارجة حرارو مثلى ألقصى فعالية له ، وان الثبات الحراري

الزمنية للحضن لألنزيم يعتمد على عوامل عدو منها طبيعة بروتين األنزيم والفترو

وتركيز المااو األساس وألفة األنزيم للتداال مع المااو األساس والرقم

الهيدروجيني للمحلول المنظم ووجوا المنش ات والمثب ات

(Whitaker, 1972; Fullbrook, 1983; Abu Sayem et al.,2006 ).

( ان إنزيم البروتييز المفرز والمناى من الف ر 2008وجماعته ) Yangأشار

Monacrosporium cystosporium 30م وألكثر من 56احتفظ بأعلى فعالية له عند ارجة

م 70اقياة م بدأ باالندفاض التدريجي الى ان فاد كامل فعاليته عند ارجات الحرارو األعلى من

( ان إنزيم البروتييز المنتج من 2009وجماعته ) Merheb-Diniبين كما اقياة فاط. 30وا ل

احتفظ م ولمدو ساعة إذ 65 ن ابتا حراريا لغاية كا Thermoascus auranticus الف ر

من فعاليته. %75 بأكثر من

( ان ارجة الحرارو المثلى لثبات إنزيم البروتييز 2011وجماعته ) Muthulakshmiوجد

. م 50كانت A. flavusالمناى من الف ر

بكامل فعاليته وألكثر B. subtilis PE-11احتفظ إنزيم البروتييز السيريني المناى من البكتريا

م م بدأ باالندفاض التدريجي حتى فاد كامل فعاليته عند 60اقياة عند ارجة حرارو 350من

( . Adinarayana et al.,2003اقياة من الحضن ) 100م وا ل 80ارجة حرارو

تأثير الرقم الهيدروجيني في فعالية األنزيم 2-8-4

إنزيم رقم هيدروجيني يدعى الرقم الهيدروجيني األمثل والذي تكون عنده فعالية يوجد لكل

ونوع المحلول وارجة الحرارو وتركيز والذي يعتمد على الاوو األيونية اإلنزيم بدرجتها الاصوى

ان (Aehle, 2004 ; 1986 ، )االلي Coenzymeكل من مااو التفاعل والمرافل اإلنزيمي

لرقم الهيدروجيني سوع يؤ ر تأ يرا كبيرا على الصفات اآليونية للمجاميع األمينية أي تغير في ا

والكاريوكسيلية الموجواو في جزيئة بروتين األنزيم وبالتالي سوع تؤ ر على الموقع أو المواقع

الفعالة لألنزيم وكذلك على هيئة وشكل البروتين هذا باإلضافة الى ان الايم العالية أو الواطئة


40

نوعا ما للرقم الهيدروجيني سوع تؤاي الى مسخ بروتين األنزيم ومن م اإلق ل من فعاليته

(. 1986)االلي،

( الى ان الفعالية المثلى ألنزيم البروتييز المناى من الف ر 2005وجماعته ) Yangأشار

Lecanicillium psalliotae الرقم في حين بلغت عند ، 10كانت عند الرقم الهيدروجيني

B. bassiana أعلى فعالية ألنزيم البروتييز المناى من الف ر 8.5الهيدروجيني

(Bidochka and Khachatourians,1987) .

من ان الفعالية المثلى إلنزيم البروتييز المنتج والمناى

,Trichoderma harzianum (2002 (DeMacro and felix الف ــريـــات

و Fusarium oxysporum var. lini (Barata etal.,2002) و

Dactylellina varietas (Yang etal.,2007a) وTrichoderma ressei QM9414

(Dienes etal.,2007) و B. bassiana (Namasivayam etal.,2010) على التوالي

. 8كانت عند الرقم الهيدروجيني

ي المنتج والمناى من اعدليبلغ عنده إنزيم البروتييز الاهو األمثل 10وكان الرقم الهيدروجيني

( . Ahmed et al.,2011أقصى فعالية له ) B. subtilisبكتريا

تأثير الرقم الهيدروجيني في ثبات اإلنزيم 2-8-5

يعد الرقم الهيدروجيني األمثل لثبات األنزيم من الصفات المهمة ألي إنزيم إذ يعتمد هذا

الرقم ألنزيم معين على عوامل عدو منها ارجة الحرارو والاوو األيونية وال بيعة الكيميائية

للمحلول المنظم وتركيز كل من مااو التفاعل واإلنزيم وال بيعة الكيميائية للمحلول المنظم

ركيز كل من مااو التفاعل واإلنزيم باإلضافة الى تراكيز المنش ات والمثب ات و المواا وت

( . Segel, 1976;1991الحافظة مثل )الكلسيرين ومركبات السلفهايدريل( )الداواي

( المناى من Trypsin like- proteaseان إنزيم البروتييز ) (2005)وجماعته Hattoriبين

بين نحصر ابتا عند رقم هيدروجيني ي كان Cordyceps militarisالف ر

فكان ابتا A. carbonarius( أما إنزيم البروتييز الحامضي المناى من الف ر 8.5-12)

( % من فعاليته 84و 92و 85و 93واحتفظ بـ ) 3بالظروع الحامضية عند رقم هيدروجيني

( على التوالي . 12و 11و 10و 2الهيدروجيني ) النسبية عند الرقم


41

الهققم الييهدقوجي ل لاتهان ي هايم التقوتييها الم قه مه ( فقهد ادهد ا 2009وجماعته ) Wangاما

دقيقهة 120( ع هد ضمه لمهد 6-5يقه مهم المهد ) Hirsutella rhossiliensisالفطهق

. المد ع د ضم ل فس 7و 4م فعاليت ع د الققمي الييدقوجي ي % 20ته ولد يضتفظ فقط Bacillus strain( ان إنزيم البروتييز المناى من بكتريا 2009وجماعته ) Almasذكر

SAL1 ولمدو ساعة 10 -7 بين صرحنقم هيدروجيني يكان ابتا عند ر .

بعض األيونات والمواد الكيميائية في فعالية األنزيم تأثير 2-8-6

ا الى وجوا أيونات معدنية والتي حتاج الكثير منهتلكي تؤاي اإلنزيمات نشاطها الحفزي

أو مجاميع تعويضية متصلة cofactorsا كمرافاات إنزيمية عمل معظمهت

prosthetic groups (Singh et al., 2007a ) .

وتعمل بع األيونات كمواا مثب ة لعمل اإلنزيم ، وتعد اراسة مثب ات اإلنزيم ذات أهمية

كبيرو كونها تع ي الفهم الدقيل عن طبيعة اإلنزيم ومت لباته للعوامل المساعدو وطبيعة الموقع

( . Usharani and Muthuraj , 2010 ; Barreh ,1977 الفعال )

ي المناى من الف ر اعدان إنزيم البروتييز الا De ((2011و Sharma وجد كل من

][EF661565.1 tamarii A. يثبط بشدو بوجوا مااوPMSF 2+وكل من أيونات الزئبلHg

2Mg+والمغنسيوم 2Zn+في حين كان أليوني الدارلين 2Ca+و الكالسيوم 2Co+والكوبلت

على %130و %120ملي مولر إذ بلغت الفعالية اإلنزيمية 5تأ يرا حا ا لألنزيم عند التركيز

التوالي.

ولر وجد ان إنزيم ملي م 5وفي اراسة لتأ ير بع األيونات المعدنية والمثب ات عند التركيز

ات النحاس يثبط بوجوا كل من أيون .niger Aي المفرز والمناى من الف ر اعدالبروتييز الا

+2Cu 2+والزئبلHg 2+والزنكZn 2+والكوبلتCo ومااوPMSF واليوريا و

، في حين كان أليون الكالسيوم تأ يرا حا ا لألنزيم اذ بلغت المركابتوايثانول والصوايوم آزايد

( . Devi et al.,2008) %105.3الفعالية اإلنزيمية

A. carbonariusوفي اراسة أارى لدصائص إنزيم البروتييز الحامضي والمناى من الف ر

تأ يرا حا ا طفيفا في 2Ba+والباريوم 1K+ان أليونات البوتاسيوم ( 2011وجماعته ) Ireوجد

تأ يرا حا ا متوس ا بنسبة 2Zn+والزنك 2Ca+الفعالية األنزيمية بينما كان أليوني الكالسيوم

تأ يرا حا ا قويا إذ بلغت الفعالية النسبية 2Cu+والنحاس 2Fe+وكان أليوني الحديدوز 14.28%


42

لغت الفعالية على التوالي وكان أليون المنغنيز التأ ير الحاث األقوى إذ ب %250و 357%

أي تأ ير يذكر على 2Sr+رانتيوم والست 2Mg+ولم يكن أليوني المغنسيوم . % 971.43النسبية

2Co+والكوبلت 1Na+بينما كان أليونات الصوايوم ملي مولر. 5التركيز الفعالية اإلنزيمية عند

(% على 39.71و5.44و 51تأ يرا تثبي يا في الفعالية اإلنزيمية وبنسبة ) 2Hg+والزئبل

التوالي.

إنزيم البروتييز المناى جزئيا من الف ر( الى ان b 2006 وجماعته ) Sumanthaأشار

R. microsporum NRRL3671 ز مما يدل انه زا قويا بوجوا كبريتات المنغنييتحفز تحفي

زي ، كذلك وجد ان هذا اإلنزيم حفلنشاطه ال 2Mn+بروتييز معدني يت لب وجوا أيون المنغنيز

وكبريتات الحديد. DTTالـ مول/ لتر من 0.1ثبط ويفاد كامل فعاليته بوجوا ي

الفصل الثالث

Materials and Methods املواد و طرائق العمل الفصل الثالث

43

ة لمعالمستواألدوات المواد واألجهزة 3-1

ة والشركات المصنعة لها لمعالمواد الكيميائية المست 3-1-1

الشركة المصنعة اسم المادة

6O12H6(C AFCO / India(الكلوكوز

BDH والكلوروفورم 3CO2(Na(وكاربونات الصوديوم المركابتوايثانول

وحامض البوريك 4(NH(Clو كلوريد االمونيوم MgSO)O)2.7H4كبريتات المغنيسيوم المائية )3BO3(H 4وكبريتات االمونيومSO2)4(NH و كلوريد الزئبق)2(HgCl و كلوريد الكالسيوم)2(CaCl

( وترترات Ureaواليوريا ) 2.2H8O2Na2N14H10(C(EDTA Oوالـ MnCl)2(و كلوريد المنغنيز الصوديوم البوتاسيوم

CARLO ERBA

Fluka-UK (pNP)مادة بارانيتروفينول

PMSFوالـ Tris)-(baseوالترس القاعدي KH)4PO2(فوسفات البوتاسيوم ثنائية الهيدروجين (S2ClO7H7C)

Fluka-Switzerland

GFS-chemicals-Germany (HCl)حامض الهيدروكلوريك

و االيثانول المطلق 4PO3(H(و حامض الفسفوريك CH)COOH)3حامض الخليك الثلجي OH)5H2(C HAZARD-UK

( ومستخلص Peptonوالببتون )( BSAوألبومين المصل البقري) (PDA) أكار ديكستروز البطاطا والـ MgCl)2المغنيسيوم )( وكلوريد Gelatin( والجيالتين )Yeast extractالخميرة )

Iodoacetamide (INO4H2(C ومادةglucosaminide-D-βacetyl -Nitrophenyl N- p )8O2N18H14(C و زيت الزيتونOlive Oil وMannitol Salt agar وNutrient broth وتوين

80

HIMEDIA / India

DEAE-Cellulose Pharmacia / Swedenالمبادل

Sephadex G-150 Pharmacia / Swedenالهالم

Trichloroacetic acid 2(حامض الخليك ثالثي كلوروOl3HC2(C Sd fine-Chem limited /

Mumbai

SIGMA-ALDRICH (Coomasie Brilliant Blue G-250)صبغة الكوماسي الزرقاء

THOMAS BAKER (NaCl)و كلوريد الصوديوم (NaOH)هيدروكسيد الصوديوم

WINLAB-LIMITED-UK ( Casein) الكازائين


44

و الشركات المصنعة لها المستعملة األجهزة 3-1-2

الشركة المصنعة اسم الجهاز

UV-Visible) فوق البنفسجية -جهاز المطياف الضوئي ذو األشعة المرئية

Spectrophotometer) Chromtech- Taiwan

Fisher Scientific-Germany (Incubator)حاضنة

GFL-Germany (Distiller)جهاز تقطير

حمام مائي مبرد بالماء الدائر

(Cooling Circulating Water Bath)

HAAKE -Germany

Hettich-Germany (Centrifuge)جهاز طرد مركزي

Hettich-Germany (Cooling Centrifuge)جهاز طرد مركزي مبرد

Human-Germany (Micropipettes)ماصات دقيقة

Japan (Vacuum pump)مضخة تفريغ

Jeio-Tech-Korea (Laminar flow cabinet)هود بايولوجي

حمام مائي هزاز

(Reciprocal Shaker Water Bath)

Julabo SW23-Germany

Labtech-Korea (Shaker Incubator)حاضنة هزازة

مزج ذو الصفيحة الساخنة جهاز

(Hot-Plate Magnetic Stirrer)

Labtech-Korea

LG-Korea (Refrigerator)ثالجة

Marienfeld-Germany (Haemocytometer)شريحة العد المجهري

Mauritius-Germany (pH-meter)جهاز قياس الرقم الهيدروجيني

Motic-Germany (Microscope)مجهر ضوئي

Sartorius-Germany (Sensitive Balance)حساس ميزان

Tafesa-Germany (Water Bath)حمام مائي

Tudor-Korea (Spectrophotometer)جهاز المطياف الضوئي

YX-280B-China (Autoclave)مؤصدة


45

طرائق العمل 3-2

حشـرة دودة الشـما الكبـر حيـاة دوار أفـي M. anisopliaeالتـثثير الحيـوي للفطـر 3-2-1G. mellonella

G. mellonella ( L. ) مستعمرة دودة الشما الكبر إعداد 3-2-1-1

دادة الشتتما الرىت ض عتتب لتا ىالماتمتتا متا متتةا الت ىيتت لت يتت لي قا األطتاا مختلتت جمعت ىاساط جمع الي قا . ي رلي الت ىي للىنا / جامع الرا المميأة لما ي مختى الحش ا

ممطتتاة ىقمتتات التتتا 3 ستت 800حجتت ىىبستتتيري الت ىيتت ا تتي قنتتاني قنتتاني تتي ااعتتع ملقتتط ايتا ( 3 ) اط التى يتد ىعتد اعتعي تي المجمتدة لمتدةستىا لقت شما نح دارا امةادة ىقطا ما ثت نقلت .( 2011 رت ي ؛ 2007تقتي ) لم ض تمذيت الي قتا ( ° 7 تت للى د ج ح ا ة )

الم ض الحصا للى مة ل دائمي نقي نقل العذا ض .ت م اقىتما لحيا التعذ الى المختى ا× 30× 30أىعتتاد قةتتخ خشتتىياطىتتاب ىتتت ت مةتاحتت ااعتتع داختت ااعتتع تتي .الحديثتت

يمتتتا ىقيتتت الااجمتتتا التتتتا متتتتي األماميتتت متتتا قمتتتات ااجقالتتتدة القةتتتخ متتتا الخشتتت ا ستتت 30 تي ستق القةتخ اعتام اقى العذا ض لحيا خت ا الىالمتا ثت ت . صنع ما السلك المشىك

ااعا .الىيض لاعا اھاتحةيةلتمذي الىالما % 10ىمحلا سر ت مشىاالقطا قطا ما الستال 24داخ القةخ قطتا متا التا ب المقتاض لمت ض اعتا الىتيض لليمتا جمتا الىتيض رت

قتتد ي قتتي المتت ض تميئتت األلتتداد الرا يتت متتا رتت طتتا لمتت ض اجتت ات التجتتا البحقتت لليتتي االستاىا ال اىتا امتا الطتا ياالداد را ي متا الىيتاض للحصتا للتى الطتا الي قتي األا لةل

قنانير منما للتج ى اذلك ىعة ألداد را ي ما ي قا الطا الذت سىقي ااععما ي أ قد ي اللحصتتتا للتتتى التتتدا الت ىيتتت ام اقىتمتتتا لحتتتيا اونستتتبط ااصتتتالما الطتتتا المطلتتتا للتج ىتتت

العتتذ ت قتتد لةلتت التتداد را يتت متتا ي قتتا الطتتا الستتاىا تتي قنتتاني الت ىيتت اتتت م اقىتمتتا لحتتيا ذ اولتتتداد الرا يتتت وجتتت ات التجتتتا تتتي حتتتيا ت رتتت األختتت ض ألرمتتتا دا العتتتذ ات التعتتتذ ااختتت

اخ ا الىالما الةتي االتي جمع لم ض اج ات التجا لليما ايعا.

البحثفي المستعملة العزلة الفطرية 3-2-1-2

تت الحصتا لليمتا Metarhizium anisopliaeلةل ما الةطت الىحث ي ذا ل ماستع ما قست للتا الحيتاة / رليت العلتا / جامعت القادستي انشتط العةلت للتى الاستط الة لتي ارتا

للتتى 5.6( ذت التت ق الميتتد اجيني ,PDA Potato Dextrose Agarدرستتت اة الىطاطتتا ) ايا . 10 – 7المدة 28د ج ح ا ة


46

M.anisopliaeللفطر بوغيتحضير المعلق ال 3-2-1-3

Sabouraud Dextrose Broth (SDB) بتنميق الطرقر ىلقس ق البقغي المعلق حضر

مق مققل الغ قق الم ققتعم ا حضققن الم قىقق 150مقق بماقق اق 250فق و ق جاقق ا ققعت

أي م ك ن ترج يغمي لتغجيع النمغ الطرري ثم قشح بغ ط قرع 7م لم ة 25ب قا حراقة

مقق مققل الراشقق ققع ىلققس شققريح ىقق كريقق ح القق م الحمققر المحققغقة 1مققل الشقق ا ذ ا قق

Improved Neubauer Haemocytometer لتاقق ير ىقق و اغبققغاو لةقق حقق ة ح ققم حيقق

ح ب ى و اغبغاو ف ك مربع مقل المربعق ح اغقبعق الةبيقرة المغاقغوة فق أقكق ح الشقريح ذ

بع ذلك ق م ى وھ الةل ىلس أقبع للحصغل ىلس مع ل اغبغاو ف المربع الغاح ذ ثقم قر

المعلق مق مقل 1( للحصقغل ىلقس ىق و اغبقغاو فق )ى م التحغي للح م 104×1ھ ا الن تج ف

)بغو/مقققققققققققق ( 7 10× 1ا حيقققققققققققق تققققققققققققم الحصققققققققققققغل ىلققققققققققققس تركيقققققققققققق البققققققققققققغي

(Goettel and Inglis,1997) لغقر الحصقغل ىلقس تركيق اقق مقل ذلقك طباق المع ولق

: (Lacey,1997)اآلتي

= اسااسي)مل( المأخوذ من المعلق األجم الحالتركي المرلغ

تركي المعل اغ

مق مقل 100ثم يضر النق تج فق ح قم المعلق المرلقغ تحضقيرث ذ فمقصو للحصقغل ىلقس

نرب المع ول ا 106×1المعل بتركي

= اغغذ مل المعل ح م )م ( المأ 610×1710×1

م ا 10= 100× 1ا0=

100م م ء مارقر معاقم مكم لق إلقس 90 يض ف إلي اغ م مل المعل 10 ىلي يؤ

كمق وة Tween 80بغو/م ذ ثقم أ قيط بضقع قرقراح مقل 106 ×1م للحصغل ىلس تركي

(ا105×1 104×1ن شرة ھة ا حضرح التراكي )

M. anisopliae الخام للفطر المزرعة راشحتحضير 3-2-1-4

مقق 250ق ققع ا جع فقق و Sabouraud Dextrose Broth (SDB) حضققر قق

أيق م ا 7 م مقل م قىق الطرقر بعمقر 5ا0م لل ق لا الغ بأقراص قررھ 150بما اق

الترشققي ب ققت ام قققق م لمقق ة أ ققبغىيل بعقق ھ تققم 2 + 25حضققن القق اق ب قاقق حققراقة

بامع ب نر بم ى ة اه ج تطريغ الهغاء اىي الترشي ب ت ام Whatman (No.1)ترشي

ىق الراشق الط ير ق ح مقل البةتريق الملغثق الم قىق قاش لتعايم µ 0.22 المرش ال قي

%75 %50 %25الت ققققققققققققققققققق في منققققققققققققققققققق حضقققققققققققققققققققرح %100بتركيققققققققققققققققققق

(Singh and Prakash,2010) ا


47

Bioassayاالختبار الحيوي 3-2-1-5

A - لفطقر البقوغي لمعلقق لل ةالحيوي اتاالختبارM. anisopliae الشقم عثقةفقي ادوار حيقاة

G. mellonellaالكبرى

االختبار الحيوي في البيوض -1

ىيعتت 100 عتتددى إنتتاث دادة الشتتما الرىتت ضاعتتعتي أاستتال ىعتتد 24ختتذ الىتتيض ىعمتت أ القطتا الرا تانيت الحاايت للتى ااعتع ىعد اا ت حسا لدد الىيض تحت المجمت لر مر

المعلتبمت متا رت ت ريتة متا ت اريتة 5س ش الىياض ىتت 9ىت ت قط أطىاب ي الىيضست تق يىتا . رت التج ىت ثتبث مت ا لرت 15شت يدايت نفيةت متا ا تةتا ىاستاط م الىاغي شت ىالمتات المقطت المعقت . تت م اقىت قتد معامل السيط ة التي تحتات للى ىيتاض .أما ت رية

. مبكالىيض لحيا الةقس احسى نسى ال

الثالثةاليرقية األطواراالختبار الحيوي في -2

الثبثتت )اوا اال اىتتا االستتاىا (الي قيتت األطتتاا الحيتتات لمعلتتب الةطتت تتي تتتأثي اللد استت الرت ت ريتة ىصتا ة منةصتل )رتب للتى حتدة( الثبثت األطتاا ي ق متا رت طتا متا 40 أخذ

م ما ر ت رية متا ت اريتة 20منما تحتات للى ىع أ خمس ما اطىاب ىت تااةل للى لتدا ي قتا تحتات للى مات مقط معق قط )معامل السيط ة( المدة دقيقتلخامسا أماالمعلب

معاملتت قتتط الطتتا اوا ال. ثتت نقلتت ي قتتا الطتتا األا قتتد تتت شتتما رمتتا تتي معاملتت الىتتيض)قطتا متا الشتما ( غذات ي قا معقت تحات س 9اطىاب ىت ت ىقط إلىىاساط شاة نالم اىتتا االستتاىا قتتد تتت نقلمتتا التتى قنتتاني ىبستتتيري معقمتت امتتةادة ىقطتتا الشتتما امتتا ي قتتا الطتتا ال

ا تت ة 2 + 25الحاايت للتى الي قتا المعاملت تي الحاعتن ىد جت األطىتاب حعن للتمذي ستتتتى نستتتتى المتتتتبك 14:10 (L/D)عتتتتائي متتتتا المعاملتتتت ستتتتال 120ا72ا24ختتتتب . ثتتتت ح

(Skrobek et al,2008) تتتتحح القتتتتي Orell and Shneiderحستتتت معادلتتتت ىاص (1993)شعىاا االمبح

نسى المبك ي المعامل −نسى المبك ي السيط ةالمبك المصحح = %𝟏𝟎𝟎−نسى المبك ي السيط ة

× 100

االختبار الحيوي في دور العذراء -3

تتي أستتتعم لمتتا ا اىعتتدد مستتاا ستتاىرتتا متتا ي قتا الطتتا ال لةلت لتتذا ض ىعتتد انستتبط لتتدد مذاتستثنات لد إعا الأى 2 ط يق اوختىا ذاتما ي الةق ة طىق الي قي رما األطاا تج ى


48

تت م اقىت العتذا ض لحتيا المعامب ىقمات التتا تحستىا لفمتا الىالمتا قنانيام الاة تمطي . 2. اصحح القي رما ي الةق ة نسى المبكاحسىتحالما الى ىالما

االختبار الحيوي في البالغات -4

ستتتتتتع قنتتتتتتانيلتتتتتت الدائميتتتتتت ااعتتتتتتع تتتتتتي ة عتتتتتتذا ض متتتتتتا المالرا يتتتتتت متتتتتتا لتتتتتتدادأ أختتتتتتذ ىالمتتا ( متتا 10ىالمتتا . اةلتت ) إلتتى حتتتى تحالمتتا ا تمتتا ىقمتتات التتتا ممطتتاة 3 ستت 800

ممطتاة ىقطعت متا قمتات التتا ا ت رت 3 ست 800 ي قناني ىبستيري سع ااإلناثالذرا امتا ثت الىتاغي المعلتبىعد لمت ثقت يستمر ىت ت س تق يىا 15ما ا تةا ايدمر ىم ش ي

يمتتتا شتتت معاملتتت الستتتيط ة ىالمتتتات المقطتتت المعقتتت . نقلتتت يتتتت اغبقتتتي ثانيتتتا ىعتتتد انتمتتتات التتت ت ممطتتاة ىقمتتات التتتا ااعتتا تتي الب تتا 3 ستت 800قنتتاني ىبستتتيري ستتع إلتتىالىالمتتا المعاملتت

ر ذ التج ى ثبث م ا لرت ت ريتة امثلمتا لمعاملت %10 قطن مشىع ىمحلا سر تستى )2الةقت ة ) يالتذر تالمتا ة ا ي الف ا نةسمالسيط ة . حعن القناني نستى المتبك . ح

.رما ي الةق ة ساىق الذر ايا . ص حح قي المبك 7 ياميا المدة

B – لفطقر لالخقام المزرعقة راشقحل ةالحيوي اتاالختبارM. anisopliae عثقةفقي ادوار حيقاة

G. mellonellaالشم الكبرى

في البيوض M. anisopliae الخام للفطر المزرعة راشحثير أت -1

مقل الطاقرة 1 الت في المحضرة م با اتبعق الررياق نط قه المق كغقة فق الطاقرة )لمع تأ

A )ا

في األطوار اليرقية الثالثة M. anisopliae الخام للفطر المزرعة راشحثير أت - 2

مقل الطاقرة 2 اتبعق الررياق نط قه المق كغقة فق الطاقرة ) م با الت في المحضرة لمع تأ

A نط ال كراآاي م ذ صحح قيم الهوك كم ف الطارة 3( ح ب ن ب الهوك يغمي لم ة

في دور العذراء M. anisopliae الخام للفطر المزرعة راشحثير أت - 3

اتبعق الررياق نط قه المق كغقة فق الطاقرة 4-1-2-3الت في المحضرة ف الطارة لمع تأ

( ا Aمل الطارة 3)


49

ة الشم عثفي بالغات M. anisopliaeالخام للفطر المزرعة راشحتأثير -4

( Aمقل الطاققرة 4 اتبعق الررياق نط قه المق كغقة فق الطاقرة )الت ق في المحضقرة قتعمل أ

أي م ذ صحح قيم الهوك ب لرريا نط ه أيض اح ب ن ب الهوك يغمي لم ة ثوث

M. anisopliae التحري عن عوامل الضراوة للفطر 3-2-2

التق ي قت مه M. anisopliae ھم ىغام الضرا ة المنت مل الطرقرأتم التحري ىل

فضو ىل بعض إن يم ح البر تيي الويبي الة يتيني الطرر ى وة ف اص ب الحشرة ذ شمل

ارح آليق تحضير ا ط انت اي م تلط معام ذ ي ء الم هري ا ق ا تل م ذلكمض واح االح

)البق قة( ح المتحصق ىليق فق ال رقغة الت ليق تم تلاي االنتق ج ب للاق انت ج ھ ث العغام بأح

و قة / 150 تقم الحضقل ب لح قن الهق اجة ب قرى قج مل ح م الغ 6 % بن ب ما اقھ

ى ذ بع إنته ء مق ة الحضقل يقتم ترشقي الغ ق لطصق 72م لم ة 28وقيا ب قا حراقة

الةتل الحيغي ىل قاش الم قى ال ي تم أ ت ام ف تاق ير ىغامق الضقرا ة المقراو وقا قته

لنغىيقق لعغامقق الضققرا ة االن يميقق اذ اح الطع ليقق فضققو ىققل تاقق ير البققر تيل لح قق الطع ليقق ا

النغىي اىتم ح ماي لتح ي افض انت ج مل ھ ث اغن يم ح ا

Seed Cultureتحضير اللقاح )البذرة ( 3-2-3

اخميت ة الخىتة حست رت متا الرلارتاة االىىتتاا أستتعم »الىذ ة » لتحعي اسط اللقاح غتت 2متتا ىعتتض التحتتاي اذلتتك ى ذاىتت & Kaur Dhar 2010)الط يقتت الماصتتا متتا قىتت )

غ مستخلخ الخمي ة ي رمي ما المات المقط اىعد إتمتا األذاىت 1غ ىىتاا ا 1رلاراة امتتتدة ل 121متتت ىالمتتتات المقطتتت اتتتت تعقيمتتتي ىالمةصتتتدة ىد جتتت حتتت ا ة 100أرمتتت الحجتتت إلتتتى

M. anisopliae دقيقتتت . لقتتتر الاستتتط المحعتتت ألتتتب ىقتتت خ ااحتتتد متتتا لةلتتت الةطتتت 15ستىا / مت متا الاستط إذ تت حستا لتدد الستىا ا 7 10 × 1] يحتات القت خ الااحتد للتى

المىت دة ( [ احعتا الاستط تي الحاعتن Haemocytometerىاستخدا ش يح العد المجم ت ) . سال 72لمدة 28 / دقيق اللى د ج ح ا ةدا ة 150 المةاةة ىس ل

ةلمية المستعط اإلنتاجاوساأل 3-2-4وهي M. anisopliae الفطر عوامل ضراوةاوساط انتاجية للتحري عن ثالثة تم تحضير

-كما يلي :


50

Casein mediaوسط الحد األدنى المدعم بالكازائين -1

غيم 0.05و ثنائيية اليييدروجينمن فوسفات البوتاسييوم غم 0.1حضر هذا الوسط بأذابة

في كمية من الكازائين غم من 1و كلوريد الصوديوم غم من 0.25كبريتات المغنيسيوم و من

اكمل الحجم الى ثم 6.5ل د ال ق الميد اجيني إلى تمام االذابة ليذه المواد االماء المقطر وبعد

دقيقية 15 لميدة 121عليى درجية حيرارة الماء المقطير عقميت فيي جيياز الم صيدة ب مل 100

حيرارة الغرفية لتييئتييا لعمليية درجية وبعد انتيياء عمليية التعقييم اترجيت اليدوارد وبيردت اليى

.( ,2010Dhar and Kaur) التلقيح Colloidal chitinالكايتين الغروي ب الحد األدنى المدعموسط -2

والييدروجين ثنائيةمن فوسفات البوتاسيوم غم 0.1ر هذا الوسط بأذابة يحضتم ت

الكايتين من غم 1كلوريد الصوديوم و غم من0.25كبريتات المغنيسيوم و غم من 0.05

ث ل د ال ق الميد اجيني تمام االذابة ليذه المواد افي كمية من الماء المقطر وبعد الغروي .( ,2010Dhar and Kaur) ارم الحج الق الاسط رما ي الةق ة الساىق

الحيوية مضادات الوسط انتاج -3

0.02 و Bactopeptonباكتوببتون غم 0.75 و مالتوزغم 2.5باذابة هذا الوسط حضر

الماء المقطر وبعد تمام االذابة كمية منكلوكوز في غم 0.43 و B-alanineاالنين –بيتا غم

ث ارم الحج الق الاسط رما ي الةق ة الساىق ل د ال ق الميد اجيني ليذه المواد (2000 Liu etal.,) .

الفطرالمنتجة من المضادات الحيويةوالتحري عن األنزيمات 3-2-5

M. anisopliae

والاليبيز في كل من االوساط االنتاجية و الكايتنيز تم التحري عن كل من االنزيمات البروتييز مضادات الوكذلك التحري عن انفراد(وكال على )( 4-2-3الثالثة االولى الواردة في الفقرة )

. الحيويةمضادات الوسط انتاج عن فضال االوساط األنتاجية الثالثة في كل من الحيوية

التحري عن انزيم البروتييز 3-2-5-1

وتقديرها في راشح M. anisopliaeتم التحري عن فعالية انزيم البروتييز المنتج من الفطر

مع بعض التحوير . Sirisha et al. (2010)تبعا للطريقة الموصوفة من قبل المزرعة

-:المستعملةالمحاليل

( مولر هيدروكسيد الصوديوم 0.5) -( 1رقم ) محلول

اتمام غم من هيدروكسيد الصوديوم في كمية من الماء المقطر , وبعد 0.2حضر بأذابة

مل بالماء المقطر . 10األذابة اكمل الحجم الى


51

الكازائين التزين محلول –( 2رقم )محلول

90لتستين الى مل من الماء المقطر , مع ا 90غم من الكازائين في 2حضر بأذابة مل بالماء المقطر . 100ثم اكمل الحجم الى 1مل من محلول رقم 5واضافة

) ( pH 8.5مولر منظم الترس 1 محلول -(3رقم ) محلول

( في كمية من الماء المقطر , وبعد Tris-base غم من الترس ) 12.11حضر بأذابة

بالماء المقطر .مل 100 ( اكمل الحجم الى8.5الى ) pHتعديل الـ

مادة التفاعل محلول -( 4رقم ) محلول

واربع حجوم من الماء المقطر وحجم واحد 2حضر بمزج حجم واحد من محلول رقم

. 3من محلول رقم

% Trichloroacetic acid (TCA) 10 محلول -( 5رقم ) محلول

( مل من الماء المقطر . 90في ) TCA غم من مادة 10حضر بإذابة

-كما يأتي : ˚م 37وتم تقدير الفعالية األنزيمية على درجة حرارة

ابيب في ان 4مل من محلول رقم 2مل من المستتلص األنزيمي الى 0.2اضيف -1

دقيقة . 20اتتبار واجري التفاعل لمدة

زيا بعدها طردت األنابيب مرك 5مل من محلول رقم 3اوقف التفاعل بأضافة -2

دقيقة . 20قة لمدة دورة / دقي 5000بسرعة

مل من 2الى 5مل من محلول رقم 3( بأضافة Blankعمل محلول صفري ) -3

مل من المستتلص األنزيمي الى مزيج التفاعل . 0.2ثم اضيف 4محلول رقم

نانوميتر باستتدام جياز المطياف الضوئي 280تمت قراءة االمتصاص على -4

. المرئية -فود البنفسجية ذو األشعة

تسبب التي األنزيم كمية) بانيا البروتييز ألنزيم األنزيمية الفعالية وحدة وتعرف وتحت نانوميتر 280 موجي طول على 0.001 مقدارها األمتصاص في زيادة

( . التقدير ظروف


52

-تقدير البروتين : 3-2-5-2

( باستتدام البومين المصل البقري Bradford , 1976تم تقدير البروتين حسب طريقة )

كبروتين قياسي .

-عمل المنحنى القياسي:

ة :لمالمحاليل المستع

( Coomasie Brilliant Blue G250محلول صبغة كوماسي الزرقاء ) -1

, ثم اضيف %95 مل من الكحول األثيلي 50غم من صبغة الكوماسي الزرقاء في مل 100اذيب

مع التبريد , بعدها اكمل الحجم الى % 85مل من حامض الفسفوريك 100الى هذا المحلول

لتر باضافة الماء المقطر ثم حفظت بقناني معتمة في الثالجة لحين االستعمال .

مايكروغرام / مل ( 100محلول البومين المصل البقري القياسي ) -2

-المصل البقري حسب الجدول اآلتي : حضرت تراكيز متدرجة من البومين

المحلولمايكروليتر من كل تركيز , ثم مزج 500الى 1مل من محلول رقم 2.5اضيف

نانوميتر , 595على طول موجي وترك لمدة تمس دقائد , بعدها تمت قراءة االمتصاص ا جيد

مل منظم 0.5( الذي يتكون من Blankبعد ان تم تصفير جياز المطياف بمحلول صفري )

. 1مل من محلول رقم 2.5و pH 5.0التالت

نانوميتر 595استحصل المنحنى القياسي برسم العالقة بين االمتصاص عند الطول الموجي

.( 1مقابل تركيز البومين المصل البقري )شكل

المحلول التزين

)مايكروليتر(

الماء المقطر


الحجم الكلي


تركيز البروتين

)مايكروغرام(

100 900 1000 10

300 700 1000 30

500 500 1000 50

700 300 1000 70

900 100 1000 90

1000 0.0 1000 100


53

. (1976)( : المنحنى القياسي للبروتين بطريقة برادفورد1الشكل )

-تقدير فعالية انزيم الكايتنيز : 3-2-5-3

-ق قح الطع لي الن يم الة يتني كم يل :

ب ت ام م وة لغي تا ير الطع لي االن يمي للة يتني ال قج(p-Nitrophenyl N-acetyl β-D-glucosaminide , pNP-GlcNAc) : كم وة تط ى-

ع تب M. anisopliae ي المنتج مل الطررلغ ال قج تم تا ير فع لي إن يم الة يتيني

مع بعض التحغير ب الىتم و ىلس كمي Park et al. (2000) للرريا المغصغف مل قب

المتحرقة مل تحل م وة (p-Nitrophenol, pNP)الب قانيتر فينغل

(p-Nitrophenyl N-acetyl β-D-glucosaminide , pNP-GlcNAc) ا

-: pNPىم المنحنس الاي لم وة الب قان يتر فينغل -1

-: المحاليل المستعملة

0.0348حضر باذابة -: بارانايتروفينول ي رموال( -104 × 2.5)محلول -( 1محلول رقم )

لتر بالماء المقطر . 1في كمية من الماء المقطر , ثم اكمل الحجم الى pNPغم من مادة

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 20 40 60 80 100 120

صصا

متالأ

ى عل

59

5تر

ومانن

(مل/مايكروغرام)يز البومين المصل البقري ترك


54

مولر كاربونات الصوديوم 0.5محلول -( 2محلول رقم )

في كمية من الماء المقطر , ثم 3CO2(Na(غم من كاربونات الصوديوم 5.299حضر باذابة

مل بالماء المقطر . 100اكمل الحجم الى

المبينة في الجدول التالي في انابيب اتتبار وبواقع مكررين لكل حجم اضيفت الحجوم (duplicate ).

رقم األنبوب مل من محلول

(1رقم )

مل من الماء المقطر

مل من محلول رقم (2)

التركيز النهائي ملي للبارانيتروفينول)

(مولر

1 0.00 4.00 1 0.00 (Blank)

2 0.125 3.875 1 0.00625

3 0.25 3.75 1 0.0125

4 0.50 3.50 1 0.025

5 0.75 3.25 1 0.0375

6 1.00 3.00 1 0.050

7 1.25 2.75 1 0.0625

8 1.50 2.50 1 0.075

نانوميتر باستتدام جياز المطياف الضوئي 420وتمت قراءة االمتصاص على

برسم العالقة بين االمتصاص وتركيز الـ واستحصل المنحنى القياسي للبارانايتروفينولpNP( 2الشكل. )


55

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

ى

علص

صامت

الا

42

0تر

مينو

نا

(pNP)( : المنحنى القياسي للبارانيتروفينول 2الشكل )

-تقدير الفعالية : -2

-:المستعملةالمحاليل

( pH 5.0)مولر منظم التالت 0.1محلول –( 1محلول رقم )

مل من حامض التليك الثلجي في كمية من الماء المقطر , وبعد 0.58حضر بتتفيف

مل بالماء المقطر . 100اكمل الحجم الى 5الى pHتعديل الـ

.( ملي مولر4بتركيز ) pNP-GlcNAcمادة التفاعل محلول -(2رقم )حلول م

عد , وب1في كمية من محلول رقم pNP-GlcNAcغم من مادة 0.13ابة حضر باذ

ذاته . 1 مل بمحلول رقم 100 اتمام االذابة اكمل الحجم الى

.مولر كاربونات الصوديوم 1محلول -)3) رقممحلول

لماء المقطر , ثم اكمل الصوديوم في كمية من ا غم من كاربونات 10.58حضر باذابة

مل بالماء المقطر . 100الحجم الى

-كما يلي : ˚م 37فعالية األنزيمية على درجة حرارة وتم تقدير ال

0.8 0.7

( 10-4 ×تركيز البارانايتروفينول )مولر

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1


56

مع 2مل من محلول رقم 0.2الى التام مل من المستتلص األنزيمي 0.2اضيف -1

دقيقة . 30اجري التفاعل لمدة و 1مل من محلول رقم 0.6

3مل من محلول رقم 1اوقف التفاعل باضافة -2

مل من 0.2الى 3مل من محلول رقم 1( باضافة Blankعمل محلول صفري ) -3

مل من المستتلص 0.2ثم اضيف 1مل من محلول رقم 0.6مع 2محلول رقم

االنزيمي الى مزيج التفاعل .

از المطياف الضوئي .( نانوميتر باستتدام جي 420تمت قراءة االمتصاص على ) -4

لتحرير الالزمة اإلنزيم كمية) بأنيا الكايتينيز إلنزيم اإلنزيمية الفعالية وحدة وتعرف

( .التقدير ظروف تحت الواحدة الدقيقة في pNP مادة من واحد مايكرومول

الاليبيز نزيمافعالية تقدير 3-2-5-4

في تقدير فعالية مع بعض التحوير Ali et al (2010)اتبعت الطريقة الموصوفة من قبل

عن طريد تسحيح الحوامض الدهنية M. anisopliaeالمنتج من الفطر انزيم الاليبيز

. نورمالي 0.05الاليبيز مع قاعدة هيدروكسيد البوتاسيوم ذات عيارية انزيم المتحررة بفعل

-:ةالمستعمل المحاليل -1

. Olive Oilزيت الزيتون -محلول مادة التفاعل : -(1محلول رقم )

موالري , 4PO2KH (0.1البوتاسيوم الييدروجينية محلول فوسفات -(2محلول رقم )

pH 7.0 ) .

فوسفات البوتاسيوم الييدروجينية غ ما 1.36حع ذا المحلا ىأذاى 4PO2KH 7تعدي الت ق الميد اجيني الى ي رمي ما المات المقط ا ىعد

.م ىالمات المقط 100ارم الحج الى KOH (0.05 N:) يد ارسيد الىاتاسيا محلول -(3محلول رقم )

غ ما يد ارسيد الىاتاسيا ي رمي ما المات 0.28حع ذا المحلا ىأذاى .م ىالمات المقط ايعا 100المقط ا ىعد اتما اوذاى ارم الحج الى

25غرام من الدليل في 0.05حضر باذابة -دليل الثايموفثالين : -)4(محلول رقم .96%بأستتدام االيثانول مل 50كمل الحجم الى ايثانول وأ %96من مل

.التفاعل يقاف أل % 96كحول اثيلي -(5محلول رقم )

-طريقة العمل : -2

2الى التام مل من المستتلص االنزيمي 1مل من زيت الزيتون و 1اضيف -1 اتتبار . في انابيب ووضعت 2مل من محلول رقم


57

في حمام مائي هزاز ˚م 37دقيقة بدرجة حرارة 45حضن المزيج لمدة -2

دورة / دقيقة . 120بسرعة

. 5مل من محلول رقم 5تم ايقاف التفاعل باضافة -3

مل من دليل الثايموفثالين الى مزيج التفاعل ثم اجريت عملية 0.1اضيف -4

.3التسحيح بأستتدام محلول رقم

يم بعد ( بالطريقة نفسيا باستثناء اضافة االنز Blankحضرت عينة السيطرة ) -5

. 5اضافة محلول رقم

عالية االنزيمية على اساس ان مليليتر واحد من قاعدة هيدروكسيد الصوديوم فحسبت ال مايكرومول من االحماض الدهنية المتحررة حسب 50موالري تعادل 0.05ذات عيارية

االنزيم ( . وتعرف وحدة الفعالية بانيا كمية Varley et al.,1976 (تعريف شيري وكراندل

تحت ظروف التقدير . كل دقيقة ول من االحماض الدهنيةالتي تحرر مايكروم

الفطر منالمنتجة الحيويةمضادات الالتحري عن 3-2-5-5

M. anisopliae

A - الفطر المنتجة منالحيوية مضادات الوجود تم التحري عن M. anisopliae -بالتطوات التالية :

في االوساط M. anisopliaeالتي ينتجيا الفطر الحيويةمضادات التم التحري عن

الفطر وتمت .اذ لقحت االوساط المذكورة بأبواغ 3-2-4المشار الييا في الفقرة الثالثةاالنتاجية

اذ اهملت األوساطالتنمية في الحاضنة اليزازة تحت الظروف المشار الييا سابقا . ثم رشحت من الراشح. الحيويةمضادات الالتاليا في حين تم استتالص

B - الفعاليــــــــــــــــة المضــــــــــــــــادة للمســــــــــــــــتخلص الفطــــــــــــــــري ضــــــــــــــــد بكتريــــــــــــــــاStaphylococcus aureus

للا قس /ما رلي العلا S. aureusت الحصا للى لةل ما ىرت يا للمااد وختىا الةعالي التثىيطي المذرا ة العةل لماقد استع . جامع ر ىبت/الحياة

اذلك حس الخطاا التالي . M.anisopliae المنتج ما الةط

S. aureusتنشيط بكتريا -1

المستعملةاواساط:- :Mannitol Salt agarوسط -1

لتير 1فييمين الوسيط غيم 111 حضر بحسب تعليمات الشركة المجيزة بأذابية

هيذا الوسيط أسيتعملبالم صدة , و تم صبه في اطبياد بتيري و قيد ماء مقطر و عقم .S. aureusلتنمية بكتريا

(: Nutrient brothالوسط المغذي السائل ) - 2

لتير مين 1 غم من الوسط في 13حضر بحسب تعليمات الشركة المجيزة بأذابة


58

و °م 121الماء المقطر , و تم تعقيم الوسط باستتدام جياز الم صدة بدرجية حيرارة

البكتيرية. لةهذا الوسط لتنشيط العز لامعاستدقيقة و قد تم 15لمدة

: Muller Hinton agarوسط - 3

لتيير ميين الميياء 1غييم فييي 38حضيير بحسييب تعليمييات الشييركة المجيييزة بأذابيية

أطبياد بتيري معقمية , و قيد تيم المقطر, و عقيم باسيتتدام الم صيدة , وتيم صيبه فيي بكترياضد الفطري ية التثبيطية للمستتلصهذا الوسط لغرض اتتبار الفعال لامعاست

S. aureus.

المحلول الملحي الفسيولوجي : - 4

مل ماء مقطر , وبعد اتمام 50غم من كلوريد الصوديوم في 0.85حضر باذابة

.امل بالماء المقطر ايضـ 100االذابة اكمل الحجم الى عملية

تحضير اللقاح 2-

الوسط المغذي السائل لغرض تحضير اللقيا , اذ وز الوسيط فيي انابييب اتتبيار أستعمل طعية مين بكتيريية بنقيل قالعزلية لل وحضير اللقيا ميل لكيل انبوبية وعقيم بالم صيدة . 10بواقع

اليى لتاكيد مين نقاوتيياوسط المغذي الصلب بعد االعزلة المنماة على ال منملم 5ار ذات قطركاال

24ولميدة °م 37بدرجية حيرارة حضينتوثم رجت االنابيب جييدا ثيم االنابيب المتصصة ليا

ساعة .

S. aureus بكترياضد الفطري ية التثبيطية للمستخلصالفعال -3

فيي وفد طريقية األنتشيار M. anisopliaeالفطر مستتلصالتثبيطية لتم اتتبار الفعالية

-بحسب اآلتي : (Egorove ,1985)االكار بوساطة الحفر

بكتيرييية و لغاييية الحصييول علييى التتفيييف العزليية لل ن التتييافيف العشييرية تييم عمييل سلسييلة ميي -1

. المناسب

20بكتيرية , و اضيف الى اطباد حاوية على العزلة لل مل من التتفيف المناسب 0.1سحب -2

عليى سيطح الطبيد بوسياطة الصيلب وتيم نشيره جييدا , Muller Hinton agarميل مين وسيط

و تركت االطباد مدة ساعة في الثالجة . L-Shapeالناشر

مليم بحييك كانيت المسيافة 5تم عمل حفر على سطح االكار باستتدام الثاقب الفليني ذو قطر -3

متساوية بين حفرة و اترى.

في ثالك من )مل /ملغم 0.1ذو التركيز ) راشح مزرعة الفطرمن يكروليتر ( ما30وضع ) -4

و لميدة سياعة فيي الثالجية , االطباد نتو حض , الحفر في حين تركت الرابعة كمعاملة سيطرة . اعةس 24مئوية لمدة 37في الحاضنة بدرجة تمن ثم حضن

الحضن. مدةتم قياس اقطار تثبيط نمو البكتريا )ملم( باستعمال المسطرة بعد اكتمال -5


59

M.anisopliae تحديد الظروف المثلى إلنتاج إنزيم البروتييز من الفطر 3-2-6

M.anisopliae تم دراسة عدد من العوامل الم ثرة في إنتياج إنيزيم البروتيييز مين الفطير ا نتتا المصتتد النيت اجينتتي ا اختيتتا المصتتد الرتتا ىاني ات ريتتة إشتتتمل تتذ العاامتت للتتى

احجت اللقتاح ات رية تا مدة الحعا ا ست ل الت ا نتا األمتبح المعدنيت ا اد ج الح ا ة ت رية .اال ق الميد اجيني

المصدر الكاربوني وتركيزه 3-2-6-1 المصدر الكاربوني -أ

تحضير عصير التمر -لصي التم الة دت رمصد را ىاني ي استط انتتا انتةي الى اتييتة متا أستعم

حعتتتتتتتت العصتتتتتتتتي ا تتتتتتتتب الط يقتتتتتتتت الماصتتتتتتتتا متتتتتتتتا قىتتتتتتتت M.anisopliaeالةطتتتتتتتت AL-Obaidi غتت 250متت متتا المتتات المملتتي التتى 500( اذ اعتتي 1987)اجمالتمتتا

ستتتتال للحصتتتتا للتتتتى 24متتتتا تمتتتت الة تتتتدت المتتتتةا منتتتتي النتتتتاض ااألقمتتتتا اتتتتت ك لمتتتتدة 5000القىمتتتتا لمليتتتت نىتتتتذ م رتتتتةت ىستتتت ل العصتتتتي ثتتتت شتتتتر ىاستتتتتخدا قمتتتتات الملمتتتت

دقتتتتائب للحصتتتتا للتتتتى ال اشتتتتر ىشتتتتر ائتتتتب. ثتتتت خةتتتت العصتتتتي 10دا ة/دقيقتتتت المتتتتدة المتحص لليي الى النسى المطلاى ما السر يا المختةل .

تقدير السكريات المختزلة -1

االتمتادا Miller(1959)قد السر يا المختةل ي اسط لصي التمت ىط يقت للى المنحنى القياسي للرلاراة رسر مختة .

عمل المنحنى القياسي للكلوكوز -2

المستعملةالمحاليل -

( حعت تذا المحلتا ىأذاىت mg / ml 1محلا الرلاراة الختةيا ) -( 1محلا ق )ارمت الحجت غ ما الرلاراة ي رمي ما المات المقط اىعتد اتمتا لمليت األذاىت 0.1 م ىالمات المقط . 100الى

ثنتتتتتتتتتتتتتتتتتائي نيتتتتتتتتتتتتتتتتتت ا حتتتتتتتتتتتتتتتتتامض السالستتتتتتتتتتتتتتتتتيليك 3,5محلتتتتتتتتتتتتتتتتتا -( 2محلتتتتتتتتتتتتتتتتتا قتتتتتتتتتتتتتتتتت )3,5 Dinitrosalicylic acid , DNSA ) )

متت متتا المتتات المقطتت اىعتتد اتمتتا 50غتت متتا المتتادة تتي 1حعتت تتذا المحلتتا ىأذاىتت غتت 30متتال ( ثتت اعتتي 2متت متتا يد ارستتيد الصتتاديا ) 20ليتت األذاىتت اعتتي لم


60

( اىعتتد اتمتتا األذاىتت ارمتت O2.4H6KNaO4CuHمتتا ت تتت ا الصتتاديا الىاتاستتيا ) م ىالمات المقط . 100الحج الى

-ت لم المنحنى القياسي للرلاراة ىحس الخطاا التالي : 0.3 ا 0.1اسي ىالمات المقط للحصا للى الت ارية )خة محلا الرلاراة القي -1

-( ملم / م ىحس الجدا اوتي : 1.0ا 0.9ا 0.7 ا 0.5 ا

ئي مملتي لمتتدة الرت أنىاىتت ااعتع تتي حمتا متت (2محلتا قتت ) متت متا راشتت 1أعتي -2 دقائب. 5

نتمات مدة الملياا مىاش ة .األناىي ي حما مائي ثلجي ىعد اى د 3- م مات مقط لر أنىاى ات جما جيدا . 5أعي 4-نتتتتاناميت 540تمتتتت قتتتت اتة األمتصتتتتاخ تتتتي جمتتتتاة المطيتتتتا العتتتتائي للتتتتى طتتتتا متتتتاجي 5-

. (Blank)ااستعم األنىا األا ي تصةي الجماةألمتصتتتاخ للتتتى الطتتتا المتتتاجي استحصتتت المنحنتتتى القياستتتي ى ستتت العبقتتت الىيانيتتت ىتتتيا اا ( .3ناناميت ارمي الرلاراة)ملم ( ارما ماعر ي الشر ) 540

رقم األنبوبة حجم محلول الكلوكوز

الخزين )مل(

حجم الماء المقطر

)مل( كمية الكلوكوز )ملغم/مل(

1 0.0 1.0 0.0

2 0.1 0.9 0.1

3 0.3 0.7 0.3

4 0.5 0.5 0.5

5 0.7 0.3 0.7

6 0.9 0.1 0.9

7 1.0 0.0 1.0


61

لكلوكوز )السكريات المختزلة( بطريقة ل( : المنحنى القياسي 3الشكل ) (3,5 Dinitro salicylic acid,DNSA)

تركيز المصدر الكاربوني –ب

خةتت لصتتي التمتت ليعطتتي ألنتتتا انتتةي الى اتييتتة لتحديتتد الت ريتتة األمثتت متتا لصتتي التمتت ( % 0.7 ا 0.5 ا 0.3 ا 0.1 ا 0.05 ا 0.01) ت ارية متد ج ما السر يا المختةل

. ت تدلي العصي ىىعض الممذيا التي اشتمل للتى عب لا المعامل الخالي ما العصي

كلورييد و %0.05بنسيبة كبريتات المغنيسيوم و %0.1بنسبة فوسفات البوتاسيوم الييدروجينية

100اىعتد ا ارمت الحجت التى 6.5ثت لتد الت ق الميتد اجيني التى %0.25بنسيبة الصوديوم ما حج الاسط %6 ث لقر ىحج لقاح مقدا م ىالعصي نةسي لر ت رية الق ىالمةصدة

72دا ة /دقيقتت لمتتدة 150 اىستت ل ˚م 28احعتتا تتي الحاعتتن المتتةاةة للتتى د جتت حتت ا ة سال اىعد ا صل الرتل الحياي لا اشر المة ل الحاات للى اونةي اذلتك للحصتا للتى

اونةي ىشر ائب .

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1

ة صي

صامت

ألا

(5

40

ر مت

نونا

)

(مل/ملغم) تركيز الكلوكوز

10.90.70.50.30.1


62

تأثير نوع المصدر النيتروجيني و تركيزه 3-2-6-2

نوع المصدر النيتروجيني -أ

نتتتت ا األمانيتتتا ا رلا يتتتد األمانيتتتا ا ت اجينيتتت تتتي )رى يتتتتا ي مصتتتاد نستتتتتتتت أختيتتتا تتي استتط لصتتي %1أذيىتت تتذ المتتااد ىنستتى الجيبتتتيا( حيتتثا االرتتاةائياااليا يتتا الصتتاديا

ستاىقا القت الاستط ادل ىالممذيا المشا اليما %0.05التم الحاات للى السر يا المختةل الةطتتتت اتتتتت الحعتتتتا تحتتتت الفتتتت ا الستتتتاىق اصتتتتةما اذلتتتتك لتحديتتتتد المصتتتتد ثتتتت لقتتتتر ىتتتتأىاا

. النيت اجيني اومث ونتا انةي الى اتيية

المصدر النيتروجيني تركيز -ب

لمت ض % ( 4 ا 3 ا 2 ا 1 ا 0.5 ا 0.25 أستخدم ت ارية متد ج ما الجيبتيا ) ا تم إذاىتما ي اسط اإلنتا الماصتا مستعم مث للمصد النيت اجيني التحديد الت رية األ

ي الةق ة الساىق .

تأثير درجة الحرارة 3-2-6-3

الجيبتيا ىنسى لصي التم ا د س تأثي د ج الح ا ة ىحعا اسط اإلنتا الحاات للى ( . 35ا 30ا 25 للى د جا ح ا ة ) M.anisopliaeاالملقر ىالةط 0.5%

تأثير اسرعة الرج 3-2-6-4

M. anisopliae حعتتا استتط إنتتتا أنتتةي الى اتييتتة الماصتتا ستتاىقا ا الملقتتر ىتتالةط

ستتال تتي حاعتتنتيا احتتدا ما ستتارن أت ستت ل التت صتتة ااألختت ض تتةاةة ا ىأستتتخدا 72لمتتدة ( دا ة / دقيق .150ا 100ا 50س مختلة ي )

حجم اللقاح تأثير 3-2-6-5

(% متا 20ا 16ا 12ا 8ا 4ىحجتا لقتاح مقتدا ا )الى اتييتة لقر استط إنتتا إنتةي اذلك لتحديد حج اللقاح األمث إلنتا اإلنةي . M.anisopliae لقاح الةط

تأثير الرقم الهيدروجيني االبتدائي 3-2-6-6

تتد التت ق الميتتد اجيني لاستتط ا 6.5ا 6.0 ا 5.5 ا 5.0 ا 4.5إنتتتا اإلنتتةي إلتتى ) ل ا حتتتامض الميتتتد ارلا يك (NaOH)متتتال يد ارستتتيد الصتتاديا 0.2 ا( ىاستتتعم 7.5ا 7.0

(HCl) ستال 72 لمدة 30 احعا ىد ج ح ا ة 16% القر الاسط اإلنتاجي ىحج لقاح مقدا دا ة / دقيق . 100ا ىس ل


63

مدة الحضن تأثير 3-2-6-7

16%ىنسى لقتاح لمع تأثي مدة الحعا لقر اسط اإلنتا الماصا ىالةق ا الساىق ياميتا اطتاا الىحتثسال اتم متاىع إنتا إنتةي الى اتييتة متا الةطت قيتد 168لمدة احعا

ا قيتتاس ستتال لتقتتدي الةعاليتت اإلنةيميتت االىتت اتيا 24اذلتتك ىستتح مرتت يا رتت متتدة الحعتتا ال ق الميد اجيني لاسط اإلنتا .

تأثير نوع األمالح المعدنية وتركيزها 3-2-6-8

تأثير نوع االمالح المعدنية -أ

د س تتتأثي رى يتتتا الممنيستتيا المائيتت ا استتةا الىاتاستتيا ثنائيتت الميتتد اجيا ارلا يتتد للتى التتاالي( 0.125ا 0.05ا 0.025الصاديا ) الماجادة أصب ي اسط اإلنتتا ىتالت ارية

حيتتتث حعتتت الاستتتط ىاجتتتاد رى يتتتتا الممنيستتتيا المائيتتت ا ىعتتتد اجاد تتتا ا ىاجتتتاد استتتةا اسيا ثنائي الميد اجيا ا ىعد اجاد ا اىاجاد رلا يتد الصتاديا اىعتد اجتاد إعتا إلتى الىات

المعتتتامب الحاايتتت للتتتى رتتتب الملحتتتيا اغيتتتا الثالتتتث اعتتتا التتتى المعاملتتت الحاايتتت للتتتى رتتت األمبح ا ت ر إحدض المعامب ىداا إعا أمبح معدنيت لمت ض المقا نت احعتا الاستط

سال . 72ي الحاعن المةاةة لمدة اإلنتاجي

تركيز االمالح المعدنية -ب

(% 1ا 0.75 ا 0.5ا 0.25 ا 0.1 ا 0.05) يس ت ارية ما رلا يد الصاديا د س ستتال ا 72 لمتتدة 30 احعتتا ىد جتت حتت ا ة 16% القتتر الاستتط اإلنتتتاجي ىحجتت لقتتاح مقتتدا

دا ة / دقيق اذلك لتحديد ت رية رلا يد الصاديا اومث ونتا انةي الى اتيية. 100ىس ل

M.anisopliae قتنقية إنزيم البروتييز المنتج من الفط 3-2-7

حعتت M.anisopliae متتا الةطتت ىعتتد تثىيتت الفتت ا المثلتتى إلنتتتا إنتتةي الى اتييتتة ا متتتتا لصتتتتي التمتتتت ىت ريتتتتة متتتتا رلا يتتتتد الصتتتتاديا % 0.1ا % 0.05استتتتط اإلنتتتتتا المرتتتتال

ا 5.5ا ىعد إتما اإلذاىت لمتذ المرانتا لتد الت ق الميتد اجيني إلتى %0.5االجيبتيا ىنسى 30احعا ي الحاعن المةاةة للى د ج ح ا ة 16%لق ىالمةصدة ث لقر ىحج لقاح مقدا

سال ىعد ا صل الرتل الحيايت لتا اشتر المة لت 72دا ة/ دقيق لمدة 100س ل ىالحاات للى اإلنةي ا ذلك للحصا للى اإلنةي ىشر ائب . اج جميا م اح التنقيت تحت

ف ا مى دة ىحس الخطاا اآلتي :


64

%60 التراسيب بااليثانول -1

ثم طرو % 60أاري ىملي التر يب للم ت لص امن يم بغ ط اميص نغل المبرو بن ب

وقياقق 30و قة / وقياقق لمقق ة 8000مرك يقق بت ققت ام اهقق ج الرققرو المركقق ي المبققرو ب ققرى

ق قح الطع لي (pH 8)م ذ ثم أذيب الرا ب ف كمي مل محلغل منظم الترس 4ب قا حراقة

يمي من يم البر تيي إ ف إلس تا ير البر تيل ا امن

DEAE-Cellulose (Batch wise )بإاستخدام المبادل التبادل االيوني-2

: المستعملةالمحاليل -

( مغلر كلغقي الصغويغم 0.25) –( مغلر ھي ق ك ي الصغويغم 0.25) - (1محلول رقم )

يقم مقل كلغقيق الصقغويغم فق 3.625يقم مقل ھي ق ك قي الصقغويغم 2.5حضر بتذابق

م ب لم ء المارر ا 250كمي مل الم ء المارر بع إتم م امذاب أكم الح م إلس

( مغلر محلغل ح مض الهي ق كلغقيك0.25) - (2محلول رقم )

لمق ء المارقر ثقم م مل ح مض الهي ق كلغقيك المرك ف كميق مقل ا 5.38حضر بت طي

م ب لم ء المارر ا 250أكم الح م إلس

(pH8.0)( مغلر منظم الترس 0.1) - (3محلول رقم )

( ف كمي مل المق ء المارقر بعق تعق ي الق Tris-baseيم مل الترس ) 12.1حضر بتذاب

pH لتر ب لم ء المارر ا 1أكم الح م إلس 8.0إلس


( ف كمي مل المق ء المارقر بعق تعق ي الق Tris-baseيم مل الترس ) 61ا0حضر بتذاب

pH لتر ب لم ء المارر ا 1أكم الح م إلس 8.0إلس

( مغلر كلغقي الصغويغم3ا0) - (5محلول رقم )

ثم أكم الح م 4يم مل كلغقي الصغويغم ف كمي مل محلغل ققم 7ا8حضر بتذاب

ذات ا 4م ب لمحلغل ققم 500إلس

( مغلر كلغقي الصغويغم 0.6) -(6محلول رقم )

ثقم أكمق الح قم 4يم مل كلغقي الصغويغم ف كميق مقل محلقغل قققم 17.55حضر بتذاب

ذات ا 4ققم م ب لمحلغل 500إلس

بح ققققب الررياقققق المغصققققغف مققققل قبقققق DEAE-Celluloseحضققققر المبقققق ول اغيققققغن

Whitaker (1972) : ذلك بتتب ع ال رغاح اآلتي


65

لتققرمل المق ء المارققر تقرك ليركقق ثقم أجيقق 1يقم مققل المبق ول اغيققغن مقع 20 لق 1-

ال ق ل العلقغي كققرقح ھق ث ال رقغة مققراح ىق ة الققس أح أصقب ال ق ل العلققغي قالاق ثققم

قش تح التطريغ بت ت ام قمع ب نر ا

وقيا ي ق فق قمقع ب نقر 30لم ة 1م مل محلغل ققم 250نش المب ول بت ف 2-

مقراح وقياق ي ق 30 لمق ة 2مق مقل محلقغل قققم 250ب لم ء الماررذ بع ھ أ قي

ى ة ب لم ء المارر ا

ا 8.0 لغ ي صغل الرقم الهي ق اين للمب ول الس 4ىل المب ول ف محلغل ققم -3

% 60ب ميصق نغل م مل النمغذج المتحص ىلي مقل رقغة التر قيب 15أ ي – 4

( يم مل المبق ول االيقغن مق ج ايق ا قع فق بقر ف مبقروة لمق ة ق ى ثقم 3إلس )

بع ھ تم الت لص مل الراش اي المب ول بترشيح بمض تطريغ

( تم حطق محلقغل اال قترواو ثقم ا قترو 5ااري ىملي ا ترواو ا ل بمحلغل ققم ) -1

حققتط بقق لمحلغل بعقق إنتهقق ء العمليقق تققم تاقق ير الطع ليقق منقق يم ( ا6بمحلققغل ققققم )

البر تيي فضو ىل تا ير البر تيل ا

Sephadex G -150 يح الهالمي بإاستخدام الهالمالترش -3



( ف كمي مل الم ء المارر بع تع ي Tris-baseيم مل الترس ) 24.2حضر بتذاب

لتر ب لم ء المارر ا 1أكم الح م إلس 8.0إلس pHال

Sephadex G-150تحضير الهالم -

20( اذلك ىتعليب Pharmaciaحع ب السيةادرس ا قا لتعليما الش ر المجمةة ) مللت ما المات المقط ث 500( ي Sehpadex G-150غ ما مسحاب السيةادرس )

لمدة سال ااحدة ث ت ك ليى د اغس لدة م ا 90اعا ي حما مائي ىد ج ح ا ة ث اليد اععي ي الحما المائي 8.0( لحيا استق ا ال ق الميد اجيني للى 1ىمحلا ق )

Degassingلمدة سال اخ ض اىعد ذلك ت ك المب ليى د ات اةال الماات مني 90للى × 1.4 مةدا ليعطي بما ىأىعاد )ىاساط معخ تة يغ ث ل ت ي لماد ةجاجي ذت جدا

ات لملي الةص س ث ىط العماد ىالحما المائي الىا د ذت المات الدائ لعماا اج ( 87 مللت /سال . 20اتم مااةنتي ىمحلا منف الت س نةسي ىس ل ج ياا تح ف ا مى دة


66

إضافة النموذج : -

إلتتى ستتطر لمتتاد التىتتاد األيتتانيمتت متتا النمتتاذ المتحصتت لليتتي متتا خطتتاة 3أعتتي متتال اىتت ق 0.2ىمحلتتا متتنف التتت س ىت ريتتة الت شتتير المبمتتي ىمتتدات ااج يتت لمليتت الةصتت

م لر أنىا 4اجمع األجةات المنةصل ما العماد ي أناىي إختىا ىااقا 8.0 يد اجيني لت / سال . اتمت قت اتة اومتصتاخ لاجتةات المنةصتل )القمت ( مل 20ا ىس ل ج ياا ثاىت

نتاناميت اقتد الةعاليت اونةيميت االىت اتيا 280ا ي األجةات التاىع للقمت لنتد طتا متاجي ي القم ااوجةات التاىع للقم .

توصيف إنزيم البروتييز 8 -3-2

لإلنزيم تقدير الثوابت الحركية 3-2-8-1

ىاساط المنحنى المقلا max(V(ا الس ل القصاض K)m(قد قي ثاى ميرالس (Reciprocal plot) لط يق استنادا لت رية مادة التةال مقاى الس ل األالي

Lineweaver & Burk (1934) .

:المستعملةالمحاليل -

(pH 8.5)( مال منف الت س 1) - (1محلول رقم )

اىعتد تعتدي ( ي رمي متا المتات المقطت Tris-baseغ ما الت س )12.11 ذاى حع ى م ىالمات المقط . 100أرم الحج إلى 8.5إلى pHالت

محلا مادة التةال - (2محلول رقم )

للتى %3) ( % إذ حعت الت ريتة )3-0.05حعت متادة التةالت )الرتاةائيا( ىت اريتة ) ارمتتا تتا ماعتتر اتتت لمتت التختتا ي منتتي ا خةينتت محلتتاو لتتدل ا %2إنةتت اد ىينمتتا حعتت المحلتتا

ىالجدا اآلتي :


67

%2مللتر من

كازائين

1من لترمل

محلول مولر

منظم الترس

الحجم النهائي

)مللتر( التركيز النهائي %

1 39 40 0.05

2 38 40 0.1

10 30 40 0.5

20 20 40 1

30 10 40 1.5

40 0.0 40 2

محاليتتتت متتتتادة التةالتتتت ألتتتتب الى اتيتتتتة ى ستتتتتعماتتتتت تقتتتتدي الةعاليتتتت اإلنةيميتتتت إلنتتتتةي ا ى ستتتتخدا المنحنتتتى المقلتتتا لت ريتتة متتتادة التةالتتت مقاىتتت الستتت ل maxVا mKاأستحصتتل قتتتي

األالي .

:(Substrate Specificityحيال مادة التفاعل )إلنزيم تخصص ا 3-2-8-2

مواد تفاعل مختلفة المالفعالية النسبية لإلنزيم بإاستع -أ


( االىتاميا المصت الىقت ت (Casienحع محالي مااد التةال لى اتينا الراةائيا BSA)( االجيبتيا )(Gelatin غ ما ر ى اتيا للى إنة اد ي رمي ما محلا 2ى ذاى

اىعد اإلذاى التام للى اتيا أرمت الحجت إلتى 8.5مال ا ق يد اجيني 1 منف الت س

م ىمحلا الت س نةسي . 100

طريقة العمل : -

حيقق ل مقق وة أ تبققرح ثوثقق أنققغاع مققل مققغاو التط ىقق لتح يقق ت صققص إنقق يم البر تييقق

التط ى شمل الة جاليل ال يوتيل البغميل المصق الباقريذ تقم تاق ير الطع ليق امن يميق

ح قب %100الةق جاليل كمق وة تط ىق ل معإىتبق ق الطع ليق امن يميق بت قتللبر تيي تقم

-الطع لي الن بي لباي مغاو التط ى ف المع ول اآلتي :

مادة تفاعل أي لماعبإاستللبروتييز الفعالية اإلنزيمية

100 × = % أي مادة تفاعل لماعبإاستالفعالية النسبية إلنزيم البروتييز

كمادة تفاعل الكازائين لماعبإاست اإلنزيميةالفعالية


68

تقدير الثوابت الحركية لإلنزيم بإختالف مادة التفاعل-ب

مااد التةال لس ل القصاض لإلنةي الرا ى ستعما حسا قيم ثاى ميرالس اات تقدي الثااى اى تىا ط يق % (3 – 0.05اىت ارية) الىاميا المص الىق ت الجيبتيا ا

الراةائيا رمادة تةال االماصا ساىقا . الح ري لإلنةي نةسما لند إستعما

تحديد الرقم الهيدروجيني األمثل لفعالية إنزيم البروتييز 3-2-8-3


( 7.5- 7.0ما ) pHمال منف الةاسةا ىمدض 0.1 - (1محلول رقم )

غتتت متتتا استتتةا الىاتاستتتيا ثنائيتتت الميتتتد اجيا تتتي رميتتت متتتا المتتتات 0.34حعتتت ى ذاىتتت متت ىالمتتات 25إلتتى التت ق الميتتد اجيني المطلتتا أرمتت الحجتت إلتتى pHالمقطتت اىعتتد تعتتدي التتت

المقط .

(10.5 -8.0مل ) pHمغلر منظم الترس بم ى 1 – (2محلول رقم )

( تتتي رميتتت متتتا المتتتات المقطتتت اىعتتتد Tris-baseغتتت متتتا التتتت س ) 0.3029حعتتت ى ذاىتتت م ىالمات المقط . 25الى ال ق الميد اجيني المطلا أرم الحج الى pHتعدي الت

ك جاليل %2محلغل م وة التط ى - (3محلول رقم )

الخةيا ) المحع ساىقا ( ما حجميا ما المتات حع ىمة حج ااحد ما محلا الراةائيا المقطتتتتتت احجتتتتتت ااحتتتتتتد متتتتتتا المحاليتتتتتت المنفمتتتتتت المحعتتتتتت ة ستتتتتتاىقا ىمتتتتتتدض األ قتتتتتتا الميد اجينيتتتتتت

(7.0- 10.5. )

طريقة التقدير : -

قتتتد الةعاليتتت إلنتتتةي الى اتييتتتة تتتي رتتت محلتتتا متتتا محاليتتت متتتادة التةالتتت المحعتتت ة تتتي ا pHالساىق ىاألسلا نةسي المتىا ي تقدي الةعالي اإلنةيمي ا سم العبق ىيا الت الخطاة

األمث للةعالي . pHالةعالي اإلنةيمي لتحديد الت

تحديد الرقم الهيدروجيني لثبات إنزيم البروتييز 3-2-8-4

( 10.5-6.5مقل ) pHمقغلر بمق ى ققيم 0.2حضرح مح لي منظم ذاح ققغة أيغنيق احق ة

ىلس النحغ اآلت :


69

(pH 6.5)منظم الطغ ط ح - (1محلول رقم )

يم مل فغ ط ح البغت يغم ثن لي الهي ق ايل ف كمي مل المق ء المارقر 0.68حضر بتذاب

6.5إلقس pHيقم مقل كلغقيق الصقغويغم ا بعق تعق ي الق 0.109 ى ل الاغة اغيغني بت ف

م ب لم ء المارر ا 25أكم الح م إلس


يقم مقل فغ قط ح البغت قيغم ثن ليق الهيق ق ايل فق كميق مقل المق ء المارقر 0.68حضر بتذاب

أكم 7إلس pHيم مل كلغقي الصغويغم ا بع تع ي ال 0.066 ى ل الاغة اغيغني بت ف

م ب لم ء المارر ا 25إلس الح م


يم مل فغ ط ح البغت يغم ثن لي الهي ق ايل ف كمي مقل المق ء المارقر 0.68حضر بتذاب

م ب لم ء المارر ا 25أكم الح م إلس 7.5إلس pH بع تع ي ال

(pH 8.0)منظم الترس - (4محلول رقم )

فق كميق مقل المق ء المارقر ىق ل الاقغة (Tris-base)يقم مقل التقرس 0.61حضر بتذاب

أكمق الح قم إلقس 8 إلقس pHيم مقل كلغقيق الصقغويغم ا بعق تعق ي الق 0.13اغيغني بت ف

م ب لم ء المارر ا 25


تي رميت متا المتات المقطت التدل القتاة (Tris-base)تت س غ متا ال 0.61حع ى ذاى أرمتت الحجتت 8.5إلتتى pHغتت متتا رلا يتتد الصتتاديا . اىعتتد تعتتدي التتت 0.223األيانيتت ى عتتا

م ىالمات المقط . 25إلى

(pH 9.0)منف الت س - (6محلول رقم )

ي رمي ما المات المقط الدل القاة (Tris-base)غ ما الت س 0.61حع ى ذاى

أرمت الحجت إلتى 9إلتى pHغ ما رلا يد الصاديا . اىعد تعتدي التت 0.259األياني ى عا م ىالمات المقط . 25


تي رميت متا المتات المقطت التدل القتاة (Tris-base)غ متا التت س 0.61حع ى ذاى أرمتت الحجتت 9.5إلتتى pHغتت متتا رلا يتتد الصتتاديا . اىعتتد تعتتدي التتت 0.259األيانيتت ى عتتا



70


القتتاة تتي رميتت متتا المتتات المقطتت التتدل (Tris-base)غتت متتا التتت س 0.61حعتت ى ذاىتت أرم الحج إلى 10إلى pHغ ما رلا يد الصاديا . اىعد تعدي الت 0.259األياني ى عا

ىالمات المقط . م 25


ي رمي ما المات المقط الدل القاة (Tris-base)غ ما الت س 0.61حع ى ذاى

أرم الحج 10.5إلى pHغ ما رلا يد الصاديا . اىعد تعدي الت 0.259األياني ى عا



1م ما رت متا المحاليت المنفمت ] محلتا قت 2م ما إنةي الى اتيية ما 2حعا 30 المتتدة 37[ تتي أناىيتت اختىتتا تتي حمتتا متتائي للتتى د جتت حتت ا ة 9المايتت محلتتا قتت

دقيقتت ثتت ىتت د األناىيتت تتي حمتتا متتائي ثلجتتي اقتتد عاليتت إنتتةي الى اتييتتة المتىقيتت تتي رتت نماذ ىاألسلا نةسي الذت سىب اصةي ي تقدي الةعالي اإلنةيميت ا ستم العبقت ىتيا النستى

لتحديد ال ق الميد اجيني األمث لثىا اإلنةي . pHلمئاي للةعالي المتىقي ا الت ا

يم نز إل تقدير الثبات الحراري ل 3-2-8-5

ا 30ا 25ا 20 مت متا إنتةي الى اتييتة تي حمتا متائي للتى د جتا حت ا ة ) 2حعتا دقيقتتتت . اىتتتت د األناىيتتتت تتتتي حمتتتتا 30( لمتتتتدة 65ا 60ا 55ا 50ا 45ا 40ا 35

مائي ثلجي مىاش ة ث قد الةعالي اإلنةيمي المتىقي .

يم نز فعالية اإل ية في يونات المعدنية والمواد الكيميائتثثير بعض األ 3-2-8-6

ملتي متال رمحلتتا 10ىت اريتتة أدنتا حعت محاليت رلا يتدا الةلتتةا االمتااد الريميائيت خةيا راآلتي :

محلا رلا يد المنمنية - (1محلول رقم )

تتي رميتت متتا المتتات الختتالي متتا MnCl)2(غتت متتا رلا يتتد المنمنيتتة 0.063حعتت ى ذاىتت م ىمذا المات . 50األيانا اىعد إتما اإلذاى أرم الحج إلى


71

محلا رلا يد الةئىب - (2محلول رقم )

تتتي رميتتت متتتا المتتتات الختتتالي متتتا HgCl)2(غتتت متتتا رلا يتتتد الةئىتتتب 0.135عتتت ى ذاىتتت ح م ىمذا المات . 50األيانا اىعد إتما اإلذاى أرم الحج إلى

محلا رلا يد النير - (3محلول رقم )

تتتي رميتتت متتتا المتتتات الختتتالي متتتا NiCl)2(غتتت متتتا رلا يتتتد النيرتتت 0.065حعتتت ى ذاىتتت م ىمذا المات . 50األيانا اىعد إتما اإلذاى أرم الحج إلى

محلا رلا يد الممنيسيا - (4محلول رقم )

تي رميت متا المتات الختالي متا MgCl)2(غ ما رلا يد الممنيسيا 0.048حع ى ذاى م ىمذا المات . 50األيانا اىعد إتما اإلذاى أرم الحج إلى

محلا رلا يد الرالسيا - (5محلول رقم )

تتي رميتت متتا المتتات الختتالي متتا CaCl)2(غتت متتا رلا يتتد الرالستتيا 0.055حعتت ى ذاىتت م ىمذا المات . 50األيانا اىعد إتما اإلذاى أرم الحج إلى

( 2FeClمحلا رلا يد الحديداة ) - (6محلول رقم )

تي رميت متا المتات الختالي متا ( 2FeClغ ما رلا يتد الحديتداة ) 0.0635حع ى ذاى م ىمذا المات . 50األيانا اىعد إتما اإلذاى أرم الحج إلى

( IAA ‚Iodoacetamideمحلغل ) - (7محلول رقم )

تتي رميتت متتا المتتات الختتالي متتا األيانتتا اىعتتد IAAمتتادة غتت متتا 0.092حعتت ى ذاىتت م ىمذا المات . 50إتما اإلذاى أرم الحج إلى

(Ethylene Diamine Tetra acetic acid , EDTA)محلغل - (8محلول رقم )

تي رميت متا المتات الختالي متا األيانتا اىعتد EDTAغت متا متادة 0.186حع ى ذاىت م ىمذا المات . 50إتما اإلذاى أرم الحج إلى

محلغل المرك بتغايص نغل - (9محلول رقم )

م ما الم راىتاايثانا ي رمي ما المات الخالي ما األيانا ث 0.035حع ىتخةي م ىمذا المات . 50أرم الحج إلى


72

محلا حامض الىا يك - (10رقم ) محلول

غ ما حامض الىا يك ي رمي ما المات الخالي ما األيانا اىعد إتما 0.031حع ى ذاى م ىمذا المات . 50اإلذاى أرم الحج إلى

(PMSF ‚Phenyl Methyl Sulfonyl Fluorideمحلا ) - (11محلول رقم )

تي رميت متا المتات الختالي متا األيانتا اىعتد PMSF مادة غ ما 0.095حع ى ذاى م ىمذا المات . 50إتما اإلذاى أرم الحج إلى


متة محلتتا إنتتةي الى اتييتتة متتا حجتت مماثتت لرتت متتا المحاليتت لنةتت التتذر للحصتتا للتتى دقتتائب ألقىمتتا تقتتدي 10 لمتتدة 37ملتتي متتال لرتت محلتتا ثتت حعتتن ىد جتت حتت ا ة 5ت ريتتة

الةعالي اإلنةيمي عب لا تقدي الةعالي اإلنةيمي للسيط ة )المحلا اإلنةيمي داا معامل ىتأت ما محالي رلا يدا الةلةا االمااد الريميااي ( اذلك لتحديد نسى الةعالي المتىقي .

اإلحصائيالتحليل 9 -2 -3

Completely Randomizedتقققم تحليققق البي نققق ح فققق تصقققميم الت ربققق الع مليققق

Design(CRD) صقققحح الن قققب الملغيققق للهقققوك ىلقققس فققق مع ولققق Orell and

Shneider( ا قتعم ا تبق ق اقق فقر معنقغي 1993)شعب ح المقوحذ(L.S.D) فق تشق يص

ب لغ ح لمعلاق ح التم قي س ا تع او ( ا2000الطر امحص لي بيل المع موح )الرا ي ل هللاذ

ىن مق ة الم تعمل ال م للطرر ذلك مل ول امع ن ب الهوك للتراكي الم قى قاش الطرر

الم قىق قاشق لاق ح ب لغ ح لمعاليرق ح الالتعر اغ يرة ثم يؤ المع ل ال ي يمص ا تع او

ا (2010ال م للطرر)ال ط ا ذ

الفصل الرابع

Results and Discussion النتائج واملناقشة الفصل الرابع

73

و املناقشة النتائج دوار أفي M. anisopliaeالفطر مزرعة وراشح البوغي معلقللاالختبار الحيوي 4-1

Galleria mellonellaعثة الشمع الكبرى حياة

لبيوضفي ا االختبار الحيوي 4-1-1

في نسب الب ب ويبو لفطرالبوغي ل( نتائج تأثير تراكيز مختلفة من المعلق 1الجدول )من بين تي

. مب \ووغ 107 ×1عنبد التركيبز % 62.88 أع البااذ ولغب , mellonella .G عثبة المبما الرببر

وبين وجبو ع ةبة طر يبة إلب يمبير و. ووغ/مب 14×10عند التركيز % 31.78وينما سجل أوطأالا

اثب التحلي األحصائي وجو فروةات معنوية وين التراكيز لصالح كما . اله ب ةك من التركيز ونسب

راشبح المزرعبة مختلفة من راكيزيوضح تأثير تف( 2) الجدول اما . م \ووغ 107 ×1التركيز الراوا

, وينما سبج % 60.91 أةص نسبة ال ب والتي ولغ %100 ركيزسب الت ويض عثة المما اذفي

كب مبن وجو ع ةة طر يبة وبين النتائج وضح تو , % 26.82أوطأ نسبة ال ب ولغ %25 تركيزال

. ةد اثب التحلي األحصائي وجو فروةات معنوية وين التراكيز .كما ونس اله ب راكيز المستعملةالت

يرجا السب في ةدرة الفطر عل اختراق ةمرة البيض ال الترام في النماطين األنزيمي والميرانيري

لديه , اذ انبه ةبا ر علب افبراز انزيمبات البروتييبز والربايتنيز وال يبيبز والسبموق ف بل عبن ةبوة الفعب

( . (Charnley, 2003الميرانيري

ان راشح الفطبر اثب ( الذي 1998وجماعته ) Genthnerالباحث تماوه نتائج الدراسة الحالية نتيجة

M. anisopliae سامة مث ا وا يحوي مMethelen chloride والذي يسب تسمما ألجنة الحيوانات

واجنة Palaemonetes pugioالمائية كالقمريات والبرمائيات فقد احدث تموالات في اجنة الروويان

الفطبر لبت تب ثر معنويبا احث ان تعريض اجنة ال فدع ألوواغكما اكد الب Xenopus laevisال فدع

في ال كات اوتموالات الذه األجنة .


74

.Gفي بيوض عثة الشمع الكبرى M. anisopliaeلفطر ل البوغي معلقال( تأثير 1جدول )

mellonella

للهالكالمصححة وية النسبة المئ عدد البيوض المعاملة التركيز )بوغ / مل(

1×104 100 31.78

1×105 100 43.82

1×106 100 49.84

1×107 100 62.88

1.25= 0.05حت مستوى معنوية ت L.S.Dقيمة

في بيوض عثة M. anisopliaeالخام للفطر راشح المزرعة مختلفة من راكيز( تأثير ت2جدول )


النسبة المئوية للهالك عدد البيوض المعاملة التركيز

25% 100 6.822

50% 100 9.863

75% 100 6.874

100% 100 0.916

1.27= 0.05حت مستوى معنوية ت L.S.Dقيمة

فببي B. bassiana( عنببد اسببتعمال الفطببر 1999وتتفببق الببذه النتببائج مببا ماوجببده تببالح وجماعتببه )

تح ظروف البي الزجاجي اذ ولغ نسبة التطفب tabaci Bemisia مرافحة ويض الذواوة البي اء

( عنبد اسبتعمال الفطبر المبذكور سباوقا فبي 2000اياق من المعاملة , كما وين الحيبدري ) 7وعد 81.16

. % 100 – 87.5مرافحة حمرة حفار ساق الذرة ان له ةدرة عالية فبي الب ب الببيض اذ ولغب نسببتها

مباعنبد معاملته Mingguang (2004)و Weibin كب مبنا وجده ما مالدراسة نتائج تماوهتاي ا

نــــــبـريــــــوبأوواغ الفط Tetranychus cinnabarinusويو حلت العنربوت القرمبزي

Paecilomyces fumosoroms وB. bassiana كمبا % 64.6 ال كها ونسببة إل حيث أ ,

إلب أ B. bassianaألوبواغ الفطبر .Cx.pipiens Lان تعبريض ويبو (2007)علبي اشبار

إلبببب أن نسبببببة فقبببب ويببببو وعوضببببة (2009)وجماعتببببه Santos . واكببببد ا هببببال كهببببا جميع

Aedes aegypti المعرضبة ألوبواغ الفطبرM. anisopliae وبوغ /مب أ إلب 102×2.8وتركيبز

. % 98عند رجة رطووة %50اختزال نسبة الفق ال


75

Trogoderma انسببة فقب ويبو الخباورفي اخفعل ان في نتائجه (2009) األمارةةد حص و

granarium علب التبوالي ووغ/مب 108×2و 106×2 عند التركيبزين % 48.33و % 56.67ال

. M. anisopliaeلفطر ل عند تعري ها

Nomuraea rileyi لفطبر الببوغي ل معلقال( فقد استعملوا 2010وجماعته ) Shanthakumarاما

×2.4عنبد التراكيبز % 0ووجدوا ان نسبة فقب الببيض كانب Spodoptera lituraضد عثة التبغ

% 10وبوغ /مب نسببة فقب 104 ×2.4ووغ /م وةبد اعطب التركيبز 107×2.4و 106×2.4و 105

.عند معاملة السيطرة %90فقط مقارنة وـ

G. mellonellaوعببد معاملببة وببيض عثببة المببما الربببر %59 الفبباة وةببد كانبب نسبببة البببيض غيببر

و 105 ×250 , امبا تراكيبز العبالق الفطبري rileyi .Nللفطر ووغ /م 105 ×133والعالق الفطري

( 45.2و 24.9و 45.4فقد حقق نسبة ) B. bassianaللفطر ووغ /م 101×250و 103×250

( 2011من البيض غير الفاة للعثة آنفة الذكر . )كريت , %

البعبو في احداث اله كبات فبي ويبو M. anisopliaeالفطر أوواغ (2011كما استعم المحنة )

An.stephensi وCx. Quinquefasciatus اةصبب نسبببة ال كببات فببي 105×2اذ سببب التركيببز

( % عل التوالي . 58.66و 60.33البيو ةد ولغ ةيمتها )

الثالثةاليرقية لألطواراالختبار الحيوي 4-1-2عثببة المببما فببي يرةببات دراسببة( تببأثير تراكيببز مختلفببة لمعلقببات الفطببر ةيببد ال3الجببدول ) تبببين مببني

51.87ووغ/م والتي ولغب 107×1نسبة ال ب عند التركيز أعل كان إذ mellonella .Gالربر

سباعة و 72وعبد % 76.94ساعة وترتفا الذه النسبة ما زيا ة مدة التعريض لتص الب 24خ ل %

فببي حببين كانبب اةبب نسبببة ال كببات فببي التركيببز األولليرةببات الطببور سبباعة 120وعببد 100.00%

سبببباعة 120و 72و 24(% وعببببد مببببرور 62.90 , 37.83, 17.77اذ ولغ )ووغ/م 104×1

عل التبوالي ممبا يمبير الب وجبو ع ةبة طر يبة وبين مبد التعبريض ونسب القتب سبواء فبي التراكيبز

الواطئة وكذلك تظهر الع ةة ذاتها في يرةات الطور الراوا والساوا , تعز الزيا ة فبي نسب العالية او

اله ب وزيا ة التركيز ال الزيبا ة فبي عبد األوبواغ ومبن ثبت از يبا نسببة األوبواغ الناميبة عنبد مهاجمبة

وةبد اثبب التحليب , العائ واضعاف النظاق المناعي للحمرة ووالتالي الزيا ة في النس المئوية لله ب

وين االطبوار اليرةيبة البث ث عنبد مسبتو األحصائي وجو فروةات معنوية في النس المصححة للقت

وان الع ةة وين نس القت والطبور اليرةبي كانب ع ةبة عرسبية , ةبد يعبو السبب الب 0.05معنوية

مبن ةبب اوبواغ ة اختراةهبا ح وسبهولممبا يسبم لجست في الطور اليرةي األول راليفبةاوانسجة جداركون

الفطببر اذ ان الطريقببة األساسببية لدخولببه وواسببطة األختببراق المباشببر لجببدار الجسببت عببن طريببق األنبببو

الجرثومي الذي يترون وعد يومين من وةوع األوواغ عل الحمرة وتحص األتاوة عنبد تبوفر الحبرارة


76

ه ةبا ر علب البدخول وومبر اةب عبن طريبق ( غيبر انب Steinhause , 1949والرطووة المناسببتين )

( Boucias & Pendland , 1998القصبيبات الهوائيبة المفتوحبة او عبن طريبق القنباة اله بمية )

تتميز يرةات عثة المبما الرببر وبأن ونباء الربايتين فيهبا يصب الب اةصب رجبة عنبد يرةبات الطبور و

ومببرة White pupae ذراء البي بباء ومرحلببة العبب Prepupaeاألخيببر وعنببد مرحلببة ماةببب العببذراء

( . Ferkovich et al. ,1981يوق ) 6-4وغ البالغات وـ زاخر ي اعف تروين الرايتين ةب و

تبعببا للتراكيببز المسببتخدمة 0.05وعلبب مسبتو كمبا اثببب التحليبب األحصببائي وجبو فروةببات معنويببة

لمختلف تراكيز المعلق البوغي اليرةية األطوار استعدا اخت ف إل كما تمير النتائج ومد التعريض .

نخفبا حساسبية افبي والسبب (4شر األطوار)مقارنة ما وقية استعدا ا أشدالا األول, اذ كان الطور

ز ا عبد خ يبا البدق اإنبه كلمبا تقبدق عمبر اليرةبات يعبو الب اليرةات تجاه الفطر وتقدق عمرالبا اليرةبي

) الساوحة في الدق ( مثب خ يبا البدق الب زميبة خ يا الدق الملتهمة المتجولةوالتي من خ لها يز ا عد

(Plasmatocytes ( وخ يببا الببدق الحبيبيببة )Granular haemocytes )التببي يعببو لهببا الف بب و

و Lavineوالذا ماأكده ك مبن , ي تدخ إل اخ جست اليرةات األكبر في التهاق األجساق الغريبة الت

strand (2002 اذ ذكببرا ان عوامبب الببدفاع الخلببوي فببي رتبببة حرشببفية األجنحببة تتجلبب فببي الببذين )

في حين إن يرةات األطوار األول لت ترتم أجهزتها الدفاعية خاتة خ يبا البدق النوعين من الخ يا ,

في التهباق ة( والتي ال تمترب عا Prohaematocytesالمترونة التي اغلبها ترون من النوع البدائي )

( . 1992الداخلة إل تجويف جسمها ) الزويدي, األجساق الغريبةوالبرتريا


77

0102030405060708090

100

In 1 In 4 In 7

83.7 79.6972.17

كالله

لية

ئولم

ابة

سلنا

األطوار اليرقية

G. mellonella

في يرقات عثة الشمع الكبرى M. anisopliaeلفطر ل البوغي معلقال( تأثير 3جدول )

G. mellonella

التراكيز )بوغ /مل ( الطور للهالك بعد )ساعة(المصححة النسبة المئوية

24 72 120

62.90 37.83 17.77 104×1 األول

1×105 23.79 48.86 77.94

1×106 35.82 58.88 93.98

1×107 51.87 76.94 100.00

58.88 34.82 16.77 104×1 الرابع

1×105 22.78 46.85 74.93

1×106 36.82 61.89 87.97

1×107 44.85 76.94 96.99

50.86 31.81 14.76 104×1 السابع

1×105 18.77 35.82 68.91

1×106 31.81 53.87 77.94

1×107 40.83 69.92 90.97

4.23= لألطوار 11.95 =للزمن 5.67 للتراكيز = 0.05تحت مستوى معنوية L.S.Dقيمة -

In= Instar*

M. anisopliaeلفطر البوغي لعالق لل الثالثاليرقية األطوار استعداد( 4شكل)

In 1 , الطور اليرقي االول = In 4رابع= الطور اليرقي ال ,In 7ابعس= الطور اليرقي ال

راشح المزرعبة مختلفة من راكيز( تأثير ت4يوضح الجدول )ف المزرعة للفطرراشح اما عن تأثيرات

والتبي األولنسببة الب ب فبي يرةبات الطبور أةص %100 ركيزسب الت اذ الث ثةاليرةية األطوارفي

هببذه ل % 67.96أوطبأ نسببة الب ب ولغب %25 تركيببزسباعة , وينمبا سبج ال 72وعبد % 100ولغب


78

اليرةي األول ورةة ورالافة , وسب ارتفاع نس اله ب الو تغر حجت الطور يرةات في المدة نفسهاال

طبقبة الربايتين ف ب عبن النظباق البدفاعي فيهبا غيبر مرتمب ممبا يسبمح جدار الجست فيبه ل بعف سبمك

األوا ي لهذا الطور ومن الجدير والذكر ان الفطر ةبا ر علب ألنزيمات الفطر ان تحدث ال رر القات و

افراز انزيمات البروتييز والرايتنيز وال يبيز والتي يختلف افرازالا وحس نوع السب لة الفطريبة ونبوع

( ان يرةبات العمبر األول لفراشبة 1952) Arnold ذكبر, (Balachander etal.,2012) العائب

( % فبي حبين 33-36) Prohaemocytesترون نسبة خ يبا البدق فيهبا مبن نبوع Ephestiaالطحين

ووبين . في يرةات العمر األخير كما ان الذه الخ يبا ةلمبا تمبترب فبي عمليبة األلتهباق % 3التتجاوز الـ

Witting (1965 إن )مبببببببن مجمببببببب عبببببببد خ يبببببببا البببببببدق المتجولبببببببة ليرةبببببببة حمبببببببرة % 50

Pseudaletia unipuncta ( Haworth ) ( Lepidoptera : Noctuidae ) شاركــ فـي

Bacillus thuringiensis عملية االلتهاق وعد حقن اليرةة وجرع عالية من عصيات البرتريبا البلوريبة

من خ يا الدق الب زمية ةيقة النواة ساالم في تلك العملية. % 90وإن

وكبذلك وبين مبدة التعبر ونسببة الهب ب تركيزالك من وجو ع ةة طر ية وين توضح الذه النتائجو

وجو فروةبات معنويبة وبين مبد التعبريض فمبث كانب إل اإلحصائيويمير التحلي . ونس اله ب

وارتفعب % 100وبالتركيز سباعة مبن المعاملبة 24وعبد % 77.97األول نسبة ال ب يرةبات الطبور

إلبب تمببير النتببائج و .علبب التببوالي سبباعة مببن المعاملببة 72و 48وعببد (% 100و 90.99) إلبب

أكثرالببا األولكببان الطببور إذ , الخبباق للفطبر راشببح المزرعببةاليرةيببة لتراكيبز األطوار اسببتعدا اخبت ف

شبر ا مقاومبة ملحوظبة للتراكيبز المسبتخدمة جميعبا سباوالطبور ال أوبد كيبز وينمبا اترللجميبا ا استعدا ا

(5 ) .


79

في االطوار اليرقية الثالث M. anisopliaeلفطر ل الخامراشح المزرعة مختلفة من راكيزت( تأثير 4جدول )

G. mellonellaعثة الشمع الكبرى ل

التركيز الطور النسبة المئوية للهالك بعد )ساعة(

24 48 72

67.96 61.95 38.93 %25 األول

50% 48.94 77.97 78.97

75% 66.96 84.98 91.99

100% 77.97 90.99 100.00

64.96 54.95 34.92 %25 الرابع

50% 45.94 60.95 68.97

75% 63.96 78.97 87.99

100% 67.96 86.98 97.00

54.95 39.93 28.91 %25 السابع

50% 40.93 59.95 63.96

75% 51.94 71.97 77.97

100% 65.96 79.98 91.99 4.6, للزمن= 5.51, للتراكيز= 8.9لألطوار= 0.05تحت مستوى معنوية L.S.Dقيمة

In= Instar *

M. anisopliaeللفطر راشح المزرعة االطوار اليرقية الثالثة لتراكيز ( استعداد5شكل )

In 1 , الطور اليرقي االول = In 4رابع= الطور اليرقي ال ,In 7ابعس= الطور اليرقي ال

وبببطء فوجببد أنهببا تتسببت طبيعببي الغيببر م حظببة سببلوب اليرةببات ومببن خبب ل سببير الدراسببة تمبب

عن الحركة والتغذية , كما كان اليرةات ممتدة ومبر طبولي حيان تماالد متوةفة الحركة وفي اغل األ

ن اليرةات المصاوة يظهر عليهبا وقبا أ التجار تح ورق الترشيح ولوحظعل السطح الداخلي لقناني

0102030405060708090

100

In 1 In 4 In 7

84.73 79.73 72.22

كالله

لية

ئولم

ابة

سلنا

األطوار اليرقية

G. mellonella


80

(, ان تلبون 1مبوت اليرةبة ) تبورة يتحول ال اللون األسبو وعبد سو اء ويصبح لونها اكن ومن ثت

لجهاز المنباعي الريوتر والبقا السو اء يدل عل فرط المي نين والذا ودوره م شر عن مهاجمة الفطر ل

ل عبن عمليتبي والبو المسب و Phenoloxidaseوالذا األمر يعم عل تحفيز النظباق األنزيمبي لليرةة

( . (Pathogen resistance Bitondi et al.,1998ومقاومة الممرضات Melanosisالملننة

- C- - B- - A-

يرقة سليمة يرقة مصابة يرقة ميتة

G. mellonella عثة الشمع الكبرى يرقات في M. anisopliae الفطر ( تأثير معامالت 1صورة )

( اذ وجدوا ظهور وقا سبو اء اللبون علب كيوترب 2012وجماعته ) Husseinوالذه النتيجة تتفق ما

ويميبب لونببه البب األسببو عنببد تعري ببها لعببالق الفطببرينلعثببة المببما الربببر يرةببات الطببور الراوببا

M. anisopliae وB. bassiana .

حصبب علبب نسبببة البب ب اذRoberts (1970)نتببائج الحاليببة األختبببار الحيببوي للدراسببة نتببائج مبباوهت

mg 0.02 وتركيز M. anisopliae الفطر ألوواغعند تعري ها An. gambiae ليرةات 100%

Cx. pipiensليرةات وعو أمراضية األكثر M. anisopliae وان عزالت . أياق أروعةوعد مرور

pipiens 100أ ت إل ال كها ونسبة% ( خ ل خمسة أياقDaoust and Roberts,1982 ) . ووبين

DeAndrade (1993) أن تعريض يرةات الطبور الثباني لبعبوAn.walkeri البذا الفطبر ألوبواغ

. أياقال ب اليرةات جميعا وعد مرور أروعة إل أ

األوبواغنتيجبة السبتنبات ايباق 5-3تعبي لمبدة ةبد M. anisopliae ان الحمبرات المصباوة وبالفطر

الفتحبات سباعة مبن مهاجمبة جسبت عائلهبا وذلبك عببر 48ومبر واضبح وعبد واختراق الخيوط الفطريبة

ثببت تمتببد الفتحببات التنفسببية إلغبب قوالببذي يسببب اختنبباق اليرةببات نتيجببة والقصبببات الهوائيببة التنفسببية

, الفطبر فبي القنباة الوسبط لليرةبات واسبتنزاف المبوا الغذائيبة لليرةبات لتخترق خ يا البمرة ثبت ينمبو

وعببد %100البب حمببرات ال ةببد تصبب نسبببة البب بووالتببالي سبباعة تببتحطت األنسببجة الدالنيببة 72ووعببد

وعبض اليرةبات أن. كمبا ( El-Sinary , 2002 ; Quesada-Moraga et al., 2006) سباعة 96


81

Laceyوأضباف (Roberts,1970; Ravallec et al.,1989)المعاملبة تمبوت خب ل االنسب

تسمت الدق إل سموق من الفطر والذي ي ي إفرازيتبعه للوواغاوت ع اليرةات أن (1988) وجماعته

ساعة . 24موت اليرةات خ ل إل ونتيجة لذلك ي ي

كلمببا از ا تركيببز العببالق البببوغي للفطببر اذونسبب الهبب ب طر يببة األوببواغتركيببز مببا وببينالع ةببة ان

األساسببية)الوحببدات األوببواغزيببا ة عببد إلبب أرتفببا معببدل البب ب الحمببرة , وةببد يعببو السببب فببي ذلببك

الجهاز المناعي لليرةات يستطيا الدفاع عبن الجسبت فقبط عنبد التراكيبز أنف عن الفطرية( لإلتاوة

ان تعبريض , (Scholte et al.,2003a)الواطئبة وعنبد زيبا ة التركيبز يفقبد الجهباز المنباعي كفاءتبه

ال كهبا إل أ B. bassianaالفطر ألوواغ Cx. quinqufasciatusيرةات الطور الثالث لبعو

107×1وتركيبز % 97.11ووغ/م خب ل يبومين وونسببة الب ب ولغب 108×1وتركيز %100ونسبة

( ان نس اله كات فبي 2011, وين كريت ) (Gayathri et al.,2010)ووغ/م وعد مرور خمسة اياق

.Bر األطببوار اليرةيببة المختلفببة لببدو ة المببما الربببر تببز ا وزيببا ة تراكيببز العببالق الفطببري للفطبب

bassiana ( 105× 2.317(% عنبببد التراكيبببز ) 22, 28.9, 38اذ كانببب نسببب القتببب لليرةبببات

( عل نف النتيجة 2011( عل التوالي . كذلك حص المحنة ) 101× 2.317 و 103× 2.317و

Cx. Quinquefasciatus و An. stephensiعنببدما عببر األطببوار األروعببة ليرةببات البعببو

اذ وجبد ان نسب الهب ب تبز ا وزيبا ة تركيبز العبالق M. anisopliae لتراكيز العالق الفطري للفطر

عن نتائج من سبقه اذ وجد ان نسبة (2012وجماعته ) Husseinالفطري ومدة التعر , ولت يختلف

فقد كان نسبة اله كات فبي يرةبات الطبور الراوبا المعلق البوغي اله ب تز ا طر يا ما زيا ة تركيز

4.8 و 103× 4.8 و 102× 4.8(% عند التركيز ) 100, 90, 65, 20, 10لعثة المما الربر )

Man3085AUMC( علببب التبببوالي لعبببالق السببب لة الفطريبببة 106× 4.8و 105× 4.8 و 104×

. M. anisopliae للفطر

نتببائج الدراسببة الحاليببة مببا مببا حصبب عليببه اتفقبب اليرةيببة فقببد األطببوارأمببا وخصببوا حساسببية

Balaraman اليرةيبببببة لبعبببببو األطبببببوارعنبببببدما وتبببببف الع ةبببببة وبببببين (1979)وجماعتبببببه

An. stephensi أنضباف تقب كلمبا تقبدق عمبر الطبور , وأ نسببة الهب ب أنونسبة اله ب حيث وجبد

%73والثالببث ونسبببة %89يليببه الطببور الثبباني ونسبببة %100ولغبب األولنسبببة البب ب يرةببات الطببور

. mg 0.033وتركيز M. anisopliaeلفطر لعند معاملتها والعالق الفطري %71والراوا ونسبة

األولمبن ان يرةبات الطبور (2010) وجماعتبه Bukhari ليبهامبا مبا توتب النتبائج الحاليبة تتفق و

الفطببببر ألوببببواغترببببون اكثببببر حساسببببية An. Stephensiو An. gambiaeوالثبببباني للنببببوعين

M. anisolpliae وسبب رةبة األولمن يرةبات الطبور الثالبث والراوبا , ويعلب الب ب يرةبات الطبور

الثالبث مبا يرةبات الطبور والمقارنبةالفطريبة لإلتباوةعرضبة أكثبرالريوتر وعد االنس مما يجعلها


82

الفطريبببببببة لإلتببببببباوةالراوبببببببا التبببببببي تربببببببون ذات كيوترببببببب متبببببببثخن ووالتبببببببالي أةببببببب عرضبببببببة و

(Sandhu et al.,1993; Lord and Fukuda, 1990) .

الحاوي عل ست anisopliae M . الفطر مزرعة ( ان راشح 1989وجماعته ) Huxhamذكر

الدستروكسبببين ةبببد اثبببر علببب المناعبببة الخلويبببة وتثبيطبببه لخ يبببا البببدق لحمبببرتي الصرتبببر األمريربببي

Periplaneta americana و الجرا الصحراويSchistocerca gregaria .

للفطببببببببببرينراشببببببببببح المزرعببببببببببة ( ان b,c 1997وجماعتببببببببببه ) Vilcinskasكببببببببببذلك ذكببببببببببر

. anisopliae M وB. bassiana ت عف التمييز الخلبوي والتفباع ت الدفاعيبة للعائب اذ وجبدوا

Onofreان الببذه النببواتج ت ببعف الخ يببا الب زميببة المعزولببة مببن يرةببات عثببة المببما الربببر . وجببد

لهبا تباثير Nomuraea rileyiالفطبر راشبح مزرعبة ( ان الببتيبدات المعزولبة مبن2002وجماعته )

وان Anticarsia gemmatalis (Lep. : Noctuidae)ةاتبب فببي يرةببات الطببور الثالببث لحمببرة

و 80 و 40 و 10 و 2الع ةة وين نسبة اله ب وتركيبز الببتيبد كانب طر يبة اذ ولغب نسببة الهب ب )

( ملغبت / مب علب 1.0 و 0.2 و 0.1 و 0.01 و 0.001 و 0.0001(% عند التركيز ) 82.6 و 81

التوالي .

الخاق للفطر راشح المزرعةملغت من 1.8أن خلط (2006)وجماعته Quesada-Moraga اكد

M. anisopliae غت من الغذاء ي ي إل ال ب يرةات الطور الثباني لحمبرة 1ماSpodoptera

littoralis وعد سبعة أياق من التغذية . %85.5ونسبة

من المعروف أن الرثيبر مبن الفطريبات الممرضبة للحمبرات تمتلبك مبد واسبا مبن الم بائف وتسبب

المببوت السببريا لم ببائفها ويعببو ذلببك المت كهببا نببواتج ثانويببة حيويببة تأخببذ ورا مهمببا فببي أمراضببية

ا الجهباز الفطريات للحمبرات المسبتهدفة , إذ تمتباز النبواتج االي بية الثانويبة وقاوليتهبا علب التبداخ مب

المناعي وتغيرات في سلوب الم يف مث اختزال النماط و شل الحمرة واختزال التغذية وتغيرات في

. (Charnley, 2003)تراكي األنسجة ووالتالي الموت السريا للم يف

( عند معاملة الطور الساوا ليرةات عثة المما الرببر 2012ة لما وجده العطبي )اي ا النتيجة مقارو

مستخلص نوعين من البرووول والمبا البرووبول السبوري والعراةبي اذ وجبد ان نسببة الهب ب تبز ا و

( % 26.66 و 15.56 و 13.36وزيببببببببا ة تركيببببببببز البرووببببببببول وكانبببببببب نتببببببببائج اله كببببببببات )

البرووببول مببن مسببتخلص ( % 75, 50, 25كيببز )اترال( % عنببد 24.83 و 14.83 و 6.66) و

والعراةي عل التوالي . السوري

دور العذراء ي ي فاالختبار الحيو 3 -4-1

عثبة المبما الرببر في عذار المعلق البوغي( تأثير تراكيز مختلفة من 5الجدول )توضح النتائج في

mellonella .G واوطبأ نسببة ووغ/مب 1107×عنبد التركيبز % 54.89نسبة الب ب أعل سجل اذ


83

وةد اثب التحلي األحصائي وجبو فروةبات معنويبة , ووغ/م 14×10عند التركيز % 36.85ال ب

مببن الببذه النتببائج وجببو اذ ي حببظ فببي النسبب المصببححة له كببات العببذار تبعببا للتراكيببز المسببتخدمة ,

راشبح مختلفبة مبن راكيبز( تبأثير ت6يوضبح الجبدول ) كمبا . ع ةة طر ية وين التراكيز ونس اله ب

, % 50.96 أةص نسبة ال ب والتي ولغ %100 ركيزسب الت عذار عثة المما اذفي المزرعة

,وانعدم اله كات في معاملة السيطرة % 32.95أوطأ نسبة ال ب ولغ %25 ركيزوينما سج الت

. ونسبة اله ب ركيزوجو ع ةة طر ية وين الت اي ا النتائجوضح تو

فبي العبذار يعبو الب وجبو المبرانق المزرعبة للفطبرراشبح سب انخفا تأثير ك من عالق و ان

كيوترب نتقلب مبن اختبراق األوبواغ ف ب عب التي تنسجها والتبي تعمب كبيئبة كارالبة للمباء , كمبا انهبا

وذلك الن وناء الرايتين يص ال اعل مستو له في مراح اليرةية األطوارالعذار أكثر ت وة من

. وظهبرت ( Ferkovich et al. ,1981)ماةبب العبذراء والعبذراء البي باء وةبب وبزوغ البالغبات

أعرا اإلتاوة عل العذار المري بة التبي تمثلب ولونهبا البنبي البداكن عنبد ودايبة اإلتباوة متحبوال

. -2-تورة اإلتاوة إل اللون األسو في نهاية

G. mellonella عثة الشمع الكبرىل لفطري في دور العذراءل البوغي لقعم( تأثير ال5جدول )

النسبة المئوية للهالك المعاملة عذارىعدد ال التركيز )بوغ / مل(

1×104 40 36.85

1×105 40 45.87

1×106 40

49.88

1×107 40 54.89

1.2للتراكيز= 0.05تح مستو معنوية L.S.Dةيمة

G. mellonella عثة الشمع الكبرىل في دور العذراءالخام راشح المزرعة ( تأثير 6جدول )

النسبة المئوية للهالك عدد العذارى المعاملة التركيز

25% 40 32.95

50% 40 40.95

75% 40 44.96

100% 40 50.96

1.38= 0.05ح مستو معنوية ت L.S.Dةيمة


84

) الى األعلى G. mellonellaعثة الشمع الكبرى عذارى في M. anisopliae الفطر ( تأثير معامالت 2صورة )

العذارى المصابة ويالحظ تغير لونها الى اللون األسود , الى األسفل العذارى السليمة (

تعبببببريض عبببببذار ذواوبببببة القبببببرن أن إلببببب (2005)وجماعتبببببه Angel-Sahagunأشبببببار

Haematobia irritans مبن الفطريبات أنبواع ةث ثب إلبM. anisopliae وB. bassiana و

P. fumosoroseus ( 71.3 - %50سببب ال كهببا ونسبب انحصببرت وببين% ) .البب ب ةوولغبب نسببب

وتركيبز .bassianaBالفطبر ألوبواغعنبد تعري بها ipiens pipienspCx. 30%عذار وعبو

( علب نسببة ةتب لعبذار الذواوبة المنزليبة 2010) وحص الممهداني. ( 2007/م )علي, ووغ 104

Musca domestica الفطبر ألوبواغعنبد تعري بها %16.66ولغبEntomophthora muscae

لبقعمال( فقبد اكبدوا ان تراكيبز 2010وجماعتبه ) Shanthakumarامبا وبوغ /مب , 105×5وتركيبز

Spodopteraلببت تبب ثر علبب نسبب البب ب العببذار لحمببرة Nomuraea rileyiللفطببر البببوغي

litura وقدر تاثيرالا في احداث التمبوالات للبالغبات البازغبة مبن البذه العبذار وةبد ولغب نسببة التمبوه

يبدي وةبد اكبد العب / مب . وبوغ 106× 2.4عنبد تعبريض العبذار للتركيبز % 96.7لبالغات الحمرة

تبباثير ةليبب فببي عببذار و ة ورق القطببن ةياسببا ومعاملببة B. bassiana( ان للفطببر 2011وسببمير)

.Anوعوضببتي عببذار كمببا تببدن نسبب الهبب ب فببي المقارنببة التببي ولببغ معببدل المببوت فيهببا تببفر ,

stephensi و Cx. Quinquefasciatus لفطر ل البوغي لقعملل عند تعرضهاM. anisopliae

%46.66لعبذار االنبوفلي و %50ولغب ووغ/مب 25×10نسبة ال ب عند التركيبز أعل اذ ولغ

( , وجبد 2011لفطبر )المحنبة ,ل الببوغي لبقعملل ساعة من ودايبة التعبر 72ووعد لعذار الريولر


85

Nomuraea rileyiللفطبر ببوغي( عند معاملته عذار عثة المبما الرببر والعبالق ال2011كريت )

الفطبر وةبدرتها علب اختبراق شبرنقة العبذراء أوبواغوعل ذلبك وصبغر % 100ان نس اله ب ولغ

فقبد B. bassianaلفطبر الببوغي لعبالق الومن ثت اتماق عملية التطف امبا عنبد معاملتبه البذه العبذار و

و 103 × 218.7 و 105 × 218.7( % عنبببد التركيبببز ) 15 و 35 و 25كانببب نسببب الهببب ب )

( ووغ / م عل التوالي وةد كان الذه اة نس اله كات من وين ك المعام ت التي 101 × 218.7

فطببببرلل البببببوغي لببببقعمال( تبببباثير تراكيببببز 2012جروببببه فببببي وحثببببه , رع محمببببو وجماعتببببه )

M. anisopliae في عذار خنفسباء اللوويبا الجنوويبةCallosobruchus maculates وةبد وجبدوا

و 5 10× 5( % عنبد التركيبز ) 70 و 70 و 100ساعة ولغب ) 120ان نس اله ب للعذار وعمر

/م عل التوالي . ( ووغ 1 10× 5 و 3 10× 5

االختبار الحيوي في البالغات 4 -4-1

G. mellonellaلفطر فبي والغبات ل البوغي لقعمتأثير تراكيز مختلفة من ال إل ( 7يمير الجدول )

وببوغ /مبب لربب مببن الببذكور 1107×أن أعلبب نسبببة البب ب سببجل عنببد التركيببز حيببث لبب النتببائج

سبباعة , فببي 168وعببد مبرور % 63.94 واإلنباث % 69.95 ذكورالببكانبب نسببة البب ب اذ ,واإلنباث

نبباثاألوذكور الببكانبب نسبببة البب ب اذ وببوغ /مبب 1104×حببين كانبب أوطببأ نسبببة البب ب عنببد التركيببز

وةببد اثببب التحليبب االحصببائي وجببو فروةببات معنويببة تبعببا . علبب التببوالي % 43.91و % 41.91

الع ةة وين أن ناهأيستنتج من الجدول و للجن ولصالح االناث التي اظهرت مقاومة اكبر من الذكور ,

أمبا وخصبوا حساسبية جبن الحمبرة نسب الهب ب كانب طر يبة ,كب مبن و المعلبق الببوغيتراكيز

عثة المما . إناثمن لإلتاوةحساسية أكثرذكور كان ال أن( 6فيوضح المر )

فبي M. anisopliae الخباق للفطبرراشبح المزرعبة ( تبأثير تراكيبز مختلفبة مبن 8يوضبح الجبدول )و

علببببببببب وببببببببباةي المعبببببببببام ت ونسببببببببببة %100والغببببببببات عثبببببببببة المبببببببببما , اذ تفبببببببببوق التركيببببببببز

سبباعة , وينمببا سببج التركيببز 72( % للببذكور واألنبباث علبب التببوالي وعببد 58.98و 68.90 البب ب )

واألنبباث علبب التببوالي وفببي المببدة ( % للببذكور 32.97و 37.98أوطببأ نسبببة البب ب ولغبب ) 25%

وجو ع ةة طر ية وين ك , وتوضح النتائجنفسها . في حين لت تسج معاملة السيطرة أية نسبة ال ب

من نس اله ب والتركيز . و عم جميبا النتبائج مبن خب ل الفروةبات المعنويبة وبين المعبام ت ,كمبا

ور واألنباث فبي معبدالت الهب ب علب البرغت مبن ان وين النتائج عدق وجو فروةبات معنويبة وبين البذك

. ( 7شر )الذكور كان اكثر حساسية من األناث


86

0102030405060708090

100

ذكور اناث

56.93 52.92

كالله

لية

ئولم

ابة

سلنا

الجنس

G. mellonella

G. mellonellaلعثة الشمع الكبرى بالغاتلفطر في دور الل البوغي علقملا( تأثير 7جدول )

النسبة المئوية للهالك التركيز الجنس

ذكور

1×104 41.91

1×105 53.93

1×106 61.94

1×107 69.95

اناث

1×104 43.91

1×105 47.92

1×106 55.93

1×107 63.94

1.3 = 0.05تحت مستوى معنوية L.S.Dقيمة

لفطرالبوغي ل معلقالتراكيز ل G. mellonellaعثة الشمع الكبرى ذكور واناث استعداد( 6شكل )

M. anisopliae

G. mellonella عثة الشمع الكبرىبالغات في الخام راشح المزرعة مختلفة من تراكيز( تأثير 8جدول )

النسبة المئوية للهالك التركيز الجنس

ذكور

25% 37.98

50% 44.98

75% 60.98

100% 68.90

اناث

25% 32.97

50% 42.98

75% 52.98

100% 58.98

6.29= 0.05ح مستو معنوية ت L.S.Dةيمة


87

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ذكور اناث

53.2146.98

كالله

لية

ئولم

ابة

سلنا

الجنس

G. mellonella

لفطرالمزرعة الخام لراشح تراكيز ل G. mellonella عثة الشمع الكبرىذكور واناث استعداد( 7شكل )

M. anisopliae

عنببببببدما عببببببر والغببببببات 1968) (وجماعتببببببه Clarkنتببببببائج تمبببببباوه النتببببببائج الحاليببببببة

Cx. tarsalis وCx. pipiens و Ae. Aegypti و Oc. sierrensis و An. albimanus

وجماعته Scholte وينو .أياقال كها جميعا خ ل خمسة إل حيث أ B. bassianaالفطر ألوواغ

(2003b) 50ان ةيمببةLT ) ) يببوق عنببد 3.5ي وتسبباالببزمن البب زق لهبب ب نصببف العببد مببن الحمببرات

إلنبباثيبوق 4.1تلبك القيمبة بلببغ, وت B. bassianaالفطبر ألوببواغ An. gambiaeتعبريض والغبات

ووغ/مببب 1.610×10وتركيبببز M. anisopliaeعنبببد تعري بببها للفطبببر Ae. aegyptiوعبببو

(Scholte et al.,2007) , يبوق عنبد تعري بها 4.4في حين ولغ القيمة المذكورة وللبعبو نفسبها

, وفببي راسببات اخببر لتجريبب اثببر الفطريببات (Leles et al.,2010)الفطببر المببذكور ألوببواغ

M. anisopliae وB.bassiana في والغبات خنفسباء اللوويبا الجنوويبة جبرCherry وجماعتبه

فببي والغببات الحمببرة الببي عزلببة فطريببة مببن الفطببرين ووجببد ان اكثببر عببزلتين اثببرت 12( 2005)

0362 B.bassiana 0351و M. anisopliae ( 104× 9.10وكانب الجرعبة نصبف القاتلبة

( فقبد جروبوا خمب 2011وجماعتهبا ) Mahdneshin( ووغ/ م عل التوالي , امبا 104× 7.10و

ووجبدوا ان خنفساء اللوويا الجنووية في والغات B.bassianaو M. anisopliaeعزالت للفطرين

اذ حقق اعل نسبة ال ب IRAN 715C B.bassianaاكثر عزلة فطرية م ثرة في البالغات الي

وبوغ / مب , وبين 108× 1ر ذو التركيبز لفطالعالق البوغي لعند غم والغات الحمرة و % 76ولغ

فببي والغببات البعببو M. anisopliaeللفطببر البببوغي ( فببي راسببته تببأثير العببالق 2011المحنببة )


88

sienAn. steph وCx. quinquefasciatus وبوغ 25×10أعلب نسببة الب ب عنبد التركيبز وكانب

An. stephensiكانب نسبببة الب ب ذكبور وعببو و ولربب النبوعين , واإلنباث/مب لرب مببن البذكور

سبباعة , وينمببا ولغبب نسبببة البب ب ذكببور وعببو النببوع 168وعببد مببرور %96.66 واإلنبباث 100%

22×10في المدة ذاتها , في حين كان أوطأ نسبة ال ب عند التركيز %90 اإلناثو %93.33الثاني

علب التبوالي %56.66و %66.66 ولاألوعبو النبوع وإنباثكانب نسببة الب ب ذكبور وووغ /مب

فبي المبدة %50و %56.66 والتبي ولغب وعبو النبوع الثباني وإناثنة ما نس ال ب ذكور قاروالم

لفطببر فببي احببداث مختلببف البببوغي لالعببالق و. اسببتعم وعببض الببباحثين تببأثير الغببذاء المخلببوط نفسببها

الببببوغي الغبببذاء المعامببب والعبببالق( ان 2011التبببأثيرات فبببي عثبببة المبببما الرببببر فقبببد اكبببد كبببريت )

البو تبأثيراةد اثر عل عمبر األنباث و وضبعها للببيض وكبان اكثبر التراكيبز B. bassiana لفطرل

يبوق وعبد 5انباث معاملبة ( اذ كبان عمبر االنباث × ووغ /م في معاملة )ذكور معاملة 105× 265.1

انباث سبليمة ( ×)ذكور سليمةانث مقارنة ومعاملة السيطرة وي ة لر 374البيض الموضوع من ةبلها

لر انث . وي ة 1064يوق وعد البيض الموضوع 13.33اذ ولغ عمر االناث

أخر من الفطريات فبي أنواعحول تأثير األوحاثالعاق ما وعض إطارالاتنسجت النتائج الحالية في

أن تعببببريض والغببببات وعببببو Soares (1982)البعو حيببببث ذكببببر كبببب الحمببببرات والغببببات

Oc. sierrensis لفطبر البوغي لعالق للT. cylindrosporum إلب ووغ/مب يب ي 56×10وتركيبز

الفطبر لاعممبن المعاملبة . وان اسبت أيباقوعبد تسبعة %100و أيباقمن البالغات وعد خمسة %50ال ب

Fusarium pallidorosum إنباثضبد Cx. quinquefascitus جميعبا خب لال كهبا إلب يب ي

عثببة المببما والغببات وإنبباث. وفيمببا يتعلببق وحساسببية ذكببور (Mohanty et al.,2008a) أيبباق أروعببة

(2003a)وجماعتبه Scholte فقد جاءت نتائج الدراسة ممباوهة لمبا وجبده , الفطر ألوواغالربر

ممبا An. gambiae وإنباثووغ /مب ضبد ذكبور 1.68×10الدراسة وتركيز ةيد الفطر استعم عندما

الببببببب ب والغبببببببات أناي بببببببا أوضبببببببح, كمبببببببا أيبببببباقأ البببببب ال كهبببببببا جميعبببببببا خببببببب ل سببببببببعة

Cx. quinquefasciatus وببين . لإلنبباث أيبباقللببذكور وسبببعة أيبباقوعببد مببرور سببتة %100ولغبب

Mnyone الفطببر المببذكور مببن سبب لة أن (2009) وجماعتببهIP46 النببوعين وإنبباثيصببي ذكببور

An. gambiae وAn. arabiensis واإلتبباوةلنببوعين ترببون أكثببر تببأثيرا اوجببد ان ذكببور كبب اذ

Kaaya (1989)أخبر مبن الحمبرات الطبيبة, فقبد وجبد أنواعبا. وفيما يخبص اإلناثالفطرية من

وبببالفطرين لإلتببباوةأكثبببر حساسبببية G. morsitans morsitansتسبببي ان ذكبببور ذواوبببة التسبببي

M. anisopliae و B.bassiana كبب مببن . وتتعببار فببي الوةبب نفسببه مببا مببا وجببده اإلنبباثمببن

Maniania و Odulaja (1998) الفطر ةيد الدراسة ألوواغالذواوة المذكورة عند تعري ها ن انم

و لإلنباث %98وبالفطر مبن البذكور , حيبث كانب نسببة ال كهبا لإلتباوةكثبر حساسبية أ اإلنباث ترون


89

لعثبة المبما الرببر البذكور مبن ( في راسبته ان البالغبات 2011كريت )وجد , كذلك للذكور 89.6%

من األناث . B.bassianaللفطر البوغي اة تاثرا والعالق

الجبوري نتائج في البالغات فتماوهلفطر ل المزرعة الخاقراشح لية لتاثير اما عن النتائج الحا

لفطرالمزرعة الخاق لوراشح Musca domesticaوالغات الذواوة المنزلية ( عندما عام 2003)

Aspergillus niger ساعة . وأشار 96وعد مرور %90أ إل ال كها ونسبة Verma و

Praksh (2010) ان معاملة خليط من والغاتAn. stephensi وCx. quinquefasciatus و

Ae. aegypti للفطر راشح المزرعة وC. tropicum 9:1وتركيز (Metabolite /Methanol)

Musca ساعات. وأن تعريض الذواوة المنزلية 8وعد %70.58سب ال ب البالغات ونسبة

domestica الفطر مزرعة لراشحE. muscae ساعة 48وعد %99.99أ إل ال كها ونسبة

( تراكيز مختلفة من راشح 2011( , اي ا جر المحنة )2010)الممهداني, %100د التركيز وعن

.Cxو An. stephensiمن البعو في والغات نوعين M. anisopliaeالفطر مزرعة

quinquefasciatus معنوي عل واةي المعام ت ونسبة ال ب وفارق %100 ف حظ تفوق التركيز

أوطأ نسبة %25 ساعة, وينما سج التركيز 72ي وعد للنوع الثان %96.66للنوع االول و 100%

أن األنزيمات والسموق . للنوعين ووحس الترتي وفي المدة نفسها %60و %70ال ب ولغ

ت ثر في الفعاليات الحيوية ألجساق الرائنات الحية فقد تعم عل تعطي وعض Mycotoxinالفطرية

. (Lalor etal.,1976)ة أو ةتلها أو ةد ت ثر عل نمو وتطور الحمرة األنسج

Aflatoxinلمرك Ae. aegyptiأن تعريض والغات (1982)وجماعته Wright وذكر

. ويقل من ةاوليته عل الفق لديها ي ي إل خفض أنتاج البيض %0.006وتركيز

M. anisopliae المنتجة من الفطروالمضادات الحيوية التحري عن األنزيمات 2- 4

في M. anisopliaeالفطر عن انتاج انزيمات البروتييز والرايتنيز وال يبيز من تت التحري

الخاا وانتاج الوسطوالذي تت التحري عنه في الحيوي م ا الانتاج عن ف ين انتاجيينطوس

. اع ه ين المذكورينطالوسالم ا ات الحيوية ع وة عل

ةاولية الفطر عل انتاج األنزيمات الث ثة فقد ولغ ( 9 ) جدولال الموضحة فيوةد وين النتائج

والرايتين المدعت ينالوسط وروتين في( وحدة / ملغت 4.11, 1.07) إلنزيت البروتييز الفعالية النوعية

اعل فعالية له في الوسط ولغ و المدعت والرازائين عل التوالي . اما انزيت الرايتنيز فقدالغروي

يليه الوسط المدعت وحدة / ملغت وروتين ( 2.48 اذ كان الفعالية النوعية ) المدعت والرايتين الغروي

. وةد اود انزيت ال يبيز اعل فعالية وروتينوحدة / ملغت ( 1.09)ولغ الفعالية النوعية والرازائين اذ

6.1الفعالية النوعية )كان الوسط المدعت والرايتين الغروي ثت في الوسط المدعت والرازائين اذ له في

. عل التواليوحدة / ملغت وروتين 4.02 )و


90

يعو ال االخت ف في ان التباين الحات في إفراز االنزيمات الث ثة في األوساط الزرعية المستعملة

. (Freimoser etal.,2005)نمط التعبير الجيني للفطر إذ أنه يختلف وحس طبيعة البيئة المغذية

منجاءت نتيجة الدراسة الحالية متماوهة ما العديد من الدراسات التي تت التحري فيها عن االنزيمات

ف عن راسة الظروف الم ئمة إلنتاج االنزيمات من الذه الفطريات. ففي راسة ة مختلففطريات

يز المنتج من الفطرن( عن نوع جديد من انزيت الرايت1999وجماعته ) Kangاجراالا

anisopliae M. ة وجد ان وسط الحد األ ن ]مرون من أم ح كبريتات المغنسيوق المائي

o2.7H4MgSo 0.5% 4وفوسفات الصو يوق أحا ية الهيدروجينNaHPO 0.5% والمدعت ]

8.66يز إذ ولغ الفعالية األنزيمية أعل ةيمة لها نوالرايتين الغروي كان األف في انتاج انزيت الرايت

. وحدة/م مقارنة وباةي األوساط

( ان الوسط المدعت والرايتين الغروي الو األف في انتاج 2002وجماعته ) Tikhonovوجد

و Verticillium chlamydosporiumانزيت الرايتينيز من الفطريات الممرضة للنيماتو ا

V. suchlasporium ولت تختلف نتيجة الباحثDuo-Chuan ( عما سبقه من 2005وجماعته )

لوسط المدعت والرايتين أعل انتاجية إلنزيت الرايتنيز المنتج من الفطر المتطف عل البحوث إذ أعط ا

. Talaromyces falvusالفطريات

Trichoderma virens UKMIولغ أعل فعالية نوعية النزيت الرايتينيز المنتج من الفطر

. (Abd-Aziz etal.,2008)( وحدة/ ملغت وروتين عند استعماله الرايتين الغروي 14.59)

( العديد من مصا ر الراروون والنايتروجين لتحديد 2009) Kaur و Dhar استعم ك من

ووجد ان الوسط الحاوي عل M. anisopliaeالمصدر األف في انتاج انزيت الرايتنيز من الفطر

الوسط األمث إلنتاج انزيت خميرة الخبز كمصدر نتيروجيني الو وني ووالرايتين الغروي كمصدر كار

الرايتينز, وأكد الباحثان عل ان انتاج انزيت الرايتينز يختلف واخت ف العزالت الفطرية والبيئات

تأثير مصدرين للراروون والما الرايتين Kaur (2010)و Dharلمستخدمة في تنمية الفطر . وحد ا

في أروعة اوساط انتاجية النتاج انزيت الغروي والدكستروز ومصدر نايتروجيني الو خميرة الخبز

ووجد ان الوسط الحاوي عل الرايتين الغروي B. bassianaعزلة فطرية للفطر 17يز من نالرايت

عل الرايتين الغروي الحاوي يز ثت الوسط نكمصدر وحيد للراروون الو األف في انتاج انزيت الرايت

الخارجية يتأثر كثيرا وبعض العوام كالمصا ر الراروونية والمدعت وخميرة الخبز. ان انتاج االنزيمات

. (Vaidya etal.,2001)والنايتروجينة و رجة الحموضة

( من خ ل راسته للظروف المثل إلنتاج انزيت ال يبيز من الفطر2009وجماعته ) Aliوجد

M. anisopliae م عند اضافة زي الزيتون / وحدة 1.96± 97.44أن أعل فعالية انزيمية ولغ

ال وسط الحد األ ن . 2%


91

عته وجما Bhagyaنتيجة الدراسة الحالية مطاوقة لما وجده فيما يخص انزيت البروتييز جاءت و

MM+C]وسط الحد األ ن المدعت والرازائين ين الزرعيينط( عند راستهت تأثير الوس2010)

من Pr2و Pr1عل انتاج انزيت البروتييز ] MM+CCلرايتين الغروي ووسط الحد األ ن المدعت وا

, إذ حص عل أعل فعالية M. anisopliae(UM4)و B. bassiana(UB9)الفطرين

و 28.5إذ ولغ الفعالية األنزيمية ) %1ساعة في الوسط المدعت والرازائين 72للنزيمين وعد مرور

و 30.08, وولغ ) B. bassianaالفطر منعل التوالي Pr2و Pr1( وحدة/ م للنزيمين 4.26

. M. anisopliaeالفطر منعل التوالي Pr2و Pr1( وحدة/م للنزيمين 16.36

( عند راستهت تأثير األوساط الزرعية 2010) Kaurو Dharأوضح

[MM+CC, MM+C, MM] عزلة فطرية للفطر 17ت البروتييز من عل انتاج انزيB.bassiana

ان وسط الحد األ ن المدعت والرازائين له القدرة عل انتاج أعل كمية من انزيت البروتييز كما ان وسط

غير ان وعض Pr1ةا ر عل ان يستحث انتاج انزيت %2الحد األ ن المدعت والرايتين الغروي

إذ ولغ الفعالية األنزيمية MMفي وسط الحد األ ن Pr1النزيت العزالت أظهرت فعالية عالية

عل التوالي, وأظهرت فعالية واطئة في UB13و UB3( وحدة/م في العزلتين 4.44و 3.88)

UB3( وحدة/م في العزلتين 0.07و 2.56إذ كان الفعالية االنزيمية ) %1الوسط المدعت والرازائين

ألنزيت (catabolite repression)عل التوالي والذه النتيجة تدل عل وجو كبح الدمي UB13و

Pr1 .عند وعض العزالت الفطرية

Trichoderma( في راسته لقاولية الفطر 2011وجماعته ) Cuervo-parralوين

harizianum VSL291 ز نيياوتييز والرايتنيز وال يبيز والزعل انتاج البرXylanases و

β -1,3-glucanases في وسط الحد األ ن المدعت والجدار الخلوي للفطريات الممرضة للنبات

و 0.60و 0.89و 0.42كمصدر للراروون وةد وجد أن أعل فعالية نوعية للنزيمات ةد ولغ )

. 3.1والرايتنيز وال يبيز و الزياالنيسز وويتا ( وحدة/ ملغت وروتين ألنزيت البروتييز 3.22و 1.82

كلوكانيز عل التوالي وفي الوسط المدعت والجدار الخلوي للفطر الممر للنبات

Moniliophthora roreri .

عل انتاج انزيت ال يبيز في Mucor racemosus( ةاولية الفطر 2010) وجماعته Nadia رع

الو %1و زي الزيتون : كلوكوز %3خمسة أوساط انتاجية وتبين ان الوسط الحاوي عل الببتون

7.3وحدة/م والفعالية النوعية 337.6األف في انتاج انزيت ال يبيز إذ ولغ الفعالية االنزيمية

وحدة/ ملغت وروتين.

عل انتاج M. anisopliae عزالت للفطر 4( اختبار ةاولية 2012وجماعته ) Rustiguelاستطاع

انزيت الرايتنيز تح تخمرات الحالة الصلبة وواستعمال شرانق و ة القز كما ة اساع وكان أعل


92

, ووين الباحث وأن الفطر IBCB360وحدة/غت من الما ة األساع( في الس لة 7.14انتاجية لإلنزيت )

النزيت الرايتنيز وذلك حس نوع الما ة األساع Isoformsرات انزيمية ةا ر عل انتاج متناظ

المستعملة في الوسط المغذي للفطر.

اةص انتاجية ألروعة من االنزيمات M.anisopliaeللفطر IWST-Ma7أظهرت العزلة الفطرية

ت الرايتينز و كايتين ( وحدة/ملغت وروتين ألنزي0.80و 0.98و 1.80و 1.90إذ ولغ الفعالية النوعية )

والبروتييز وال يبيز عل التوالي مقارنة والعزالت chitin deacetylase (CDA) ي استليز

و IWST- Ma4و IWST- Ma3و IWST- Ma2و IWST- Ma1التسعة والي

IWST- Ma13 وIWST- Ma16 وARSEF7413 وARSEF3603 وARSEF2596

(Balachander etal.,2012) .

( عن انزيمي البروتييز وال يبيز المفرزة من ةب عزالت 2012) وجماعته Husseinتحر

عزلة من الفطر 90. اختبرت ألج ذلك M.anisopliaeو الفطر B.bassianaالفطر

B. bassiana عزلة من الفطر 15وM. anisopliae الت الفطر . اظهرت جميا عز

B. bassiana ةاولية عل إفراز انزيت البروتييز عدا ثمانية عزالت, كما ان النالك تباينا وين العزالت

ت الي ـــــاج االنزيــــــلية في انتـــــــــــــــزالت فاعــــــــــــفي انتاج انزيت البروتييز غير أن اكثر الع

Bba AUMC Nos.3260, 3263, 3268, 3271, 3566, 3573 and 3574 والنسببة النبزيت و

يز فتستطيا جميا العزالت انتاج االنزيت وتختلف العزالت فيما وينها وقوة االنتاجية. ال يب

الخمسة عمر فأظهرت جميعها القدرة عل انتاج البروتييز وكان M. anisopliaeأما عزالت الفطر

, في حين أظهرت ستة عزالت فقط Man AUMC No.3329أعل انتاجية لإلنزيت من ةب العزلة

أةص انتاجية للنزيت. Man AUMCNo.3085القاولية عل انتاج ال يبيز وحقق العزلة

ر ةاولية ستة عزالت فطرية عل انتاج االنزيمات الث ثة ( ان يختب b2012وجماعته ) Khanاستطاع

والث ثة المتبقية تعو B.bassianaالبروتييز والرايتيز وال يبيز ث ثة من الذه العزالت تعو للفطر

الي األكفأ من وين العزالت الستة في V.lecanii 3. ووجد ان العزلة Verticillium lecaniiللفطر

ايتينيز وال يبيز وةدرته عل انتاج انزيت ال يبيز أعل من ةدرته في انتاج الرايتنيز. انتاج انزيمي الر

0.493الي األكفأ في انتاج انزيت البروتييز إذ ولغ الفعالية االنزيمية B.bassiana 70كما ان العزلة

وحدة/م في اليوق الثالث والراوا عل التوالي من ودء فترة الح ن. 0.64و

( وحثا حول ةاولية ث ثة أنواع من الفطريات الممرضة 2012) وجماعته Fernandesأجر الباحث

للحمرات عل إفراز انزيت البروتييز وال يبييز واالمليز والسيلوليز واالستريز والبرتنيز في وسط الحد

ةيد الدراسة, الخاتة ور نوع من أنواع االنزيمات (Substrates)األ ن المدعت وموا أساع


93

ةدرته العالية عل افراز انزيت البروتييز في M. anisopliaeوأظهرت نتائج الدراسة الخاتة والفطر

, وأظهر ةدرة اضعف النتاج واةي االنزيمات. %4و %1الوسط المدعت والجي تين عند التركيزين

اليوق الخام من فترة في B. bassiana (HQ917687) (Novel)ةأظهرت العزلة الفطرية الجديد

الح ن ةاولية عل افراز انزيت الرايتنيز أعل من ةاوليتها عل افراز انزيت البروتييز وال يبيز في

( 2.26و 4.66و 4.73و 5.24, إذ كان الفعالية االنزيمية )%1وسط الحد األ ن المدعت والرايتين

وال يبيز عل التوالي Pr2يز والبروتي Pr1وحدة/م النزيت الرايتنيز والبروتييز

(Mishra etal.,2013) .

في وسط الحد األ ن المدعت M. anisopliaeالفطر المنتجة من( :التحري عن االنزيمات 9جدول )

.والرايتين الغروي ووسط الحد األ ن المدعت والرازائين

*Collidal chitin(MM+CC), **Casein(MM+C)

كـ لي عل انتاجه .aureus S اعتمد عل تثبيط ورتريا فقد الحيويم ا ال وإنتاجاما فيما يتعلق

الحيويةم ا ات الوسط انتاج ملت في 5.3 لبرتريا ة وةد ولغ ةطر تثبيط اوساط األنتاجية الث ثضمن األ

استعمالالراشح المنتج من استعمالفي حين لت ي حظ وجو فعالية تثبيطية عند (10جدول )

. المدعت والرايتين الغروي والمدعت والرازائين الوسطين

( إذ اختبروا اضافة عدة أنواع من المصادر 2000وجماعته ) Liuان هذه النتيجة مشابهة لما وجده

لزيادة Czapek- Dox broth [CD broth]الكاربونية والنايتروجينية الى وسط انتاج الدستروكسين

كمصدر كاربوني والببتون Maltosوتبين ان اضافة المالتوز M.anisopliaeانتاجه من الفطر

Pepton كمصدر نايتروجيني هما األفضل في زيادة انتاجية الدستروكسين كما ان اضافة الحامض

)وحدة/ملغم بروتين(الفعالية النوعية نوع االنزيم نوع الوسط

MM+CCh*

1.07 وروتييز

2.48 كايتينيز

6.1 اليبيز

MM+Cas**

11 .4 وروتييز

1.09 كايتينيز

4.02 اليبيز


94

الى الوسط االنتاجي قد زاد االنتاجية الى الضعفين مقارنة %0.1بنسبة B-alanineاالميني

ن اضافة هذا الحامض هو المفتاح لبناء حلقة الدستروكسين، إذ بمجموعة السيطرة وهذا يدل على ا

αيرتبط حامض − 𝐻𝑦𝑑𝑟𝑜𝑥𝑦 مع β − 𝑎𝑙𝑎𝑛𝑖𝑛𝑒 خالل البناء الحيوي لهذا المنتج . -المالتوز, واكتو[نف مرونات وسط إنتاج الدستروكسين استعمالو (2007وجماعته ) Liuةاق

اآلنين, كلوكوز[ لغر راسة العوام الم ثرة عل إنتاج -, ويتا Bacto-peptonوبتون

( الو األمث إلنتاج 9ووجد ان الرةت الهيدروجيني ) M.anisopliaeمن الفطر Bو Aالدستروكسين

( ملغت/لتر عل التوالي كما ان اةص 310.6و 71.0إذ ولغ ةيمة اإلنتاجية ) Bو Aالدستروكسين

. (1.5vvm)ملغت/لتر عند نسبة تهوية 700.0وتل إل Bين إنتاجية للدستروكس

والمستخلص الناتج من وسط الحد األ ن المدعت والرايتين الغروي أو S. aureusان عدق تثبيط ورتريا

ذين الوسطين والذا ةد يرجا الرازائين ةد يعو إل عدق إنتاجية الم ا الحيوي )الدستروكسين( في ال

يوق.14-12فترة التخمر المستخدمة في الذه الدراسة, إذ عا ة ترون فترة التخمر إل ةصر

(Liu etal.,2000 ; Liu etal., 2007) .

M. anisopliaeمرك مختلف له ع ةة والدستروكسين عزل من ويئة الفطر 35يوجد اكثر من

(Pedras etal.,2002) وعزل الدستروكسين ألول مرة من الفطرM. anisopliae غير انه عزل

-Alternaria brassicae (Ayer and Penaأي ا من فطريات ممرضة أخر مث

Rodriguez,1987) . والفطر(Springer etal.,1984) Trichothecium roseum والفطر

(Venkatsubbaiah etal.,1994) Ophisophaerella herpotricha عل الرغت من ان و

إال أن وعض عزالته ترون ةليلة M. anisopliaeالدستروكسين شخص ألول مرة من الفطر

إ ذ إن إنتاج الدستروكسين يعتمد عل نوع (Wang etal.,2003)اإلنتاجية أو معدومة اإلنتاجية

. (Skrobek etal.,2008)الس لة ونوع الم يف

أو م ا Antitumoralيقوق الدستروكسين وعدة وظائف إذ إنه يعد كم ا للسرطان

أو مثبط cytotxicلخ يا أو ساق ل insecticidalأو ةات للحمرات antiviralفايروسي

كما phytotoxic (Liu and Tzeng, 2012)لنباتات أو ساق ل immunosuppressantمناعةلل

ان الدستروكسين يعد مثبط لنمو مختلف س الت البرتريا

(kaijiang and Roberts,1986;Dumas etal.,1995) والذا ي كد ما وجد في نتيجة الدراسة

من ةب الم ا الحيوي المنتج من ةب S. aureusالحالية إذ وجد ان النالك تثبيط لنمو ورتريا

. M. anisopliaeالفطر


95

M. anisopliaeالفطر المنتج من( :التحري عن الم ا الحيوي 10جدول )

ة )ملت (تثبيطيالفعالية الةطر نوع الوسط

MM+CC* 0.0

MM+C** 0.0

DTX*** 5.3

M. anisopliaeتحديد الظروف المثلى النتاج انزيم البروتييز من الفطر 3-4

ان انتاج االنزيمات يتأثر وصورة كبيبرة وبأيض الخليبة المايرروويبة المنتجبة لهبا والبذي وبدوره

. (Gearage et al.,1995)يتأثر كثيرا ومرونات الوسط الذي تنمو فيه الذه الرائنات المجهرية

مرونببات لرغببت ان الطبيعببة الوراثيببة للرائنببات المجهريببة تبب ثر كثيببرا فببي انتاجهببا للنزيمببات غيببر ان

ونببات الوسببط الريميائيببة كالمصببدر الرببارووني والنتروجينببي ونسبببتهما البب وع ببهما البببعض ونببوع االي

الخصبائص ر في تحديد خصائص االنزيمبات المنتجبة ف ب عبن ان تلبك يربالمعدنية وتركيزالا األثر ال

تتأثر والصفات الفيزيائية للوسط مث الرةت الهيدروجيني للوسط و رجة الحرارة وسبرعة البرج وتهويبة

,لبذا يعبد تحديبد (Kole et al.,1998 ; Reddy et al.,2011)الوسبط وحجبت اللقباح ومبدة الح بن

الب اف ب نمبو لهبذه الظروف المثل لنمو الرائنات المجهرية من االمور ذات االالمية البالغة للوتبول

االحيبببباء ووالتببببالي اةصبببب انتاجيببببة للنزيمببببات نظببببرا الالميتهببببا فببببي الحفبببباظ علبببب التببببوازن وببببين

المرونببات غيببر المسببتخدمة فببي نهايببة العمليببة التخمريببة كميببة مختلببف مرونببات الوسببط والتقليبب مببن

(Kathiresan and Manivannan,2006).

ير تركيز المصدر الكاربوني تأث -1ذ بلغييي إ % 0.05هيييو إنيييزيل البروتيييييز إلنتييياج أن أفضيييل تركييييز لعصيييير التمييير ( (8يبيييين الشيييكل

بتركييز عصيير التمير اسيتعمالوحدة /ملغيل بيروتين ، وفيي ضيوء هيذه النتيا ج تيل 3.34الفعالية النوعية . جميعهاالالحقة في مراحل البحث اإلنزيلإلنتاج % 0.05

وذلك ألالميته في تحريبر في انتاج االنزيمات ووني في وسط التغذية االميةان لتواجد المصدر الرار

الطاةببببببببببببة التببببببببببببي تحتاجهببببببببببببا الرائنببببببببببببات المجهريببببببببببببة للنمببببببببببببو وانتاجهببببببببببببا ل نزيمببببببببببببات

Ire et al.,2011) ; (Haq et al.,2008 .

حتياجببببات الرائنببببات المجهريببببةعهببببا وتراكيزالببببا وفقببببا التتببببباين المصببببا ر الراروونيببببة فببببي انوا

(Jaswal et al.,2008) يعبد ديبدة ورخيصبة ومتبوافرة فبي البيئبة وان البحث عن مصا ر كاروونيبة ج


96

عليبببببببه البحبببببببوث العلميبببببببة وذلبببببببك الرتفببببببباع اسبببببببعار السبببببببرريات النقيبببببببة تقببببببباق اساسبببببببيا البببببببدفا

والمستحصب Date syrup (DS)لذا تبت اختيبار عصبير التمبر (Dahot ,1994)والهايدروكاروونات

74%عليه مبن ثمبار الصبنف الزالبدي البذي تحتبوي ثمباره علب نسببة عاليبة مبن السبرريات تصب الب

( .,1988معظمها سرريات مختزلة )و ك

يحتببوي عصببير التمببر ف بب عببن السببرريات علبب االحمببا الدالنيببة و االحمببا االمينيببة

والمعبببببببببببببا ن مثببببببببببببب الرالسبببببببببببببيوق Cوالبروتينبببببببببببببات والفيتامينبببببببببببببات مثببببببببببببب فيتبببببببببببببامين

للرباروون مصبدرا وبدي عد لذا (AI-Khateeb,2008)والحديد والبوتاسيوق والصو يوق مغنيسيوقوال

وااليونبببببببببببات المعدنيبببببببببببة ويحبببببببببببوي المغبببببببببببذيات الرافيبببببببببببة لنمبببببببببببو االحيببببببببببباء المجهريبببببببببببة

2011) (Khiyami etal.2008 ; Mossavi- Nasab and Yousefi , .

مصبا ر كاروونيبة مختلفبة استعمالتناول راسات عديدة انتاج انزيت البروتييز من االحياء المجهرية و

علبب اعلبب انتاجيببة النببزيت البروتييببز (2008b)وجماعتببه Mohantyووتراكيببز مختلفببة ,اذ حصبب

M. anisopliaeمبن الفطبر trypsin like protease(Pr2) و chymoelastase (Pr1) ونوعيبه

ووفعاليببة Culex quinquefasciatusعنببدما اضبباف البب وسببط االنتبباج كيوتربب وعببو 892

( وحبدة/ملغت وبروتين ,علب التبوالي, مقارنبة مبا كب مبن الوسبط البذي 0.308و 0.365نوعية ولغب )

اذ ولغبب Aedes aegyptiوالبعببو Anopheles stephensiاضببيف لببه كيوتربب البعببو

لي ( وحببدة/ملغت وببروتين علبب التببوا0.244و 0.154( و)0.258و 0.211الفعاليببة النوعيببة ل نببزيمين )

ساعات من الح ن .8 وعد

اذ ولغب اعلب فعاليبة Aspergillus oryzaeالرز النتاج انبزيت البروتييبز مبن الفطبر نخالة استعمل

نخالبببة الحنطبببة اسبببتعمالووحبببدة/غت 1000وحبببدة/ غبببت مقارنبببة والفعاليبببة االنزيميبببة 1400انزيميبببة

(Chutmanop et al.,2008).

فببي وسببط االنتبباج 1.5%خميببرة الخبببز كمصببدر كببارووني ونسبببة اسببتعمالان (2012)وينبب العبببا ي

638.2ةبد اعطب اعلب انتاجيبة النبزيت البروتييبز اذ ولغب الفعاليبة النوعيبة B. bassianinللفطبر

وحدة /ملغت وروتين .


97

في إنتاج إنزيم البروتييز من الفطر )عصير التمر( ( : تأثير تركيز المصدر الكاربوني8الشكل )

M. anisopliae

تأثير نوع المصدر النيتروجيني و تركيزه -2هيييو المصيييدر النيتروجينيييي األكفييي فيييي الجيالتيييين نأ ( 9)الشيييكل الموضيييحة فيييي نتيييا ج الأظهييير

حيدها األقصيى إذ بلغي الفعاليية النوعييةمة ، المسيتخد ةنيتروجينيإنتاج اإلنزيل مقارنة بباقي المصادر ال

كبريتيا االمونييول أوطي فعاليية نوعيية لينيزيل بوجيود وحدة / ملغل بروتين . في حين سجل (5.714)

. وحدة / ملغل بروتين( 2.378) اذ بلغ

سييتنادال لهييذه النتييا ج تييل إختيييار البروتييييز فييي تجييار مصييدرال نيتروجينيييال إلنتيياج إنييزيلالجيالتييين وا

الالحقة كافة . البحث

0

1

2

3

4

5

0.01 0.05 0.1 0.3 0.5 0.7

ة عي

نو ال

يةعال

لفا

(دة

حو

/م

لغم

)

)%(تركيز عصير التمر

0.7 0.5 0.3 0.1 0.05 0.01


98

anisopliae .Mر من الفطنوع المصدر النيتروجيني في إنتاج إنزيم البروتييز ( : تأثير 9الشكل )

وبعد أن تل تحديد المصدر النيتروجيني األمثل إلنتاج اإلنزيل درس تراكيز مختلفة من الجيالتين

4.739نوعية إن اعلى فعالية ( 10 ( في الشكل ويتبين زيل ،تاج اإلنلتحديد التركيز األمثل منه إلن

الفعالية النوعية في حين إنخفض الجيالتين، من % 0.5تركيز استعمالعند وحدة / ملغل بروتين

عند حتى وصل اقلها البحث هذا في لمتركيز المصدر النيتروجيني المستعتدريجيال بزيادة

بناءال عليه فقد أعتمد هذا التركيزو ،وحدة / ملغل بروتين 2.048اذ بلغ من الجيالتين %4 التركيز

التجار الالحقة .ب

0

1

2

3

4

5

6ة

عينو

الية

عاللفا

(ة

حدو

/نتيرو

بغم

مل)

المصدر النيتروجيني


99

M. anisopliaeمن الفطرم البروتييز في إنتاج إنزيتركيز الجيالتين ( : تأثير 10الشكل )

في وسبط االنتباج احبد العوامب االساسبية المب ثرة فبي نمبو مستعم يعد المصدر النيتروجيني ال

, ووالنسببة (Wang et al.,2005)الخ يا المايررووية وله تأثير حاث او مثببط فبي انتاجهبا للنزيمبات

النزيت البروتيييز يعد المصدر النيتروجيني مرون اساسي وجوالري يبدخ فبي ونباء االحمبا االمينيبة

(Patil and Chaudhari,2013) وعل الرغت من استعمال عصير التمر الذي يحوي عل المغذيات

الدراسببات والتجببار اثبتبب انببه غيببر غنببي واالحمببا وعببض الرافيببة لنمببو االحيبباء المجهريببة اال ان

االمينية والدالنية لذا وج تزويد الوسط المغذي للرائن المجهري وعوام اعمة كالمصبدر النتروجينبي

, لببذا تببت اختيببار الجي تببين كمصببدر (Djilali et al.,2012)مببوا ه االي ببية لغببر تحفيببز انتاجببه ل

وعبد ان اثبتب كفاءتبه فبي رفبا مسبتو انتباج M. anisopliaeنتروجينبي اعبت لوسبط تنميبة الفطبر

, يعبد الجي تبين مصبدرا نتروجينيبا مهمبا اذ يتبألف مبن العديبد مبن مسبتعم انزيت البروتييز من الفطر ال

مبببن السبببرريات السداسبببية الموجبببو ة فبببي 75%االحمبببا االمينيبببة والسبببرريات اذ وجبببد علببب االةببب

Hydroxylysineالذي يعد مصدر تصنيا الجي تين ترتبط والممبتق االمينبي (Cllagen)الروالجين

وان ةست من الذه السرريات ومنها سرر الرلوكوز تبقب O-glycoside linkageوآترة ك يروسيدية

لهذا عد الجي تين مصدرا كاروونيا جيبدا مبن (Wood,1958)ال حد ما مرتبطة ومرونات النتروجين

لدن وعض الباحثين .

البذي وبين (Clarkson,1996)وجد ان النتيجة المستحص عليها خ ل الذه الدراسة التتفق ما نتيجبة

M. anisopliaeان الجي تين البو االف ب كوسبط زرعبي سبائ لزيبا ة انتباج الرتلبة الحيويبة للفطبر

البذي ينتجبه Serine endoprotease (Pr1) ون ان يربون النالبك اسبتحثاث النتباج او افبراز انبزيت

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

0.25 0.5 1 2 3 4

ة حد

وية

عاللف

ا /

ن تيرو

بغم

مل

)%(تركيز الجيالتين


100

و Verticillium lecanii و Aschersonia aleyrodisغالبا الذا الفطر وغيره من الفطريات مث

B. bassiana مبن الع بو ال باغط والذي يفرز في الغالبappressorium اثنباء عمليبة االختبراق

لريوتر الحمرات .

ن وببأ Khachatourians (1988)و Bidochkaالباحثببان تتفببق نتيجببة البحببث الحببالي مببا مبباذكره

زيا ة انتاج انزيت البروتييز المحل للبروتينبات له ور فعال في تحفيز و 1%الجي تين وتركيز استعمال

. B. bassianaمن فب الفطر

الذين وجبدوا ان انتباج انبزيت البروتييبز (2008b)وجماعته Mohantyكذلك اتفق ما نتيجة الباحث

ةبد از ا ثب ث مبرات 892M.anisopliae المفرز مبن الفطبر 2Prو 1Pr المفرز من الفطر ونوعيه

نتيجة الضافة الجي تين كما ة حاثة مقارنة ما معاملة السيطرة .

Penicilliumكببان البيبتببون المصببدر النتروجينببي األكفببأ فببي انتبباج انببزيت البروتييببز مببن الفطببر

chrysogenum وحدة/م 12.71اذ ولغـــ الفعـــاليـــة االنـــزيمــية(Haq et al.2008) .

من الفطر الي المصدر النيتروجيني األكفأ في إنتاج اإلنزيمين األمونيوق كبريتاتأن وجد

B. bassiana مقارنة وباةي المصا ر النيتروجينية المستخدمة , إذ ولغ الفعالية النوعية حدالا

تين , عل التوالي . في ( وحدة / ملغت ورو20.43و 676.47األةص إلنزيمي البروتييز والرايتينيز )

( وحدة / 2.55و 208.85ولغ ةيمتها ) اذحين ظهرت أوطأ فعالية نوعية لإلنزيمين ووجو اليوريا

( 2012)العبا ي ,ملغت وروتين إلنزيمي البروتييز والرايتينيز , عل التوالي أي ا .

ليببات النتببروجين تببنظت عببا ة وآالسببته ب ةببد يفسببر ذلببك البب ان الجينببات الممببفرة ل نزيمببات المطلووببة

ليببات كبببح ايببض النتببروجين ببا البب آليببة سببيطرة رئيسببية تعببرف وآاسببتحثاث او تحفيببز متخصصببة تخ

(Nitrogen metabolic repression ) وتبعبا لهبذه اآلليبات فالجينبات تعببر ومسبتويات عاليبة عنبد

جباالزة ومف بلة فأنبه يب ي ظروف تحديد النتروجين فقط, اما عند النمبو ووجبو مصبا ر نايتروجينيبة

Larcherوالذا ماوينه (Marzluf,1997) التعبير الجيني ل نزيمات المحللة فال يقاال اعطاء اشارة

Scledosporiumاذ الحظبببوا ان اعلببب انتببباج النبببزيت البروتييبببز مبببن الفطبببر (1996)وجماعتبببه

apiospermum 1%فبي حبين ان زيبا ة التركيبز فبي الوسبط الب 0.1%يرون عند تركيز الببتبون

ا ال زيا ة في معدل نمو الفطر وانخفا كبير جدا في انتاج االنزيت .

ان ك من الببتبون والربازائين يحفبز تبراكت انبزيت البروتييبز فبي (1996)وجماعته Ashurكما الحظ

نزيميببة وذلببك الن الببذه المصببا ر ووالتببالي انخفببا الفعاليببة اال A. terreusالوسببط الزرعببي لفطببر

النيتروجينية البسيطة ترون حاوية علب عبد كبيبر مبن االحمبا االمينيبة والببتيبدات الصبغيرة ووبذلك

, ان المصبا ر (Catabolic repression)ت ي ال ايقاف انتاج االنبزيت وآليبة كببح االيبض الهدميبة

تباينبة مبن االحمبا االمينيبة الحبرة والببتيبدات النتروجينية الع وية المعقبدة تربون مصبدرا لتراكيبز م


101

التي يرون لها تبأثيرا مهمبا فبي تنظبيت انتباج انزيمبات البروتييبز حسب اآلليبة المبذكورة سباوقا ةبد تربون

االحما االمينية وتراكيز ةليلة غيبر كافيبة لحبث انتباج االنبزيت او وتراكيبز مثلب لحبث االنتباج فتسبب

ةببببد ترببببون وتراكيببببز عاليببببة فتسببببب كبببببح انتبببباج انزيمببببات البروتييببببز اعلبببب انتبببباج ل نببببزيت او انهببببا

(Egorov et al.,1983).

تأثير مدة الحضن -3

وحيدة 4.76ساعة من التخمير بفعاليية نوعيية 24يبدأ بعد نزيل أن إنتاج اإل (11)الشكل يوضح

ملغيييل وحيييدة / 12.25 سييياعة مييين التخمييير بفعاليييية نوعيييية 72ليصيييل إليييى أقصييياه بعيييد ملغيييل بيييروتين/

بروتين.

مببن فعاليببة انببزيت البروتييببز المنببتج مببن 80%ان (2007)وجماعتببه Itoمببا مبباذكره تتفق الذه النتيجة

ساعة. 120ساعة من الح ن و وتل اةصاالا وعد 24ةد ودأت وعد B. bassianaالفطر

التببببي ذكببببرت ان انتبببباج انببببزيت البروتييببببز المفببببرز مببببن الفطببببر (2012)مببببا ماوجدتببببه العبببببا ي و

B. bassiana وحدة / ملغت وروتين ليص ال 133.3ساعة من التخمر وفعالية نوعية 24ةد ودأ وعد

وحدة /ملغت وروتين . 1304.34ساعة من التخمر وفعالية نوعية 72اةصاه وعد

ريا النزيت البروتييز يدل عل وفرة وغبزارة المبوا الغذائيبة فبي وسبط التنميبة ان االفراز المبرر والس

الببببببذي يحببببببوي متطلبببببببات النمببببببو للرببببببائن المجهببببببري ف بببببب عببببببن متطلبببببببات انتاجببببببه ل نببببببزيت

(Qureshi et al.,2011; Pandit and Maheshwari,2012) .

سياعة ألفضيل إنتياج مين اإلنيزيل وتيل 72وفي ضوء هيذه النتيا ج فقيد تيل تثبيي ميدة حضين قيدرها

عنببد تحديببد اعلبب انتاجيببة Kaur (2010)و Dharكبب مببن وجببد وينمببا إسيتخدامها فييي التجييار كافيية .

يبوق 4-6اذ كانب فبي االيباق M. anisopliaeالنزيت البروتييز المفرز من ةب اروعة عبزالت للفطبر

ياق الي المثلب النتباج أ 5 وأن مدة ح ن مقدارالا (2011)وجماعته Ali والحظ من وداية الح ن ,

. M. anisopliae IF 28.2انزيت البروتييز من الفطر


102

M.anisopliaeالفطر( : تأثير مدة الحضن في إنتاج إنزيم البروتييز من 11الشكل )

في حبال انتباج انبزيت البروتييبز (2005)وجماعته Camposما ماوينه وينما اتفق نتيجة البحث

عنبد (2006)وجماعتبه Haqماوجبده ما , و B. amorphaو B. bassianaمن ك من الفطريات

, والببذا ماأكببده اي ببا , وكببذلك Penicillium griseoroseumنتبباج انببزيت البروتييببز مببن الفطببر ا

Simkoviê والنسبة للفطر (2012)وجماعتهTrichoderma atroviride فطبر, واي ا والنسبة لل

Rhizopus sp. التي اعط اعل انتاجية النزيت البروتييز المتعا ل وعد مبرور ث ثبة ايباق مبن ودايبة

. (Sumantha,2006 b)الح ن

اوسبباط زرعيببة مختلفببة لتنميببة االحيبباء المجهريبة ينببتج عنببه اخببت ف فببي مببدة الح ببن المان اسبتع

ذلببك اذ اوضببحا Padmaja (2012)و Prakashاالنزيمببات كمببا وبين ذلببك كبب مببن إلنتبباجال زمبة

الما ذات انتاج عالي النزيت البروتييز والي س لة ااحد M. anisopliaeس لتين من الفطر الموأستع

M19 ر ذات انتاج واطئ ل نزيت والي س لة واالخM10 ا وسبط اوساط زرعية احبدال 7 المووأستع

4

5

6

7

8

يينجرو

يدله

اقم

لرا

0

2

4

6

8

10

12

14

24 48 72 96 120 144 168

ة حد

وية

عنو

الية

عاللف

ا /

ن تيرو

بغم

مل

(ساعة ) مدة الحضن


103

والبببو وسبببط مربببون مبببن امببب ح كبريتبببات االمونيبببوق [( minimal media (MM)الحبببد اال نببب

4SO2)4(NH 4وفوسبببفات البوتاسبببيوق ثنائيبببة الهيبببدروجينPO2KH وفوسبببفات البوتاسبببيوق احا يبببة

ان كبببب السبببب لتين اعطبببب اعلبببب فعاليببببة ] 4MgSOوكبريتات المغنسيوق 4KHPOالهيدروجين

المووأسببتع M19وسبب لة M10وينمببا اعطبب سبب لة MMوسببط المسبباعة وأسببتع 72ل نببزيت خبب ل

ساعة عل التوالي . 120ساعة و 96واةي االوساط الزرعية اعل فعالية ل نزيت خ ل

اذ اشبباروا البب ان مببدة (1999)وجماعتببه Braga ليببهواختلفبب نتيجببة البحببث الحببالي مببا ماحصبب ع

العائبدتين للفطبر CL11وسب لة 22الح ن المثل العطاء اعل انتاجية النبزيت البروتييبز مبن سب لة

M. anisopliae . الي خمسة اياق

تطبول او ةبد الفطريبات ح ن النتباج االنبزيت مبن ة ال ان النالك تباينا واضحا في مدة الشارألوتجدر ا

ساعة الي المثل العطباء اعلب انتاجيبة النبزيت البروتييبز مبن الفطبر 96كان مدة الح ن , فقدقصرت

Aspergillus flavus AS2 (Rani et al.,2012) وفبي الفطبرNomuraea rileyi كانب مبدة

رانب ف Hirsutella rhossiliensisامبا فبي الفطبر (Nunes et al.,2010)اياق 10الح ن المثل

. (Wang et al. , 2009) يوق كافية للحصول عل االنتاجية القصو للنزيت 12مدة الح ن

الفعالييية النوعييية فييي تصييل حتييى باالنخفيياض تييدريجيال دة الحضيين المثالييية يبييدأ إنتيياج اإلنييزيلبعييد ميي

عنبد زيبا ة مبدة الح بن ليب ان انخفا انتاجيبة االنبزيت ،بروتين ( وحدة / ملغل3.5اليول السابع إلى)

مسبتفيدة مي من نمبو الفطريبات لية التي تطرح في الطور اللوغارتعل ان االنزيت من موا االيض االو

ثت يبدأ واالنخفا التدريجي (Sumantha et al.,2006)من توفر الموا الغذائية في الوسط الزرعي

حدوث تغيرات في وسط النمو وومر خاا في ةيمة الرةت الهيدروجيني , وافبراز والذي ةد يعز ال

-Al-juamily and Al)الرببائن الحببي النزيمببات اخببر تعمبب علبب تحطببيت االنببزيت ةيببد الدراسببة

Zaidy,2012) او ةد يرون السب ن و المبوا الغذائيبة ومبرور الوةب وانتباج مبوا اي بية سبامة ,

(Romero et al.1998). تييدريجيال عيين الييرقل الهيييدروجيني إزدييياد قيميية يشييير ايضييال الييى ((11 الشييكل وفضييالل عيين ذليي فيي ن

إنتاج إنزيل ساعة حيث يصل 72بعد 7.1 لوسط التخمر ليصل إلى 5.5الرقل الهيدروجيني االبتدا ي

. 8.14 في اليول السابعلرقل الهيدروجيني قيمة لى أعلو بلغ ،إلى أقصاه البروتييز من ارتفاع الرةت الهيدروجيني (1999)وجماعته Bragaتتفق الذه النتيجة ما ماأشار اليه

من الفطر 22لوسط تخمر الس لة 6.45التدريجي خ ل فترة التخمر عن الرةت الهيدروجيني االوتدائي

M. anisopliae لخام اذ تص انتاجية انزيت البروتييز ال الذروة في اليوق ا 7.78ليص ال

في اليوق السا ع عمر من وداية الح ن , اما والنسبة 8.57وليبلغ الرةت الهيدروجيني اعل ةيمة له


104

اذ ارتفا الرةت 22مماوهة للس لة فران النتيجة M. anisopliaeمن الفطر CL11لس لة

في اليوق الخام ثت 8.14ليص ال 6.46روجيني االوتدائي الهيدروجيني تدريجيا عن الرةت الهيد

في اليوق السا ع عمر من وداية الح ن . 8.67يز ا ليص ال

از يبا البرةت الهيبدروجيني تبدريجيا الب ت اذ اشار (2012)نتيجة العبا ي تناظر نتائج البحث الحالية

72وعببد 7.0البب ليصبب B. bassianaلوسببط تخمببر الفطببر 6.5عببن الببرةت الهيببدروجيني االوتببدائي

.اةص انتاج ألنزيت البروتييز سج ساعة حيث

لع ارتفاع الرةت الهيدروجيني خ ل فترة التخمر يعز ال وجو عصير التمبر ف ب عبن الجي تبين

اذ انبه فبي حالبة , M. anisopliaeاللذان يزو ان الوسط واالحما االمينية ال برورية لتنميبة الفطبر

االحياء المجهرية للمركبات االمينية الع وية لغر النمو فبأن ذلبك يب ي الب ارتفباع البرةت استعمال

الهيبدروجيني لربون البذه المركبببات سبتفقد مجموعبة االمببين ممبا يب ي البب ارتفباع البرةت الهيببدروجيني

.1989))الحيدري والمصلح,

تأثير درجة الحرارة -4 M. anisopliae مين الفطييرير درجيية الحييرارة فييي إنتيياج إنييزيل البروتييييز تيي ث ( 12 )الشييكليوضيح

وحييدة / ملغييل ( 1.67)الفعالييية النوعييية إذ بلغيي ل 25درجيية حييرارة إنخفيياض إنتيياج اإلنييزيل عنييد ويبييين

حياء المجهرية طئة تصبح الفعاليات االي ية للذلك وانه عند رجات الحرارة الوا يمرن تفسير بروتين

فيميا إزداد هيذه الفعاليية ووصيل إليى أقصياها عنيد . (Ellaiah and Srinivasulu,1996)وطيئبة

حييرارة الدرجيية ، ممييا يشييير إلييى أن وحييدة / ملغييل بييروتين( 95 .5حيييث بلغيي )ل 30الدرجيية الحرارييية

ف ن الشكل وفضالل عن ذل . عتمد في التجار الالحقة كافةأالتي و ل 30 هي المثلى إلنتاج اإلنزيل

هييذه ويمكيين تفسيييرل 35النوعييية لينييزيل بازدييياد درجيية الحييرارة إلييى فعالييية ال إنخفيياض المييذكور يوضييح

رجببات الحببرارة العاليببة تبب ثر عرسببيا علبب العمليببات االي ببية ل حيبباء المجهريببة المنتجببة أن الحاليية

. (Irfan et al.,2011)ووالتالي انتاج االنزيت ل نزيمات المحللة للبروتين مسببة تثبيط نمو الفطر

نبباء وافببراز انببزيت البروتييببز تعببد رجببة حببرارة الح ببن معيببارا حرجببا يبب ثر علبب كبب مببن عمليتببي و

وذلبك مبن خب ل تبأثيره (Peek et al.,1992;Engel et al.,1998)ي فبي االحيباء المجهريبة القاعد

-عل :


105

0

1

2

3

4

5

6

7

25 30 35

ة عي

نو ال

يةعال

لفا

دةحو

/ن

تيرو

بغم

مل

(م ) درجة الحرارة

عمليبببببببببببة امتصببببببببببباا االوكسبببببببببببجين وتزويبببببببببببد الطاةبببببببببببة ال اء الفعاليبببببببببببات االي بببببببببببية 1-

(Frankena et al.,1986) .

. (Votruba et al.,1991)عمليات النق والترجمة لتصنيا البروتين 2-

.(Rahman et al.,2005)تأثيرالا عل الخواا الفيزيائية للغماء الخلوي 3-

M. anisopliae من الفطرالحرارة في إنتاج إنزيم البروتييز ( : تأثير درجة 12الشكل )

ن أاذ اوضببحوا (2011)وجماعتببه Ali حاليببة وهببذا الخصببوا التتفببق مببا مببا أور هلجببة اان النتي

للفطبببر M460و M440و M408التبببي تسبببج عنبببدالا السببب الت البببي ᵒق 35 رجبببة الحبببرارة

M. anisopliae وي المعبروف انتاجيبة النبزيت البروتييبز القاعبداةصب (Pr1) Subtilisin-like

. Trypsin-like (Pr2)وكذلك ل نزيت

)السب لة ةليلبة M10الي المثل النتاج انزيت البروتييز من س لتي الساوقة الذكرالدرجة الحرارية وان

M.anisopliae)الس لة غزيرة االنتاج النبزيت البروتييبز ( للفطبر M19 تييز( واالنتاج النزيت البرو

(Prakash and Padmaja,2012).

ان (2004)وجماعتببه Haqوجببد لفطريببات اخببر اذ مببا مبباور فببي العديببد مببن األوحبباثاتفقبب و

Penicilliumاالنتاجيببببة القصببببو النببببزيت البروتييببببز المفببببرز مببببن السبببب لة الطببببافرة للفطببببر

21-HUV griseoroseum ق 30كان عند الدرجة الحراريةᵒ وحدة / 58اذ ولغ الفعالية االنزيمية

عل اعل انتاجية النزيت البروتييز والربايتينيز مبن الفطبر (2012)حصل العبا ي كذلك ملغت وروتين

bassiana B. ق 30عند رجة الحرارةᵒ وحدة / ملغبت 57.64)و (887.66اذ ولغ الفعالية االنزيمية

وروتين النزيمي البروتييز والرايتينيزعل التوالي .


106

رجبـة الحـبـرارة استعمل و تتباين رجة الحرارة المثل إلنتاج أنزيت البروتييز وتباين الفطريات اذ

, T. harzianum (Elad and Kapat,1999)النتـببـاج انـــزيــببـت البروتيـببـيز مببن الفطببر ᵒق 22

Nomuraea الي الم ئمة ل نتاجية المثل النزيت البروتييز من الفطر ᵒق 28وكان رجة الحرارة

rileyi (Nunes et al.,2010) تحققب االنتاجيبة القصبو النبزيت البروتييبز المفبرز مبن الفطبر . و

Aspergillus flavus ق 30عنـبببـدᵒ وحبببدة / ملغبببت وـــروتيـبببـن 45اذ ولغببب الفعالـبببـية االنزيميـبببـة

.,2011)et al(Muthulakshmi . أكد كذلكChutmanop ق 30عل ان (2008)وجماعتهᵒ الي

. Aspergillus oryzae رجة الحرارة المثل النتاج اةص كمية من انزيت البروتييز من الفطر

رجة حرارية م ئمة لتحقيق اعل انتاجية النزيت البروتييز كمبا وبين وةد يرون لنف الفطر اكثر من

البي الم ئمبة ل نتباج ᵒق 30)و 27اذ كانب رجتبي الحبرارة ) (2009)وجماعتبه Krishnaذلبك

. .Penicillium spاالمث النزيت البروتييز من الفطر

تأثير الرقم الهيدروجيني اإلبتدائي -5 M. anisopliae في إنتاج إنزيل البروتييز من الفطربتدا ي اإلهيدروجيني الرقل الإن ت ثير

رقييل الفطيير قييادر علييى إنتيياج اإلنييزيل بشييكل أفضييل فييي مييد ن إذ يالحييظ أ ( 13)موضييح فييي الشييكل

النوعييةاذ بلغي الفعاليية 5.5اليرقل الهييدروجيني ( بييد أن أعليى إنتياج تحقيد عنيد 5 - 6)هييدروجيني

( 2.97)وانخفض تدريجيال حتى وصل أوط قيمية لهيا( وحدة / ملغل بروتين 6.90إلنزيل البروتييز )

. 7.5 عند الرقل الهيدروجيني وحدة / ملغل بروتين

فيي مراحيل 5.5 إليى نتياجإللوسيط االيرقل الهييدروجيني وبناءل على ما تقدل من نتيا ج فقيد تيل تعيديل

. ها الالحقة جميع البحث


107

M. anisopliae الفطر ( : تأثير الرقم الهيدروجيني االبتدائي في إنتاج إنزيم البروتييز من13الشكل )

ا من العوام المهمة التي تحد يعد الرةت الهيدروجيني نمو الفطريبات وفعاليتهبا الحيويبة أمبر

ا, وتم با اليبدروجينيمللرةباق الهيدروجينبة الواطئبة وان معظمهبا ي از الفطريبات وتحملهباتبمعقد ا تلبك رةم

. (Berry,1975) 6.0- 5.0أمث للنمو ما وين

ان إنتبباج إنببزيت البروتييببز ووسبباطة األحيبباء المجهريببة يعتمببد ومببر كبيببر علبب ةيمببة الببرةت

تفات الوسط الغذائي كذووان المبوا الغذائيبة وانتقالهبا الهيدروجيني خارج الخلية إذ يتركز تأثيره عل

وتأينها وتركيز البيراروونات الناتجة من ذووان ثباني أوكسبيد الرباروون البذي يب ثر علب السبعة الدارئبة

للوسببببببببط الغببببببببذائي والتببببببببي يببببببببنعر تأثيرالببببببببا علبببببببب نمببببببببو الفطببببببببر وإنتاجببببببببه لإلنزيمببببببببات

Bull & Bushnel,1976) .)

جيني تببأثير كبيببر علبب العديببد مببن العمليببات اإلنزيميببة ونقبب المرونببات كمببا ان للببرةت الهيببدرو

المختلفببببببة عبببببببر الغمبببببباء الخلببببببوي والببببببذي وببببببدوره يعببببببزز نمببببببو الخ يببببببا وإنتاجهببببببا لإلنببببببزيت

(Ellaiah etal.,2002; Akujobi etal.,2012; Ali and Vidhale,2013) .

( أن الببرةت الهيببدروجيني يبب ثر علبب عمليببة الترجمببة 1999وجماعتببه ) Ramonوةببد ذكببر

فقد ذكرا أن للرةت الهيدروجيني تأثير Chaudhari (2013)و Patilواالستنسا ووناء البروتين , أما

األوليبة والثانويبة الداخلبة في ميرانيرية التعبير الجيني المنظت للتفباع ت األي بية, وأن تربوين المبوا

ا عل الرةت الهيدروجيني للوسط.وية إلنتاج إنزيت البروتييز القاعدمليات الحيفي الع ي تعتمد كثير

0

1

2

3

4

5

6

7

8

4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50

ة حد

وية

عنو

الية

عاللف

ا /

ن تيرو

بغم

مل

الرقم الهيدروجيني األبتدائي

7.50 7.00 6.50 6.00 5.50 5.00 4.50


108

اختلفبب ةببيت الببرةت الهيببدروجيني المسببتخدمة فببي الدراسببات البحثيببة إلنتبباج انببزيت البروتييببز

( علبببب ان الببببرةت 2008وجماعتببببه ) Chutmanopأكببببد وبببباخت ف األحيبببباء المجهريببببة فقببببد

الهيببدروجيني االوتببدائي للمببا ة األسبباع يبب ثر علبب إنتبباج انببزيت البروتييببز وتحقيقببه أعلبب فعاليببة

Aspergillusإنزيمية من خ ل راسبتهت للظبروف المثلب إلنتباج إنبزيت البروتييبز مبن الفطبر

oryzea كما وجد . 7.5إذ وجدوا ان الرةت الهيدروجيني األمث لتحقيق أعل انتاجية لإلنزيت

Abdul Sahib (2009( ان الرةت الهيدروجيني االوتدائي )الو األمث لتحقيق أعل إنتاجية 10 )

. Aspergillus nigerة للفطرإلنزيت البروتييز القاعدي من العزلة المحلي

وجبد Paecilomyces marquandiiالمثل إلنتاج البروتييبز مبن الفطبروفي راسة للظروف

Soares ( 2010وجماعته ) كان األمث في تحقيق أةصب ( 5 )ان الرةت الهيدروجيني االوتدائي

( علبب أعلبب إنتاجيببة إلنببزيت البروتييببز 2012حصببل العبببا ي )إنتاجيببة إلنببزيت البروتييببز . و

إذ ولغبب الفعاليببة 6.5عنببد الببرةت الهيببدروجيني االوتببدائي B. bassiana المفببرز مببن الفطببر

وحدة/ ملغت وروتين. 603.3النوعية لإلنزيت

اذ وجبد ان أعلب فعاليبة (Kucera ,1981)ة تتفق مبا مبا ذكبره ن القيمة المستحصلة الحاليا

. 5.5كان عند الرةت الهيدروجيني M. anisopliaeإلنزيت البروتييز المفرز من الفطر

( إذ وجببدا ان الببرةت الهيببدروجيني 2010) Banerjeeو Negiن مببا نتيجببة الببباحثي واتفقبب

ليببببببز مببببببن الفطببببببر يكببببببان األف بببببب فببببببي إنتبببببباج انزيمببببببي البروتييببببببز واألم 5.5االوتببببببدائي

Aspergillus awamori MTCC6652 .

( الببذي أكببد أن 2008وجماعتببه ) Diasولببت تختلببف نتيجببة البحببث الحببالي مببا نتيجببة الباحببث

كانبب عنببد B. bassiana(CG425)مببن الفطببر Pr2و Pr1البروتييببز أعلبب إنتاجيببة إلنببزيت

وجماعتببه Irfanالببرةت الهيببدروجيني ذاتببه مببن ةببب اسببتعم كمببا . 5.5الببرةت الهيببدروجيني

الفطببببببببر ( لتحقيببببببببق أةصبببببببب انتاجيببببببببة إلنببببببببزيت البروتييببببببببز الحام ببببببببي مببببببببن 2011)

Rhizopus oligosporus-M30 .

علب انتاجيبة وينا أن ا( إذ (Kaur 2010و Dharما ما وجده ك من ولت تتفق نتيجة البحث

M. anisopliae عبزالت فطريبة للفطبر 7المفبرز مبن Pr2و Pr1عيبه إلنزيت البروتييز ونو

Aliكببذلك لببت تتفببق نتيجببة الدراسببة مببا نتيجببة الباحببث . 7.0كانبب عنببد الببرةت الهيببدروجيني

المفبرز مبن الفطبر Pr2و Pr1 إذا أكدوا أن أعلب فعاليبة إلنبزيت البروتييبز (2011)وجماعته

M. anisopliae إذ ولغب أعلب فعاليبة إلنبزيت البروتييبز 8 الهيدروجينيكان عند الرةتPr1


109

عل التوالي. ولع البذا M460و M440و M408للعزلة 118.00و 139.36و 177.89

المستعملة في البحث .يعز ال اخت ف العزلة الفطرية النتيجة الحاليةاألخت ف في

ن إنتاج ك نبوع مبن أنبواع إنزيمبات البروتييبز يتببا طريقبة تعبيبر جينبي مختلفبة كاسبتجاوة أ

إذ إن اإلنزيمبات تنبتج عنبد البرةت الهيبدروجيني (Ambient pH) ت الهيدروجيني الخارجي للرة

. (Ramon etal.,1999) الذي ترون عنده فعالة أو م ثرة فقط

تأثير حجم اللقاح -6ا في نمو الخلية ووناء اإلنبزيت لبذا ا ألي عملية حيوية لرونه م ثر يعد تركيز اللقاح عام حرج

) ;Patil &Chaudhari,2013) Sandhya etal.,2004 يج أن ي اف والمستو األمث

فبي إنتبباج سببتعمالشبائعة االق ائببيعبد مبن الطر األوببواغوأن تلقبيح ويئبة النمببو وعبد معلببوق مبن

اإلنزيمببات مببن الفطريببات , إذ ت ببمن الحصببول علبب نتببائج ةاولببة للترببرار وغيببر متذوذوببة . يعببرف

Abusham ( حجت اللقاح األمثب وأنبه الحجبت البذي يحتبوي عبد محبدو ومعلبوق مبن 2009وجماعته )

يات المحبدو ة فبي الوسبط الزرعبي وتحقيبق اإلنتاجيبة األحياء المجهرية القا رة عل االستفا ة من المغذ

القصو من اإلنزيت.

ما زيا ة أعدا الخ يا في كمية زيا ة تدريجية في إنتاج اإلنزيت (14)في المر ةموضحال النتائج تبين

وحدة / ملغت وروتين (11.35اللقاح الم افة إل الوسط الزرعي حت ولغ الفعالية النوعية أةصاالا )

( وحدة /ملغت 4.91, إال أنها إنخف وعد ذلك لتص إل ) %16عند إضافة حجت لقاح مقداره

ا عل ان حجت اللقاح العالي لي . % 20حجت لقاح استعمالوروتين عند تعطي الذه النتيجة م شر

وال رورة أن يعطي حصيلة عالية من األنزيت وإنما ينتج عنه نفاذ الموا الغذائية من الوسط الزرعي

ووة مبرر ف عن فقدان األوكسجين وذلك للنمو السريا للمزرعة وترت الخ يا مما ي ي إل

كسجين المستهلرين ووالتالي انخفا إنتاج اإلنزيت انخفا نسبة السرر واألو

(Haritha etal.,2011; Muthulakshmi etal.,2011; Deb

etal.,2013;Patil &Chaudhari,2013)

كمببا ان لحالببة التنبباف لهببذه األعببدا الربيببرة مببن الخ يببا تببأثير علبب تمثيبب العناتببر الغذائيببة

في فعالية اإلنزيت المنتج ةت الهيدروجيني له مما ي ثر سلبا األساسية في الوسط الزرعي وتغير الر

بحبثإلنتاج إنزيت في مراحب ال %16حجت اللقاح استعماللذا فقد تت . ( 2009 وآخرون, و)سع

ا عل ال حقة .ا البحث النتيجة المستحصلة من الذاعتما


110

اللقباح ووبين كميبة األنزيمببات والنالبك العديبد مبن الدراسبات أالتمب ودراسبة الع ةبة وبين حجبت

مبن خب ل اسبتعمال أعبدا محبدو ة مبن األوبواغ أو مبن خب ل أمبا المنتجة من فطريبات مختلفبة

106×4ن حجت اللقاح أ (1994وجماعته ) Patersonاستعمال حجوق معينة من اللقاح فقد وجد

Braga عم اسبتو . M. anisopliaeإلنتباج انبزيت البروتييبز مبن الفطبر األف ب /م البو ووغ

/ مببب إلنتببباج إنبببزيت البروتييبببز مبببن الفطبببروبببوغ 107×3( حجبببت لقببباح مقبببدار 1999وجماعتبببه )

M. anisopliae . في حين ةاق كب مبنAli ( و 2011وجماعتبه )Prakash وPadmaja

الفطببر/ مبب إلنتبباج إنببزيت البروتييببز مببن وببوغ 106×1حجببت لقبباح مقببداره اسببتعمال( و2012)

المذكور نفسه.

( في راستها حبول الظبروف المثلب 2012اتفق نتيجة الدراسة ما ما توتل إليه العبا ي )

البو %16إذ وجدت ان حجت اللقباح B. bassianaإلنتاج إنزيت البروتييز والرايتنيز من الفطر

. % 20األمث إلنتاج اإلنزيمين وانخفض إنتاج اإلنزيمين وزيا ة حجت اللقاح إل

المنببتج مببن الفطببر ( ان إنببزيت البروتييببز الحام ببي 2010وجماعتببه )Abdul Rauf أكببد

Rhizopus oligosporus أوضبح امبوين, %1وتب إلب أةصب إنتاجيبة عنبد الحجبت اللقباح

Shankar ( ان 2011وجماعتبببه )البببو حجبببت اللقببباح األمثببب إلنتببباج اإلنبببزيت مبببن الفطبببر %10

Beauveria sp. . الببو األمثبب لتحقيببق اإلنتاجيببة القصببو إلنببزيت % 3 وكببان حجببت اللقبباح

أمببا الفطببر . A. flavus (MuthulakShmi etal.,2011)البروتييببز المفببرز مببن الفطببر

A. flavus AS2 والمطفببر وراثي ببا فقببد وتبب إلبب اإلنتاجيببة القصببو إلنببزيت البروتييببز عنببد

. (Rani etal.,2012) %10حجت لقح مقداره استعمال


111

M. anisopliae من الفطريم البروتييز ( : تأثير حجم اللقاح في إنتاج إنز 14الشكل )

تأثير سرعة الرج -7( وحيدة /ملغيل بيروتين ، 9.52 بلغي ) زييالبروتي أعلى فعاليية نوعيية إلنيزيلن أ (15)يوضح الشكل

حييييث تيييزداد تهويييية الوسيييط الزرعيييي عنيييد هيييذه السيييرعة والتيييي تكفيييي ، رة /دقيقيييةدو 100عنيييد سيييرعة رج

نمييا ظهيير بيلتجهيييز األوكسييجين الييذا والمييواد الغذا ييية فييي الوسييط ممييا ينييتج عنييه زيييادة اإلنتاجييية ،

ملغيييل وحيييدة / 5.07إذ بلغييي ، صيييفر )الوضيييع السييياكن (عنيييد سيييرعة رج لينيييزيلأوطييي فعاليييية نوعيييية

بروتين ويعز ذل إلى عدل كفاية التهوية والمواد الغذا ية والتي تؤدي إلى عدل قدرة الفطر للنمو بشكل

إنتباج اإلنزيمبات الحاضبنة الهبزازة فبي استعمالان , ( Sepahy & Jabalameli ,2011) كفوء

ووسبباطة األحيببباء المجهريببة الهوائيبببة كالفطريبببات يسببمح واالسبببتغ ل األمثبب لمرونبببات الوسبببط

الزرعي ف عن ترون طبقة رةيقة نسبي ا من البيئة )الوسط الزرعي( المهواة ووسباطة االنتمبار

ومبزج خ ل سطح السبائ عبن طريبق الحركبة الرحويبة للبرج , ووبذلك يسبمح البرج أو التحريبك

وتجان مرونات الوسط الزرعي ومر جيد وكفوء وحيث يستطيا الفطر من النمو في اتزان وين

ــــــــــي األسفــــــــــية فــــــــــوا الغذائــــــــــــاإلمدا من الهواء في األعل واإلمدا من الم

(Rhodes & Fletcher ,1966 ; Casida ,1968;Stanbury & Whitaker , 1984)

0

2

4

6

8

10

12

4 8 12 16 20

ة حد

وية

عنو

الية

عاللف

ا /

ن تيرو

بغم

مل

%حجم اللقاح

20 16 12 8 4


112

( فوائببد الببرج 2002)وجماعتببه Calik( و 2006) Tariو Genckalوةببد أوجببز كبب مببن

للوسط الزرعي واآلتي:

الزرعي. من خ ل تحريك ومزج مرونات الوسط( زيا ة ذووان األوكسجين 1

( تحسين توزيا المغذيات في الوسط الزرعي. 2

( تمتي أو تفريق الخ يا المترتلة .3

زيا ة العمليات االي ية الهوائية خ ل عملية التخمر.( 4

وحيدة 8.12 غي بل اذبزييادة سيرعة اليرج يية لينيزيلالفعالية النوع اضنخفإ (15)كذل يبين الشكل

دقيقة . دورة / 150عند سرعة رج بروتين ملغل /

ان السرع العالية للبرج ال تب ي وال برورة إلب زيبا ة إنتباج اإلنبزيت وب ةبد تب ي الب

تقليبب إنتاجببه مببن خبب ل مسببت اإلنببزيت وتحطببيت الخ يببا أو إنهببا تبب ي إلبب تحلبب الخ يببا وزيببا ة

Shear forcesنافببببببببببذيتها نتيجببببببببببة االحتربببببببببباب وفعبببببببببب ةببببببببببو القببببببببببص

(Singh etal,2007 b ; Haritha etal., 2011; Sepahy & Jabalameli,2011)

M. anisopliae( : تأثير سرعة الرج في إنتاج إنزيم البروتييز من الفطر 15الشكل )

دقيقية إلنتياج إنيزيل دورة / 100سيرعة رج و في ضوء هذه النتيجة تل تثبي الحاضنة الهزازة على

. مراحل البحث الالحقةعتمد في وأ M. anisopliae من الفطر زيالبروتي

0

2

4

6

8

10

0 50 100 150

ة حد

وية

عنو

الية

عاللف

ا /

ن تيرو

بغم

مل

( دقيقة / دورة )سرعة الرج

50 0 150 100


113

فقاق كب مبن M. anisopliaeسرع رج مختلفة إلنتاج إنزيت البروتييز من الفطر استعمل

Patrson ( و 1994وجماعتبه )Mohanty جماعتبه و(2008 bو )سبرعة البرج اسبتعمال

ورة/ ةيقة. 180سرعة الرج استعمال( و2011وجماعته ) Ali ورة/ ةيقة, وينما ةاق 150

ورة/ ةيقبببببة إلنتببببباج إنبببببزيت البروتييبببببز مبببببن الفطبببببر 150سبببببرعة البببببرج اسبببببتعمل وةبببببد

M. flavoviride (Tiago etal.,2002) فببي إنتبباج كببذلك كانبب تلببك السببرعة الببي المثلبب

(. والفطببببر 2012)العبببببا ي, B. bassianaيز مببببن الفطببببر نيتالبروتييببببز والربببباإنزيمببببي

B. bassiana وB.amorpha (Campos etal.,2005) ,وإنتباج البروتييبز مبن الفطبر

B. bassiana (Rao etal.,2006; Ito etal.,2007) . أمباAbdul Sahib (2009) فقبد

للفطببرتمرببن مببن الحصببول علبب أعلبب إنتاجيببة إلنببزيت البروتييببز المنببتج مببن العزلببة المحليببة

A. niger ووجببد ورة/ ةيقببة. 140عنببد سببرعة الببرجAlves ( ان سببرعة 2005وجماعتببه )

. .Mucor sp ورة/ ةيقة الي المثل إلنتاج إنزيت البروتييز من الفطر 120الرج

مسبتعم تتفق نتيجة الدراسة الحالية ما ما وجد في الدراسات السباوق ذكرالبا ولعب الفطبر ال لت

في الذه الدراسة يعو لس لة ال تحتاج إل األوكسجين ورميات كبيرة.

ةبد يعبز إلب االخت فبات فبي فسبيولوجية الرج واخت ف األحيباء المجهريبة ف سرعخت ان ا

. (Ghanem etal.,2011)ونات الوسط وحجمه والدورق الرائن المنتج لإلنزيت ومر

تأثير نوع األمالح المعدنية و تركيزها -8 إنيزيلطيال واضيحال فيي إنتياج معيال تي ثيرال تنشييالثالثية األميالح ستعمالإن ال ( 16 )من الشكل يظهر

وحدة /ملغل بيروتين (7.66عية )، إذ بلغ الفعالية النو مقارنة بالمعاملة الخالية من األمالح البروتييز

ملغييل وحييدة / 4.78بلغيي فعالييية نوعييية إذ امليية الخالييية ميين األمييالح المييذكورة أقييلبينمييا أظهيير المع ،

االميييالح ، وتييدرج المعييامال االخييير فييي ت ثيرهييا عليييى انتيياج األنييزيل بيييين المعامليية الثالثييية بييروتين

حاويية عليى مليح كلورييد الصيوديول لوحيده قيد كيان لهيا تي ثيرال غيير ان المعاملية الواالخر الخالية منها .

كانيييييييييييي لهييييييييييييا فعالييييييييييييية نوعييييييييييييية اقييييييييييييل ميييييييييييين اقييييييييييييل معامليييييييييييية تثبيطيييييييييييييال علييييييييييييى انتيييييييييييياج األنييييييييييييزيل اذ

وحدة / ملغل بروتين . 4.46)المعاملة الخالية من االمالح ( وقد بلغ قيمتها تعببد األمبب ح المعدنيببة )األيونببات المعدنيببة( أحببد المغببذيات األساسببية التببي تحتاجهببا األحيبباء

المجهرية ومقا ير ضئيلة للنمو وتروين اإلنزيمات وثبوتية واستقرار وع ها اآلخر لرنهبا تختلبف


114

كما إن (Stanbury & Whitaker ,1984; Ire etal.,2011) واالعتما عل مصدر اإلنزيت

عض الذه األيونات يزيد من الثبات الحراري للنزيمات ويجعلها فعالة حت عنبد رجبات وجو و

. (Haq etal.,2006)الحرارة العالية

anisopliae M.من الفطر إنزيم البروتييز( : تأثير نوع األمالح المعدنية في إنتاج 16الشكل )

التي أوضح الدور الفعال للم ح المعدنية في إنتباج اإلنبزيت مبن عديد من األوحاثيوجد ال

( أمببببب ح كبريتببببببات االمونيببببببوق 2012) Padmajaو Prakash اسببببببتعم الفطريبببببات, فقببببببد

4oS2)4(NH 4فوسبببفات البوتاسبببيوق ثنائيبببة الهيبببدروجين ) وoP2(KH وفوسبببفات الصبببو يوق

مبن في انتاج انزيت البروتييبز 4OMgSوكبريتات المغنسيوق 4oPH2(K) أحا ية الهيدروجين

Dhar اسبتعم B. bassianaإلنتاج إنزيت البروتييز مبن الفطبر و . M. anisopliaeالفطر

% 4OP2(KH 0.1( أمببببب ح فوسبببببفات البوتاسبببببيوق ثنائيبببببة الهيبببببدروجين)Kaur (2010و

.%0.05وكلوريد الصو يوق %0.05وكبريتات المغنسيوق

0

1

2

3

4

5

6

7

8

ة عي

نو ال

يةعال

لفا

(ة

حدو

/نتيرو

بغم

مل)

نوع الملح المعدني


115

( وتدعيت الوسط المنتج إلنزيت البروتييز مبن الفطبر2010وجماعته ) Saravanakumarةاق

A. fischeri ( 1( غبت وكلوريبد البوتاسبيوق )1ر من فوسفات البوتاسبيوق ثنائيبة الهيبدروجين )و

( غت. 0.5( غت و كبريتات المغنسيوق المائية )0.02غت وكبريتات الحديدوز المائية )

لدراسيية تيي ثير اخييتال فقييط وفييي ضييوء النتييا ج اعيياله لقييد تييل التركيييز علييى ملييح كلوريييد الصييوديول

كبريتييييا المغنيسيييييول الما ييييية ن )مييييع ثبوتييييية تركيييييز الملحييييين ا خييييري ركييييزه فييييي انتيييياج انييييزيل البروتييييييزت

وديول لتحدييييد اذ درسييي تراكييييز مختلفييية مييين كلورييييد الصييي ( فوسيييفا البوتاسييييول ثنا يييية الهييييدروجينو

% 0.1التركيييز األمثييل منييه إلنتيياج اإلنييزيل ، وقييد سييجل أعلييى فعالييية نوعييية عنييد اسييتخدامه بتركيييز

، فييي حييين وحييدة / ملغييل بييروتين (8.66بلغيي الفعالييية النوعييية ) اذ (17) وكمييا موضييح فييي الشييكل

عنييد دة / ملغييل بييروتينوحيي 6.1 فوصييل الييى الفعالييية النوعييية تييدريجيال بزيييادة تركيييز الملييح إنخفضيي

من ملح كلوريد الصوديول . %1التركيز تعمبب علبب خفببض إنتاجيببة البروتييببز مببن األحيبباء NaClان التراكيببز العاليببة لملببح

لرونها تسب تغيرات في تركي اللبيدات المرونبة للغمباء (Ventosa etal.,1998)المجهرية

. (Suganthi etal.,2013)الخلوي لخ يا األحياء المجهرية

M. anisopliaeمن الفطرم البروتييز في إنتاج إنزي تركيز كلوريد الصوديوم( : تأثير 17الشكل )

0

2

4

6

8

10

0.05 0.1 0.25 0.5 0.75 1

ة عي

نو ال

يةعال

لفا

(ة

حدو

/م

لغم

)

NaCl ( % )تركيز الملح

0.5 0.25 1 0.75 0.1 0.05


116

( إذ حصبلوا علب أعلب إنتاجيبة 2011وجماعتبه ) Ireاتفق نتيجة البحث مبا نتيجبة الباحبث

لملببح كلوريببد % 0.1عنببد تركيببز A. carbonariusإلنببزيت البروتييببز المنببتج مببن الفطببر

% 0.1وتركيببز المببذكور نفسببه ملببح ال( 2008وجماعتببه ) Haq مكببذلك اسببتع. الصببو يوق

لتبدعيت الوسبط المنبتج إلنبزيت وق ثنائيبة الهيبدروجين ووبنف التركيبزف عن فوسفات البوتاسبي

. P. chrysogenumالبروتييز من الفطر

( عند راسبته للظبروف 2009) Abdul Sahibالحالية ما ما وجده الباحث النتيجة واختلف

إذ حصب علب أعلب إنتاجيبة لإلنبزيت عنبدما A. nigerالمثل إلنتاج إنزيت البروتييز من الفطبر

. %1كان تركيز كلوريد الصو يوق

جزئية إلنزيم البروتييزالتنقية ال 4-4المكون في وسط اإلنتاج M. anisopliae بتنمية الفطروذل مل من إنزيل البروتييز 48تل إنتاج

من % 0.1وكمصدر نايتروجيني الجيالتينمن % 0.5 يل بالمدعو % 0.05من عصير التمر

تل تحديدها من خالل التجار السابقة ، و تح الظرو المثالية لينتاج التي الصوديول كلوريد

. لغرض استخدامه في تنقية اإلنزيل

خطوات التنقية :

خطوا التنقية 1تح ظرو مبردة ، و يلخص المخطط جر جميع خطوا تنقية اإلنزيل

. M. anisopliae من الفطر يل البروتييز المنتجالجز ية إلنز


117

M. anisopliaeتنقية إنزيم البروتييز من الفطر خطوات : (1مخطط )

تنمية الفطر في وسط غذائي تحت الظروف المثالية إلنتاج اإلنزيم

الترشيح

(تهمل)الكتلة الحيوية مل( 48)راشج المزرعة

%60الترسيب بالكحول األثيلي

راسب

(8.0برقم هيدروجينيمولر، 0.005)ترسمل من محلول منظم ال16ي إذابة ف

DEAE-Celluloseالمبادلستعمالالتبادل األيوني بأ

(Elution)األسترداد

Sephadex G-150الهالم ستعمالالترشيح الهالمي بأ

أنزيم منقى جزئيا

يهمل (Wash)الغسل

(يهمل)راشح


118

الترسيب بالكحول األثيلي -1

هو التركيز األمثل لترسي إنزيل البروتيييز وحققي هيذه الخطيوة تنقيية % 60أظهر النتا ج أن

و % 56.37مرة و حصيلة إنزيمية مقدارها 1.9جز ية إلنزيل البروتييز بعدد مرا تنقية مقدارها

( .11كما هو موضح في )جدول

األوليى مين التنقيية هيو اليتخلص مين ان الهد من عملية تركيز األنزيما عندما تيتل فيي المراحيل

اكبر كمية ممكنة من الماء للحصول على محاليل بروتينية اكثر تركييزا ، فضيال عين تحقييد درجية

( وتستخدل لهيذا الغيرض Reed, 1975)من النقاوة عبر التخلص من البروتينا غير األنزيمية

اما المذيبا العضوية مثل الكحول األثيلي او األسيتون ، او تستخدل األمالح غيير العضيوية مثيل

، كميييا تسيييتخدل البيييوليمرا تيييا الصيييوديول او الكلورييييدا فيييي الغالييي يكبريتيييا األمونييييول او كبر

Poly ethylene glycol (PEG)العضيييوية بعمليييية التركييييز مثيييل البيييولي اثيليييين كاليكيييول

(White et al. 1973 . )

ربا ييبسيييييب خفيييييض ثابييييي العيييييزل الكهيييييمثيييييل اإليثيييييانول العضيييييوية بالميييييذيبا الترسيييييي يحيييييدث

(dielectric constant) يتغير ت ثير اإلذابة لجزي ا الماء المحيطة باإلنزيل مما يؤدي إلى اذللوسط

. وألنه من الممكن ( Whitaker,1972)بالتالي تكتلها ثل ترسبهاالبروتين و جزي ا ل بين زيادة التداخ

. السييطرة عليى تركييز الميذي ودرجية الحيرارة وجبيفقيد الميذيبا أن يفقد اإلنزيل فعاليته بسيهولة بهيذه

( Agglomerateوقييي الميييزج والييييذي ييييؤثر عليييى تكيييوين التكييييتال ) كييييل مييينويعتميييد الترسيييي عليييى

تييؤثر ( والتيييStirringاطة الميزج )سييالمتولييدة بو ( Shear forces)قيو القييص والفعاليية اإلنزيمييية ، و

. (Aehle ,2004) أيضال على تكوين التكتال


119

M. anisopliae( : خطوات تنقية إنزيم البروتييز من الفطر11جدول )

األحيييياء مييين با العضيييوية فيييي تنقيييية إنيييزيل البروتيييييزالميييذياألمالح و د الترسيييي بيييا يييطر اسيييتعمل

85الترسي بكبريتا األمونيول بنسيبة اشيباع ) Babel (1968و Somkutiاستعمل ، المجهرية

وكاني Mucor pusillusثل بالكحول األثيلي كخطوا اولية في تنقية انزيل البروتييز مين الفطير %

. % 64الحصيلة األنزيمية بعد الترسي بالكحول األثيلي

(% كخطوة اولية في تنقية انزيل البروتييز 75-60بنسبة اشباع )استعمل الترسي بكبريتا األمونيول

% 47.4ميييييييرة وحصييييييييلة انزيميييييييية 2.8بعيييييييدد ميييييييرا تنقيييييييية B.bassianaالخيييييييارجي مييييييين الفطييييييير

(Bidochka and Khachatourians,1987 . )

الحجم خطوة التنقية )مليلتر(

الفعالية )وحدة/مليلتر(

تركيز البروتين )ملغم/مليلتر(

الفعالية النوعية )وحدة/ ملغم

بروتين(

الفعالية الكلية )وحدة(

عدد مرات التنقية

الحصيلة )%(

100 1 48.96 3.4 0.3 1.02 48 المستخلص اإلنزيمي الخال

%60الترسي بالكحول األثيلي

24

1.15 0.178 6.46 27.6 1.9 56.37

المبادل استعمالالتبادل األيوني ب االيوني السال

DEAE-Cellulose ( Batch wiseطريقة الوجبة )

موالري كلوريد 0.3األسترداد بي 0.6الصوديول ثل األسترداد بي

موالري كلوريد الصوديول

22.2 0.5625 0.011 51.136 12.488 15.04 25.5

استعمالي بالترشيح الهالم Sephadex G-150المبادل

20 0.293 0.003 97.666 5.86 28.726 11.97


120

استعمالب T.harzianum و Talaromyces flavusإنزيل البروتييز من الفطريا تنقيةوجر

68.1)بحصيييلة إنزيمييية و مييرة (2.5و 3.8)تييل الحصييول علييى عييدد مييرا تنقييية و المييادة المييذكورة نفييال

( .Haggag et al. ,2006)، على التوالي %( 55.2و

ستعمل ليد تنقيتيه % 80الترسيي بكبريتيا األمونييول (2010)وجماعتيه Namasivayamوا

. B.bassianaمن الفطر إلنزيل البروتييز

تنقيية كخطيوة أوليى فيي الكحول األثيليي الترسي بي (2011)وجماعته Zanphorlin في حين إستطاع

مييرة 1.6 بعييدد مييرا تنقييية .Myceliophthora spإنييزيل البروتييييز السيييريني القاعييدي ميين الفطيير

. % 79.5وحصيلة إنزيمية

( 40- 70كبريتيا األمونييول بنسي إشيباع )الترسيي ب المباسيتع (2011)وجماعتيه Shankarقيال و

عييدد و % 69.5كانيي الحصيييلة اإلنزيمييية و .Beauveria sp ميين الفطييرالبروتييييز تنقييية إنييزيل ل %

مرة . 1.5تنقية مرا

كخطييوة اولييية فييي تنقييية انييزيل البروتييييز ميين % 70اشييباع بنسييبة الترسييي بكبريتييا األمونيييول وتييل

% 73.33والحصيييلة األنزيمييية 1.08وكييان عييدد مييرا التنقييية Pleurotus sajor-cajuالفطيير ( Ravikumar etal.,2012)

الترسي بالكحول األثيلي عند مرة1.728 بعدد مرا تنقيةو % 41.47حصيلة األنزيمية وكان ال

.( 2012)العبادي ، B.bassiana تنقية إنزيل البروتييز من الفطرعملية في % 70

)طريقة الوجبة ( كروماتوغرافيا التبادل األيوني -2و ميرة 15.04 ينيزيل بلغي التنقيية لعيدد ميراإليى إن ( 11)تشير النتا ج المدرجة فيي الجيدول

ر % 25.5اإلنزيمييية حصيييلة ال بييادل ماإلنييزيل المنقييى جز يييال النيياتج ميين الخطييوة السييابقة فييي العنييدما ميير

0.3ب سييييتعمال محلييييول األسييييترداد ذو التركيييييز و DEAE-Cellulose الموجيييي الشييييحنة األيييييوني

رتيييبط إ إلنيييزيلولكيييون ا ميييوالري 0.6مييوالري كلورييييد الصيييوديول ثيييل ب سيييتعمال المحليييول ذاتييه ذو التركييييز

. شحنة سالبة حمللذا فهو ي في ظرو الفصل المستخدمة بالمبادل


121

المبادل المذكور لميا يتمييز بيه مين مييزا عيدة جعلتيه مين اكثير انظمية الكروماتوغرافييا شييوعا استعمل

( والسيعة العاليية السيتيعا البروتينيا High resolving powerالقيدرة العاليية عليى الفصيل ) منهيا

( ووضوح وبساطة مبدأ الفصل والذي يعتمد بشكل High protein –binding capacityالمرتبطة )

مال مييا لفصييل البروتينييا ذا األوزان الجزي ييية فضييالل عيين كونييه اسيياع علييى األخييتال فييي الشييحنة ،

( Jonson & Ryden ,1998 ; Karlsson et al. 1998مسخ البروتين .)كبيرة وقلة احتمالية ال

تعمل فييي امييا طريقيية الوجبيية فهييي تقنييية تقليدييية تسييتخدل فييي المراحييل األولييى ميين تنقييية األنييزيل وهييي تسيي

. استعمل طريقة الوجبية كخطيوة ( Bruton,1983فصل األنزيل بصورة متكررة من المبادل األيوني )

وذليي ميين خييالل Penicillium duponti K1014فيي تنقييية انييزيل البروتييييز الحامضييي ميين الفطيير

نظل الخيال وبوجود محلول م ذو الشحنة السالبة CM-celluloseتمرير األنزيل عبر المبادل األيوني

(pH 4.0 ذو التركييييييز )31.9وكانييييي الحصييييييلة األنزيميييييية بعيييييد هيييييذه الخطيييييوة ميييييوالري 0.01 %

(Hashimoto et al.1973 ) .الوجبية فيي طريقيةب كروماتوغرافييا التبيادل األييوني ايضيا تيل اسيتعمال

بوسياطة المبيادل األييوني السيال Microsporum canisنزيل البروتييز من الفطير الجز ية ألتنقية ال

CM-cellulose ثل المبادل األيوني الموجDEAE-cellulose بطريقة العمود ، وكان عدد ميرا

% 62.1ميييييييييييييرة والحصييييييييييييييلة األنزيمييييييييييييييية 35.8المستحصيييييييييييييلة مييييييييييييين الخطيييييييييييييوة األخييييييييييييييرة التنقيييييييييييييية

( . 2007)شخير وجماعته ،

في العديد من األيونية الموجبة الشحنةالمبادال استعمالا التبادل األيوني ب كروماتوغرافيأستعمل

الفطييير مييين تمييي تنقيييية إنيييزيل البروتيييييز القاعيييدي، فقيييد دراسيييا تنقيييية إنيييزيل البروتيييييز مييين الفطرييييا

Trichoderma viride المبادل باستعمالSephadex A-50 DEAE- الحصييلة اإلنزيميية وكان

(Šimkovič et al. ,2008) . %(30-20) التنقية بمقداربعد إجراء

وكان عدد ميرا التنقيية المذكور نفال باستعمال المبادل A. nigerكما نقي انزيل البروتييز من الفطر

( . Devi et al., 2008) % 32نزيمييية مييرة والحصيييلة األ 34.42بعييد اجييراء هييذه الخطييوة

.Beauveria sp الفطيير ميينفييي تنقييية إنييزيل البروتييييز (2011) وجماعتييه Shankar هاسيتعملو

كمييا . % 38.6مييرة بحصيييلة إنزيمييية 10.02و كييان عييدد مييرا التنقييية المستحصييلة ميين هييذه الخطييوة


122

و Neurospora crassa الفطرييا ييز مينفيي خطيوا تنقيية إنيزيل البروتيالمبادل المذكور أستعمل

Penicillium janthinellum إنزيمييةوبحصييلة ، عليى التيوالي ميرة (9.3و 3.1)تنقيية بعدد مرا

واسيتعمل هيذا المبيادل ايضيا مين .(Abirami et al. ,2011) ( % ، عليى التيوالي أيضيال 28و 76)

ليصيبح B.bassiana في تنقية انزيل البروتييز القاعدي السييريني مين الفطير( 2012قبل العبادي )

المبيادل األييوني استعملفي حين . % 16.3مرة ولتصبح الحصيلة األنزيمية 2.13عدد مرا التنقية

تنقييةبعيدد ميرا A. tamariالبروتيييز القاعيدي مين الفطير تنقية إنزيل في CM-Celluloseالسال

. (Sharma & De ,2011) %50مقدارها إنزيمية بحصيلةو مرة 26

الترشيح الهالمي -3

هييالل اسييتعمالالتبييادل األيييوني خطييوة الترشيييح الهالمييي لتنقييية انييزيل البروتييييز ب قبيي خطييوةاع

، اختييير هييذا الهييالل الن حييدود الفصييل فيييه للبروتينييا تتييراوح بييين Sephadex G-150السيييفاديكع

بروتيييز القاعيدي ألنيزيل الوهيذا الميد يغطيي األوزان الجزي يية ( 1990كيلودالتن )المظفر ، 5-300

( . Yang et al.2008كيلودالتن ) 39 -30والتي يتراوح مداها بين

فييي األجييزاء بييروتينيتين ظهييور قمتييين هعنيي نييتجوالييذي ( الترشيييح الهالمييي لمنييزيل 18يوضييح الشييكل )

وبعييد جمييع تليي 18-12اتضييح وجييود فعالييية انزيمييية فييي األجييزاء وبتقييدير الفعالييية األنزيمييية 11-17

وبتقييدير فعاليتهييا األنزيمييية فضييال عيين البييروتين ، امكيين الحصييول علييى مللتيير 20جييزاء بلييه حجمهييا األ

وحدة / ملغل بروتين وقد حقق هذه الخطوة مين تنقيية األنيزيل عيدد ميرا تنقيية 97.666 فعالية نوعية

. % 11.97مرة وحصيلة انزيمية 28.726مقدارها


123

M.anisopliaeمن الفطر لتنقية إنزيم البروتييز كروماتوغرافيا الترشيح الهالمي ( : 18الشكل )

بمحلاول مان م الاي تمات موازنتا و ( سام 80×1.4)بأبعااد Sephadex G -150عمود استعمالب

مل / جزء 4وبواقع دقيقة / لترمل 20بسرعة جريان ( 8.0مولر ، برقم هيدروجيني 0.02الترس )

المتعلقة وتنقية انزيت البروتييز من األحياء األوحاثور استعمال ال ق السيفا ير في العديد من

في تنقية انزيت البروتييز من الفطر SephadexG-75ال ق عم المجهرية , فقد است

M. pusilllus 55.0مرة ووحصيلة انزيمية 34.0وولغ عد مرات التنقية %

(Somkuti & Babel ,1968 . ) ستعم وأHashimoto ( ال ق ) 1973وجماعتهSephadex

G-200 الفطر في تنقية انزيت البروتييز منP. duponti K1014 وحقق الذه الخطوة حصيلة

. % 25.5انزيمية ولغ

لتصبببح A. oryzaeفببي تنقيببة انببزيت البروتييببز مببن الفطببر Sephadex G-100 اسببتعم الهبب ق

(. Murthy & Naidu,2010مرة ) 33.76وعد مرات التنقية % 20.4الحصيلة األنزيمية

Rhizopus oligosporusلتنقية انزيت البروتييز من الفطر Sephadex G-75واستعم اله ق

(Devi et al.2011 . )

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0.035

0.04

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

ة حد

وية

يمنز

ال اية

عاللفا

\مل

ة صي

صامت

الا

(2

80

)تر

مينو

نا

رقم الجزء المنفصل

البروتين الفعالية األنزيمية


124

توصيف إنزيم البروتييز 4-5

فببي ه مببن خطببوة كروماتوغرافيببا الترشببيح اله مببي المسببتخلص اإلنزيمببي المتحصبب عليبب معسببتأ

راسة وعض الصفات المهمة إلنزيت البروتييز .

( [ :maxV( و السرعة القصوى )mKالثوابت الحركية ] ثابت ميكالس ) -1

( لتقببدير ثاوبب ميرببال و السببرعة القصببو إلنببزيت 1934)وببورب -طريقببة الينببويفر اسببتعمل

نـــح مـــــ( % . يت 3-0.05ين و وتراكيز انحصرت وين )الرازائ ما ة التفاع استعمالالبروتييز و

ملغت/ م وينمبا ولغب ةيمبة السبرعة 0.182خ ل النتائج أن ةيمة ثاو ميرال إلنزيت البروتييز ولغ

(. 19ملغت / م . ةيقة , )المر 0.364القصو

إلنزيم البروتييز المنقى جزئيا من maxVو mKلتقدير ( 1934)بورك -( : منحنى الينويفر19الشكل )

ين مادة تفاعلكازائالباستعمال M. anisopliaeالفطر

من أالبت الثواوب المميبزة للنبزيت كونبه يعببر عبن عبد مبن خواتبه والسبيما mKيعد ثاو ميرال

فرلما كان ةيمته واطئة كلما كان ألفة اإلنزيت عالية االرتباط ومبا ة التفاعب , رجة ألفته لما ة التفاع

الربيبرة إلب الحاجبة إلب تركيبز عبالي مبن مبا ة التفاعب للوتبول إلب نصبف التمببا mKوتمير ةيمة

ويختلبف البذا الثاوب وباخت ف مصبدر اإلنبزيت ومبا ة . ;Whitaker,1972) 1983وعلبي , يسباجد)

علببب تركيبببز مبببا ة التفاعببب maxVوالسبببرعة القصبببو mKوتعتمبببد ةيمبببة , (Segel,1976)التفاعببب

(Voet & Voet,2010)والظروف المحيطة مث رجة الحرارة والرةت الهيدروجيني والقوة األيونية

.

-2

0

2

4

6

8

10

-15 -10 -5 0 5 10 15 20 251/[S]

1/V


125

عنببببد توتببببيف أنببببزيت البروتييببببز المنقبببب جزئي ببببا مببببن الفطببببر ((2008وجماعتببببه Deviذكببببر

niger A. أن ةيمببةmK ةيمببة ملغببت/ مبب و 0.8ولغببmaxV ووأسببتعمال وحببدة/ملغت 85.0ولغبب

ا الثواوبب الحركيببة إلنببزيت ( فقببد حببد 2010) Naiduو Murthyأمببا . الرببازائين كمببا ة للتفاعبب

maxV 715 ملغبت/ مب وةيمبة mK 3.0وجبدا ان ةيمبة و .oryzea Aالبروتييز المنق من الفطبر

الرازائين كما ة للتفاع . لاووأستعم. ةيقة ملغت/م

ملغت/مب 16.13ولغب maxVملغت/م وةيمبة البـ 4.34ولغ mK( أن ةيمة الـ 2012وجدت العبا ي )

ي والمنقب جزئي با ستها لصفات إنزيت البروتييز القاعبدالرازائين كما ة تفاع عند را و وأستعمال. ةيقة

. B. bassianaمن الفطر

مختلفةتفاعل تخصص اإلنزيم حيال مواد -2 يمتاز إنزيت البروتييز وتخصصه الواسا وفعاليته حيال العديد من موا التفاع سواء كان تناعية

, لذا تبت التعبرف علب تخصبص إنبزيت البروتييبز المنقب (Gupta etal.2002)أو وروتينات طبيعية

صب البقبري المو رجة ألفته حيال ك من الرازائين والجي تبين والببومين M. anisopliaeمن الفطر

وطريقببة maxVو mKوإعتبارالببا مببوا تفاعبب يعمبب عليهببا اإلنببزيت . كمببا تببت تقببدير الثواوبب الحركيببة

. كمبا تبت حسبا نسببة السبرعة القصبو إلب ثاوب ( 12 و 02 و 19 األشبرال) وبورب -الينبويفر

كمببا ة الجي تببين وأسببتعمالةبب كانبب األ. أظهببرت النتببائج أن ةيمببة ثاوبب ميرببال mK / maxVميرببال

178.0لإلنببزيت ) mK ةببيت, إذ ولغبب و الرببازائين ريالبببومين المصبب البقبب أسببتعمال مقارنببة مببا تفاعبب

( ملغبت / 364.0و 339.0و 465.0) maxV عل التوالي . وينما ولغ ةيت( ملغت/ م 182.0و 179.0و

نبزيت إل mK / maxVوولغب نسببة . أي با علب التبوالي , حيال البروتينات الث ثبة المبذكورةم . ةيقة

الربازائين حيبال 2.00 و الببومين المصب البقبريحيبال 1.894 و الجي تين حيال 2.612لبروتييز ا

. (12)الجدول وكما موضح في

. إن العالقيية بييين البروتييييز قيييد البحييثأفضييل مييادة تفاعييل إلنييزيل الجيالتييين ن فيي واسييتنادال الييى ماتقييدل

على ألفة اإلنزيل لمادة تفاعله وهذا دا مال ما يعبر عنيه بثابي سرعة التفاعل وتركيز مادة التفاعل تعتمد

. ) et alAhmed, .2011( لينزيل mKميكالع


126

إلنزيم البروتييز المنقى جزئيا من الفطر maxVو mK( لتقدير 1934بورك ) -( : منحنى الينويفر20الشكل )

M. anisopliae ين كمادة تفاعل.جيالتال بأستعمال

إلنزيم البروتييز المنقى جزئيا من الفطر maxVو mKبورك لتقدير -( : منحنى الينويفر21الشكل )

M. anisopliae البومين المصل البقري مادة تفاعل. المأستعب

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

-15 -10 -5 0 5 10 15 20 25

1/[S]

1/V

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

-15 -10 -5 0 5 10 15 20 25

1/V

1/[S]


127

كما قدر الفعالية النسبية إلنزيل البروتييز حيال البروتينا المستخدمة في هذه الدراسة مقارنة مع

أن إلنييزيل البروتييييز مقييدرة 14الجييدول . ويتضييح ميين %100الكييازا ين والييذي تحسيي فعاليتييه النسييبية

، إذ نفسييها التفاعييل األخير المسيتخدمة وتحي ظيرو اإلختبيار مقارنية بميواد الجيالتيينأفضيل لتحلييل

الجيالتييييين مييييواد التفاعييييل اسييييتعمال( % ب109.1و 136.36بلغيييي الفعالييييية النسييييبية إلنييييزيل البروتييييييز )

والبومين المصل البقري ، على التوالي . جماعتبهو Mohanty تتفق النتيجة المستحصلة من الذه الدراسة ما ما توت إليه كب مبن

(b 2008إذ وجبببدوا ) عنبببد إضبببافة الربببازائين و الجي تبببين وألببببومين المصببب البقبببري(BSA)

ان M. anisoplia 892 مبن الفطبر Pr2و Pr1والببتبون مبوا حاثبة إلنتباج إنبزيت البروتييبز

وكانبب إنتاجيتببه ث ثببة أضببعاف مببا أنتجتببه البيئببة Pr1الجي تببين ةببد حفببز إنتبباج إنببزيت البروتييببز

وحدة/ملغت وروتين مقارنة 0.168. إذ ولغ الفعالية النوعية األساسية المترونة من األم ح فقط

حفز إنتاجه ألببومين ساعة من ودء التخمر, ولت ي 12وحدة/ملغت وروتين ووعد 0.089والرازائين

وجماعتببه Yang. أشببار الببتببون و Bovine Serum Albumin(BSA)المصبب البقببري

علبب Lacanicillium psalliotae( إلبب ةاوليببة إنببزيت البروتييببز المنقبب مببن الفطببر 2005)

تحلي مد واسا من موا التفاع كان أف لها الرازائين يليه ألبومين المص البقري والجي تين

( % , عل التوالي.12و 14و 20و 29و 100والروالجين ثت كيوتر النيماتو ا وفعالية نسبية )

ا وجد Dactylellinaان إنزيت البروتييز المنقب مبن الفطبر (2007a)وجماعته Yang وأي

varietas يستطيا تحلي مد واسا من موا التفاع اشتمل عل الربازائين وألببومين المصب

(% 3 و 20و 10و32و100 البقري والجي تين وكيوتر النيماتو ا والروالجين وفعاليبة نسببية )

عل التوالي.

Arthrobotrysر ان إنبزيت البروتييبز المنقب مبن الفطب (2007b)وجماعتبه Yangوأوضبح

conoides تخصصبية عاليبة حيبال الربازائين وودرجبة أةب حيبال ألببومين المصب البقبري ذو

أعلب فعاليبة .Beauveria spأظهر إنزيت البروتييز المنق مبن الفطبر . والروالجين الممسو

مقارنبببة والفعاليبببة النسببببية لرببب مبببن %100نسببببية حيبببال الربببازائين كمبببا ة تفاعببب إذ ولغببب

( % علببببببب 5.06و 47.38الهيموغلببببببووين وألبببببببومين المصببببببب البقببببببري والتبببببببي ولغبببببب )

. (Shankar etal.,2011)التوالي


128

( عببن مببا ور ذكببره فببي الدراسببات 2012ولببت تختلببف النتيجببة التببي حصببل عليهببا العبببا ي )

بببا أن الفعاليبببة النسببببية ولغببب ) (% حيبببال 86.5و 88.4و 91.9و 100أعببب ه إذ وجبببدت أي

الرازائين وألبومين البيض والجي تين وألبومين المص البقري عل التوالي.

وام التبي تعتمبد عليهبا طبيعبة التخصبص فبي ارتبباط مبا ة ( عد من الع1987ت )فليح, ذكر

تجبباذ المجموعببات الممببحونة لمببا ة التفاعبب مببا تلببك التفاعبب وبباألنزيت, والببذه العوامبب الببي:

الموجببو ة فببي اإلنببزيت , تببداخ المجموعببات الرارالببة للمبباء مببا تلببك الموجببو ة فببي البببروتين ,

المجموعات المتراوطة للبروتين . التآتر الهيدروجيني ما البروتين , التداخ ما

M. anisopliae إلنزيم البروتييز المنقى من الفطروالفعالية النسبية الثوابت الحركية ( :12جدول )

مختلفة )بروتينات( حيال مواد تفاعل

الثبات الحراري لإلنزيم -3

بدرجا حرارة M. anisopliae ر من الفط جز يال المنقىأظهر نتا ج حضن إنزيل البروتييز

انحصر بدرجا حرارة دقيقة ، أن اإلنزيل احتفظ بكامل فعاليته 30( ل و لمدة 65-20بين ) تنحصر

حتفظ ( ، 22 ( ل )الشكل30-20بين ) ة حرارة بدرج من فعاليته األصلية % 97.8بحوالي اإلنزيلوا

و فقد ،( ل 60 و 55 جة حرارة )بدر ، إنخفض بعدها الفعالية اإلنزيمية بشكل ملحوظ ل 35

. % 65عند درجة حرارة تمامال ل ، بينما فقدها 60جة حرارة بدر اليتهفعمن % 94.5اإلنزيل

Km / Vmax )ملغم/مل .دقيقة(Vmax ()ملغم / ملKm مادة التفاعل

الفعالية

النسبية %

136.36 2.612 0.465 0.178 الجيالتين

109.1 1.894 0.339 0.179 البومين المصل البقري

100 2.00 0.364 0.182 الكازا ين


129

0

20

40

60

80

100

120

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

ة قي

تبلم

اية

عاللفا

) %

(

(م ) درجة الحرارة

M. anisopliae ( : الثبات الحراري إلنزيم البروتييز المنقى جزئيا من الفطر22الشكل )

الطبيعيية يمكن ان يعز سب االنخفاض في فعاليية اإلنيزيل عنيد درجية الحيرارة العاليية إليى تغيير الحالية

وأن التغير السريع في طبيعة اإلنزيل يؤدي إلى تحطييل denaturation )مسخ بروتين األنزيل( لمنزيل

األواصييييييييييييير الهيدروجينيييييييييييييية الضيييييييييييييعيفة بصيييييييييييييورة تيييييييييييييؤدي إليييييييييييييى فقيييييييييييييدان اإلنيييييييييييييزيل لفعاليتيييييييييييييه كليليييييييييييييا

( . ; Muthulaksmi, etal.,2011 1986)داللي،

تسيياهمية الغييير الييية إذ تعمييل عليى تكسيير األواصيير تبيدي أغليي اإلنزيمييا حساسييية ليدرجا الحييرارة الع

التييي تحييافظ علييى التركييي ثالثييي األبعيياد لمنييزيل فتبييدأ السالسييل متعييددة الببتيييد باالنفتيياح والييذي يرافقييه

. (Whitaker,1972; Murray,2003)فقدان سريع للفعالية األنزيمية

ألنييزيل البروتييييز وذليي حسيي مصييدر اإلنييزيل فقييد وجييد فييي تحديييد الثبييا الحييراري األبحيياثوقييد تباينيي

Liang ( فيييييي دراسيييييته للثبيييييا الحيييييراري إلنيييييزيل البروتيييييييز المنقيييييى مييييين الفطييييير 2006وجماعتيييييه )

Monascus purpurcus ل 40ان اإلنزيل كان ثباتلا لغاية درجة حرارة .

اتلييا حراريلييا عنييد مييد حييراريبث Arthrobotrys coniodeل البروتييييز المنقييى ميين الفطيير وامتليي إنييزي

. (Yang etal., 2007b)ل 70دقيقة، لكنه يثبط تماملا بدرجة حرارة 20ل بعد حضنه (42-60)

و Neurospora crassa( ان إنزيل البروتييز المنقى من الفطرين 2011وجماعته ) Abiramiبين

Penicillium janthinellum بييين انحصيير كييان ثابتلييا حراريلييا لمييدة ثييالث سيياعا عنييد درجييا


130

ثباتيييال حراريليييا ميييع A.nigerأبيييد إنيييزيل البروتيييييز المنقيييى مييين العزلييية المحليييية للفطييير ، ل (30-40)

. (Devi etal.,2008)( ل ولمدة ساعة كاملة 40االحتفاظ بكامل فعاليته عند درجة حرارة )

ل ويفقيد 30ف نيه يكيون ثابتليا حراريليا عنيد درجية .Beauveria spأما إنزيل البروتييز المنقى مين الفطير

. (Shankar etal.,2011)ل بعد حضنه لمدة ساعة 40من فعاليته بدرجة حرارة 15%

وجيد إن األنيزيل إذ B.bassianaولل يختل كثيرلا في ثباته الحراري إنيزيل البروتيييز المنقيى مين الفطير

ميين فعاليتييه األصييلية %90ل ، واحييتفظ اإلنييزيل بحييوالي (40-20)امييل فعاليتييه بمييد حييراري احييتفظ بك

(.2012. )العبادي، %70ل، وفقدها تماملا عند درجة حرارة 45بدرجة حرارة

فعالية اإلنزيمالرقم الهيدروجيني األمثل ل -4

في موضح M. anisopliae من الفطر فعالية إنزيل البروتييزثير الرقل الهيدروجيني في ت أن

كونه منمما يشير إلى 8.0 البحثقيد لفعالية اإلنزيل األمثل الرقل الهيدروجيني نفكا( 23الشكل )

. Alkaline Protease ةقاعديال ا البروتييز

أن كل إنزيل يمتل رقملا هيدروجينيلا مثاليلا واحدلا لفعاليته ، بيد أن بعض de Man (2007)ذكر

يا إال أن بعيض اإلنزيميا اإلنزيما تمتل أكثر من ذل ، وعادة ميا يكيون هيذا اليرقل بميد ضييد تمامل

تبدي مد واسع له. لهيبدروجيني األمثب ( مبن أن البرةت ا2006وجماعتبه ) Erlacherتتفق الذه النتيجة ما ما توت إليبه

وجماعتبه Yang مباذكره و. (8.0البو ) B. brongriartiiلفعالية إنزيت البروتييز المنق من الفطر

(2007a) ( كبببان األمثببب لفعاليبببة إنبببزيت البروتييبببز المنقببب مبببن الفطبببر 8أن البببرةت الهيبببدروجيني ) مبببن

Dactylellina varietas , ولبت يختلبف إنبزيت البروتييبز المنقب مبن الفطبرB. bassiana إذ كانب

. ان البببرةت (Namasivayam etal.,2010) (8أعلببب فعاليبببة لبببه عنبببد البببرةت الهيبببدروجيني )

Pleurotus sajor-Cajuالو األمث لفعالية إنزيت البروتييز المنق من الفطر الهيدروجيني المذكور

(Ravikumar etal.,2012) .

سبب مصببدر اإلنببزيت فقببد وجببدح مثبب لفعاليببة إنببزيت البروتييببز يختلببفتحديببد الببرةت الهيببدروجيني األ ان

Liang ( 2006وجماعته ) ان مد الرةت الهيدروجيني األمث لفعالية إنزيت البروتييز المنق من الفطر

Monascus purpurcus ووجبببد , 9 - 7ينحصبببر وبببينDevi ( ان البببرةت 2008وجماعتبببه )

(. 10كان ) A. nigerي والمنق من الفطر ث لفعالية إنزيت البروتييز القاعدالهيدروجيني األم


131

0

1

2

3

4

5

7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5

ة مي

زيإلن

اية

عاللف

ا(

ة حد

و /

مل )

الرقم الهيدروجيني

A. oryzaeنببزيت البروتييببز المنقبب مببن الفطببر وكببان الببرةت الهيببدروجيني السبباوق الببذكر الببو األمثبب أل

(Murthy &Naidu,2010) وكببان الببذا الببرةت الببو األمثبب لفعاليببة إنببزيت البروتييببز المنقبب مببن .

وكببذلك إلنببزيت البروتييببز المنقبب مببن الفطببر Beauveria sp. (Shankar etal.,2011)الفطببر

Myceliophthora sp. (Zanphorlin etal.,2011) .

أكثبببر مبببن ةيمبببة البببرةت أةببب أو pH( أن الفعاليبببة اإلنزيميبببة تقببب عنبببد ةبببيت 20ي حبببظ مبببن المبببر )

الهيببدروجيني األمثبب لفعاليببة اإلنببزيت وذلببك وسببب ترببوين تببورة أيونيببة لإلنببزيت أو للمببا ة األسبباع أو

ببا غيببر م ئمببة للتفاعبب األنزيمببي, وةببد يرببون وسببب تغيببر فببي التركيبب الطبيعببي لإلنببزيت لرليهمببا مع

( . 1991)الداو ي,

إن التبأثير فبي ثمباالت األحمببا االمينيبة عنبد القببيت األعلب واالوطبأ مببن البرةت الهيبدروجيني األمثبب

للفعالية والتي يج أن ترون في حالة معينة لري يحبدث التفاعب مبن شبأنه أن يب ثر علب ارتبباط المبا ة

همبا أو اكتسبا أو فقبدان األساع واإلنزيت, إضافة إل تأثيراته عل شحنة اإلنبزيت ومبا ة التفاعب أو كلي

مجباميا ممبحونة سبت ثر عرسبي ا علبب ارتبباط مبا ة التفاعب وباإلنزيت لببذا سبوف يعيبق أو يبطب التحفيببز

(Murray,2003; Yandri etal., 2008) .

M. anisopliaeني األمثل لفعالية إنزيم البروتييز المنقى جزئيا من الفطر( : الرقم الهيدروجي23الشكل )


132

نزيمالرقم الهيدروجيني لثبات اإل -5

ان تحديد الرقل الهييدروجيني األمثيل لثبيا اإلنيزيل يعيد ضيروريلا لكونيه مين الصيفا المهمية فيي تحدييد

يني األمثيييييل لثبيييييا إنيييييزيل درع اليييييرقل الهييييييدروج ، ليييييذل (Whitaker,1972)التنقيييييية وخيييييزن اإلنيييييزيل

اإلنزيل يحتفظ بكامل فعاليته ن أ( 24 الشكل ) من و يتضح ، M.anisopliaeز المنقى من البروتيي

عنيد من فعاليته % 92.86بي اإلنزيل احتفظ ( كما يالحظ أن 9.0 -7.0 )بمد هيدروجيني رقل عند

ل ، و انخفضيي الفعالييية إلييى 37 دقيقيية بدرجيية حييرارة 30لمييدة هحضيينبعييد 9.5الييرقل الهيييدروجيني

، كييذل إنخفضيي الفعالييية اإلنزيمييية فييي األرقييال الهيدروجينييية 10.5عنييد الييرقل الهيييدروجيني 50.0%

عنييييييد الييييييرقل %71.43فعالييييييية ال، إذ بلغيييييي والقريبيييييية ميييييين الييييييرقل الهيييييييدروجيني المتعييييييادل الحامضييييييية

. 6.5 الهيدروجيني

من الفطر جزئيا المنقى ي األمثل لثبات إنزيم البروتييز( : الرقم الهيدروجين24الشكل )

M. anisopliae عتمادال على هذه النتيجة فان اإلنزيل يعد ثابتيال نسيبيال فيي األرقيال ة القاعديية والقريبية مين الهيدروجينييوا

وقييد يعييود السييب إلييى حييدوث ،التعييادل إال أنييه غييير ثابيي فييي الظييرو الحامضييية والقاعدييية المتطرفيية

تغييرا فييي التركييي الثييانوي والثييالثي لجز ييية اإلنييزيل )الييدنتره( عييالوة علييى تغيييير الحاليية األيونييية للموقييع

Bisswanger (2008 )، وعليل (Lehmacher & Bisswanger ,1990)الفعيال وميادة التفاعيل

0

20

40

60

80

100

120

5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5

ة قي

تبلم

اية

عاللف

ا )

%(

الرقم الهيدروجيني


133

األيونيية الموجيودة داخيل اإلنيزيل وعليى أن عدل الثبا قد يعز إلى حدوث تغيرا فيي شيحنة المجياميع

سييطحه )والتييي لهييا دور مهييل فييي وظيفيية اإلنييزيل( وهييذا سيييؤثر علييى الشييحنة الكلييية لمنييزيل والتييي بييدورها

سو تؤثر بشكل غير عكسي على التركي الطبيعي لمنزيل.

اإلنيزيل والطبيعية تباين الدراسيا فيي تحدييد اليرقل الهييدروجيني لثبيا اإلنيزيل، وذلي الخيتال مصيدر

الكيمياوية للمحلول المنظل واللذان يعدان من العوامل المهمة في تحديد الرقل الهيدروجيني لثبا األنيزيل

(Segel,1976) .

ي إذ وجيييد أن إنيييزيل البروتيييييز القاعيييد( ، 2008وجماعتيييه ) Yangتتفيييد نتيجييية البحيييث ميييع نتيجييية

د مياحتفظ بفعالية عاليية عنيد ال Monacrosporium cystosporiumالسيريني المنقى من الفطر

-A. flavus K( أن إنيزيل البروتيييز المنقيى مين الفطير 2003) kim. وجيد دقيقية 30( ولميدة 7-9)

( بعييد حضيينه 11-8ميين فعاليتييه عنييد رقييل هيييدروجيني ينحصيير بييين ) %80يكييون ثابتلييا ويحييتفظ بييي 03

فقد وجد أنيه Lacanicillium psalliotaeمن الفطر . أما إنزيل البروتييز المنقى ساعة 24لمدة

. (Yang etal.,2005)( . 10-9) تلا عند رقل هيدروجيني ينحصريبقى ثاب

ثابتلييا عنييد رقييل هيييدروجيني Hirsutella rhossiliensisبقييي إنييزيل البروتييييز المنقييى ميين الفطيير

فقيط مين فعاليتيه عنيد كيل مين اليرقل %20بييدقيقية واحيتفظ 120( عنيد حضينه لميدة 6-5ينحصر بين )

. (Wang etal.,2009)بعد حضنه لنفع المدة 7و 4

بكامل فعاليته عند رقل هيدروجيني ينحصر بين B.bassianaاحتفظ إنزيل البروتييز المنقى من الفطر

( 30)بعييد حضيينه لمييدة 7.5ميين فعاليتييه عنييد الييرقل الهيييدروجيني %78.5( كمييا احييتفظ بييي 8.0-10.0)

( .2012ل . )العبادي، 37دقيقة بدرجة حرارة

ميد واسيع مين Alternaria solaniي السيريني المنقى جز يلا من الفطير كان إلنزيل البروتييز القاعد

( 12-6) لييييييييييييييييييييييييييرقل الهيييييييييييييييييييييييييييدروجيني لثبييييييييييييييييييييييييييا اإلنييييييييييييييييييييييييييزيل امييييييييييييييييييييييييييد الثباتييييييييييييييييييييييييييية إذ كييييييييييييييييييييييييييان

(Chandrasekaran and Sathiyabama, 2013) .


134

ية في فعالية اإلنزيم ائيتأثير بعض أيونات المعادن و المواد الكيم -6

ي فعالية اإلنزيل فقد كان ف إلى تباين ت ثير األيونا الفلزية( 13)وتشير النتا ج المبينة في الجدول

الفعالية أرتفع، إذ ملي مولر 5عند التركيز لينزيل حاثال ت ثيرال فقط )2Fe+( الحديدوزأليونا

. % (290.566 )ة بنسب

إذ بلغييي اإلنييزيلفعالييية فيييي أمييا كلوريييد النيكييل وحيييامض البورييي فقييد كييان لهميييا تيي ثيرال تثبيطيييال واضييحال

كمبا تبدل .( % عليى التيوالي 64.151و 71.698 ) الميادتين الميذكورتين اسيتعمالعاليية المتبقيية بالف

والرالسببيوق Mn)2+(( والمنغنيببز 2Mg+(أن أليونببات المغنسببيوق الجببدول المببذكور فببي النتببائج

)+2(Ca ا تثبيطي ا في فعالية اإلنزيت أةو وريك إذ ولغ من تأثير كلوريد النير وحامض البتأثير

(% علبب التببوالي, غيببر أن أيببون 37.73و 33.96و 33.96الفعاليببة المتبقيببة لإلنببزيت )نسبببة

(% وذلبك لربون 16.98الزئبق كان له التأثير التثبيطي األةو إذ ولغ الفعالية المتبقية للنبزيت )

فبببي الببببروتين وتحولهبببا (Thiol groups)أيونبببات الزئببببق تتفاعببب مبببا مجببباميا الثبببايول

Mercaptides عبن أنهبا تتفاعب مبا ثمباالت األحمبا األمينيبة الهسبتدين ف ب Histidine

, عبب وة علبب ذلببك فببأن الببرواوط الثنائيببة الربريبب الموجببو ة فببي Tryptophanوالتريبتوفببان

& Wellingta etal. 2004 , Do Nascimento)اإلنببزيت تببتحطت وفعبب أيببون الزئبببق

Martins,2004) .

Merheb- Diniالسببباوقة, إذ اثبببب األوحببباثجببباءت البببذه النتبببائج متفقبببة مبببا الرثيبببر مبببن

Thermoascus( ان إنبببزيت البروتييبببز المعبببدني والمنقببب مبببن الفطبببر 2009وجمبببا عتبببه )

aurantiacus 2+يحفز ووجو أيون الحديدوزFe .

الخبببارجي والمنقببب مبببن الفطبببر( ان إنبببزيت البروتييبببز 2010وجماعتبببه ) Upadhyayوجبببد

(MTCC277) flavus A. 2+تببز ا فعاليتببه ووجببو أيونببات الحديببدFe 2+والخارتببينZn

ملببي مببولر وتثبببط فعاليتببه عنببد نفبب التركيببز ووجببو أيونببات 50عنببد التركيببز 2Co+والروولبب

2Hg+والزئببببببق 2Mn+والمنغنيبببببز 2Ca+والرالسبببببيوق 2Mg+والمغنسبببببيوق 1Na+الصبببببو يوق

. 2Cu+والنحاع

وبأن إنبزيت البروتييبز الحام بي والمنقب مبن وا( فقبد وجبد2013وجماعتبه ) Yinأمبا

. 2Fe+ينمط ووجو أيونات الحديدوز .BCRC32720 niger Aالفطر


135

المنقى بروتييز( : تأثير بعض األيونات المعدنية و المواد الكيميائية في فعالية إنزيم ال13جدول )

M. anasopliae من الفطر

الفعالية المتبقية )%( / مل ( الفعالية ) وحدة التركيز ) ملي مولر( األيون أو المادة الكيميائية

100 0.33 - إنزيل غير معامل

CaCl 5 0.125 37.73)2(كلوريد الكالسيول

MgCl 5 0.11 33.96)2(كلوريد المغنيسيول

MnCl 5 0.11 33.96)2(كلوريد المنغنيز

5 0.96 290.5 (2FeClكلوريد الحديدوز )

NiCl 5 0.23 71.69)2(كلوريد النيكل

5 0.21 64.15 (Boric acid)حامض البوريك

HgCl 5 0.056 16.98)2كلوريد الز بد )

PMSF 5 0 0

اثيلين ثنا ي أمين رباعي (EDTA)حامض الخلي

5 0.33 100

Iodoacetamide (IAA) 5 0.537 113.158

مركابتوايثانول (mercaptoethanol)

5 0.087 26.41


136

با فبي ان وجو األيونات المعدنية يوفر حماية للنزيت ضبد المسبت الحبراري ويلعب ور مهم

. (Paliwal etal.,1994)استمرار المر الفعال للنزيت عند رجات الحرارة العالية

( سببب القاوليببة التحفيزيببة لبببعض األيونببات 2012) Bamideleو Femi-Olaأوضببح كبب مببن

الموجبو ة عنبد Catalytic groupsوذلك لرونها حينمبا تبرتبط مبا مجباميا العوامب المسباعدة

المبا ة األسباع -المواةا الفعالة للنزيمات توفر الحماية لها وتحبافظ علب اسبتقرار معقبد اإلنبزيت

ناتج النهائي, أما سب القاولية التثبيطيبة للببعض األخبر مبن األيونبات فيعبو الب ةاوليبة إلعطاء ال

التأكسد واألختزال لد الذه األيونات إذ تعم عل إخراج االلرترونات من التفاع الحات وبين

المواةببا الفعالببة لإلنزيمببات وركائزالببا )المببا ة األسبباع( مسببببة حببدوث تمببوالات أمببا فببي تركيبب

المبا ة األسباع ووبذلك تمنبا تربوين -زيت أو تركي الما ة األساع معطلة تربون معقبد اإلنبزيتاإلن

الناتج النهائي.أميا فيميا يتعليد بتي ثير المثبطييا المختلفية فيي فعاليية اإلنيزيل فيي ن النتيا ج تشيير إليى أن اإلنيزيل فقييد

)أحد مثبطا البروتييز السيريني( والذي يحدد طبيعة البروتييز ضمن PMSF اليمال بوجود تما فعاليته

للحييامض األمينييي Sulfonated )كبرتيية( سييلفنة، حيييث أنييه يقييول ب Serine Proteasesمجموعيية

الموجييييود فييييي الموقييييع الفعييييال لينييييزيل وبالتييييالي ينييييتج عنييييه فقييييدان الفعالييييية بالكامييييل Serineالسيييييرين

(Sharma & De ,2011 . ) ( ملي موالر للمثبط 5-1ان التركيز )وتت أثباتPMSF يثبط ومدة

فببببببببي عببببببببد غيببببببببر ةليبببببببب مببببببببن األوحبببببببباث ي السببببببببيرينيإنببببببببزيت البروتييببببببببز القاعببببببببد

(Kumar etal.,1999;Huang etal.,2003;Kamoun etal.,2008;Reddy

etal.,2008) .

)أحبد مثبطبات البروتييبز المعبدني( EDTAمبن البـ في الفعاليبة األنزيميبة تأثيرا ك لالنالت يرن وينما

البـ اسبتعمال. وعنبد Metallo-Proteases لي ضبمن مجموعبة أن اإلنزيت ةيد البحث عل مما يدل

IAA أحببد مثبطببات وروتييببز السيسببتاين(Cystein Proteases ) 113.158 ونسبببةإز ا ت الفعاليببة % .

ت ثيرال تثبيطييال واضيحال Mercaptoethanol الي أن لمادة فضالل عن ذل ف ن الجدول المذكور يبين

. % 26.415 نزيلليالفعالية المتبقية نسبة في فعالية إنزيل البروتييز إذ بلغ


137

ووجبو مبا ة %95ونسببة يثببط B. bassianaإنبزيت البروتييبز المنقب مبن الفطبر أن وجبد

Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ملبي مبوالر. وعنبد نفب 10عنبد التركيبز

و 100إذ ولغب الفعاليبة اإلنزيميبة ) EDTAأو مبا ة Iodoacetamideالتركيز لت يتبأثر ومبا ة

( ملببي مبببوالر ووجببو كلوريبببدات 10و 0.1( % علبب التبببوالي وثبببط كبببذلك عنببد التركيبببز )99

Mercaptoethanolالصبببببببببو يوق والمغنسبببببببببيوق والرالسبببببببببيوق والحديبببببببببد ومبببببببببا ة

(Bidochka & Khachatourians,1988) .

Dactylellina( ان إنببزيت البروتييببز المنقبب مببن الفطببر 2007aوجماعتببه )Yangوأوضببح

varietas يثببط ومبدة ووجبو مبا ة البـPMSF . كمبا أثبب Shankar ( أن 2011وجماعتبه )

ا تثبيطي بببا فبببي فعاليبببة إنبببزيت البروتييبببز المنقببب مبببن الفطبببر Hg)+2 (أليونبببات الزئببببق تبببأثير

Beauveria sp. ( ملي مولر , وينمبا أ 10عند التركيز ) %63.16إذ ولغ الفعالية المتبقية

, أمبا مبا تي البـ %97.75إل تثببيط الفعاليبة ونسببة PMSF( ملي مولر من ما ة الـ1) استعمال

EDTA وIAA . ا ملحوظ ا في فعالية اإلنزيت فلت يرن لها تأثير

با .Myceliophthora spلوحظ ان فعالية إنبزيت البروتييبز المنقب مبن الفطبر ةبد ثبطب تمام

EDTAزيمية ووجو البـ, في حين لت تتأثر الفعالية اإلن PMSFملي مولر من ما ة الـ 5ووجو

بق فقد كان (% عل التوالي . أما أيون الزئ100و 95إذ ولغ الفعالية المتبقية للنزيت ) IAAو

. (Zanphorlin etal.,2011) %33.3إذ ولغ الفعالية المتبقية له مثبط ا ةوي ا

ت الرالسبببيوق ( ان فعاليبببة إنبببزيت البروتييبببز تبببز ا ووجبببو كلوريبببدا2012العببببا ي ) ووينببب

ملبي مبوالر علب 5(% عنبد التركيبز 140.83و 174.67والمغنسيوق إذ كان الفعاليبة المتبقيبة )

التوالي , أما كلوريد المنغنيز والنير والزئبق فقد ثبطوا فعالية اإلنزيت عند نف التركيز إذ ولغ

يوريببك الفعاليببة (% علبب التببوالي. وثبببط حببامض ال36.03و 52.40و 87.34الفعاليببة المتبقيببة )

فقبد أ ت إلب تثببيط PMSF. أمبا مبا ة ملبي مبولر 5تقريب ا عنبد التركيبز %50االنزيمية ونسبة

ملبي مبوالر 5 اسبتعمال( ملي مولر, وعنبد 5و 1الفعالية االنزيمية وصورة كلية عند التركيزين )

از ا ت الفعاليببببة االنزيميببببة للنببببزيت لتصبببببح الفعاليببببة المتبقيببببة IAAو EDTAمببببن مببببا تي

نفببب التركيبببز السببباوق مبببن مبببا ة اسبببتعمال(% علببب التبببوالي وعنبببد 114.63و 144.13)

Mercaptoethanol 33ثبط الفعالية اإلنزيمية ونسبة% .

Conclusions and Recommendations األستنتاجات والتوصيات

138

(Conclusions)االستنتاجات

M. anisopliaeللفطر البوغي وراشح المزرعةلمعلق ا تبين من الدراسة أن -1

حياة عثة الشمع الكبرى ولكن بصورة متباينة فقد أبدت ادوارلهما تأثير واضح في

الى الهالك اليرقات والبالغات تعرضتالبيوض والعذارى مقاومة ملحوظة بينما

البوغي وراشح معلقلبنسبة اكثر وكان الطور اليرقي األول أكثر حساسية ل

من الطورين الرابع و السابع . المزرعة

ان العزلة الفطرية قيد الدراسة قادرة على انتاج انزيمات البروتييز والكايتينيز تبين -2

والاليبيز فضال عن مضاد األحياء المجهرية )الدستروكسين ( غير ان عامل

.هو انزيم البروتييز للفطر الضراوة الرئيسي

انزيم تاجالثمن ألن ةورخيصمن مواد متوفرة محليا ط اقتصادي وس أمكن تركيب -3 وسط عصير التمر المدعم ببعض المغذيات . البروتييز يتمثل باستعمال

تفاعل مما أظهر إنزيم البروتييز قيد الدراسة تخصصا حيال العديد من مواد ال -4

ه في السيطرة الحيوية ضد أنواع مختلفة من الحشرات .يشير إلى إمكانية إستعمال

يطرة الحيوية ضد الحشرات التي تنتشر في إمكانية إستخدام إنزيم البروتييز في الس -5

ه في فصل الصيف نظرا لقلة ثباته في الخريف والربيع , وال يمكن إستعمال فصلي

درجات الحرارة العالية .

(Recommendations)التوصيات

حول استعمال الفطر في السيطرة على أنواع مختبرية وحقلية أجراء دراسات -1

أخرى من الحشرات االقتصادية و الطبية ومفصليات األرجل فضال عن تاثيره

.في األعداء الحيوية

عثة السيطرة على عندما يستعمل في أجراء دراسة حول تأثير الفطر في النحل -2

. الشمع الكبرى

بالطرائق الوراثية . M. anisopliaeتحسين إنتاج إنزيم البروتييز من الفطر -3

دراسة المواد األيضية األخرى المنتجة من الفطر )مثل األحماض العضوية( -4

والتي لها دور في السيطرة الحيوية .

دراسة الظروف المثلى ألنتاج سموم الدستروكسين لتحسين انتاجه من الفطر . -5

References املصادر

139

المصادر العربية

الحيوية والكيميائية في بعض (. تأثير بعض عوامل المكافحة 2009 ) محمد صبري جبراالمارة،

) Trogoderma granariumخنفساء الحبوب الشعرية )الخابرا( حياتية حشرةه اوج

(Everts) (Coleoptera: Dermestidaeرسالة ماجستير. كلي ) ة الزراعة / جامعة

صفحة. 113البصرة.

.صفحة 207 المعارف، دار .مصر . ومنتجاته العسل نحل 1994 ). ) .علي محمد ، البنبي

Galleria(. بعض أوجه المكافحة لدودة الشمع الكبرى 1998نهاد كاظم خلف. ) التميمي،

mellonella ( L. ) ( Lepidoptera : Pyralidae ) المرباة على أوساط غذائية

صناعية. رسالة ماجستير. كلية الزراعة. جامعة بغداد. العراق.

( . دراسات مختبرية حول استخدام رواشح بعض الفطريات 2003.) دينا حسين هاتفالجبوري،

.Musca domestica Lكطعوم سامة لمكافحة حشرة الذباب المنزلي

(Diptera: Muscidae رسالة ماجستير. الكلية التقنية / المسيب. صفحة .)120 .

.Myrtus communis Lتأثيرات مستخلصات نبات األس . )1991( .، رضا صكب رانيالجو

. جامعة . كلية الزراعة أطروحة دكتوراه . في حشرتي الخابرا ودودة الشمع الكبرى

. العراق .بغداد

( . األحياء المجهرية الصناعية . 1989، نظام كاظم والمصلح، رشيد محجوب . )الحيدري

الطبعة األولى ، جامعة بغداد .

Beauveria. دراسـات مختبريـة وحقليـة حـول تأثيـر الفطـر ( 2000 )، عـادل طه . الحيدري

bassiana (Bals.) Vuill فـي حفــار سـاق الـذرة(Phalaenidae : Lepidoptera)

Sesamia cretica صفحة( . 65جامعة بغداد ) –زراعة كلية ال –. رسالة ماجستير

/ العلمي البحث و العالي التعليم وزارة . الحيوية التقنية . ( 1990 ) . محمود زهرة ،الخفاجي

. النشر و للطباعة الحكمة دار مطابع . بغداد جامعة

Ricinus communis. تأثير مستخلصات أوراق نبات الخروع (2010). هبة عباس عليالخفاجي ،

L. في بعض جوانب حياتية لبعوضة الكيوليكس(Diptera: Culicidae) Culex pipiens

قادسية. رسالة ماجستير.كلية العلوم / جامعة ال

البحث و العالي التعليم وزارة . المتقدمة الحيوية الكيمياء . ( 1991 ) . حسن محمد علي الداودي،

. الزراعة كلية – بغداد جامعة / العلمي


140

.. تصميم وتحليل التجارب الزراعية( 2000 ).خاشع محمود وخلف هللا، عبدالعزيز محمدالراوي،

الطبعة ارة التعليم العالي والبحث العلمي. دار الكتب للطباعه والنشر. جامعة الموصل.وز

صفحه. 488الثانية.

( . المقاومة الحيوية لآلفات . دارالكتب للطباعـــــــة والنـشر. جامعة 1992حمزة كاظم )الزبيدي،

. 167-63الموصل .

/ بغداد جامعة . الطبعة الثانية . المجهرية األحياءمبادئ فسلجة . ( 1980 ) . رؤوف مها ،السعد

. 396صفحة . العلمي البحث و العالي التعليم وزارة

( .دراسة كيموحيوية ألنزيم البروتييز المنتج من الفطر2012، سرور محمد علي .) العبادي

Beauveria bassiana رسالة ماجستير / كلية العلوم / جامعة كربالء . .

Vuil. Beauveria (.Bals)(. كفاءة الفطر2011، شيماء حميد و سمير، صالح حسن.) العبيدي

bassiana في المكافحة االحيائية لدودة ورق القطن(Boisd.) Spodoptera littoralis .

. 82 -77. 1. العدد 29 بات العربية . الحجموقاية الن مجلة

.تاثير مستخلص البروبويس الفينولي وبعض منظمات ( 2012، مسلم عاشور عبد الواحد .) العطبي

Galleria mellonellaالنمو الحشرية في دودة الشمع الكبرى

L.(Lepedopteera:Pyralidae) ( . 1( / العدد )4لة الكوفة للعلوم الزراعية /المجلد ). مج

159- 166 .

Sorok. Metarhizium (.Metsch)تقييم كفاءة الفطر ( .2011، احمد غانم نوري ) المحنة

anisopliae في مكافحة نوعين من البعوض (Diptera: Culicidae) في محافظة الديوانية

رسالة ماجستير /كلية العلوم / جامعة القادسية . .

Musca ( . المكافحة الجرثومية للذبابة المنزلية2010.) حسين رياض محمودالمشهداني،

domestica L. (Diptera: Muscidae) باستخدام الفطر المضادEntomophthora

muscae .69صفحة / كلية العلوم / جامعة القادسية. رسالة ماجستير .

بعة الثانية ،جامعة بغداد (. الكيمياء الحياتية. الجزء األول ، الط1990سامي عبد المهدي )المظفر ،

. 492،وزارة التعليم العالي والبحث العلمي . صفحة

تأثير مستخلصات نبات السبحبح ( . 2013) كامل عبد الحسين ، اسيل الوائلي

Melia azedarach(Geranial:Meliaceae) في بعض جوانب األداء الحياتي لعثة الشمع

رسالة ماجستير / كلية L.(Lepidoptera:Pyrallidae ) Galleria mellonella الكبرى

التربية للبنات / جامعة الكوفة .


141

في بعض الجوانب ( . تأثير بعض عوامل المكافحة الحيوية 2014علي مرتضى كاظم )، الياسري

. رسالة Musca domestica (L.) (Diptera: Muscidae)الحياتية للذبابة المنزلية

ماجستير / كلية العلوم / جامعة القادسية .

الصفات في التساقط وبعض NAA ،3CA.تأثير منظمات النمو :األيثرل ، (1988رعد طه .)بالكت ،

الزراعة ، جامعة صنف زهدي ، رسالة ماجستير ، كليةالطبيعية والكيمياوية لثمار نخلة التمر

العراق . –بغداد

تقييم كفاءة بعض طرق المكافحة في السيطرة على ( . 2007حقي إسماعيل داوي ) تقي ،

Galleria mellonella (L.) ( Lepidoptera : Pyralidae ) دودة الشمع الكبرى

عسل . رسالة ماجستير . كلية زراعة / جامعة بغداد . وتأثيراتها على نحل ال

حياتية وبيئية دودة حياة دودة الشمع ( . دراسة1997. )، محمد سعيد وعوشان ، هيثم سالم خنبش

. 83 – 80( : 2)15اليمن . مجلة وقاية النبات العربية . –الكبيرة في منطقة لحج

الموصل )ترجمة ( صفحة –فهم األنزيمات . مطابع جامعة الموصل . ( 1983 ) . كامل باسل ،داللي

468 .

العالي و التعليم وزارة / الموصل جامعة . الحيوية الكيمياء أساسيات . ( 1986 ) . كامل باسل ،داللي

. العلمي البحث

341. . دار اليوسف. بيروت. لبنان وعة تربية النحل وكيفية معالجتهاموس . ( 2005) . ، حسينرمال

صفحة.

كلية ترجمة(. ) . األغذية كيمياء . ( 1983 ) . محمد يحيى عالء علي، و جورج عادل ،ساجدي

. األولىالطبعة . وودز .إي .أي و أوراند .دبليو .أل : تأليف . البصرة جامعة / الزراعة

( تحديد الظروف المثلى 2009، اسماء محمد ؛ عزيز ، غازي منعم ؛ الخفاجي ، زهرة محمود ) سعود

المعزولة محليا . المجلة Staphylococcus aureus AG10ألنتاج البروتييز من بكتريا

. 26-10(: 1) 8العراقية للتقانات الحياتية

(. التنقية الجزئية وبعض صفات 2007مران ، رباب ؛ الجنابي ، جواد كاظم عبود )، حيدر ؛ ع شخير

، .Iraqi J.Biotech. المجلة العراقية للتقانة الحيوية Microsporum canisالبروتييز من

. 131-119، الصفحات 1، العدد 6المجلد


142

. المبيدات. وزارة التعليم العالي والبحث العلمي . دار (1993 ). عواد والمالح ، نزارمصطفىشعبان،

صفحة. 520الكتب للطباعة والنشر. جامعة الموصل.

، حمود مهدي ؛ عبود ، هادي مهدي ؛ علي ، حمدية زاير؛ عبود ، فاتن حمادة ؛ سعيد ، فالح صالح

للفطريات الممرضة لحشرة الذبابة البيضاء ( . تقويم القابلية األمراضية1999حسن . )

Bemisia tabaci آذار . 1عدد 4. مجلة الزراعة العراقية . مجلد

تأثير .( 2004. )، سعدي حسين و الجوراني ، رضا صكب و عبد الجبار، تماضر مروان صبر

mellonella مع الكبرىالمستخلص الكحولي لنبات اليوكالبتوس في حياتية دودة الش

L. Galleria . 94ــ 89(: 4) 35. مجلة العلوم الزراعية العراقية .

Eucalyptus camaldulensis تأثير نبات اليوكالبتوس ( .2001مروان . ) تماضر عبد الجبار،

Dehnh) ( جامعة لزراعة. كلية ا . رسالة ماجستير في حياتية دودة الشمع الكبرى .

. بغداد. العراق

دراسة تأثير المستخلص االيثانولي ألوراق وثمار نبات الدورانتا .( 2007)هالة هيثم محمد. علي،

Duranta repens L. وفطرBeauveria bassiana(Balsamo) على االداء الحياتي

ية العلوم للبنات / جامعة رسالة ماجستير. كل .Culex pipiens pipiens Lلبعوضة

صفحة. 137بغداد.

(.تعيين الظروف المثلى 2006، عبد الملك محمد ؛ ابوغرة ، صياح ؛ الفاهوم ،سحر خالد .) عمران

المعزولة من ترب مختلفة في Bacillus firmusألنتاج انزيم البروتييز القلوي من بكتريا

. 387 -373( الصفحات 2العدد ) –( 22محافظة دمشق . مجلد)

. مدخل إلى الكيمياء الحياتية . وزارة التعليم العالي والبحث العلمي / (1987، خولة أحمد . ) فليح

جامعة الموصل .

دودة الشمع ( . دراسة القدرة األمراضية لبعض المسببات المرضية في 2011، حسنين طاهر .) كريم

رسالة مختبريا . Galleria mellonella (L.) ( Lepidoptera : Pyralidae ) الكبرى

ماجستير . كلية زراعة / جامعة بغداد .

( تأثير 2012، عماد احمد ؛ محمد ، حسام الدين عبدهللا ؛ النعيمي ، مروة ثامر عبد الستار .) محمود

ومبيد األكتلك في الدور Metarhizum anisopliae (Metchnikoff)Sorokin فطر

.Callosobruchus maculatus Fساعة لخنفساء اللوبيا الجنوبية 120و 24العذري بعمر

(Coleoptera:Bruchidae) ( . 3) 9. مجلة بغداد للعلوم . مجلد


143

المصادر األجنبية

Abd-Aziz , S.; Sin, T.L.; Alitheen,N. ; Shahab N. and Kamaruddin,K.

(2008). Microbial degradation of chitin materials by Trichoderma

virensUKM1. J. Biol. Sci., 8: 52-59.

Abdul Rauf ; Irfan,M. ; Nadeem,M. ; Ahmed,I. & Iqbal,H. (2010).

Optimization of Growth Conditions for Acidic Protease Production

from Rhizopus oligosporus through Solid State Fermentation of

Sunflower Meal. World Academy of Science , Engineering and

Technology. 72.

Abdul Sahib,R.A.(2009).Study of optimum condition for alkaline protease

production from local isolate of Aspirgillus niger .Iraqi Journal of

Science,Vol.50,No.4,pp.476-481

Abirami,V. ; Meenakshi,S. ; Kanthymathy,K. ; Bharathidasan,R.;

Mahalingam,R. & Panneerselvam,A. (2011). Partial Purification and

Characterization of an Extracellular Protease from Penicillium

janthinellum and Neurospora crassa. European Journal of

Experimental Biology.1(3):114-123.

Abu Sayem , S. M. , Alam , M. J. & Mozammel Hoq , Md. (2006) .Effect of

temperature ,Ph and metal ions on the activity and stability of alkaline

protease from novel Bacillus licheniformis MZK03 .Proc.Pakistan

Acad.Sci.43(4):257-262.

Abusham,R.A.;Rahman,R.N.Z.RA.;Salleh,A.B.(2009).Optimization

of physical factors affecting the production of thermo-stable organic

solvent –tolerant protease from anewly isolated halo tolerant Bacillus

subtilis strain Rand .Microbial cell Factories,8:20 .

Adams D.J. (2004). Fungal cell wall chitinases and glucanases. Microbiology ,

150: 2029–2035.

Adinarayana,K.;Ellaiah,P. and Prasad D.S.(2003).Purification and partial

characterization of Thermostable Serine Alkaline Protease from a newly

isolated Bacillus subtilis PE-11.AAPS PharmSciTech,4(4)ARTICLE 56.

Aehle, W. (2004) . Enzymes in industry. Wiley-VCH Verlag GmbH &

Co.KGaA,Weinheim.

Ahmed, I. ; Zia, M. & Iqpal, H. (2011). Purification and kinetic parameters

characterization of an alkaline protease produced from Bacillus subtilis

through submerged fermentation technique . World Applied Sciences

Journal. 12(6): 751-757.


144

Akujobi ,C. ; Odu, N. ; Okorondu,S. & Ike,G.(2012) . Production of protease

by Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus isolated from

abattoir environment . Journal of Research in Biology. Vol.2. No.2:077-

082 .

Aldridge, D. C. and Turner, W. B. (1969). Structures of Cytochalasin C and

Cytochalasin D from Metarhizium anisopliae. Journal of the Chemical

Society Section C Organic Chemistry, 923-928.

Al-Khateeb, A.A., (2008). Enhancing the growth of date palm (Phoenix

Dactylifera) in vitro tissue by adding date syrup to the culture medium.

Sci. J. King Faisal University (Basic Appl. Sci.) 19, 71–85.

Ali, S. ; Zhen , H.; Xiang, R.S.; Bashir, M.H. ; Afzal, M. and Long , T.(2009).

Production and extraction of extracellular lipase from entomopathogenic

fungus Metarhizium anisopliae (Clavicipitaceae: Hypocreales). Pakistan

Journal of zoology. Vo.41 No.5 pp.341-347.

Ali,S. ; Ren,S. ; Huang,Z. & Wu,J. (2010). Purification of enzymes related to

host penetration and pathogenesis from entomopathogenic fungi.Current

Research,Tecnology and Education Topics in Applied Microbiology and

microbial Biotechnology .

Ali,S. ; Huang,Z, ; Zang,W. & Ren,S. (2011) . Production and Regulation of

Extracellular Proteases from the Entomopathogenic Fungus Metarhizium

anisopliae (Cordycipitaceae; Hypocreales) in the Presence of Diamondback

Moth Cuticle. Pakistan J. Zool., vol. 43(6). pp. 1203-1213.

Ali, S. S.; Vidhale ,N.N.(2013) Protease Production by Fusarium

oxysporum in Solid- State Fermentation Using Rice Bran

. American Journal of Microbiological Research, Vol. 1, 3, 45-47.

Al-Juamily and H. Al-Zaidy, B.(2012)Optimization Conditions of

Production Fibrinolytic Enzyme from Bacillus lichniformis.

British Journal of Pharmacology and Toxicology 3(6): 289-295.

AL- Obaidi ,Z. S. ; Gh.M. Aziz ; Th. S. AL- Hakkak and M. A. AL- Hilli

.(1987) . Optimization of propagation medium for bakers yeast using date

extract and molasses . Date palm J.5(1) : 164-178 .

Almas, S.; Hameed, A.; Shelly, D.; Mohan, P. (2009). Purification and

characterization of a novel protease from Bacillus strain SAL1.

African Journal of Biotechnology, 8 (15): 3603-360 .


145

Alves, M. ; de Campos-Takaki, G. ; Okada, K. ; Pessoa, I. & Milanez,A.

(2005). Detection of extracellular protease in Mucor species. Rev

Iberoam Micol. 22:114-117.

Ambethgar,V.(2009). Potential of entomopathogenic fungi in insecticide

resistance management (IRM): A review. Journal of Biopesticides. 2(2):

177-193.

Amiri, B., Ibrahim, L. and Butt, T. M. (1999). Antifeedant properties of

destruxins and their potential use with the entomogenous fungus

Metarhizium anisopliae for improved control of crucifer pests. Biocontrol

Science and Technology 9, 487498.

Amiri-Besheli, B., Khambay, B., Cameron, S., Deadman, M. L. and Butt, T.

M. (2000). Inter- and intra-specific variation in destruxin production by

insect pathogenic Metarhizium spp., and its significance to pathogenesis.

Mycological Research 104, 447452.

Angel-Sahagun,C.A.; lezama-Gutierrez, R.; Molina-Ochoa, J.; Galindo-

Velasco, E.; Lopez-Edwards, M.; Rebolledo-Dominguez, O.; Cruz-

Vazquez, C; Reyes-Velazquez, W.P; Skoda,S.R, and Foster,J.E.

(2005).Susceptibility of biological stages of the hornfly,

Haematobia irritans, to entomopathogenic fungi (Hyphomycetes). J.

insec. Sci..33:1-8

Annamalai,N.; Rajeswari,M. ; Vijayalakshmi,S. & Balasubra-manian,T.(2011)

. Purification and characterization of chitinase from Alcaligenes faecalis

AU02 by utilizing marine wastes and its antioxidant activity. Annals of

Microbiology. 61(4): 801–807.

Arnold , J.W. (1952). The haemacytes of Mediterranean flour moth Ephestia

kuhniella Zell.(Lepid.Pyralididae) Can.J.Zool.30,352-64.

Ashiralieva, A., Genersch, E. (2006). Reclassification, genotypes and

virulence of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American

foulbrood in honeybees - a review, Apidologie 37, 411–420.


146

Ashur,S.A.;El-Shura, H.M.;Metwally ,M. and Habib,S.A.(1996).Fungal

fermentation of whey incorporated with certain supplements for the

production of protease .Micrbios.86(346):59-69.

Ayer, W.A and Pena-Rodriguez, L.M.(1987). Metabolites produced by

Alternaria brassicae , The black spoot pathogen of canola. Part1. The

phytotoxic components part2, sesquiter penoid metabolites .

J.Nat.prod.50,400-417.

Bakhiet, N., Stahly, D.P.(1985). Ultrastructure of sporulating Bacillus larvae

in a broth medium. Applied Environmental Microbiology 50, 690 – 92.

Balachander, M.;Remadevi, O.K.; Sasidharan, T.O and Bai, N.S.(2012).

Virulence and mycotoxic effects of Metarhizium anisopliae on Mahogany

shoot borer, Hypsipyla robusta (Lepidoptera:pyralidea). Journal of

Forestry Research.23(4):651-659.

Balaraman, K.; Bheemarao, N.S. and Rajagopalan ,P.K. (1979). Isolates of

Metarhizium anisopliae , Beauveria tenella and Fusarium oxysporum

(Deuteromycetes) and their pathogenicity to Culex fatigans and

Anopheles stephensi. Indian J.Med.70:718-722.

Barata, R. ; Andrade, M.; Rodrigues,R. & Castro, I. (2002). Purification and

characterization of an extracellular trypsina-like protease of Fusarium

oxysporum var. lini. Journal of Bioscience and Bioengineering. Vol. 94.

No. 4. pp. 304-308.

Barreh, A.J. (1977). Proteinases in mammalians cell and tissues. North

Holland publishing, company Amsterdam, New York, Oxford.

Benito, M.J.;Rodríguez, M.; Dez, F.l. N.; Asensio, M.A.;Dez,M. E. B. and

Co´rdoba, J. J.(2002) Purification and Characterization of an

Extracellular Protease from Penicillium chrysogenum Pg222

Active against Meat Proteins.American Society for Microbiology.

Vol. 68. 3532–3536.

Berry, D.R. (1975). The Environmental control of the physiology of

filamentous fungi. In the filamentous fungi. Vol. 1 (ed. by Smith, J.R.

& Berry, D.R) pp.16-32-Arnold.

Beys da Silva, W.O. ; S. Mitidieri; A. Schrank and M.H. Vainstein,

(2005). Production and extraction of an extracellular lipase from the

entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Process Biochem.,

40: 321-326.


147

Beys Da Silva ,W.O. ; Santi,L.; Schrank,A.; Vainstein,M.H.(2010).

Metarhizium anisopliae lipolytic activity plays a pivotal role in

Rhipicephalus (Boophilus) microplus infection fungal biology 114,10-15.

Bhagya,L. ; Gurvinder,K. & Padmini.P. (2010). Isolation and purification of

cuticle degrading extra cellular proteases from entomopathogenic fungal

species of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. International

Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technolgy.vol.1.Issue-3.

Bidochka, M. & Khachatourians, G.(1987). Purification and properties of an

extracellular protease produced by the entomopathogenic fungus

Beauveria bassiana. Applied and Environmental Microbiology. Vol.

53. No.7. p. 1679-1684.

Bidochka, M. & Khachatourians,G. (1988). N-Acetyl-d-Glucosamine –

Mediated Regulation of Extracellular Protease in the Entomo –

pathogenic fungus Beauveria bassiana .Appl. Environ. Microbiol.

Vol.54 No. 11. 2699-2704.

Bischoff , J.F., Rehner , S.A.and Humber,R.A.( 2009) A multilocus

phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia, v.101,

p.512-530.

Bisswanger, H.(2008). Enzyme kinetics.Principles and Methods. 2nd edition.

Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA,Weinheim.

Bitondi , M.M., Mora, I.M., Simose,Z.L.P. and Figueiredo, V.L.C. (1998).The

Apis mellifera pupal melanisation program is affected by treatment with

ajuvenile hormone analogue. Journal of Insect Science,3,34-38.

Bohlmann, J.T.; Cameselle,C. ; Nunez , M.J. and Lema, J.M. (1998) . Oxalic

acid production by Aspergillus niger. Part II: Optimisation of

fermentation with milk whey as carbon source. Bioprocess Eng., 19: 337-

342.

Bollhalder, F. (1999). Trichogramma for wax moth control. Amer. Bee J.

139(9): 711-712.

Boucias, D. G. and J. C. Pendland. (1998) . Principles of insect pathology.

Kluwer Academic Publishers. London. pp. 537.

Bradford, M. (1976) . A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of

Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye

Binding . Analytical Biochemistry , 72: 248-254 .

Braga, G.; Destéfano, R. & Messias,C. (1999) . Protease production during

growth and autolysis of submerged Metarhizium anisopliae cultures.

Revista de Microbiologia. 30 : 107-113.


148

Bruton,G.J.(1983).Large-scale purification of enzymes.Phil.Trans.R.Soc.

Lond.B 300,249-261.

Bukhari, T.; Middelman, A.; Koenraadt, C. J.M.; Takken, w. and Knols, B.G.

(2010). Factors affecting fungus induced larval mortality in Anopheles

gambiae and Anopheles stephensi. Malaria Journal.9:22.

Bull,A.T. and Bushnel,,M.E.(1976).Environmental control of fungal growth

.Inthe filamentous fungi.J.E.Smith and D.R.Berry eds.Vol.2:1-26.Edward

Arnold.London.

Burges, H. D. (1978). Control of wax moths : Physical, chemical and

biological methods. Bee World. 59: 129-138.

Burgess, R. R. (2008) . Protein Purification . in: Proteomics of the Nervous

System . Edited by Nothwang, H. G. & Pfeiffer, S. E. Wiley-VCH

Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim .

Calik.P.;Bilir,E.;Calic,G. and Özdamar ,T.H.(2002). Influence of pH condition

on metabolic regulation in serine alkaline protease production by Bacillus

licheniformis .Enzyme Microbial Technology .vol.31,no.5,pp.685-697 .

Campos, R.; Arruda, W.; Boldo, J.; da Silva, M.; de Barros, N.; de Azevado,

J.; Schrank, A. & Vainstein, M. (2005). Boophilus microplus Infection by

Beauveria amorpha and Beauveria bassiana: SEM Analysis and

Regulation of Subtilisin-like Proteases and Chitinases. Current

Microbiology.Vol. 50. pp. 257-261.

Cantwell, G. E. and Smith, L. J. (1970). Control of the greater wax moth

Galleria mellonella, in honeycomb and combhoney. Amer. Bee J. 110:

141.

Cantwell, G. E.; Jay, E. G.; Pearman Jr, G. C. and Thompson, J. V.

(1972). Control of the greater wax moth, Galleria mellonella ( L. ), in

comb honey with carbon dioxide. Part I. Laboratory studies. Amer. Bee J.

112: 302-303.

Cantwell, G. E.; Lehnert, T. and Travers, R. S. (1975). USDA research on

ethylene oxide fumigation for control of disease and pests of the honey

bee. Amer. Bee J. 115: 96-97.

Cantwell, G. E. and Lehnert, T. (1979). Microbial control of the greater wax

moth on stored comb. Amer. Bee J. 119: 200-201.

Carlile,M.J.;Watkinson,S.C. and Gooday,G.W.(2001) TheFungi

.AcademicPress, New York.pp:85-184.

Caron , D. M . ) 1992( . Wax moth . American . Bee . J .,132: 647-649.


149

Casida, L. E. Jr. (1968) . Industrial microbiology . John Wiley and Sons , Inc. ,

New York .

Chandrasekaran , M. and Sathiyabama, M.(2013) , Production , Partial

Purification and characterization of protease from a phytopathogenic

fungi Alternaria solani (E11. And Mart.) sorauer . Journal of Basic

Microbiology . Abstract .

Charnley, AK.( 2003). Fungal Pathogens of Insects: Cuticle Degrading

Enzymes and Toxins. Advances in Botanical Research.40: 241-321.

Charreire, J. D. and Imdorf, A . (1999) . Protection of honey combs

from wax moth damage. Amer. Bee J., 139: 627- 630.

Cherry ,A.J.; Abalo, P. ; Hell, K. (2005). A laboratory assessment of the

potential of different strains of the entomopathogenic fungi Beauveria

bassiana(Balsamo) Vuillemin and Metarhizium anisopliae

(Metschnikoff) to control Callosobruchus maculatus (F.) (Coleoptera:

Bruchidae) in stored cowpea. J. Stored Prod. Res., 41: 295-309.

Chutmanop, J.; Chuichulcherm, S.; Chisti, Y. & Srinophakun, P. (2008).

Protease production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation

using agroindustrial substrates. Journal of Chemical Technology and

Biotechnology. 83:1012–1018.

Clark, T.B.; Kellen, W.R.; Fukuda, T. and Lindegren, J.E. (1968). Field and

laboratory studies on the pathogenicity of the fungus Beauveria bassiana

to three genera of mosquitoes . J.Invert. Pathol.11(1):1-7.

Clarkson, J. M. (1996). Molecular biology of fungi for the control of insects.

In molecular biology of biological control of plants. Edited by

Gunasekaran, M. and Weber, D.J.© by CRC press, Inc.

Cloyd, R.A.(1999). The entomopathogenic fungus Metarhizum anisopliae

Midwest Biological control News.5(7).

Coggshall , W. L . and Morse , R. A .(1995). Bees wax . wiewas press .

193pp .

Colter, D. (1994). Those pesky wax moths. Amer. Bee J. 134(12): 824-826.


150

Cuervo-Parra1, J.A.; Ramírez-Suero1, M.; Sánchez-López, V. and Ramírez-

Lepe1,M. (2011) Antagonistic effect of Trichoderma harzianum

VSL291 on phytopathogenic fungi isolated from cocoa (Theobroma

cacao L.) fruits. African Journal of Biotechnology Vol. 10(52), pp.

10657-10663.

Dahiya,N. ; Tewari,R. & Hoondal,G. (2006). Biotechnological aspect of

chitinolytic enzymes: a review. Appi Microbial Biotechnol . 71:773-

782.

Dahot, M. (1994). Purification and some properties of alkaline protease from

Penicillium expansum. Journal of Islamic Academy of Sciences. 7:2.

100-105.

Dako, E., Bernier, A.; Dadie, A.T. and Jankowski, C. K.(2012). The

Problems Associated with Enzyme Purification.Chemical

Biology, 978-953.

Daoust, R.A. and Roberts, D.W. (1982). Virulence of natural and insect

passed strain of Metarhizium anisopliae to mosquito larvae. J . Invert.

Pathol.40:107-117.

Da Silva, J.C. ;Junior,J.P.D. and Marcondes,C.B.(1989).Selection of

Metarhizium anisopliae for extracellular enzyme production and

virulence toward Triatoma infestans .Brazil.J.Genetics, 12,1,1-17.

Davidson, R.; Gertler, A. and Hofmann ,T. (1975). "Aspergillus oryzae acid

proteinase. Purification and properties, and formation of pi-

chymotrypsin." Biochem. J. 147(1); 45-53. PMID: 239702

De Andrade, C.F. (1993). Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. : potential

to recycle in mosquito larvae. Boyce Thompson Institute at Cornell

University.

Deb, P.; Talukdar, S. A.; Mohsina, K.; Sarker, P. K. and Abu Sayem,

S.M.(2013). Production and partial characterization of extracellular

amylase enzyme from Bacillus amyloliquefaciens .SpringerPlus , 2:154.

De Man, J. M. (2007) . Principles of Food Chemistry . Third Edition .

Springer International Edition .

De Marco, J. & Felix, C. (2002) .Characterization of a protease produced by a

Trichoderma harzianum isolate which controls cocoa plant witches'

broom disease . BMC Biochemistry . 3: 3 .

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/239702




151

Devi,M. ; Banu,A. ; Gnanaprabhal,G. ; Pradeep,B. & Palaniswamy, M.(2008).

Purification , Characterization of alkaline protease enzyme from native

isolate Aspergillus niger and its compatibility with commercial

detergents. Indian Joyrnal of Science and Technology. Vol.1. No.7.

Devi,P. ; Raghavan,P. ; Vasudheven,I. ; Joshua,L. & VijayaKumar, M. (2011).

Purification and Characterization of Protease from Rhizopus

oligosporus. International Journal of Biological Technology. 2(2): 46-

49.

Dhar, P and Kaur , G.(2009) Effects of carbon and nitrogen sources on

the induction and repression of chitinase enzyme from Metarhizium

anisopiale isolates. Annals of Microbiology. Volume 59, Issue

pp.545-551.

Dhar, P and Kaur , G.(2010) Cuticle – Degrading protease produced by

Metarhizium anisopliae and their in Different Media .Indian J Microbiol

.50 (4) 449-455 .

Dias, B.; Neves, P.; Furlaneto-Maia, L. & Furlaneto,M. (2008). Cuticle –

degrading proteases produced by the entomo-pathogenic fungus

Beauveria bassiana in the presence of coffee berry borer cuticle.

Brazilian Journal of Microbiology. 39: 301-306.

Dienes, D. ; Börjesson, J. ; Hägglund, P. ; Tjerneld, F. ; Lidén, G. ; Réczey, K.

& Stålbrand, H. (2007). Identification of a trypsin-like serine protease

from Trichoderma reesei QM9414. Enzyme and Microbial Technology.

40: 1087-1094.

Djilali,B.;Bouziane ,A.;Ahmed,H.;Kada,I. and Nawal,O.(2012).Study of the

Behaviour of Lactbacillus Delbrueckii Subsp.Bulgaricus in Date Syrup in

Batch Fermentation with Controlled pH .J.Biotechnol Biomaterial.2

Do Nascimento,W. & Martins,M. (2004). Production and properties of an

extracellular protease from thermophilic Bacillus sp. Brazilian Journal of

Microbiology . 35:91-96.

Dumas, C.; Robert, P.; Pais , M.;Vey , A. and Quiot , J.M. (1995),

Insecticidal and cytotoxic effects of natural and hemisynthetic destruxins

. comp. Biochem. Physiol., 108,195-203.

Duo-Chuan, L. ; Shu, C. ; Jing, L.U. (2005). Purification and partial

characterization of two chitinases from the mycoparasitic fungus

Talaromyces flavus. Mycopathologia 159: 223–229.


152

Dutta, P. ; Dutta, J. & Tripathi, V. (2004) . Chitin and chitosan : chemistry,

properties and application . Journal of Scientific and Industrial Research

. 63: 20-31 .

Eaton, G.K. AND AYRES, M.P. (2002). Plasticity and constraint in growth

and protein mineralization of ectomycorrhizal fungi under simulated

nitrogen deposition. Mycologia, 94: 921-932.

Ebadi, R. (1975) . Wax of bee. Journal of Iranian Entomology. 10(4), 61-64.

Egorov , N. S. ;Loriya,Z.K.and Yudina, T.G.(1983) .Effect of protein on

exprotease synthesis in Bacillus thuringiesis.Microbiol. (USSR),52

(4):443-446.

Egorov , N. S. (1985) . Antibiotics ascientific approach . Mir publishers

Moscow .

Elad, Y. and Kapat, A. (1999) .The role of Trichoderma harzianum protease

in the biocontrol of Botrytis cinerea. European Journal of Pathology .

105: 177-189 .

Ellaiah,P. and Srinivasulu,D.(1996).Production of extracellular protease by

Streptomyces fradiae.Hind.Antibiot.Bull.,38:41-47.

Ellaiah,P.;Adinarayana,K.;Bhavani,Y.;Padmaja,P. and

Srinivasulu,B.(2002).Optimization of process parameters for

glucoamylase production under solid state fermentation by a newly

isolated Aspergillus species .Process Biochem,38:615-620.

El-Sinary, N. H. (2002). Influence of the entomopathogenic fungus

, Beauveria bassiana (Balsamo) on the mature larvae of the potato tuber

moth, Phthorimaea operculella (Zeller) under different degrees of

temperature and relative humidity. Mansoura University Journal of

Agricultural Sciences, 27, 4151–4161.

Engel,L.S.;Hill,J.M.;Caballero,A.R.;Green,L.C. and Callaghan,R.J. (1998).

Protease IV a unique extracellular protease and virulence factor from

Pseudomonas aeruginosa .J.Biol. Chem. .vol.273,no.27 ,pp.16792-16796 .

Erlacher, A. ; Sousa, F. ; Schroeder, M. ; Jus, S. ; Kokol, V. ; Cavaco-Paulo,

A. & Guebitz, G.(2006). A new cuticle scale hydrolysing protease from

Beauveria brongniartii. Biotechnol Lett. 28:703–710.


153

M.R. and Wraight, S.P.( 2007). Mycoinsecticides and Mycoacaricides:Faria,

A comprehensive list with worldwide coverage and international

256.-trol 43: 237classification of formulation types. Biol. Con

Femi- Ola , T.O and Bamidele , O.S.(2012) . Studies on the catalytic

properties of Partially Purified Alkaline protease from some selected

Microorganisms. Malaysian Journal of Microbiology . Vol.8(3) pp.191-

196.

Ferkovich ,S.M. ;Oberlander,H. and Leach, C.E.(1981).Chitin

synthesis in larval and pupal epidermis of the Indian meal moth,Plodia

interpunctella (Hubner), and the greater wax moth Galleria mellonela

(L.). Journal of insect Physiology ,27,509-514 .

Fernandes , E.G. ; Valério , H.M. ; Feltrin , T. and Sand , S.T.V.D.

(2012) . Variability in the production of extracellular enzymes by

entomopathogenic fungi grown on different substrates . Brazilian Journal

of microbiology : 827 – 833 . ISSN 1517 – 8382 .

Flint, H. M. and Merkel, J. R. (1983). Mating behavior, sex phermon

responses and radiation sterilization of the greater wax moth ( Lepidoptera

: Pyralidae ). J. Econ. Entomol. 76: 467-472.

Frankena,J.;Koningostein,VanVerseveld,H.and Stouthamer,A.(1986).Effect

of different limitations in chemostat cultures on growth and production of

exocellular protease by Bacillus licheniformis .Applied Microbiology and

Biotechnology .vol.24,no.2,pp.106-112 .

Freimoser , F.M. ; Hu , G. and St Leger , J. (2005) Variation in gene

expression patterns as the insect pathogen Metarhizium anisopliae adapts to

different host cuticles or nutrient deprivation in vitro . Microbiology , 151 ,

361 – 371 .

Fullbrook, P.D (1983). Practical limits and prospects. In: Industrial

Enzymology (eds. Godfrey, T. and Reichelt J.) p.41-110 nature Press.

Garraway, M .O. and Evans, R.C. (1984). Fungal nutrition and physiology.

John Wiley and sons. New York and Toronto.

Gaur, S.; Agrahari,S. and Wadhwa, N.(2010). Purification of Protease

from Pseudomonas thermaerum GW1 Isolated from Poultry

Waste Site The Open Microbiology Journal 4,64-74.


154

Gayathri, G.; Balasubramanian, C.; Moorthi, P.V. and Kubendran, T. (2010).

Larvicidal potential of Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin and

Paecilomyces fumosoroseus(Wize) Brown and smith on Culex

quinquefasciatus (Say). J.Biopesti.3(1):147-151.

Gearage ,S.;Raja,V. ;Krishna,M.R.V.;Subramanian,T.V.and

Jayaraman,K.(1995),Process Biochem,30,457-462.

Genersch, E., Forsgren, E., Pentikäinen, J., Ashiralieva, A., Rauch, S.,

Kilwinski, J., Fries, I. (2006). Reclassification of Paenibacillus larvae

subsp. pulvifaciens and Paenibacillus larvae subsp. Larvae as

Paenibacillus larvae without subspecies differentiation, Int. Journal of

Systematic and Evoloutionary Microbiology 56, 501–511.

Genckal,H. and Tari,C.(2006).Alkaline protease production from alkalophilic

Bacillus sp. Isolated from natural habitats .Enzyme Microbial Technology

.vol.39,no.4,pp.703-710 .

Genthner, F.J.; Chancy,C.A.;Couch,J.A.;Foss,S.S.;Middaugh,D.P. ;

George,S.E. ;Warren,M.A.;Bantle,J.A.(1998). Toxicity and Pathogenicity

Testing of the Insect Pest Control Fungus Metarhizium anisopliae

.Springer.V.35 ,Issue 2 ,pp317-324

Ghanbary, M.A.T., A. Asgharzadeh, A.R. Hadizadeh and M.M. Sharif,

(2009). A quick method for Metarhizium anisopliae isolation from

cultural soils. Am. J. Agric. Biol. Sci., 4: 152-155.

http://www.scipub.org/fulltext/AJAB/AJAB42152-155.pdf

Ghanem, K. ; AL-Fassi,F. & Farsi, R. (2011). Statistical optimization of

cultural condition for chitinase production from shrimp shellfish waste by

Alternaria alternata . African Journal of Microbiology Research. Vol.

5(13).pp.1649-1659.

Ghosh,P.K.;Saxena,R.K.;Gupta, R.;Yadav,R.P. and Davidson S.(1996)

.Microbial lipases: production and applications. Science progress,79(2)

:119-157 .

Goettel, M.S. and Inglis, D.(1997). Fungi: Hyphomycetes. In. : Lacey, L.(ed.)

Manual of Techniques in Insect Pathology. Academic Press. Sandiego.409

pp.


155

Goodman, R. D., Williams, P., Oldroyd, B. P., & Hoffman, J. (1990). Studies

on the use of phosphine for the control of greater wax moth, Galleria

mellonella in stored honeybee comb. American Bee Journal,130, 437–477.

Graham, L.S. & Sticklen M.B.( 1994).Plant chitinases. Can J Bot, 72: 1057

–1083.

Graham, M.J. (2003). The Hive and The Honey bee. Dadant and Sons, INC.

Hamilton. Illinois. USA. pp. 1324.

Graniti, A. (1972). The evolution of the toxin concept in plant pathology.

In'Phytotoxins in Plant Diseases' (R. K. S. Woods, A. Ballio and A.

Graniti, eds.), pp. 1-18. Academic Press, New York.

Griesch, J. and Vilcinskas, A. (1998). Proteases released by entomopathogenic

fungi impair phagocytic activity, attachment and spreading of

plasmatocytes isolated from haemolymph of the greater wax moth Galleria

mellonella. Biocontrol Science and Technology 8, 517-531.

Griesch, J., Wedde, M. and Vilcinskas, A. (2000). Recognition and regulation

of metalloproteinase activity in the haemolymph of Galleria meltoneIla: a

new pathway mediating induction of humoral immune responses. Insect

Biochemistry and Molecular Biology 30, 461472.

Gross, O.; Tijssen, P.; Weinberg, D. and Tal, J. (1990). Expression of

densonucleosis virus GmDNV in Galleria mellonella larvae : size analysis

and in vitro translation of viral transcription products. J. Invertebrate

pathology. 56(2): 175-180.

Gunduz, E. A. and Gulel, A. (2005). Investigation of fecundity and sex ratio

in the parasitoid Bracon hebetor Say ( Hymenoptera : Braconidae ) in

relation to parasitoid age. Turk J. Zool. 29 : 291-294.

Gupta, S.; Roberts, D.W. and Renwick, J.A.A. (1989). Preparative isolation of

destruxins from Metarhizium anisopliae by high- performance liquid –

chromatography. Journal of Liquid Chromatography.12 :383-395.

Gupta,S.,Krasnoff,S.B.,Renwick,J.A.A.,Roberts,D.W.,Steiner,J.R.and Clardy

,J.(1993a). Viridoxin-a and Viridoxin-b –Novel toxins from the fungus

Metarhizium flavoviride .Journal of Organic Chemistry 58,1062-1067.


156

Gupta,R. ; Beg,Q. ; Khan,S. & Chauhan,B.(2002). An overview on

fermentation, downstream processing and properties of microbial alkaline

proteases. Appi Microbial Biotechnol. 60: 381-395.

Haggag, W.; Kansoh, A. & Aly, A. (2006) . Proteases From Talaromyces

flavus and Trichoderma harzianum : Purification , Characterization and

Antifungal Activity Against Brown Spot Disease on Faba Bean. Plant

Pathology. Bulletin. 15: 231-239 .

Haq, I.-U. ; Mukhtar, H. ;Ali,Z. and Riaz, N. (2004). Protease Biosynthesis

by Mutant Strain of Penicillium griseoroseum and Cheese Formation .

Pakistan J. of Biological Sciences . 7. (9): pp. 1473-1476 .

Haq, I. and Mukhtar, H.(2005).Studies on the optimization of protease

production by Bacillus subtilis IH-16.Pak.J.Zool.,24:67-74.

Haq, I.-U.; Mukhtar, H. & Umber, H. (2006). Production of protease by

penicillium chrysogenum Through Optimization of Environmental

conditions.Journal of Agriculture & Social Sciences.Vol.2. No.1: 23-25.

Haq, I.-U. ; Mukhtar, H. & Umber, H. (2008). Fermentation Medium

Optimization For The Biosynthesis of Protease by Penicillium

chrysogenum in shake flasks. Pakistan J. Zool. Vol. 40. (2): pp. 69-73.

Haran, S. H. Schickler, A. Oppenheim and Chet I. (1995). Mycology

Research99:441-446.

Haritha, R. ; SivaKumar,K. ; Swathi,A. ; Mohan,Y. & Ramana,T. (2011) .

Characterization of marine Streptomyces carpaticus and optimization of

condition for production of extracellular protease. Microbiology Journal .

pp.1-13.

Hassan, F.; Shah, A.A.; and Hameed, A. (2006).Industrial application of

microbial lipases. Enzyme and Microbial Technology; 39(2), 235-251.

Hasan, S. ; Ahmed, A. ; Purwar ,A. ;Nausheen , K. ; Kundan , R. & Gupta, G.

(2013). Production of extracellular enzymes in the entomopathogenic

fungus Verticillium lecanii . Bioinformation 9(5):238-242 .

Hashimoto,H.;Kaneko,Y.;Iwaasa,T. and Yokotsuka,T.(1973).Production and

purification of acid protease from the thermophilic fungus ,Penicillium

duponti K1014.Applied Microbiology.Vol.25,No.4,pp:584-588.

Hattori, M. ; Isomura, S. ; Yokoyama, E. ; Ujita, M. & Hara,

A.(2005).Extracellular trypsin-like proteases produced by Cordyceps

militaris. Journal of Bioscience and Bioengineering. Vol. 100. Issue (6).

pp. 631–636.


157

Hegedus, D.D. and Khachatourians, G.G., (1988). Production of an

extracellular lipase by Beauveria bassiana. Biotechnol. Lett., 10: 637-

642.

Hesseltine ,C.W. (1972). Solid state fermentations. Biotechnol. Bioeng, 14:

517-532.

Hoe, P.K.; Bong, C.F.; Jugah, K. and Rajan, A. (2009). Evaluation of

Metarhizium anisopliae var anisopliae ( Deuteromycotina:

Hyphomycete) isolates and their effects on subterranean termite

Coptotermes curvignathus ( Isoptera: Rhinotermitidae) . Am. J. of

Agricul. And Biol. Sci. 4 (4) : 289-297.

Holme , D. & Peck,H. (1998). Analytical Biochemistry .third edition. Prentice

Hall.

Huang ,Q.; Peng, Y. and Li, X. (2003). Purification and

Characterization of an alkaline serine protease from dehairing

function from Bacillus pumilus. Curr Microbiol 46: 169-173.

Humber, R.A. (1997). Fungi : Identification. In Manual of Techniques in

Insect Pathology ( L.A.Lacey,ed.) , pp. 153-185. Academic Press :

London.

Hussain, A. and Mannan A., Zubair H., Mirza B. (2010). Purification and

Characterization of Alkaline Proteases from Aspergillus terreus, J. Chem.

Soc. Pak., Vol. 32.

Hussein, K.A.; Abdel-Rahman,M.A.A.; Abdel-Mallek, A.Y.; El-Maraghy, S.S.

and Joo, J.H.(2012). Pathogenicity of Beauveria bassiana and

Metarhizium anisopliae against Galleria mellonella.phytoparasitica

40:117-126 .

Huxham,I.M.;Lackie,A.M. and McCorkindale, N.J.(1989).Inhibitory effects

of cyclodepsipeptides,destruxins,from the fungus Metarhizium

anisopliae, on cellular immunity in insects. Journal of Insect Physiology

.Volume 35,Issue 2 , p:97-105.

Ire,F. ; Okolo,B. ; Moneke,A. & Odibo,F. (2011). Influence of cultivation

conditions on the production of a protease from Aspergillus carbonarius

using submerged fermentation.African Journal of Food Science. Vol.

5(6):pp. 353-365.


158

Irfan,M. ; Abdul Rauf, ; Syed,Q. ; Nadeem,M. & Baig,S. (2011). Exploitation

of Different Agro-residues for Acid protease Production by Rhizopus

sp.in Koji Fermentation. IJAVMS. Vol. 5. Issue 1:43-52.

Ito, E. ; Varéa-Pereira, G. ; Miyagui, D. ; Pinotti, M. and Neves, P. (2007).

Production of extracellular protease by a Brazilian strain of Beauveria

bassiana reactivated on coffee berry borer,Hypothenemus hampei.

Brazilian Archives of Biology and Technology.V.50. No.2. pp. 217-223.

Jafari, R. ; Goldasteh , S. and Afrogheh ,S.(2010) .Control of the

wax moth Galleria mellonella L. (Lepidoptera : pyralidae ) by the

Male sterile Technique (MST).Arch.Biol.Sci.Belgrade. , 62:309-

313 .

James, P. J., Kershaw, M. J., Reynolds, S. E. and Charnley, A. K. (1993).

Inhibition of desert locust (Schistocerca gregaria) malpighian tubule fluid

secretion by destruxins, cyclic peptide toxins from the insect pathogenic

fungus Metarhizium anisopliae. Journal of Insect Physiology 39, 797-804.

Jaswal,R.; Kocher,G. & Virk,M. (2008).Production of alkaline protease by

Bacillus circulans using agricultural residues:A statistical approach. Indian

Journal of Biotechnology.Vol.7. pp. 356-360.

Jegorov, A.; Matha, V.; Sedmera, P. and Roberts, D.W.(1989). Destruxin

from Metarhizium anisopliae . In proceding of the International

conference on Biopesticides , Theory and practice(Ed. By A.Jegorov and

V.Matha). 64-70 pp.

Jegorov, A.; Sedmera, P.; Havlicek, V. and Matha, V. (1998). Destruxins

Ed(1) acyclopeptide from the fungus Metarhizium anisopliae.

Phytochemistry . 49:1815-1817.

Jonson, J.C. and Ryden, L. (1998). Protein purification principles,

highresolution methods, and application, 2nd ed. John Wiley& Sons .Inc,

pp.695.

Jonason,N.B;Boetel,M.A.;Eide,J.D.;Campbell,L.G.and Rao,M.B.(2005).

Virulence of Metarhizium anisopliae(Deuteromcotina:Hyphomycetes)

to sugarbeet root maggot (Diptera: Ulidiidae)larvae.J.Sugar Beet

Research, 42 (3-4):103 –117


159

Kaaya, G.P. (1989). Glossina morsitans morsitans: mortalities caused in

adults by experimental infection with entomopathogenic fungi . Acta

tropica. 46: 107-114.

Kaaya, G.P.; Seshu-Reddy, K.V.; Kokwaro, E.D. and Munyinyi, D.M.

(1993). Pathogenicity of Beauveria bassiana , Metarhizium anisopliae and

Serratia marcescens to the banana weevil Cosmopolites sordidus .

Internati. centre of insect physiol. and ecol. 3:177-187.

Kaaya, G.P. and Hassan, S. (2000). Entomogenous fungi as promising

biopesticides for teck control . Exp. Appl. Acarol.24:913-926.

Kaijiang, L. and Roberts, D.W.(1986) The production of destruxins by the

entomogenous fungus, Metarhizium anisopliae var.major. J. Invert.

Pathol.,47,120-22.

Kamoun ,S.A.; Haddar, A. and El-Hadj, A.N.( 2008) .Stability of

thermostable alkaline protease from Bacillus licheniformis RP1

in commercial solid laundry detergent formulations. Microbiol

Res 3: 299-306 .

Kang, S. ; Park, S. & Lee, D. (1999) . Purification and Characterization of a

Novel Chitinase from the Entomopathogenic Fungus, Metarhizium

anisopliae . Journal of Invertebrate Pathology. 73: 276-281.

Karlsson, E. Ryden, L. and Brewer, J. (1998) . Ion exchange chromatograph .

In : Introduction To Protein Purification (ed. Wiley . Liss) A John Wiley

and Sons , INC . Publication . (Cited from Mukran ,2003) .

Kathiresan, K. and Manivannan, S.(2006) .Amylase production by

Penicillium fellutanum isolated from mangrove rhizosphere soil. African

Journal of Biotechnology Vol. 5 (10), 829-832.

Kaur, M.; Dhillon, S.; Chaudhary, K.; and Singh, R. (1998). Production,

purification and characterization of a thermostable alkaline protease from

Bacillus polymyxa. Indian J. Microbiol. 38: 63-67.

Kershaw, M. J., Moorhouse, E. R., Bateman, R., Reynolds, S. E. and

Charnley, A. K. (1999). The role of destruxins in the pathogenicity of

Metarhizium anisopliae for three species of insect. Journal of Invertebrate

Pathology 74, 213-223.


160

Khan,S. ; Guo,L. ; Maimaiti,Y. ; Mijit,M. & Qiu,D. (2012a).

Entomopathogenic fungi as microbial biocontrol agent . Molecular Plant

Breeding . Vol.3. No.7 .

Khan, S.;Guo, L.;Shi,H.,Mijit, M. and Qiu, D.(2012b) Bioassay and enzymatic

comparison of six entomopathogenic fungal isolates for virulence or

toxicity against green peach aphids myzus persicae. African Journal of

Biotechnology Vol.11(77) pp.14193-14203.

Khetan, S.K. (2001). Microbial pest control ,1st edition.Marcel Dekker.

Khiyami, M.;Aboseide ,B. and Pometto , A.(2008).Influence of complex

nutrient sources:Dates syrup and dates pits on Lactocooous lactis growth

and nisin production.J.Biotechnol.136:717-742.

Kim,J. (2003). Preliminary Characterization of Keratinolytic Enzyme of

Aspergillus flavus K-03 and Its Potential in Biodegradation of Keratin

Wastes. Mycobiology. 31(4): 209-213.

Klingen, I.; Meadow, R. and Aandal, T. (2002). Mortality of Delia floralis,

Galleria mellonella and Mamestra brassicae treated with insect

pathogenic hyphomycetous fungi. J. Appl. Entomol. 126(5): 231-237.

Kodaria, Y. (1961).Biochemical studies on the muscardine fungi in the silk

worms, Bombyx mori L. Journal of faculty Textile Technology . Sinshu

University.5:1-68.

Kole,M.M.,Draper,I.andGerson,D.F.(1998).J.Chem.Technol.Biotechnol.41,197

-206.

Kornberg, A. (1990). Why purify enzymes. "In Method In Enzymology" Vol,

182(edited by Deutscher, M.P.) 1-5, Academic press. New York.

Krishna,V. ; Gupta,M. ; Gupta,N. ; Gaudani,H. ; Trivedi,S. ; Patil, P. ;Gupta,

G. ; Khairnar,Y. ; Borasate,A. & Mishra,D. (2009). Optimization of

growth and production of protease by Penicillium species using submerged

fermentation. International Journal of Microbiology Research. Vol.1.

Issue.1. pp.14-18.

Kucera,M.(1981).The production of toxic protease by the entomopathogenic

fungus Metarhizium anisopliae in submerged culture .Journal of

Invertebrate Pathology .Vol.38.(1), pp:33-38.


161

Kumar ,C.G. ;Tiwari, M.P. and Jany, K.D. (1999).Novel alkaline

serineproteases from alkalophilic Bacillus spp.: purifi cation and

some properties. Process Biochemistry 34: 441-449.

Kumar,C. & Takagi,H. (1999).Microbial alkaline proteases: from a

bioindustrial viewpoint.Biotechnology Advances. 17.561-594.

Lacey, C.M.; Lacey, L.A. and Roberts , D.W. (1988). Route of invasion and

histopathology of Metarhizium anisopliae in Culex quinquefasciatus

.J.Invert.Pathol.52:108-118.

Lacey, L.A. (1997). Manual of techniques in insect pathology (Biological

Techniques) . Academic Press. Sadiego.London.Boston.408pp.

Lalor, J.H.; Chinuici, J.P. and Liewellyn, G.C.(1976). Effect of fungal

metabolite , alfatoxin B1 on larval viability and gross morphology in

Drosophila melanogaster in press. J. Microbiol. 17: 210-215.

Lambert, K. (2003) . Field trials using the fungal pathogen , Metarhizium

anisopliae (Deuteromycetes: Hyphomycetes) to control the ectoparasitic

mite, Varroa destructor (Acari:Varroidae) in honey bee colonies. J.

Econ.Entomol.96(4):1091-1099.

Larcher ,G.;Cimon,B.;Symoens,F.Trongchin,G.;Chabase,D. and Bouchara,J.

(1996).A 33 Kda serine proteinase from Scedosporium apiospermum

.Biochem.J.315:11a-126.

Lavine, M.D and M.R. Strand .(2002). Insect hemocytes and their role in

immunity, Insect Biochem. Mol. Biol. 32(10): 295-309.

Lehmacher, A. and Bisswanger, H. (1990). Isolation and characterization of

an extremely thermostable D- glucose / xylose isomerase from Thermus

aquaticus HB8. J. Gen. Microbiol. 136: 679-686.

Leles, R.N.; Sousa, N.; Rocha, L.F.; Santos, A.H.; Silva, H.H.G. and Luz, C.

(2010) . Pathogenicity of some hypocrealean fungi to adult Aedes aegypti

(Diptera:culicidae) Parasitol.Res.107:1271-1274.

Liang,T. ; Lin,J. ; Yen,Y. ; Wang,C. & Wang,S.(2006).Purification and

characterization of a protease extracellularly produced by Monascus

purpureus CCRC31499 in a shrimp and crab shell powder medium.

Enzyme and Microbial Technology.Vol. 38. Issues. 1-2. pp.74-80.


162

Lineweaver, H. & Burk, D. (1934) . The determination of enzyme dissociation

constants . J. Am. Chem. Soc. , 56: 658-666 .

- Liu , B-L. ; Chen , J-W. and Tzeng ; Y.M. (2000) . Production of

cyclodepsipeptides Destruxin A and B from Metarhizium anisopliae .

Biotechnol . Prog. 16 , 993 – 999 .

Liu, B-L.;Rou, T-M.; Rao, Y.K. and Tzeng, Y,-M.(2007). Effect of PH

and Aeration on the production of Destruxins A and B from Metarhizium

anisopliae. International Journal of Applied science and Engineering , 5

,1:17-26.

Liu, B-L. and Tzeng.(2012) . Development and applications of

destruxins : A review . Biotechnology advances. Volume 30, Issue 6,

pages 1242-1254.

Lord, J.C. and Fukuda, T. (1990). Aleptolegnia (Saprolegniales) pathogenic

for mosquito larvae. J. Invert. Pathol.55:130-132.

Madelin,M.F.(1963).Diseases caused by Hyphomycetous fungi .pp.233-271.in

E.A.Steinhaus [ed.].Insect pathology.An Advanced

Treatise.Vol.2.Academic Press,New York.

Mahdneshin,Z.;Vojoudi.S.;Ghosta,Y.;Safaralizadae,M.H. and Saber,

M.(2011).Laboratory evaluation of the entomopathogenic fungi, Iranian

isolates of Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin and Metarhizium

anisopliae (Metch) Sorokin against the control of the cowpea weevil,

Callosobruchus maculatus F. (Coleoptera:Bruchidae) .African Journal of

Microbiology Research .Vol.5 (29),pp.5215-5220.

Mahmoud, M.F.( 2009). Pathogenicity of three commercial products of

entomopathogenic fungi ,Beauveria bassiana , Metarhizium anisopliae and

Lecanicillium lecanii against adults of olive fly , Bactrocera oleae

(Gmelin) (Diptera: Tephritidae) in the laboratory . Plant Protect.

Sci.45(3):98-102.

Maniania, N.K. and Odulaja, A. (1998) .Effect of species ,age and sex of

tsetse on response to infection by Metarhizium anisopliae

.Biocontrol.43:311-323.

Marzluf,G.(1997).Genetic regulation of nitrogen metabolism in the

fungi.Microbiol.Mol.Biol.Rev.61(1):17-32.


163

Matsumoto,K.S.(2006) .Fungal chitinases. Research Signpost. 289-304 ISBN:

81-7736-269-0

McCoy, C. W., Samson, R. A., and D.G. Boucias (1988). Entomogenous

fungi. In Handbook of Natural Pesticides, Boca, Raton, Fla: Mr ic Press.

Vol. 5, Microbial Insecticides, Part A, Entomogenous Protozoa and Fungi,

C. M. Ignoffo and N. B. Mandava, eds.

McCoy, C. & Tigano-Milani, M. (1992). Use of entomo - pathagenic fungi in

biological control : A world view . Pesq. Agropec. Bras. Brasflia.27: 87-

93.

Mehta ,J. ; Jakhetia, M. ; Choudhary, S. ; Mirza, J. ; Sharma, D. ; Khatri, P.;

Gupta , P. and Nair , M. M.(2012). Impact of Carbon & Nitrogen Sources

on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana

(entomopathogenic fungi) European Journal of Experimental Biology, 2

(6):2061-2067.

Merheb-Dini, C. ; Cabral, H. ; Leite, R.; Zanphorlin, L. ; Okamoto, D.;

Rodriguez, G.; Juliano, L. ; Arantes, E.; Gomes, E. & Da-Silva, R. (2009).

Biochemical and functional characterization of a metalloprotease from the

thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus. Journal Agricultural and

Food Chemisty. 57(19): 9210-9217.

Miller ,G .I. (1959) . Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of

reducing sugar . Anal. Chem. , 3r . 426-428 .

Mishra , S. ; Kumar , P. and Malik , A. (2013) Effect of process parameters on

the enzyme activity of anovel Beauveria bassiana isolate . International

journal of current microbiology and Applied sciences . V.2 , N.9 , PP.49 –

56 .

Mnyone, L.L.; Russell,T.L.; Lyimo, I.N.; Lwetoijera, D.W.; Kirby, M.J. and

Luzm, C. (2009). First report of Metarhizium anisopliae IP46

pathogenicity in adult Anopheles gambiae S.S and An. Arabiensis(

Diptera: culicidae) . Parasites and Vectors.1-4.

Mohanty, S.S. ; Raghavendra, K.; Rai, U and Dash, A.P. (2008a). Efficacy of

female Culex quinquefasciatus with entomopathogenic fungus Fusarium

pallidoroseum. Parasitol. Res.103:171-174.

Mohanty, S.S. ; Raghavendra, K. and Dash, A.P. (2008b).Induction of

chymoelastase(Pr1) of Metarhizum anisopliae and its role in causing

mortality to mosquito larvae .World J Microbiol Biotechnol 24:2283-2288


164

Molnάr, I. ; Gibsonc, D. M. and Krasnoffc, S. B.(2010). Secondary

metabolites from entomopathogenic Hypocrealean fungi. Nat. Prod. Rep.,

vol. 27,no.9,pp: 1252 .

Moosavi-Nasab,M. and Yousefi ,A. (2011) .Biotechnological production of

cellulose by Gluconacetobacter xylinus from agricultural waste .Iranian

Journal of Biotechnology .Vol.9,No.2 ,pp:94-101.

Morse, R.A. (1978) .Honey bee pests,predators and diseases. Cornell

Unversity Press.

Morse, R.A. and K. Flottum. (1997). Honey bee pests, predators and

disease. 3rd edition. the. A. I. Root company. USA. pp. 718.

Mracek, Z.; Becvar, S.; Rezac, P.; Kindlmann, P. and Webster, J. M. (1997).

Canadian steinernematid ( Nematoda ) isolates and their infectivity , under

cold condition, to greater wax moth ( Galleria mellonella ) larvae.

Biological control. 8(2): 160-164.

Muller-Kogler ,E. and Stein, W.(1976)Gewachshausversuche mit metarhizium

anisopliae(Metsch)Sorok.zur infektion von Sitona lirmatus L. im

Boden.Pflanzenschutzberichte,83,96-108.

Murray,R. ; Granner,D. ; Mayes,P. & Rodwell,V. (2003). Harper‘s Illustrated

Biochemistry. Twenty-sixth edition . Mc Graw-Hill companies , Inc.USA.

Muthulakshmi, C.; Gomathi, D.; Kumar, D.; Ravikumar, G. ; Kalaiselvi, M.

and Uma, C.(2011). Production ,purification and characterization of

protease by Aspergillus flavus under solid state fermentation . Jordan

Journal of Biological Sciences. Vol.4. No. 3. pp.137-148.

Murthy,P. & Naidu,M. (2010). Protease production by Aspergillus oryzae in

solid-state fermentation Utilizing Coffee By-Products. World Applied

Sciences Journal. 8(2):199-205.

Nadia , N.; Nehad , Z.A.; Elsayed , A.E.; Essam , M.A. and Hanan

M.A.(2010). Optimization of lipase synthesis by Mucor racemosus-

production in atriple impeller bioreactor . Malaysian Journal of

Microbiology 6(1) :7-15.

Naidu,K.S.( 2011 ).Characterization and Purification of Protease enzyme.

Journal of Applied Pharmaceutical Science 01(03):107-112.


165

Namasivayam,S.; Sivasubramanian,S. & Kumar,G. (2010). Influence of

media on protease production by Beauveria bassiana (Bals.) Vuil. and

stability towards commercially available detergents, surfactants and

enzyme inhibitors. International Journal of Biological Technology .1(1)

:78-83.

Negi,S. and Banerjee,R.(2010).Optimization of culture parameters to enhance

production of amylase and protease from Aspergillus awamori in a single

fermentation .African Journal of Biochemistry Research, 4(3):73-80.

Nigam, P. (1990). Investigation of some factors important for SSF of bagasse

for animal feed production. J.Microb. Technol .12:808-811.

[cited from mohmmad Sae'ed ,(1996)].(in Arabic)

Nirmal,N.; Shankar,S. & Laxman,R. (2011). Fungal proteases :An

Overview. Int. J. Biotech & Biosci. Vol. 1(1): pp.1-40 .

Nunes,A.; Martins,J. ; Furlaneto,M. & Barros,N. (2010). Production of cuticle-

degrading proteases by Nomuraea rileyi and its virulence against

Anticarsia gemmatalis . Ciência Rural. Santa Maria. Vol.40. No.9. pp.

1853-1859.

Onofre,S.B.;Gonzalez,R.R.;Messias,C.L.;Azevedo,J.L. and de Barros,N.M.

(2002).LC50 of the Peptide Produced by the Entomopathogenic Fungus

Nomuraea rileyi (Farlow)Samson Active Against Third Instar Larvae of

Anticarsia gemmatalis (Lep.:Noctuidae) .Brazilian Archves of Biology and

Technology.Vol.45,n.3:pp.269-275.

Paliwal N., Singh S.P. and Garg S.K. (1994). Cation induced thermal

Stability of an alkaline protease from a Bacillus sp. Bioresour Technol

50:209-211.

Palsaniya, P.; Mishra, R.;Beejawat,N.; Sethi, S. and Gupta, B. L.(2012).

Optimization of alkaline protease production from Bacteria isolated

from soil. Journal of Microbiology and Biotechnology Research,2

(6):858-865.

Pandit, N.P. and Maheshwari ,S.K. (2012) Optimization of Cellulase

Enzyme Production from Sugarcane Pressmud Using Oyster

Mushroom - Pleurotus Sajor-Caju by Solid State Fermentation. J

Bioremed Biodegrad 3:140. doi:10.4172/2155-6199.


166

Park,S. ; Lee,J. & Lee,H. (2000) . Purification and characterization of

chitinase from a marine bacterium, Vibrio sp.98CJ11027. The Journal of

Microbiology. 38(4) : 224-229.

Paterson,I.C. ;Charnley,A.K.; Cooper,R,M. and Clarkson,M.(1994).Specific

induction of a cuticle-degrading protease of the insect pathogenic fungus

Metarhizium anisopliae .Microbiology,140,pp:185-189.

Patil,U. and Chaudhari, A.(2013). Production of Alkaline Protease by

Solvent-Tolerant Alkaliphilic Bacillus circulans MTCC 7942 Isolated

from Hydrocarbon Contaminated Habitat: Process Parameters

Optimization .Indian Journal of Biotechnology .

Pedras, M.S.C., Zaharia , L.I and Ward , D.E.(2002) The destruxins : synthesis

, biosynthesis biotransformation and biological activity. Phytochemistry ,

59:579-596. DOI: 10.1016/500 31-9422(02) 00016-x.

Peek,K. ;Daniel,R.M.; Monk,C.;Parker,L. and Coolbear ,T.(1992).Purification

and characterization of athermostable proteinase isolated from Thermus

sp.strain Rt 41 A . European Journal of Biochemistry.Vol.207.NO.3 .PP.

1035-1044.

Poprawski, T. J., Robert, P. H. and Maniania, N. K. (1994). Contact activity of

the mycotoxin destruxin E to Empoasca vitis. Journal of Applied

Entomology117, 135 -143.

Powell,J.A. and Opler, P.A.(2009).Moths of western north America.University

of Calfornia press, pl.24-51,p.186.

Prakash,G.V.S.B. and Padmaja,V.(2012).Substrate effects and abiotic factors

influencing protease enzyme production in the entomopathogenic fungus

Metarhizium anisopliae .African J.of Biotechnology.Issn 1684-5315.

Prosser, J.I. and A.J. Tough, (1991). Growth mechanisms and growth Kinetics

of filamentous microorganisms. Crit. Rev. Biotechnol., 10: 253-274.

Quesada-Moraga, E., Ruiz-García, A., & Santiago-Álvarez, C. (2006).

Laboratory evaluation of entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and

Metarhizium anisopliae against puparia and adults of Ceratitis capitata

(Diptera: Tephritidae). Journal of Economic Entomology, 99, 1955–1966.

Quiot, J. M., Vey, A., Vago, C. and Pais, M. (1980). Anti-viral activity of a

mycotoxin- study of the toxin of the hyphomycete Metarhizium anisopliae

(Metsch) Sorok in lepidoptera celt-culture. Comptes Rendus

Hebdomadaires Des Seances De L Academie Des Sciences Serie D

291,763 766.


167

Quiot, J. M., Vey, A. and Vago, C. (1985). Effects of mycotoxins on

invertebrate cells In vitro. Advances in Cell Research 4, 203-212.

Qureshi,A. ; Bhutto,M. ; Khushk,I. & Dahot,M. (2011). Optimization of

cultural conditions for protease production by Bacillus subtilis EFRL 01.

African Journal of Biotechnology. Vol. 10(26). pp. 5173-5181.

Rahman, R.N.A.; Geok. L.P.; Basri. M. and Saleh. A.B, (2005).Physical

Factors Affecting the Production of Organic Solvent-tolerant Protease by

Pseudomonas aeruginosa strain k. Bioresource technology (96) :429-436.

Raju, K.; Jaya, R. and Ayyanna, C. (1994). Hydrolysis of casein by Bajara

protease importance. Biotechnol. Coming Decadea, 181: 55–70

Ramon, A.M.;Porta,A. and Fonzi, W.A.(1999).Effect of environmental Ph on

morphological development of Candida albicans is mediated via the pac

C-related transcription factor encoded by PRR2.J.Bacteriol.181(24):7524-

7530.

Rani, M. R., Prasad, N. N. and Sambasivarao ,K.R.S. (2012).

Optimization of cultural conditions for the production of alkaline

protease from a mutant Aspergillus flavus AS2. Asian J. Exp. Biol.

Sci. vol,3(3): 565-576.

Rao,M.; Tanksale,A.; Ghatge,M. and Deshpande, V. (1998). Molecular and

Biotechnological Aspects of Microbial Proteases . Microbiol. Mol. Biol.

Rev. 62(3):597-635.

Rao, Y. ; Lu, S. ; Liu, B. and Tzeng, Y. (2006). Enhanced production of an

extracellular protease from Beauveria bassiana by optimization of

cultivation processes. Biochemical Engineering Journal. Vol. 28.

Issue(1). pp. 57–66.

Ravallec, M.; Riba, G. and Vey, A. (1989). Sensibilite d’Aedes albopictus

(Diptera:Culicidae) a I’hyphomycete entomopathogen Metarhizium

anisopliae . Entomophaga.34:209-217.

Rath,A.C.;Worledge,D.;Anderson,C. and Carr,C.J.(1995). Virulence of the

Entomogenous Fungi Metarhizium anisopliae(Metschnikoff) Sorokin, M.

flavoviride Gams and Rozsypal and Beauveria bassiana (Ballsamo)

Vuillemin to Adoryphorus couloni (Burmeister) (Coleoptera:

Scarabaeidae). J . Aust. ent. Soc., 34: 181-186


168

Ravikumar,G.; Gomathi,D.; Kalaiselvi,M. & Uma ,C.(2012). A

protease from the medicinal mushroom Pleurotus sajor-caju;

production, purification and partial characterization. Asian Pacific

Journal of Tropical Biomedicine. 1- 6.

Raw, G. R. (1954). Enemies of bees. Bee World. 35: 159-160.

Reddy ,L.V.A. ; Wee, Y.J.and Ryu, H.W. (2008). Purification and

Characterization of an organic solvent and detergent-tolerant

novel protease produced by Bacillus sp. RKY3. J Chem Technol

Biotechnol 83: 1526-1533.

Reddy, M.; Kumar,C.; Swathi,K. ; Nagamani,B.; Venkateshwar, S. & Rao, L.

(2011). Extracellular alkaline protease production from isolated Bacillus

subtilis SVR -70 by using submerged fermentation . International Journal

of Pharma . Research & Development. Vol.3. pp.216-220.

Reed, G. (1975). Oxidoreductase, in ((Enzyme in Food Processing))

P. (176-196) Academic Press.

Rhodes, A. and Fletcher, D. L. (1966) . Principles of industrial microbiology .

1st ed. Pergamon Press , Oxford .

Rifaat, H.M.;Hassanein, S.M.; El-Said,O.H.;Saleh, S.A. and Selim, M. S.

M.(2005) Purification and characterisation of extracellular

neutral protease from Streptomyces microflavus. Arab J.

Biotech., Vol. 9, No. (1) Jan. (2006): 51-60.

Roberts, D. W. (1966a). Toxins from the entomogenous fungus

Metarhizium anisopliae 1. Production in submerged and surface

cultures, and in inorganic and organic nitrogen media. Journal of"

Invertebrate Pathology8, 212 221.

Roberts, D. W. (1966b). Toxins from the entomogenous fungus

Metarhizium anisopliae II. symptoms and detection in moribund

hosts. Journal of Invertebrate Pathology 8, 222 - 227.

Roberts, D.W. (1970).Coelomomyces, Entomophthora, Beauveria, and

Metarhizium as parasites of mosquitoes. Miscellaneous

publications of the Entomological Society of America.7:140-155.

Roberts, D. W. (1980). Toxins of entomopathogenic fungi. In 'Microbial

Control of Insects, Mites and Plant Diseases' (H. D. Burges, ed.), pp.

441-463. Academic Press, New York.


169

Roberts, D. (1989). World picture of biological control of insects by fungi

.Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro. Vol. 84. Supl.III. 89-100.

Roberts, D. W. & St.Leger, R. J. S. (2004). Metarhizium spp., cosmopolitan

insect-pathogenic fungi: mycological aspects. Adv Appl Microbiol 54:

1–70.

Romero, F.; Garcia L.A.;and Diaz, M. ;(1998). Protease production from

whey at high concentration by Serratia marcescens. Resour.

Environ. Biotechnol., 2: 93–115. Cited from Muthulakshmi et. al.

(2011).

Rustiguel, C.B; Jorge , J,A. and Guimarães, L.H.S.(2012). Optimization of the

chitinase production by different Metarhizium anisopliae strains under

solid – state Fermentation with silkworm chrysalis as substrate using

CCRD. Advances in Microbiology,2,268-276.

Samarntarn, W.; Cheevadhanarak, S. and Tanticharoen, M. (1999).

Production of alkaline protease by a genetically engineered Aspergillus

oryzae U1521. J. Gen. App. Microbiol. 45: 99-103.

Samson, R. A., Evans, H. C., and Latg, J.P. (1988). Atlas of entomopathogenic

fungi. Springer, Berlin Heidelberg New York.

Samuels, R. I., Charnley, A. K. and Reynolds, S. E. (1988a). Application of

reversed-phase hplc in separation and detection of the cyclodepsipeptide

toxins produced by the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae.

Journal of Chromatographic Science 26, 15-19.

Samuels, R. I., Charnley, A. K. and Reynolds, S. E. (1988b). The role of

destruxins in the pathogenicity of 3 strains of Metarhizium anisopliae for

the tobacco hornworm Manduca sexta. Mycopathologia 104, 51-58.

Samuels, R. I., Reynolds, S. E. and Charnley, A. K. (1988c). Calcium-channel

activation of insect muscle by destruxins, insecticidal compounds

produced by the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae.

Comparative Biochemistry and Physiology C-Pharmacology Toxicology &

Endocrinology90, 403-412.

Samuels, K. D. Z., Pinnock, D. E. & Allsopp, P. G. (1989). The potential

of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin(Deutermycotina:

Hyphomycetes) as a biological control-agent of Inopus rubriceps

(Macquart) (Diptera, Stratiomyidae). J. Aust. Entomol. Soc. 28, 69–74.


170

Sandhu, S.S.; Rajak, R.C. and Sharma, M. (1993). Bioactivity of Beauveria

bassiana and Metarhizium anisopliae as pathogens of Culex

tritaeniorhynchus and Aedes aegypti : Effect of instar, dosages and time.

Indian Journal of microbiol.33:191-197.

Sandhya, C. ; Adapa, L. K. ; Nampoothiri, K. M. ; Binod, P. ; Szakacs, G. ;

Pandy, A. (2004) . Extracellular chitinase production by Trichoderma

harzianum in submerged fermentation . J. Basic Microbiol. , 44(1): 49-58

Santos, A.H.; Tai, M.H.; Rocha, L.F.; Silva, H.H.G. and Luz,

C.(2009).Dependence of Metarhizium anisopliae on high humidity for

ovicidal activity on Aedes aegypti.Bio control.1:37-42.

Saravanakumar,K.;Thiyagarajan,A.andKaviyarasan,V.(2010).Optimization of

medium constituents for the production of extracellular alkaline protease

by Aspergillus fiscberi using response surface experimental

design.J.Biosci.Res.,Vol.1(3):118-129.

Saurabh, S.; Jasmine, I.; Pritesh, G. & Kumar, R. (2007). Enhanced

productivity of serine alkaline protease by Bacillus sp. Using soybean as

substrate. Malaysian Journal of Microbiology . Vol.3(1). pp.1 – 6.

Saxena,R.K.;Sheoran, A.;Giri,B.and Davidson,W.S.(2003). Purification

strategies for microbial lipases. (Review). Journal of Microbiological

Methods 52 , 1 – 18.

Scholte, E.J.; Njiru, B.N.; Smaliegange, R.C.; Takken, W. and Knols, B.G.J.

(2003a). Infection of malaria( Anopheles gambiae S.S) and filariasis(

Culex quinquefasciatus) vectors with the entomopathogenic fungus

Metarhizium anisopliae . Malaria Journal.2:1-10.

Scholte, E.J.; Takken, W. and Knols, B.G.J. (2003b). Pathogenicity of five

East African entomopathogenic fungi to adult Anopheles gambiae S.S (

Diptera: Culicidae) mosquitoes.Netherlands Entomological Society.14:25-

29.

Scholte, E.J.; Knols, B.G.J.; Samson, R.A. and Takken , W. (2004).

Entomopathogenic fungi for mosquito control : areview.J. of Insect

Sci.4:24pp.

Scholte, E.J.; Takken, W. and Knols, B.G.J. (2007). Infection of adults Aedes

aegypti and Ae. Albopictus mosquitoes with entomopathogenic fungus

Metarhizium anisopliae . Acta Trop.102:151-158.


171

Segel, I.H. (1976). Biochemical calculations. John Wiley and Sons New York,

London.

Sepahy,A. & Jabalameli, L. (2011) . Effect of culture conditions on the

production of an extracellular protease by Bacillus sp. Isolated from

soil sample of Lavizan Jungle park. Enzyme Research. pp. 1-7 .

Sevinc,N. & Demirkan, E. (2011). Production of protease by Bacillus sp. N-40

isolated from soil and its enzymatic properties. J.Biol. Environ.Sci. 5(14):

95-103.

Shahid, A.A, Qayyumrao A., Bakhsh A., Husnain T. (2012).

Entomopathogenic fungi as biological controllers: New insights into

their virulence and pathogenicity. Arch. Biol. Sci. 64(1):21-42.

Shankar, S. ; Rao, M. & Laxman, R. (2011), Purification and

characterization of an alkaline protease by a new strain of Beauveria sp.

.Process Biochemistry.Vol. 46. pp. 579-585.

Shanthakumar, S.P.; P.D. Murali; S. Malarvannan; V. R. Prabavathy and

S.Nair.( 2010). Laboratory evaluation on the potential of entomopathogenic

fungi, Nomuraea rileyi against tobacco caterpillar, Spodopteralitura

Fabricius (Noctuidae: Lepidoptera) and its safety to Trichogramma sp.

J. Biopesticides 3(1 Special Issue) 132-137.

Sharma, N. & De, k.(2011). Production, Purification and crystallization of an

alkaline protease from Aspergillus tamari [EF661565.1]. Agric. Biol. J. N.

Am. 2(7): 1135-1142.

Shimanuki , H . (1981) . Controlling the greater wax moth , apest of honey

combs. United States University of Minnesota Science and Education

Administration .pp 11.

Shimizu, S.; Tsuchitani, Y. & Matusumoto, T. (1992). Purification and

properties of an extracellular protease from Beauveria bassiana .

Journal of Sericultural Science of Japan. Vol. 61. No.5 : 421-428.

Šimkovič,M. ; Kurucová,A. ; Hunová,M. & Varečka, Ľ.(2008). Induction of

secretion of extracellular proteases from Trichoderma viride. Acta

Chimica Slovaca. Vol.1. No. 1: 250 – 264.

Šimkovič,M. ; Gdovinova´,A. ;Zemkova ,Z and Varecˇka,L. (2012). Properties

of secreted protease from vegetative Trichoderma atroviride mycelia

cultivated with protein inducer reveal a complex protein-recognition

mechanism. Antonie van Leeuwenhoek. 101: 253–265.


172

Singh, R.S.; Dhaliwal, R. and Puri, M. (2007a). Partial purification and

characterization of exo inulinase from Kluyveromyces marxianus YS-1 for

preparation of High- Fructose Syrup. J. M.icrobiol. Biotechnol. 17(5):

733-738.

Singh, R.S.; Sooch, B.S. and Puri, M. (2007b). Optimization of medium and

process parameters for the production of inulinase from a newly isolated

Kluyveromyces marxianus YS-1. Bioresource Technology 98: 2518-2525.

Singh, G and Prakash, S. (2010) . Fungi Beauveria bassiana ( Balsamo)

metabolites for controlling malaria and filarial in tropical countries.

Advances in Biomedical Research. 238-242.

Sirisha,S. ; Gurvinder, K . & Padmini,P. (2010). Strain improvement of

entomopathogenig fungal species Beauveria bassiana and Metarhizium

anisopliae by Protoplast Fusion. International Journal of Applied Biology

and Pharmaceutical Technology.Vol.1: Issue-3.

Skrobek , A.; Shah, F.A; Butt, T.M.(2008). Destruxin production by the

entomogenous fungus Metarhizium anisopliae in insects and factors

influencing their degradation. Biocontrol.53:361-373.

Sloman, I. S. and Reynolds, S. E. (1993). Inhibition of ecdysteroid secretion

from Manduca prothoracic glands in vitro by destruxins - cyclic

depsipeptide toxins from the insect pathogenic fungus Metarhizium

anisopliae. Insect Biochemistry and Molecular Biology 23, 43- 46.

Smith, A.D.; Datta,S.P. ; Howard, S.G.; Campbell, P.N.; Bentley R. and

McKenzie,H.A. (1997) . Oxford Dictionary of Biochemistry and

Molecular Biology. Oxford University Press, Oxford.

Soares, Jr.G.G. (1982 ).Pathogenesis of infection by the hyphomycetous

fungus Tolypocladium cylindrosporum in Aedes sierrensis and Culex

tarsalis (Diptera: culicidae) . Entomophaga.27: 283-300.

Soares,F. ; Braga,F. ; Geniêr,H.; de Araújo,J. ; Ferreira,S. ; Araujo,J. ;

Tavela,A. ; Vilela,V. & de Queiróz, J. (2010). Optimization of medium

composition for protease production by Paecilomyces marquandii in

solid-state fermentation using response surface methodology. African

Journal of Microbiology Research. Vol. 4(24). pp. 2699-2703.

Somkuti,G. & Babel, F. (1968). Purification and Properties of Mucor Pusillus

Acid Protease. Journal of Bacteriology. Vol. 95. No . 4. p.1407-1414.

Research Journal of Agriculture and Biological Sciences. 5(4) : 349-360 .


173

Soundarapandian, P. and Chandra ,R., (2007). Mass Production of

Endomopathogenic Fungus Metarhizium anisopliae (Deuteromycota;

Hyphomycetes) in the Laboratory. Research Journal of Microbiology, 2:

690-695.

Springer , J.P; Cole, R.J.; Dorner ,J.W.; Cox, R.H.; Richard, J.L.; Barnes ,

C.L.; Vander Halem, D.(1984). Structure and conformation of roseiotoxin

B.J.Am. chem..soc.106,2388-2392.

Stanbury, P. F. and Whitaker, A. (1984) . Principles of fermentation

technology . 1st ed. Pergamon Press , Oxford .

Stawski, D.; Rabiej, S.; Herczynska,L. & Draczynski, Z. (2008).

Thermogravimetric analysis of chitins of different origin. Journal Of

Thermal Analysis and Calorimetry. Vol.93(2):489-494.

Steinhause, E.A.(1949).Principle of In Pathology .New York.Tornto.

London.Mc Graw- Hill book company INC.757.

St. Leger, R. J., Staples, R. C. and Roberts, D. W. (1992c). Cloning and

regulatory analysis of starvation-stress gene, Ssga, encoding a

hydrophobin-like protein from the entomopathogenic fungus,

Metarhizium anisopliae. Gene120, 119-124.

Suganthi ,C.;Msgeswari,A. ;Karthikeyan,S.;Anbalagan,M.;Sivakumar,A. and

Gothandam,K.M.(2013).Screening and optimization of protease

production from a halotolerant Bacillus licheniformis isolated from

saltern sediments.J.of Genitic Engineering and Biotechnology .11,47-52.

Sumantha, A.; Larroche,C. & Pandey,A.(2006 a). Microbiology and Industrial

Biotechnology of Food- Grade Proteases : A Perspective. Food

Technol. Biotechnol. 44 (2): 211-220.

Sumantha, A.; Deepa, P.; Sandhya1, C.; Szakacs, G.; Carlos, R. S.

and Pandey1, A.(2006 b).Rice Bran as a Substrate for Proteolytic

Enzyme Production. Brazilian archives of biology and technology.

Vol.49, n. 5 : pp. 843-851.

Sung, G.H.; Hywel-Joues, N.L.; Sung, J.M.; Luangsa-ard, J.J.; Stresh tha, B.

and Spatafora, J.W.( 2007) . Phylogenetic classification of cordyceps

and clavicipitaceous fungi. Studies in Mycology.57:5-59.

Suzuki, A. and Tamura, S. (1972). Isolation and structure of protodestruxin

from Metarrhizium anisopliae. Agricultural and Biological Chemistry

36, 896-898.


174

Szabo, I. T. and Heikel, D. (1987). Fumigation with SO2 to control wax moth

in honeybee comb. Bee World. 68: 37-38.

Tal, J. and Attathom, T. (1993). Insecticidal potential of the insect parvovirus

GmDAN. Archives of Biochemistry and Physiology. 22: 345-356.

Tambekar,D. & Tambekar ,S. (2011). Partial Characterization and

Optimization of Protease Production from newly isolated Cohnella

Thermotolerans from Lonar Lake .Journal of Research in Biology.

Vol.1. No.4:292 – 298 .

Tamerler, C.; Ullah, M.; Adlard, M.W. and Keshavarz, T. (1998). Effect of

pH on physiology of Metarhizium anisopliae for production of

swainsonine. FEMS Microbiol. Lett. 168(1): 17-23.

Tanada, Y. and Kaya, H.K. (1993). Insect Pathology, Academic Press, San

Diego, CA.

Tangthirasunun , N.; Poeaim , S. ; Soytong, K. ; Sommartya, P. and

Popoonsak, S. (2010) Variation in morphologyy and ribosomal DNA

among isolates of Metarhizium anisopliae from Thailand. Journal of

Agricultural Technology. Vol. 6(2): 317-329

Tedders, W.L.; Weaver, D.J.; Wehunt, E.J. and Gentry, C.R. (1982). Bioassay

of Metarhizium anisopliae , Beauveria bassiana and Neoaplectana

carpocapsae against the larvae of the plum curculio, Conotrachelus

uenuphar( Herbst) ( Coleoptera: Curculionidae) . Environ.Entomol.11:

901-904.

Tew, J.E.( 2001). Beekeeping principles, a Manual for the Beginner, a Guide

for the Gardener. 1st edition. James. E. Tew and Walter. T. Kelley

Co. Inc. ( USA , 2000 ). pp. 200.

Theunis, W. (1997). Technigues and media for isolation , culture, storage and

Bioassay of Metarhizum anisopliae and Beauveria brongniartii. Pacific

Regional Agriculture Programme.14:1-11.

Thungrabeab, M. & Tongma,S.(2007). Effect of entomopathogenic fungi,

Beauveria bassiana (Balsam) and Metarhizium anisopliae (Metsch) on

non target insect. KMITL Sci.Tech. J. Vol.7. No. 1.


175

Tiago, P.V.; Fungaro, M.H.P.; Furlaneto, M.C.( 2002) Cuticle- degrading

proteases from the entomopathogen Metarhizium flavoviride and their

distribution in secreted and intracellular fractions. Lett. Appl.

Microbiol. 34:91–94.

Tikhonov, V.E., Lopez-Llorca, L.V., Salinas, J. and Jansson, H.-

B. (2002) Purification and characterization of chitinases from the

nematophagousfungi Verticillium,chlamydosporium and V.

suchlasporium. Fungal Genet Biol 35, 67–78.

Toriello, C.;Pe´ rez-Torres, A.; Burciaga-Dı´az, A.; Navarro-Barranco, H.; Pe

rez-Mejı´a, A.; Lorenzana-Jime´ nez, M. and Mier, T.( 2006). Lack of

acute pathogenicity and toxicity in mice of an isolate of Metarhizium

anisopliae var. anisopliae from spittlebugs. Ecotoxicol. Environ. Saf. 65,

278–287.

Tremacoldi, C.R.; Carmona, E.C. (2005). Production of extracellular alkaline

proteases by Aspergillus clavatus. World J. Microbiol Biotechnol 21:

169–172.

Turner, W. B. and Aldridge, D. C. (1983). Triterpenoids and steroids. In

'Fungal Metabolites 2nd Edition (W. B. Turner and D. C. Aldridge,

eds.), pp. 225-336. Academic Press, London.

Unsal, S.; Ozparlak, H. and Aktumsek, A. (2004). Effect of diflubenzuron on

the integument of fifth instar Galleria mellonella larvae.

Phytoparasitica. 32(1): 43-51.

Upadhyay , M.K.; Kumar ,R. ;Kumar, A.; Gupta , S.; Kumari , M.; Singh ,A.;

Jain , D. and Verma, H.N.(2010). Optimization and Characterization of

an extracellular protease from Aspergillus Flavus “MTCC277”. African

Journal of Agriculture Research Vol.5(14) pp.1845-1850.

Usharani, B. & Muthuraj, M. (2010). Production and characterization of

protease enzyme from Bacillus laterosporus. African Journal of

Microbiology Research. Vol.4.(11).pp. 1057-1063.

Ustariz , F. ;Laca,A. & Diaz, L. (2008). Fermentation condition increasing

protease production by Serratia marcescens in fresh whey. Rev.Tec.Ing.

Univ.Zulia. Vol.31. No.1.79-89.

Vaidya , R.J.; Shah, I.M.; Vyas, P.R. and Chhatpar , H.S.(2001).Production

of chitinase and optimization from anovel isolate Alcaligenes

xylosoxydans: potential in antifungal biocontrol. World J. Microb.

Bioechnol. 17:691-696.

Varley, H.; Gowenlock, A.H.; Bell, M.( 1976) . Practical Biochemistry, 5th ed.; I.W.

Heinemann: London, UK .


176

Venkatsubbaiah , P.; Tisserat , N.A. and Chilton , W.S.(1994) metabolites of

Ophiosphaerella herpotricha Mycopathologia,128,155-159.

Ventosa,A.;Nieto,J.J.andOren,A. (1998).Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:504-544.

Verma, P. and Prakash, S. (2010). Efficacy of Chrysosporium tropicum

metabolite against mixed population of adult mosquito ( Culex

quinquefasciatus , Anopheles stephensi and Aedes aegypti) after

purification with flash chromatography. Springer-Verlag.107: 163-166.

Verma,J.;Modi,D.; Sharma,R. & Saxena,S.(2011). Vetal role of Alkaline

Protease in Bio-industreis : A review . Plant archives . Vol . 11. No.

2.pp. 1083-1092.

Vilcinskas, A. and M. Wedde.(1997a). Inhibition of Beauveria bassiana

proteases and fungal development by inducible protease inhibitors in

the haemolymph of Galleria mellonella larva, Bio. Sci. and Tech

12:591-602.

Vilcinskas, A., Matha, V. and Gotz, P. (1997b). Effects of the

entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae and its secondary

metabolites on morphology and cytoskeleton of plasmatocytes isolated

from the greater wax moth, Galleria mellonella. Journal of Insect

Physiology 43, 1149-1159.

Vilcinskas, A., Matha, V. and Gotz, P. (1997c). Inhibition of phagocytic

activity of plasmatocytes isolated from Galleria mellonella by

entomogenous fungi and their secondary metabolites. Journal of lnsect

Physiology 43, 475-483.

Vining, L. C. (1990). Functions of secondary metabolites. Annual Review of

Microbiology 44, 395-427.

Voet, D. & Voet, J. (2010). Biochemistry. Fourth edition. John Wiley & Sons ,

Inc.

Votruba ,J.;Pazlarova ,J.;Dvorakova,M.,Vachora,L.,Strnadova,M.; Kucerova,

H.,Vinter,V.;Zourabian,R.and Chaloupka,J.(1991). External factors

involved in the regulation of synthesis of an extracellular proteinase in

Bacillus megaterium:effect of temperature .Applied Microbiology and

Biotechnology,Vol.35,No.3,pp.352-357.


177

Wang, J.J. and Shih , J.C.H. (1999) Fermentation production of

keratinase from Bacillus licheniformis PWD-1 and a recombinant B.

subtilis FDB-29. Journal of Industrial Microbiology and

Biotechnology, vol. 22, no. 6, p. 608-616.

Wang, C. ; Skrobek , A. and Butt, T.M.(2003). Concurrence of losing a

chromosome and the ability to produce destruxins in a mutant of

Metarhizium anisopliae . FEMS Microbiology Letters 226.P.373-378.

Wang,L.; Ridgway,D.; Gu,T. & Moo-Young,M. (2005) . Bioprocessing

strategies to improve heterologous protein production in filamentous

fungal fermentation. Biotechnology Advances . 23. pp.115-129.

Wang, B. ; Liu, X. ; Wu, W. ; Liu, X. & Li, S. (2009). Purification,

characterization, and gene cloning of an alkaline serine protease from a

highly virulent strain of the nematode-endoparasitic fungus Hirsutella

rhossiliensis. Microbiological Research. 164: 665-673.

Ward , A.G. and A. Courts . (1977). The Science and Technology of Gelatin.

A Cademic press . London , New York , San Francisco . 506pp.

Warhust, P. and Goebel, R. (1995). The bee book , beekeeping in the warmer

areas of Australia. State of Queensland, Department of Primary

Industries. pp. 244.

Weibin, S.H.I. and Mingguang, F.E. (2004). Ovicidal activity of two fungal

pathogens(Hyphomycetes) against Tetranychus cinnabarinus (Acarina:

Tetranichidae) . Chinese Sci. Bull.49(3): 263-267.

Wellingta, C.A.N. and Meire, L.L.M.(2004) Production and properties of

an extracellular protease from thermophilic Bacillus sp.Braz .J.

Microbiol.35:1-2.

Whitaker,J.(1972). Principles of Enzymology for the Food Science . Marcel

Dekker, Inc. New York.

White, A.; Handler, p. and Smith, E. (1973). Principles of biochemistry. Mc

Grow – Hill Book Company – Albakistan Publication, New York.

Witting,G. (1965).Astudy of the role of blood cells in insect disease.12th

Int.Congr.Ent.(London,1964),743.

Wood , H.W.(1958).Technical and pharmaceutical uses of gelatine. J. Photogr.

Sci , 6 , 91-96. (Cited from ward and courts , 1977).

Wright, V.F.; Vesonder, R.F. and Ciegler, A. (1982).Mycotoxins and other

fungal metabolites as insecticide. In: Kurstak, E. (ed.) microbial and

viral pesticides . Marcel Dekker.580pp.


178

Yandri, ; Suhartati,T.; Herasari,D. & Hadi,S. (2008). The chemical

modification of protease enzyme isolated from local bacteria isolate,

Bacillus subtilis ITBCCB148 with cyanuric chloride polyethylenglycol.

European Journal of Scientific Research. Vol. 23 No.1. pp. 177-186.

Yang, J. ; Huang, X. ; Tian, B. ; Wang, M. ; Niu ,Q. & Zhang, K. (2005).

Isolation and characterization of a serine protease from the

nematophagous fungus, Lecanicillium psalliotae, displaying

nematicidal activity. Biotechnology Letters. 27 : 1123–1128.

Yang, J.; Liang, L. ; Zhang, Y. ; Li, J. ; Zhang, L. ; Ye, F. ; Gan, Z. & Zhang,

K. (2007a). Purification and cloning of a novel serine protease from the

nematode-trapping fungus Dactylellina varietas and its potential roles

in infection against nematodes. Appl. Microbiol Biotechnol. 75: 557-

565.

Yang,J. ; Li,J. ; Liang,L. ; Tian,B. ; Zhang,Y. ; Cheng,C. & Zhang, K. (2007b).

Cloning and characterization of an extracellular serine protease from the

nematode-trapping fungus Arthrobotrys conoides. Arch. Microbiol.

188:167–174.

Yang ; Jin-Kui, ; Ye,F. ; Mi,Q. ; Tang,S. ; Li,J. & Zhang,K.(2008). Purification

and Cloning of an Extracellular Serine Protease from the Nematode-

Trapping Fungus Monacrosporium cystosporium. J. Microbiol.

Biotechnol. 18(5): 852–858.

Yeh, S.F.; Pan, W.; Ong, G.T.; Chiou, A.J.; Chuang, C.C.; Chiou, S.H. and

Wu, S.H. (1996) . Study of structure-activity correlation in destruxins ,

aclass of cyclodepsipeptide possessing suppressive effect on the

generation of hepatitis B virus surface antigen in human hepatoma cells

.Biochem and Biophysi. Res. Communica.229: 65-72.

Yike, I. (2011). Fungal proteases and their pathophysiological effects .

Mycopathologia . 171:299–323.

Yin , L.J.;Hsu, T.H. and Jiang , S.T.(2013) . Characterization of Acidic

protease from Aspergillus niger, BCRC 32770. Journal of Agriculture &

Food chemistry .

Zabriskie , D.W. , W.B. Armiger , D.H. Phillips and P.A. Albano . (1980).

Trader's guide to fermentation media formulation. Traders protein ,

Memphis , Tennessee. (cited from Dokken , 2007).

Zacarin, G. G.; Gobbi, N. and Chaud-Netto, J. (2004). Host preference of

Apanteles galleria ( Wilkinson ) ( Hymenoptera : Braconidae ) for

Galleria mellonella ( L. ) or Achroia grisella ( Fabricius ) (Lepidoptera

: Pyralidae ). Neotropical Entomology. 33(1): 65-70.


179

Zanphorlin, L.; Cabral,H.; Arantes,E.; Assis,D.; Juliano,L.; Juliano, M.; Da-

Silva,R.; Gomes,E. & Bonilla-Rodriguez,G. (2011) . Purification and

characterization of a new alkaline serine protease from the

thermophilic fungus Myceliophthora sp., Process Biochemistry. 46:

2137-2143.

Zayed,A. (2003). Pathgenicity of two Beauveria bassiana indigenous isolates

towards the greater wax moth Galleria mellonella L. Larvea in Egypt.

Efflatounia. 3: 10-14.

Zhao, M. ; Huang, J. ; Mo, M. & Zhang, K. (2005). A potential virulence

factor involved in fungal pathogenicity: serine-like protease activity of

nematophagous fungus Clonostachys rosea. Fungal Diversity. 19: 217-

234.

Zimmermann, G. (1993). The entomopathogenic fungus Metarhizium

anisopliae and its potential as a biocontrol agent. Pesticide Science 37:

375-379.

Zimmermann, G., Papierok, B. and Glare, T.(1995).Elias Metschinokoff, Elie

Metschnikoff or Ilya Mechnikov (1845-1916) a pioneer insect

pathology, the first describer of the entomopathogenic fungus

Metarhizium anisopliae and how to translate a Russian name.

Biocontrol Science and technology 5:527-530.

A

Summary This studying consist of two main axis , the first was carried out to

evaluation the efficiency of local isolate of fungus Metarhizium anisopliae

for control Grater wax moth Galleria mellonella L. by using fungal

suspension and secondary metabolites concentrations , and in the second axis

the study was focused on production and characterization of an effective

biological control agent from this fungus . The results showed as later :

1- (A) The different concentration of fungal spore suspension have affected

the life stages of G. mellonella . The mortality percentages of eggs was 62.88

% at the concentration of 1×107 spore/ml and decreased to 31.78 % at the

concentration of 1×104 spore/ml . The larval instars have showed highest

mortality rate reached (100 , 96.99 and 90.97 ) % for 1st , 4th and 7th larval

instars respectively , during 120 h at the concentration of 1×107 spore/ml .

The values of lowest mortality rate when treated with 1×104 spore /ml

during 120 h were (62.90 , 58.88 , 50.86 ) % for 1st , 4th and 7th larval instars

respectively . 54.89 % the highest mortality rate for the pupae was recorded

when treated with 1×710 spore /ml while 36.85 % were found to be dead

when exposed to 1×410 spore /ml. for the adults , and the treatment with

highest concentration of spore suspension caused a high adult mortality, i.e

69.95 % and 63.94 % for adult males and for females after 168 hours. While

the lowest mortality percentages were 41.91 % and 43.91 % when treated

with 1×10 4 spore/ml for the same time .

(B) The relationship between cultural filtrate which contain different

secondary metabolites and percentage of mortality of egg ,larvae, pupa and

adult were positive. 60.91 % of egg dead at a concentration 100% , and

26.82 % were dead at the concentration 25% . The full cultural filtrate caused

a mortality at a rate ( 100 , 97 and 91.99 ) % from 1st , 4th and 7th larval

instars respectively during 72 h . Decline to ( 67.96 , 64.96 and 54.95 ) %

mortality was found for the same instar respectively when treated with

concentration 25 % at 72 hours . This indicates that the secondary

metabolites of the fungal were more effective on 1st larval instars than the 7th

instars . that highest mortality was 50.96 % at the concentration 100% and

32.95 % with concentration 25 % for pupa . As for adults the results revealed

that the highest mortality was ( 68.90 and 58.98 ) % for male and female

respectively at a concentration 100% while the lowest rate of mortality were

(37.98 and 32.97 ) % for male and female at aconcentration of 25%

respectively.

B

2- Display the isolate of fungus ability on the production enzymes protease ,

chitinase and lipase but the optimum production recorded for protease in

minimal media supported with casein where the specific activity was 41.12

units / mg protein . The largest inhibitor diameter for resistant organisms was

5.3 mm which taken from destroxins media against S. aureus .

3- The optimal conditions for the enzyme production from the fungus used in

this study were found using medium composed of Date syrup (DS) at

concentration 0.05 % supplemented with 0.5 % gelatin , at initial pH 5.5 with

an inoculum size 16 % , and incubation at 30 ˚C on a rotary shaker at 100

rpm for 72 h.

4- Protease from culture filtrate of M. anisopliae , were partially purified by

precipitation with 60% ethanol and Ion exchange chromatography using

DEAE- Cellulose (Batch wise ) then by gel filtration chromatography using

Sephadex G-150 . Fold purification was 28.726 with 11.97 % yield for the

enzyme at the final step of this purification procedure.

5- The purified Protease was characterized . The results showed the

following :

A- The Km values for protease were (0.178 , 0.179 and 0.182 ) mg/ml ,

against gelatin , BSA and casein as substrates , respectively . While the

Vmax values were (0.465 , 0.339 and 0. 465) mg/ml.min for the three

substrates respectively too .

B- The optimum pH for the Protease activity was pH 8.0 , and it

was stable in the pH ranged between (7.0 - 9.0) .

C-The Protease showed heat stability at (20-30) ˚C for 30 minutes .

D-The efects of protease inhibitors and various metal ions on the

enzyme activity were determined. Only in the presence of PMSF

at (5) mM the enzyme activity was strongly inhibited, indicating that

protease enzyme belongs to the serine-type peptidase group, While iron

chloride (FeCl2) had stimulated effect on the enzyme activity .

Ministry of Higher Education & Scientific Research

University of Kerbela

College of Education for pure sciences

Department of Biology

Production and Characterization of

Alkaline protease from Metarhizium anisopliae as abiological control agent against Greater wax

moth Galleria mellonella

A thesis Submitted

To the Council of the College of Education for Pure Sciences - Kerbela University as a Partial Fulfillment of the

Requirements for the Philosophy Dactora degree of science in Biology / Zoology (Biological control)

By

Muna Ibrahim Jasim AL-Musawi

M. Sc. In Biology / zoology

Supervision

Assist Prof.Dr.MOHAMMAD REDDA ANNON

2015 A.D. 1436 A.H.

ﻣﻦ أنزيم البروتييز القاعدي إنتاج وتوصيف ﻛﻌاﻣﻞ...

Documents

Transcript of ﻣﻦ أنزيم البروتييز القاعدي إنتاج وتوصيف ﻛﻌاﻣﻞ...