Versi terjemahan dari Crystal structure of wild-type human thrombin in the Na+-free state.pdf

Page 1 Biochem. J. (2005) 392, 21-28 (Dicetak di Inggris) DOI: 10.1042/BJ20051217 21 Struktur kristal tipe manusia trombin-liar di Na + Bebas negara Daniel JD JOHNSON, Ty E. ADAMS, Wei LI dan James A. Huntington 1 Universitas Cambridge, Departemen Hematologi, Divisi Kedokteran Struktural, Unit Penelitian Trombosis, Institut Cambridge untuk Penelitian Medis, Wellcome Trust / Bangunan MRC, Hills Road, Cambridge CB2 2XY, Inggris Peraturan aktivitas trombin sangat penting untuk hemostasis dan pencegahan trombosis. Trombin memiliki beberapa procoagulant substrat, termasuk dan trombosit reseptor fibrinogen, dan perekat bagian- TiAl kofaktor untuk merangsang pembentukan sendiri. Namun, throm- bin juga mampu melayani fungsi antikoagulan dengan Kegiatan- Ating protein C. spesifisitas trombin terutama diatur dengan mengikat kofaktor TM (thrombomodulin), tapi co-ordi- bangsa Na + dapat juga mempengaruhi aktivitas trombin. Na + Bebas-bentuk sering disebut sebagai 'memperlambat' karena kecepatan penurunan pembelahan substrat procoagulant, tetapi bentuk lambat masih mampu cepat aktivasi protein C di hadapan TM. Molekuler dasar aktivitas proteolitik lambat trombin tetap sulit dipahami, meskipun dua dekade studi solusi dan pub banyak likasikan struktur kristalografi. Dalam tulisan ini, kami melaporkan struktur pertama dari tipe liar trombin manusia tumbuh unliganded karena tidak adanya koordinasi Na + . Na + mengikat adalah situs-ob- disajikan di posisi 6 memerintahkan Å sangat (1 Å = 0,1 nm) dihapus dari yang terlihat di Na + -Terikat negara. Gerakan Na + loop hasil non-katalitik-ikatan hidrogen di situs aktif dan memblokir dari saku mengikat substrat S1 dan S2. Serupa, jika lebih dramatis, perubahan yang diamati dalam struktur sebelumnya

dari trombin varian lambat E217K konstitutif. Lambatnya perilaku trombin dalam solusi tanpa Na + sekarang bisa dipahami dalam hal keseimbangan antara spesies inert, diwakili oleh struktur kristal dijelaskan dalam tulisan ini, dan bentuk aktif, di mana penambahan Na + populates aktif negara. Kata kunci: allostery, struktur kristal, hemostasis, throm lambat bin, natrium. PENDAHULUAN Pentingnya trombin ditegaskan oleh posisinya sebagai akhir serin protease yang dihasilkan dalam pembekuan darah kaskade. Trombin melayani banyak fungsi dalam hemostasis, yang generasi bekuan darah (untuk review, lihat [1,2]), termasuk cleav- usia fibrinogen menjadi fibrin bentuk polymerogenic nya, aktivasi trombosit melalui pembelahan-diaktifkan reseptor protease dan stimulasi ofits ownformation throughcleavageactivationofes- sential kofaktor V dan VIII. Trombin juga menstabilkan bekuan fibrin melalui aktivasi Faktor XIII, yang lintas-link fibrin poli- mer, dan TAFI (fibrinolisis activatable inhibitor trombin), yang menghambat rincian proteolitik gumpalan. Namun, trombin juga dapat bertindak sebagai suatu antikoagulan melalui aktivasi protein C, ketika terikat pada kofaktor sel-permukaan endotel TM (Thrombomodulin) [3]. Activated protein C dimatikan trombin formasi melalui inaktivasi pembelahan Faktor Va dan VIIIA (Forareview, lihat [4]). Thiscomplexnetworkofthrombinactivities adalah co-ordinasi melalui kompetisi untuk exosites pada permukaan trombin (untuk review, lihat [5,6]), dan mungkin juga melibatkan perubahan spesifisitas disebabkan oleh kofaktor-perubahan yang disebabkan dari situs-aktif sifat trombin. Meskipun struktur trombin terikat untuk TM tidak ditemukan adanya situs aktif perubahan konformasi [7], struktur dipecahkan di hadapan sebuah-situs inhibitor aktif, dan studi solusi baru-baru ini mendukung peran allostery dalam meningkatkan tingkat pembelahan protein C [8,9]. Hal ini juga telah ditunjukkan bahwa spesifisitas trombin dapat diubah oleh koordinasi ke univalen kation natrium (Na + ). Dengan tidak adanya Na + , Trombin memotong protrombotik substrat dengan mengurangi efisiensi (7-kali lipat untuk fibrinopeptide A), tetapi masih mampu efisien pembelahan protein C ketika terikat untuk TM [10]. Na + Trombin bebas demikian dianggap suatu antikoagulan karena berkurang

kemampuan untuk membelah substrat procoagulant, sementara kemampuan untuk mengaktifkan proteinCinthepresenceofTMisretained.TheNa + -FreeandNa + - bentuk terikat telah menjadi dikenal sebagai 'lambat' dan 'cepat' trombin [11] masing-masing, dan solusi banyak dan studi kristalografi telah dilakukan untuk berusaha untuk memahami dasar molekuler untuk katalitik diamati perbedaan mereka. Solusi studi telah menetapkan bahwa bentuk lambat memiliki terbatas-situs sumbing aktif dengan beberapa rantai samping aromatik di konformasi diubah [11-15]. Sangat penting adalah terbukti keterlibatan trp 215 (Penomoran template berdasarkan chymotrypsin [16]) yang menghasilkan perubahan kuantum nya pada Na + koordinasi, akuntansi untuk semua% 10-18 diamati di- peningkatan fluoresensi trinsic [17]. Na + adalah oktahedral co- terkoordinasi dengan dua rantai atom oksigen utama-residu Arg 221a dan Lys 224 dan empat molekul air [18,19], dan mutasi dan berdekatan dengan Na + mengikat loop-telah dibuat untuk menciptakan konstitutif lambat varian trombin untuk kemungkinan terapeutik use.ThustheE217Kthrombinvariantwasdiscoveredbyscanning [20] dan mutagenesis saturasi [21], dan ditemukan untuk membelah fibrinogen 270 kali lipat kurang efisien dibandingkan tipe liar, sementara tetap mempertahankan -Liar-jenis kegiatan dekat terhadap protein C saat pasti TM. sifat serupa telah dijelaskan untuk ganda mutan W215A/E217A [22,23]. Baru-baru ini, tiga varian struktur trombin telah kembali porting yang diklaim untuk mewakili bentuk lambat. Dalam dua laporan, Na + tidak termasuk dalam kondisi kristalisasi untuk trombin varian R77aA, dalam ketiadaan dan kehadiran PPACK ( D -Phe-Pro-Arg chloromethylketone) [24,25]. Para penulis con- cluded bahwa struktur diwakili trombin lambat yang hanya didasarkan pada pengecualian Na

+ dari kristalisasi buffer, namun, struktur pada dasarnya tidak bisa dibedakan dari Na + -Co-ordinasi trombin. Kami telah menerbitkan dua struktur Singkatan yang digunakan: DTT, dithiothreitol, PEG, poli (etilena glikol); PPACK, D Phe-Pro-Arg chloromethylketone-; rmsd, root mean square deviasi; TM, thrombomodulin. 1 Kepada siapa korespondensi harus ditujukan (jah52@cam.ac.uk email). Co-koordinat dan faktor-faktor struktur akan muncul di Protein Data Bank berdasarkan 2AFQ kode aksesi. c 2005 Biokimia Masyarakat

Page 2 22 DJD Johnson dan lain-lain varian trombin dengan fitur struktural yang konsisten dengan mengamati sifat-sifat biokimia trombin lambat. Struktur dari S195A trombin mengungkapkan suatu konfigurasi yang berubah sisi chainsforresiduesTrp 60D , Cys 168 , Cys 182 , Trp 215 andPhe 227 , Terkemuka untuk penyempitan dari situs sumbing aktif di wilayah tersebut aril mengikat saku (-S4 posisi S2) [26]. Ini diikuti oleh struktur varian E217K lambat konstitutif yang berbagi fitur dari S195A dan juga mengungkapkan-katalis hidrogen non bonding di situs aktif disebabkan oleh reposisi dari Na + - loop mengikat [27]. Dalam tulisan ini, kami melaporkan 1,93 Å (1 Å = 0,1 nm) structureofwild-typehumanthrombinsolvedfromcrystalsgrown karena tidak adanya koordinasi kation univalen. Struktur mirip dengan trombin E217K, mengungkapkan diblokir S1 dan S2 saku dan hidrogen non-katalitik-ikatan jaringan diubah di situs aktif. EKSPERIMENTAL Escherichia coli ekspresi trombin manusia Manusia prethrombin-2 itu diungkapkan dan melipatnya dengan beberapa

modifikasi untuk dijelaskan metode sebelumnya [28,29]. Secara singkat, cDNA sesuai dengan urutan-2 prethrombin kloning dari ref clone IMAGE. 6283420 dan subcloned ke pET23 (+) vektor (Novagen) pra-dicerna dengan HindIII dan EcoRI. Setelah transformasi dari vektor-2 prethrombin ke E. coli galur BL21 (DE3) plysS, sel dikultur pada 37 ◦ C dalam 2 × TY (Tryp- nada / ekstrak ragi) kaldu dengan 50 μ g / ml ampisilin dan 34 μ g / ml kloramfenikol ke D 595 dari 0,6, diikuti dengan induksi dengan 1 mM IPTG (β isopropil - D -Thiogalactoside) selama 4 jam Panen sel yang disimpan pada -80 ◦ C. pelet sel Thawed (biasanya dari 2 liter kultur sel) segaris dalam 20 mM Tris / HCl, 1% (v / v) Triton X-100, 20 mM EDTA dan 20 mM DTT (dithiothreitol), pH 7,4, dan disonikasi di atas es di-s semburan 10 untuk total 5 menit. Setelah sentrifugasi pada 20.000 g selama 20 menit, inklusi pelet tubuh yang berurutan dicuci, kemudian disentrifugasi, dengan 20 mM Tris / HCl, 20 mM EDTA dan 20 mM DTT, pH 7,4, pertama yang berisi 1% (v / v) Triton X-100, kemudian mengandung 1,0 M NaCl, dan akhirnya dengan 20 mM Tris / HCl dan 20 mM EDTA, pH 7,4, sendirian. The pelet dicuci itu resuspended dalam 20 ml 7,0 M guanidinium klorida, 20 mM Tris / HCl, EDTA 0,5 mM dan 20 mM DTT, pH 8,0, kemudian desalted menjadi 6 klorida guanidinium M, 20 mM Tris / HCl dan 0,5 mM EDTA, pH 8,0, dan glutathione ditambahkan untuk konsentrasi akhir 5 mengurangi glutathione mM dan 2 mM glutathione teroksidasi, sebelum inkubasi pada suhu kamar selama 3 h. Setelah menyesuaikan pH 5.0, protein dilarutkan adalah didialisis terhadap guanidinium klorida 6,0 M dan 20 mM EDTA, pH 5,0. Refolding diprakarsai oleh tetes demi tetes cairan yang cepat ke 100 vol. 50 Tris / mM, 0,6 M arginin HCl, 20 mM CaCl 2 , 10% (v / v) gliserol dan 0,2% (v / v) Brij58, pH 8,5, di kamar temperatur untuk 24 jam Protein melipat dipekatkan untuk 100 ml menggunakan Da molekul massa 10000 cut-off VivaFlow 200 modul (VivaScience), kemudian didialisis dua kali terhadap 5 liter 25 mM Tris / HCl, 2 mM EDTA, 0,1% (v / v) PEG [poli (etilen glikol)] 6000 di 4 ◦ C semalam. Endapan dihapus oleh sentrifugasi dan penyaringan sebelum pemurnian dengan benar melipat prethrombin-2 pada kolom ml heparin-Sepharose 5 (Amersham Biosciences) eluting dengan gradien 0-1,0 M NaCl. Posisi elusi dengan benar dilipat prethrombin-2

ditentukan dengan mengukur aktivitas amidolytic terhadap berkromogen substrat S-2238 (Chromogenix) setelah aktivasi sampel dari setiap fraksi dengan bisa ular dari carinatus Echis. puncak itu dikumpulkan, diencerkan 5 kali lipat dalam 50 mM Tris / HCl, pH 7,4, dan re-dimurnikan heparin-Sepharose. Prethrombin-2 diaktifkan dengan inkubasi selama 3 jam pada 37 ◦ C dengan bisa ular dari E. carinatus (10% oleh massa) yang telah pra-diobati dengan PMSF menghambat aktivitas protease serin. Setelah-lipat pengenceran 5 dengan 50 mM Tris / HCl, pH 7,4, trombin dimurnikan pada heparin a- Sepharose kolom seperti di atas. Benar refolding protein itu diverifikasi oleh kemampuannya untuk membentuk kompleks stabil SDS-stoikiometri dengan antithrombin (hasil tidak ditampilkan). Kristalisasi, pengumpulan data dan perbaikan Aktif trombin dielusi dari kolom heparin-Sepharose final di sekitar. 650 mM NaCl. Puncak segera dan mantan haustively didialisis terhadap 20 mM Tris / HCl dan 650 mM LiCl, pH 7,4, kemudian terkonsentrasi menjadi 5,7 mg / ml menggunakan ml 2 10000 Da molekul-massa cut-off VivaSpin konsentrator (VivaScience). Kristalisasi adalah dengan difusi uap tetes menggantung terdiri- ing dari 2 μ l trombin dan 2 l μ larutan tergesa-gesa [24% (V / v) PEG 3350 dan 250] magnesium asetat mM. Difraksi- kualitas kristal tumbuh dalam waktu 2-3 hari, dan data yang dikumpulkan pada hari ketujuh setelah percobaan kristal didirikan. Volume dari tetes kristalisasi (4 l μ) tetap tidak berubah sampai untuk 2 bulan, sehingga kondisi di mana kristal diperoleh 2,85 mg / ml trombin, 10 mM Tris / HCl, 325 mM LiCl, 125 mM magnesium asetat dan 12% (v / v) PEG 3350, pH 7.0.Crystalswerewashed, dissolvedinSDSsamplebufferand berjalan di SDS / PAGE untuk memverifikasi bahwa mereka secara eksklusif terdiri utuh trombin α-. Kristal cryoprotected di 300 mM LiCl, magnesium asetat 160 mM, 22% (v / v) PEG 3350 dan 10% (v / v) gliserol sebelum flash-pendinginan sampai 100 K dalam sebuah nitrogen aliran uap. Rendah dan resolusi tinggi dataset dikumpulkan dari kristal tunggal yang telah anil dengan menghalangi cryostream tiga kali selama 3 s, diikuti oleh anil 10-s keempat di Sumber Synchrotron Radiation Daresbury (Warrington, Cheshire, Inggris) stasiun 9.6. Data diolah dengan menggunakan Mosflm, Scala dan Potong [30]. Struktur ini diselesaikan dengan pengganti molekul menggunakan program MolRep [31] dengan -Terikat trombin struktur PPACK asli [16] (aksesi PDB kode 1PPB) sebagai model pencarian, dan dua molekul ditempatkan dalam unit asimetris. Setelah perbaikan tubuh kaku, peta awal yang dihasilkan oleh bersepeda antara bangunan model otomatis utilitas ARP / warp [32] dan penyempurnaan menggunakan Refmac [33]. Yang pertama membangun kembali di XtalView [34] dilakukan pada template trombin struktur (PDB 1XMN kode aksesi) [35] dengan menggunakan peta yang dihasilkan oleh ARP / warp, dalam rangka untuk memperkecil potensi

model bias. perbaikan lebih lanjut dilakukan dengan menggunakan program SSP [34] (versi 1.0), dan NCS pembatasan tidak digunakan. Pengolahan data dan penyempurnaan statistik diberikan dalam Tabel 1. Struktur trombin terikat pada terminal hirudin pep-C- pasang (hirugen, PDB 1HAH kode aksesi [36]) telah dipilih untuk mewakili cepat trombin karena isomorf untuk kristal dari mana Na + mengikat situs-pertama kali diidentifikasi [19], dan karena memiliki celah aktif-situs gratis. Dengan demikian merupakan allosterically diaktifkan trombin struktur melalui pendudukan boththeNa + siteandexositeI.FiguresweremadeusingBobscript [37], Raster3D [38] dan Spock. HASIL DAN PEMBAHASAN Kristalisasi Dari lebih dari 150 struktur trombin disimpan dalam PDB, tidak ada yang dari tipe trombin liar di ketiadaan aktif situs atau inhibitor exosite. The kecenderungan dari trombin untuk menjalani otolisis telah mengharuskan penggunaan inhibitor atau mutagenesis di bawah konsentrasi yang tinggi dan waktu inkubasi yang panjang diperlukan c 2005 Biokimia Masyarakat

Page 3 Struktur kristal trombin lambat 23 Tabel 1 Pengolahan data, perbaikan dan model (PDB kode aksesi 2AFQ) Parameter Nilai Kristal Grup ruang P2 1 2 1 2 Cell dimensi (A) a = 153,34 b = 82,31 c = 50,93 Pelarut konten (%) 41.8 Pengolahan data statistik Panjang gelombang (A) 0,87 (SRS Daresbury, Stasiun 9.6) Resolusi (A) 50.90-1.93 2.03-1.93

Total refleksi 403365 47912 Unik refleksi 49378 7065 Keserbaragaman 8.2 6.8 (I)> /σ <I 4.8 1.1 <I> / Σ (<I>) 14.6 3.0 Kelengkapan (%) 99.9 99.4 R menggabungkan * 0.10 0.55 Model Atom dalam unit asimetris: Protein 4486 Air 478 Gliserol molekul 9 Rata-rata B-faktor (A 2 ) 26.9 Perbaikan statistik 20-1,93 A 2,05-1,93 A Refleksi dalam bekerja / set gratis 47766/1513 7555/250 R-faktor † / R-bebas (%) 19.7/22.9 25.9/29.2 Rmsd obligasi (A) / sudut ( ◦ ) 0.006/1.3 dari hal idealistis Ramachandran plot; residu dalam:

Wilayah yang paling disukai (%) 87.4 Selain itu diijinkan wilayah (%) 11.9 Murah hati memungkinkan wilayah (%) 0.2 Batasan wilayah (%) 0.4 (Cys 220 ) * R menggabungkan = hkl i | Saya hkl - <Saya hkl > | / hkl i <Saya hkl >. † R-faktor = hkl | | F obs | - | F calc | | / hkl | F obs |. toformproteincrystals.Indeed, forthewild-typehumanthrombin diproduksi di kita E. coli ekspresi sistem, kita juga mengamati otolisis dengan kehidupan-setengah dari 48 jam pada 37 ◦ C di hadapan menjenuhkan Na + (3,6 mg / trombin ml pada pH 7,4; hasil tidak ditampilkan). Dengan tidak adanya Na + , Trombin masih rentan terhadap autoly- sis, dan di bawah kondisi yang digunakan untuk kristalisasi (2,85 mg / ml, 325 mM LiCl, magnesium asetat 125 mM dan 10 mM Tris / HCl, pH 7,0, dan 21

◦ C) paruh berhubungan ke ~ 6 hari (hasil tidak ditampilkan). Namun, kristal tumbuh untuk ukuran penuh dalam waktu 2-3 hari dan ditemukan hanya berisi bahan uncleaved dengan SDS / PAGE (Resultsnotshown). Althoughthereisareported K d forthebinding Li + untuk trombin [39,40], literatur lama dan baru-baru ini biofisik penelitian telah menyimpulkan bahwa struktur dan aktivitas trombin tidak dipengaruhi oleh garam lithium [14,15,41]. Selain itu, kami baru-baru ini memecahkan struktur trombin S195A (terikat antithrombin dan heparin) pada 320 mM Li + [42], dan, meskipun Na + - bindingsitewasformed, nodensitycorrespondingtoco-ordinasi kation univalen diamati (lihat Gambar 1S Tambahan di http://www.BiochemJ.org/bj/392/bj3920021add.htm). Untuk menentukan apakah, di bawah kristalisasi saat ini kondisi kami, Li + akan diharapkan untuk menempati Na + mengikat situs-, kita con- menyalurkan titrasi Li + dan Na + ke dalam solusi yang mengandung throm- bin dan MgCl 2 . Kami menemukan bahwa, meskipun Na + afinitas dan fluor- peningkatan escence normal, tidak ada Li + mengikat terdeteksi sampai dengan 500 mM (lihat 2S Gambar Tambahan di http://www. BiochemJ.org/bj/392/bj3920021add.htm). Jadi kita kristal yang diperoleh dari tipe manusia trombin utuh tumbuh liar di tidak adanya koordinasi kation univalen. Secara keseluruhan struktur Dari kristal flash-cooled single kami memperoleh berkualitas tinggi difraksi data ke 1,93 Å resolusi. Pengganti molekul kembali vealed dua molekul trombin di unit asimetris, dan, sebagai monomer masing-masing terdiri dari cahaya dan rantai berat, kedua

monomer yang dilambangkan AB dan CD untuk mencerminkan mengindentifikasi rantai cations.Allofthesubsequentstructuralanalysisappliesequallyto dua monomer dalam unit asimetris. Menariknya, satu-satunya glikosilasi situs di trombin, Asn 60g , Ditemukan untuk menengahi kristal kontak untuk monomer AB, menunjukkan bahwa kristal bisa tidak telah terbentuk dari trombin glikosilasi. Dua monomer pada dasarnya identik sehubungan dengan backbone menyesuaikan- asi di daerah yang mengandung struktur sekunder [rmsd (root deviasi mean square) dari 0,41 Å], dan juga identik dalam wilayah tersebut dengan struktur trombin umumnya dianggap sebagai mewakili trombin cepat (rmsd sebesar 0,7 Å untuk 1PPB, yang -Terikat trombin struktur PPACK asli, dan untuk 1HAH, aktif- trombin bebas situs dihambat oleh terminal hirudin peptida-C [36]). Namun, perbedaan yang signifikan di permukaan fleksibel loop menghasilkan α RMSDs C approx. 3 Å ketika membandingkan monomer AB dengan CD, 1PPB atau 1HAH. Bila lampu fleksibel rantai telah dihapus dari perhitungan, nilai ini berkurang menjadi 0.77 Å untuk CD dan approx. 2 Å untuk 1PPB dan 1HAH. C α jejak AB berwarna menurut rmsd dengan 1HAH diberikan pada Gambar 1 (A). Daerah yang biasanya berbeda antara struktur trombin adalah terminal cahaya rantai-N, C-terminus dan dua loop yang frame situs aktif, 60-loop dan loop-γ (juga dikenal sebagai loop 147 atau loop otolisis). Memang, γ-loop sepenuhnya teratur di kedua AB dan CD, dengan kepadatan tidak teramati untuk residu 143-152, meskipun kehadiran loop utuh telah diverifikasi oleh SDS / PAGE (hasil tidak ditampilkan). Kurangnya kepadatan untuk loop-γ dalam struktur ini konsisten dengan meningkatkan kerentanan proteolitik dalam tidak adanya co-ordinasi Na + [15]. Yang penting, beberapa lainnya daerah ditemukan di konformasi yang menyimpang dari yang ditemukan di trombin cepat. Na + Mengikat loop (Cys 220 -Tyr 225 ) Telah bergeser 6 Å (Asp 222 ), Dan 186-loop berdekatan telah pindah 5 Å (Lys 186d ). Gerakan Na yang + mengikat loop juga mempengaruhi

konformasi dari situs loop aktif (Gly 193 -Ser 195 ) Karena koneksi kovalen melalui ikatan disulfida antara Cys 220 dan Cys 191 . Pergeseran ini telah diamati sebelumnya dalam struktur trombin varian lambat rekombinan E217K [26]. Fleksibilitas keseluruhan trombin telah terbukti meningkatkan karena tidak adanya co-ordinasi Na + [15], dan, konsisten dengan menemukan, kami mengamati beberapa daerah dengan tinggi faktor B-(Gambar- ure 1B). Menariknya, daerah ini sesuai bagi mereka yang telah bergeser konformasi sehubungan dengan trombin cepat (Gambar- ure 1A). Sebuah ketidakmampuan untuk model γ-loop mewakili yang signifikan peningkatan mobilitas, sementara lebih sederhana peningkatan kembali model- gions diberi warna sesuai dengan faktor B-mereka. Kedua loop ad- jacent ke Na + Mengikat loop (186-loop dan γ-loop) adalah sangat teratur, dengan kepadatan kurang untuk loop-γ seluruh, dan the186-loopdifficulttomodelinthepoordensity.Bothloopsform menstabilkan kontak dengan Na + -Mengikat loop dalam bentuk cepat, tetapi reposisi Na + loop diamati dalam studi ini telah melanggar kontak. Menariknya, Na yang + Mengikat dan aktif- loop situs tidak sangat mobile, meskipun pergeseran signifikan dalam mereka konformasi. Hal ini menunjukkan adanya bersama membalik antara dua stabil konformasi untuk loop ini, dengan dua set berbeda kontak stabilisasi. Kualitas kerapatan elektron tinggi untuk ini wilayah dan jaringan yang diamati ikatan hidrogen dukungan hipotesis ini (lihat Gambar 2). Wilayah lain yang pergeseran dalam posisi tidak berkorelasi dengan B-faktor tinggi I. exosite TM mengikat di exosite I dengan afinitas tinggi dan dapat mengkonversi lambat c 2005 Biokimia Masyarakat

Page 4 24 DJD Johnson dan lain-lain Gambar 1 Struktural perbandingan Na

+ -Trombin bebas wild type dengan trombin cepat (A) representasi stereo α C jejak monomer AB berwarna menurut rmsd dengan trombin dalam konformasi cepat normal (1HAH) mengungkapkan suatu keseluruhan dilestarikan lipat, tetapi dengan konformasional perubahan signifikan di daerah tertentu. Jalan warna dari 1 sampai 3 rmsd A, dari abu-abu sampai merah. Trombin ditampilkan dalam orientasi standar, dengan ikatan disulfida dalam kuning, sig- nifikan daerah diberi label, dan situs-Ser aktif 195 digambarkan sebagai sebuah bola hijau. (B) Stereo representasi dari α C jejak monomer AB (dalam orientasi yang sama seperti di atas, dengan bola hijau mewakili Ser 195 , Dan batang kuning menunjukkan ikatan disulfida), berwarna menurut B-faktor, dari abu-abu sampai merah untuk B-faktor antara 20 sampai 40 A 2 . Exosite I ditandai dengan oval. trombin menjadi penggerak yang efektif protein C. alosterik perubahan disebabkan oleh TM mengikat untuk memperlambat trombin adalah setara dengan perubahan disebabkan oleh hirugen (yang juga mengikat dalam exosite I), oleh Na + atau oleh-situs inhibitor aktif [13]. Mobilitas exosite I ob- bertugas di AB bisa menjelaskan efek alosterik dari exosite I- mengikat ligan pada trombin lambat. Situs aktif Trombin dalam ketiadaan Na + koordinasi adalah 'lambat' karena peningkatan K m dan penurunan k kucing menuju peptida dan protein substrat. Fitur-fitur ini dijelaskan dengan baik oleh situs-aktif konformasi diamati dalam struktur ini. Active-situs residu 57, 191-195 dan 214-221 diperlihatkan pada Gambar 2 (A), dengan 2F o -F c kerapatan elektron berkontur di dua kali rmsd peta (2 σ) untuk menggambarkan kualitas tinggi struktur di wilayah ini. B rendah dan berkualitas faktor kepadatan tinggi karena jaringan of-ikatan interaksi hidrogen, yang ditunjukkan pada Gambar 2 (B), yang menghasilkan signifikan memblokir dari celah-situs aktif dan penataan dari situs geometri aktif. Glu 192 telah bergeser

approx. 3 Å membuat dimediasi ikatan hidrogen air antara oksigen yang rantai samping dan rantai samping dari Ser 195 dan Nya 57 dan rantai oksigen utama Ser 214 , Dan ikatan hidrogen langsung dengan-rantai nitrogen utama Gly 216 . Selain itu, tulang punggung konformasi Glu 192 sekarang menempatkan-rantai oksigen utama dalam posisi- tion untuk hidrogen-ikatan dengan baik rantai samping dan rantai utama Ser 195 , Sehingga rendering Ser 195 non-katalitik. Lubang oxyanion adalah juga signifikan mengatur kembali dalam struktur ini, dengan rantai-utama nitrogen Ser 195 hidrogen terikat pada rantai oksigen utama Glu 192 , Dan, sebagai tambahan, pergerakan Glu 192 telah reorientasi Gly 193 sehingga hidrogen-obligasi Asp 221 (Melalui air molekul). Ini situs baru aktif-hidrogen-ikatan konfigurasi menjelaskan secara signifikan mengurangi k kucing dari trombin dalam ketiadaan of-ordinasi Na co + . Peningkatan K m juga sama dijelaskan. Gambar 3 menunjukkan representasi permukaan trombin dalam standar the- dard orientasi (aktif-situs-menghadap, sehingga substrat mengikat dari kiri ke kanan dari N-ke C-Termini). Perbandingan cepat trombin (1HAH; Gambar 3A) yang sama dengan trombin monomer AB (Gambar 3B) mengungkapkan penyempitan dari saku S1 dan S2 yang akan menyebabkan luas sterik tumpang tindih dengan residu P1 dan P2 c 2005 Biokimia Masyarakat

Page 5 Struktur kristal trombin lambat 25 Gambar 2 situs aktif Na + type trombin bebas liar-adalah non-katalitik (A) stereo representasi kerapatan elektron (biru) residu sekitar 57, 191-195 dan 214-221 berkontur di 2 σ menunjukkan kualitas tinggi struktur di situs daerah aktif. Karbon atom ditunjukkan dengan warna kuning, oksigen merah, nitrogen dalam, belerang dalam warna hijau, dan air biru magenta. (B) interaksi-ikatan hidrogen di situs aktif sangat luas dan non-katalitik (hijau rusak baris). Penting bagi aktivitas trombin adalah gerakan Glu 192 , Yang menghasilkan rantai ikatan hidrogen-utama untuk rantai-sisi H γ dan main-rantai N-H Ser 195 , dan membalik dari mitra lubang oxyanion Gly 193 . Atom-atom yang biasanya merupakan lubang oxyanion (Gly 193 dan Ser 195 nitrogen) ditandai dengan panah. (C) Sebuah superposisi yang sama aktif-situs residu untuk Na + type trombin bebas liar--(kuning), E217K varian rekombinan lambat trombin (cyan) dan trombin cepat normal (magenta) menggambarkan sifat radikal dari situs aktif gangguan yang disebabkan oleh tidak adanya Na + . The-situs geometri aktif juga sama terganggu untuk varian E217K, tapi orientasi tegak lurus dari rantai sisi trp 215 lebih lanjut blok aktif situs. Orientasi trp 215 sisi rantai di Na + free trombin-sejajar dengan yang trombin cepat, tetapi telah membalik 180 ◦ untuk membentuk ikatan hidrogen dengan Glu 217 (Lihat B). dari substrat potensial. Dengan demikian struktur Na + Trombin bebas disajikan di sini memiliki arsitektur aktif-situs berubah mengarah ke non-katalitik-ikatan hidrogen jaringan dan memblokir sterik

dari saku mengikat substrat. Kami baru saja memecahkan struktur konstitutif lambat trombin varian E217K, ditunjukkan untuk perbandingan pada Gambar 2 (C), di mana kita mengamati oklusi yang sama dari situs aktif sumbing karena pergerakan Na + Mengikat loop dan residu Glu 192 . Meskipun lubang oxyanion terganggu oleh sama interaksi, the-situs Ser aktif 195 diamati dalam kontak langsung dengan rantai samping dari Glu 192 . Efeknya adalah agak lebih dramatis menghalangi dari saku S1 (Gambar 3C). Selain itu, Trp 215 diamati dalam orientasi tegak lurus yang normal konformasi diamati, mengakibatkan obstruksi sebagian dari c 2005 Biokimia Masyarakat

Page 6 26 DJD Johnson dan lain-lain Gambar 3 Permukaan representasi trombin mengungkapkan pemblokiran dari saku mengikat substrat (A) Pandangan stereo permukaan trombin cepat (PDB kode aksesi 1HAH; hijau berwarna untuk hidrofobik), dalam orientasi standar, menunjukkan celah aktif-situs terbuka yang kompeten dalam mengikat substrat peptida (yang ditampilkan di sini sebagai batang adalah daerah-P2 P4 dari pusat loop reaktif dari HCII dari kode aksesi 1JMO PDB). Situs aktif ditandai dengan mewarnai γ atom O dari Ser 195 merah, dan mengikat saku aril ditunjukkan dengan cara yang sama dengan mewarnai seluruh trp 215 residu cyan. (B) Sebaliknya, situs belahan aktif Na + -Free wild type trombin berada dalam ditutup konformasi lebih banyak dengan kantong S1 dan S2 secara signifikan diblokir. Pembatasan ini terlihat dari tumpang tindih substrat dan menguburkan dari serin katalitik (merah). (C) yang sama representasi dari trombin lambat rekombinan (E217K) menunjukkan oklusi lebih besar bahkan dari situs aktif, dan memblokir lebih dari mengikat saku aril (S2-S4) oleh reorientasi dari trp 215 sisi rantai (cyan).

c 2005 Biokimia Masyarakat

Page 7 Struktur kristal trombin lambat 27 aril mengikat saku (S2-S4) (Gambar 3C). Kami mengamati serupa orientasi trp 215 dalam struktur sebelumnya trombin S195A [25]. Dalam struktur yang disajikan di sini, kita tidak melihat halangan mengikat dari saku aril, sebagai trp 215 adalah dalam konfigurasi paralel. Namun, seperti yang terlihat pada Gambar 2 (C), rantai sisi trp 215 adalah membalik 180 ◦ sehubungan dengan konformasi dalam trombin cepat. The Alasan untuk hal ini konformasi baru ini ikatan hidrogen dengan Glu 217 , diilustrasikan pada Gambar 2 (B). Interaksi ini tidak dapat dibentuk oleh yang E217K varian, menyebabkan trp 215 untuk mengadopsi suatu konformasi yang lebih lanjut occludes the-situs celah aktif dan membantu menjelaskan berkurang kegiatan varian relatif terhadap Na + -Trombin bebas wild type. Kesimpulan Struktur tipe manusia trombin-liar di Na + Bebas negara yang disajikan di sini adalah konsisten dengan sifat-sifat yang dianggap berasal dari dengan bentuk yang lambat trombin: (i) ia memiliki lebih tertutup aktif- situs sumbing dengan menghalangi dari saku S1 dan S2, menjelaskan peningkatan K m , (Ii) situs aktif ditemukan di non-katalitik hidrogen-bondingnetwork, k explainingthereduced kucing , (Iii) trp 215 berada dalam konformasi yang berbeda dari bentuk cepat, menjelaskan perubahan kuantum menghasilkan fluoresensi; (iv) permukaan loop lebih fleksibel, konsisten dengan data biokimia baru-baru ini [15]; dan (v) Na yang +

mengikat loop-berada dalam konformasi berbeda dengan ditemukan di Na + -Terikat negara. Selain itu, struktur Na + - trombin wild type bebas adalah sama dengan yang lambat rekombinan trombin varian E217K. Struktur ini menunjukkan bahwa masyarakat miskin efisiensi katalitik trombin dalam ketiadaan Na + mencerminkan keseimbangan antara negara lembam, seperti yang dijelaskan di sini, dan keadaan aktif, dimana pengaruh Na + Selain itu adalah untuk menarik kesetimbangan ke arah kanan dan mempromosikan populasi aktif negara. data flow Berhenti mendukung model keseimbangan dengan menunjukkan bahwa sepertiga dari trombin dalam ketiadaan Na + tidak mampu mengikat baik Na + atau-situs inhibitor aktif [13]. Tinggi konsentrasi Na + atau inhibitor mengakibatkan yang sama membatasi rate, yang diinterpretasikan sebagai tingkat nol-order konversi dari negara inert ke-kompeten negara mengikat. The konformasi aktif negara telah dikenal selama puluhan tahun; yang negara inert kini telah terungkap. Pendanaan untuk Jah diberikan oleh Medical Research Council (Inggris) dan Inggris Yayasan Jantung, dan TEA didukung oleh dana dari Isaac Newton Trust (Cambridge, Inggris). Kami berterima kasih RJ Baca untuk membantu dengan menjalankan ARP / Warp. DAFTAR PUSTAKA 1 Stubbs, MT dan Bode, W. (1993) Seorang pemain dari banyak bagian: lampu sorot jatuh pada trombin's struktur. Thromb. Res,. 69 1-58 2 Bode, W. (2005) Struktur trombin, seorang seperti proteinase bunglon. J. Thromb. Haemostasis, doi: 10.1111/j.1538-7836.2005.01356.x 3 Esmon, CT (1987) Pengaturan jalur antikoagulan alami. Science 235, 1348-1352 4 Esmon, CT (2003) Jalur protein C. Dada 124, 26s-32S 5 Huntington, JA (2005) mekanisme pengakuan molekuler trombin. J. Thromb. Haemostasis 3, 1861-1872 6 Lane, DA, Philippou, H. dan Huntington, JA (2005) trombin Pengurus. Darah 106, 2605-2612 7 Fuentes-Prior, P., Iwanaga, Y., Huber, R., Pagila, R., Rumennik, G., Seto, M., Morser, J., Cahaya, DR dan Bode, W. (2000) dasar struktur untuk aktivitas antikoagulan dari trombin-thrombomodulin kompleks. Nature (London) 404, 518-525

8 Rezaie, AR dan Yang, L. (2003) Thrombomodulin allosterically memodulasi aktivitas trombin antikoagulan. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 12051-12056 9 Lu, G., Chhum, S. dan Krishnaswamy, S. (2005) Afinitas C protein untuk trombin the- kompleks thrombomodulin ditentukan dengan cara primer aktif situs-tergantung interaksi. J. Biol. Kimia,. 280 15471-15478 10 Dang, OD, Vindigni, A. dan Di Cera, E. (1995) Saklar alosterik mengontrol procoagulant dan antikoagulan kegiatan trombin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5977-5981 11 Wells, CM dan Di Cera, E. (1992) Thrombin adalah sebuah Na + -Enzim diaktifkan. Biokimia 31, 11721-11730 12 Orthner, CL dan Kosow, DP (1980) Bukti bahwa trombin manusia-α adalah monovalen kation-enzim diaktifkan. Arch. Biochem. Biophys,. 202 63-75 13 Lai, MT, Di Cera, E. dan Shafer, JA (1997) jalur Kinetic untuk lambat untuk berpuasa transisi trombin: bukti terkait ligan mengikat pada domain struktural yang berbeda. J. Biol. Kimia,. 272 30275-30282 14 Villanueva, GB dan Perret, V. (1983) Pengaruh natrium dan garam lithium pada trombin manusia konformasi α-. Thromb. Res,. 29 489-498 15 De Filippis, V., De Dea, E., Lucatello, F. dan Frasson, R. (2005) Pengaruh Na + mengikat konformasi, stabilitas dan pengakuan sifat molekul trombin. Biochem. J. 390, 485-492 16 Bode, W., Mayr, I., Baumann, U., Huber, R., Batu, SR dan Hofsteenge, J. (1989) halus 1.9 Struktur kristal α-trombin manusia: interaksi dengan D -Phe-Pro-Arg chloromethylketone dan signifikansi dari Pro-Pro-trp penyisipan segmen-Tyr. EMBO J. 8, 3467-3475 17 Arosio, D., Ayala, YM dan Di Cera, E. (2000) Mutasi kompromi W215 trombin pembelahan fibrinogen, tetapi tidak PAR-1 atau protein C. Biokimia 39, 8095-8101 18 Di Cera, E., Guinto, ER, Vindigni, A., Dang, QD, Ayala, YM, Wuyi, M. dan Tulinsky, A. (1995) Na The + situs mengikat trombin. J. Biol. Chem. 270, 22089-22092 19 Zhang, E. dan Tulinsky, A. (1997) Lingkungan molekul Na + mengikat situs trombin. Biophys. Kimia,. 63 185-200 20 Gibbs, CS, Coutre, SE, Tsiang, M., Li, WX, Jain, AK, Dunn, KE, Hukum, VS, Mao, CT, Matsumura, SY dan Mejza, SJ (1995) Konversi trombin menjadi

antikoagulan oleh rekayasa protein. Nature (London) 378, 413-416 21 Tsiang, M., Paborsky, LR, Li, WX, Jain, AK, Mao, CT, Dunn, KE, Lee, DW, Matsumura, SY, Matteucci, MD, Coutre, SE et al. (1996) Protein engineering trombin untuk spesifisitas optimal dan potensi aktivitas antikoagulan in vivo. Biokimia 35, 16449-16457 22 Cantwell, AM dan Di Cera, E. (2000) desain Rasional dari antikoagulan ampuh trombin. J. Biol. Kimia,. 275 39827-39830 23 Gruber, A., Cantwell, AM, Di Cera, E. dan Hanson, SR (2002) trombin mutan W215A/E217A menunjukkan dan kuat antikoagulan aman dan efek antitrombotik in vivo. J. Biol. Kimia,. 277 27581-27584 24 Pineda, AO, Carrell, CJ, Bush, LA, Prasad, S., Caccia, S., Chen, ZW, Mathews, FS dan Di Cera, E. (2004) Molecular pembedahan Na + mengikat trombin. J. Biol. Kimia,. 279 31842-31853 25 Pineda, AO, Savvides, S., Waksman, G. dan Di Cera, E. (2002) Crystal Struktur lambat antikoagulan bentuk trombin. J. Biol. Kimia,. 277 40177-40180 26 Huntington, JA dan Esmon, CT (2003) Dasar molekul allostery trombin diungkapkan oleh 1,8 A struktur lambat "bentuk". Struktur 11, 469-479 27 Carter, WJ, Myles, T., Gibbs, CS, Leung, LL dan Huntington, JA (2004) Crystal E217K varian struktur trombin antikoagulan memberikan wawasan ke dalam trombin allostery. J. Biol. Kimia,. 279 26387-26394 28 Soejima, K., Mimura, N., Yonemura, H., Nakatake, H., Imamura, T. dan Nozaki, C. (2001) Sebuah refolding metode yang efisien untuk persiapan manusia prethrombin rekombinan-2 dan karakterisasi α-trombin diturunkan-rekombinan. J. Biochem. (Tokyo) 130, 269-277 29 DiBella, EE, Maurer, MC dan Scheraga, HA (1995) Ekspresi dan pelipatan sapi prethrombin rekombinan-2 dan aktivasi untuk trombin. J. Biol. Chem. 270, 163-169 30 Leslie, AWG (1992) Bersama CCP4 dan ESF-EACMB Newsletter pada Protein Kristalografi No 26, SERC, Laboratorium Daresbury, Warrington 31 Vagin, A. dan Teplyakov, A. (2000) Sebuah pendekatan untuk copy pencarian multi molekul penggantian. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr,. 56 1622-1624 32 Perrakis, A., Morris, R. dan Lamzin, VS (1999) Automated protein pembentukan model dikombinasikan dengan perbaikan struktur iteratif. Nat. Struct. Biol,. 6 458-463 33 Murshudov, GN, Vagin, AA dan Dodson, EJ (1997) Perbaikan makromolekul struktur dengan metode-kemungkinan maksimum. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 53, 240-255 34 Brunger, AT, Adams, PD, Clore, GM, Delano, WL, Gros, P., Grosse-Kunstleve, RW, Jiang, JS, Kuszewski, J., Nilges, M.,, Pannu NS et al. (1998) Kristalografi & NMR sistem: suite perangkat lunak baru untuk penentuan struktur makromolekul. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr,. 54 905-921 35 Carter, WJ, Cama, E. dan Huntington, JA (2004) Struktur kristal trombin terikat untuk heparin. J. Biol. Kimia,. 280 2745-2749

c 2005 Biokimia Masyarakat

Page 8 28 DJD Johnson dan lain-lain 36 Skrzypczak-Jankun, E., Carperos, VE, Ravichandran, KG, Tulinsky, A., Westbrook, M. dan Maraganore, JM (1991) Struktur hirugen dan hirulog 1 kompleks α-trombin. J. Mol. Biol,. 221 1379-1393 37 Esnouf, RM (1997) Sebuah diubah versi ekstensif dari MolScript yang termasuk sangat meningkatkan kemampuan mewarnai. J. Mol. Graphics Modell. 15, 132 38 Merritt, EA dan Murphy, MEP (1994) Raster3D Versi 2.0: sebuah program untuk fotorealistik molekul grafis. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr,. 50 869-873 39 Guinto, ER dan Di Cera, E. (1997) peran Kritis W 60D di allostery trombin. Biophys. Kimia,. 64 103-109 40 Prasad, S., Cantwell, AM, Bush, LA, Shih, P., Xu, H. dan Di Cera, E. (2004) Residu Asp-189 kontrol baik pengikatan substrat dan spesifisitas kation monovalen dari trombin. J. Biol. Kimia,. 279 10103-10108 41 Landis, BH, Koehler, KA dan Fenton, JW (1981) thrombins Manusia: Kelompok IA dan IIA garam-tergantung sifat α-trombin. J. Biol. Chem. 256, 4604-4610 42 Li, W., Johnson, DJ, Esmon, CT dan Huntington, JA (2004) Struktur trombin-heparin terner kompleks-antithrombin mengungkapkan mekanisme antitrombotik heparin. Nat. Struct. Mol. Biol,. 11 857-862 Diterima 27 Juli 2005 / 15 September 2005; diterima 4 Oktober 2005 Diterbitkan sebagai Segera Diumumkan BJ 4 Oktober 2005, DOI: 10.1042/BJ20051217 c 2005 Biokimia Masyarakat

Teks asli Inggrisating protein C. The specificity of thrombin is primarily regulated

Sarankan terjemahan yang lebih baik