UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN PENETAPAN KADAR …repository.usd.ac.id/8939/2/128114128_full.pdf ·...

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN PENETAPAN KADAR

BROMELAIN TERHADAP BOVINE SERUM ALBUMIN (BSA) DARI

EKSTRAK KULIT BUAH NANAS (Ananas comosus (L.) Merr)

SKRIPSI

Diajukan untuk memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Yohanes Bintang Pambudi

NIM : 1281141128

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2017

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN PENETAPAN KADAR

BROMELAIN TERHADAP BOVINE SERUM ALBUMIN (BSA) DARI

EKSTRAK KULIT BUAH NANAS (Ananas comosus (L.) Merr)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana (S. Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Yohanes Bintang Pambudi

NIM: 128114128

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2017


iv

“Segala perkara dapat kutanggung di dalam Dia yang memberi

kekuatan kepadaku”

Filipi 4:13

When we pray, God hears more than we say, answer more than we

ask, gives more than we imagine..

In His time and His own way.

Dipersembahkan untuk Gusti Yesus Kristus, Bunda Maria, Keluarga,

orang-orang terkasih yang telah membantu secara moral dan materi.

Dan bagi yang merasa bahwa karya ini berguna


vii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis haturkan kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah

melimpahkan segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi yang berjudul ” Uji Aktivitas Antioksidan dan Penetapan

Kadar Bromelain Terhadap Bovine Serum Albumin (BSA) Dari Ekstrak Kulit Buah

Nanas (Ananas comosus L. Merr)” sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar

Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta.

Dalam menyelesaikan skripsi ini penulis mengalami banyaknya kesulitan

dan hambatan. Keberhasilan penulis dalam penyusunan skripsi ini tentunya tidak

terlepas dari dukungan, bantuan, nasehat, bimbingan, kritik dan saran dari berbagai

pihak. Oleh karena itu, dengan tulus dan kerendahan hati penulis mengucapkan

terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si, Apt., selaku dosen pembimbing atas

bimbingan, arahan, semangat, kritik dan saran selama penyusunan proposal

hingga selesainya skripsi ini.

3. Bapak Maywan Hariono, Ph.D, Apt., selaku dosen penguji atas, arahan, kritik

dan saran atas skripsi ini.

4. Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc., selaku dosen penguji atas,

arahan, kritik dan saran atas skripsi ini.


viii

5. Segenap dosen Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, yang telah

membagikan ilmu selama penulis menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi.

6. Segenap staf laboratorium, staf kebersihan, dan staf keamanan Fakultas

Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Terutama Pak Wagiran, Pak

Musrifin, Pak Parlan dan Mas Kunto yang telah banyak membantu kelancaran

penelitian.

7. Richard Andrison Sadeli, teman seperjuangan skripsi, atas kerjasama,

dukungan, semangat, dan masukan yang diberikan.

8. Teman-teman penghuni dan ibu Kost DMP atas dukungan dan semangatnya.

9. Teman, sahabat tempat bertukar pikiran dan kegembiraan serta kesusahan

(Sarjo, Putra, Indra, Fofo, Gotaro, Jabon, Budi) atas kebersamaan dan

dukungan.

10. Teman-teman FSM C, FST B, Mas Boy 2012 dan Farmasi angkatan 2012 atas

kebersamaan, kerjasama, dan kenangan selama di Fakultas Farmasi.

11. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah membantu

penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

Seperti pepatah, “tak ada gading yang tak retak”, demikian juga penulis

menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih jauh dari sempurna dan masih

memiliki banyak kekurangan dan kesalahan mengingat keterbatasan kemampuan

dan pengalaman yang dimiliki dan dialami oleh penulis. Oleh karena itu, dengan

segala kerendahan hati penulis sangat mengharapkan saran dan kritik yang

membangun dari semua pihak untuk kebaikan bersama di kemudian hari. Akhir


ix

kata, penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu

pengetahuan dan masyarakat.

Yogyakarta, 15 Juni 2016

Penulis


x

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ........................................................................................ i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................. ii

HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ...................................................................... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .......................................................... v

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................................ vi

PRAKATA ....................................................................................................... vii

DAFTAR ISI .................................................................................................... x

DAFTAR TABEL ............................................................................................ xiv

DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xv

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xvi

INTISARI ......................................................................................................... xvii

ABSTRACT ....................................................................................................... xviii

BAB I. PENGANTAR ..................................................................................... 1

A. Latar belakang .................................................................................... 1

1. Rumusan masalah ......................................................................... 4

2. Keaslian penelitian ....................................................................... 4

3. Manfaat penelitian ........................................................................ 5

B. Tujuan penelitian ................................................................................ 5

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA.............................................................. 6

A. Nanas .................................................................................................. 6

1. Klasifikasi tumbuhan .................................................................... 6


xi

2. Morfologi ...................................................................................... 6

3. Kandungan kimia .......................................................................... 7

B. Bromelain. .......................................................................................... 7

C. Radikal Bebas ..................................................................................... 8

D. Antioksidan ......................................................................................... 8

1. Definisi antioksidan ...................................................................... 9

2. Uji aktivitas antioksidan ............................................................... 9

3. Penggolongan antioksidan ............................................................ 10

E. Spektrofotometri UV-Visibel ............................................................. 11

F. Metode DPPH ..................................................................................... 12

G. Landasan Teori ................................................................................... 12

H. Hipotesis ............................................................................................. 14

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ....................................................... 15

A. Jenis dan rancangan penelitian ........................................................... 15

B. Variabel dan definisi operasional ....................................................... 15

1. Variabel utama .............................................................................. 15

2. Variabel pengacau ........................................................................ 15

3. Definisi operasional ...................................................................... 16

C. Bahan penelitian ................................................................................. 17

D. Alat penelitian..................................................................................... 17

E. Tata cara penelitian ............................................................................. 17

1. Determinasi buah nanas ................................................................ 17

2. Pengumpulan buah nanas ............................................................. 18


xii

3. Pembuatan ekstrak kulit buah nanas ............................................ 18

4. Analisis kualitatif .......................................................................... 19

5. Penetapan kadar enzim bromelain ................................................ 19

6. Pembuatan larutan uji aktivitas antioksidan ................................. 21

7. Uji aktivitas antioksidan .............................................................. 22

F. Analisis hasil....................................................................................... 23

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................ 26

A. Hasil determinasi buah ....................................................................... 26

B. Hasil pengumpulan bahan .................................................................. 26

C. Hasil preparasi sampel ........................................................................ 27

D. Hasil uji pendahuluan ......................................................................... 29

1. Uji ninhidrin ................................................................................. 29

2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan .......................................... 31

E. Hasil penetapan kadar enzim bromelain terhadap BSA .................... 32

F. Hasil optimasi uji aktivitas antioksidan .............................................. 37

1. Penentuan Operating Time (OT) .................................................. 36

2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum

(λ maks) ........................................................................................ 35

G. Hasil uji aktivitas antioksidan ............................................................. 38

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................... 46

A. Kesimpulan ......................................................................................... 46

B. Saran ................................................................................................... 46

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 47


xiii

LAMPIRAN ..................................................................................................... 52

BIOGRAFI PENULIS ..................................................................................... 80


xiv

DAFTAR TABEL

Tabel I. Hasil pengukuran absorbansi kadar enzim bromelain

terhadap BSA ............................................................................. 34

Tabel II. Hasil penetapan kadar enzim bromelain terhadap BSA ............ 35

Tabel III. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum

DPPH ......................................................................................... 38

Tabel IV. Hasil aktivitas antioksidan rutin dengan metode DPPH ............. 41

Tabel V. hasil aktivitas antioksidan ekstrak bromelain kulit buah nanas

dengan metode DPPH ................................................................ 42

Tabel VI. Hasil hasil perhitungan IC50 rutin dan ekstrak bromelain

Kulit buah nanas ......................................................................... 43


xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Reaksi ninhidrin dengan protein ................................................ 30

Gambar 2. Hasil uji ninhidrin ..................................................................... 30

Gambar 3. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan .............................. 32

Gambar 4. Kurva persamaan regresi linear

Bovine Serum Albumine (BSA) ................................................ 33

Gambar 5. Kurva penentuan Operating Time (OT) rutin ............................ 37

Gambar 6. Reaksi antara senyawa antioksidan dengan DPPH .................... 39

Gambar 7. Kurva persamaan regresi linear rutin ......................................... 40

Gambar 8. Kurva persamaan regresi linear ekstrak

kulit buah nanas ......................................................................... 42


xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi buah nanas

(Ananas comosus L. Merr) ........................................................ 52

Lampiran 2. Gambar buah nanas .................................................................. 53

Lampiran 3. Perhitungan rendemen ............................................................... 54

Lampiran 4. Penimbangan analisis kualitatif ................................................. 55

Lampiran 5. Data penimbangan penetapan kadar bromelain terhadap

BSA .......................................................................................... 55

Lampiran 6. Optimasi penetapan kadar bromelain terhadap BSA ................. 56

Lampiran 7. Penetapan kadar bromelain terhadap BSA ................................ 59

Lampiran 8. Penimbangan pengujian aktivitas antioksidan ........................... 63

Lampiran 9. Perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding

dan larutan uji ............................................................................ 64

Lampiran 10. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan................................. 67

Lampiran 11. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH ............. 71

Lampiran 12. Perhitungan nilai IC50 rutin dan ekstrak

kulit buah nanas ......................................................................... 73

Lampiran 13. Uji statistik ................................................................................. 76


xvii

INTISARI

Kulit buah nanas (Ananas comosus L. Merr) memiliki kandungan senyawa protein

proteolitik yang dapat berperan sebagai antioksidan. Antioksidan merupakan

senyawa yang dapat menghambat reaksi radikal bebas dalam tubuh. Penelitian ini

bertujuan untuk menetapkan kadar enzim bromelain dalam ekstrak kulit buah nanas

dan menguji aktivitas antioksidan. Estimasi kadar bromelain ditentukan secara

spektrofotometri dengan menggunakan standar Bovine Serum Albumine (BSA).

Aktivitas antioksidan ditentukan dengan metode DPPH yang dinyatakan dalam

IC50 (Inhibition Concentration 50).

Penelitian menunjukkan bahwa estimasi kadar enzim bromelain yang dihitung

terhadap BSA dalam ekstrak kulit buah nanas sebesar (7,8233 ± 0,1096) %.

Aktivitas antioksidan ekstrak kulit buah nanas yang dinyatakan dengan nilai IC50

sebesar (4869,3 ± 28,2744) μg/mL.

Kata kunci : Ananas comosus L. Merr, aktivitas antioksidan, DPPH, bromelain,

IC50


xviii

ABSTRACT

Pineapple peels (Ananas comosus L. Merr) contain proteolytic protein that can act

as antioxidant. Antioxidant is a compound that can inhibit the reaction of free

radicals within the body. The aims of this study are to determine the concentration

of total protein in pineapple peels extract and its antioxidant activity.

The assay of total protein was determined by spectrophotometric with Bovine

Serum Albumin (BSA) as the reference. Antioxidant activity was determined using

DPPH radical scavenging method, expressed as IC50 (Inhibition Concentration 50).

Results showed that the total protein concentration of the pineapple peels extract is

(7,8233 ± 0,1096) % w/w. Furthermore, the antioxidant activity of bromelain from

pineapple peels extract is found weak with the IC50 value (4869,3 ± 28,2744)

μg/mL.

Keywords: Ananas comosus L. Merr, antioxidant activity, DPPH, total protein,

IC50


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Pada masa modern penyakit degeneratif semakin banyak berkembang.

Penyakit degeneratif seperti kanker, diabetes, CHD (Cardiovascular Heart

Disease), disfungsi otak dan penuaan dini sering dikatikan dengan adanya

kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh radikal bebas (Ames, Shigenaga, dan

Hagen, 1993).

Radikal bebas merupakan suatu senyawa yang mempunyai elektron bebas

tidak berpasangan. Hal inilah yang menjadikan senyawa radikal bebas bersifat

sangat reaktif dan tidak stabil. Karena ketidakstabilannya tersebut, senyawa radikal

bebas akan segera menyerang komponen seluler yang berada di sekitarnya, seperti

lipid, karbohidrat, protein maupun asam lemak. Radikal bebas melakukan reaksi

oksidasi patogenik terhadap sel atau komponennya, sehingga dapat menyebabkan

disfungsi sel, kerusakan struktur sel atau mutasi yang berakibat pada timbulnya

penyakit degeneratif (Prakash, Rigelhof, dan Miller, 2001).

Efek dari radikal bebas dapat dihentikan dengan adanya antioksidan.

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghentikan reaksi berantai

radikal bebas dengan bekerja sebagai pendonor elektron. Oleh karena itu

antioksidan dapat mengurangi terjadinya kerusakan sel-sel tubuh. Senyawa

antioksidan dapat diperoleh dari senyawa-senyawa metabolit sekunder tanaman

yang mempunyai struktur cincin aromatis fenol atau senyawa fenolik. Cincin


2

aromatis fenol inilah yang akan berkontribusi terhadap aktivitas antioksidan

(Winarsi, 2007).

Senyawa antioksidan sintetik seperti butylated hydroxyanisole (BHA),

propyl gallate (PG) dan butylated hydroxytoluene (BHT) telah banyak digunakan

secara luas selama beberapa waktu. Akan tetapi, terdapat kemungkinan senyawa

antioksidan sintetik tersebut mempunyai efek toksik dan karsinogenik. Oleh karena

itu dilakukan eksplorasi senyawa antioksidan yang baru, aman dan efektif dari alam

yang diambil dari berbagai tanaman. Banyak penelitian telah menunjukkan bahwa

senyawa antioksidan dari tanaman tersebut cukup efektif dalam menghambat

terbentuknya radikal bebas (Zou, Lu, dan Wei, 2004; Azlim et al., 2010)

Nanas merupakan tumbuhan yang hidup di daerah tropis. Nanas

mengandung berbagai senyawa seperti vitamin C (Gardner et al., 2000), asam

ferulat, asam kafeat, dan p-asam hidroksibenzoat (de Simon et al., 1992; van

Lelvveld dan de Bruyn, 1977), serta bromelain. Bromelain dapat ditemukan di

berbagai bagian tanaman nanas, seperti daging, stem, dan kulit. Bromelain

merupakan golongan enzim protease yang mampu memecah protein rantai panjang

menjadi fragmen protein yang lebih kecil bahkan sampai ke bentuk asam amino

(Ali, Milala, dan Gulani 2015). Enzim protease dapat meregenerasi jaringan yang

terluka dan mencegah timbulnya keloid. Pembentukan keloid disebabkan karena

adanya akumulasi dari jaringan kolagen dan pembentukan jaringan pyridinoline

yang diasosiasikan dengan radikal bebas. Beberapa enzim protease yang digunakan

dalam perawatan luka adalah papain dan bromelain (Pendzhiev, 2002).


3

Untuk melihat potensi antioksidan dari enzim protease yang telah digunakan

dalam perawatan luka, dalam penelitian ini dilakukan pemeriksaan aktivitas

antioksidan terhadap kulit buah nanas. Berbagai penelitian telah membuktikan

bahwa kulit nanas mempunyai kemampuan sebagai antioksidan dan aktivitas

biologis lainnya (Hossain dan Rahman, 2011; da Silva et al, 2010; Erukainure et al,

2012). Kulit dari buah nanas merupakan salah satu bagian dari limbah buah nanas,

selain bonggol dan daunnya. Limbah tersebut umumnya dapat digunakan sebagai

pakan ternak. Khususnya kulit buah nanas dapat digunakan untuk produksi kertas,

baju, dan uang kertas. Hal tersebut disebabkan kulit buah nanas banyak

mengandung selulosa, hemiselulosa, dan karbohidrat yang lain (Bartholomew et

al., 2003). Bromelain diduga terkandung dalam kulit, selain di bonggol, dan daun

(Ketnawa, Rawdkuen, dan Chaiwut, 2010).

Penelitian aktivitas antioksidan ini dilakukan dengan metode DPPH (1,1-

diphenyl-2-picrylhydrazyl) secara kolorimetri dengan menggunakan

spektrofotometer pada daerah visibel. Metode DPPH dipilih karena sederhana,

mudah, cepat, dan peka serta hanya memerlukan sedikit sampel. Parameter yang

digunakan untuk uji penangkapan radikal DPPH adalah IC50 yaitu konsentrasi

ekstrak yang dibutuhkan untuk menangkap radikal DPPH sebanyak 50% (Zou, Lu,

dan Wei, 2004). Pengukuran konsentrasi protein total dari ekstrak kulit buah nanas

dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri 280 nm yang merupakan

salah satu metode yang cepat dan sederhana dalam menentukan protein total

(Chaurasiya dan Hebbar, 2013).


4

1. Rumusan Masalah

a. Apakah ekstrak kulit buah nanas mempunyai daya antioksidan?

b. Berapa nilai aktivitas antioksidan ekstrak kulit buah nanas yang dinyatakan

dengan IC50?

c. Berapa kadar enzim bromelain dalam ekstrak kulit buah nanas yang dihitung

terhadap BSA?

2. Keaslian Penelitian

Sejauh penelusuran peneliti, penelitian yang serupa pernah dilakukan oleh

Bresolin, Silveira, Tambourgi, dan Mazzola (2013) dengan judul “Isolation and

Purification of Bromelain from Waste Peel of Pineapple for Therapeutic

Application”. Penelitian ini menggunakan kulit buah nanas yang didapat di

Campinas (Brazil), purifikasi dengan menggunakan metode presipitasi dengan

amonium sulfat, dan pengukuran konsentrasi enzim menggunakan ion exchange

chromatography. Selain itu penelitian serupa juga pernah dilakukan oleh Hatam,

Suryanto, dan Abidjulu (2013) dengan judul “Aktivitas Antioksidan dari Ekstrak

Kulit Nanas (Ananas comosus (L.) Merr)”. Penelitia ini dilakukan menggunakan

kulit nanas yang didapatkan di Bolaang Mongondow, Manado (Indonesia),

ekstraksi menggunakan etanol 80% dan teknik maserasi, soxhlet dan refluks, dan

penentuan aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-

picrylhydrazyl).

Perbedaan penelitian ini dengan penelitian yang pernah dilakukan tersebut

teletak pada tempat dimana buah nanas didapatkan, metode purifikasi, dan metode

uji kualitatif dan penetapan kandungan bromelain. Penelitian ini menggunakan


5

buah nanas yang diperoleh di Pasar Stan Maguwoharjo (Yogyakarta), purifikasi

menggunakan etanol 95% dengan perbandingan 1:3 selama 24 jam, uji kualitatif

menggunakan ninhidrin, dan pengukuran konsentrasi enzim menggunakan metode

spektrofotometri 280 nm.

3. Manfaat Penelitian

a. Manfaat Teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat menambah perkembangan wawasan

pengetahuan khususnya dalam ilmu kefarmasian tentang aktivitas antioksidan

dari ekstrak dari kulit buah nanas.

b. Manfaat Praktis

Penelitian ini diharapkan dapat menambah wawasan kepada masyarakat tentang

aktivitas antioksidan dalam ekstrak kulit buah nanas sehingga kulit-kulit nanas

hasil dari kupasan buah nanas dapat digunakan untuk pemeliharaan kesehatan.

B. Tujuan Penelitian

1. Untuk mengetahui daya antioksidan ekstrak kulit buah nanas.

2. Untuk mengetahui nilai aktivitas antioksidan ekstrak kulit buah nanas yang

dinyatakan dalam IC50.

3. Untuk mengetahui kadar protein total dari ekstrak kulit buah nanas yang

dinyatakan dalam persentase (%).


6

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Nanas

1. Klasifikasi tumbuhan

Divisi : Spermatophyta

Sub divisi : Angiospermae

Kelas : Monocotyldoneae

Bangsa : Bromeliales

Suku : Bromeliaceae

Marga : Ananas

Spesies : Ananas comosus Merr. (Tjitrosoepomo, 1994; Backer dan van

Den Brink, 1963).

2. Morfologi

Tanaman nanas berbentuk semak dan hidupnya bersifat tahunan. Susunan

bagian tumbuhan nanas meliputi akar, batang, daun, bunga, buah, dan tunas. Berbiji

tunggal. Bentuk batang nanas seperti gada, berukuran panjang antara 20-25 cm atau

lebih, tebal dengan diameter 2,0-3,5 cm, beruas-ruas pendek. Tangkai bunga atau

buah merupakan perpanjangan batang. Daun nanas tumbuh memanjang sekitar 130-

150 cm, lebar antara 3-5 cm atau lebih, bagian pinggir daun ada yang berduri dan

tidak berduri, permukaan daun bagian atas halus berwarna hijau tua atau merah tua

bergaris atau coklat kemerah-merahan. Daun mahkota berbentuk garis memanjang

dengan panjang lebih kurang 2 cm, putih dan ungu, dari dalam dan pangkalnya

dengan dua pinggiran yang menonjol, berkuku (Rukmana, 1996).


7

3. Kandungan kimia

Nanas mengandung vitamin C (Gardner et al., 2000), asam ferulat, asam

kafeat, dan p-hidroksi asam benzoat (de Simon et al., 1992; van Lelvveld dan de

Bruyn, 1977), serta bromelain. Kulit nanas mengandung selulosa, hemiselulosa dan

karbohidrat lain (Bartholomew et al., 2003).

B. Bromelain

Bromelain merupakan enzim proteolitik yang didapat dari tanaman dengan

family bromeliaceae, dimana yang paling banyak ditemukan terdapat pada buah

nanas (Ananas comosus L. Merr). Penggunaan bromelain pada umumnya adalah

sebagai agen anti-inflamasi, anti-edema, antitrombotik, dan aktivitas fibrinolit ik

(Manzoor, Nawaz, Mukhtar, dan Haq, 2016). Bromelain umumnya paling banyak

ditemukan di bagian stem dan dagingnya. Oleh karena itu munculnya nama stem

bromelain dan fruit bromelain dikarenakan enzim tersebut umumnya dapat

ditemukan di bagian stem dan daging buah nanas (Maurer, 2001).

Bromelain tersusun atas rantai tunggal polipeptida dengan 212 asam amino

terlipat menjadi dua domain struktur yang stabil oleh jembatan disulfide dan ikatan

hydrogen. Sisi aktif terletak di permukaan molekul di antara domain, dengan dua

residu katalik, yaitu Cys25 dan His159 (Ishihara, Takahashi, Oguri, dan Tejima,

1979). Bromelain mempunyai bentuk serbuk amorf dengan warna putih bening

sampai kekuning-kuningan, berbau khas, mempunyai kestabilan pada pH 5,0-7,0.

Bromelain larut sebagian dalam eter dan aseton, dan mempunyai suhu optimal pada

50o C – 60o C (Maurer, 2001).


8

Metode isolasi bromelain dapat dilakukan salah satunya dengan metode

presipitasi. Metode ini dilakukan dengan penambahan pelarut organik seperti

aseton, alkohol, dan amonium sulfat. Bromelain diisolasi dari bagian tanaman yang

sudah berbentuk perasan atau sari buahnya dengan menambahkan pelarut organic

sebagai bahan pengendap. Dalam beberapa penelitian ada yang menggunakan cara

pengendapan yang berbeda, seperti melakukan pengendapan dengan penambahkan

larutan pada pH tertentu dan perlakuan pada suhu tertentu (Maurer, 2001).

C. Radikal Bebas

Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki sebuah elektron tak

berpasangan pada jari-jari terluar dari atom. Sifatnya tidak stabil dan pada struktur

biologis dapat menyebabkan kerusakan oksidatif (Chaisawvong dan Supapor,

2009). Radikal bebas dapat mengoksidasi asam nukleat, protein, lipid serta DNA,

dan dapat menginisiasi timbulnya penyakit degeneratif (Prakash, Rigelhof, dan

Miller, 2007).

Dalam rangka mendapatkan stabilitas kimia, radikal bebas memilik i

kecenderungan untuk mencari pasangan. Radikal bebas akan menyerang molekul

stabil yang terdekat dan mengambil elektron. Zat yang terambil elektronnya akan

menjadi radikal bebas juga sehingga akan memulai suatu reaksi berantai yang

akhirnya terjadi kerusakan sel (Winarsi, 2007).


9

D. Antioksidan

1. Definisi antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang diperlukan tubuh menetralis ir

radikal bebas dan mencegah kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebas

terhadap sel normal, protein, dan lemak. Antioksidan memiliki berat molekul kecil

akan menstabilkan radikal bebas dengan melengkapi kekurangan elektron yang

dimiliki radikal bebas (Winarsi, 2007).

Kebanyakan senyawa ini (misalnya tokoferol) digunakan sebagai pengawet

dalam berbagai produk (misalnya dalam lemak, minyak dan produk makanan untuk

menunda ketengikan dan perubahan-perubahan yang tidak diinginkan, dalam karet

untuk menunda oksidasi). Pengertian antioksidan yang lebih relevan secara biologis

ialah senyawa alami atau sintetik yang ditambahkan ke dalam produk untuk

mencegah atau menunda kerusakan yang disebabkan oleh udara (Huang, Ou, dan

Prior, 2005).

2. Uji aktivitas antioksidan

Uji aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan beberapa metode, baik

secara kuantitatif maupun kualitatif. Uji aktivitas antioksidan secara kuantitat if

yang biasa dilakukan adalah dengan metode DPPH. Prinsip dari metode ini adalah

penangkapan elektron bebas dari senyawa radikal bebas yang dapat menyebabkan

adanya reaksi perubahan warna pada DPPH dari ungu menjadi kuning (Dephour,

Ebrahimazedh, Fazel, dan Mohammad, 2009). Metode lain yang sering digunakan

antara lain, metode Ferric-reducing antioxidant power (FRAP), Cupric ion

reducing antioxidant capacity (CUPRAC), dan Trolox equivalent antioxidant

capacity (TEAC). Selain itu uji aktivitas antioksidan secara kualitatif dapat


10

dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT) atau dengan menggunakan

kromatografi kertas (Davidek, 1997).

3. Penggolongan antioksidan

Menurut sumbernya, antioksidan dapat digolongkan menjadi dua macam,

yaitu antioksidan sintetik dan alami (Gulcin, Uguz, Oktay, Beydemir, dan

Kufrevioglu, 2004).

a. Antioksidan sintetik

Antioksidan sintetik merupakan antioksidan yang dibuat melalui sintesis secara

kimia, contohnya: ter-butyl hidroquinone (tBHQ), butylated hydroxyanisole

(BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), dan propil galat (PG) (Gulcin, et al.,

2004). Konsentrasi rendah dari antioksidan tBHQ dan BHA telah lama

digunakan untuk mencegah oksidasi dari produk makanan sehingga dapat

menstabilkan produk tersebut (nutrisi, rasa, maupun warna). Dalam konsentrasi

yang tinggi, tBHQ dapat menyebabkan kanker. Penyebabnya adalah metabolit

dari oksidasi tBHQ, yaitu 2-tertbutyl-1,4-benzoquinone (tBBQ) dan Reactive

Oxygen Species (ROS) (Gharavi, Haggarty, dan El-Kadi, 2007).

b. Antioksidan alami

Antioksidan alami merupakan antioksidan yang diproduksi langsung oleh

tanaman maupun tubuh, contohnya: senyawa polifenol flavonoid seperti rutin,

tanin, katalase dan glutation peroksidase bekerja dengan cara mengubah H2O2

menjadi H2O dan O2, sedangkan superoksid dismutase bekerja dengan cara

mengkatalisis reaksi dismutasi dari radikal anion superoksida menjadi H2O2

(Gulcin, et al., 2004).


11

E. Spektrofotometri UV-Visibel

Spektrofotometri visibel merupakan teknik spektroskopik yang memakai

sumber radiasi elektromagnetik sinar tampak (380-780 nm) dengan memakai

instrumen spektrofotometer. Distribusi elektron didalam suatu senyawa organic

secara umum yang dikenal sebagai orbital elektron pi (п), sigma (α) dan elektron

tidak berpasangan (n). Apabila pada molekul dikenakan radiasi elektromagnetik

maka akan terjadi ekstasi elektron ke tingkat energi yang lebih tinggi yang dikenal

sebagai orbital elektro anti bonding (Mulja dan Suharman, 1995; Fessenden dan

Fessenden, 1995).

Setiap senyawa memiliki energi yang sama dengan perbedaan energi antara

keadaan tingkat dasar dan energi keadaan tereksitasi, maka elektron-elektron pada

keadaan tingkat dasar akan dieksitasi ke tingkat energi eksitasi dan sebagian energi

cahaya yang sesuai dengan panjang gelombang ini diserap. Frekuensi yang diserap

setiap senyawa sangat spesifik karena perbedaan energi antara tingkat dasar dan

tingkat eksitasi setiap senyawa juga spesifik (Sastrohamidjojo, 2001).

Interaksi antara senyawa yang mempunyai gugus kromofor dengan radiasi

elektromagnetik dan spektra absorbansi elektromagnetik. Spektrum visible

mempunyai absorbansi antara 400-800 nm, sedangkan spektrum UV mempunya i

absorbansi antara 100-400 nm (Fessenden dan Fessenden, 1995). Kromofor

merupakan gugus tak jenuh kovalen yang dapat menyerap radiasi dalam daerah-

daerah UV dan visibel, pada senyawa organik dikenal pula gugus auksokrom, yaitu

gugus jenuh yang terikat pada kromofor. Terikatnya gugus auksokrom pada


12

kromofor dapat mengubah panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum

(Sastrohamidjojo, 2001).

F. Metode DPPH

Uji aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH merupakan

metode uji yang paling sering digunakan. Metode ini menggunakan senyawa

radikal bebas 1,1-dyphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Senyawa DPPH merupakan

senyawa radikal nitrogen yang tidak stabil karena adanya elektron bebas yang tidak

berpasangan yang dapat menyebabkan DPPH memiliki sifat reaktif. DPPH akan

mengalami reduksi melalui proses donasi elektron sehingga warna DPPH akan

mengalami perubahan warna dari ungu menjadi kuning (Halliwell dan Gutteridge,

2000).

Parameter yang digunakan metode ini adalah parameter IC50. IC50

merupakan parameter konsekuensi yang ekuivalen dapat memberikan 50% efek

aktivitas antioksidan. Parameter ini dapat diketahui dengan mengintepretas ikan

hasil uji dalam suatu data eksperimental (Molyneux, 2004).

G. Landasan Teori

Reaksi oksidasi berlebihan yang terjadi di dalam tubuh dapat memicu

terbentuknya radikal bebas. Radikal bebas merupakan suatu senyawa yang

memiliki elektron tidak berpasangan yang menyebabkan senyawa tersebut sangat

reaktif dan tidak stabil. Untuk mencapai kestabilan, elektron tidak berpasangan

akan mencari pasangan elektron di sekitarnya. Radikal bebas dapat mengoksidas i


13

asam nukleat, protein, lipid, DNA, dan dapat memicu penyakit degeneratif.

Senyawa antioksidan dapat meredam radikal bebas dan menghambat reaksi

oksidatif, sehingga kerusakan sel akibat radikal bebas dapat dicegah (Winarsi,

2007)

Nanas merupakan tanaman yang mudah ditemukan di daerah tropis.

Selama bertahun-tahun telah banyak kegunaan dari bagian-bagian buah nanas yang

digunakan dalam pemeliharaan kesehatan. Seperti kulit nanas yang telah menjadi

bahan penting dalam pengobatan tradisional untuk mengobati berbagai penyakit

selama bertahun-tahun. Berbagai penelitian telah membuktikan bahwa kulit nanas

mempunyai kemampuan sebagai antioksidan dan aktivitas biologis lainnya

(Hossain dan Rahman, 2011; da Silva et al, 2010; Erukainure et al, 2012).

Bromelain merupakan salah satu enzim protease yang umum digunakan dalam

perawatan luka. Enzim protease yang digunakan dalam perawatan luka untuk

regenerasi jaringan dan mencegah timbulnya keloid berpotensi memiliki aktivitas

antioksidan (Pendzhiev, 2002). Enzim ini tidak hanya dapat ditemukan di bagian

daging, stem dan daun, namun juga di kulit nanas (Hebbar, Sumana, dan Raghvarao,

2008).

Kandungan protein total dalam suatu sampel dapat dianalisis secara

kualitatif dengan menggunakan metode uji warna ninhidrin dan kuantitatif dengan

menggunakan metode spektrofotometri. Prinsip uji warna yaitu pembentukan

warna biru-ungu dari reaksi antara ninhidrin dan asam amino (Bottom, Hanna, dan

Siehr, 1978). Prinsip spektrofotometri yaitu protein yang memiliki cincin aromatik

seperti fenilalanin, triptofan, histidin, dan tirosin memiliki serapan yang kuat pada


14

panjang gelombang 280 nm. Intensitas serapan pada panjang gelombang tersebut

sebanding dengan jumlah enzim dalam sampel (Ahmed, 2005).

Metode DPPH merupakan metode pengujian aktivitas antioksidan yang

sederhana dan cepat. Metode ini menggunakan radikal bebas DPPH untuk menguji

suatu senyawa antioksidan dalam meredam radikal bebas. Elektron tak berpasangan

DPPH memberikan serapan yang kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan

warna ungu. Warna ungu akan berubah menjadi kuning ketika terdapat senyawa

antioksidan yang meredam radikal bebas DPPH (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel,

dan Mohammad, 2009; Molyneux, 2004).

H. Hipotesis

Ekstrak dari kulit buah nanas (Ananas comosus (L.) Merr.) memiliki aktivitas

antioksidan.


15

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan

rancangan acak lengkap pola searah.

B. Variabel dan Definisi Operasional

Variabel – variabel yang digunakan pada penelitian ini adalah:

1. Variabel utama

a. Variabel bebas

Variasi konsentrasi ekstrak kulit buah nanas.

b. Variabel tergantung

Aktivitas antioksidan (%IC) dan kadar enzim bromelain ekstrak kulit buah

nanas.

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali

Jumlah (g) kulit yang digunakan, suhu evaporasi, waktu pengendapan, dan lama

penyimpanan ekstrak kulit buah nanas.

b. Variabel pengacau tidak terkendali

Suhu blender, suhu sentrifugasi, tempat tumbuh tanaman, waktu pemanenan,

umur buah yang dipanen, cara panen.


16

3. Definisi Operasional

a. Aktivitas antioksidan

Aktivitas antoksidan adalah kemampuan ekstrak kulit buah nanas untuk

menangkap radikal DPPH dibandingkan dengan kontrol negatif.

b. Ekstrak kulit buah nanas

Ekstrak kulit buah nanas adalah ekstrak yang berbentuk cairan kental yang

diperoleh dari presipitasi crude extract dengan etanol, dimana menurut Soares

(2012) crude extract merupakan supernatan hasil dari proses ekstraksi kulit

buah nanas.

c. Kadar enzim bromelain

Kadar enzim bromelain adalah suatu nilai yang dinyatakan dalam bentuk

persentase yang menyatakan kadar bromelain dalam ekstrak kulit buah nanas

yang ditetapkan menurut Ahmed (2005) yang dihitung terhadap bovine serum

albumin (BSA) sebagai reference standard dalam penghitungan kadar enzim

bromelain.

d. Persen inhibition concetration (%IC)

Persen inhibition concetration adalah suatu nilai yang dinyatakan dalam bentuk

persentase yang menyatakan kemampuan enzim bromelain dalam ekstrak kulit

buah nans dalam menangkap radikal DPPH.

e. Inhibition concetration 50 (IC50)

Inhibition concetration 50 adalah nilai dosis enzim bromelain dalam ekstrak

kulit buah nanas yang dapat menghasilkan penangkapan 50% radikal DPPH.


17

C. Bahan Penelitian

Bahan uji yang digunakan adalah kulit buah nanas yang dibeli pada bulan

Februari - April 2016 dan diperoleh dari pedagang buah pasar Stan, Maguwoharjo,

kabupaten Sleman, Yogyakarta. Bahan kimia kualitas farmasetis yang digunakan

dalam penelitian ini yaitu aquadest; bahan kimia kualitas teknis (CV. General

Labora) berupa ethanol dan air deionisasi; bahan kimia kualitas pro analitik (E.

Merck) berupa metanol dan ninhidrin; bahan kimia kualitas pro analitik (Sigma

Chem. Co.) berupa rutin dan DPPH; bahan kimia kualitas pro analitik (DiaSys)

berupa bovine serum albumine (BSA).

D. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini, antara lain: blender (Maspion),

corong Buchner (Desaga), mikropipet 50-200 µL (Acura 825, Socorex), vortex

(Stuart Scientific), sentrifuge (Hettich), magnetic stirrer (Thermo Scientific),

vacuum rotary evaporator (BUCHI Rotavator R-3), waterbath (Memmert),

spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV mini-1240 UV-Vis Spektrofotometer),

neraca analitik (Metler Tolledo, BP 160P), serta alat-alat gelas yang lazim

digunakan di laboratorium (Pyrex-Germany).

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi buah nanas.

Determinasi buah nanas dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta berdasarkan Backer dan


18

van Den Brink (1963) dengan mencocokan karakteristik buah nanas yang

digunakan dengan gambar, taksonomi, dan keterangan kelompok tumbuhan. Hal

ini dilakukan untuk mengetahui kebenaran identitas tanaman yang digunakan dalam

penelititan serta untuk meminimalisir adanya kesalahan yang terjadi ketika

pengambilan sampel.

2. Pengumpulan kulit buah nanas.

Kulit buah nanas diperoleh dari pasar Stan, Maguwoharjo, kabupaten

Sleman, Yogyakarta. kulit yang diambil berasal dari buah yang memiliki jenis dan

tingkat kematangan yang sama.

3. Pembuatan ekstrak kulit buah nanas.

Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Soares, Vaz,

Correia, Pessoa, dan Carneiro-da-Cunha (2012) dengan beberapa modifikasi.

a. Preparasi buah nanas (Ananas comosus (L.) Merr).

Buah Nanas dicuci dengan air mengalir, dikeringkan, dan dikupas. Kulit

buah sebanyak 70,0 g dipotong kecil-kecil kemudian dicampur dengan air

deionisasi 4°C (1:1 w/w) dan dihaluskan menggunakan blender. Larutan jus

disaring dengan menggunakan kain katun tipis lalu disentrifugasi dengan

kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Supernatan kemudian dikumpulkan

dalam gelas beker untuk proses selanjutnya.

b. Purifikasi dengan teknik ethanol precipitation

Supernatan dari kulit buah nanas sebanyak 100,0 mL didinginkan hingga

mencapai suhu 4°C kemudian ditambahkan dengan etanol 90% dengan

perbandingan 1:3. Campuran diaduk menggunakan magnetic stirrer selama 5


19

menit dan didiamkan selama 24 jam pada suhu 4°C sehingga didapatkan

endapan koloidal putih hingga kuning muda. Setelah terjadi pengendapan,

campuran kemudian diuapkan untuk memisahkan etanol menggunakan vacuum

rotary evaporator dengan suhu 50°C selama 30 menit. Endapan dikumpulkan

dalam cawan petri dan dipekatkan menggunakan waterbath dengan suhu 50°C

selama 3 jam. Cairan kental berwarna kekuningan dikumpulkan sebagai ekstrak

kulit buah nanas.

4. Analisis kualitatif

Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Panda (2000)

dengan beberapa modifikasi. BSA sebanyak 0,5 mL dengan konsentrasi 50 mg/mL

dilarutkan ke dalam 10,0 mL air deionisasi, ekstrak kulit buah nanas sebanyak 250,0

mg dilarutkan ke dalam 50,0 mL air deionisasi, dan ninhidrin sebanyak 350,0 mg

dilarutkan ke dalam 100,0 mL etanol 90%. Larutan BSA diambil sebanyak 1 mL

lalu dimasukan ke dalam tabung reaksi dan ditambah dengan larutan ninhidrin

sebanyak 5 mL. Campuran dipanaskan pada suhu 100°C selama 15 menit sehingga

muncul warna biru-ungu yang menandakan terjadi reaksi antara asam amino

dengan ninhidrin. Analisis yang sama juga dilakukan untuk larutan ekstrak kulit

buah nanas dan air deionisasi. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.

5. Penetapan kadar enzim bromelain ekstrak kulit buah nanas

Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Ahmed (2005)

dengan beberapa modifikasi.


20

a. Pembuatan larutan uji

Ekstrak kulit buah nanas ditimbang sebanyak 250,0 mg dan dilarutkan ke

dalam 25,0 mL aquadest (5°C) sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji

sebesar 10000 µg/mL.

b. Pembuatan larutan pembanding BSA

BSA sebanyak 0,5 mL dengan konsentrasi 50 mg/mL dilarutkan ke dalam

25,0 mL aquadest (5°C). Larutan tersebut diambil sebanyak 4,0; 5,5; 7,0; 8,5

dan 10,0 mL lalu ditambah dengan aquadest (5°C) hingga 10,0 mL, sehingga

diperoleh konsentrasi larutan pembanding BSA sebesar 400, 550, 700, 850 dan

1000 µg/mL.

c. Penetapan panjang gelombang maksimum

Larutan baku BSA dengan konsentrasi 400, 700, dan 1000 µg/mL

dimasukan ke dalam tabung reaksi dan divortex selama 30 detik, lalu didiamkan

selama OT. Larutan diukur serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm.

d. Pengukuran absorbansi larutan standar dan uji

Larutan BSA dengan konsentrasi 400, 550, 700, 850 dan 1000 µg/mL

diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum terhadap blanko yang

terdiri dari aquadest (5°C). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. Kemudian,

larutan uji dengan konsentrasi 10000 µg/mL diukur serapannya pada panjang

gelombang maksimum terhadap blanko yang terdiri dari aquadest (5°C).

Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.


21

e. Estimasi kadar enzim bromelain

Berdasarkan hasil dari prosedur 5 d untuk BSA dan ekstrak kulit buah nanas

kemudian dihitung nilai % kadar enzim.

6. Pembuatan larutan uji aktivitas antioksidan

Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Thangaraj (2016)


a. Pembuatan larutan DPPH

DPPH sebanyak 15,8 mg ditimbang dan dilarutkan ke dalam metanol p.a.

hingga 100,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan DPPH sebesar 0,4

mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat

baru.

b. Pembuatan larutan standar rutin

Rutin sebanyak 5,0 mg dilarutkan ke dalam metanol p.a hingga 100,0 mL.

Larutan tersebut diambil sebanyak 2,0; 3,0; 4,0; 5.0 dan 6,0 mL lalu ditambah

dengan metanol p.a hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan

standar rutin sebesar 10, 15, 20, 25, dan 30 µg/mL.

c. Pembuatan larutan uji

Ekstrak kulit buah nanas sebanyak 250,0 mg ditimbang dan dilarutkan ke

dalam aquadest hingga 25,0 mL. Larutan tersebut diambil sebanyak 3,0; 3,5;

4,0; 4,5 dan 5,0 mL lalu ditambah dengan aquadest (5°C) hingga 10,0 mL,

sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 dan 5,0

mg/mL.


22

7. Uji Aktivitas Antioksidan

Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Thangaraj (2016)


a. Uji Pendahuluan

Dalam tiga buah tabung reaksi, masing-masing ditambah dengan larutan

DPPH dan air deionisasi, larutan rutin 25 µg/mL, dan larutan bromelain 5

mg/mL sebanyak 1,0 mL kemudian ditambah dengan metanol p.a sebanyak 3

mL. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan didiamkan selama

30 menit. Setelah 30 menit, perubahan warna dari ketiga larutan diamati.

Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.

b. Penentuan operating time (OT)

Dalam tiga buah labu ukur 5 mL, masing-masing ditambah dengan larutan

DPPH dan larutan rutin 5, 15, dan 25 µg/mL sebanyak 1,0 mL kemudian

ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan divortex selama 30

detik dan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometes visibel

pada panjang gelombang 517 nm tiap 5 menit selama 1 jam. Replikasi dilakukan

sebanyak 3 kali.

c. Penetapan panjang gelombang maksimum

Dalam tiga buah labu ukur 10 mL, masing-masing ditambah dengan larutan

DPPH sebanyak 0,5; 1,0; dan 1,5 mL, kemudian ditambah dengan metanol p.a

hingga tanda batas, sehingga diperoleh konsentrasi DPPH sebesar 0,020; 0,040;

dan 0,060 mM. Larutan dimasukan ke dalam tabung reaksi dan divortex selama


23

30 detik, lalu didiamkan selama OT. Larutan diukur serapannya pada panjang

gelombang 400-600 nm.

d. Pengukuran absorbansi larutan kontrol DPPH

Larutan DPPH sebanyak 2,0 mL dimasukan ke dalam labu ukur 10 mL dan

ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Setelah OT, larutan dibaca

serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang

gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.

e. Pengukuran absorbansi larutan uji

Larutan DPPH sebanyak 2,0 mL dimasukan ke dalam labu ukur 10 mL dan

ditambah dengan 2 mL larutan pembanding dan larutan uji pada berbagai seri

konsentrasi yang telah dibuat, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga

tanda batas. Larutan divortex selama 30 detik, lalu didiamkan selama OT.

Setelah OT, larutan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer

visibel pada panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 3

kali.

f. Estimasi aktivitas antioksidan

Berdasarkan hasil dari prosedur 7 d dan e untuk rutin dan ekstrak bromelain

kemudian dihitung niai %IC dan IC50.

F. Analisis Hasil

Kadar protein total dalam ekstrak kulit buah nanas dinyatakan sebagai

persentase. Nilai absorbansi larutan uji dimasukan ke dalam persamaan regresi

linier kurva baku BSA dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan baku, sedangkan


24

sumbu y adalah absorbansi sehingga diperoleh konsentrasi protein total yang

kemudian dikonversi menjadi persentase kadar protein total dalam ekstrak kulit

buah nanas.

Aktivitas penangkapan radikal DPPH (%IC) dihitung berdasarkan rumus:

Absorbansi larutan kontrol − Absorbansi larutan pembanding/uji

Absorbansi larutan kontrol ×100 %

Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 menggunakan persamaan

regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun pembanding,

sedangkan sumbu y adalah %IC.

Data lalu dianalisis secara statistik untuk menentukan ada atau tidaknya

perbedaan bermakna antara nilai IC50 larutan pembanding dan larutan uji. Analisis

statistik dilakukan dengan panduan Bolton dan Bon (2010) dan dengan software R

3.2.5. Nilai IC50 diuji dengan Shapiro-Wilk untuk mengetahui distribusi data tiap

kelompok. Apabila didapat distribusi data yang normal maka analisis dilanjutkan

dengan uji F dengan taraf kepercayaan 95% untuk mengetahui homogenitas data

kelompok. Apabila didapat data yang homogen maka analisis dilanjutkan dengan

uji T-Independent untuk melihat perbedaan antar kelompok bermakna (signifikan)

(p<0,05) atau tidak bermakna (tidak signifikan) (p>0,05). Apabila didapat data

yang tidak homogen maka analisis dilanjutkan dengan uji T-Independent unequal

variances (Welch’s T-test) untuk melihat kebermaknaan perbedaan tiap kelompok.

Apabila didapatkan distribusi tidak normal, maka analisis dilanjutkan dengan uji

Lavene dengan taraf kepercayaan 95% untuk mengetahui homogenitas data

kelompok. Analisis dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney untuk melihat perbedaan


25

antar kelompok bermakna (signifikan) (p<0,05) atau tidak bermakna (tidak

signifikan) (p>0,05).


26

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Buah

Determinasi merupakan sebuah tahap awal dalam sebuah penelitian dengan

menggunakan tanaman. Determinasi tanaman bertujuan untuk mengetahui

kebenaran identitas tanaman yang digunakan dalam penelitian serta untuk

meminimalisir akan adanya kesalahan yang terjadi ketika melakukan pengambilan

sampel. Jaminan kebenaran sampel sangat penting karena pada buah nanas terdiri

dari berbagai macam varietas. Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium

Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta,

pada tanggal dengan acuan buku Flora of Java (Backer dan van Den Brink, 1963).

B. Hasil Pengumpulan Bahan

Bahan yang diperlukan adalah kulit buah nanas. Bahan tanaman pada

penelitian ini diperoleh dari Pasar Stan, Maguwoharjo, Yogyakarta. Buah nanas

yang digunakan adalah buah nanas yang masih muda dan dibeli dari satu orang

penjual saja pada hari yang sama. Pertimbangan tersebut dikarenakan dengan umur

buah nanas yang masih muda diharapkan kandungan bromelain yang masih tinggi

dan untuk diharapkan buah nanas yang diperoleh berasal dari tempat tumbuh yang

sama, serta varietas yang sama.


27

C. Hasil Preparasi Sampel

Kulit buah nanas yang telah dikupas dari daging buah kemudian diblender

untuk mendapatkan ukuran partikel yang lebih kecil. Ukuran partikel yang lebih

kecil akan membuat luas permukaan sampel yang mengalami kontak dengan

pelarut semakin besar. Kontak dengan pelarut yang semakin besar akan

memudahkan pelarut untuk menarik senyawa yang diinginkan. Adanya kontak

antar penyari dengan sampel mengakibatkan adanya kesempatan penyari untuk

masuk menembus membran sel dan menarik senyawa yang diinginkan (Rahayu,

2009). Air deionisasi digunakan sebagai pelarut karena dapat melarutkan enzim

bromelain yang bersifat hipofilik yang terkandung di dalam kulit buah nanas. Kulit

buah yang telah diblender kemudian disaring menggunakan corong Buchner yang

dilapisi dengan kain katun dengan bantuan pompa vakum.

Hasil penyaringan yang telah didapat kemudian didinginkan sampai pada

suhu 4o C. Hal ini berguna untuk menjaga supaya enzim tidak rusak dan tetap stabil

serta menjaga keberadaan aktivitas dari enzim bromelain. Selain itu, menurut

Dennison (2003), menjaga proses ekstraksi dalam keadaan dingin dapat menjaga

enzim dari denaturasi dan degradasi. Hal ini disebabkan enzim secara struktur

sangat labil dan sangat rentan terhadap degradasi mikroba. Denaturasi dan

degradasi dapat diminimalisir dengan menjaga enzim dalam keadaan dingin pada

suhu 4oC. Filtrat kemudian disentrifugasi supaya enzim kasar terpisah dari sisa-sisa

jaringan nanas. Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit.

Hasil sentrifugasi yang didapat berupa endapan yang merupakan sisa-sisa jaringan

nanas dan supernatan yang mengandung enzim kasar bromelain. Supernatan yang


28

mengandung bromelain diambil sebagai crude extract. Crude extract umumnya

mempunyai aktivitas yang rendah karena masih merupakan campuran dari beberapa

enzim dan ada kemungkinan masih terkandung senyawa-senyawa yang lain selain

enzim. Purifikasi dilanjutkan dengan pendinginan ekstrak kasar pada suhu 4°C,

kemudian dilakukan penambahan etanol dingin (90%) dengan perbandingan 1:3.

Campuran kemudian diaduk dengan menggunakan magnetic stirrer untuk

membantu etanol menarik senyawa-senyawa selain bromelain untuk terpisah.

Etanol merupakan pelarut organik yang sesuai untuk memisahkan senyawa selain

bromelain karena menurut Englard dan Seifter (1990), pelarut organik seperti etanol

akan mengakibatkan pengendapan terhadap protein. Campuran kemudian

didiamkan selama 24 jam dalam lemari pendingin. Hal ini untuk memberi waktu

bagi campuran untuk terpisah membentuk endapan koloidal, dimana bromelain

tidak larut dalam pelarut organik.

Endapan koloidal yang telah terbentuk kemudian dipisahkan dari campuran

hingga hanya tersisa endapan koloidal dengan etanol yang masih tersisa sedikit di

dalam campuran. Campuran kemudian dihilangkan sisa etanolnya dengan rotary

evaporator. Proses dalam rotary evaporator ini dilakukan pada suhu 50oC untuk

menjaga kandungan enzim bromelain yang ada didalam ekstrak kulit buah nanas

tetap stabil. Prinsip kerja dari rotary evaporator ini adalah memisahkan campuran

dari pelarutnya dengan adanya penurunan tekanan, sehingga pelarut akan lebih

cepat menguap di bawah titik didihnya dan senyawa yang dituju dari pemisahan

pelarut ini tidak mengalami kerusakan. Langkah selanjutnya dilakukan pemekatan

di atas waterbath. Pemekatan ini dilakukan untuk menghilangkan sisa etanol dalam


29

ekstrak kulit buah nanas hingga didapatkan bobot tetap dari ekstrak. Ekstrak kental

yang telah didapat kemudian ditimbang bobot tetapnya. Bobot tetap menurut

Faarmakope Indonesia (1979) adalah bobot yang telah mengalami penimbangan

dua kali berturut-turut tidak mengalami perubahan lebih dari 0,5 mg tiap gram sisa

yang ditimbang. Bobot ekstrak kulit buah nanas yang didapat sebesar 3,299 gram

dengan rendemen yang didapat sebesar 1,5713%. Pada penelitian ini tidak

dilakukan fraksinasi karena belum diketahui secara pasti kandungan senyawa yang

ada pada ekstrak kulit buah nanas yang dibuat, sehingga hanya digunakan ekstrak

kulit buah nanas.

D. Hasil uji pendahuluan

1. Uji Ninhidrin

Uji ninhidrin merupakan uji pendahuluan untuk mengetahui adanya

keberadaan protein yang diharapkan pada kulit buah nanas. Uji ini merupakan uji

kualitatif yang menjadi dasar untuk uji kuantitaf penetapan kadar enzim bromelain.

Uji dengan metode ninhidrin ini menghasilkan warna ungu (Ruherman’s Purple)

jika dalam reaksi yang diujikan terdapat asam amino (Boyer, 2011). Uji ini

merupakan uji yang cepat dan sensitive dalam mendeteksi asam amino, protein, dan

peptide. Akan tetapi uji ini tidak mampu memberikan hasil yang selektif sehingga

tidak bisa digunakan untuk menentukan asam amino dalam tingkat yang lebih

spesifik.


30

Gambar 1. Reaksi Ninhidrin dengan protein (Bottom, Hanna dan

Siehr, 1978)

Ninhidrin akan bereaksi dengan gugus amino alfa yang terdapat dalam asam

amino, peptida dan protein. Karena terjadi reaksi antara ninhydrin dengan gugus

amino alfa maka akan terbentuk hidrindantin. Ninhidrin kemudian akan

berinteraksi dengan hidrindantin dan NH3 untuk membentuk senyawa yang mampu

menghasilkan warna ungu.

Gambar 2. Hasil uji ninhidrin


31

Uji pendahuluan ini menggunakan kontrol negatif. Kontrol negatif yang

digunakan yaitu larutan ninhidrin yang dicampur dengan air deionisasi untuk

menunjukkan jika hasilnya negatif. Uji pendahuluan ini memberikan hasil positif

dilihat dari terbentuknya warna biru-keunguan pada campuran larutan ninhidr in

dengan larutan sampel. Sehingga dapat disimpulkan bahwa kulit buah nanas

mengandung protein, yang salah satunya adalah bromelain.

2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Uji pendahuluan aktivitas antioksidan bertujuan untuk mengetahui adanya

keberadaan senyawa protein yang berperan sebagai senyawa antioksidan. Uji ini

merupakan uji kualitatif yang digunakan sebagai dasar untuk uji kuantitatif aktivitas

antioksidan ekstrak kulit buah nanas. Prinsip uji ini adalah reaksi antara ekstrak

kulit buah nanas dengan 1,1-difenil-2-pikrihidrazil (DPPH).

Menurut Molyneux (2004), DPPH merupakan senyawa radikal bebas yang

stabil karena adanya resonansi elektron di keseluruhan molekul yang menunjukkan

bahwa molekul stabil. Resonansi ini ditunjukkan dengan warna DPPH yang

berwarna ungu. Senyawa antioksidan yang terkandung di dalam ekstrak akan

merubah warna DPPH dari ungu menjadi kuning. Hal tersebut dikarenakan

senyawa antioksidan memiliki elektron bebas yang tidak berpasangan sehing ga

dapat mengikat elektron bebas dari DPPH (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan

Mohammad, 2009).


32

Gambar 3. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A : kontrol negatif = DPPH

+ metanol; B : kontrol positif = DPPH + rutin; C : sampel)

Uji ini menggunakan kontrol positif dan kontrol negatif. Kontrol positif

yang digunakan adalah DPPH yang direaksikan dengan rutin yang menunjukkan

hasil positif. Kontrol negatif yang digunakan adalah DPPH yang menunjukkan hasil

negatif. Reaksi antara ekstrak kulit buah nanas dengan DPPH menunjukkan hasil

positif dengan adanya perubahan warna ungu menjadi kuning yang dapat dilihat

secara visual dengan mata. Sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak kulit buah

nanas memiliki aktivitas sebagai antioksidan.

E. Hasil Penetapan Kadar Enzim Bromelain Terhadap BSA

Dalam tanaman nanas terkandung banyak mineral, vitamin, lemak, glukosa

dan protein. Senyawa-senyawa tersebut banyak tersebar di berbagai bagian, antara

lain daging buah, daun, kulit, tangkai, dan batang. Enzim bromelain merupakan

salah satu unit fungsional dari protein itu sendiri, dimana dari berbagai penelit ian

terdahulu diketahui bahwa kulit nanas mengandung enzim bromelain. Maka dari

itu, dilakukan penetapan kadar enzim bromelain yang terkandung dalam ekstrak

kulit buah nanas (Ketnawa, Rawdkuen, dan Chaiwut, 2010).

A B C


33

Gambar 4. Kurva baku Bovine Serum Albumin (BSA)

Penetapan kadar dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometr i

pada daerah UV pada panjang gelombang 280 nm. Menurut Ahmed (2005),

pengukuran kadar pada panjang gelombang 280 nm ini dapat diaplikasikan pada

protein murni, dimana asam amino yang dapat dideteksi merupakan asam amino

yang mempunyai cincin aromatic seperti tryptophan, tyrosin, phenylamin, dan

histidin. Kelebihan metode ini adalah mudah, cepat dan tidak merusak kandungan

protein yang ada dalam sampel. Namun metode ini mempunyai kekurangan yaitu

cakupan protein yang dideteksi cukup variatif sehingga tidak mampu mengukur

kadar protein yang lebih spesifik. Selain itu juga sensitivitas dari metode ini

mencapai 0,2 – 2 mg/ml dan sangat tergantung dari keberadaan jumlah gugus

aromatik yang ada pada asam amino. Bovine Serum Albumin (BSA) digunakan

sebagai standar referens karena sifatnya yang stabil dan telah banyak digunakan

dalam penelitian sebelumnya terhadap penghitungan kadar protein.

y = 0,0006833x - 0,000533R = 0,9999

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 200 400 600 800 1000 1200

Ab

sorb

ansi

Konsentrasi (µg/mL)


34

Tabel I. Hasil pengukuran absorbansi kadar

enzim bromelain terhadap BSA

Replikasi Konsentrasi

(µg/mL) Absorbansi

Persamaan regresi linear

1

400 0,273 y = 0,0006833x

– 0,000533

r = 0,9999

550 0,375

700 0,478

850 0,580

1000 0,683

2

400 0,251 y = 0,0006833x

– 0,020933

r = 0,9999

550 0,358

700 0,455

850 0,561

1000 0,662

3

400 0,274 y = 0,0006893x

– 0,004333

r = 0,9998

550 0,371

700 0,477

850 0,585

1000 0,684

Hasil pengukuran absorbansi pada replikasi 1 dan 2 menunjukkan nilai r

sebesar 0,9999. Sedangkan pada replikasi 3 menunjukkan nilai r sebesar 0,9998.

Nilai r yang baik menunjukkan koefisisen korelasi yang baik juga, ditunjukkan dari

semakin mendekatinya titik-titik hasil perbandingan antara konsentrasi BSA

dengan absorbansi BSA terhadap garis lurus yang terbentuk (Gambar 6).

Secara berturut-turut, persamaan regresi yang didapat dari replikasi 1, 2, dan

3 yaitu: y = = 0,0006833x – 0,000533; y = 0,0006833x – 0,020933; dan y =

0,0006893x – 0,004333. Hasil yang diperlihatkan pada tabel I menunjukkan bahwa

terdapat hubungan yang linear antara konsentrasi BSA dengan absorbansi yang

dihasilkan. Hal ini sesuai dengan Ahmed (2005) yang menyatakan bahwa semakin


35

tinggi konsentrasi dari protein yang diukur (dalam hal ini adalah BSA) maka

semakin tinggi pula absorbansi yang dihasilkan. Persamaan regresi yang didapat

kemudian akan digunakan dalam menentukan nilai kadar enzim bromelain. Ekstrak

kulit buah nanas diukur nilai absorbansinya untuk kemudian digunakan dalam

menghitung kadar enzim bromelain yang dihitung terhadap BSA. Secara berturut-

turut nilai absorbansi ekstrak kulit buah nanas yang didapat adalah 0,545; 0,531;

dan 0,531.

Tabel II. Hasil penetapan kadar enzim bromelain

Replikasi

Bobot

enzim (mg)

Bobot

ekstrak (mg)

Kadar Enzim

(%) b/b

x ± SD

1 19,96 250,5 7,95 7.8233 ±

0,1096 2 19,44 250,5 7,76

3 19,44 250,5 7,76

Hasil penetapan kadar enzim bromelain dari kulit buah nanas yang dihitung

terhadap BSA dapat dilihat pada tabel 2. Secara rata-rata, kadar enzim yang didapat

dari penelitian ini sebesar 7,8233 % b/b. Hasil ini sangat berbeda jauh dengan hasil

yang didapatkan oleh penelitian yang dilakukan Bresolin et al (2013) yang mampu

mencapai 75%. Hal yang mampu menyebabkan perbedaan hasil yang sangat jauh

ini salah satunya adalah singkatnya waktu sentrifugasi dimana pada penelit ian

Bresolin et al (2013) waktu sentrifugasi mencapai 30 menit dan pada penelitian ini

waktu sentrifugasi hanya mencapai 10 menit. Kemudian bentuk ekstrak kental

sebagai hasil purifikasi dari ekstrak kulit buah nanas yang memungkinkan masih

adanya kandungan protein yang lain selain bromelain dan juga masih adanya


36

kandungan air yang terdapat di dalam ekstrak kental. Hal ini berbeda dengan hasil

dari Bresolin et al (2013) dimana hasil purifikasi mencapai bentuk serbuk.

F. Hasil Optimasi Uji Aktivitas Antioksidan

1. Penentuan Operating Time (OT)

Penentuan OT bertujuan untuk mendapatkan rentang waktu yang tepat

dalam pengukuran absorbansi sampel, dimana reaksi antara radikal DPPH dengan

senyawa uji telah berlangsung secara optimal sehingga dapat menghasi lkan

absorbansi yang stabil. Penentuan OT ini dilakukan dengan cara mengukur

absorbansi dari larutan DPPH dengan larutan rutin menggunakan spektrofotometer

visible pada panjang gelombang serapan maksimum teoritis, yaitu 517 nm (Kedare

dan Singh, 2011).

Penentuan OT didasarkan pada waktu ketika nilai absorbansi mulai stabil

atau selisih nilai absorbansi tiap selang waktu mulai kecil. Pengukuran absorbansi

untuk penentuan OT ini dilakukan tiap selang waktu 5 menit selama 60 menit.

Dalam penentuan OT ini digunakan larutan rutin dengan 3 konsentrasi yang

berbeda, yaitu 5 µg/mL, 15 µg/mL, dan 25 µg/mL. Setiap konsentrasi akan

memberikan nilai absorbansi yang berbeda pada panjang gelombang yang

maksimum, sehingga ketiga konsentrasi tersebut akan merepresentasikan OT pada

setiap konsentrasinya.


37

Gambar 5. Kurva penentuan OT rutin

Hasil yang didapat menunjukkan bahwa nilai absorbansi yang stabil pada

larutan rutin ditunjukkan mulai pada menit 30 sampai 60. Hal ini sesuai dengan

teori dari Blois (1958) dan penelitian dari Kim et al (2002). Secara teoritis hal ini

menunjukkan bahwa pada menit ke-30 seluruh senyawa yang memliki daya

antioksidan pada larutan pembanding dan larutan uji telah tepat bereaksi dengan

radikal DPPH, sehingga OT untuk reaksi radikal DPPH dengan larutan pembanding

dan uij adalah 30 menit. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa pengukuran

akan memberikan hasil yang reprodusibel bila diukur pada menit ke-30 sampai 60.

2. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum (λ maks)

Penentuan panjang gelombang maksimum bertujuan untuk mendapatkan

panjang gelombang yang akan digunakan untuk mengukur nilai serapan pada

sampel. Pada panjang gelombang maksimum inilah DPPH akan memberikan

serapan yang maksimum. Penentuan panjang gelombang maksimum ini

menggunakan 3 konsentrasi larutan DPPH, yaitu 0,020; 0,040; dan 0,060 mM.

Setiap konsentrasi akan memberikan nilai serapan yang berbeda pada panjang

00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

1

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Ab

sorb

ansi

Waktu (Menit)

5 µg/ml 15 µg/ml 25 µg/ml


38

gelombang maksimum. Nilai serapan yang berbeda pada panjang gelombang

maksimum ini merepresentasikan penggunaan ketiga konsentrasi yang berbeda

dalam penenentuan panjang gelombang maksimum. Penentuan panjang gelombang

maksimum dilakukan pada rentang panjang gelombang 400-600 nm.

Tabel III. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum

DPPH

Konsentrasi larutan DPPH

λ maksimum hasil scanning

λ maksimum yang

digunakan

λ maksimum teoritis

0,020 mM 515,5

515,0 517,0 0,040 mM 515,0

0,060 mM 515,5

Dari tabel dapat dilihat bahwa panjang gelombang maksimum yang didapat

adalah 515 nm, yang merupakan rata-rata dari ketiga panjang gelombang dari 3

konsentrasi yang berbeda. Hasil yang didapatkan berbeda 2 nm dengan panjang

gelombang maksimum teoritis, yaitu 517 nm. Perbedaan selisih antara panjang

gelombang maksimum uji dengan panjang gelombang maksimum teoritis ini masih

diperbolehkan menurut Farmakope Indonesia IV (1995), dimana pergeseran

panjang gelombang yang diperbolehkan yaitu 2 nm dari batas yang ditentukan.

G. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan

Uji aktivitas antioksidan ekstrak kulit buah nanas dilakukan dengan

menggunakan metode DPPH. Prinsip pengukuran aktivitas antioksidan pada

metode ini adalah penangkapan elektron bebas dari senyawa radikal yang

menyebabkan berkurangnya intensitas warna radikal DPPH dari ungu menjadi

kuning (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009). DPPH merupakan


39

suatu senyawa radikal nitrogen yang tidak stabil karena mempunyai elektron bebas

yang tidak berpasangan yang mengakibatkan DPPH mempunyai sifat reaktif.

DPPH yang direaksikan dengan senyawa

Gambar 6. Reaksi antara senyawa antioksidan dengan DPPH (Li, Xu,

dan Chen, 2014).

antioksidan, dalam penelitian ini adalah ekstrak kulit buah nanas, akan mengikat

atom H dari senyawa antioksidan sehingga menyebabkan terjadinya delokalisas i

elektron. Hal inilah yang menyebabkan DPPH menjadi stabil karena adanya donor

elektron dari senyawa antioksidan. Peristiwa tersebut yang menyebabkan sifat

DPPH sebagai radikal bebas menurun.

Dalam penelititan ini kontrol positif yang digunakan adalah rutin. Rutin

merupakan senyawa golongan flavonoid yang telah diketahui mempunyai aktivitas

antioksidan. Gugus -OH fenolat dari rutin yang menyebabkan senyawa tersebut

mampu mereduksi DPPH dengan menurunkan intensitas warnanya dari ungu

menjadi kuning (Li, Xu, dan Chen, 2014). Elektron bebas DPPH akan mengikat

satu atom H dari senyawa antioksidan, baik dari rutin maupun senyawa dalam

sampel, sehingga mencegah terjadinya resonansi elektron pada DPPH. Hal inilah

yang menyebabkan perubahan warna ungu menjadi kuning pada DPPH. Perubahan

warna tersebut sebanding dengan jumLah radikal bebas DPPH yang berhasil

ditangkap oleh senyawa antioksidan.


40

Gambar 7. Kurva persamaan regresi linear rutin

Pengukuran aktivitas antioksidan pada metode DPPH ini menggunakan

parameter IC50. IC50 merupakan konsentrasi senyawa uji yang diperlukan untuk

menghambat senyawa radikal bebas sebesar 50%. Menurut Zou, Lu, dan Wei

(2004), nilai IC50 ini didapatkan dari persamaan regresi linier yang menyatakan

adanya hubungan konsentrasi senyawa uji dengan persen aktivitas antioksidan yang

ditimbulkan. Hubungan antara aktivitas antioksidan dengan IC50 mempunya i

korelasi berbanding terbalik. Semakin kecil nilai senyawa uji IC50, semakin besar

aktivitas antioksidan dari senyawa tersebut.

Dari tabel IV dapat dilihat bahwa semakin tinggi konsentrasi rutin, semakin

kecil nilai absorbansi yang dihasilkan. Hal ini sebanding dengan besarnya persen

aktivitas antioksidan yang ditimbulkan, karena semakin banyaknya pendonor atom

untuk radikal DPPH yang membuat DPPH menjadi lebih stabil.

y = 2.0646x - 9.7888r = 0.9999

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40%IC

Konsentrasi (µg/mL)


41

Tabel IV. Hasil aktivitas antioksidan rutin dengan

menggunakan metode DPPH


(µg/mL)

Absorbansi kontrol

DPPH

Absorbansi larutan

pembanding %IC

Persamaan regresi

linear

1

10

0,805

0,716 11,0559 y = 2,0646x –

9,7888

r = 0,9999

15 0,635 21,1180

20 0,554 31,1801

25 0,468 41,8633

30 0,384 52,2981

2

10

0,810

0,710 12,4221 y = 2,13x – 9,1082

r = 0,9997

15 0,631 22,2360

20 0,538 33,7888

25 0,450 44,4444

30 0,368 54,5679

3

9,8

0,798

0,705 11,6541 y = 2,1529x –

10,5263

r = 0,9995

14,7 0,630 21,0526

19,6 0,541 32,2055

24,5 0,451 43,4837

29,4 0,365 54,2606

Dari gambar dapat dilihat bahwa replikasi 1 dari rutin memiliki persamaan

regresi linear dengan nilai r paling baik, yaitu 0,9999. Semakin baik nilai r yang

mendekati 1 menunjukkan bahwa semakin baik pula koefisien korelasi dari regresi

linear yang ditunjukkan dengan semakin mendekatnya titik-titik hasil perbandingan

antara konsentrasi rutin dengan %IC rutin terhadap garis-garis yang terbentuk.

Dengan kata lain, hasil yang ditunjukkan dari gambar menunjukkan bahwa terdapat

korelasi antara nilai konsentrasi rutin dengan %IC rutin yang tidak lain adalah

aktivitas antioksidan yang dihasilkan. Persamaan regresi yang didapatkan

kemudian digunakan untuk menghitung IC50.


42

Tabel V. Hasil aktivitas antioksidan ekstrak kulit buah nanas dengan

menggunakan metode DPPH


(mg/mL)

Absorbansi

kontrol

DPPH

Absorbansi larutan

pembanding %IC

Persamaan

regresi linear

1

3,006

0,868

0,595 31,4516 y =

10,2790x + 0,2994

r = 0,9990

3,507 0,552 36,4055

4,008 0,501 41,0138

4,509 0,465 46,4287

5,010 0,415 52,1889

2

3,0

0,861

0,601 29,9539 y = 10,4574x -

1,3907

r = 0,9999

3,5 0,557 35,3077

4,0 0,513 40,4181

4,5 0,469 45,5284

5,0 0,422 50,9872

3

3,0

0,874

0,609 30,3203 y = 10,5263x -

1,1441

r = 0,9996

3,5 0,560 35,9267

4,0 0,518 40,7322

4,5 0,468 46,4530

5,0 0,425 51,3729

Gambar 8. Kurva persamaan linear ekstrak kulit buah nanas

y = 10.458x - 1.3924r = 0.9999

0

10

20

30

40

50

60

0 1 2 3 4 5 6

%IC

Konsentrasi (mg/mL)


43

Persamaan regresi linear dan perhitungan IC50 ekstrak kulit buah nanas

ditunjukkan pada tabel V. Dari tabel dapat dilihat bahwa semakin tinggi konsentrasi

ekstrak kulit buah nanas yang digunakan semakin tinggi persen aktivitas

antioksidannya. Konsentrasi yang digunakan pada ekstrak kulit buah nanas lebih

tinggi daripada konsentrasi rutin. Hal ini untuk mendapatkan rentang nilai

absorbansi yang masuk dalam rentang 0,2-0,8.

Persamaan regresi linear yang telah didapatkan digunakan untuk

menghitung nilai IC50 dari masing-masing replikasi. Perhitungan nilai IC50 rutin dan

ekstrak kulit buah nanas ditunjukkan pada tabel VI.

Tabel VI. Hasil perhitungan nilai IC50 rutin dan ekstrak kulit buah

nanas

Rutin

Replikasi IC50 (μg/mL) Rerata ± SD

1 28,9591 28,2744 ± 0,6202 2 27,7503

3 28,1138 Ekstrak kulit buah nanas

Replikasi IC50 (μg/mL) Rerata ± SD

1 4835,1 4869,3 ± 28,2744 2 4914,2

3 4858,6

Secara berturut-turut, nilai IC50 yang didapat dari ketiga replikasi adalah

4893,4 μg/mL, 4914,2 μg/mL, dan 4858,6 μg/mL, dengan rerata (4888,733 ±

28,744) μg/mL. Hal ini jika dibandingkan dengan penelitian dari Hatam, Suryanto

dan Abidjulu (2013), hasil yang didapatkan jauh berbeda dimana nilai IC50 yang

didapatkan oleh penelitian Hatam, Suryanto dan Abidjulu mencapai 1513,56


44

μg/mL. Hal yang menyebabkan perolehan nilai IC50 pada penelitian ini sangat

tinggi masih belum dipahami oleh peneliti.

Uji statistik dilakukan setelah mendapatkan nilai IC50. Uji statistik ini

digunakan untuk memastikan kebermaknaan nilai IC50 rutin dengan nilai IC50

ekstrak kulit buah nanas. Uji statistik menggunakan software R seri i386 3.0.2. Uji

pertama adalah uji normalitas data. Uji ini dilakukan untuk melihat apakah data

terdistribusi normal atau tidak. Uji normalitas ini juga yang akan menentukan jenis

uji yang akan digunakan selanjutnya. Apabila jumLah data kurang dari 50, maka

digunakan uji normalitas Saphiro-Wilk (Dahlan, 2012).

Hasil uji statistik menunjukkan nilai p-value untuk IC50 rutin adalah 0,568

dan nilai p-value untuk IC50 ekstrak kulit buah nanas adalah 0,5605. Kedua data

IC50 mempunyai nilai p-value lebih besar dari 0,05 (taraf kepercayaan 95%). Hal

ini menunjukkan nilai signifikansi yang dihasilkan lebih besar daripada nilai

signifikansi yang ditentukan. Sehingga dapat disimpulkan bahwa nilai IC50 rutin

dan ekstrak kulit buah nanas terdistribusi normal.

Uji parametrik merupakan uji yang dilakukan setelah uji Saphiro-Wilk

dilakukan. Hal ini dilakukan karena data terdisribusi normal. Uji yang dilakukan

adalah uji t tidak berpasangan yang digunakan untuk menguji perbedaan dari kedua

kelompok data dengan objek yang berbeda, yaitu rutin dan ekstrak kulit buah nanas,

dilihat dari adanya perbedaan rata-rata. Hasil perhitungan yang didapat

menunjukkan nilai p-value adalah 3,306e-09. Nilai signifikansi yang didapat lebih

besar dari nilai signifikansi yang telah ditentukan, yaitu 0,05 (taraf kepercayaan


45

95%). Sehingga dapat disimpulkan bahwa nilai rata-rata IC50 rutin dan ekstrak kulit

buah nanas tidak berbeda bermakna.


46

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Ekstrak kulit buah nanas mempunyai aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar

(4869,3 ± 28,2744) μg/mL.

2. Kadar enzim bromelain dalam ekstrak kulit buah nanas yang dihitung terhadap BSA

sebesar (7,8233 ± 0,1096) % b/b.

B. Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai penetapan kadar enzim bromelain

dari kulit buah nanas dengan menggunakan standar bromelain.

2. Sebaiknya dilakukan penelitian lebih lanjut tentang kandungan yang lebih spesifik

dari ekstra kulit buah nanas.


47

DAFTAR PUSTAKA

Ames, B.N., Shigenaga, M.K., and Hagen, T.M., 1993, Oxidants, antioxidants, and

the degenerative diseases of aging, Proc. Natl. Sci., California, pp. 7915-

7922.

Ahmed, H., 2005, Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification, and

Characterization, CRC Press, Florida, pp. 35-42.

Ali, A.A., Milala, M.A., and Gulani, I.A., 2015, Antimicrobial Effect of Crude

Bromelain Extracted from Pineapple Fruit (Ananas comosus (Linn.) Merr.),

Advances in Biochemistry, 3, 1-4.

Backer, C.A., and Backuizen van Den Brink, Jr. R.C., 1963, Flora of Java, Vol. I,

40-56, N.V.P. Noordhoff-Gromingen, The Netherlands.

Backer, C.A., and Backuizen van Den Brink, Jr. R.C., 1963, Flora of Java, Vol. III,

26-33, N.V.P. Noordhoff-Gromingen, The Netherlands.

Bartholomew, D.P., Paull, R.E., and Rohrbach, K.G., 2002, The Pineapple: Botany,

Production and Uses, CABI Publishing, Wallingford, p. 113.

Bhattacharyya, B.K., 2008, Bromelain: An Overview, Natural Product Radiance,

7(4), 359-363.

Bolton, S., and Bon, C., 2010, Pharmaceutical Statistics: Practical and Clinical

Applications, Informa Healthcare, New York, pp. 82-106

Bottom, C.B., Hanna, S.S., and Siehr, D.J., 1978, Mechanism of the Ninhydrin

Reaction, Biochemical Education, 6(1), 4-5.

Bresolin, I.R.A.P., Bresolin, I.G.L., Silveira, G., Tambourgi, E.B., and Mazzola,

P.G., 2013, Isolation and Purification of Bromelain from Waste Peel of

Pineapple for Therapeutic Application, Brazilian Archives of Biology and

Technology, Vol.56, n.6: pp. 971-979

Chaisawvong, N., and Sangsrichan, S., 2009, Antioxidant and Radical Scavenging

Activity of Herbal Medicine Samples, Pure and Applied Chemistry International

Conference, 42-44.

Chaurasiya, R.S., and Hebbar, H.U., 2013, Extraction of Bromelain from Pineapple

Core and Purfication by RME and Precipitation Methods, Separation and

Purification Technology, 111, 90-97.


48

da Silva DIS, Nogueira GDR, Duzzioni AG, Barrozo MAS. 2013. Changes of

antioxidant constituents in pineapple (Ananas comosus) residue during

drying process. Indust Crops Prod 50: pp. 557–62.

de Simon, B. F., Perez-Ilzarbe, J., Hernandez, T., Gomez-Cordoves C and Estrella,

I. (1992), Importance of phenolic compounds for the characterization of

fruit juices, J Agric Food Chem, 40, pp. 1531-1535.

Dahlan, 2012, Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan, Salemba Medika,

Jakarta, hal. 17

Davidek, 1997, in Macek, K., 1972, Pharmaceutical Applications of Thin Layer

Chromatography, Elseiver Publishing Company, Amsterdam, London,

New York, pp. 569, 608-611

Dehpour, A.A., Ebrahimzadeh, M.A., Fazel, N.S., and Mohammad, N.S., 2009,

Antioxidant Activity of Methanol Extract of Ferula Assafoetida and Its

Essential Oil Composition, Grasas Aceites, 60(4), 405-412.

Dennison, C., 2003, A Guide to Protein Isolation, Springer International

Publishing, New York, pp. 84-88.

Depkes RI, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan Republik

Indonesia, Jakarta, pp, 7, 1036, 1061.

Englard, S. and Seifter, S., 1990, Precipitation techniques. in: Guide to protein

purification, Eds. Deutscher, M.P., Academic Press, San Diego, USA

Erukainure OL, Ajiboye JA, Okafor OY, Kosoko SB, Owolabi FO, Adenekan SO.

Antioxidant effect of pineapple (Ananas cosmosus) peel extract on alcohol

induced oxidative stress in splenic tissues of male albino rats, J Food

Biochem, 2012; 36:643–7

Fessenden, R.J. dan Fessenden, J.S., 1995, Kimia Organik, Jilid II, edisi 3, Penerbit

Erlangga, Jakarta, pp. 119-210.

Gharavi,N,. Haggarty,S., dan El-Kdai, A.O.S., 2007, Chemoprotective and

carcinogenic Effect of tert-Butylhydroquinone and Its Metabolites, Current

Drug Metabolism, 8, 1-7

Gardner, P.T., White, T.A.C., McPhail, D.B. and G.G. Duthie. 2000. The relative

contributions of vitamin C, carotenoids and phenolics to the antioxidant

potential of fruit juices. Food Chemistry. 68, 471-474.


49

Gulcin, I., Uguz, M. T., Oktay, M., Beydemir, S., & Kufrevioglu, O. I. (2004).

Evaluation of the antioxidant and antimicrobial activities of clary sage

(Salvia sclarea L.). Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 28, 25–33

Halliwell, B., 2012, Free Radicals and Antioxidant: Updating a Personal View,

Nutrition Review, 70, 257-265.

Halliwell, B., and Gutteridge, J.M.C., 2000, Free Radical in Biology and Medicine,

Oxford University Press, New York, p. 34.

Hatam, S.F., Suryanto, E., dan Abidjulu, J., 2013, Aktivitas Antioksidan dari

Ekstrak Kulit Nanas (Ananas comosus (L.) Merr), Jurnal Ilmiah Farmasi,

Vol. 2:01, hal. 2302-2493.

Hossain MA, Rahman SM. 2011. Total phenolics, flavonoids and antioxidant

activity of tropical fruit pineapple. Food Res Intl 44(3):672–6.

Ishihara, H., Takahashi, N., Oguri, S., dan Tejima, S., 1979, Complete Structure of

the Carbohydrate Moiety of Stem Bromelain, The Journal of Biological

Chemistry, pp. 10715-10719

Kedare, S.B., and Singh, R.P., 2011, Genesis and Development of DPPH Method

of Antioxidant Assay, Journal of Food, Science, and Technology, 48(4),

412-422.

Ketnawa, S., Rawdkuen, S., and Chaiwut, P., 2010, Two Phase Partitioning and

Collagen Hydrolysis of Bromelain from Pineapple Peel Nang Lae Cultivar,

Biochemical Engineering Journal, 52(2010), 205-211.

Li, X., Xu, M., dan Chen, D., 2012, Protective Effect Against Hydroxyl-Induced

DNA Damage and Antioxidant Activity of Radic bupleuri In Vitro, Spatula

DD, 2(4), pp. 219-227

Manosroi, A., Chankhampan, C., Pattamapun, K., Manosroi, W., and Manosroi, J.,

2014, Antioxidant and Gelatinolytic Activities of Papain from Papaya Latex

and Bromelain from Pineapple Fruits, Chiang Mai J. Sci., 41(3), 635-648.

Maurer, H.R., 2001, Bromelain: biochemistry pharmacology, and medical use.

Cellular and Molecular Life Science, 58 1234-1245.

Manzoor, Z., Nawaz, A., Mukhtar, H., and Haq, I., 2016, Bromelain: Methods of

Extraction, Purification and Therapeutic Applications, Brazilian Archives

of Biology and Technology, vol. 59.


50

Molyneux, P., 2004, The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazil

(DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci.

Technol., 26(2), 211-219

Morales-Gonzalez, J.A., 2013, Oxidative Stress and Chronic Degenerative

Diseases: a Role for Antioxidants, Intech Publisher, Croatia, pp. 39-41.

Mulja, H.M., dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press,

Surabaya, pp.26-33.

Ou, B., Huang, D.J., Woodill, M.H., Flanagan, J.A., and Deemer, E.K., 2002,

Analysis of Antioxidant Activities of Common Vegetables Employing

Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) and Ferric Reducing

Antioxidant Power (FRAP) Assays: A Comparative Study, J. Agric. Food

Chem., 50, 3122-3128.

Panda, H., 2000, Herbal Cosmetics Hand Book, Asia Pasific Business Press, New

Delhi, pp. 525-526

Pendzhiev, A.M., 2002, Proteolytic Enzymes of Papaya: Medicinal Applications,

Pharmaceut. Chem. J., 36, 315-317.

Prakash, A., Rigelhof, F., and Miller, E., 2001, Antioxidant Activity: Medallion

Laboratories, Analithycal Progress, 19(2), 1-4.

Rukmana, 1996, Nanas Budidaya dan Paskapanen, Penerbit Kanisius, Yogyakarta,

pp. 75-76.

Sastrohamidjojo, H., 2001, Spektroskopi, Penerbit Liberti, Yogyakarta, hal 1-43.

Soares, P.A.G., Vaz, A.F.M, Correia, M.T.S., Pessoa, A., and Carneiro-da-Cunha,

M.G., 2012, Purification of Bromelain from Pineapple Wastes by Ethanol

Precipitation, Separation and Purification Technology, 98, 389-395.

Tjitrosoepomo, G., 1994, Taksonomi Tumbuhan Obat-Obat, 113, Universitas

Gadjah Press, Yogyakarta.

van Lelyveld, L.J., and de Bruyn, J.A., (1977), polyphenols ascorbic acid and

related enzyme activites associated with black heart in Cayenne pineapple

fruit, Agrochemophysica, 9, 1-6

Winarsi, H., 2007, Antioksidan Alami dan Radikal Bebas, Potensi dan Aplikasinya

dalam Kesehatan, Kanisius, Yogyakarta, hal. 273-274


51

Zou, Y., Lu, Y., and Wei, D., 2004, Antioxidant Activity of a Flavonoid-Rich

Extract of Hypericum perforatum L. in Vitro, J. Agric. Food Chem., 52,

5032-5039.


52

LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman nanas

(Ananas comosus (L.) Merr.)


53

Lampiran 2. Gambar buah nanas


54

Lampiran 3. Perhitungan rendemen

Bobot masing-masing kulit buah nanas yang digunakan adalah 70 gram, sehingga

total bobot kulit buah nanas yang digunakan adalah 210 gram.

Cawan 1 (g) Cawan 2 (g) Cawan 3 (g)

Berat cawan 35,5880 38,3940 34,6945

Berat cawan +

ekstrak 55,2464 30,4336 35,8174

Berat ekstrak 1,1005 1,0897 1,1097

Total berat ekstrak kulit buah nanas = 1,1005 g + 1,0897 g + 1,1097 g

= 3,2999 g

Rendemen ekstrak kulit buah nanas = 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑑𝑎𝑝𝑎𝑡

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑏𝑎ℎ𝑎𝑛 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑔𝑢𝑛𝑎𝑘𝑎𝑛 ×100%

= 3,2999 𝑔𝑟𝑎𝑚

210 𝑔𝑟𝑎𝑚 ×100%

= 1,5713%


55

Lampiran 4. Penimbangan analisis kualitatif

a. Data penimbangan ekstrak kulit buah nanas

Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)

Berat wadah 14,6535 13,5859 14,7843

Berat wadah + sampel 14,9091 13,5882 15,0355

Berat wadah + sisa 14,6550 13,8373 14,7868

Berat sampel 0,2541 0,2514 0,2487

b. Data penimbangan ninhidrin

Ninhidrin

Berat wadah 13,5739

Berat wadah + sampel 13,9238

Berat wadah + sisa 13,5744

Berat sampel 0,3494

Lampiran 5. Data penimbangan penetapan kadar protein total


Berat wadah 25,8160 14,2743 23,7527


Berat wadah + sisa 25,8164 14,2751 23,7534

Berat sampel 0,2508 0,2505 0,2505


56

Lampiran 6. Optimasi penetapan kadar protein total

a. Penentuan operating time (OT) bovine serum albumine pada λ = 280 nm

Waktu (Menit) Absorbansi konsentrasi 400 µg/ml

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

5 0,271 0,268 0,270

10 0,272 0,268 0,271

15 0,271 0,268 0,271

20 0,271 0,269 0,271

25 0,272 0,268 0,272

30 0,271 0,268 0,271

OT yang diperoleh 5 menit



5 0,475 0,477 0,478

10 0,475 0,478 0,478

15 0,475 0,478 0,478

20 0,475 0,477 0,477

25 0,476 0,477 0,478

30 0,475 0,477 0,478




5 0,680 0,683 0,681

10 0,681 0,684 0,681

15 0,680 0,685 0,681

20 0,680 0,684 0,681

25 0,680 0,684 0,681

30 0,681 0,684 0,682



57

b. Penentuan λ maksimum bovine serum albumine

1. Spektra bovine serum albumine 400 µg/ml



58



59

Lampiran 7. Penetapan kadar protein total

a. Konsentrasi bovine serum albumine

1. Konsentrasi larutan induk bovine serum albumine

Replikasi V1

(ml)

C1

(mg/ml)

V2

(ml)

C2

(mg/ml)

1 0,5 50 25 1

2 0,5 50 25 1

3 0,5 50 25 1

2. Konsentrasi seri larutan bovine serum albumine

Replikasi V1

(ml)

C1

(µg/ml)

V2

(ml)

C2

(µg/ml)

1

4 1000 10 400

5,5 1000 10 550

7 1000 10 700

8,5 1000 10 850

10 1000 10 1000

2

4 1000 10 400

5,5 1000 10 550

7 1000 10 700

8,5 1000 10 850

10 1000 10 1000

3

4 1000 10 400

5,5 1000 10 550

7 1000 10 700

8,5 1000 10 850

10 1000 10 1000


60

b. Kurva baku bovine serum albumine

Replikasi Konsentrasi (µg/ml) Absorbansi Persamaan regresi

linear

1

400 0,273

y = 0,0006833x –

0,000533

r = 0,9999

550 0,375

700 0,478

850 0,580

1000 0,683

2

400 0,251

y = 0,0006833x –

0,020933

r = 0,9999

550 0,358

700 0,455

850 0,561

1000 0,662

3

400 0,274

y = 0,0006893x –

0,004333

r = 0,9998

550 0,371

700 0,477

850 0,585

1000 0,684

Persamaan regresi linear yang digunakan adalah y = 0,0006833x – 0,000533

c. Penetapan kadar protein total larutan uji

1. Konsentrasi ekstrak kulit buah nanas

Replikasi 1

𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎

𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 =

250,8 𝑚𝑔

25 𝑚𝑙 = 10032 µg/ml

Replikasi 2



250,5 𝑚𝑔

25 𝑚𝑙 = 10020 µg/ml


61

Replikasi 3



250,5 𝑚𝑔

25 𝑚𝑙 = 10020 µg/ml

2. Absorbansi ekstrak kulit buah nanas

Replikasi Absorbansi

1 0,545

2 0,531

3 0,531

3. Konsentrasi dan bobot enzim ekstrak kulit buah nanas

Replikasi 1


y = 0,0006833x – 0,000533

0,545 = 0,0006833x – 0,000533

x = 798,380 µg/ml

massa = konsenstrasi x volume

= 798,380 x 25 = 19959,5 µg = 19,96 mg

Replikasi 2


y = 0,0006833x – 0,000533

0,531 = 0,0006833x – 0,000533

x = 777,891 µg/ml


62

massa = konsentrasi x volume

= 777,891 x 25 = 19447,27 µg = 19,44 m

Replikasi 3


y = 0,0006833x – 0,000533

0,531 = 0,0006833x – 0,000533

x = 777,891 µg/ml

massa = konsentrasi x volume

= 777,891 x 25 = 19447,27 µg = 19,44 mg

4. Kadar enzim ekstrak kulit buah nanas

Persentase enzim = 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 ×100%

Replikasi 1

Persentase enzim = 19,96

250,8 ×100%

= 7,95%

Replikasi 2


250,5 ×100%

= 7,76%

Replikasi 3


250,5 ×100%

= 7,76%


63

Replikasi

Bobot

enzim

(mg)

Bobot

ekstrak

(mg)

Kadar

Enzim

(%) b/b

x ± SD

1 19,96 250,8 7,95

7.8233 ± 0,1096 2 19,44 250,5 7,76

3 19,44 250,5 7,76

Lampiran 8. Penimbangan pengujian aktivitas antioksidan

a. Data penimbangan DPPH


Berat wadah 14,2743 13,5727 13,5835


Berat wadah + sisa 14,2744 13,5727 13,5837

Berat sampel 0,0158 0,0158 0,0159

b. Data penimbangan rutin


Berat wadah 14,2743 13,5727 13,5835


Berat wadah + sisa 14,2743 13,5729 13,5836

Berat sampel 0,0050 0,0050 0,0049


64

c. Data penimbangan ekstrak kulit buah nanas


Berat wadah 14,3645 23,8360 20,5345


Berat wadah + sisa 14,3650 23,8375 20,5358

Berat sampel 0,2505 0,2500 0,2500

Lampiran 9. Perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding, dan

larutan uji

a. Konsentrasi DPPH

1. Replikasi 1

BM = 394,33

Mol =𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎

𝐵𝑀 =

15,8 𝑚𝑔

394,33= 0,0401 mmol

M =𝑚𝑜𝑙


0,0401 𝑚𝑚𝑜𝑙

0,1 𝐿= 0,4010 mM

2. Replikasi 2

BM = 394,33


𝐵𝑀 =

15,8 𝑚𝑔

394,33= 0,0401 mmol

M =𝑚𝑜𝑙


0,0401 𝑚𝑚𝑜𝑙

0,1 𝐿= 0,4010 mM

3. Replikasi 3

BM = 394,33


𝐵𝑀 =

15,9 𝑚𝑔

394,33= 0,0403 mmol

M =𝑚𝑜𝑙


0,0403 𝑚𝑚𝑜𝑙

0,1 𝐿= 0,4030 mM


65

b. Konsentrasi rutin

1. Konsentrasi larutan induk

Replikasi 1



5,0 𝑚𝑔

100 𝑚𝑙= 50 µg/ml

Replikasi 2



5,0 𝑚𝑔

100 𝑚𝑙= 50 µg/ml

Replikasi 3



4,9 𝑚𝑔

100 𝑚𝑙= 49 µg/ml

2. Konsentrasi seri larutan baku rutin

Replikasi V1

(ml)

C1

(µg/ml)

V2

(ml)

C2

(µg/ml)

1

2 50 10 10

3 50 10 15

4 50 10 20

5 50 10 25

6 50 10 30

2

2 50 10 10

3 50 10 15

4 50 10 20

5 50 10 25

6 50 10 30

3

2 49 10 9,8

3 49 10 14,7

4 49 10 19,6

5 49 10 24,5

6 49 10 29,4


66

c. Konsentrasi ekstrak kulit buah nanas

1. Konsentrasi larutan induk

Replikasi 1



250,5 𝑚𝑔

25 𝑚𝑙= 10,02 mg/ml

Replikasi 2



250 𝑚𝑔

25 𝑚𝑙= 10,00 mg/ml

Replikasi 3



250 𝑚𝑔

25 𝑚𝑙= 10,00 mg/ml

2. Konsentrasi seri larutan uji

Replikasi V1

(ml)

C1

(mg/ml)

V2

(ml)

C2

(mg/ml)

1

3 10,020 10 3,006

3,5 10,020 10 3,507

4 10,020 10 4,008

4,5 10,020 10 4,509

5 10,020 10 5,010

2

3 10,000 10 3,0

3,5 10,000 10 3,5

4 10,000 10 4,0

4,5 10,000 10 4,5

5 10,000 10 5,0

3

3 10,000 10 3,0

3,5 10,000 10 3,5

4 10,000 10 4,0

4,5 10,000 10 4,5

5 10,000 10 5,0


67

Lampiran 10. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan

a. Penentuan operating time (OT) rutin pada λ = 517 nm



5 0,812 0,811 0,816

10 0,793 0,903 0,797

15 0,787 0,796 0,790

20 0,782 0,791 0,785

25 0,780 0,787 0,783

30 0,780 0,783 0,781

35 0,780 0,783 0,781

40 0,781 0,782 0,779

45 0,781 0,782 0,780

50 0,782 0,783 0,781

55 0,783 0,785 0,782

60 0,785 0,788 0,785




5 0,681 0,689 0,680

10 0,641 0,662 0,651

15 0,619 0,638 0,628

20 0,607 0,620 0,609

25 0,599 0,605 0,596

30 0,593 0,605 0,584

35 0,593 0,605 0,584

40 0,590 0,600 0,581

45 0,585 0,595 0,574

50 0,581 0,587 0,570

55 0,579 0,582 0,568

60 0,578 0,577 0,568



68



5 0,518 0,503 0,510

10 0,501 0,511 0,499

15 0,493 0,483 0,463

20 0,453 0,451 0,438

25 0,429 0,426 0,409

30 0,398 0,408 0,410

35 0,397 0,394 0,399

40 0,397 0,381 0,394

45 0,393 0,381 0,389

50 0,389 0,375 0,386

55 0,386 0,372 0,382

60 0,380 0,369 0,375


b. Penentuan λ maksimum

1. Spektra DPPH 0,020 mM


69

2. Spektra DPPH 0,040 Mm


70

3. Spektra DPPH 0,060 mM


71

Lampiran 11. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH

%IC =𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙−𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 ×100%

a. Rutin


(µg/ml)

Absorbansi

kontrol

DPPH

Absorbansi

larutan

pembanding

%IC

Persamaan

regresi

linear

1

10

0,805

0,716 11,0559 y =

2,0646x –

9,7888

r = 0,9999

15 0,635 21,1180

20 0,554 31,1801

25 0,468 41,8633

30 0,384 52,2981

2

10

0,810

0,710 12,4221 y = 2,13x –

9,1082

r = 0,9997

15 0,631 22,2360

20 0,538 33,7888

25 0,450 44,4444

30 0,368 54,5679

3

9,8

0,798

0,705 11,6541 y =

2,1529x –

10,5263

r = 0,9995

14,7 0,630 21,0526

19,6 0,541 32,2055

24,5 0,451 43,4837

29,4 0,365 54,2606


72



(mg/ml)

Absorbansi

kontrol

DPPH

Absorbansi

larutan

pembanding

%IC

Persamaan

regresi

linear

1

3,006

0,868

0,595 31,4516 y =

10,2790x +

0,2994

r = 0,9990

3,507 0,552 36,4055

4,008 0,501 41,0138

4,509 0,465 46,4287

5,010 0,415 52,1889

2

3,0

0,861

0,601 29,9539 y =

10,4574x -

1,3907

r = 0,9999

3,5 0,557 35,3077

4,0 0,513 40,4181

4,5 0,469 45,5284

5,0 0,422 50,9872

3

3,0

0,874

0,609 30,3203 y =

10,5263x -

1,1441

r = 0,9996

3,5 0,560 35,9267

4,0 0,518 40,7322

4,5 0,468 46,4530

5,0 0,425 51,3729


73

Lampiran 12. Perhitungan nilai IC50 rutin dan ekstrak kulit buah nanas

a. Rutin

Replikasi 1


y = 2,0646x – 9,7888

50 = 2,0646x – 9,7888

x = 28,9591 µg/ml

Replikasi 2


y = 2,13x – 9,1082

50 = 2,13x – 9,1082

x = 27,7503 µg/ml

Replikasi 3


y = 2,1529x – 10,5263

50 = 2,1529x – 10,5263

x = 28,1138 µg/ml

Replikasi Persamaan regresi linear y IC50 X (nilai IC50)

µg/ml

1 y = 2,0646x – 9,7888 50 28,9591

2 y = 2,13x – 9,1082 50 27,7503

3 y = 2,1529x – 10,5263 50 28,1138


74

Replikasi IC50 SD X (µg/ml) X ± SD

1 28,9591

0,6202 28,2744 28,2744 ± 0,6202 2 27,7503

3 28,1138


Replikasi 1


y = 10,2790x + 0,2994

50 = 10,2790x + 0,2994

x = 4,8351 mg/ml = 4835,1 µg/ml

Replikasi 2


y = 10,4574x - 1,3907

50 = 10,4574x - 1,3907

x = 4,9142 mg/ml = 4914,2 µg/ml

Replikasi 3


y = 10,5263x - 1,1441

50 = 10,5263x - 1,1441

x = 4,8586 mg/ml = 4858,6 µg/ml


75

Replikasi Persamaan regresi linear y IC50 X (nilai IC50)

µg/ml

1 y = 10,2790x + 0,2994 50 4835,1

2 y = 10,4574x - 1,3907 50 4914,2

3 y = 10,5263x - 1,1441 50 4858,6

Replikasi IC50 SD X ( µg/ml) X ± SD

1 4835,1

28,2744 4869,3 4869,3 ± 28,2744 2 4914,2

3 4858,6


76

Lampiran 13. Uji statistik

a. Uji normalitas (Shapiro-Wilk Test)


77

Hipotesis null (H0) = data terdistribusi normal

Hipotesis alternatif (H1) = data tidak terdistribusi normal

Taraf kepercayaan 95%

Jika p-value kurang dari 0,05 maka H0 ditolak dan H1 diterima

Jika p-value tidak kurang dari 0,05 maka H1 ditolak dan H0 diterima

Data IC50 rutin dan ekstrak bromelain kulit buah nanas terdistribusi normal karena

p-value rutin = 0,568 dan p-value ekstrak bromelain kulit buah nanas = 0,5605.

Jadi, H1 ditolak dan H0 diterima sehingga kesimpulannya adalah data terdistribusi

normal.

b. Uji varian data

Hipotesis null (H0) = varian data tidak berbeda signifikan (homogen)

Hipotesis alternatif (H1) = varian data berbeda signifikan (tidak homogen)


Jika p-value kurang dari 0,05 maka H0 ditolak dan H1 diterima

Jika p-value tidak kurang dari 0,05 maka H1 ditolak dan H0 diterima


78

Varian data IC50 rutin dan ekstrak bromelain kulit buah nanas tidak homogen,

karena p-value = 0,008543. Jadi, H0 ditolak dan H1 diterima sehingga

kesimpulannya adalah varian data berbeda signifikan atau tidak homogen.

c. Uji hipotesis

Hipotesis null (H0) = data tidak berbeda signifikan

Hipotesis alternatif (H1) = data berbeda signifikan


Jika t’ kurang dari t maka H1 ditolak dan H0 diterima

Jika t’ tidak kurang dari t maka H0 ditolak dan H1 diterima

Data IC50 rutin dan ekstrak bromelain kulit buah nanas berbeda secara signifikan,

karena t’ = 4,302 dan t = 206,39. Jadi, H1 ditolak dan H0 diterima sehingga

kesimpulannya adalah data tidak berbeda signifikan.


79

Lampiran 14. Tabel t-distributions


80

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan dan

Penetapan Kadar Protein Total Ekstrak Kulit Buah Nanas

(Ananas comosus L. Merr)” ini memiliki nama lengkap

Yohanes Bintang Pambudi. Dilahirkan di kota Bantul pada

tanggal 15 Mei 1993 dari pasangan Antonius Suripto dan

Endang Nurhandayani. Penulis telah menyelesaikan

pendidikan di TK Angkasa Adisucipto Yogyakarta pada

tahun 1997 hingga 1999, kemudian melanjutkan pendidikan

dasar di SD Kanisius Baciro pada tahun 1999 hingga 2005,

pendidikan menengah di SMP Pangudi Luhur 2 Yogyakarta

pada tahun 2005 hingga 2008 dan SMA Pangudi Luhur van

Lith Muntilan pada tahun 2008 hingga 2011. Penulis kemudian melanjutkan

pendidikan perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta pada tahun 2012 hingga 2016. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, penulis cukup aktif dalam

kegiatan kemahasiswaan, kepanitiaan dan kegiatan lain. Penulis cukup aktif dalam

Jaringan Mahasiswa Kesehatan Indonesia (JMKI) Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta sebagai Humas periode 2012-2013. Penulis juga cukup

aktif dalam kegiatan kepanitiaan, antara lain : Panitia TITRASI periode 2013 dan

2014, Panitia Pelepasan Wisuda (2014), Panitia Pharmacy Performance dan Road

to School (2013).


UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN PENETAPAN KADAR …repository.usd.ac.id/8939/2/128114128_full.pdf ·...

Documents

Transcript of UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN PENETAPAN KADAR …repository.usd.ac.id/8939/2/128114128_full.pdf ·...