UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI AIR DAUN

GAMBIR (Uncaria gambir Roxb) DENGAN MIKRODILUSI

DAN ANALISIS KOMPONEN PENYUSUNNYA

NURI IZZATIL WAFA

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011

ABSTRAK

NURI IZZATIL WAFA. Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi Air Daun Gambir

(Uncaria gambir Roxb) dengan Mikrodilusi dan Analisis Komponen

Penyusunnya. Dibimbing oleh LAKSMI AMBARSARI dan WARAS

NURCHOLIS.

Daun gambir (Uncaria gambir Roxb) memiliki potensi sebagai obat

tradisional yang telah digunakan sejak lama oleh sebagian masyarakat. Hal ini

mendorong para peneliti untuk menguji aktivitas antibakteri daun gambir. Metode

yg umum digunakan yaitu difusi agar yang memiliki beberapa keterbatasan,

diantaranya membutuhkan waktu yang lama dan bahan yang lebih banyak.

Metode yang sedang dikembangkan yaitu metode cawan mikro (mikrodilusi) yang

menyediakan teknik penentuan konsentrasi hambat tumbuh minimum (KHTM)

dari sejumlah sampel yang berbeda dan membutuhkan sampel dalam jumlah yang

sedikit. Metode ini juga dapat digunakan untuk beragam jenis mikroorganisme,

murah, dan menghasilkan hasil yang yang dapat diulang. Penelitian ini bertujuan

menentukan konsentrasi hambat tumbuh minimum fraksi air daun gambir dengan

metode mikrodilusi dan melakukan analisis komponen yang terkandung di

dalamnya dengan GC-MS pirolisis. Daun gambir diekstraksi dengan

menggunakan metanol-air, lalu dipartisi dengan menggunakan n-heksana dan

kloroform. Ekstraksi daun gambir menghasilkan tiga jenis fraksi, yaitu fraksi

kloroform, n-heksana, dan air dengan masing-masing rendemen sebesar 0.048 %,

0.031 % , dan 3.033 %. Fraksi yang digunakan untuk analisis selanjutnya adalah

fraksi air. Konsentrasi hambat tumbuh minimum fraksi air daun gambir terhadap

pertumbuhan E.coli dan S.aureus sebesar 0.05 mg/mL, sedangkan konsentrasi

bunuh minimumnya belum dapat ditentukan karena tidak berada pada range

konsentrasi 0.01-40 mg/mL. Hasil identifikasi dengan GC-MS pirolisis

menunjukkan bahwa fraksi air daun gambir mengandung senyawa pirokatekol

yang merupakan fragmen penyusun katekin.

ABSTRACT

NURI IZZATIL WAFA. Antibacterial Activities Assay of Aqueous Fraction of

Gambir Leaves (Uncaria gambir Roxb) by Microdilution and its Components

Analysis. Under the direction of LAKSMI AMBARSARI and WARAS

NURCHOLIS

The potency of gambir (Uncaria gambir Roxb) leaves as a traditional medicine

had known since long time ago. This is the reason for some researchers to

evaluate the antibacterial activities of gambir leaves. The method that usually used

for antibacterial assay is agar-diffusion which has some weakness, i.e. need more

time and materials. Nowadays, microdilution become antibacterial assay method

that has been developed in many countries. Microdilution gives a useful technique

to determine MIC of some different samples, and require only a little number of

the sample. This method also used for wide variety of microorganisms, not

expensive, and gives a reproducible result. This research aimed to determine

minimal inhibitory of aqueous fraction of Gambir leaves by microdilution method

and identified its components by pyrolisis GC-MS. Gambir leaves extracted with

methanol-water solution, and then being separated by using hexane and

chloroform. Gambir leaves extraction produce three fractions, i.e. chloroform,

hexane, and aqueous fraction which has yield 0.048 %, 0.031 % , and 3.033 %

respectively. Fraction which is used for further analysis is aqueous fraction. The

minimal inhibitory concentration of aqueous fraction of Gambir leaves toward

E.coli and S.aureus growth is 0.05 mg/mL, whereas minimal bactericidal

concentration was not observed within the concentration ranges of the fractions

tested (0.01-40 mg/mL). Identification result by pyrolisis GC-MS showed that

aqueous fraction of gambir leaves contain pyrocathecol which is composer

fragment of catechin.

UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI AIR DAUN

GAMBIR (Uncaria gambir Roxb) DENGAN MIKRODILUSI

DAN ANALISIS KOMPONEN PENYUSUNNYA

NURI IZZATIL WAFA

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011

Judul Skripsi : Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi Air Daun Gambir (Uncaria

gambir Roxb) dengan Mikrodilusi dan Analisis Komponen

Penyusunnya

Nama : Nuri Izzatil Wafa

NIM : G84061263

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr.Laksmi Ambarsari, MS Waras Nurcholis, M.Si

Ketua Anggota

Diketahui

Dr. Ir. I Made Artika, M. App Sc.

Ketua Departemen Biokimia

Tanggal lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-

Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan karya ilmiah dengan

judul Uji Aktivitas Antibakteri dan Analisis Komponen Fraksi Air Daun Gambir

(Uncaria gambir Roxb). Penelitian dilaksanakan dari bulan Juni 2010 sampai Mei

2011 di Laboratorium Penelitian Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Laksmi Ambarsari, MS dan

Waras Nurcholis, M.Si selaku pembimbing yang telah memberikan pengarahan,

saran, dan kritik selama penelitian ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih

kepada seluruh staf dan laboran Laboratorium Penelitian Biokimia atas bantuan

teknis selama penelitian ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih atas bantuan

dan dukungan Kalia Barnita, Umul Karimah, Silvikasari, Osy Yostia Utami, dan

Nourmala Putri Agustyn selama pengerjaan penelitian. Ucapan terima kasih juga

penulis ucapkan kepada kedua orang tua dan adik-adik yang selalu memberikan

inspirasi dan dukungan. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi penulis

sendiri maupun semua pihak yang membutuhkannya demi perkembangan dan

kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi.

Bogor, Oktober 2011

Nuri Izzatil Wafa

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 24 April 1988 sebagai anak

pertama dari pasangan Muchlish Abdi dan Nurjanah. Penulis lulus dari SMA N 34

Jakarta pada tahun 2006 dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk Institut

Pertanian Bogor melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB).

Penulis memilih mayor dari Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor.

Selama perkuliahan, penulis pernah aktif sebagai bendahara umum serum-G

FMIPA IPB periode 2007/2008, bendahara umum BEM FMIPA IPB periode

2008/2009, anggota badan pengawas CREBs periode 2008/2009, dan beberapa

kepanitiaan lainnya. Penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah

Biokimia Umum pada tahun 2010. Selain itu, penulis juga pernah melakukan

praktik lapangan di Laboratorium Kimia Bahan Alam, Pusat Penelitian

Bioteknologi, LIPI Cibinong dengan judul Aktivitas Antioksidan dan Bioaktivitas

Ekstrak Metanol dan Air Kulit Kayu Kulilawang (Cinnamomum culilawane Bl.).

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... ix

DAFTAR TABEL ........................................................................................... ix

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... ix

PENDAHULUAN .......................................................................................... 1

TINJAUAN PUSTAKA

Gambir (Uncaria gambir Roxb) ............................................................ 1

Antibakteri ............................................................................................. 2

Metode Pengujian Aktivitas Antibakteri…………………………… ... 3

Metode Mikrodilusi…………………………………………………. .. 3

Kromatografi Gas dan Spektrometri Massa…………………. ............. 4

Bakteri Uji ............................................................................................. 5

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat ..................................................................................... 6

Metode .................................................................................................. 6

HASIL DAN PEMBAHASAN

Fraksi Air Daun Gambir ....................................................................... 8

KHTM melalui Metode Mikrodilusi ..................................................... 9

Komponen Penyusun Fraksi Air Daun Gambir ..................................... 11

SIMPULAN DAN SARAN ............................................................................ 12

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 12

LAMPIRAN .................................................................................................... 16

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Gambir (Uncaria gambir Roxb) .............................................................. 2

2 Uji aktivitas antibakteri ekstrak terhadap E.coli ....................................... 9

3 Komponen penyusun ekstrak air daun gambir ........................................ 11

4 Struktur pirokatekol .................................................................................. 12

5 Sruktur katekin ......................................................................................... 12

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Kadar rendemen ekstraksi daun gambir .................................................... 8

2 Deskripsi pertumbuhan bakteri pada microplate ..................................... 10

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Strategi penelitian .................................................................................... 17

2 Ekstraksi flavonoid.................................................................... ............... 18

3 Pengamatan penentuan KHTM ekstrak daun gambir terhadap S.aureus 19

4 Hasil uji konsentrasi bunuh minimum ekstrak terhadap E.coli ................ 20

5 Hasil uji konsentrasi bunuh minimum ekstrak terhadap S.aureus ........... 21

6 Nama komponen penyusun fraksi air daun gambir .................................. 22

7 Analisis fitokimia fraksi air daun gambir ................................................. 23

1

PENDAHULUAN

Tanaman gambir merupakan tanaman

perdu dari famili Rubiaceae (kopi-kopian)

yang memiliki nilai ekonomi tinggi

karenamengandung asam kateku tannat

(tanin), katekin, pirokatekol, florisin, lilin,

dan fixed oil. Tanaman ini telah banyak

digunakan sebagai obat tradisional,

diantaranya untuk obat luka bakar, obat diare

dan disentri serta obat kumur-kumur pada

sakit kerongkongan (Nazir 2000).

Berbagai potensi gambir telah banyak

diteliti, diantaranya sebagai anti nematode

(Bursapeleucus xyphylus) dari ekstrak gambir

(Alen et al. 2004), bahan infus untuk

penyembuhan terhadap gangguan pada

pembuluh darah (Sukati & Kusharyono 2004),

dan obat tukak lambung (Tika et al. 2004).

Penelitian telah dilakukan sehubungan dengan

kemampuan ekstrak gambir sebagai anti

mikroba (Rahayuningsih et al. 2004), anti

bakteri (Lisawati 2004), serta sebagai bahan

toksisitas terhadap organ ginjal, hati dan

jantung (Armenia et al. 2004).

Potensi antibakteri yang dimiliki tanaman

gambir mendorong penelitian aktivitas

antibakterinya. Berbagai metode untuk

mengukur nilai konsentrasi hambat minimum

(KHTM) telah digunakan, seperti difusi agar

dan dilusi (pengenceran) secara berseri.

Metode difusi agar telah digunakan sejak lama

untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak

tanaman. Teknik difusi agar bekerja baik

dengan inhibitor tertentu, tetapi akan

menimbulkan masalah ketika menentukan

ekstrak yang mengandung komponen yang

tidak diketahui. Dampak antimikroba dapat

dihambat atau ditingkatkan oleh kontaminan.

Jenis agar, konsentrasi garam, suhu inkubasi,

dan ukuran molekul senyawa antibakteri dapat

mempengaruhi hasil yang diperoleh dengan

teknik difusi agar. Teknik ini juga

membutuhkan waktu yang lama dan bahan

materi yang cukup banyak (Ellof 1998).

Keterbatasan-keterbatasan tersebut menjadi

alasan untuk mencari metode lain yang lebih

baik dan ekonomis.

Metode yang dapat dijadikan alternatif

untuk menentukan konsentrasi hambat

tumbuh minimum ekstrak tanaman adalah

metode dilusi yang mencakup makrodilusi

dan mikrodilusi. Metode mikrodilusi sedang

dikembangkan karena memiliki sensitivitas

yang lebih tinggi dibandingkan dengan teknik

difusi agar. Menurut Ellof (1998), sensitivitas

mikrodilusi inimencapai 30 kali lebih sensitif.

Teknik mikrodilusi dapat digunakan untuk

beberapa sampel yang berbeda dengan jumlah

sampel yang sedikit. Hal ini sangat berguna

jika jumlah senyawa antibakteri yang

didapatkan sedikit dan terbatas. Teknik

mikrodilusi juga dapat membedakan antara

efek bakteriostatik dan bakterisidal serta dapat

menentukan nilai konsentrasi hambat tumbuh

minimum (KHTM) (Langfield et al. 2004).

Mikrodilusi tidak membutuhkan waktu

yang lama karena pengujian dilakukan dalam

waktu satu kali pada satu microplate dengan

jumlah sumur yang banyak.Metode

mikrodilusi ini dapat digunakan untuk

berbagai macam mikroorganisme, murah, dan

menghasilkan hasil dapat diulang.Mikrodilusi

menggunakan sampel yang diencerkan secara

berseri. Volume kultur bakteri yang

dimasukkan ke dalam sumur seragam. Ukuran

inokulum yang biasa digunakan yaitu 106

sampai 108 CFU/mL. Kultur bakteri yang

digunakan memiliki optical density 0.4 pada

620 nm atau kultur yang telah distandardisasi

dengan larutan standar McFarland 0.5 (Baris

et al. 2006). Larutan McFarland 0.5 adalah

larutan standar yang terdiri dari barium

klorida dan asam sulfat. Volume dan ukuran

sel sama untuk semua perlakuan, maka

pengaruh konsentrasi sampel yang berbeda-

beda dalam menghambat pertumbuhan bakteri

uji dapat diamati.

Penelitian ini bertujuan menentukan

konsentrasi hambat tumbuh minimum fraksi

air daun gambir (Uncaria gambir Roxb)

dengan metode mikrodilusi berdasarkan

kekeruhan, serta mengidentifikasi senyawa

yang terkandung di dalamnya dengan

Pyrolysis Gas Chromatography and Mass

Spectrometry (Py GC-MS). Hipotesis yang

diajukan adalahkonsentrasi hambat tumbuh

minimum fraksi air daun gambir dapat

ditentukan dengan metode mikrodilusi. Hasil

penelitian ini diharapkan dapat memberikan

informasi ilmiah mengenai metode

mikrodilusi sebagai metode alternatif yang

memberikan banyak keuntungan untuk

menguji aktivitas suatu senyawa antibakteri

yang berasal dari suatu jaringan.

TINJAUAN PUSTAKA

Gambir

Gambir (Uncaria gambir Roxb) termasuk

tanaman dalam famili Rubiaceae (kopi-

kopian). Taksonomi tanaman gambir yaitu

kingdom Plantae, divisi Angiospermae, sub

divisi Eudicots, kelas Asterid, ordo

Gentianales, familia Rubiaceae, genus

2

Uncaria, dan spesies Uncaria gambir Roxb

(Dhalimi 2006).

Tanaman gambir memiliki batang tegak,

bulat, percabangan simpodial, warna cokelat

pucat. Daunnya tunggal, berhadapan, bentuk

lonjong, tepi bergerigi, pangkal bulat, ujung

meruncing, dan berwarna hijau (Gambar 1).

Bunganya merupakan bunga majemuk,

memiliki mahkota sebanyak 5 helai yang

berbentuk lonjong, terletak di ketiak daun,

warna ungu, buah berbentuk bulat telur,

panjang lebih kurang 1.5 cm, warna hitam

(Soedibyo 1998).

Komponen utama tanaman gambir yaitu

katekin dan asam kateku tannat (Hayani

2003). Menurut Amos et al. (2004), katekin

termasuk ke dalam struktur flavonoid, tidak

berwarna, dan dalam keadaan murni sedikit

tidak larut dalam air dingin tetapi sangat larut

dalam air panas, larut dalam alkohol dan etil

asetat. Komposisi kimia ekstrak gambir

adalah katekin 7-33%, asam kateku tannat 20-

55%, pirokatekol 20-30%, gambir fluorensi 1-

3%, kateku merah3-5%, kuersetin 2-4%, fixed

oil 1-2%, lilin, dan sedikit alkaloid (Nazir

2000). Katekin dan asam kutekutannat

merupakan komponen yang memiliki potensi

sebagai zat antibakteri. Tanaman gambir

berguna untuk zat pewarna dalam industri

batik, industri penyamak kulit, ramuan makan

sirih sebagai obat, dan digunakan pula sebagai

bahan baku pembuatan permen dalam acara

adat di India serta sebagai penjernih pada

industri air (Susilobroto 2000).

Potensi tanaman gambir sebagai senyawa

antibakteri membuat gambir banyak

digunakan sebagai obat, diantaranya sebagai

obat tukak lambung (Tika et al. 2004) dan

sebagai bahan baku obat sakit perut dan sakit

gigi (Nazir 2000). Penelitian yang dilakukan

oleh Idris (1997) membuktikan bahwa

patogen Fusarium sp sebagai

penyebabpenyakit bercak daun tanaman

klausena dapat dikendalikan dengan

menggunakan pestisida nabati yang berasal

dari ekstrak daun gambir.

Gambar 1 Tanaman Gambir.

Gambir juga banyak manfaatnya untuk

dunia farmasi, diantaranya sebagai

perangsang sistem syaraf otonom

(Kusharyono 2004), bahan anti feedan

terhadap hama Spodoptera litura Fab.

(Handayani et al. 2004). Senyawa yang

terkandung di dalam tanaman gambir

kebanyakan adalah senyawa flavonoid dan

senyawa fenolik lainnya. Flavonoid adalah

suatu kelompok senyawa fenol terbesar yang

ditemukan di alam. Senyawa-senyawa ini

merupakan zat warna merah, ungu dan biru,

dan sebagian zat warna kuning yang

ditemukan dalam tumbuhan. Flavonoid

memiliki kerangka dasar karbon yang terdiri

atas 15 atom karbon, di mana dua cincin

benzen (C6) terikat pada suatu rantai propan

(C3) sehingga membentuk susunan C6-C3-C6

(Lenny 2006).

Flavonoid merupakan senyawa metabolit

sekunder yang terdapat pada tanaman hijau,

kecuali alga. Flavonoid yang banyak

ditemukan pada tumbuhan tingkat tinggi

adalah flavon, flavonol, isoflavon, flavanon,

kalkon dan dihidrokhalkon, proantosianidin

dan antosianin, serta auron dan

dihidroflavonol.

Flavon, flavonol, dan antosianidin adalah

jenis yang banyak ditemukan di alam

sehingga sering disebut sebagai flavonoid

utama. Banyaknya senyawa flavonoid ini

disebabkan oleh berbagai tingkat hidroksilasi,

alkoksilasi atau glikosilasi dari struktur utama

(Lenny 2006). Flavonoid berfungsi sebagai

antibakteri dengan cara membentuk senyawa

kompleks terhadap protein ekstraseluler yang

mengganggu integritas membran sel bakteri

(Cowan 1999).

Antibakteri

Antibakteri adalah zat yang dapat

mengganggu pertumbuhan atau bahkan

mematikan bakteri dengan cara mengganggu

metabolisme mikroba yang merugikan.

Antibakteri hanya dapat digunakan jika

mempunyai sifat toksik selektif, artinya dapat

membunuh bakteri yang menyebabkan

penyakit tetapi tidak beracun bagi

penderitanya. Faktor-faktor yang berpengaruh

pada aktivitas zat antibakteri adalah pH, suhu

stabilitas senyawa, jumlah bakteri yang ada,

lamanya inkubasi, dan aktivitas metabolisme

bakteri.

Antibakteri dapat dibedakan berdasarkan

mekanisme kerjanya, yaitu antibakteri yang

menghambat pertumbuhan dinding sel,

antibakteri yang mengakibatkan perubahan

permeabilitas membran sel atau menghambat

3

pengangkutan aktif melalui membran sel,

antibakteri yang menghambat sintesis protein,

dan antibakteri yang menghambat sintesis

asam nukleat sel. Aktivitas antibakteri dibagi

menjadi 2 macam yaitu aktivitas

bakteriostatik (menghambat pertumbuhan

tetapi tidak membunuh patogen) dan aktivitas

bakterisidal (dapat membunuh patogen dalam

kisaran luas). Pengendalian mikroorganisme

khususnya bakteri, dapat dilakukan secara

kimia seperti pemberian antibiotik dan zat-zat

kimia lainnya, ataupun pengendalian secara

fisik seperti pemberian panas, pendinginan,

radiasi, dan pengeringan (Brooks et al. 2001).

Metode Pengujian Aktivitas Antibakteri

Uji aktivitas antibakteri dapat dilakukan

dengan metode difusi dan metode

pengenceran (dilusi). Disc diffusion test atau

uji difusi cakram dilakukan dengan mengukur

diameter zona bening (clear zone) yang

merupakan petunjuk adanya respon

penghambatan pertumbuhan bakteri oleh

suatu senyawa antibakteri dalam ekstrak.

Syarat jumlah bakteri untuk uji kepekaan

(sensitivitas) yaitu 105-108 CFU/mL

(Hermawan et al. 2007).

Metode difusi merupakan salah satu

metode yang sering digunakan. Metode difusi

dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu metode

silinder, metode lubang (sumuran) dan metode

cakram kertas. Metode lubang (sumuran)

yaitu membuat lubang pada agar padat yang

telah diinokulasi dengan bakteri. Jumlah dan

letak lubang disesuaikan dengan tujuan

penelitian, kemudian lubang diinjeksikan

dengan ekstrak yang akan diuji. Setelah

dilakukan inkubasi, pertumbuhan bakteri

diamati untuk melihat ada tidaknya daerah

hambatan di sekeliling lubang (Kusmayati &

Agustini 2007). Prinsip metode pengenceran

adalah senyawa antibakteri diencerkan hingga

diperoleh beberapa macam konsentrasi,

kemudian masing-masing konsentrasi

ditambahkan suspensi bakteri uji dalam media

cair. Perlakuan tersebut akan diinkubasi pada

suhu 37ºC selama 18-24 jam dan diamati ada

atau tidaknya pertumbuhan bakteri, yang

ditandai dengan terjadinya kekeruhan. Larutan

uji senyawa antibakteri pada kadar terkecil

yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan

bakteri uji, ditetapkan sebagai Kadar Hambat

Tumbuh Minimum (KHTM) atau Minimal

Inhibitory Concentration (MIC). Selanjutnya

biakan dari semua tabung yang jernih

diinokulasikan pada media agar padat,

diinkubasikan pada suhu 37ºC selama 18-24

jam, lalu diamati ada atau tidaknya koloni

bakteri yang tumbuh. Media cair yang tetap

terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan

sebagai Kadar Bunuh Minimal (KBM) atau

Minimal Bactericidal Concentration (MBC)

(Pratiwi 2008).

Metode Mikrodilusi

Metode mikrodilusi saat ini sedang

dikembangkan karena metode difusi agar

yang sering digunakan memiliki keterbatasan.

Metode mikrodilusi memungkinkan

penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh

Minimum (KHTM) dari beberapa macam

sampel dan sampel yang dibutuhkan dalam

jumlah sedikit.Hal ini penting jika senyawa

antimikrob yang ingin diuji jumlahnya

terbatas, seperti yang terjadi pada banyak

bahan alam. Metode ini juga dapat digunakan

untuk mikroorganisme yang beragam, tidak

mahal, dan menghasilkan hasil yang dapat

diulang (Ellof 1998). Selain itu, dengan

menggunakan metode mikrodilusi, dapat

dibedakan antara efek bakteriostatik dan

bakterisidal, serta dapat menentukan nilai

KHTM secara kuantitatif (Langfield et al.

2004). Mikrodilusi lebih sensitif dibandingkan

dengan metode lain. Pengerjaan teknisnya

tidak membutuhkan keahlian yang tinggi dan

hemat waktu.

Metode mikrodilusi menggunakan

microplate sebagai instrumennya. Setiap

sumur pada microplate diisi oleh media

pertumbuhan, ekstrak yang ingin diuji

aktivitasnya, dan kultur bakteri.Jumlah

kulturbakteri yang digunakan pada metode

mikrodilusi biasanya 1x106CFU/mL (Basri &

Fan 2005). Beberapa peneliti menggunakan

kultur bakteri yang memiliki optical density

0.4 (fase log) pada panjang gelombang 620

nm atau kultur cair yang telah distandardisasi

dengan larutan standar kekeruhan McFarland

0.5 (Baris et al. 2006). Larutan McFarland

dibuat dari campuran barium klorida dan asam

sulfat sehingga menghasilkan larutan yang

keruh. Kultur cair bakteri disamakan

absorbannya dengan absorban McFarland 0.5

(antara 0.08 sampai 0.1) sehingga dihasilkan

bakteri dengan jumlah 1.5 x 108CFU/mL.

.Beberapa teknik digunakan dalam

pengamatan pertumbuhan bakteri pada

metode mikrodilusi, yaitu menggunakan

larutan indikator, pengamatan kekeruhan, atau

dengan pembacaan absorban menggunakan

plate reader. Beberapa peneliti menggunakan

larutan pewarna indikator (Ellof 1998) atau

spektrofotometri untuk menentukan

4

keberadaan pertumbuhan di microplate

(Devienne & Raddi 2002). Penggunaan

indikator kolorimetrik menghilangkan

kebutuhan untuk plate reader dan mencegah

keambiguan dengan pengamatan visual.

Larutan indikator yang digunakan diantaranya

adalah garam tetrazolium (Ellof 1998) dan

diasetat fluorescein (Chand 1994). Namun,

berdasarkan penelitian Kreander et al. (2005),

larutan tersebut tidak sesuai sehingga

mendorong pada pengendapan atau fluoresens

non-spesifik.

Beberapa penelitian menggunakan larutan

indikator pada metode mikrodilusi. Mothana

et al. (2010) meneliti aktivitas antimikroba

minyak atsiri dari kulit kayu tanaman

Commiphora ornifolia dengan metode

mikrodilusi dengan menggunakan larutan

indikator p-iodonitro-tetrazolium violet.

Perubahan warna kuning menjadi merah muda

mengindikasikan reduksi larutan akibat

pertumbuhan bakteri. Rakotoniriana et al.

(2009) menguji aktivitas antibakteri 23

tanaman endemik di Madagaskar dengan

metode mikrodilusi dengan menggunakan

larutan indikator methylthiazoyltetrazolium

chloride (MTT). Konsentrasi hambat tumbuh

minimum ekstrak tanaman-tanaman tersebut

adalah konsentrasi terkecil yang tidak

menunjukkan adanya perubahan warna MTT.

Kelemahan penggunaan larutan indikator

dalam mikrodilusi membuat Kreander et al.

(2005) menemukan pengukuran absorbansi

sederhana suspensi bakteri untuk menjadi

pengukuran pertumbuhan yang terpercaya dan

reproducible, yaitu metode mikrodilusi

berdasarkan kekeruhan. Kekeruhan dijadikan

sebagai indikator ada atau tidaknya

pertumbuhan bakteri. Konsentrasi terkecil

yang menunjukkan kejernihan ditetapkan

sebagai konsentrasi hambat tumbuh minimum

ekstrak.Beberapa penelitian menggunakan

metode mikrodilusi ini. Zaenab et al. (2004)

menguji aktivitas antibakteri siwak

(Salvadora persica Linn.) terhadap bakteri

Streptococcus mutans dan Bacteroides

melaninogenicus dengan melihat kekeruhan

yang terjadi. Basri &Fan (2005) menentukan

nilai KHTM ekstrak air dan ekstrak aseton

tanaman quercus infectoria dengan

mengamati kekeruhan pada microplate setelah

diinkubasi selama satu malam.Teknik ini juga

digunakan oleh Darwish dan Aburjai (2010)

untuk menentukan konsentrasi hambat

tumbuh minimum ekstrak tanaman terhadap

Escherichia coli.

Teknik mikrodilusi dengan pembacaan

spektrofotometer menggunakan absorban

pada panjang gelombang 620 nm. Konsentrasi

yang menunjukkan penurunan nilai absorban

yang tajam (Devienne & Raddi 2002) atau

konsentrasi terendah yang menunjukkan nilai

absorban nol dianggap sebagai KHTM (Salie

et al. 1996). Beberapa penelitianmenggunakan

metode ini. Yogisha S&Koteshwara AR

(2009) melakukan metode mikrodilusi

berdasarkan metode turbidimetri, yaitu

pengukuran absorban pada panjang

gelombang 620 nm dengan plate reader.

Pengujian aktivitas antibakteri kitosan

terhadap bakteri Staphylococcus aureus yang

dilakukan oleh Tin et al. (2010) menggunakan

panjang gelombang 600 nm untuk pengukuran

absorban, sama halnya dengan penelitian yang

dilakukan oleh Tadtong et al. (2009)

mengenai pengujian aktivitas minyak atsiri

dari tanaman Etlingera punicea (Roxb.) yang

juga menggunakan panjang gelombang 600

nm.

Kromatografi Gas-Spektrometri Massa

(GC-MS)

Kromatografi adalah metode pemisahan

secara fisiko-kimia senyawa yang terkandung

di dalam suatu larutan, cair maupun gas.

Kromatografi memisahkan sebuah sampel

menjadi beberapa fraksi dan mengukurnya

atau mengidentifikasi fraksi tersebut.

Komponen yang akan dipisahkan

didistribusikan di antara dua fase yang tidak

bercampur. Salah satu komponen penting

dalam kromatografi adalah fase diam, yang

bisa berbentuk padatan atau cairan. Fase diam

ditarik ke sebuah bahan pendukung yang

inert. Sampel yang biasanya berbentuk uap

atau terlarut dalam pelarut, digerakkan

melalui fase diam dengan didorong oleh

sebuah cairan atau gas, yang disebut sebagai

fase gerak. Saat fase gerak bergerak melewati

fase tetap, komponen sampel mengalami

sejumlah pertukaran (partisi) di antara dua

fase. Hal yang dimanfaatkan dalam

kromatografi adalah perbedaan dalam sifat

kimia dan fisik dari komponen sampel.

Perbedaan ini menyebabkan perpindahan

(migrasi) setiap komponen. Ketika sampel

telah muncul dari corong kromatograf, hal itu

dinamakan terelusi(Patnaik 2004).

Jika fase diam terdapat di dalam kolom

disebut kromatografi kolom. Fase diam

juga dapat menggunakan kertas penyaring.Ini

disebut kromatografi planar yang meliputi

kromatografi lapis tipis, kromatografi kertas,

dan elektroforesis. Kromatografi kolom dibagi

menjadi kromatografi gas dan kromatografi

5

cair berdasarkan bentuk fisik fase gerak yang

digunakan (Patnaik 2004).

Sejak tahun 1952, kromatografi gas

berkembang sangat pesat. Senyawa apapun,

organik maupun anorganik, yang dapat

mendapat tekanan uap sebesar 60 torr (suhu

kolom dapat meningkat sampai 350°C) dapat

dielusi dari kolom kromatografi gas.

Keterbatasan kromatografi gas adalah sampel

atau derivatifnya harus volatil pada suhu

kolom yang terprogram. Komponen dasar

sebuah kromatografi gas adalah gas pembawa

dengan regulator tekanan dan pengontrol

aliran, katup dan splitter, kolom pemisah,

detektor, oven dengan suhu yang diatur, dan

perekam data. Spektrofotometer massa

memiliki komponen-komponen, yaitu sistem

masuknya sampel, sumber ion, sistem

akselarasi ion, penganalisis massa, sistem

pengumpulan-ion (biasanya detektor

pengganda elektron), sistem data, dan sistem

vakum. Tekanan pada spektrofotometer harus

kurang dari 10-6 torr untuk menghindari

tabrakan ion pada jalannya (Patnaik 2004).

Instrumen GC-MS merupakan gabungan

antara kromatografi gas dan spektrometri

massa. Kromatografi gas dapat memisahkan

senyawa volatil dan semi volatil dengan

resolusi yang baik, tetapi tidak dapat

mengidentifikasi senyawa-senyawa tersebut.

Spektroskopi massa dapat menyediakan

informasi struktur detail sebagian besar

senyawa, tetapi tidak dapat memisahkan

senyawa tersebut. Oleh karena itu, kombinasi

antara kedua teknik tersebut disarankan

(Jeffery et al. 1989).

Ada tiga syarat untuk GC-MS, yaitu:

volume gas dari kromatografi gas harus

dikurangi sehingga sesuai dengan katup

spektrofotometer massa dan juga konsentrasi

analit dikurangi, spektrum analit harus

diperoleh dalam watu yang cepat, serta sistem

data harus mampu mengatasi volume data

yang dihasilkan oleh scanning cepat

spektrofotometer massa. Penghubung

langsung dengan kolom tabung terbuka adalah

ujung yang dipanjangkan dari kromatografi

gas ke sumber ion pada spektrometr

massa.Aliran kromatografi gas cukup lambat

dan pompa vakumnya cukup tinggi sehingga

vakum yang dibutuhkan oleh

spektrofotometer massa dapat dijaga tanpa

penghubung apapun. Kerugian yang

didapatkan dari GC-MS adalah semua

buangan kolom tersimpan di sumber ion

spektrofotometer massa sehingga

terkontaminasi lebih cepat. Selain itu, kolom

GC tidak bisa diubah tanpa menghentikan MS

karena tidak ada cara untuk memisahkan satu

dengan yang lain. Penghubung split terbuka

membuat jarak antara kolom GC dan katup

MS yang dijaga pada tekanan atmosfer

dengan menggunakan sumber gas sekunder

dan vakum pemisah. Jumlah gas murni dapat

dikontrol untuk mematikan kolom tanpa

mematikan MS. Selain itu, komponen sampel

yang tidak dinginkan dapat dihilangkan

sebelum memasuki MS (Patnaik 2004).

Salah satu bentuk GC-MS adalah GC-MS

pirolisis. GC-MS pirolisis adalah sebuah

teknik untuk mempirolisis sampel yang non-

volatil di bawah kondisi yang diatur, biasanya

tanpa oksigen dan dekomposisi produk

dipisahkan di dalam kolom kromatografi gas.

Kromatogram yang dihasilkan (pirogram)

digunakan untuk analisis kuantitatif dan

kualitatif sampel. GC-MS pirolisis telah

banyak digunakan untuk banyak macam

sampel, tetapi kegunaan utamanya adalah

untuk analisis polimer untuk investigasi

polimer alami ataupun polimer sintetik

(Jeffery et al. 1989).

Bakteri Uji

Staphylococcus aureus

Staphylococcus berasal dari kata staphyle

yang berarti kelompok buah anggur dan kokus

yang berarti benih bulat. Staphylococcus

aureus berbentuk bola dengan diameter 1 µm

yang tersusun dalam bentuk kluster yang tidak

teratur. Stafilokokus bersifat nonmotil dan

tidak membentuk spora. Staphylococcus

aureus dapat menyebabkan pneumonia,

meningitis, empiema, endokarditis atau sepsis

dengan supurasi di tiap organ (Jawetz et al.

2001).

Bakteri S. aureus berbentuk seperti untaian

buah anggur yang bulat sferis. Pada lempeng

agar, koloninya berbentuk bulat, diameter 1-2

mm, cembung, buram, mengkilat dan

konsistensinya lunak. Warna khasnya adalah

kuning keemasan, hanya saja intensitas

warnanya dapat bervariasi (Todar 2004).

Bakteri S. aureus tidak bergerak, tidak

berspora, dan merupakan bakteri Gram

positif. Terkadang pada bakteri yang telah

difagositosis dan pada biakan tua yang hampir

mati dapat ditemukan bakteri Gram negatif

pada bagian tengah gerombolan bakteri.

Klasifikasi S. aureus menurut Bergey

dalam Brooks et al. (2001) adalah sebagai

berikut:

Kingdom : Prokariota

Divisi : Firmicutes

Kelas : Bacilli

6

Ordo : Bacillales

Famili : Staphylococcaceae

Genus : Staphylococcus

Spesies : Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Escherichia coli merupakan bakteri gram

negatif yang termasuk dalam famili

Enterobacteriaceae, bakteri ini merupakan

flora normal yang terdapat dalam usus dan

merupakan kelompok besar yang berbentuk

batang, bersifat anaerob fakultatif dan habitat

alaminya adalah saluran usus manusia dan

hewan Morfologinya berupa koloni yang

bundar, cembung, tipis dengan tepi yang nyata

(Jawetz et al. 2001).

Klasifikasi E. coli menurut Brookset al.

(2001) adalah sebagai berikut :

Kingdom : Procaryota

Divisi : Gracilicutes

Kelas : Scotobacteria

Ordo : Eubacteriales

Famili : Entobacteriaceae

Genus : Escherichia

Spesies : Escherichia coli

E. coli dapat menyebabkan berbagai

penyakit, seperti infeksi saluran kemih (ISK)

dan diare. Beberapa strain E. coli

menyebabkan diare yaitu Enterophatogenic E.

coli (EPEC), Enterotoxigenic E. coli (ETEC)

merupakan penyebab penyakit diare.

Enterohemoragic E. coli (EHEC)

dihubungkan dengan hemoragic colitis,

Enteroinvasive E. coli (EIEC) menyebabkan

penyakit mirip shigellosis sedangkan

Enteroagregative E. coli (EAEC)

menyebabkan diare yang akut dan kronis

(Brooks et al. 2001).

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang digunakan pada

penelitian ini terdiri atas bahan untuk

ekstraksi daun gambir dan bahan untuk uji

aktivitas antibakteri. Bahan-bahan untuk

ekstraksi daun gambir terdiri atas daun

gambir, metanol, akuades, n-heksana, dan

kloroform. Bahan-bahan untuk penentuan

(uji) aktivitas antibakteri terdiri atas fraksiair

daun gambir, kultur cair bakteri uji (E.coli

dan S. aureus), alkohol 70%, spirtus, media

pertumbuhan bakteriNutrient Agar (NA) dan

Nutrient Broth(NB) steril, larutan BaCl2 1 %,

dan larutan H2SO4 1%.

Alat-alat yang digunakan terdiri atas

peralatan untuk ekstraksi daun gambir dan uji

aktivitas antibakteri. Alat yang digunakan

untuk ekstraksi daun gambir di antaranya

gelas piala, blender, rotary evaporator, oven,

pengaduk bergoyang, vakum, penangas air,

corong pisah, neraca analitik, dan kertas

saring. Alat-alat yang digunakan untuk uji

antibakteri di antaranya tabung reaksi, lampu

spiritus, labu Erlenmeyer, autoklaf, oven,

pipet mikro 10 dan 1000 μL, tips steril,

inkubator, vorteks, kuvet, spektrofotometer

dan cawan mikro 96 sumur.

Metode

Persiapan Sampel (Harborne 1987)

Daun gambir yang digunakan diperoleh

dari kebun gambir di Payakumbuh, Sumatera

Barat. Daun yang dipilih adalah daun yang

sudah tua (siap panen). Sebelum digunakan

daun dikeringkan selama seminggu,

pengeringan dilakukan sekitar jam 8-11 pagi.

Kemudian daun dioven pada suhu 50°C

sampai kadar air kurang dari 10% dan

dilakukan penggilingan dengan blender lalu

serbuk disaring sehingga diperoleh serbuk

berukuran 80 mesh.

Ekstraksi Daun Gambir (Modifikasi

Markham 1982 dan Sukadana 2010)

Ekstraksi daun gambir dilakukan dengan

metode maserasi bertingkat, yaitu modifikasi

dari metode Markham (1982). Selanjutnya

dilakukan fraksinasi dengan menggunakan

metode modifikasi Sukadana (2010). Serbuk

daun gambir dimaserasi dengan 200 mL

larutan metanol:air (9:1) selama 3 kali.

Setelah itu dilakukan penyaringan. Residunya

dimaserasi kembali dengan 200 mL

metanol:air (1:1) selama tiga kali. Maserasi

dilakukan selama 24 jam disertai dengan

pengadukan yang teratur pada 200 rpm.

Seluruh filtrat yang diperoleh dipekatkan

dengan rotary evaporator. Selanjutnya

ekstrak dilarutkan dengan campuran metanol-

air (1:1), kemudian dipartisi dengan heksana

250 mL menghasilkan fraksi kental n-heksana

dan fraksi metanol-air. Fraksi metanol-air

diuapkan kandungan metanolnya sehingga

diperoleh fraksi air. Fraksi air kemudian

dipartisi dengan 250 mL kloroform dan

dihasilkan fraksi kental kloroform dan air.

Pembuatan Media Nutrient Agar (NA)

Media NA dibuat dengan konsentrasi 2%.

Sebanyak 2 gram media NA dilarutkan dalam

100 mL akuades. Kemudian diaduk dengan

7

magnetic stirer dengan pemanasan pada suhu

70°C. Kemudian 28 mL media ini

ditempatkan ke dalam tabung reaksi masing-

masing 7 mL untuk agar miring dan sisanya

untuk agar cawan. Media selanjutnya di

sterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu

121 °C selama 15 menit. Media untuk agar

miring diletakan pada papan miring hingga

beku dan diinkubasi selama 24 jam. Media

agar cawan dituang secara aseptis ke dalam

cawan Petri steril dan diinkubasi selama 24

jam.

Pembuatan Media Nutrient Broth (NB)

Media ini dibuat dengan konsentrasi 2%.

Sebanyak 2 gram media NB dilarutkan dalam

100 mL akuades di dalam erlenmeyer.

Kemudian diaduk dengan magnetik stirer

disertai dengan pemanasan pada suhu 70°C.

Erlenmeyer kemudian ditutup rapat dengan

kapas dan aluminium foil. Media ini

disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu

121 °C selama 15 menit.

Pembuatan Larutan Baku McFarland 0.5

(Andrews 2008)

Larutan baku McFarland terdiri atas dua

komponen, yaitu larutan BaCl2 1 % dan

H2SO4 1 %. Sebanyak 0,05 mL larutan BaCl2

1 % dicampurkan dengan 9.95 mL larutan

H2SO4 1 % dan dikocok hingga homogen.

Kekeruhan larutan diukur pada panjang

gelombang 620 nm dengan menggunakan

akuades sebagai blangkonya. Nilai absorban

larutan baku harus berada di kisaran 0,08

sampai dengan 0.13. Larutan baku McFarland

0,5 ekuivalen dengan suspensi sel bakteri

dengan konsentrasi 1.5 × 108 CFU/mL.

Penentuan Aktivitas Antibakteri

(Modifikasi Ellof 1998)

Peremajaan Bakteri Uji. Peremajaan

dilakukan dengan menginokulasikan bakteri

uji (Escherichia coli dan Staphylococcus

aureus) ke dalam media nutrient agar (NA)

dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37

°C. Koloni yang tumbuh di media

dipindahkan ke dalam 25 mL media NB

secara aseptik dan disesuaikan serapannya

dengan larutan baku McFarland 0.5 sehingga

diperoleh suspensi dengan jumlah sel 1.5 ×

108CFU/mL.

Pengujian Aktivitas Antibakteri.

Sebanyak 500 mg fraksi air daun gambir

dilarutkan dalam 10 mL DMSO sehingga

konsentrasinya menjadi50 mg/mL sebagai

larutan stok. Larutan stok dimasukkan ke

dalam sumur microplate kemudian diencerkan

dengan media NB steril sampai diperoleh

konsentrasi 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 10, 20, 30,

dan 40 mg/mL. Sebanyak 5 µL suspensi

bakteri uji yang telah distandardisasi jumlah

selnya dimasukkan ke dalam sumur dan

diinkubasi selama 24 jam pada inkubator 37

°C. Volume total campuran larutan ekstrak

daun gambir, media NB, dan suspensi bakteri

adalah 200 µL. Percobaan dilakukan triplo.

Setelah 24 jam, cawan mikro diamati secara

pengamatan visual dengan mata. Konsentrasi

paling jernih (tidak keruh) ditetapkan sebagai

konsentrasi hambat minimum. Konsentrasi

bunuh minimum adalah konsentrasi ekstrak

terkecil yang membunuh 99.9 % dari

inokulum bakteri. Kontrol perlakuan dalam

percobaan terdiri atas kontrol positif, yaitu

antibiotik kloramfenikol 1mg/mL, media NB,

danbakteri uji, kontrol negatif berupa media

dan bakteri uji. Untuk menentukan

konsentrasi bunuh minimum, subkulturkan

100 µL suspensi yang jernih masing-masing

ke dalam medium NA lalu diamati setelah 24

jam.

Identifikasi kandungan daun gambir

dengan GC-MS Pirolisis

Fraksi air daun gambir dengan konsentrasi

10 mg/mL dimasukkan ke dalam tabung

kuarsa. Pyrolyzer dihubungkan dengan sebuah

sistem GC-MS dengan alat GCMS-QP 2010

yang dihubungkan dengan detektor perangkap

ion spektrometer massa.Suhu injektor GC

adalah 280ºC dan pertemuan antara lubang

dan GC diatur suhunya 300ºC. Suhu

spektrometer massa dijaga pada suhu 270ºC

dan discan dengan range m/z 35-425. Untuk

pirolisis, GC diprogram suhu awal50ºCselama

5 menit, lalu dipanaskan pada suhu 600

ºCdengan laju 6.5ºC per menit sampai 250 ºC

selama 5 menit. Spektrum massa direkam

dengan menggunakan software detektor

perangkap ion. Data yang dihasilkan berupa

pirogram yang memberikan informasi berupa

puncak senyawa hasil fragmentasi

(pemecahan) senyawa utuh yang terkandung

di dalam larutan tersebut.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Fraksi Air Daun Gambir

Ekstraksi tanaman gambir merupakan

tahap awal sebelum pengujian aktivitas

antibakteri. Ekstraksi dilakukan untuk

mendapatkan senyawa kimia yang diinginkan

dari suatu jaringan. Daun gambir diekstraksi

dengan menggunakan metode maserasi

8

bertingkat. Daun gambir dimaserasi dengan

campuran metanol-air (9:1) sebanyak tiga

kali, lalu dengan metanol-air (1:1) sebanyak

tiga kali. Hal ini dilakukan karena flavonoid

glikosida dan yang lebih polar seperti aglikon

lebih baik diekstraksi dengan alkohol atau

dengan campuran alkohol dan air (Marston

dan Hostettmann 2006).

Prinsip maserasi adalah penyarian zat aktif

yang dilakukan dengan cara merendam serbuk

simplisia dalam cairan penyari yang sesuai

selama beberapa hari, cairan penyari akan

masuk ke dalam sel melewati dinding sel.

Larutan yang konsentrasinya tinggi akan

terdesak keluar dan diganti oleh cairan

penyari dengan konsentrasi rendah (proses

difusi). Peristiwa tersebut berulang sampai

terjadi keseimbangan konsentrasi antara

larutan di luar sel dan di dalam sel.

Selanjutnya ekstrak dipekatkan dengan rotary

evaporator.

Setelah dilakukan maserasi dengan larutan

campuran metanol-air, ekstrak yang

dihasilkan kemudian dipekatkan. Selanjutnya

ekstrak tersebut dilarutkan di dalam metanol-

air (1:1) lalu dipartisi dengan n-heksana yang

bersifattidak polar untuk memisahkan

senyawa-senyawa non polar di dalam daun

gambir. Senyawa-senyawa yang mungkin

terkandung di dalam fraksi n-heksana adalah

minyak atsiri dan pigmen tumbuhan yang

bersifat nonpolar seperti kuinon isoterpenoid

(Harborne 1993). Hasil partisi dengan heksana

adalah fraksi n-heksana danfraksimetanol-air.

Fraksi metanol-air kemudian dipekatkan

untuk menghilangkan kandungan metanolnya

sehingga diperoleh fraksi air. Fraksi air ini

kemudian dipartisi dengan kloroform yang

bersifat semi polar. Hal ini dilakukan untuk

memisahkan senyawa yang kurang polar.

Menurut Marston dan Hostettmann (2006),

flavonoid yang kurang polar (isoflavon,

flavonon, flavon termetilasi, dan flavonol)

diekstraksi dengan menggunakan kloroform,

diklorometana, dietil eter, atau etil asetat.

Selain itu, senyawa yang diduga terkandung

di dalam fraksi kloroform adalah terpenoid.

Lenny (2006) menyatakan bahwa terpenoid

dapat terekstrak dengan baik pada eter dan

kloroform. Senyawa yang tergolong ke dalam

kelompok terpenoid diantaranya triterpenoid,

sterol, serta pigmen tumbuhan. Hasil partisi

dengan kloroform adalah fraksi air dan fraksi

kloroform.

Metode fraksinasi yang digunakan pada

penelitian ini adalah metode yang dilakukan

oleh Sukadana (2010) dalam mengekstrak

senyawa flavonoid dari buah belimbing

manis. Fraksinasi menghasilkan tiga fraksi,

yaitu fraksi n-heksana, kloroform, dan air.

Ketiga fraksi menunjukkan hasil yang positif

pada pengujian fitokimia flavonoid. Fraksi air

belimbing manis menunjukkan intensitas

warna orange yang paling tinggi dan jumlah

rendemen yang paling banyak, maka diduga

bahwa fraksi air mengandung flavonoid yang

lebih banyak daripada fraksi n-heksana dan

kloroform. Fraksi air tersebut dipisahkan

dengan teknik kromatografi kolom

menghasilkan 8 jenis fraksi. Salah satu fraksi

yang dihasilkan tersebut kemudian

dimurnikan dengan kromatografi lapis tipis

untuk selanjutnya dilakuakan identifikasi

dengan spektrofotometerr UV-Vis. Hasil

identifikasi isolat tersebut dengan UV-Vis

menunjukkan adanya gugus hidroksil yang

diduga sebagai struktur katekin. Oleh karena

itu, metode Sukadana (2010) ini digunakan

pada fraksinasi daungambir untuk

memperoleh senyawa flavonoid, terutama

senyawa katekin.

Ekstraksi 100 gram daun gambir dengan

metode maserasi bertingkat dan fraksinasi

menghasilkan tiga fraksi, yaitu fraksi

kloroform, fraksi n-heksana, dan fraksi air

dengan jumlah rendemen masing-masing

dapat dilihat pada Tabel 1. Jumlah rendemen

fraksi air merupakan yang paling banyak

dibandingkan dengan fraksi yang lain. Hal ini

menunjukkan bahwa senyawa flavonoid yang

terkandung di dalam daun gambir lebih

banyak larut di dalam air.

Tabel 1 Rendemen ekstraksi daun gambir

Jenis fraksi Jumlah rendemen

(%)

Air 3.033

Kloroform 0.048

n-heksana 0.031

Hal ini sesuai dengan teori bahwa

flavonoid yang bersifat polar lebih mudah

larut di dalam air karena adanya gula

glikosida yang mengandung gugus hidroksil.

Selain flavonoid, kemungkinan terdapat

senyawa fenol lainnya yang juga terdapat

pada fraksi air daun gambir, diantaranya

hidrokuinon, katekol, dan kelompok asam

fenolat (Grotewold 2005). Secara ilmiah telah

diketahui bahwa keberadaan flavonoid di

dalam daun gambir paling dominan yaitu

sekitar 40-50% (Hayani 2003).

Hal ini juga didukung dengan hasil

penelitian Silvikasari (2010) yang menguji

kandungan fitokimia daun gambir.Hasil uji

fitokimia menunjukkan fraksi air hanya

9

mengandung flavonoid, fraksi kloroform

hanya mengandung triterpenoid, dan fraksi

heksana hanya mengandung tannin. Uji

alkaloid dan fenolik memberikan hasil negatif

pada ketiga fraksi. Oleh karena itu, fraksi air

yang mengandung flavonoid yang digunakan

untuk analisis selanjutnya, yaitu penentuan

KHTM (konsentrasi hambat tumbuh

minimum).

Konsentrasi Hambat Tumbuh

Minimum (KHTM) melalui Metode

Mikrodilusi

Konsentrasi hambat tumbuh minimum

(KHTM) fraksi air daun gambir

ditentukandengan metode mikrodilusi dan

bakteri yang digunakan adalah Escherichia

coli dan Staphylococcus aureus. Bakteri uji

distandardisasi dengan larutan McFarland 0.5

sehingga jumlah sel yang digunakan sama

yaitu1.5 × 108 CFU/mL. Fraksi air daun

gambir dilarutkan dengan DMSO 1 %

sehingga diperoleh konsentrasi 0.01, 0.05, 0.5,

1, 10, 20, 30, dan 40 mg/mL.Setiap sumur

berisi media nutrient broth (NB), fraksi air

daun gambir, dan suspensi bakteri.Kontrol

DMSO dibuat sesuai dengan konsentrasi

fraksi air daun gambir. Setiap konsentrasi

dilakukan secara triplo. Kontrol positif berisi

kloramfenikol 1 mg/mL, media NB, dan

suspensi bakteri. Kontrol negatif berisi media

NB dan bakteri (Gambar 2).

Teknik yang digunakan adalah

pengamatan kekeruhan setelah microplate

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC.

Kontrol negatif menunjukkan kekeruhan.

fraksi air daun gambir dibandingkan dengan

kekeruhan kontrol negatif. Kekeruhanterlihat

pada fraksi air daun gambir dengan

konsentrasi 0.01 mg/mL dan 0.05 mg/mL,

sedangkan pada konsentrasi 0.5 mg/mL

sampai 40 mg/mL terlihat jernih (tidak keruh).

Kontrol positif tidak menunjukkan kekeruhan

karena kloramfenikol merupakan antibiotik

yang memiliki kemampuan tinggi dalam

membunuh bakteri dan mikroorganisme lain.

Kontrol negatif menunjukkan kekeruhan

karena ada pertumbuhan bakteri di dalam

media.

Gambar 2 Uji aktivitas fraksi air daun gambir terhadap E.coli.

Keterangan : Fraksi air daun gambir dengan konsentrasi (mg/mL): 0.01 (1A-C),

0.05 (2A-C), 0.5 (3A-C), 1 (4A-C), 10 (5A-C), 20 (6A-C), 30 (7A-C),

dan 40 (8A-C). DMSO dengan konsentrasi (mg/mL) : 0.01 (1D-F),

0.05 (2D-F), 0.5 (3D-F), 1 (4D-F), 10 (5D-F), 20 (6D-F), 30 (7D-F),

dan 40 (8D-F). Kontrol positif (1-3H). Kontrol negatif (7-9H).

10

Menurut Irianto (2006), semakin keruh

suatu kultur, semakin banyak jumlah selnya.

Hal ini menunjukkan bahwa fraksi air daun

gambir menghambat pertumbuhan E.coli

dan S.aureus pada konsentrasi fraksi 0.5

mg/mL sampai 40 mg/mL. Oleh karena itu,

disimpulkan bahwa nilai KHTM fraksi air

daun gambir terhadap E.coli dan S.aureus

adalah 0.5 mg/mL. Pengamatan terhadap

microplate dapat dilihat pada Lampiran 3.

Kontrol DMSO menunjukkan kekeruhan

pada konsentrasi 0.05 sampai konsentrasi 1

mg/mL. Hal ini mengindikasikan bahwa

DMSO memiliki aktivitas dalam

menghambat pertumbuhan bakteri E.coli

pada konsentrasi 10 sampai 40 mg/mL.

Deskripsi mengenai ada atau tidaknya

pertumbuhan pada microplate dapat dilihat

pada Tabel 2.

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa

fraksi air daun gambir memiliki aktivitas

antibakteri yang tinggi. Sebuah bahan alam

dianggap memiliki aktivitas yang kuat jika

memiliki KHTM antara 0.05 sampai 0.5

mg/mL, aktivitas sedang jika nilai KHTM

0.6 sampai 1.5 mg/mL, dan dikatakan

memiliki aktivitas yang lemah jika di atas

1.5 mg/mL (Aligiannis et al. 2001).

Tabel 2 Pengaruh konsentrasi fraksi air daun

gambir terhadap E.coli dan

S.aureus Konsentrasi

(mg/mL) E.coli S.aureus

Kontrol

DMSO

0.05

+ + +

+ + +

+ + +

0.01

+ + +

+ + +

+ + +

0.5

- - +

- - +

- - +

1

- - +

- - +

- - +

10

- - -

- - -

- - -

20

- - -

- - -

- - -

30

- - -

- - -

- - -

40

- - -

- - -

- - -

Keterangan: + : ada pertumbuhan bakteri

- : tidak ada pertumbuhan

Senyawa antibakteri yang terdapat di

dalam fraksi air daun gambir

didugaberspektrum luas karena dapat

bekerja pada bakteri Gram positif dan Gram

negatif. Dinding sel bakteri Gram positif

memiliki lebih banyak peptidoglikan

dibandingkan dengan bakteri Gram negatif.

Oleh karena itu, pertahanan bakteri Gram

positif lebih kuat. Hasil yang diperoleh pada

penelitian ini adalah bahwa senyawa

antibakteri fraksi air daun gambir

menghambat pertumbuhan bakteri Gram

positif dan negatif dalam konsentrasi yang

sama. Oleh karena itu, diduga bahwa

mekanisme kerja senyawa antibakteri fraksi

air daun gambir tidak dalam penghambatan

sintesis dinding sel.

Senyawa yang diduga terkandung di

dalam fraksi air daun gambir adalah

senyawa fenolik, yaitu senyawa yang

mengandung cincin benzena dan gugus

hidroksil. Senyawa fenolik dapat

menyebabkan denaturasi protein melalui

proses adsorpsi yang melibatkan ikatan

hidrogen. Fenol dalam kadar rendah,

membentuk kompleks protein-fenol dengan

ikatan lemah dan segera mengalami

peruraian, diikuti penetrasi fenol ke dalam

sel dan menyebabkan presipitasi serta

denaturasi protein. Fenol dalam kadar yang

tinggi menyebabkan koagulasi protein dan

sel membran mengalami lisis, mengubah

permeabilitas membran bakteri (Soekardjo

&Siswandono 2000).

Tahap lanjutan dari penentuan KHTM

dengan metode mikrodilusi adalah

menentukan konsentrasi bunuh minimum

(KBM). Konsentrasi bunuh minimum

(KBM) diperoleh dengan mengsubkulturkan

100 µL isi sumur yang tidak keruh (jernih)

ke dalam nutrient agar (NA). Konsentrasi

bunuh minimum adalah konsentrasi fraksi

air daun gambir yang dapat menghambat

99.9% populasi bakteri. Fraksi yang

disubkulturkan adalah fraksi yang tidak

menunjukkan adanya kekeruhan, yaitu 0.5,

1, 10, 20, 30, dan 40 mg/mL.

Hasil subkultur ke dalam nutrient agar

(NA) menunjukkan bahwa masih terdapat

pertumbuhan bakteri sampai dengan

konsentrasi fraksi 40 mg/mL. Tidak ada

fraksi yang berhasil membunuh 99.9%

populasi bakteri. Hal ini menunjukkan

bahwa aktivitas bakterisidal fraksi daun

gambir tidak terdapat pada konsentrasi fraksi

antara 0.5 sampai 40 mg/mL. Menurut

Pelzcar & Chan (1998), semakin tinggi

konsentrasi suatu bahan antibakteri maka

11

semakin kuat aktivitas antibakterinya. Oleh

karena itu, diperkirakan KBM fraksi air

daun gambir lebih besar dari 40 mg/mL.

Hasil penelitian Silvikasari (2010)

menunjukkan bahwa fraksi air daun gambir

memiliki KBM 9% atau setara dengan 90

mg/mL. Hasil uji KBM untuk E.coli dapat

dilihat pada Lampiran 4 dan untuk S.aureus

pada Lampiran 5.

Hasil penentuan KHTM berbeda dengan

KBM. Konsentrasi hambat tumbuh

minimum (KHTM) adalah konsentrasi

terkecil ekstrak yang dapat menghambat

pertumbuhan bakteri, sedangkan konsentrasi

bunuh minimum (KBM) adalah konsentrasi

ekstrak yang dapat membunuh 99.9%

populasi bakteri. Hal ini serupa dengan

hasil yang diperoleh oleh Acharyya et al.

(2009) yang menentukan konsentrasi

hambat tumbuh minimum (KHTM) dan

KBM beberapa tanaman obat terhadap

beberapa bakteri. Tanaman A.lebbeck diuji

pada konsentrasi 0.05-32 mg/mL.

Konsentrasi hambat tumbuh minimum

A.lebbeck terhadap Baccilus subtilis adalah

32 mg/mL, tetapi konsentrasi bunuh

minimumnya tidak dapat ditentukan pada

konsentrasi 0.05-32 mg/mL. Oleh karena itu,

nilai KHTM tidak berkaitan dengan KBM.

Komponen PenyusunFraksi air

Daun Gambir

Hasil identifikasi dengan GC-MS

pirolisis menunjukkan bahwa fraksi air

daun gambir (Uncaria gambir Roxb.)

mengandung 25 senyawa berbeda yang

diekspresikan dalam bentuk puncak (peak)

kromatogram (pirogram) (Gambar 3).

Nama-nama senyawa yang dihasilkan dapat

dilihat pada Lampiran 6.

Instrumentasi yang digunakan adalah

GC-MS pirolisis sehingga dilakukan

pembakaran sampel dengan suhu 600ºC

tanpa oksigen sehingga semua senyawa yang

terkandung di dalam sampel menjadi volatil

dan terdekomposisi menjadi fragmen-

fragmen penyusunnya. Hasil identifikasi

pada pirogram menunjukkan adanya

senyawa pirokatekol (1,2-Benzenediol)

pada puncak ke-9 dengan konsentrasi

1.46%. Struktur pirokatekol dapat dilihat

pada Gambar 4. Senyawa katekol

(pirokatekol) merupakan fragmen utama di

dalam pirogram yang merupakan hasil

dekomposisi senyawa katekin (Galletti GC

& James BR 1992). Hal ini dapat dilihat

adanya struktur katekol pada struktur

senyawa katekin (Gambar 5).

Gambar 3 Komponen penyusun fraksi air daun gambir.

12

Menurut Nazir (2000), daun gambir

mengandung katekin sebesar 7-33%. Hasil uji

fitokimia fraksi air daun gambir (Silvikasari

2010) menunjukkan hasil yang positif untuk

senyawa flavonoid yang ditunjukkan dengan

adanya warna merah (Lampiran 7). Hal ini

sesuai dengan hasil GC-MS pirolisis yang

menunjukkan adanya senyawa flavonoid,

yaitu katekin.

Gambar 4 Struktur pirokatekol.

Gambar 5 Struktur katekin.

Penelitian ini termasuk di dalam Program

Kreativitas Mahasiswa bidang penelitian

(PKM-P). Senyawa yang ingin diperoleh di

dalam PKM-P tersebut adalah katekin. Hasil

identifikasi pada penelitian ini menunjukkan

bahwa struktur katekin telah ditemukan

terkandung di dalam fraksi air daun gambir

berdasarkan adanya pirokatekol yang

merupakan fragmen penyusun katekin.

Namun, untuk memperoleh senyawa katekin,

fraksi air daun gambir harus dimurnikan

dengan menggunakan metode kromatografi

kolom dan lapis tipis. Hal ini menjadi saran

untuk penelitian selanjutnya.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Fraksi air daun gambir memiliki nilai

konsentrasi hambat tumbuh minimum 0.50

mg/mL terhadap pertumbuhan bakteri

Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.

Konsentrasi minimum fraksi air daun gambir

yang mampu membunuh bakteri uji belum

dapat ditentukan karena tidak ada di dalam

range konsentrasi fraksi air yang diujikan.

Hasil identifikasi dengan GC-MS pirolisis

menunjukkan bahwa fraksi air daun gambir

mengandung pirokatekol (katekol) yang

merupakan fragmen penyusun senyawa

katekin.

Saran

Metode mikrodilusi yang disarankan

adalah mikrodilusi dengan pengukuran

absorbansi atau dengan menggunakan larutan

indikator.Fraksi air daun gambir perlu

ditingkatkan konsentrasinya agar dapat

diperoleh nilai konsentrasi bunuh minimum

(KBM).Identifikasi komponen penyusun

fraksi air daun gambir disarankan

menggunakan GC-MS, bukan GC-MS

pirolisis agar dapat diketahui semua senyawa

penyusun fraksi air daun gambir. Selain itu,

perlu dilakukan pemurnian fraksi air daun

gambir agar diperoleh senyawa katekin.

DAFTAR PUSTAKA

Acharyya Saurabh, Amarendra Patra, dan

Prasanta K Bag. 2009. Evaluation of

the antimicrobial activity of some

medicinal plants against enteric

bacteria with particular reference to

multi-drug resistant Vibrio cholera.

Tropical Journal of Pharmaceutical

Research 8: 231-237.

Alen Y, E Rahmayuni dan A Bakhtiar.

2004.Isolasisenyawa bioaktif

antinematodaBursaphelencchus

xylophilus dari ekstrak gambir.

Seminar Nasional

TumbuhanTanamanObat Indonesia

XXVI. Padang, 7-8 September 2004.

Aligiannis N, Kalpotzakis E, Mitaku S,

Chinou IB. 2001. Composition and

antimicrobial activity of the essential

oils of two Origanum species.J Ag

Food Chem 40: 4168-4170.

Amos, I Zaenudin, A Triputranto, B

Rusmandra dan S Ngudiwaluyo.

2004. Teknologi Pasca Panen

Gambir. Jakarta: BPPT Pr.

Andrews JM. 2008. BSAC standardized disc

susceptibility testing method (version

7). J Antimicrob Chemother 56:60-

76. [terhubung berkala]

http://jac.oxfordjournals.org/cgi/repri

nt/62/2/256 [27 Juni 2010].

Armenia AS dan Arifin. 2004.Toksisitas

ekstrak gambir (Uncaria

gambirRoxb) terhadap organ ginjal,

hati danjantung mencit. Seminar

Nasional TumbuhanTanaman Obat

Indonesia XXVI. Padang,7-8

September 2004.

13

Baris O, Gulluce M, Sahin F, Ozer H, Kilic H,

Ozkan H, Sokmen M, Ozbek T

.2006. Biological activities of the

essential oil and methanol extract of

Achillea Biebersteinii Afan.

(Asteraceae). Turk. J. Biol. 30: 65-

73.

Basri DF dan Fan SH .2005. The potential of

aqueous and acetone extracts of galls

of Quercus infectoria as antibacterial

agents. Indian J. Pharmacol. 37:26-

29.

Brooks GF, Janet SB, Stephen AM. 2001.

Mikrobiologi Kedokteran.Jakarta:

Salemba Medika.

Chand S, Lusunzi I, Veal DA, Williams LR,

Karuso P. 1994. Rapid screening of

the antimicrobial activityof extracts

and natural products.J. Antibiot 47:

1295-1304.

Cowan MM. 1999. Plant products as

antimicrobial agents. Clinical

Microbiology Reviews 12: 564–582.

Dhalimi A. 2006. Permasalahan gambir di

Sumatera Barat dan alternatif

pemecahannya. Journal of

Education. 5: 46-59.

Darwish RM dan Talal A Aburjai. 2010.

Effect of ethnomedical plants used in

folklore medicine in Jordan as

antibiotic resistant inhibitors on

Escherichia coli. BioMed Central 10:

2-8.

Devienne KF dan Raddi MSG.

2002.Screening for antimicrobial

activity of natural products using a

microplate photometer.Braz. J.

Microbiol. 33: 97-105.

Ellof JN. 1998. A sensitive and quick

microplate method to determine the

minimal inhibitory concentration of

plant extracts for bacteria. Planta

Med 64:711-713.

Galletti GC & James BR. 1992. PY-GC_ion

trap detection of polyphenols

(vegetable tannins):preliminary

result. J. Organic mass spectrometry

27:226-230.

Grotewold E. 2005. The Science of

Flavonoids. USA: Sprinmger.

Handayani D R, Ranova, Farlian, dan Arneti.

2004. Pengujian efek anti feedan dari

ekstrak dan fraksi daun gambir

(Uncaria gambir Roxb) terhadap

hama Spedoptera litura Fab. Seminar

Nasional. Tumbuhan Tanaman Obat

Indonesia XXVI. Padang, 7-8

September 2004.

Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia:

Penuntun cara modern menganalisis

tumbuhan. Ed II. Penerjemah;

Padmawinata K dan Soediro J,

Niksolihin editor. Bandung: ITB.

Terjemahan dari: Phytochemical

methods.

Hayani E. 2003. Analisis kadar katekin dari

gambir dengan berbagai metode.

Buletin Teknik Pertanian 8: 31-32.

Hermawan A, Hana W, dan WiwiekT. 2007.

Pengaruh Ekstrak Daun Sirih (Piper

betle L.) terhadap Pertumbuhan

Staphylococcus aureus dan

Escherichia coli dengan Metode

Difusi Disk. Medan: Universitas

Erlangga.

Idris H, Nasrun, dan Syamsu H. 1997.

Pemanfaatan daun gambir sebagai

pestisida nabati untuk pengendalian

penyakit kanker batang pada tanaman

kayu manis. Prosiding Kongres

Nasional XIV ; Palembang, 27-29

Oktober 1997. Palembang:

Perhimpunan Fitopatologi Indonesia.

hlm 480-482.

Irianto K.2006.Mikrobiologi Menguak Dunia

Mikroorganisme. Jilid I.

Bandung:Yrama Widya.

Jawetz et al. 2001. Mikrobiologi Kedokteran.

Surabaya: Salemba Medical.

Jeffery GH et al. 1989. Vogel’s Textbook of

Quantitative Chemical Analysis Fifth

Edition. New York: John Wiley and

Sons Inc.

Kreander K, Vuorela P, Tammela P. 2005. A

rapid screening method for detecting

active compounds against

erythromycin-resistant bacterial

strains of Finnish origin. Folia

Microbiol 50:487-493.

Kusharyono. 2004. Efek infus gambir

(Uncaria gambir Roxb) yang

diperoleh dari pasar terhadap sistem

syaraf otonom mencit jantan.

Seminar Nasional.

14

TumbuhanTanaman Obat Indonesia

XXVI. Padang, 7-8 September 2004.

Kusmayati dan Agustini NWR. 2007. Uji

aktivitas senyawa antibakteri dari

mikroalga (Porphyridium cruentum).

Biodiversitas. 8: 48-53.

Langfield RD, Scarano FJ, Heitzman ME,

Kondo M, Hammond GB, Neto CC.

2004.Use of a modified microplate

bioassay method to investigate

antibacterial activity in the Peruvian

medicinal plant Peperomia galiodes.

J. Ethnopharmacol. 94: 279-281.

Lisawati Y. 2004. pengujian efek anti bakteri

ekstrak daun dan ranting gambir

(Uncaria gambir Roxb) terhadap

beberapa banteri penyebab diare

secara invitro. Seminar Nasional

Tumbuhan Tanaman Obat Indonesia

XXVI. Padang, 7-8 September 2004.

Lenny S. 2006. Senyawa flavonoida, fenil

propanoid, dan alkaloid. [Skripsi].

Medan: Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas

Sumatera Utara.

Lokhande PD, Gawai KR, Kodam KM,

Kuchekar BS, Chabukswar, dan

Jagdale SC. 2007. Antibacterial

activity of extracts of Piper longum.

Journal of Pharmacology and

Toxicology 2: 574-579.

Markham KR 1982. Techniques of Flavonoid

Identification.New York: Academic

Press.

Marston A. and Hostettmann K. 2006. In:

Flavonoids- Chemistry, Biochemistry

and Applications. London: Taylor &

Francis Group.

Mothana et al. 2010. Chemical analysis and

biological activity of the essential

oils of two endemic soqotri

commiphoraspecies.Molecules

15:689-698.

Nazir M. 2000. Budidaya Gambir,

Pengolahan, dan Prospek

Diversifikasinya. Padang: Yayasan

Hutanku.

Patnaik Pradyot. 2004. Dean’s Analytical

Chemistry Handbook Second Edition.

New York: McGraw-Hill Inc.

Pelczar MJ dan Chan ECS. 1998. Dasar-

dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Pr.

Pratiwi Sylvia T. 2008. Mikrobiologi

Farmasi. Jakarta: Erlangga.

Rahayuningsih, C., T. E. Basjir dan Y.

Warastuti.2004. Uji ekstrak daun

gambir (Uncaria gambir Roxb) awet

radiasi terhadap kemampuannya

sebagai anti mikroba.Sem. Nas.

Tumbuhan Tanaman Obat Indonesia

XXVI. Padang, 7-8 September 2004.

Rakotoniriana et al. 2010.Antimicrobial

activity of 23 endemic plants in

Madagascar.Tropical Journal of

Pharmaceutical Research 9(2): 165-

171.

Salie F, Eagles PFK, Lens HMJ. 1996.

Preliminary antimicrobial screening

of four South African Asteraceae

species. J. Ethnopharmacol. 52: 27-

33.

Silvikasari. 2010. Aktivitas Antibakteri

Ekstrak Kasar Flavonoid Daun

Gambir (Uncaria gambir

Roxb).[Skripsi]. Bogor: Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam, Institut Pertanian Bogor.

Soedibyo Mooryati. 1998. Alam, Sumber

Kesehatan, Manfaat, dan Kegunaan.

Jakarta: Balai Pustaka.

Soekardjo B dan Siswandono. 2000. Kimia

Medisinal (Edisi kedua). Surabaya:

Airlangga University Press.

Sukadana IM. 2010. Aktivitas Antibakteri

senyawa flavonoid dari buah

belimbing manis (Averrhoa

carambola Linn.L). J.Kimia 3:109-

116.

Sukati K dan Kusharyono. 2004. Efek infuse

gambir (Uncaria gambir Roxb) yang

diperoleh dari pasar terhadap

parameter onset dan durasi waktu

tidur thiopental pada mencit jantan.

Seminar Nasional. Tumbuhan

Tanaman Obat Indonesia XXVI.

Padang, 7-8 September 2004.

Susilobroto B. 2000. Keragaan industri

pengolahan gambir dan penyulingan

nilam dan peluang pasar. Prosiding

Teknologi Pengolahan Gambir dan

Nilam. Padang 24-25 januari 2000.

Balai Penelitian Tanaman Rempah

dan Obat. Bogor. h 36-44.

Tadtong Sarin et al. 2009. Antimicrobial

activities of essential oil from

15

Etlingera punicea rhizome.J Health

Res 23:77-79.

Tika FH, H. Mukhtar dan A Bakhtiar.

2004.Efek katekin dari gambir

terhadap tukak lambung tikus putih

betina. Seminar Nasional Tumbuhan

Tanaman Obat Indonesia XXVI.

Padang, 7-8 September 2004.

Tin San et al. 2010. Synergistic combinations

of chitosans and antibiotics in

Staphylococcus aureus. Letters in

Drug Design & Discovery7: 31-35.

Todar K. 2004. Todar’s Online Textbook of

Bacteriology. Madison: University of

Wisconsin-Madison.

Yogisha S dan Koteshwara AR. 2009. In-vitro

antibacterial effect of selected

medicinal plant extracts. Journal of

Natural Products 2: 64-69.

Zaenab, Mardiastuti HW, VP Anny, B

Logawa. 2004. Uji antibakteri siwak

(Salvadora persica Linn.) terhadap

Streptococcus mutans dan

Bacteroides melaninogenicus.

Makara 8: 37-40.

16

LAMPIRAN

17

Lampiran 1 Strategi penelitian

Preparasi simplisia daun

gambir

Ekstraksi flavonoid daun gambir

Penentuan Konsentrasi Hambat

Tumbuh Minimum dengan mikrodilusi

Uji Konsentrasi Bunuh Minimum ke

nutrient agar (NA)

Identifikasi dengan GC-MS

18

Lampiran 2 Ekstraksi flavonoid

Serbuk daun gambir

Maserasi dengan campuran

metanol: air 1:1

Filtrat hasil maserasi metanol:air

Ekstrak kental dilarutkan dengan

campuran metanol:air 1:1

Maserasi dengan campuran

metanol:air 9:1

Diaduk 200

rpm

Maserasi dilakukan

sebanyak 3 kali

Diaduk 200

rpm

Maserasi

sebanyak 3 kali

Dipekatkan dengan rotary

evaporator

Partisi dengan 250 mL n-

heksana

Fraksi kental n-

heksana

Fraksi metanol-

air

metanol diuapkan dengan rotary

evaporator

Fraksi air

Partisi dengan 250 mL

kloroform

Fraksi kental

kloroform

Fraksi air

19

Lampiran 3 Penentuan KHTM ekstrak daun gambir terhadap Staphylococcus

aureus

Uji aktivitas antibakteri ekstrak air daun gambir konsentrasi (mg/mL):

0.01 (1A-C), 0.05 (2A-C), 0.5 (3A-C), 1 (4A-C), 10 (5A-C), 20 (6A-C),

30 (7A-C), 40 (8A-C) terhadap bakteri S.aureus. Kontol negatif (7-9H),

Kontrol positif (1-3H)

20

Lampiran 4 Hasil uji Konsentrasi Bunuh Minimum ekstrak terhadap E.coli

Uji KBM ekstrak daun gambir terhadap E.coli dengan konsentrasi

(mg/mL): 0.5 (a), 1 (b), 10 (c), 20 (d), 30 (e), 40 (f).

a b

c d

e f

c

21

Lampiran 5 Hasil uji Konsentrasi Bunuh Minimum ekstrak terhadap S.aureus

Uji KBM ekstrak daun gambir terhadap S.aureus dengan konsentrasi

(mg/mL): 0.5 (a), 1 (b), 10 (c), 20 (d), 30 (e), 40 (f).

a b

c d

e f

22

Lampiran 6 Nama komponen penyusun fraksi air daun gambir

23

Lampiran 7 Analisis fitokimia fraksi air daun gambir