VARIASI GENETIK EMPAT VAR. PADI UNGGUL DENGAN ANALISIS RAPD

MENGGUNAKAN 2 PRIMER OPR OLEH :

Panagal M*., John B*., Arun K.**, Ali A.*** DKK.*Dept. BIOTEK. LINGK., Plant Science Univ. BHARATHIDASAN, TAMIL NADU, INDIA.

**Dept. BIOTEKNOLOGI, PERG. TINGGI Marudhu Pandiyar, TAMIL NADU, INDIA.*** Dept. Kimia, Univ. Nasional PUKYONG, BUSAN KOREA SELATAN.

Sumber : ARPN Journal Of Agricultural and Biological ScienceVol. 5, No. 4, July 2010

Dikaji kembali :BAMBANG SURYOTOMO(Surakarta, 28 Juni 2013)

(TUGAS BIOMOL & REKAYASA GENETIKA)

RINGKASAN-1

1. Untuk mengetahui keanekaragaman Genetik 4 Genotipe Padi (Oryza sativa ) digunakan Marker (Penanda) acak RAPD.

2. Genom DNA Padi (O. sativa ) diisolasi dari daunnya, dan dihitung menggunakan Spktrofotometer sinar UV serta diampliflikasi dgn menggunakan Primer OPR1 dan OPR2.

3. Dgn OPR1, Genom DNA 4 Genotipe Padi yg diamplifikasi, memberikan fragmen yang Non-Polymorfik (tidak dapat membedakan dari keempatnya).

RINGKASAN-2

4. Dgn OPR2, Genom DNA dari 4 Genotipe yg diam-plifikasi, menujukkan fragment yg Polymorfik. (dapat membedakan dari keempatnya).

5. Dgn menggunakan Software Jarak Genetik Nei’s (1978) dapat ditentukan variasi kekerabatan Genotipe padi yg diuji.

6. Kekerabatan Genotipe padi yg diuji secara berurutan adalah: ADT38, ASD16, IR20 dan PONNI (Gb.4)

7. Dari hasil tsb dapat digunakan sebagai bahan pertim-bangan untuk menghasilkan Hibrida dgn Heterosis yang maksimum (yg diinginkan).

PENDAHULUAN-1

• Beras mrpk tan.penting di dunia, menyediakan banyak kalori. Saat ini 90% beras diproduksi dan dikonsumsi di Negara-2 Asia (Parantha-man et al., 2009).

• Di India, dalam tahun 2003-2004, 87 juta ton beras, yg dipro-duksi dari daerah 42,41 juta ton (James Martin, 2007).

• Permintaan beras diperkirakan pd thn 2010, 100 juta ton dan akan meningkat menjadi 140 juta ton pd thn 2025 (Singh, 2004).

• Beras memp. Genom terkecil dr semua jenis cereal; 430 juta Nukleotida, dapat menjadi model genom tanaman berbunga

PENDAHULUAN-2

1. Genotipe ADT 38 Adaptip pada wil.dgn Irigasi yg tidak teratur Tahan thd embusan angin, tahan belalang,

Gall midge, Daya hasil = 58kw/ha2. Genotipe ASD 16 Toleran salinitas, cenderung tahan Wereng

coklat, kutu busuk. Daya hasilnya 56 = kw/ha

PENDAHULUAN-3

3. PONNI Tahan thd hama bakteri daun, Virus tungro,

penggerek batangDaya hasil 45 kw/ha.4. IR 20Tahan thd hama bakteri daun, Virus tungro,

penggerek batangDaya hasil 45 kw/ha.

PENDAHULUAN-4• Saat ini PCR (Polymeration Chain Reaction)

berbasis RAPD (Randomly Amplified Polymor-phic DNA) lebih murah & sederhana diban-dingkan RFLP (Retriction Fracment Length Polymorphism) (William et al., 1990).

• Keuntungan RAPD, sederhana, DNA sedikit, mampu meregenerasi polymorfisme.(Yu& Ngu yen, 1994). Memp.Primer Universal, butuh primer sedikit unt. Identifikasi polymorfisme suatu Spesies. Krn itu penel. Ini dilakukan

Bahan dan Metoda-1

1. Bahan Tanaman Empat Var. biji O. sativa yi, PONNI, ADT38, IR20, & ASD 16, Diperoleh dari Bank-benih dr Univ. Pertanian , India. Benih ditanam dalam pot pada kondisi laboratorium.

2. Isolasi Genom DNA Metode Isolasi menurut Sambrook et. Al., (1989) dgn sedikit

modifikasi. Contoh daun tan. (0,5 g/kg) digiling dgn 1 ml buffer yg homogen.

1 ml sample lysis kmd disentrifugasi pada kecep.8000 rpm selama 10 menit pada suhu 4⁰ C. Supernatan dipindahkan dalam tabung baru berukran 1,5 ml dan dicampur dngn Fenol, Isoamyllalcohol disentrifugasi pada 1.000 rpm selama 10 Menit pada suhu 4⁰

Bahan dan Metoda-2

3. Gel Elektrofrensis15 µl DNA dicampur dgn Pewarna bermuatan

(Genei, Bangalore), dan diloading pd 0.8% Gel Agarosa.

Genomik DNA dielektroforensis pd 75 Volt selama 1 jam, dan Amplifikasi PCR dilakukan selama 1-2 jam pd 55 Volt.

Gel diwarnai dgn Etidium Bromida dan disinari dengan UV untuk visualisasinya (Bend2nya)

Bahan dan Metoda-3

4. Penghitungan DNA dgn Spektrofotometer UV

Sampel DNA yg diisolasi diukur dgn Spektrofotometer sinar tampak UV. Dgn absorbansi pada 260-280 nm, maka Konsentrasi DNA dapat ditentukan.

Konsentrasi DNA = OD260 x 50 µg/ml x faktor pengenceran.

5. Primer Primer Acak disintesis di Genei Bangalore. Panjang masing2 Primer 10 bp (pasang basa), dgn urutan sequen

sbb: Primer Sequence

OPR1 GCACCGATCT

OPR2 GATTCCGCGG

Bahan dan Metode-4

6. Reaksi RAPD-PCR Reaksi amplifikasi dilakukan men. Saker et al. (2005) dgn

sedikit modifikasi, yg berisi Template (1.5 µl), Primer (1 µl), Campuran Enzim induk (12,5 ml) dan Air Milli Q (10 ml).

Amplifikasi dilakukan pd siklus termal DNA pd profile PCR; Pre denaturasi pd 94⁰C selama 5 menit, 36 siklus pd 94⁰C selama 30 dtik, 36⁰C selam 30 dtk dan 72⁰C selama 1 menit dan akhir ekstensi pd 72⁰C selama 5 menit, produk akhirnya diamplifikasi pd 4⁰C.

15 µl produk (DNA) diamplifikasi pd 2% Gel Agarosa dgn Ethidum Bromida. Elektroforensis tampak pd sinar UV

Bahan dan Metoda-5

7. Analisis Data Analisis dilakukan dgn membandingkan Pola RAPD

setiap individu Genom DNA sempel. Fragmen yg memberikan marker jelas/kuat untuk

setiap individu diberi skor shg muncul pd grafik data. Pola pita Gen dievaluasi berdasarkan Jarak Genetik

Nei’s (1978) dgn Program Free-Tree-Free (Pavlicek et al., 1999).

Pohon Filogenetic dibuat dengan bantuan Software

Hasil dan Pembahasan-1

1. Genom DNA padi yg diisolasi dan diuji dg. Elelektroforensis, menghasilkan pita yang beragam dgn konsentrasi 3,8-93 ng.(Gbr. 1).

2. Dgn Primer OPR1 Genom 4 Var yg diuji menghslkan 27 pita yg memp. 300-1600 ps basa (bp),Primer tsb Tidak Bisa membedakan genom ke-4 Var. Padi yg diuji (dgn Primer OPR1 Amplifikasi Genon DNA Padi yg diuji, menunjukkan Non Polymorphic, pola pita identik, gbr. 2).

Hasil dan Pembahasan - 23. Dgn Primer OPR2, hsilnya lebih informatif di-

banding Primer OPR1, artinya dgn Primer OPR2 dapat menunjukkan Pola pita yg ber-beda dari 4 Var. Genom padi yg diuji. (gb.3).

4. Analisis RAPD dgn Primer OPR2 yg memp. sequence GATTCCGCGG dpt digunakan untuk membedakan pola pita genom DNA padi yg diuji dan menganalisis hub. kekerabatan (dgn menggunakan Dendrogram UPGMA, Gb. 4).

Ilustrasi PCR berbasis RAPD

Ilustrasi Genomic DNA

Hasil Analisa Elektroforensis GENOM DNA Padi (Oryza sativa) yg diuji (Gb. 1)

1.ADT38 = 89 ng2.ASD16 =100 ng3.PONNI = 88.3 ng4.IR20 = 93 ng

Amplifikasi dgn OPR-1 (Non Polymorfic) (Gb.2)

Amplifikasi dgn OPR1 ‘tdk bisa’ membedakn antar Genom DNAM = 1 Kb DNA Ladder1= ADT382= ASD163= IR204= PONNI

Amplifikasi dgn OPR-2 (Polymorfic) (Gb.3)

Dgn Primer OPR2, dpt membedakan antar Genotipe PadiM = 100 bp DNA Ladder1= ADT382 = ASD163 = IR204 = PONNI

HUBUNGAN KEKERABATAN BERDSRKAN JARAK GENETIK 4 GENOTIPE PADI (Oryza sativa) (Gb.4)

Gb. 4. Dendrogram UPGMA Nei’s(1978), mengukur jarak genetic diantara 4 sampel O. sativa hasil analisis RAPD

Hubungan kekerabatan (jarak genetic) populasi EMPAT GENOTIPE. Padi (Oryza sativa ), tampak berbeda

diukur berdasar ‘Jarak genetic Nei’s (1978)’.

PONNI IR20 ADT38 ASD16

PONNI0.39138 1.77767 1.02564

IR200.39138 1.60944 1.95601

ADT381.77767 1.60944

ASD161.02564 1.95601 0.8574

KESIMPULAN-1

1. Dgn analisis PCR berbasis RAPD dpt menduga keragaman dan hubungan genetik antar spesies dari Oryza sativa

2. Dgn dua Primer (OPR1 & OPR2) dpt me-ngungkap keragaman genetic Genotipa Padi (Oryza sativa ).

3. Urutan keragaman genetik padi yg diteliti adl: ADT38, ASD16, IR20 dan PONNI. (dari pohon Filogenik)

KESIMPULAN-2

4. Jarak genetik terjauh terdapat antara Genoti-pa ASD16 dgn IR20 (1.95601).

5. Jarak genetik terdekat terdpt pada Genotipa PONNI dgn IR20 (0.39138).

6. Analisis dgn PCR berbasis RAPD merupakan penelitian yg murah dan terbaik mengetahui keragaman Genetik Spesies baru.

PENUTUP

Pertanyaan :1. Mengapa data fenotipe (daya hasil, tingkat

serangan) tidak disertakan dalam analisis? Mungkin hasil lebih memp. Arti bagi Breeder.

2. Genotipe Uji yg digunakan sedikit, kalau genotipe ditambah, mungkinkah Primer OPR1 yg digunakan dapat Polymorfis?.

Wassalamu’alaikum Wr. Wb.