UJI SENSITIVITAS

Uji Kepekaan Terhadap Antimikroba

Uji kepekaan terhadap antimikroba dimulaiketika pertemuan yang diprakarsai WHO di Genewa (1977), kepedulian terhadap semakin luasnya resistensi antimikroba baik yang berhubungan dengan infeksi manusia atau hewan. Hal ini mencetuskan programsurveilanceuntuk memonitor resistensi antimikroba menggunakan metode yang sesuai. Dengan tes kepekaan terhadap antimikroba akan membantu klinisi untuk menentukan antimikroba yang sesuai untuk mengobati infeksi. Untuk mendapatkan hasil yang valid, tes kepekaan harus dilakukan dengan metode yangakurat dan presisi yang baik, dimana metode tersebut langsung dapat digunakan dalam menunjang upaya pengobatan. Kriteriayang penting dalam metode tes kepekaan adalah hubungannya dengan respon pasien terhadap terapi antimikroba.Dari pertemuan tersebut WHOmerekomendasikanpenggunaan teknik difusi Kirby-Bauer yang telah diperkenalkan pada tahun 1976, metode tersebut sangat sesuai khususnya untuk golonganEnterobactriaceae, tetapi dapat pula digunakan untuk semua bakteri pathogen.Pada prinsipnya tes kepekaan terhadap antimikroba adalah penentuan terhadap bakteri penyebab penyakit yang kemungkinan menunjukkan resistensi terhadap suatu antimikroba atau kemampuan suatu antimikroba untuk menghambat pertumbuhan bakteri yang tumbuh in vitro, sehingga dapat dipilih sebagai antimikrobayang berpotensi untuk pengobatan.

Faktor lingkungan yang berpengaruh terhadap tes kepekaanPenentuan tes laboratorium terhadap mikroorganisme, untuk hasil yang lebih akurat harus memperhatikan faktor fisika dan kimia yang mempengaruhi baik terhadap mikroorganisme ataupun pengaruh terhadap daya kerja antimikroba, sehingga harus dihindarifaktor-faktor lingkungan yang kemungkinan merpengaruhi,Faktor lingkungan tersebut diantaranya:1.pHBeberapa antimikroba dipengaruhi oleh pH lingkungan, contohnyaaktifitas antibakteri eritromisindan aminoglikosida berkurang apabila terjadipenurunan pH, sedangkan aktifitas tetrasiklin akan menurun bila terjadi peningkatan pH. Aktifitas aminoglikosida yang daya kerjanya menghambat sintesis protein bakteri melalui membran sel dengan proses oksidasi, sehingga apabilatidak terdapat oksigen akan mengurangi aktifitas antimikroba tersebut.2.KationAktifitas aminoglikosida juga dipengaruhi oleh konsentrasi kation Ca++dan Mg++. Tahapan aktifitas antimikroba yang penting adalah absorpsi antimikroba ke permukaan sel bakteri. Aminoglikosida bermuatan positif dan bekerjaterutama untuk bakteri gram negatif,misalnya membran luarPseudomomonas aeruginosayang bermuatan negatif3.Tersedianya bahan gizi tertentuBahan gizi tertentu dapat mempengaruhi aktifitas antimikroba, misalnya bakteri enterococcus mampu menggunakan timindan asam folat hasil metabolisme untuk menghindari pengaruh aktifitassulfoamida dan trimetroprim, yang dihambat olehjalur metabolik asam folat.

Informasi mengenai resistensi yang kemungkinan berasal dari lingkungandigunakan untuk membuat metoda standaryang dapat mengurangi pengaruh faktor lingkungan terhadap bakteriuji, sehingga pemeriksaan lebih akurat.

Tujuan pengendalian faktor lingkungan1.Hambatan pertumbuhan berkaitan dengan aktifitas antimikroba melawan bakteri uji dan tidak dibatasi oleh bahan gizi, suhu dan kondisi lingkungan lainnya yang dapat menghalangi pertumbuhan, sehingga dapat dipastikan hambatan pertumbuhan hanya disebabkan oleh antimikroba yang digunakan.2.Mengoptimalkankondisi untuk pemeliharaan keutuhan dan aktifitas antimikroba sehingga dapat dipastikan kegagalanmenghambatpertumbuhan bakteri disebabkan oleh keresistenan bakteri itu sendiri tapi bukan dari pengaruh lingkungan yang membuat antimikroba inaktif.3.Untuk mempertahankan hasil konsisten yang berulang (reproducibilitydanconsistency) sehingga organisme yang sama akan memperlihatkan hasil kepekaan yang sama, terhadap metode uji laboratorium yang digunakan

Pengujian dilakukan di bawah kondisi standar, dimana kondisi standar berpedoman kepadaClinical and Laboratory Standards Institute(CLSI). Standar yang harus dipenuhi yaitu: konsentrasi inokulum bakteri, media perbenihan (Muller Hinton) dengan memperhatikan pH, konsentrasikation, tambahan darah dan serum, kandungan timidin, suhu inkubasi, lamanya inkubasi dan konsentrasi antimikrobaWalaupun kondisi penting untuk pemeriksaan invitro telah distandarkan namun tidak ada kondisi invitro yangmengambarkan kondisi yang sama dengan keadaan invivo tempat yang sebenarnya bakteri tersebut menginfeksi. Dengan demikian ada beberapa faktor yang memegang peranan penting daripasien disamping hal-hal yang dapat mempengaruhi hasil uji kepekaanyang telah diperhitungkan pada metode uji. Faktor tersebut yaitu:a.Difusiantimikroba pada sel dan jaringanhospesb.Protein serum pengikat antimikrobac.Gangguan dan interaksi obatd.Status daya tahan dan system imun pasiene.Mengidap beberapa penyakitsecara bersamaanf.Virulensi dan patogenitas bakteri yang menginfeksig.Tempat infeksi dan keparahan penyakit

Dasar pemeriksaan uji kepekaan1.Merupakan metode yang langsung mengukur aktifitas satu atau lebih antimikrobaterhadap inokulum bakteri2.Merupakan metode yang secara langsung mendeteksi keberadaan mekanisme resitensi spesifik pada inokulum bakteri3.Merupakan metode khusus untuk mengukur interaksi antara mikroba dan antimikroba

Metode-metode pengukuran aktifitas antimikrobaKemampuan antimikroba dalam melawan bakteridapat diukur menggunakan metode yang biasa dilakukan yaitu :A.Metode konvensional:dilusi (agar atau kaldu),difusi danEtestB.Uji kepekaan komersial

Persiapan sebelum uji dilakukanBeberapa persiapan yang diperlukan untuk melaksanakan ujidengan metode dilusi dan difusiyaitu meliputi persiapan inokulum dan antimikroba yang akan digunakan

Persiapan inokulumPersiapan inokulum yang tepat penting untukuji kepekaan untuk mendapatkan hasil yang akurat dan konsisten. Ada dua persiapan yang harus dilakukan yaitu: biakan murni dan pembuatan inokulum standar.Biakan murni diperlukan karena interpretasi berdasarkan inokulum yang tercampur tidak dapat diterima dan akan menghambat mendapatkan hasil. Biakan murni dilakukan dengan mengambil empat atau lima koloni yang sama secara morfologi dan ditanam pada media perbenihan cair dan dibiarkan tumbuhsubur, pada umumnya memerlukan waktu inkubasi 3 sampai 5 jam. Bisa juga sebagai alternative4 sampai 6 koloni berusia 16 sampai 24 jam dipilih dari media agar dan dibuat suspensi dengan NaCl 0,85% untuk mendapatkan suspensi yang keruh. Kemudian kekeruhan dibandingkan dengan suspensi standar Mc Farland, pada latar belakang hitam. Standar Mc Farland dibuat dengan mencampur asam sulfat 1% dan barium klorida 1,175% untuk mendapatkankekeruhan standar. Standar kekeruhan 0,5 Mc Farland telah tersedia secara komersial, yang memiliki kekeruhan sebanding dengan 1,5 x 108colony forming unit(CFU)/ml.

Memilih antimikroba untuk uji kepekaanPemilihan antimikroba dilakukan oleh staf medis terutama dokter spesialis penyakit infeksi dan bila perlu disertai ahli farmasi. Pemilihan berdasarkankelompok bakteri, hasilidentifikasi bakteri (karena ada beberapa antimikroba spesifik hanya untuk bakteri tertentu, misalnya ceftadizime spesifik untukPseudomonas aeruginosa), spektrum antimikroba dan tempat asal infeksi (misalnya untuk infeksi saluran urinaria dipilih nitofurantoin). Deretan antimikroba secara umum didasarkan pada kelompok organisme ,secara umum dibagi menjadi:i.Enterobacteriaceaeii.Pseudomonas aeruginosadanAcinetobactersppiii.Staphylococcussppiv.Enterococcussppv.Streptococcusspp (kecualiS. pneumoniae)vi.Streptococcus pneumoniavii.Haemophilus influenzaviii.Neisseria gonorrhoeae

A.Metode konvensional

1.Metode dilusiMetode dilusi terdiri dari dua teknik pengerjaan yaitu teknik dilusi perbenihan cair dan teknik dilusi agar. Yang bertujuan untuk penentuan aktifitas antimikroba secara kuantitatif, antimikroba dilarutkan kedalam media agar atau kaldu, yang kemudianditanamibakteri yang akan dites. Setelah diinkubasi semalam, konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri di sebut dengan MIC (minimal inhibitory concentration). Nilai MIC dapat pula dibandingkan dengankonsentrasiobat yang didapat di serum dan cairan tubuh lainnya untuk mendapatkan perkiraanrespon klinik.a)Dilusi perbenihan cairDilusi perbenihan cair terdiri dari makrodilusi dan mikrodilusi. Pada prinsipnya pengerjaannya sama hanya berbeda dalam volume. Untuk makrodilusi volume yang digunakan lebihdari 1 ml, sedangkan mikrodilusi volumeyang digunakan0,05 ml sampai 0,1 ml. Antimikroba yang digunakan disediakan pada berbagai macam pengenceran biasanya dalam satuan g/ml, konsentrasi bervariasi tergantung jenis dan sifat antibiotik. (misalnya cefotaxime untuk uji kepekaan terhadapStreptococcus pneumonia, pengenceran tidak melebihi 2 g/ml, sedangkan untukEscherichia colipengenceran dilakukan pada 16 g/mlatau lebih).Secara umum untuk penentuan MIC pengenceran antimikroba dilakukan penurunan konsentrasi setengahnya misalnya mulai dari 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, 0,25 g/ml) konsentrasi terendah yang menunjukkanhambatanpertumbuhan dengan jelas baik dilihat secara visual atau alat semiotomats dan otomatis, disebut dengan konsentrasi daya hambat minimum/ MIC (minimal inhibitory concentration).Kondisi untuk uji kepekaan teknik perbenihan cair terdapat pada lampiran 1.Gambar 1. Contoh teknik dilusi perbenihan cair(sumberINTRODUCTION TO BACTERIOLOGICAL METHODS)

b)Dilusi agarPada teknik dilusi agar, antibiotik sesuai dengan pengenceran akan ditambahkan kedalam agar, sehingga akan memerlukan perbenihan agar sesuai jumlah pengeceranditambah satu perbenihan agar untuk kontrol tanpa penambahan antibiotik , konsentrasi terendah antibiotik yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri merupakan MIC antibiotik yang di uji. Kondisi untuk uji kepekaan teknik agar dilusi terdapat pada lampiran 2. Salah satu kelebihan metode agar dilusi untuk penentuan MICNeisseria gonorrhoeaeyang tidak dapat tumbuh pada teknik dilusi perbenihan cair.

Gambar 2. Penentuan MIC pada teknik agar dilusi

Penentuan MBC dari MIC perbenihan cairDasar penentuan antimikroba secara invitro adalah MIC (minimum inhibition concentration) dan MBC (minimum bactericidal concentration). MIC merupakan konsentrasi terendah bakteri yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri dengan hasil yang dilihat dari pertumbuhan koloni pada agar atau kekeruhan pada pembiakan kaldu. Sedangkan MBC adalah konsentrasi terendah antimikroba yang dapat membunuh 99,9% pada biakan selama waktu yang ditentukan.Agar antimikrobaefektif pada MIC atau MBC. Sedapat mungkinmencapai tempat infeksi. Absorpsiobat dan distribusi antimikroba akan mempengaruhi dosis, rute dan frekuensi pemberian antimikroba untuk mendapatkan dosis efektif di tempat terjadinya infeksiPenentuan konsentrasi minimum antibiotik yang dapat membunuh bakteri /minimumbactericidal concentration(MBC) dilakukan dengan menanam bakteri pada perbenihan cair yang digunakan untuk MIC ke dalam agar kemudian diinkubasi semalam pada 37C. MBC adalah ketika tidak terjadi pertumbuhan lagi pada agar .

Contoh MBC:Misalnya pada konsentrasi antibiotik 0 g/ml,1 g/ml dan 2 g/mlmenunjukkan banyak pertumbuhan bakteri

Pada konsentrasi 4 g/ml,8 g/ml,16 g/ml masih menunjukkan pertumbuhan bakteri tapi jumlah koloninya semakin sedikit

Pada konsentrasi antibiotik 32 g/ml ,64g/ml, pada konsentrasi 32 g/mltumbuh 8 koloni bakteri, sedangkan pada 64 g/mltidak tumbuh, sehingga MBC (minimum bactericidal concentration) adalah 64 g/ml

Keuntungan dan kerugian metode dilusi:Dengan teknik dilusi memungkinkan penentuan kualitatif dan kuantitatif dilakukan bersama-sama.MIC dapat membantudalam penentuan tingkat resistensi dan dapat menjadi petunjuk penggunaan antimikroba .Kerugiannyametode ini tidak efisien karena pengerjaannya yang rumit, memerlukan banyak alat-alat dan bahan serta memerlukan ketelitian dalam proses pengerjaannya termasuk persiapan konsentrasi antimikroba yang bervariasi

2.Metode difusi.Cakram kertas, yang telah dibubuhkan sejumlah tertentu antimikroba, ditempatkan pada media yang telah ditanami organism yang akan di uji secara merata. Tingginya konsentrasidari antimikrobaditentukan oleh difusi dari cakram dan pertumbuhan organism ujidihambat penyebarannya sepanjang difusi antimikroba (terbenuk zona jernih disekitar cakram), sehingga bakteri tersebutmerupakan bakteri yang sensitif terhadap antimikroba. Ada hubungan persamaan yang hampir linear (berbanding lurus) antara log MIC, seperti yang diukur oleh metode dilusi dan diameter zona daya hambatpada metode difusi.

Gambar 3. Hubungan linear antara konsentrasi MIC (g/ml) dan zona hambat antimikroba (mm)

Gambar 4. Grafik hubungan log MIC dengan zona hambat metode difusi

Hasil dari tes kepekaan,mikroorganisme diklasifikasikan ke dalam dua atau lebih kategori. Sistim yang sederhana menentukan dua kategori yaitu sensitif dan resisten. Meskipun klasifikasi tersebut memberikan banyak keuntungan untuk kepentingan statistik dan epidemiologi, bagi klinisi merupakan ukuran yang terlalu kasar untuk digunakan. Dengan demikian hasil dengan 3 klasifikasi yang biasa digunakan, (sensitif, intermediate, dan resisten) seperti pada metode Kirby-Bauer.Terapi antimikroba idealnya berdasarkan penentuan bakteri penyebab dan antimikroba sesuai yang sensitif terhadap bakteri tersebut.Pengobatan secara empiris biasanya dimulai sebelum ada hasil laboratorium mikrobiologi, ketika pengobatan harus dilakukan sebelum penyakit menjadi bertambah parah . efektifitas antimikroba bervariasi tergantung lokasi infeksi, kemampuan antimikroba mencapai sumber infeksi dan kemampuan bakteri untuk menahan atau menginaktifasi antimikroba. Beberapa antimikroba dapat bertindak sebagai bakterisidal (benar-benar membunuh bakteri) sedangkan yang lain bertindak sebagai bakteriostatik (mencegah bakteri berkembang biak), dengan demikian sistem imun hospes mempengaruhi kepekaan terhadap bakteri tersebut..Di laboratorium klinik, uji kepekaan lebih banyak digunakan metode cakram difusi. Pada metode ini inokulum bakteri ditanam secara merata pada permukaan agar. Cakramantimikrobadiletakkan pada permukaan agar dan dibiarkan berdifusi ke dalam media sekitarnya. Hasilnya dilihat zona hambat antimikroba terhadap pertumbuhan bakteri. Ukuran zona jernih tergantung kepada kecepatan difusi antimikroba, derajat sensitifitas mikroorganisme dan kecepatan pertumbuhan bakteri. Zona hambat cakram antimikroba pada metode difusi berbanding terbalik dengan MIC. Semakin luas zona hambat, maka semakin kecil konsentrasi daya hambat minimum MIC. Untuk derajatkategori bakteri dibandingkan terhadap diameter zona hambat yang berbeda-beda setiap antimikroba, sehingga dapat ditentukan kategori resisten, intermediate atau sensitif terhadap antimikroba uji.

Tabel.1 Standar Diameter zona interpretasi dan perkiraan kaitannya MIC untuk penentuan kategori serta interpretasi hasil

Antimikroba(jumlah tiap cakram)Dan organismeDiameter zona (millimeter tedekat) untuk masing-masing kategoriPerkiraankaitan dengan MIC (mikro gm/ml) untuk:

RIMSSRS

Ampicillin (10 g)

Enterobacteriaceae14>324258321616