Vol 13 No 3 September 2011-3
6
150 J BP Vo l. 1 3, No. 3 , S e pt e m b e r 2 01 1 Re kom binas i Ge n Pe nyandi - xi losidas e as al Ge oba cil lusT he rm oleovo rans I T-08 dalam Plasmid Phis1525 (Re com binant Gen of Encodi ng -X ylos ida se from Ge oba cil lus T he rmoleovorans I T-08 in pH I S 152 5 Plas m id) Sri Sum arsih*, Ni Nyom an Tr i Pusp anings ih*, Ami Soe wan di J S* ABSTRACT Key words PENDAHULUAN su d a h men ja d i ” ” un t u k produksi berba gai protein rekombi nandan telah di guna kan se cara luas s eb aga i se l ina ng untuk kloning be rbaga i ge n het erologus denga n berbaga i sistem ekspres i. Nam un de miki an,ad abe be rapake ndalayangse ringkali terj adipada prose sproduksi protein he terologus. ti dak me m punya i m eka ni sm ee ksportprotei n, se hinggaproteinyangdiproduksi dalamjumlahbesa rakandi akum ul asisecaraintras elulerdan ham pirsemuanyadalam ben tukbadani nklusi ( Choi and Le e , 2004; Schallmey et al., 20 04 ). Bakte ri Gram positif m em punya i be be rapa kelebihan diban dingkan de ngan se l ina ng lain untu k produksi protein rekom bina n. Bakte ri ini ma mpu m eng ekspresikan b ebe rapa DNA heterol ogus, ti dak menghasilkan protease alkalin, dikenal stabil dalam m elakukan repl ikasi dan m em eli hara plas mid, se rta tidak di tem ukan a danya endotoksi n pa da dindi ng se lnya. Beberapa vektor e kspresi dan galur telah di kem ban gkan dan diguna kan un tuk produksi be rbaga i protei n, misal nya glukosi l transferase ( Wang etal ., 20 05),levansucrase ( Malten etal., 2006; Ya n g etal ., 20 06), da n pe nisilin am idase ( Ya ng et al., 2006 ) dan fragm en a ntibodi scFv ( J o rda n et al, 2007). Plasmid pHI S1525 m erup akan shuttle vector untuk e k s p res i g en h etero lo g us d i d an , yan g dikonstruksi untu k kep erluan produks i, sekresi da n pem urni an satu taha p sua tu protein heterol ogus yang mengandung p e nanda histidin ( ) ( M alte n et al., 2006; Hollman et al., 2006). Ekspres i ge n dalam si ste mpHIS1525 /B. m eg te rium - xilosidase ekst rase luler. Tuj uan pene litian ini ad alah un tuk -xilosidase asal I T-08 ke da lam plasm id pHI S1525 da n dipropaga si di . Untuktaha pa n pe ne litian se lan jutnya , plasm id rekom binan yan g diperoleh di ekspresikan di dalam sistem pHIS1525 / . MATERI DAN M ETODE Sam pe l Pene litian 1. Plasmidrekombinan p TP 510 / merupakan koleks i L ab ora torium Biokim ia Dep arte m e n K im ia Fakultas Sain dan Teknologi Una ir. *Depa rtem en Kimia, Fakultas Sains da n Te knologi Uni versitas Airl an gga
description
recombinan DNA
Transcript of Vol 13 No 3 September 2011-3
7/21/2019 Vol 13 No 3 September 2011-3
http://slidepdf.com/reader/full/vol-13-no-3-september-2011-3 1/5
150 JBP Vol. 13, No. 3, September 2011
Rekombinasi Gen Penyandi -xilosidase asal Geobacillus Thermoleovorans IT-08
dalam Plasmid Phis1525
(Recombinant Gen of Encoding -Xylosidase from Geobacillus Thermoleovorans
IT-08 in pHIS1525 Plasmid)
Sri Sumarsih*, Ni Nyoman Tri Puspaningsih*, Ami Soewandi J S*
ABSTRACT
Key words
PENDAHULUAN
sudah menjadi ” ” untuk
produksi berbagai protein rekombinan dan telah digunakan
secara luas sebagai sel inang untuk kloning berbagai gen
heterologus dengan berbagai sistem ekspresi. Namun
demikian, ada beberapa kendala yang seringkali terjadi padaproses produksi protein heterologus. tidak mempunyai
mekanisme eksport protein, sehingga protein yang diproduksi
dalam jumlah besar akan diakumulasi secara intraseluler dan
hampir semuanya dalam bentuk badan inklusi (Choi and Lee,
2004; Schallmey et al., 2004).
Bakteri Gram positif mempunyai
beberapa kelebihan dibandingkan dengan sel inang lain
untuk produksi protein rekombinan. Bakteri ini mampu
mengekspresikan beberapa DNA heterologus, tidak
menghasilkan protease alkalin, dikenal stabil dalam
melakukan replikasi dan memelihara plasmid, serta tidak
ditemukan adanya endotoksin pada dinding selnya. Beberapavektor ekspresi dan galur telah dikembangkan
dan digunakan untuk produksi berbagai protein, misalnya
glukosiltransferase (Wang et al., 2005),levansucrase(Malten
et al., 2006; Yang et al., 2006), dan penisilin
amidase ( Yang et al., 2006) dan fragmen antibodi scFv
( J ordan et al, 2007).
Plasmid pHIS1525 merupakanshuttle vector untuk
ekspresi gen heterologus di dan ,
yang dikonstruksi untuk keperluan produksi, sekresi dan
pemurnian satu tahap suatu protein heterologus yang
mengandung penanda histidin ( ) (Malten et al.,
2006;Hollman et al., 2006).
Ekspresi gen dalam sistem pHIS1525/B. megterium
-
xilosidase ekstraseluler. Tujuan penelitian ini adalah untuk
-xilosidase asal
IT-08 ke dalam plasmid
pHIS1525 dan dipropagasi di . Untuk tahapan
penelitian selanjutnya, plasmid rekombinan yang diperoleh
di ekspresikan di dalam sistem pHIS1525/ .
MATERI DAN METODE
Sampel Penelitian
1. Plasmid rekombinan pTP510/ merupakan
koleksi Laboratorium Biokimia Departemen Kimia
Fakultas Sain dan Teknologi Unair.
*Departemen Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga
7/21/2019 Vol 13 No 3 September 2011-3
http://slidepdf.com/reader/full/vol-13-no-3-september-2011-3 2/5
Sri Sumarsi .: Re om inasi Gen Penyan i -xi osi ase 15
. asm p
an peroe
ar nst tute o cro o ogy, ec nca n versty
Braunschweig, Germany.
ara er a
emua prose ur mo e uer a u an sesua enganprosedur standar am roo and use (2001).
so as an pemurn an p asm
soas pasm p , p an pasm
re om nan a u an engan mengguna an t
-x os ase a am p
mp as gen penyan -x os ase gen xy
a u an engan meto e mengguna an p asm
rekombinan pTP510 sebagai cetakan ( ) dan
sepasang primer yang didesain berdasarkan atas sekuen
dalam pTP510 dan sekuen sisi-sisi restriksi yang
se a an pa a . eta restr pasm p an
p tercantun pa a .
Gam ar 1 Peta Restr s a pTP510, pHIS1525.
r mer yang er as esa n a a a se aga
er ut.
- : -
-
- : -
TATTTAAACC-3’
Kondisi amplifikasi adalah sebagai berikut: Pra-
enaturas pa a
dilakukan dalam 30 siklus. Pada setiap siklus reaksi
ter r atas e erapa ta apan rea s : enaturas pa a
seama ment, annea ng pa a seama
detik, (3) perpanjangan rantai pada 72 C selama 2 menit
an penam a an pa a seama ment.
Produk PCR (amplikon) yang diperoleh dianalisis dengen
elektroforesis gel agarosa 1%.
roses re om nas gen penyan -x os ase aa
pasm p an transormas a u an
melalui beberapa tahapan sebagai berikut: (1) pemotongan
ganda (double digest) amplikon dan plasmid pHIS1525
dengan 2 jenis enzim restriksi acI danSphI, (2) rekombinasi
gas amp on an pasm p mengguna an
enz m gase trans ormas pasm re om nan e aa
se ompeten
ee s trans orman
ee s trans orman a u an engan memn a an
oon- oon a ter yang tum u e aa
e erapa trans orman p secara aca , ana ss restr s
an ee tro oress ge agarosa .
e uensnga apan se uens ng a u an untu mengeta u
se uen ragmen gen yang ter nsers e aam ve tor.
- os ase xy ar
dilakukan menggunakan
alat PCR dengan plasmid pTP510 sebagai DNA cetakan
( ). memperlihatkan bahwa
amp on yang tunu an engan a anya p ta
se tar p pa a ee trooregram.
Ana s s pro u PCR amp on engan
ee tro oress ge agarosa 1% pTP =pasm pTP510
DNA ceta an , M =DNA penan a; X =amp on
se eum pemurnan; X’ anX’’=amp on
setea pemurnian.
7/21/2019 Vol 13 No 3 September 2011-3
http://slidepdf.com/reader/full/vol-13-no-3-september-2011-3 3/5
152 JBP Vol. 13, No. 3, September 2011: 150–154
xyl) dalam
E. coli
Amplikon (+1500 pb) dan plasmid pHIS1525
(+7000 pb) dipotong ganda dengan enzim restriksi SacI/
SphI) sehingga menghasilkan fragmen DNA sengan ujung
lengket yang komplementer. Kemudian kedua fragmen
DNA tersebut diligasikan menggunakan enzim ligase dan
selanjutnya ditransformasikan ke dalam sel kompeten
.
Seleksi yang membawa plasmid
pHIS1525 rekombinan dilakukan dengan menganalisis
DNA plasmid dari 10 (sepuluh) transforman yang dipilih
secara acak. terdapat 4 (empat) DNA plasmid dengan
ukuran yang lebih besar dibandingkan dengan DNA plasmid
pHIS1525, yaitu DNA plasmid dari transforman 1, 2, 5 dan
9 ( ). TransformanyangdidugamembawaDNA Transforman yang diduga membawa DNA
plasmid rekombinan tersebut berturut-turut dinamakan
coli rekombinan: E1, , E3, danE4. Kemudiandianalisis lebih lanjut untuk mengetahui ukuran DNA
plasmid serta ukuran dan struktur gen yang terinsersi ke
dalam plasmid pHIS1525.
Gambar 3. Analisis DNA plasmid rekombinan dengan
elektroforesis gel agarosa 1% pHIS: vektor
pHIS1525. Nomor 1–10: DNA plasmid dari
transforman 1–10.
Pemotongan ganda DNA plasmid rekombinan (E1)menggunakan enzim restriksiSacI/SphI menghasilkan dua
fragmen DNA, yang ditunjukkan dengan adanya dua pita
DNA pada elektroforegram dengan ukuran sekitar 7000
pb dan sekitar 1500 pb (Gambar 4B). Pita DNA dengan
ukuran +1500 pb tersebut sama dengan ukuran amplikon
(Gambar 4C), yang mendekati ukuran gen penyandi
fragmen DNA yang berukuran ±7000 pb, sama dengan
ukuran plasmid pHIS1525 (Gambar 4D). Oleh karena itu,
dilakukan sekuensing untuk membuktikan apakah gen
sisipan dalam plasmid pHIS1525 yang mempunyai ukuran
Sekuensing
Dari hasil sekuensing plasmid rekombinan dengan
dan perunutan nukleotida ini, dapatdiperoleh sekuen gen sisipan dalam plasmid pHIS1525
sebagai berikut.
Pada penelitian ini, amplifikasi gen penyandi
-xilosidase (gen ) dari pTP510 dilakukan dengan
metode PCR menggunakan sepasang primer yang didesain
dengan memperhatikan data sekuen gen penyandi asal
IT-08 ( dengan nomor akses
DQ345777) dan sekuen sisi restriksi di sekitar
cloning site (MCS) dari vektor plasmid pHIS1525. Gen
diinsersikan ke dalam plasmid pHIS1525 melalui
MCS, secara langsung sekuen penyandisignal
peptide (SPlipA), di antara sisi restriksiSacI danSphI.Strategi yang sama juga dilakukan dalam desain
primer untuk kloning gen penyandi levansucrase
yaitu : pMM1525, pHIS1525, pSTREP1525
dan pSTREPHIS1525, yang masing-masing menghasilkan
Malten et al., 2006).
Gambar 4. Analisis plasmid rekombinan E1 dengan
elektroforesis agarosa 1%. A = , B =
hasil pemotongan ganda plasmid E1 denganSacI/
SphI, C = Amplikon pHIS =plasmid pHIS1525
III (Fermentas).
7/21/2019 Vol 13 No 3 September 2011-3
http://slidepdf.com/reader/full/vol-13-no-3-september-2011-3 4/5
Sri Sumarsih dkk.: Rekombinasi Gen Penyandi b-xilosidase 153
Amplikon gen yang diperoleh dari amplifikasi
dari plasmid pTP510 merupakan fragmen DNA ujung
tumpul (blunt end) yang didesain mengandung sisi restriksiSacI ( ) pada ujung 5’ dan sisi restriksi SphI
( ) pada ujung 3’. Pemotongan ganda amplikon
dengan enzim restriksi SacI/ SphI dimaksudkan untuk
menghasilkan fragmen DNA dengan ujung lengket (
end). Enzim restriksi SacI memotong fragmen DNA pada
sekuen dan komplemennya
sedangkan enzim restriksi SphI memotong fragmen DNA
pada sekuen dan komplemennya
Plasmid pHIS1525 yang juga dipotong ganda dengan
enzim restriksi SacI/SphI menghasilkan vektor kloning
yang mempunyai ujung-ujung lengket yang komplementer
dengan ujung-ujung lengket amplikon gen . Dengandemikian, baik amplikon gen maupun vektor kloning
pHIS1525 mempunyai ujung-ujung lengket yang saling
komplementer.
Ligasi ujung-ujung lengket yang komplementer dapat
ujung tumpul. Hal ini disebabkan ujung-ujung lengket
yang komplementer (cocok) dapat saling berpasangan basa
melalui pembentukan ikatan hidrogen, untuk membentuk
struktur yang relatif stabil. Akibatnya, enzim ligase dapat
bekerja dengan lebih baik, yang akan mempercepatterbentuknya ikatan fosfodiester yang menyambung kedua
molekul DNA tersebut (Brown, 2001).
Analisis restriksi dilakukan dengan melakukan
pemotongan tunggal DNA plasmid menggunakan
enzim restriksi, untuk mengetahui ukuran DNA plasmid
rekombinan dan DNA sisipan. Pemotongan DNA plasmid
menggunakan enzim restriksi SacI akan membuka plasmid
sehingga menjadi bentuk liniernya, yang ditunjukkan
dengan adanya pita tunggal di sekitar 9000 pb pada
elektroforegram gel agarosa. Hal ini menunjukkan bahwa
plasmid rekombinan mempunyai ukuran sekitar 9000 pb,
yang lebih tinggi dibandingkan dengan ukuran vektorplasmid (7474 pb). Dengan demikian, dapat diperkirakan
bahwa vektor plasmid telah terinsersi dengan DNA asing.
Untuk mengetahui struktur gen sisipan dalam plasmid
pHIS1525 rekombinan dan tingkat homologinya terhadap
dengan . Lima primer yang telah berhasil
didesain dan digunakan untuk menentukan sekuen gen
ATGAAAAAAGTACTTATGGCATTCATTATTTGTTTATCGCTGATTCTATCTGTTTTAGCCGCTCCGCCG
TCTGGCGCAGGCGCCGCATTGAAGATCTCCGGAGCTC TCGATATTCTAACCCAGTAATTAAAGGGTTTT
ATCCGGATCCCAGTATTTGTCGAGTAGGTAGTGATTATTACTTAGTTACAAGTTCATTCCAGTACTTCC
CTGGGGTTCCAATTTTTCATAGTACTAATTTAATTAATTGGAATAAGATAGGATATTGTTTAATTAGAC
CAAGTCAACTTATGTTAAATAATGCAACAAATAGAAGTGGTATATTTGCACCTACCCTTCGTTATCATG
AGGGAATTTTTTATTTAATAACAACAAACGTAACACTAAAGAAGAACTTTATTGTTATGTCCGAAGATC
TACAAGGGGAATGGTCTGAACCGATTTGGATTGATGGATGGGGAGGCATTGATCCATCACTATTTTTTG
ATAACGATGGGAAGGTTTATATTACCGGGACAAATGATAATGCTAGGGGTGAAGAATTAGGAATTTACC
AAGCAGAAATAGATTTAAAGAAAGGAAGTATTATAGGTGAAAGAAAACTCATATGGAAAGGTACAGGCG
GCTCTTACCCGGAAGCCCCCCATTTATATAAAGTTAATGGCTGGTATTATTTATTAATCGCAGAAGGAG
GTACAGAGTATGGTCATATGGTGACCGTTGCAAGGAGTAAATATCCCTTCGGTCCTTTCGAAAGTTGTC
CTTTTAATCCAATATTAACTCATAGAAGCACAAACCATCCTCTTCAGGCAATCGGTCATGCTGATATTG
TTCAGTATCATGACGGAAGTTGGTGGGCAGTTTTTCACGGTACTCGTCCCATCTCTTATCCACCGAAAC
ACCATTTGGGCAGAGAGACTTGTTTAGCTCCTATCAAGTGGACAGACGATGGTTGGCCTATTATTGGTT
ACAACGGAAGAATTGATATTAAAATGGATGCTGGTTATCTGCCTGTGAAAGAAAAAAATATTGGGGATG
AGATCATTGAAGATGATTTTAACAGTGATATTTTTTCTACAGATTGGAATTTTATTCAAAACCCTCGCC
TTGAACACTATTCTTTGAAGGGACGTCCTAGTTGGTTAAAAATGCGGGGTACAGAAAAAACATTGAATG
ATATAAATTCCCCAACGTTTATTGGGCGGCGCCAAGAACATTTTGTTTGTAATGTGTCGACATTATTAG
AATTTAAACCGAATCAGGATAATGAGGAAGCTGGGCTAACCGTTTATATGAATGAAAAGCACCACTATG
AAATTGCCCTAACAAAGAAAAATGGACGAATAAATGTAGTTTTGAAGAAAACTGTAGGGGATATTCAGG
TTGTTGTAAATTCATTAGAGTATTTCTCTAATACGATTATTTTTTCTATTCAAGCTAATCCGGAAGAAT
ACAAGTTTTCATTTGTTGATCCTAATACAGGTCAGACTTATCTATTAGGAACAGGACTTACTACACTTT
TATCTACGGAGGTTGCAGGAGGGTTCACAGGCGTTTACTTTGGGTTATATGCCACTGGTAATGGAAAAG
TTTGTACGGCTCCCGCCTTTTTTGATTGGTTTAAATATATTCCTGAAATA TTGCATGCCGGCCTGAGAG
GATCGCATCACCATCACCATCAC TAA
Keterangan:
Ungu : ATG =
Hijau : sekuen Signal peptida (SPlipA)
Merah : GAGCTC =enzim restriksi SacI
GCATGC =enzim restriksi SphI
7/21/2019 Vol 13 No 3 September 2011-3
http://slidepdf.com/reader/full/vol-13-no-3-september-2011-3 5/5
154 JBP Vo . 13, No. 3, Septem er 2011: 150–154
s span a am p asm p re om nan a aa :
- , - , - , - an -tenga ,
se agamana gam ar an pa a s ema se aga er ut.
P yl-1(F)
P yl-2(F) P yl-tengah
P yl-2(R)P yl-1(R)
yang terinsersiaam pasm p , menunu an se uen
dengan urutan sebagai berikut: start - sgna pept ep - gen xy -
6- sop. a n apat eas an
meau agram er ut n:
StartSignalpeptide
SPlipASekuengenxyl His6 Stop
as ana s s ter a ap se uen-se uen secara
omputas mengguna an program o t equence
gnment tor menunu an a wa gen s span aa
pasm p mempunya se uen yang sama engan
IT-08 ( nomor akses DQ345777), dengan tingkat
homologi sebesar 99,93%. Berdasarkan peta plasmid
pHIS1525 dan data-data yang diperoleh pada penelitian ini,
ma a apat gam ar an peta pasm re om nan yang
Gam ar 5. Peta Restr s pSMX.
Dari hasil yang diperoleh pada penelitian ini, maka
dapat disimpulkan bahwa rekombinasi gen penyandi
-x os ase asa -
a am p asm p er as a u an, meng as an
plasmid rekombinan yang dinamakan pSMX.
rown , . ene onng an nayss: n
ntro ucton, ourt e t on, ac we c ence t .,
USA.
o an e , . ecretory an extrace uar
production of recombinant protein using Escherichia
coli, Appl. Microbiol biotechnol, 64: 625–635.
o mann , a ten, Biendendieck, ang,
ang, a n, and ec wer, 2006. Bacillus
megater um as a ost or recom nant prote n
production, Eng. Life Sci., 6(5): 470–474.
or an ust ot e en ec . c rrmann
. a n, an . u e , . ro uct on orecom nant ant o y ragments n ac us
megater um, cro a e actor es, : – .
a ten , e en ec , amer, rew ,
ammen uc o z . u zen an
a n, . ac usmegater um asm yste
Sam roo , and . . sse (eds), 2001. Molecular
onng: a a oratory manua, r e t on, o
Spring Harbor Laboratory Press, New York.
c a mey, . . ng , an . . ar . .
Development in the use of Bacil lus species for
industrial production, Can. J. Microbiol, 50: 1–17
ang o mann urc . mtz aten
a n, an . ec wer, 2005. Proteome analysis
o a recom nant ac us megater um stran ur ng
eteroogous pro ucton o a g ucosy trans erase,
roteome scence, : .
ang e en ec ang amer
a ten, a n, and ec wer, 2006. High
y e recom nant penc n am ase pro uct on
an export nto t e growt me um usng ac us
megater um, cro a e actores, : .
