UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA ISOLASI DAN UJI...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DARI

KAPANG ENDOFIT DAUN TANAMAN LEUNCA

(Solanum nigrum)

SKRIPSI

AMBAR KHAERINNISA

NIM : 1111102000090

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JUNI 2015

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DARI

KAPANG ENDOFIT DAUN TANAMAN LEUNCA

(Solanum nigrum)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Farmasi

AMBAR KHAERINNISA

NIM : 1111102000090

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JUNI 2015

iii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya sendiri,

dan semua sumber yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar

Nama : Ambar Khaerinnisa

NIM : 1111102000090

Tanda tangan :

Tanggal : 19 Juni 2015

vi

ABSTRAK


Jurusan : Farmasi

Judul : Isolasi dan Uji Aktivitas Antibakteri dari Isolat Kapang

Endofit Daun Tanaman Leunca (Solanum nigrum)

Kapang endofit merupakan mikroorganisme menguntungkan yang berinteraksi

dengan tanaman inang tanpa menyebabkan gangguan atau kerusakan pada

tanaman inang. Leunca (Solanum nigrum) merupakan salah satu tanaman lokal

yang biasa digunakan untuk tanaman herbal. Tujuan dari penelitian ini adalah

untuk mengisolasi dan menyeleksi kapang endofit dari daun leunca (Solanum

nigrum) yang memiliki kemampuan memproduksi senyawa antibakteri terhadap

bakteri Shigella dysenteriae ATCC 13313, Salmonella typhimurium ATCC

14028, Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538 dan

Helicobacter pylori ATCC 43504 dengan menggunakan metode difusi cakram.

Isolat kapang endofit terlebih dahulu difermentasi shaker selama 14 hari dengan

medium PDY (Potato Dextrose Yeast) dan supernatannya digunakan sebagai

larutan uji. Lima dari empat belas isolat kapang endofit yang berhasil diisolasi

dari daun tanaman leunca (Solanum nigrum) memiliki aktivitas antibakteri

terhadap Shigella dysenteriae, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus dan

Helicobacter pylori, namun tidak menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap

Salmonella enterica sv thypimurium. Aktivitas antibakteri paling tinggi

ditunjukkan oleh supernatan kapang DT 10 dengan diameter zona hambat 8,85

mm terhadap bakteri S. dysentriae , 7,76 mm terhadap bakteri S.aureus, 8,8 mm

terhadap B.subtilis, dan 8,8 mm terhadap bakteri H.pylori.

Kata kunci: Leunca (Solanum nigrum), kapang endofit, antibakteri, difusi cakram

vii

ABSTRACT

Name : Ambar Khaerinnisa

Department : Pharmacy

Title : Isolation and Evaluation on Antibacterial Activities of Endophytic

Fungi from Black Nightshade Leaves (Solanum ningrum)

Endophytic fungi is beneficial microorganism that interacts with plant without

causing any harm to the host. Black Nightshade (Solanum ningrum) is one of the

local plants commonly used as a medicinal herb. The research purpose was to

isolate and selected endophytic fungi from black nightshade (Solanum nigrum)

leaves that has ability to producing antibacterial compound against Shigella

dysenteriae ATCC 13313, Salmonella enterica sv thypimurium ATCC 14028,

Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538, and

Helicobacter pylori ATCC 43504 through disc diffusion method. The isolated

endophytic fungi were firstly fermented in a shaker for 14 days using potato

dextrose-yeast (PDY) media, while the supernatant liquid test was carried out.

Five out of fourteen endophytic fungi that were successfully isolated from black

nightshade leaves (Solanum nigrum) possess anti-bacterial activity against

Shigella dysenteriae, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, and Helicobacter

pylori; however, they did not show the anti-bacterial activity against Salmonella

enterica sv thypimurium. The highest anti-bacterial activities were showed by

supernatant DT 10 with the inhibition zone of 8.85 mm againstS. dysentriae; 7.76

mm against S.aureus; 8.8 mm against B.subtilis; and 8.8 mm against H.pylori.

Key words: Black nightshade (Solanum nigrum), endophytic fungi, anti-bacteria

compound, disc diffusion.

viii

KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmanirrahim.

Alhamdulillah, puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan

anugerah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan

skripsi ini. Shalawat serta salam ditunjukkan kepada junjungan besar Nabi

Muhamad SAW yang telah memberikan petunjuk kebenaran sebagai rahmat

sekalian alam.

Skripsi dengan judul “Isolasi dan Uji Aktivitas Antibakteri dari Kapang

Endofit Daun Tanaman Leunca (Solanum nigrum)” ini disusun untuk

memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar sarjana farmasi di Program

Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

Penulis menyadari bahwa tanpa adanya bantuan dan bimbingan dari

banyak pihak, penelitian dan penyelesaian penulisan skripsi ini akan

mengalami banyak hambatan. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima

kasih kepada:

1. Prof Dr. Atiek Soemiati,M.Sc,Apt dan Ibu Puteri Amelia., M.Farm., Apt

selaku pembimbing yang telah meluangkan banyak waktu untuk

memberikan bimbingan, motivasi, petunjuk, serta dorongan bagi penulis

dari awal hingga skripsi ini dapat terselesaikan.

2. Bapak Saiful Bahri., M.Si selaku dosen mikrobiologi yang telah

memberikan saran serta masukan kepada penulis.

3. Untuk ayahanda Doddy Nurhasan dan ibunda Ria Diana yang tiada

hentinya memberikan bantuan materil, non materil, motivasi dan juga doa

kepada penulis untuk menyelesaikan skripsi ini.

4. Kakak dan Adikku tercinta Amalia Putri dan Aini Tiara yang selalu

memberikan semangat dan dukungan kepada penulis.

5. Bapak Dr. H. Arif Soemantri., S.KM., M.Kes Selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

ix

6. Bapak Yardi, phD., Apt., selaku Kepala Program Studi Farmasi, Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

7. Bapak dan Ibu staf pengajar Prodi Farmasi dan tata usaha di lingkungan

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

yang telah memberikan berbagai ilmu pengetahuan dan informasi kepada

penulis.

8. Sahabat Ati Maryanti, Rian Destiyani Putri, Faradhila Nur Saraswati,

Khairunisa, Niekha Zoelienna, Ana Yuliana, dan Miyadah Samiyah yang

tidak pernah berhenti memberikan semangat, bantuan dan motivasi kepada

penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

9. Teman-teman di Laboratorium Mikrobiologi Meri, Puput, Rachma, Arini,

Brasti, Karimah, Sumiati, Bahtiar, Adit, Fitri, Mozer, dan Syaima yang

menemani dan mengisi waktu penelitian menjadi menyenangkan.

10. Seluruh sahabat dan teman Program Studi Farmasi angkatan 2011 sebagai

teman seperjuangan yang telah memberikan dukungan dan semangat.

11. Semua laboran Mba Rani, Kak Eris, Ka Tiwi, Ka Lisna, Ka Rahmadi yang

telah memberikan pengetahuan dan informasi tentang teknis pengerjaan di

laboratorium kepada penulis.

Semoga amal baik dan bantuannya mendapat ganjaran dari Allah SWT dan

laporan ini bermanfaat bagi penulis dan pembaca umumnya.

Tidak ada manusia yang luput dari sesalahan dan kekhilafan, demikian pula

dengan penulisan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan

kritik yang dapat membangun dari semua pihak pembaca. Semoga dalam

penulisan skripsi ini, bermanfaat bagi semua pihak khususnya dalam dunia

kefarmasian.

Jakarta, Juni 2015

Penulis

x

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini:


NIM : 1111102000090

Program Studi : Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya,

dengan judul :

ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DARI KAPANG

ENDOFIT DAUN TANAMAN LEUNCA (Solanum nigrum)

untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Dibuat di : ..........................

Pada Tanggal : .........................

Yang menyatakan,

(.................................)

xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ....................................................................................... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .......................................... iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................... iv

HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... v

ABSTRAK ....................................................................................................... vi

ABSTRACK .................................................................................................. vii

KATA PENGANTAR ................................................................................... viii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI..................... x

DAFTAR ISI ................................................................................................... xi

DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xiv

DAFTAR TABEL ........................................................................................ xvi

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xvii

BAB 1 PENDAHULUAN ............................................................................. 1

1.1 Latar Belakang ............................................................................. 1

1.2 Rumusan Masalah ....................................................................... 3

1.3 Tujuan Penelitian ........................................................................ 3

1.4 Manfaat Penelitian ...................................................................... 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA .................................................................... 5

2.1 Mikroba Endofit .......................................................................... 5

2.1.1 Definisi ............................................................................. 5

2.1.2 Metode Isolasi Kapang Endofit ........................................ 7

2.2 Fermentasi ................................................................................... 8

2.3 Tanaman Leunca (Solanum nigrum) ......................................... 10

2.3.1 Taksonomi Tanaman ...................................................... 11

2.3.2 Deskripsi ......................................................................... 11

2.3.3 Kandungan Kimia ........................................................... 12

2.3.4 Penggunaan secara Tradisional ...................................... 12

2.4 Bakteri Patogen ........................................................................... 12

2.3.1 Staphylococcus aureus .................................................... 13

2.3.2 Shigella dysentriae ......................................................... 14

2.3.3 Bacillus subtilis .............................................................. 15

2.3.4 Salmonella enterica sv thypimurium .............................. 16

2.3.5 Helicobacter pylori ........................................................ 17

xii

2.5 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Bakteri ........ 18

2.6 Fase Pertumbuhan Bakteri ......................................................... 19

2.7 Antibakteri ................................................................................. 20

2.7.1 Uji Aktivitas Antibakteri ................................................ 22

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN .................................................... 23

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ................................................... 23

3.2 Alat ............................................................................................ 23

3.3 Bahan ........................................................................................ 23

3.3.1 Tanaman Uji ................................................................... 23

3.3.2 Bahan Kimia Sterilisasi Permukaan ............................... 24

3.3.3 Media Pertumbuhan Mikroba ........................................ 24

3.3.4 Bahan Uji Aktivitas Antibakteri .................................... 24

3.3.5 Bahan Untuk Identifikasi Kapang .................................... 24

3.4 Cara Kerja ................................................................................... 24

3.4.1 Persiapan Alat .................................................................. 24

3.4.2 Pembuatan Medium Isolasi, Peremajaan, dan

Pemeliharaan ................................................................... 25

3.4.3 Pembuatan Mediuim Perbanyakan .................................. 25

3.4.4 Pembuatan Medium Fermentasi ..................................... 26

3.4.5 Pembuatan Medium Pengujian ........................................ 26

3.4.6 Isolasi Kapang Endofit ..................................................... 26

3.4.7 Seleksi Kapang yang Berpotensi sebagai Antibakteri dengan

Metode Agar Disk ........................................................... 27

3.4.8 Fermentasi ....................................................................... 28

3.4.9 Uji Aktivitas Antibakteri .................................................. 28

3.4.10 Karakteristik Kapang Endofit yang Mempunyai Aktivitas

Antibakteri ..................................................................... 30

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................... 31

4.1 Isolat Kapang Endofit .................................................................. 33

4.2 Identifikasi Bakteri Patogen ......................................................... 34

4.3 Pembuatan Kurva Tumbuh .......................................................... 36

4.4 Seleksi Kapang yang Berpotensi sebagai Antibakteri dengan

Metode Agar disk........................................................................ 38

4.5 Uji Aktivitas Antibakteri ........................................................... 40

4.6 Karakteristik Kapang Endofit yang Mempunyai Aktivitas

Antibakteri .................................................................................. 42

xiii

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................... 46

5.1 Kesimpulan ................................................................................ 46

5.2 Saran .......................................................................................... 47

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 48

xiv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Tanaman Leunca (Solanum nigrum) .......................................... 11

Gambar 4.1 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji ................................................ 37

Gambar 1. Tanaman Solanum nigrum .......................................................... 54

Gambar 2. Contoh Kultur Kapang Endofit Majemuk daun DS ................... 54

Gambar 3. Contoh Kultur Kapang Endofit Majemuk daun DM .................. 54

Gambar 4. Contoh Kultur Kapang Endofit Majemuk daun DT ................... 55

Gambar 5. Hasil Isolat Kapang Endofit Daun Tanaman Leunca

(Solanum nigrum) ..................................................................... 55

Gambar 6. Hasil Isolat Kapang Endofit Daun Tanaman Leunca

(Solanum nigrum) ..................................................................... 56

Gambar 7. Pengamatan Mikroskopik Bakteri Uji ........................................ 57

Gambar 8. Hasil Seleksi Isolat Kapang Endofit terhadap S.dysentriae ...... 58

Gambar 9. Hasil Seleksi Isolat Kapang Endofit terhadap S.aureus ............ 58

Gambar 10. Hasil Seleksi Isolat Kapang Endofit terhadap B.subtilis ........... 59

Gambar 11. Hasil Seleksi Isolat Kapang Endofit terhadap H.pylori ............. 60

Gambar 12. Hasil Seleksi Isolat Kapang Endofit terhadap

S.enterica sv thypimurium ......................................................... 60

Gambar 13. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Supernatan Isolat Kapang Endofit

DT 1, DT 10 dan DM 3 Terhadap S.dysentriae ......................... 61


DT 8, DS 4, dan DS 5 Terhadap S.dysentriae ........................... 61


DT1, DT 10 dan DM 3 Terhadap S.aureus ............................... 62


DT 8, DS 4, dan DS 5 Terhadap S.aureus ................................. 62


DT1, DT 10 dan DM 3 Terhadap B.subtilis .............................. 63


DT 8, DS 4, dan DS 5 Terhadap B.subtilis ................................ 63


DT 1, DT 10 dan DM 3 Terhadap H.pylori .............................. 64


DT 8, DS 4, dan DS 5 Terhadap H.pylori ................................. 64


xv

DT1, DT 10 dan DM 3 Terhadap S.enterica sv thypimurium ... 65


DT 8, DS 4, dan DS 5 Terhadap S.enterica sv thypimurium. ... 65

Gambar 23. Pengamatan Makroskopik Isolat DT 1 yang diisolasi dari Daun

Tanaman Solanum nigrum ......................................................... 66

Gambar 24. Pengamatan Mikroskopik Isolat DT 1 yang diisolasi dari Daun


Gambar 25. Pengamatan Makroskopik Isolat DT 10 yang diisolasi dari Daun


Gambar 26. Pengamatan Mikroskopik Isolat DT 10 yang diisolasi dari Daun


Gambar 27. Pengamatan Makroskopik Isolat DS 4 yang diisolasi dari Daun


Gambar 28. Pengamatan Mikroskopik Isolat DS 4 yang diisolasi dari Daun


Gambar 29. Pengamatan Makroskopik Isolat DS 5 yang diisolasi dari Daun


Gambar 30. Pengamatan Mikroskopik Isolat DS 5 yang diisolasi dari Daun


Gambar 31. Pengamatan Makroskopik Isolat DM 3 yang diisolasi dari Daun


Gambar 32. Pengamatan Mikroskopik Isolat DM 3 yang diisolasi dari Daun

Tanaman Solanum nigrum. ........................................................ 70

xvi

DAFTAR TABEL

Tabel 4.1 Daftar Isolat Kapang Endofit Daun Tanaman Solanum nigrum 34

Tabel 4.2 Hasil Identifikasi Bakteri Uji ..................................................... 35

Tabel 4.3 Hasil Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji ....................................... 37

Tabel 4.4 Hasil Seleksi Kapang yang Mempunyai Aktivitas Antibakteri . 38

Tabel 4.5 Diameter Zona Hambat yang Terbentuk pada Uji Aktivitas

Antibakteri ................................................................................. 41

Tabel 4.6 Karakteristik Kapang Endofit yang Memiliki Aktivitas Antibakteri

.................................................................................................... 43

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Bagan Tahapan Penelitian. ......................................................... 71

Lampiran 2. Surat Hasil Determinasi Tanaman Leunca (Solanum nigrum) .. 72

Lampiran 3. Bagan Tahapan Isolasi Kapang Endofit. ................................... 73

Lampiran 4. Tahapan Pemurnian. ................................................................... 74

Lampiran 5. Tahapan Identifikasi Bakteri Uji ............................................... 75

Lampiran 6. Tahapan Pembuatan Kurva Pertumbuhan Bakteri. ................... 76

Lampiran 7. Tahapan Seleksi Kapang yang Berpotensi sebagai Antibakteri

dengan Metode Agar Disk .......................................................... 77

Lampiran 8. Bagan Cara Kerja Fermentasi .................................................... 78

Lampiran 9. Tahapan Uji Aktivitas Antibakteri .............................................. 79

Lampiran 10. Tahapan Karakteristik Kapang Endofit yang Mempunyai

Aktivitas Antibakteri ................................................................. 81

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Penggunaan antibiotik di dunia menunjukkan kecenderungan meningkat

dari tahun ke tahun. Tidak kurang dari 3000 ton antibiotik digunakan dalam bidang

kesehatan pertahunnya ( Izza, 2011). Pada bidang industri pangan, pakan, pertanian,

kesehatan, biokimia, genetika, dan biologi molekuler penggunaan antibiotik lebih

dari 40.000 ton per tahunnya. Penggunaan antibiotik yang besar di masyarakat dan

rumah sakit telah memicu resisten antibakteri (Neu, 1992). Oleh karena itu,

langkah-langkah mendapatkan jenis antibiotik baru masih sangat diperlukan baik

lewat sintesis kimia, biokimia baru atau penemuan isolat mikroba baru (Kaitu,

2013).

Tanaman merupakan salah satu sumber daya yang sangat penting dalam

upaya pengobatan dan upaya mempertahankan kesehatan masyarakat. Bahkan

sampai saat inipun menurut perkiraan badan kesehatan dunia (WHO), 80%

penduduk dunia masih bergantung pada pengobatan tradisional termasuk

penggunaan obat yang berasal dari tanaman (Izza, 2011). Sampai saat ini

seperempat dari obat-obat modern yang beredar di dunia berasal dari bahan aktif

yang diisolasi dan dikembangkan dari tanaman. Salah satu contohnya yaitu aspirin

yang merupakan analgesik paling populer yang diisolasi dari tanaman Salix dan

Spiraea, demikian pula paclitaxel dan vinblastin merupakan obat antikanker yang

sangat potensial yang berasal dari tanaman (Radji, 2005).

Indonesia mempunyai keanekaragaman hayati terbesar kedua setelah

Brazil, sehingga menjadikan Indonesia sebagai negara yang potensial dalam

mengembangkan obat herbal yang berbasis pada tanaman obat yang terdapat di

Indonesia. Lebih dari 1000 spesies tumbuhan dapat dimanfaatkan sebagai bahan

baku obat. Tumbuhan tersebut menghasilkan metabolit sekunder dengan struktur

molekul dan aktivitas yang beraneka ragam, memiliki potensi yang sangat baik

untuk dikembangkan menjadi obat berbagai penyakit (Radji, 2005).

Sumber baru bahan bioaktif yang akhir-akhir ini banyak dieksplorasi adalah

mikroba endofit. Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup di dalam jaringan

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

tumbuhan pada periode tertentu dan mampu membentuk koloni dalam jaringan

tumbuhan tanpa membahayakan inangnya, bahkan seringkali bersimbiosis secara

mutualistis (Tan RX, Zou WX, 2001 dalam Sinaga, 2013).

Mikroba endofit dapat berupa bakteri atau jamur, tetapi saat ini yang lebih

banyak dieksplorasi adalah jamur-jamur endofit. Mikroba endofit mempunyai

kemampuan untuk memproduksi senyawa-senyawa bioaktif, baik yang sama

dengan inangnya ataupun tidak sama, tetapi seringkali memiliki aktivitas biologis

yang serupa dengan senyawa bioaktif yang diproduksi inangnya (Sinaga, 2013).

Menurut literatur, senyawa yang dihasilkan oleh mikroba endofit seringkali

memiliki aktivitas yang lebih besar dibandingkan aktivitas senyawa tumbuhan

inangnya (Strobel, 2003). Beberapa endofit mampu memberikan proteksi kepada

tanaman inangnya untuk melawan beberapa nematoda, mamalia, herbivora insekta

maupun bakteri dan fungi patogen. Endofit lainnya, mampu meningkatkan efek

alelopati pada tanaman inangnya terhadap spesies lain yang tumbuh di dekatnya,

biasanya menjadi kompetitor untuk nutrisi dan tempat untuk hidup. Hal ini dapat

menjadi alasan kenapa beberapa tanaman dengan endofit tertentu biasanya cukup

kompetitif untuk menjadi spesies yang dominan di dalam lingkungannya (Tan RX

dan Zou WX, 2001).

Senyawa bioaktif yang dihasilkan dari biomassa membutuhkan sumber

tanaman yang sangat banyak. Untuk mengefisiensikan cara memperoleh senyawa

bioaktif tersebut, maka digunakan mikroba endofit spesifik yang diperoleh dari

bagian dalam tanaman yang diharapkan mampu menghasilkan sejumlah senyawa

bioaktif yang dibutuhkan tanpa harus mengekstrak dari tanamannya (Sinamarta,

2003).

Menurut Stierle et al., (1995) dalam Fatiqin (2009), bahwa pemanfaatan

mikroba endofit dalam memproduksi senyawa aktif memiliki beberapa kelebihan,

antara lain senyawa yang dihasilkan lebih cepat dengan mutu yang seragam, dapat

diproduksi dalam skala besar dan kemungkinan diperoleh komponen bioaktif baru

dengan memberikan kondisi yang berbeda.

Leunca (Solanum nigrum) memiliki efek farmakologis yang berkhasiat

sebagai obat. Leunca (Solanum nigrum) digunakan secara tradisional untuk

mengobati berbagai penyakit seperti rasa sakit, peradangan, penyakit demam

3


enterik, dan diuretik. Leunca memiliki banyak senyawa yang bertanggung jawab

untuk aktivitas farmakologi. Komponen aktifnya adalah glikoalkaloid,

glikoprotein, polisakarida, senyawa polifenol seperti asam gallat, katekin, asam

protokatekuat, asam kafeat, epikatekin, rutin, dan naringenin (Chauhan et al.,

2012).

Beberapa penelitian sebelumnya tentang Solanum nigrum menunjukkan

bahwa Solanum nigrum memiliki aktivitas antibakteri. Subashini et al. (2013)

meneliti bahwa ekstrak metanol dari biji Solanum nigrum menunjukkan aktivitas

antibakteri terhadap bakteri S.thypi, B.subtilis, S.aureus, dan V.cholera. Sementara

penelitian Matasyoh et al. (2014) menunjukkan bahwa ekstrak etanol dari berbagai

macam jenis Solanum nigrum menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap S.aureus,

B.subtilis, P.syringe, B.mirabilis, E.coli, S.thypi, Shigella spp, dan P.acne.

Penelitian Sridhar et al. (2011) menunjukkan bahwa ekstrak daun, biji dan akar dari

Solanum nigrum dengan menggunakan pelarut organik (etanol, metanol, etil asetat,

dietil eter, kloroform dan heksan) menunjukkan aktivitas antibakteri pada bakteri

B.subtilis, B.megaterium, S.aureus, K.pneumonia, E.coli, P.vulgaris dan P.putrida.

Sejauh ini, belum ditemukan adanya studi yang terfokus pada aktivitas

antibakteri yang terdapat dalam kapang endofit dari tanaman leunca. Oleh karena

itu, penelitian ini bertujuan untuk melakukan uji aktivitas antibakteri dari isolat

kapang endofit daun tanaman leunca (Solanum nigrum).

1.2 Rumusan Masalah

Dari uraian di atas, tanaman leunca banyak ditemui di Indonesia. Leunca

(Solanum nigrum) digunakan secara tradisional untuk mengobati berbagai penyakit

seperti rasa sakit, peradangan, penyakit demam enterik, dan diuretik. Tanaman

leunca banyak mengandung glikoalkaloid, glikoprotein, polisakarida, senyawa

polifenol seperti asam gallat, katekin, asam protokatekuat, asam kafeat, epikatekin,

rutin, dan naringenin.

Tanaman leunca dapat memproduksi senyawa metabolit sekunder yang

berkhasiat sebagai antibakteri. Sampai saat ini belum ditemukan adanya penelitian

yang terfokus pada kapang endofit tanaman leunca sebagai antibakteri.

4


1.3 Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan Umum

Untuk mengetahui aktivitas antibakteri kapang endofit yang diperoleh dari

isolat daun tanaman leunca (Solanum nigrum).

1.3.2 Tujuan Khusus

1. Untuk memperoleh isolat kapang endofit dari daun tanaman leunca

(Solanum nigrum).

2. Untuk memperoleh isolat kapang endofit daun tanaman leunca (Solanum

nigrum) yang mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus

aureus, Shigella dysentriae, Salmonella enterica sv thypimurium,

Helicobacter pylori, dan Bacillus subtilis.

1.4 Manfaat Penelitian

1.4.1 Secara teoritis

Secara teoritis penelitian ini akan menambah khasanah ilmu pengetahun

tentang aktivitas antibakteri dari kapang endofit yang diisolasi dari daun tanaman

leunca (Solanum nigrum) yang nantinya akan memberikan manfaat terhadap

pembuatan obat baru.

1.4.2 Secara metodologi

Secara metodologi penelitian ini mengangkat kapang sebagai agen

antibakteri dan dapat digunakan pada penelitian selanjutnya untuk uji aktivitas

lainnya dari kapang endofit yang diisolasi dari daun tanaman leunca (Solanum

nigrum).

1.4.3 Secara aplikatif

Secara aplikatif hasil penelitian ini hendaknya dapat diterapkan dalam

usaha mendapatkan sumber obat baru yang bermanfaat bagi ilmu pengetahuan

sebagai wujud pemanfaatan sumber daya alam.

5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Mikroba Endofit

2.1.1 Definisi

Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup di dalam jaringan tanaman

pada periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan

tanaman tanpa membahayakan inangnya. Setiap tanaman tingkat tinggi dapat

mengandung beberapa mikroba endofit yang mampu menghasilkan senyawa

biologi atau metabolit sekunder yang diduga sebagai akibat koevolusi atau transfer

genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikroba endofit

(Tan RX dan Zou WX, 2001).

Mikroba endofit yang terdapat dalam jaringan tumbuhan ada beberapa

bentuk yaitu: fungi (kapang dan khamir), bakteria, mycoplasma, archaebakteria.

Diantara keempat bentuk organisme tersebut, fungi adalah bentuk mikroorganisme

yang paling banyak ditemukan sebagai endofit (Strobel, 2003).

Fungi endofit dapat membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa

membahayakan inangnya Hubungan yang terjadi antara inang dan fungi endofit

bukan merupakan hubungan patogenitas. Fungi endofit yang terdapat dalam

tanaman memacu perkecambahan, untuk bertahan dalam kondisi yang kurang

menguntungkan, mempercepat pertumbuhan, ketahanan terhadap patogen

lemah, dan beberapa kasus yang dapat meningkatkan ketahanan tanaman

terhadap tekanan lingkungan (Rante et al., 2013).

Kemampuan mikroba endofit memproduksi senyawa metabolit sekunder

sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat besar dan dapat

diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder dari mikroba endofit yang

diisolasi dari tanaman inangnya tersebut. Sekitar 300.000 jenis tanaman yang

tersebar di muka bumi ini, masing-masing tanaman mengandung satu atau lebih

mikroba endofit yang terdiri dari bakteri dan kapang (Strobel, 2003). Sehingga

apabila endofit yang diisolasi dari suatu tanaman obat dapat menghasilkan alkaloid

atau metabolit sekunder sama dengan tanaman aslinya atau bahkan dalam jumlah

6


yang lebih tinggi, sehingga tidak perlu menebang tanaman aslinya untuk diambil

sebagai simplisia (Radji, 2005).

Berbagai jenis endofit telah berhasil diisolasi dari tanaman inangnya, dan

telah berhasil dibiakkan dalam media perbenihan yang sesuai. Metabolit sekunder

yang diproduksi oleh mikroba endofit tersebut telah berhasil diisolasi dan

dimurnikan serta telah dielusidasi struktur molekulnya. Beberapa mikroba endofit

yang menghasilkan antibiotika diantaranya adalah:

1. Cryptocandin

Merupakan antifungi yang dihasilkan oleh mikroba endofit

Cryptosporiopsis quercina yang berhasil diisolasi dari tanaman obat Tripterigeum

wilfordii, dan berhasiat sebagai antijamur yang patogen terhadap manusia yaitu

Candida albicans dan Trichopyton spp. (Strobel et al., 1999 dalam Radji, 2005).

2. Ecomycyn

Ecomycin diproduksi oleh Pseudomonas viridiflava juga aktif terhadap

Cryptococcus neoformans dan Candida albicans. Ecomycin merupakan lipopeptida

yang disamping terdiri dari molekul asam amino yang umum juga mengandung

homoserin dan beta hidroksi asam aspartat (Miller et al., 1998 dalam Radji, 2005).

3. Pseudomycin

Senyawa kimia yang diproduksi oleh mikroba endofit Pseudomonas

Syringae berhasiat sebagai anti jamur adalah pseudomycin, yang dapat menghambat

pertumbuhan Candida albicans dan Cryptococcus neoformans (Harrison et al.,

1991 dalam Radji, 2005).

4. Munumbicin

Antibiotika berspektrum luas yang disebut munumbicin, dihasilkan oleh

endofit Streptomyces spp. strain NRRL 30562 yang merupakan endofit yang

diisolasi dari tanaman Kennedia nigriscans, dapat menghambat pertumbuhan

Bacillus anthracis, dan Mycobacterium tuberculosis yang multiresisten terhadap

berbagai obat anti TBC (Castillo et al., 2002).

5. Kakadumycin

Jenis endofit lainnya yang juga menghasilkan antibiotika berspektrum luas

adalah mikroba endofit yang diisolasi dari tanaman Grevillea pteridifolia. Endofit

ini menghasilkan metabolit kakadumycin. Aktifitas antibakterinya sama seperti

7


munumbicin D, dan kakadumycin ini juga berkhasiat sebagai anti malaria (Castillo

et al., 2003 dalam Radji, 2005).

2.1.2 Metode Isolasi Kapang Endofit

Isolasi kapang endofit dilakukan dengan metode direct seed planting.

Tanaman sampel bisa diisolasi langsung dari tanaman hidup atau tanaman yang

diawetkan. Apabila tanaman diawetkan, sedikit dari jaringan tanaman dipotong dari

tanaman dan ditaruh dalam plastik bersegel. Plastik tempat menyimpan tanaman

harus bebas dari udara lembab (Strobel, 2003). Sebelum dilakukan sterilisasi

permukaan, tanaman sampel yang langsung diperoleh dari alam (tidak diawetkan)

dialiri dengan air mengalir selama 10 menit hingga bersih dari pengotor seperti

debu dan tanah (Wahyudi P, 1998).

Sterilisasi permukaan bertujuan untuk mengeliminasi mikroba yang

terkandung pada permukaan tanaman. Sterilisasi permukaan dapat dilakukan

dengan beberapa cara antara lain dibakar, dicelupkan dalam alkohol 70-75%, dan

dicelupkan di larutan NaOCl (Strobel, 2003). Langkah selanjutnya setelah

dilakukan sterilisasi permukaan, jaringan bagian luar dihilangkan dengan pisau

steril. Jaringan bagian dalam lalu diiris membujur dan diletakkan dengan hati-hati

pada permukaan media agar. Potongan tanaman pada media isolasi diinkubasi

selama 5-21 hari (Strobel, 2003 ; Wahyudi P, 1988 dalam Atika, 2007).

Pada umumnya kapang yang telah diperoleh sebagai kultur murni dapat

langsung dimanfaatkan dengan fermentasi atau dilakukan uji ketahanan dulu. Uji

ketahanan dapat dilakukan dengan menumbuhkan kapang pada berbagai media dan

kondisi. Untuk memperoleh metabolit dari kapang endofit dapat dilakukan dengan

fermentasi lalu senyawa bioaktif diekstraksi (Strobel, 2003 dalam Atika, 2007).

Beberapa media yang biasa digunakan sebagai media isolasi yaitu:

Granulated Agar, Corn Meal Malt (CMM) Agar, Potato Dextrose Agar (PDA).

Dapat dilakukan modifikasi media dengan melakukan pengurangan nutrisi media

sehingga nutrisi yang terdapat dalam media hanya 10% dari konsentrasi nutrisi

penuh. Media tersebut kerap disebut media miskin. Media sederhana yang biasa

digunakan yaitu PDA 10% dan Granulated Agar. Tujuan dari pembuatan media

8


sederhana ini untuk menghambat kapang non-endofit yang bersifat fast grower

sehingga pertumbuhan kapang endofit yang bersifat slow grower tidak terganggu.

Untuk menghindari kontaminasi bakteri dapat ditambahkan antibiotik

seperti: kloramfenikol, tetrasiklin, dan ampisilin (Atika, 2007). Media yang

digunakan sebagai media permurnian biasanya merupakan media yang lebih kaya

dan lebih mudah dicerna dari media isolasi. Media yang sering digunakan sebagai

media pemurnian adalah PDA sedangkan, media yang digunakan untuk fermentasi

yaitu: Potato Dextrose Broth (PDB). PDB seringkali dikombinasi dengan Yeast

Extract, kombinasi ini dikenal sebagai media PDY (Potato Dextrose Yeast)

(Strobel, 2003 dalam Atika, 2007).

2.2 Fermentasi

Fermentasi berasal dari kata fervere (Latin), yang berarti mendidih,

menggambarkan aksi ragi pada ekstrak buah selama pembuatan minuman

beralkohol. Pengertian fermentasi agak berbeda antara ahli mikrobiologi dan ahli

biokimia. Pengertian fermentasi dikembangkan oleh ahli biokimia yaitu proses

yang menghasilkan energi dengan perombakan senyawa organik. Ahli

mikrobiologi industri memperluas pengertian fermentasi menjadi segala proses

untuk menghasilkan suatu produk dari kultur mikroorganisme (Walker & Gingold,

1993 dalam Sulistyaningrum, 2008).

Fermentasi juga dapat diartikan sebagai suatu disimilasi senyawa-senyawa

organik yang disebabkan oleh aktivitas mikroorganisme. Disimilasi merupakan

reaksi kimia yang membebaskan energi melalui perombakan nutrien. Pada proses

disimilasi, senyawa substrat yang merupakan sumber energi diubah menjadi

senyawa yang lebih sederhana atau tingkat energinya lebih rendah. Reaksi

disimilasi merupakan aktivitas katabolik sel (Smith,1990 ; Pelczar 1986 dalam

Sulistyaningrum, 2008).

Proses fermentasi mendayagunakan aktivitas suatu mikroba tertentu atau

campuran beberapa spesies mikroba. Mikroba yang banyak digunakan dalam

proses fermentasi antara lain khamir, kapang dan bakteri (Pelczar, 1986 dalam

Sulistyaningrum, 2008).

9


Secara umum ada empat kelompok fermentasi yang penting secara ekonomi

(Stanburry, 1984 dalam Sulistyaningrum 2008) :

1. Fermentasi yang memproduksi sel mikroba (biomass)

Produksi komersial dari biomass dapat dibedakan menjadi produksi yeast

untuk industri roti, dan produksi sel mikroba untuk digunakan sebagai makanan

manusia dan hewan.

2. Fermentasi yang menghasilkan enzim dari mikroba

Secara komersial, enzim dapat diproduksi oleh tanaman, hewan, dan

mikroba, namun enzim yang diproduksi oleh mikroba memiliki beberapa

keunggulan yaitu, mampu dihasilkan dalam jumlah besar dan mudah untuk

meningkatkan produktivitas bila dibandingkan dengan tanaman atau hewan.

3. Fermentasi yang menghasilkan metabolit mikroba

Metabolit mikroba dapat dibedakan menjadi metabolit primer dan metabolit

sekunder. Produk metabolisme primer yang dianggap penting contohnya etanol,

asam sitrat, polisakarida, aseton, butanol, dan vitamin. Sedangkan metabolit

sekunder yang dihasilkan mikroba contohnya antibiotik, pemacu pertumbuhan

inhibitor enzim, dan lain-lain.

4. Proses transformasi

Sel mikroba dapat digunakan untuk mengubah suatu senyawa menjadi

senyawa lain yang masih memiliki kemiripan struktur namun memiliki nilai

komersial yang lebih tinggi. Proses transformasi dengan menggunakan mikroba ini

lebih baik bila dibandingkan dengan proses kimia, berkaitan dengan penggunaan

reagen kimia yang lebih sedikit. Selain itu proses dapat berlangsung pada suhu

rendah tanpa membutuhkan katalis logam berat yang berpotensi menimbulkan

potensi.

Fermentasi dapat dilakukan dengan metode kultur permukaan dan kultur

terendam (submerged). Medium kultur permukaan dapat berupa medium padat,

semi padat atau cair. Sedangkan kultur terendam dilakukan dalam medium cair

menggunakan bioreaktor yang dapat berupa labu yang diberi aerasi, labu yang

digoyang dengan shaker atau fermentor (Ansori, 1992 dalam Sulistyaningrum,

2008).

10


Dibandingkan dengan medium padat, medium cair mempunyai beberapa

kelebihan, yaitu jenis dan konsentrasi komponen-komponen medium dapat diatur

sesuai dengan yang diinginkan, dapat memberikan kondisi yang optimum untuk

pertumbuhan, dan pemakaian medium lebih efisien (Ansori, 1992 dalam

Sulistyaningrum 2008).

Fermentasi permukaan medium cair merupakan cara fermentasi yang telah

sejak lama dipraktekkan untuk memproduksi berbagai produk fermentasi, misalnya

produksi asam asetat secara tradisional. Fermentasi permukaan medium cair ini

mulai ditinggalkan sejak fermentasi terendam terbukti lebih efisien, khususnya

dalam memproduksi produk-produk fermentasi yang bernilai ekonomis tinggi dan

menghendaki sterilitas yang tinggi, seperti misalnya produksi antibiotika (Ansori,

1992 dalam Sulistyaningrum, 2008). Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam

proses fermentasi adalah:

a. Kecepatan aerasi sering tidak sesuai dengan jumlah oksigen yang

dibutuhkan dan oksigen yang terlarut dalam media. Hal ini dapat diatasi

dengan penggunaan detektor untuk mengontrol oksigen yang terlarut.

b. Jumlah sumber karbon dan nutrisi lain harus sesuai baik dalam jumlah dan

komposisi dengan mikroba dan produk yang diinginkan.

c. Toksin yang terakumulasi dan dapat menghambat pertumbuhan.

d. Perubahan pH selama proses fermentasi. Hal ini dapat diatasi dengan

melakukan titrasi pH selama fermentasi berlangsung.

e. Busa yang mungkin timbul. Busa dapat disebabkan oleh : kandungan garam,

pH, suhu, komposisi media, aliran udara, agitasi, dan penambahan antibusa

yang berlebihan. Anti busa yang ditambahkan dalam media fermentasi

dapat mengurangi jumlah oksigen yang terlarut media (McNeil and Harvey,

2008 dalam Purwanto, 2011).

2.3 Tanaman Leunca (Solanum nigrum)

Leunca adalah tanaman obat dari keluarga Solanaceae. Nama umumnya

adalah Makoi dan blacknight shade. Dua varietas Solanum nigrum dapat berupa

buah warna hitam dan kedua adalah buah berwarna coklat kemerahan. Varietas

11


buah warna hitam beracun. Seluruh tanaman digunakan untuk bidang kesehatan

(Chauhan et al., 2012).

2.3.1 Taksonomi Tanaman

Berdasarkan taksonominya, tanaman Solanum nigrum diklasifikasikan

sebagai berikut:

Kingdom : Plantae

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Orde : Solanales

Famili : Solanaceae

Genus : Solanum

Spesies : Solanum nigrum

(Prima, 2012)

Gambar 2.1 Tanaman Leunca (Solanum nigrum)

[koleksi pribadi]

2.3.2 Deskripsi

Tinggi leunca adalah 25-100 cm, merupakan tanaman tahunan. Batangnya

tegak, bulat, lunak, hijau. Buah berwarna hitam, bulat, 8- 10 mm. Daun bulat telur,

dasarnya cuneate, lebar 4-10 cm dan 3-7, puncak yang tumpul. Perbungaan kelopak

12


berbentuk cangkir, mahkota putih, lobus bulat telur-lonjong, Siliata menyebar.

Filamen barukuran 1-1,5 mm; anter berukuran 2.5- 3,5 mm. Biji berbentuk bulat

pipih, kecil berwarna putih. Akar tunggang, berwarna putih kecoklatan (Chauchan

et al., 2012; Depkes RI, 1994).

2.3.3 Kandungan Kimia

Solanum nigrum memiliki banyak senyawa yang bertanggung jawab untuk

aktivitas farmakologi. Komponen aktifnya adalah glikoalkaloid, glikoprotein, dan

polisakarida, senyawa polifenol seperti asam galat, katekin, asam protokatekuat,

asam kafeat, epikatekin, rutin, dan naringenin (Chauhan et al., 2012).

2.3.4 Penggunaan secara Tradisional

Solanum nigrum telah digunakan secara tradisional untuk mengobati

berbagai penyakit seperti rasa sakit, peradangan dan penyakit demam enterik.

Solanum nigrum memiliki banyak aktivitas seperti antitumorigenik, antioksidan,

anti-inflamasi, hepatoprotektor, diuretik, agen antipiretik, antibakteri, antimikotika,

sitotoksisitas, antikonvulsan, anti ulcerogenik. Solanum nigrum juga digunakan

terhadap penyakit menular seksual (Chauhan et al., 2012).

2.4 Bakteri Patogen

Bakteri uji yang digunakan untuk penelitian ini ada lima jenis, yaitu

Staphylococcus aureus, Shigella dysentriae, Salmonella enterica sv thypimurium,

Helicobacter pylori, dan Bacillus subtilis.

2.4.1 Staphylococcus aureus

2.4.1.1 Morfologi

Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif berbentuk bulat

berdiameter 0,7-1,2 µm, tersusun dalam kelompok-kelompok yang tidak teratur

seperti buah anggur, fakultatif anaerob, tidak membentuk spora, dan tidak bergerak.

Bakteri ini tumbuh pada suhu optimum 37ºC, tetapi membentuk pigmen paling baik

pada suhu kamar (20-25ºC). Koloni pada perbenihan padat berwarna abu-abu

sampai kuning keemasan, berbentuk bundar, halus, menonjol, dan berkilau. Lebih

13


dari 90% isolat klinik menghasilkan Staphylococcus aureus yang mempunyai

kapsul polisakarida atau selaput tipis yang berperan dalam virulensi bakteri (Jawetz

et al., 1995 ; Novick et al., 2000 dalam Kusuma, 2009).

2.4.1.2 Klasifikasi

Domain : Bacteria

Kingdom : Eubacteria

Filum : Firmicutes

Kelas : Bacilli

Ordo : Bacillales

Famili : Staphylococcaceae

Genus : Staphylococcus

Spesies : Stapylococcus aureus (Rosenbach, 1884)

2.4.1.3 Sifat Kultur

Stapylococcus aureus tumbuh dengan baik pada berbagai media

bakteriologik dibawah suasana aerobik atau mikro-aerobik. Tumbuh dengan cepat

pada temperatur 37℃, namun pembentukan pigmen yang terbaik adalah pada

temperatur kamar (20-35℃). Koloni pada media yang padat akan berbentuk bulat,

halus, menonjol, dan berkilau-kilau, membentuk berbagai pigmen berwarna kuning

keemasan (Jawetz et al., 2005 dalam Kusuma, 2009).

2.4.1.4 Patogenesis dan patologi

Sebagian bakteri Stapylococcus merupakan flora normal pada kulit, saluran

pernafasan, dan saluran pencernaan makanan pada manusia. Bakteri ini juga

ditemukan di udara dan lingkungan sekitar. Stapylococcus aureus yang bersifat

invasif, menyebabkan hemolisis, membentuk koagulase, dan mampu meragikan

manitol (Warsa, 1994 dalam Kusuma, 2009).

Infeksi oleh Stapylococcus aureus ditandai dengan kerusakan jaringan yang

disertai abses bernanah. Beberapa penyakit infeksi yang disebabkan oleh

Stapylococcus aureus adalah bisul, jerawat, impetigo, dan infeksi luka. Infeksi

yang lebih berat diantaranya pneumonia, mastitis, plebitis, meningitis, infeksi

14


saluran kemih, osteomielitis, dan endokarditis. Stapylococcus aureus juga

merupakan penyebab utama infeksi nosokomial, keracunan makanan, dan sindroma

syok toksik (Ryan et al., 1994 ; Warsa, 1994 dalam Kusuma, 2009).

2.4.2 Shigella dysenteriae

2.4.2.1 Morfologi

Shigella dysenteriae adalah bakteri Gram negatif yang memiliki morfologi

batang ramping, tidak berkapsul, tidak bergerak, tidak membentuk spora, bersifat

fakultatif anaerob tetapi paling baik tumbuh secara aerobik. Bentuk koloni Shigella

dysenteriae konveks, bulat, transparan dengan pinggir-pinggir utuh mencapai

diameter kira-kira 2 mm dalam 24 jam. Bakteri ini sering ditemukan pada

perbenihan diferensial karena ketidakmampuannya meragikan laktosa (Jawetz et

al., 2005). Shigella sp mempunyai susunan antigen yang kompleks. Terdapat

banyak tumpang tindih dalam sifat serologik berbagai spesies dan sebagian besar

bakteri ini mempunyai antigen O yang juga dimiliki oleh bakteri enterik lainnya.

Antigen somatik O dari Shigella sp adalah lipopolisakarida. Kekhususan

serologiknya tergantung pada polisakarida dan terdapat lebih dari 40 serotipe.

Klasifikasi Shigella sp didasarkan pada sifat-sifat biokimia dan antigeniknya

(Jawetz et al., 2005).

2.4.2.2 Klasifikasi

Kingdom : Bacteria

Filum : Proteobacteria

Kelas : Gamma Proteobacteria

Ordo : Enterobacteriales

Famili : Enterobacteriaceae

Genus : Shigella

Spesies : Shigella dysentriae (Jawetz et al., 2005)

2.4.2.3 Patogenesis dan patologi

Shigellosis disebut juga disentri basiler, disentri sendiri artinya salah satu

dari berbagai gangguan yang ditandai dengan peradangan usus, terutama kolon dan

15


disertai nyeri perut , dan buang air besar yang sering mengandung darah dan mukus.

Habitat alamiah bakteri disentri adalah usus besar manusia, tempat bakteri tersebut

dapat menyebabkan disentri basiler. Infeksi Shigella dysenteriae praktis selalu

terbatas pada saluran pencernaan, dan invasi bakteri ke dalam darah sangat jarang.

Shigella dysenteriae menimbulkan penyakit yang sangat menular dengan dosis

infektif dari bakteri Shigella dysenteriae adalah kurang dari 10 organisme dan

merupakan golongan Shigella sp yang cenderung resisten terhadap antibiotik

(Jawetz et al., 2005).

Shigella dysenteriae dapat menyebabkan 3 bentuk diare:

Disentri klasik dengan tinja yang konsisten lembek disertai darah dan mukus

Diare berair (Watery diarrhea)

Kombinasi antara disentri klasik dengan tinja yang konsisten lembek disertai

darah, mukus, ditambah dengan diare berair (Jawetz et al., 2005).

2.4.3 Bacilllus subtilis

2.4.3.1 Morfologi

Bacillus subtilis adalah bakteri aerobik gram positif, mempunyai ciri-ciri sel

berbentuk batang pendek (rods), sendiri-sendiri, jarang membentuk rantai, motil

dengan flagella peritrich, permukaan spora terwarnai pucat dan membentuk

endospora berukuran 0,8 x 1,5-1,8 µm. Pada spora yang berkecambah, dinding

spora pecah secara melintang (Jauhari, 2010).

Koloni bakteri pada medium agar berbentuk bundar, tepi tidak teratur,

permukaan tidak mengkilap, menjadi tebal dan keruh (opaque), kadang-kadang

mengkerut dan berwarna krem atau kecoklatan. Bentuk koloni agak bervariasi pada

media yang berbeda. Koloni meluas pesat pada medium yang berpermukaan

lembab (Jauhari, 2010).

2.4.3.2 Klasifikasi

Klasifikasi B. subtilis ini adalah sebagai berikut:

Kingdom : Bacteria

Filum : Firmicutes

Kelas : Bacilli

16


Ordo : Bacillales

Famili : Bacillaceae

Genus : Bacillus

Spesies : Bacillus subtilis (Madigan, 2005)

2.4.4 Salmonella enterica sv thypimurium

2.4.4.1 Morfologi

Salmonella sp. adalah bakteri batang lurus, gram negatif, tidak berspora,

bergerak dengan flagel peritrik, berukuran 2-4 µm x 0.5-0,8 µm. Salmonella sp.

tumbuh cepat dalam media yang sederhana (Jawetz et al., 2005), hampir tidak

pernah memfermentasi laktosa dan sukrosa, membentuk asam dan kadang gas

dari glukosa dan manosa, biasanya memporoduksi hidrogen sulfida atau H2S,

pada biakan agar koloninya besar bergaris tengah 2-8 mm, bulat agak cembung,

jernih, pada media BAP tidak menyebabkan hemolisis, pada media Mac Concey

koloni Salmonella sp. Tidak memfermentasi laktosa (NLF), konsistensinya smooth

(WHO, 2003).

2.4.4.2 Klasifikasi

Salmonella enterica sv thypimurium adalah bakteri Gram negatif dengan

klasifikasi sebagai berikut :

Famili : Enterobacteriaceae

Genus : Salmonella

Spesies : Salmonella enterica sv thypimurium

(Syahruchrahman et al., 1993 ; Bryan et al., 1963)

2.4.4.3 Patogenesis dan Patologi

Bakteri Salmonella enterica sv thypimurium ditularkan melalui makanan

dan minuman yang terkontaminas oleh kotoran atau tinja dari seorang penderita

demam typoid. Bakteri ini akan masuk melalui mulut bersama makanan dan

minuman dan kemudian hanyut ke saluran pencernaan. Apabila bakteri masuk ke

dalam tubuh manusia, tubuh akan berusaha untuk mengeliminasinya. Tetapi bila

bakteri dapat bertahan dan jumlah yang masuk cukup banyak, maka bakteri akan

17


berhasil mencapai usus halus. Kemudian bakteri berusaha masuk ke dalam tubuh

dan akhirnya merangsang sel darah putih untuk menghasilkan interleukin yang

merangsang terjadinya gejala demam, perasaan lemah, sakit kepala, nafsu makan

berkurang, sakit perut, gangguan buang air besar serta gejala lainnya (Darmawati

dan Sri Sinto, 2008).

2.4.5 Helicobacter pylori

2.4.5.1 Morfologi

Helicobacter pylori adalah bakteri gram negatif berbentuk batang atau

kokoid (beberapa kepustakaan menyebutnya spiral atau seperti huruf “S”),

mempunyai flagel yang memungkinkan bakteri ini memiliki daya motilitas tinggi,

dan bersifat mikroaerofilik. Tempat yang sesuai didalam tubuh manusia adalah

antrum. H.pylori dapat berkonversi dari bentuk batang ke bentuk kokoid. Bentuk

batang lebih virulen dibanding bentuk kokoid, sedangkan bentuk kokoid sendiri

dikatakan berperan terhadap kekambuhan infeksi (Tehuteru, 2004).

2.4.5.2 Klasifikasi

Domain : Eubacteria

Kingdom : Bacteria

Filum : Proteobacteria

Kelas : Epsilonproteobacteria

Ordo : Campylobacterales

Famili : Helicobacteraceae

Genus : Helicobacter

Spesies : Helicobacter pylori (bioweb.uwlax.edu)

2.4.5.3 Patogenesis dan Patologi

Infeksi H.pylori seringkali ditemui pada anak-anak. Terdapat tiga kelainan

yang dapat ditemukan sebagai akibat infeksi H.pylori pada anak. Pertama, infeksi

akut H.pylori pada lambung dapat menyebabkan hipoklorhidria akibat adanya

proses inflamasi yang menyebabkan disfungsi sel parietal. Dalam beberapa bulan,

keadaan hipoklorhidria ini dapat sembuh dan pH lambung kembali normal,

18


sedangkan pada infeksi kronis, H.pylori akan terus merangsang produksi asam

lambung. Mekanisme terjadinya keadaan tersebut belum diketahui secara pasti.

Kelainan kedua yang ditemukan adalah inflamasi lambung. Infeksi H.pylori dapat

menginduksi respon humoral sistemik dan mukosa, namun antibodi yang terbentuk

tidak dapat mengeradikasi kuman. Hal ini diduga disebabkan adanya mukus

lambung yang melindungi H.pylori, sehingga tidak dapat ditembus oleh antibodi

spesifik. Kolonisasi H.pylori di lambung biasanya disertai proses inflamasi

sehingga dapat ditemukan sel neutrofil, sel T, sel plasma, dan makrofag secara

bersamaan dengan berbagai derajat degenerasi dan kerusakan sel epitel. Ulserasi

merupakan kemungkinan kelainan ketiga yang tergantung dari virulensi strain

H.pylori. Masing-masing strain H.pylori mempunyai tingkat virulensi yang berbeda

(Tehuteru, 2004).

Gastritis atrofi, ulkus duodenum, dan karsinoma lambung lebih banyak

dijumpai pada pasien yang terinfeksi oleh H.pylori yang memproduksi CagA

(Tehuteru, 2004).

2.5 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Bakteri

Secara umum ada dua faktor yang dapat mempengaruhi pertumbuhan

bakteri yaitu faktor lingkungan dan zat hara sebagai nutrien yang sesuai untuk

pertumbuhan optimum. Termasuk dalam faktor lingkungan adalah suhu, pH,

oksigen dan tekanan osmotik (Lay dan Hastowo, 1992 dalam Silaban, 2011).

a. Suhu

Pada umumnya bakteri tumbuh pada suhu 37℃, untuk setiap spesies ada

batasan suhu maksimum dan minimum untuk pertumbuhan. Beberapa

kelompok bakteri menurut suhu optimum yaitu psikrofil (Bakteri dapat tumbuh

pada suhu 5-30℃ mesofil (bakteri tumbuh pada suhu 15-50℃ dan termofil

(bakteri dapat tumbuh pada suhu 50℃-60℃).

b. pH

Pada umumnya bakteri tumbuh pada pH sekitar 7,0, meskipun kisaran pHnya,

untuk mengatur pH dapat ditambahkan asam atau basa.

19


c. Oksigen

Bakteri dibagi dalam 3 kelompok menurut keperluannya akan oksigen yaitu

aerob obligat (bakteri yang memerlukan oksigen untuk pertumbuhannya),

anaerob obligat (bakteri yang hanya dapat tumbuh bila tidak ada oksigen) dan

fakultatif anaerob (bakteri yang dapat tumbuh dalam keadaan dengan atau tanpa

oksigen).

d. Tekanan Osmotik

Bakteri pada umumnya dapat tumbuh dalam kisaran tekanan osmotik yang

cukup besar. Bakteri yang membutuhkan tekanan osmotik yang disebut

osmofilik. Bakteri yang membutuhkan konsentrasi garam yang tinggi disebut

halofilik. Pada beberapa bakteri memerlukan konsentrasi garam yang tinggi

untuk pertumbuhannya. Akan tetapi bila konsentrasi garam sangat tinggi maka

air akan keluar dari sel sehingga pertumbuhan akan berhenti.

2.6 Fase Pertumbuhan Bakteri

Bakteri mengalami pertumbuhan yang dapat dibagi dalam 4 fase menurut

(Pratiwi, 2008; Dwidjoseputro, 1994) yaitu:

1. Fase lag

Pada saat dipindahkan ke media yang baru, bakteri tidak langsung tumbuh

dan membelah, meskipun kondisi media sangat mendukung untuk pertumbuhan.

Bakteri biasanya akan mengalami masa penyesuaian untuk menyeimbangkan

pertumbuhan.

2. Fase log

Selama fase ini, populasi meningkat dua kali pada interval waktu yang

teratur. Jumlah koloni bakteri akan terus bertambah seiring lajunya aktivitas

metabolisme sel.

3. Fase tetap

Pada fase ini terjadi kompetisi antara bakteri untuk memperoleh nutrisi dari

media untuk tetap hidup. Sebagian bakteri mati sedangkan yang lain tumbuh dan

membelah sehingga jumlah sel bakteri yang hidup menjadi tetap.

20


4. Fase kematian

Pada fase ini, sel bakteri akan mati lebih cepat daripada terbentuknya sel

baru. Laju kematian mengalami percepatan yang eksponensial.

2.7 Antibakteri

Antibakteri didefinisikan sebagai zat aktif yang bersifat toksisitas selektif

yaitu membunuh bakteri yang merugikan manusia tanpa menimbulkan toksisitas

terhadap manusia. Zat semacam ini juga sering disebut zat kemoterapeutik yaitu zat

kimia yang digunakan untuk mengobati penyakit menular (kemoterapi) atau

mencegah penyakit (kemoprofilaksis). Antibiotik didefinisikan sebagai zat yang

dihasilkan suatu mikroorganisme (terutama fungi) baik langsung maupun analog

dan sintesisnya yang dalam jumlah amat kecil bersifat merusak atau menghambat

mikroorganisme lain (Atika, 2007).

Menurut Pelczar dan Chan (1988) cara kerja zat antibakteri dalam

melakukan efeknya terhadap mikroorgaisme adalah sebagai berikut:

Antibakteri yang menghambat metabolisme sel

Bakteri patogen mensintesis sendiri asam folat untuk kelangsungan

hidupnya dari asam para amino benzoat (PABA). Antibakteri golongan ini bersaing

dengan PABA untuk diikutsertakan dalam pembentukan asam folat, maka

terbentuk analog asam folat yang nonfungsional. Akibatnya kehidupan bakteri akan

terganggu. Efek yang ditimbulkan oleh antibakteri golongan ini yaitu bakteriostatik.

Obat yang memiliki mekanisme kerja seperti ini yaitu obat-obat golongan

sulfonamida dan trimetoprim.

Antibakteri yang menghambat sintesis dinding sel

Antibakteri jenis ini menghambat pembentukan komponen dinding sel

bakteri yaitu polipeptidoglikan yaitu suatu kompleks polimer mukopeptida

(glikopeptida). Antibakteri ini akan menghambat reaksi paling dini dalam proses

sintesis dinding sel dan reaksi terakhir (transpeptidasi) dalam rangkaian reaksi

tersebut. Akibatnya tekanan osmotik di dalam sel akan lebih tinggi dibandingkan

di luar sehingga terjadi lisis dinding sel. Obat yang termasuk golongan ini secara

kimia digolongkan sebagai turunan β-laktam yaitu penisilin dan sefalosporin serta

turunan polipeptida seperti basitrasin.

21


Antibakteri yang menganggu permeabilitas membran sel

Antibakteri yang termasuk golongan ini yaitu polimiksin. Polimiksin

sebagai senyawa amonium-kuartener dapat merusak membran sel setelah bereaksi

dengan fosfat pada fosfolipid membran sel bakteri. Polimiksin tidak efektif

terhadap kuman Gram-positif karena jumlah fosfor bakteri ini rendah. Kerusakan

membran sel menyebabkan keluarnya berbagai komponen penting dari dalam sel

bakteri yaitu protein, asam nukleat, nukleotida, dan lain-lain.

Antibakteri yang menghambat sintesis asam nukleat sel

Antibakteri yang masuk golongan ini yaitu rifampisin dan golongan

kuinolon. Rifampisin menghambat sintesis RNA dan DNA dengan berikatan

dengan enzim polimerase-RNA. Sedangkan golongan kuinolon menghambat enzim

DNA girase. DNA girase ini berfungsi menata kromosom yang sangat panjang

menjadi bentuk spiral sehingga bisa muat dalam sel kuman yang kecil.

Antibakteri yang menghambat sintesis protein

Untuk keperluan hidupnya, sel bakteri perlu mensintesis berbagai protein.

Sintesis protein bakteri berlangsung di ribosom yang terdiri dari dua sub unit yaitu

ribosom 30S dan ribosom 50S. Obat yang masuk golongan ini menghambat sintesis

protein dengan beberapa cara yang melibatkan pengikatan ribosom. Pengikatan

ribosom 30S menyebabkan kode pada mRNA salah dibaca oleh tRNA pada waktu

sintesis protein. Akibatnya terbentuk protein yang abnormal dan nonfungsional

bagi sel mikroba. Pengikatan pada ribosom 50S menyebabkan terjadinya

translokasi kompleks tRNA-peptida dari lokasi asam amino tidak dapat menerima

kompleks tRNA-asam amino yang baru. Obat yang termasuk dalam golongan ini

secara kimia dikenal sebagai turunan aminoglikosida, makrolida, linkosamida

(linkomisin), tetrasiklin, dan amfenikol (kloramfenikol dan tiamfenikol).

2.7.1 Uji Aktivitas Antibakteri

Pada uji ini diukur respon pertumbuhan populasi mikroorganisme terhadap

agen antibakteri. Tujuannya adalah untuk menentukan potensi dan kontrol kualitas

selama proses produksi senyawa antibiotik di pabrik, untuk menentukan

farmakokinetik obat pada hewan atau manusia, dan untuk memonitor dan

mengontrol kemoterapi obat. Kegunaan uji antibakteri ini adalah diperolehnya

22


suatu sistem pengobatan yang efektif dan efisien. Terdapat bermacam-macam

metode uji antibakteri, yaitu metode difusi dan dilusi (Pratiwi, 2008).

Metode difusi

Metode yang paling sering digunakan adalah metode difusi agar.

Menggunakan cakram kertas saring yang berisi sejumlah tertentu obat yang

ditempatkan pada permukaan medium padat yang sebelumnya telah diinokulasi

bakteri uji pada permukaan medianya. Setelah inkubasi, diameter zona hambatan

sekitar cakram dipergunakan mengukur kekuatan hambatan obat terhadap orgaisme

uji (Jawetz et al., 1996).

Menurut Davis dan Stout (1971), kekuatan daya hambat bakteri

dikategorikan dibagi atas: sangat kuat (zona bening >20mm), kuat (zona bening 10-

20mm), sedang (zona bening 5-10mm), dan lemah (<5mm).

Metode dilusi

Metode ini menggunakan antibakteri dengan kadar yang menurun secara

bertahap, baik dengan media cair atau padat. Kemudian media diinokulasi bakteri

uji dan diinkubasi. Tahap akhir dilarutkan antibakteri dengan kadar yang

menghambat atau mematikan. Uji kepekaan cara dilusi agar memakan waktu dan

penggunaanya dibatasi pada keadaan tertentu saja. Uji kepekaan cara dilusi cair

menggunakan tabung reaksi, tidak praktis dan jarang dipakai selain itu juga dapat

menggunakan microdilution plate. Keuntungan uji mikrodilusi cair adalah bahwa

uji ini memberi hasil kuantitatif yang menunjukkan jumlah antibakteri yang

dibutuhkan untuk mematikan.

23

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu

Penelitian ini dilakukan di Lab Mikrobiologi, Laboratorium Farmakogosi

dan Fitokimia, UIN Syarif Hidayatullah, Jakarta. Program Studi Farmasi, Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri, Syarif Hidayatullah,

Jakarta. Waktu pelaksanaan penelitian dimulai pada bulan Januari hingga bulai Mei

2015.

3.2 Alat

Laminar Air Flow (minihelix II), cawan petri bulat (normax), kertas saring,

tabung reaksi (pyrex), inkubator (france etuves), shaker, alat sentrifus, blank disc

(oxoid), vortex mixer, timbangan analitik, mikroskop cahaya (shimadzu), autoklaf

digital, micro pipet dan tip, jarum ose, ose bulat, beaker glass (schott duran), gelas

ukur, pinset, hot plate, water bath, , bunsen, glass object, cover glass, jangka sorong

(tricle brand), magnetic stirrer, kaca arloji, batang pengaduk, spatula, labu

Erlenmeyer (pyrex), spektrofotometri (hitachi), oven (memmert) dan alat-alat

lainnya yang umum digunakan di Laboratorium Mikrobiologi.

3.3 Bahan

3.3.1 Tanaman Uji

Sampel tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian daun

dari Tanaman Leunca (Solanum nigrum) yang didapat Balittro, Bogor yang diambil

pada tanggal 20 Februari 2015. Kemudian bagian dari tanaman ini telah

dideterminasi di Herbarium Bogoriense, LIPI, Cibinong, Bogor.

Sampel daun yang digunakan berjumlah 6 helai. Bagian daun yang

digunakan dalam penelitian ini, diambil dari bagian yang berbeda yaitu daun bagian

atas yang terdapat di bawah daun pucuk, daun bagian tengah dan daun bagian

bawah dekat dengan percabangan batang. Sampel daun yang digunakan harus

masih segar dan belum layu atau menguning. Sampel daun juga harus sehat (tidak

berpenyakit) dan bebas dari kontaminasi.

24


3.3.2 Bahan Kimia Sterilisasi Permukaan

Larutan natrium hipoklorit (NaOCl) 5,25%, etanol 70%, akuades steril

3.3.3 Media Pertumbuhan Mikroba

a. Media yang digunakan untuk isolasi kapang endofit yaitu: Potato Dextrose

Agar (PDA)

b. Media yang digunakan untuk seleksi kapang yang berpotensi sebagai

antibakteri: Nutrient Agar (NA)

c. Media yang digunakan untuk fermentasi kapang endofit: Potato Dextrose

Broth (PDB), Yeast Extract

d. Media yang digunakan untuk uji aktvitas antibakteri yaitu: Nutrient Agar

(NA).

3.3.4 Bahan Uji Aktivitas Antibakteri

a) Bakteri uji : Staphylococcus aureus ATCC 6538, Shigella dysentria ATCC

13313, Bacillus subtilis ATCC 6633, Salmonella enterica sv thypimurium

ATCC 14028, dan Helicobacter pylori ATCC 43504 yang diperoleh dari

Labotarorium Mikrobiologi Farmasi Fakultas Farmasi UI.

b) Bahan Pengenceran inokulum: NaCl fisiologis 0,9% (Otsuka), akuades

steril (otsuka)

c) Bahan pewarnaan Gram: Karbol Kristal Ungu 0,5%, cairan Lugol, etanol

96%, Safranin 0,5%.

3.3.5 Bahan untuk identifikasi kapang: pewarna Methylen blue

3.4. Cara Kerja

3.4.1 Persiapan Alat

Semua alat dan bahan yang digunakan dalam keadaan bersih dan steril.

Sterilisasi dengan melewatkan alat di atas api bunsen sampai berpijar digunakan

untuk mesterilkan peralatan seperti ose, jarum, dan spatula. Sterilisasi dengan oven

dilakukan dengan suhu 170 °C selama 2 jam. Alat-alat yang disterilisasi dengan

cara oven adalah cawan petri, beaker glass, erlenmeyer, dan tabung reaksi.

25


Sterilisasi dengan cara autoklaf dilakukan pada suhu 121oC selama 15 menit. Alat-

alat yang disterilisasi dengan autoklaf adalah alat-alat presisi (gelas ukur, pipet

volumetri) (Volk, 1988).

3.4.2 Pembuatan Medium Isolasi, Medium Peremajaan, dan Medium

Pemeliharaan

3.4.2.1 Potato Dextrose Agar (PDA) plate

Sesuai dengan petunjuk penggunaan yang tercantum pada label PDA merek

Merck, ditimbang Potato Dextrose Agar 39 gram dan ditakar 1 liter aquades. Bahan

dicampurkan dan diaduk dalam magnetik stirer. Disterilisasi dengan autoklaf

selama 15 menit dengan suhu 121°C. Dituang ke dalam cawan petri, masing-masing

10 mL, biarkan media memadat (Yulia, 2005).

3.4.2.2 Potato Dextrose Agar (PDA) slant

Sesuai dengan petunjuk penggunaan yang tercantum pada label PDA merek

Merck, ditimbang Potato Dextrose Agar 39 gram, dan takar 1 liter aquades. Bahan

dicampurkan dan diaduk dengan pengaduk magnetik. Bahan dimasukkan ke dalam

tabung slant masing-masing 10 mL. Disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit

dengan suhu 121°C. Media diletakkan dalam tabung dengan posisi miring ± 45°

dan biarkan media memadat (Yulia, 2005).

3.4.3 Pembuatan Medium Perbanyakan

3.4.3.1. Pembuatan Potato Dextrose Broth (PDB)

Media PDB dibuat dengan cara sejumlah kentang dikupas dan dipotong

menjadi dadu dan kemudian dicuci. Potongan kentang ditimbang 200 g masukkan

dalam erlenmeyer dan didihkan dengan 1000 mL akuades. Diamkan hingga suhu

40oC kemudian disaring.

3.4.3.1 Pembuatan Nutrient Broth (NB)

Sesuai dengan petunjuk penggunaan yang tercantum pada label NB merek

Merck, ditimbang Nutrient Broth 8 gram, dan takar 1 liter aquades. Bahan

26


dicampurkan dan diaduk dengan pengaduk magnetik. Media disterilisasi dengan

autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121°C.

3.4.4 Pembuatan medium fermentasi

3.4.4.1 Potato Dextrose Yeast (PDY)

Disiapkan 1000 mL medium PDB; Yeast Extract 2 gram; dan kalsium

karbonat 5 gram (CaCO3). Bahan dihomogenkan kecuali CaCO3, aduk dengan

pengaduk magnetik ukur pH sampai 6,0. Tambahkan CaCO3, kemudian diaduk.

Media diterilkan dengan autoklaf 15 menit, pada suhu 121℃. Media dimasukkan

masing-masing 200 mL ke dalam botol kaca steril (Atika, 2007).

3.4.5 Pembuatan Medium Pengujian

3.4.5.1 Nutrient Agar (NA)

Sesuai dengan petunjuk penggunaan yang tercantum pada label NA merek

Merck, Ditimbang 20 gram Nutrient Agar dan 1000 mL aquades. Bahan dicampur

dan diaduk dengan magnetik stirer. Media disterilisasi dengan autoklaf selama 15

menit dengan suhu 121°C. Media dituang ke dalam cawan petri, masing-masing 10

mL, dan dibiarkan memadat (Yulia, 2005).

3.4.6 Isolasi Kapang Endofit

3.4.6.1 Sampling Tanaman

Tanaman diambil bagian daun yang masih segar. Dalam penelitian ini,

sampel tanaman diambil dari daerah Balittro, Bogor. Tanaman tersebut kemudian

dideterminasi di Lembaga Penelitian Biologi atau Herbarium Bogoriense. Tanaman

yang masih segar tersebut diberi kode menurut bagian daun yang digunakan.

3.4.6.2 Sterilisasi Permukaan dan Penanaman Simplisia

Bagian daun yang telah dicuci dengan air mengalir lalu disterilkan secara

bertingkat dengan mencelupkan ke dalam alkohol 70% selama 1 menit kemudian

dicelupkan pada larutan NaOCl 5,25% selama 5 menit lalu terakhir dicelupkan lagi

dalam alkohol 70% selama 30 detik menggunakan pinset yang sebelumnya telah

dilewatkan pada api (flambeer) terlebih dahulu. Kemudian sampel dipotong

27


menjadi ukuran ± 1 cm (Atika, 2007). Sampel ditanam di dalam media agar PDA.

Cawan petri yang sudah mengandung sampel tanaman kemudian diinkubasi pada

suhu kamar selama 14 hari (Atika, 2007 dengan modifikasi).

3.4.6.3 Pemurnian Kapang Endofit

Kapang endofit yang tumbuh pada media isolasi selanjutnya dimurnikan

pada media PDA cawan petri dan PDA agar miring. Hifa kapang diambil sedikit

menggunakan ose, kemudian dipindahkan ke dalam cawan petri yang berisi PDA,

kemudian kapang endofit diinkubasi pada suhu kamar selama 7 hari. Isolat kapang

yang telah murni ditransfer ke agar miring PDA baru untuk dijadikan working

culture dan stock culture (Atika, 2007). Proses pemurnian ini dilakukan secara

duplo.

3.4.7 Seleksi Kapang yang Berpotensi sebagai Antibakteri dengan Metode

Agar Disk

Seleksi kapang endofit yang berpotensi sebagai antibakteri dilakukan

dengan metode difusi agar padat (Diffusion Agar Plate Method). Bakteri uji yang

digunakan yaitu Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis,

Helicobacter pylori, dan Salmonella enterica sv thypimurium. Bakteri uji dibuat

suspensinya dengan cara memasukkan 100 µL suspensi bakteri ke dalam 10 mL

media NB kemudian di shaker dengan waktu yang sesuai dengan fase log

pertumbuhan bakteri. Langkah selanjutnya, suspensi bakteri di pipet sebanyak 1

mL ke dalam media agar NA dan dicampur dengan media NA kemudian digoyang

goyang sehingga suspensi dan agar tercampur merata.

Isolat fungi endofit yang telah dimurnikan ke dalam medium PDA diambil

dengan sedotan steril atau cork borer berdiameter 6 mm dan dipindahkan ke media

NA yang berisi bakteri uji. Satu cawan petri media NA yang telah berisi bakteri uji

dapat ditanami potongan isolat murni fungi endofit ±8 isolat. Kultur di inkubasi

pada suhu ruang (27-29ºC) selama 4 hari. Aktivitas antibakteri fungi endofit dilihat

dari zona hambat yang terbentuk (Elfina et al., 2014 dengan modifikasi).

28


3.4.8 Fermentasi

Fermentasi kapang endofit dilakukan dengan menggunakan media PDY

(Potatoes Dextrose Yeast), yang bertujuan untuk memperoleh ekstrak yang

mengandung senyawa metabolit sekunder dari isolat kapang endofit. Koloni

murni kapang endofit pada cawan petri PDA yang telah diinkubasi selama 7

hari, kemudian dengan menggunakan cork borer diambil 3 potongan berukuran

1 x 1 cm. Potongan kapang tersebut kemudian diinokulasikan ke dalam media

fermentasi cair PDY sebanyak 200 mL dalam botol kaca steril berukuran 500

mL.

Kapang endofit kemudian difermentasi goyang menggunakan rotary shaker

dengan kecepatan 130 rpm, dilakukan pada suhu 37℃ selama 14 hari. Setelah itu

medium cair hasil fermentasi tersebut dimasukkan ke dalam tabung sentrifus

ukuran 15 mL yang sebelumnya telah disterilisasi terlebih dahulu, kemudian

disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan hasil

sentrifugasi diambil.Supernatan ini kemudian digunakan untuk uji aktivitas

antibakteri sebagai larutan uji (Sinaga, 2009 ; Kumala, 2006 dengan modifikasi).

3.4.9 Uji Aktivitas Antibakteri

3.4.9.1 Identifikasi Bakteri Uji

Identifikasi bakteri uji dilakukan secara makroskopik dan mikroskopik

pada bakteri uji yang berusia 18-24 jam. Identifikasi makroskopik dilakukan

dengan mengamati morfologi dan pertumbuhan koloni.

Pengamatan mikroskopik dilakukan dengan metode pewarnaan Gram.

Gelas objek dibersihkan dahulu dengan kain bersih yang sudah dibasahi dengan

etanol 70%, kemudian dilewatkan di atas api untuk menghilangkan lemak dan

biarkan dingin sebelum dipakai. Buat batas bulatan dengan pensil gelas. Buat

suspensi kuman dengan satu ose NaCl fisiologis atau akuades steril di atas gelas

objek, fiksasi dengan melewatkan gelas objek pada api bunsen. Tuangkan larutan

Karbol Kristal Ungu 0,5% pada sediaan dan biarkan selama 5 menit. Bilas dengan

air. Cairan Lugol diteteskan di atas preparat selama 45-60 detik, kemudian dicuci

dengan air. Celupkan preparat dalam bejana berisi alkohol 96% goyang-goyangkan

selama 30 detik atau hingga zat warna bersih. Preparat dicuci dengan air. Larutan

29


Safranin diteteskan di atas preparat, kemudian dibiarkan selama 1-2 menit, cuci

dengan air dan keringkan. Tetesi minyak immersi diatas sediaan, amati dengan

mikroskop (Atika, 2007).

3.4.9.2 Pembuatan Kurva tumbuh bakteri

Bakteri S.dysentriae, S.aureus, B.subtilis, S.enterica sv thypimurium, dan

H.pylori diremajakan masing-masing sebanyak dua biakan, pertama sebagai biakan

stok dan kedua sebagai biakan suspensi. Satu ose diambil dari kultur bakteri yang

akan diremajakan kemudian digoreskan ke agar miring. Biakan tersebut

ditumbuhkan pada agar miring NA selama 24 jam pada suhu 37℃.

Biakan yang telah tumbuh pada agar miring NA, ditambahkan dengan 5mL

NaCl 0,9% (w/v) steril. Sebanyak 2 mL suspensi bakteri diinokulasikan ke dalam

erlenmeyer 250 mL yang berisi 200 mL NB (Nutrient Broth), dikocok dan NB steril

tanpa suspensi bakteri sebagai kontrol. Spektrofotometer visible diatur dengan

panjang gelombang 600 nm, kuvet dibersihkan kemudian diukur absorbansi awal

NB steril sebagai kontrol dan NB yang mengandung bakteri pada menit ke-0 (t0).

Setelah absorbansi awal ditentukan, media NB diinkubasi pada pengocokan 120

rpm dengan temperature 37℃. Setiap interval 30 menit dilakukan pengukuran

absorban untuk mendapatkan kurva tumbuh. Kurva pertumbuhan diakhiri setelah

melewati fase stasioner (Utami, 2009).

3.4.9.3 Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Cakram

Suspensi bakteri 1 mL dimasukkan secara aseptis ke dalam cawan petri

steril kemudian ditambahkan media agar yang telah dibuat untuk masing-masing

bakteri uji sejumlah 10mL. Suspensi kuman yang telah diberi agar dalam cawan

petri digoyangkan perlahan untuk memperoleh suspensi kuman yang tersebar

merata pada media agar (Rachmayani, 2008).

Uji aktivitas antibakteri dilakukan secara in vitro dengan metode difusi

cakram. Larutan uji diserapkan ke dalam cakram sebanyak 20 µL. Cakram yang

sudah diresapi larutan uji diletakkan pada permukaan media uji kemudian

diinkubasi (Atika, 2007).

30


Kontrol positif yang digunakan pada uji aktivitas antibakteri yaitu cakram

kloramfenikol. Cakram diletakkan pada permukaan media uji lalu diinkubasi.

Kontrol negatif yaitu pelarut pada proses fermentasi, yaitu akuades steril. Sebanyak

20 µl larutan kontrol negatif diserapkan ke cakram steril. Cakram yang sudah

diresapi larutan kontrol negatif diletakkan pada permukaan media uji kemudian

diinkubasi (Atika, 2007).

Bakteri uji diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37,5℃. Diamati zona

hambatan yang terbentuk setelah inkubasi. Diameter zona hambat diukur dengan

jangka sorong (Atika, 2007).

3.4.10 Karakteristik Kapang Endofit yang Mempunyai Aktivitas Antibakteri

Pengamatan morfologi kapang secara makroskopik dilakukan dengan

mengamati karakteristik koloni suatu biakan, antara lain meliputi: warna dan

struktur permukaan koloni; ada atau tidaknya tetes eksudat; dan ada atau tidaknya

lingkatan kosentris. Pengamatan koloni dilakukan sejak awal penanaman hingga

beberapa waktu tertentu, dan segala macam perubahan yang terjadi harus dicatat

(Gandjar et al., 1999).

Karakteristik mikroskopik kapang endofit menggunakan metode slide

culture, yaitu kertas saring diletakkan pada dasar cawan petri steril kemudian

dibasahi dengan aquadest steril. Kaca objek dimasukkan ke dalam cawan petri

tersebut dan cover glass diletakkan disamping kaca objek, setelah itu cawan petri

tersebut ditutup. Media PDA steril diteteskan di atas kaca objek dengan

menggunakan pipet steril, kemudian bagian atasnya diinokulasikan kapang endofit.

Kaca penutup objek diletakkan di atas potongan agar, kemudian cawan petri

ditutup.

Isolat diinkubasi pada suhu 27℃ selama 7 hari. Hasil inkubasi diamati di

bawah mikroskop pada perbesaran 400 kali, kemudian difoto (Jauhari, 2010 dengan

modifikasi).

31

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk menguji aktivitas antibakteri dari metabolit

sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit. Secara garis besar terdapat tiga

tahapan dalam penelitian ini yaitu isolasi kapang endofit, fermentasi dan uji

aktivitas hasil fermentasi kapang endofit terhadap bakteri uji.

Kapang endofit diisolasi dari spesies tanaman genus Solanum yaitu

Solanum nigrum atau biasa disebut leunca. Tanaman tersebut diperoleh dari Balittro

yang terdapat di Bogor dan kemudian telah dideterminasi di Herbarium Bogoriense,

LIPI, Cibinong, Bogor (lampiran 2 halaman 72).

Pertimbangan pemilihan tanaman sampel didasarkan pada hipotesis Strobel

(2003) tentang dasar pemilihan tanaman inang kapang endofit secara rasional.

Ada tiga kriteria yang menjadi dasar pemilihan tanaman sampel secara rasional

yaitu: tanaman tersebut unik secara biologi, misalnya mengandung suatu

senyawa yang penting bagi kelangsungan hidup manusia; tanaman tersebut

memiliki ethnobotanical history, misalnya tanaman tersebut digunakan sebagai

obat-obat tradisional; dan tanaman tersebut hidup di lingkungan dengan

keragaman hayati yang tinggi.

Leunca (Solanum nigrum) memiliki efek farmakologis yang berkhasiat

sebagai obat. Solanum nigrum telah digunakan secara tradisional oleh masyarakat

sekitar untuk mengobati berbagai penyakit, contohnya penyakit demam enterik,

mengatasi rasa sakit, peradangan, dan diuretik (Chauchan et al., 2012). Selain itu

Solanum nigrum mengandung berbagai senyawa yang penting bagi kelangsungan

hidup manusia. Kandungan yang terdapat dalam Solanum nigrum adalah

glikoalkaloid, glikoprotein, polisakarida, senyawa polifenol seperti asam galat,

katekin, asam protokatekuat, asam kafeat, epikatekin, rutin, dan naringenin.

Beberapa penelitian sebelumnya tentang Solanum nigrum, memberikan hasil

bahwa leunca (Solanum nigrum) memiliki aktivitas antimikroba, antidiabetes,

aktivitas imunostimulan, efek proteksi, anti HCV, anti ulcer, antioksidan,

32


hepatoprotektif, kardioprotektif, antidiare, antikanker, antikejang, antiinflamasi,

dan aktivitas analgesik (Chauchan et al., 2012).

Tanaman sampel yang digunakan harus sesuai dengan kriteria yaitu sehat

(daun masih segar dan tidak layu) dan tidak menunjukkan gejala penyakit karena

dalam jaringan tanaman inang yang sakit biasanya didominasi oleh kapang

patogen (Atika, 2007).

Sampel yang digunakan pada proses isolasi yaitu daun dari tanaman

leunca (Solanum nigrum). Daun tersebut diambil dari berbagai bagian yang

berbeda, yaitu: daun bagian atas yang terdapat di bawah daun pucuk, daun bagian

tengah, dan daun bagian bawah dekat dengan percabangan batang. Perbedaan

bagian dalam pengambilan sampel ini bertujuan agar kapang endofit yang

dihasilkan lebih banyak dan memberikan hasil yang beraneka ragam.

Sampel selanjutnya dibersihkan dari debu, tanah, dan pengotor-pengotor

lain dengan menggunakan air bersih yang mengalir lalu permukaan daun

disterilisasi. Sterilisai permukaan merupakan proses kritis yang harus dilakukan

sebelum melakukan penanaman daun ke media agar. Proses tersebut harus

menjamin permukaan daun yang akan digunakan harus steril dan bebas dari

kontaminasi, sehingga kapang yang tumbuh pada media isolasi merupakan kapang

endofit (Strobel, 2003).

Pada penelitian ini digunakan larutan alkohol 70% dan NaOCl 5,25%

sebagai desinfektan pada proses sterilisasi permukaan. Mekanisme kerja dari

alkohol yaitu mendenaturasi protein dan melarutkan lemak pada membran protein

sehingga dapat merusak sel mikroba. Proses tersebut memerlukan air sehingga

alkohol 70% lebih baik dibandingkan alkohol absolut (Siswando, 1995 dalam

Ramadhan, 2011). NaOCl merupakan desinfektan yang biasa digunakan dalam

prosedur sterilisasi permukaan (Stone, Polishook& White, 2004). Zat kimia ini

termasuk ke dalam golongan halogen dengan mekanisme kerja mengoksidasi

gugusan sulfhidril (-SH) secara ireversibel sehingga mengganggu reaksi enzimatis

pada metabolisme mikroorganisme (Volk& Wheeler, 1988 dalam Ramadhan,

2011).

33


4.1 Isolat Kapang Endofit

Proses selanjutnya setelah sterilisasi permukaan adalah isolasi. Isolasi

dilakukan dengan cara metode direct seed planting yaitu langsung menempelkan

bagian tanaman pada media isolasi. Potongan daun pada media isolasi kemudian

diinkubasi selama 14 hari dan diamati pertumbuhannya setiap hari. Koloni kapang

yang tumbuh dapat dikatakan sebagai kapang endofit apabila memiliki ciri: waktu

tumbuh lebih dari 5 hari, tumbuh disekitar sampel daun yang ditanam dan memiliki

morfologi yang berbeda dari kapang yang tumbuh pada cawan petri kontrol

(Ramadhan, 2011).

Media isolasi yang digunakan yaitu media PDA (Potato Dextrose Agar).

Media yang digunakan untuk pemurnian kapang endofit biasanya berupa media

yang kaya akan nutrisi dan mudah dicerna oleh kapang tersebut. PDA merupakan

media umum yang digunakan untuk menumbuhkan kapang. PDA dapat digunakan

sebagai media isolasi (Kumala et al., 2006) dan media peremajaan kapang endofit

yang telah berhasil diisolasi. Pada media ini kapang akan lebih mudah tumbuh

(Ramadhan, 2011).

Setiap kapang endofit yang berhasil tumbuh pada media isolasi kemudian

dimurnikan dan diremajakan dengan menggunakan media PDA. Peremajaan

kapang endofit merupakan hal yang harus dilakukan secara teratur. Hal ini

dilakukan untuk mencegah kapang endofit berada pada fase kematian dipercepat

dimana sel-sel yang mati lebih banyak dibandingkan sel yang hidup (Gandjar et al.,

2006 dalam Ramadhan, 2011).

Berdasarkan variasi dari daun tanaman Solanum nigrum, maka diperoleh 14

isolat kapang endofit. Isolat-isolat tersebut dipilih dengan cara memilih isolat yang

bebas kontaminasi, tumbuh secara maksimal dan berbeda satu sama lainnya secara

mikroskopik. Daftar isolat dan gambar isolat kapang endofit yang dihasilkan dapat

dilihat pada tabel 4.1 (gambar 5 dan 6 halaman 55-56).

34


Tabel. 4.1. Daftar Isolat Kapang Endofit Daun Tanaman Solanum nigrum

Nama

Tanaman

Bagian Daun yang

Digunakan

Jumlah Isolat Kode Isolat

Solanum

nigrum

Daun bagian bawah

dekat dengan

pecabangan batang

7

DT 1

DT 4

DT 6

DT 8

DT 9

DT 10

DT 11

Daun bagian tengah

5

DS 1

DS 2

DS 4

DS 5

DS 7

Daun bagian atas yang

terdapat di bawah daun

pucuk

2

DM 1

DM 3

Keterangan: DT= Daun Tua; DS= Daun Sedang; DM= Daun Muda

Keempat belas isolat murni kapang endofit yang diperoleh tersebut

kemudian akan diuji seleksi kapang yang berpotensi sebagai antibakteri dengan

metode agar disk dan kapang yang menunjukkan hasil positif akan dilanjutkan ke

tahap berikutnya yaitu fermentasi.

4.2 Identifikasi Bakteri Patogen

Sebelum dilakukan skrining dan uji aktivitas bakteri, bakteri uji

diidentifikasi terlebih dahulu secara makroskopik dan mikroskopik. Sebelumnya

bakteri uji ditumbuhkan pada media NA dan diinkubasi pada suhu 37℃ selama 24

jam. Tujuan dilakukan identifikasi tersebut adalah untuk memastikan identitas dan

kemurnian bakteri patogen yang akan diuji.

35


Identifikasi bakteri secara makroskopis dilakukan dengan pengamatan

warna koloni, bentuk koloni, permukaan pinggiran koloni dan diameter dari koloni.

Sedangkan identifikasi bakteri secara mikroskopis dilakukan dengan metode

pewarnaan Gram. Metode ini digunakan untuk membedakan antara bakteri Gram

positif dan bakteri Gram negatif. Untuk bakteri Gram positif, bakteri akan berwarna

ungu sedangkan untuk bakteri Gram negatif, bakteri akan bewarna merah (Atika,

2007).

Terdapat lima bakteri uji yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini.

Bakteri-bakteri tersebut digunakan karena bersifat patogen dan dapat menyebabkan

penyakit, selain itu bakteri uji yang digunakan mewakili bakteri Gram negatif dan

Gram positif.

Dua bakteri uji yaitu Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus berwarna

ungu pada pewarnaan Gram, sehingga menunjukkan bahwa kedua bakteri tersebut

merupakan bakteri Gram positif (gambar 7 halaman 57). Sedangkan tiga bakteri uji

lainnya yaitu Helicobacter pylori, Salmonella enterica sv thypimurium, dan

Shigella dysentriae berwarna merah pada pewarnaan Gram, sehingga menunjukkan

bahwa ketiga bakteri tersebut merupakan bakteri Gram negatif (gambar 7 halaman

57).

Tabel 4.2. Hasil Identifikasi Bakteri Uji

Bakteri uji Makroskopik Mikroskopik

Staphyloccus aureus Koloni berbentuk bulat

bewarna kuning

berdiameter 0,8-1,2 mm

dan mempunyai pinggiran

koloni yang rata.

Merupakan bakteri Gram

positif dengan membentuk

warna ungu, sel berbentuk

kokus dan berkelompok

seperti buah anggur

Shigella dysentriae Koloni berbentuk titik-titik

kecil bewarna putih

berdiameter 0,6-1,7 mm

dan mempunyai pinggiran

koloni yang rata.


negatif dengan membentuk

warna merah, sel berbentuk

batang pendek membulat.

36


Lanjutan Tabel 4.2. Hasil Identifikasi Bakteri Uji

Bakteri Uji Makroskopik Mikroskopik

Bacillus subtilis Koloni berbentuk bulat

bewarna putih dengan

pinggiran koloni yang rata.

Diameter koloni 0,9-1 mm.


positif dengan membentuk

warna ungu, sel berbentuk

batang pendek

Helicobacter pylori Koloni berbentuk bulat

dengan warna putih

kekuningan. Diameter

koloni 0,8-1,3 mm.




batang agak pendek

Salmonella enterica

sv thypimurium

Koloni berbentuk titik-titik

putih bulat dengan

permukaan pinggir yang

rata. Diameter koloni 0,9-

1,0 mm.




batang.

4.3 Pembuatan Kurva Pertumbuhan

Pembuatan inokulum bakteri uji dilakukan dengan cara membuat kurva

pertumbuhan terlebih dahulu. Pertumbuhan bakteri ini dapat dilihat dari perubahan

nilai absorbansi yang didapat setelah dilakukan pengukuran pada menit yang

berbeda (Sugoro et al., 2008). Pada kurva pertumbuhan ini, menunjukkan terdapat

dua fase, yaitu fase adaptasi dan fase log (Gambar 4.1). Tujuan dari pembuatan

kurva pertumbuhan ini adalah untuk mengetahui fase logaritmik dari masing-

masing bakteri uji. Fase logaritmik ini merupakan fase yang cocok untuk pengujian

antibakteri, karena bakteri uji dalam keadaan yang aktif melakukan pembelahan sel

dengan laju yang konstan (Jauhari, 2010).

Menurut Sugoro et al. (2008), pada fase log terjadi pembelahan yang cepat

sehingga dinding selnya tipis sehingga diharapkan aktivitas dari antibakteri dapat

terjadi secara maksimal. Sel yang paling sensitif adalah sel dengan tingkat

proliferasi yang tinggi (aktif melakukan pembelahan) dan tingkat diferensiasi yang

37


rendah, sedangkan sel yang resisten atau tidak mudah rusak adalah sel dengan

tingkat diferensiasi yang tinggi dan tidak melakukan pembelahan.

Gambar 4.1 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji

Untuk melakukan uji aktivitas, masing-masing bakteri uji ditumbuhkan

sampai fase logaritmiknya. Berdasarkan hasil kurva pertumbuhan yang terbentuk

(Gambar 4.1), dapat diketahui bahwa masing masing bakteri uji memiliki waktu

fase logaritmik yang berbeda (Tabel 4.3). Fase log terjadi pada jam ke-3 sampai

jam ke-9 untuk Staphyloccus aureus, jam ke-10 sampai jam ke-15 untuk Shigella

dysentria, jam ke-13 sampai jam ke-16 untuk Bacillus subtilis, jam ke-4 sampai jam

ke-9 untuk Helicobacter pylori, dan jam ke-10 sampai ke-19 untuk Salmonella

enterica sv thypimurium.

Tabel 4.3. Hasil Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji

Bakteri uji Fase Lag (jam) Fase Log (jam)

Staphyloccus aureus 1-2 3-9

Shigella dysentriae 1-5 10-15

Bacillus subtilis 1-12 13-16

Helicobacter pylori 1-3 4-9

Salmonella enterica sv

thypimurium

1-2 10-19

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Ab

sorb

ansi

(O

D)

Waktu (jam)

S. aureus S. dysenteriae b.subtilis H. pylori s.thyposa

38


4.4 Seleksi Kapang Endofit yang berpotensi sebagai Antibakteri dengan

metode Agar disk

Langkah selanjutnya adalah seleksi kapang endofit yang berpotensi sebagai

antibakteri. Seleksi tersebut bertujuan untuk mengetahui berapa jenis isolat kapang

yang aktif sebagai antibakteri dan kemudian akan dilanjutkan ke tahap selanjutnya

yaitu fermentasi. Seleksi ini dilakukan dengan metode agar disk. Isolat fungi yang

telah dimurnikan sebelumnya diambil dengan sedotan steril atau cork borer

berdiameter 6 mm dan dipindahkan ke media NA yang berisi bakteri uji. Kultur

diinkubasi pada suhu ruang selama 2 hari. Aktivitas antibakteri kapang endofit

dapat terlihat dari zona hambat yang terbentuk (Elfina et al., 2014). Hasil seleksi

kapang yang mempunyai aktivitas antibakteri dapat dilihat pada tabel 4.4.

Tabel.4.4. Hasil seleksi kapang yang mempunyai aktivitas antibakteri (mm)

Isolat kapang

endofit

S. dysentriae S. aureus B. Subtilis H. pylori S. thypimurium

DT 1 7,5 mm 7,7 mm 8,70 mm - 7,5 mm

DT 4 - - - - -

DT 6 - - - - -

DT 8 7,5 mm 7,5 mm 7,2 mm - -

DT 9 - - - - -

DT 10 7,0 mm 8,3 mm 7,30 mm 7,3 mm -

DT 11 - - - - -

DS 1 - - - - -

DS 2 - - - - -

DS 4 9,6 mm 9,3 mm 7,90 mm 7,5 mm 7,05 mm

DS 5 - 8,3 mm - - -

DM 1 - - - - -

DM 3 - 9,0 mm 8,55 mm 7,0 mm -

Didapatkan 6 isolat kapang endofit yang mempunyai aktivitas terhadap bakteri

patogen yang akan digunakan dari hasil seleksi ini. Isolat-isolat tersebut adalah DT

1, DT 8, DT 10, DS 4, DS 5 dan DM 3.

39


Isolat DT 1

Isolat kapang DT 1 membentuk zona hambat pada empat bakteri uji. Isolat

DT 1 membentuk zona hambat pada bakteri S.dysentriae dengan diameter zona

hambat sebesar 7,5 mm; S.aureus sebesar 7,7 mm; B.subtilis sebesar 8,7 mm; dan

S.thypimurium sebesar 7,5 mm.

Isolat DT 8

Isolat kapang DT 8 membentuk zona hambat pada tiga bakteri uji. Isolat

kapang DT 8 membentuk zona hambat pada bakteri S.dysentriae dengan diameter

zona hambat sebesar 7,5 mm; S.aureus sebesar 7,5mm; dan B.subtilis sebesar 7,2

mm.

Isolat DT 10

Isolat kapang DT 10 membentuk zona hambat pada empat bakteri uji Isolat

kapang DT 10 membentuk zona hambat pada bakteri S.dysentriae dengan diameter

zona hambat sebesar 7,0 mm; S.aureus sebesar 8,3 mm; B.subtilis sebesar 7,3 mm;

dan H.pylori sebesar 7,3 mm.

Isolat DS 4

Isolat kapang DS 4 membentuk zona hambat pada kelima bakteri uji Isolat

kapang DS 4 membentuk zona hambat pada bakteri S.dysentriae dengan diameter

sebesar 9,6 mm; S.aureus sebesar 9,3 mm; B.subtilis sebesar 7,9 mm; H.pylori

sebesar 7,5 mm dan S.thypimurium sebesar 7,05 mm.

Isolat DS 5

Isolat kapang DS 5 membentuk zona hambat hanya pada satu bakteri uji.

Isolat DS 5 memberikan zona hambat hanya pada bakteri S.aureus sebesar 8,3 mm.

Isolat DM 3

Isolat kapang DM 3 membentuk zona hambat pada tiga bakteri uji Isolat

DM 3 memberikan zona hambat pada bakteri S.aureus sebesar 9,0 mm; B.subtilis

sebesar 8,55 mm; dan H.pylori sebesar 7,0 mm.

Keenam isolat kapang endofit yang mempunyai aktivitas terhadap kelima

bakteri kemudian akan diproses lebih lanjut lewat proses fermentasi. Fermentasi

dilakukan dalam botol kaca yang telah disterilisasi sebelumnya dengan

menggunakan 200mL media PDY. Media ini mengandung karbohidrat yang berasal

dari Potato Dextrose Broth dan Nitrogen yang berasal dari Yeast Extract. Kultur

40


tersebut diinkubasi pada suhu 37℃ dengan shaker inkubator 130 rpm selama 14

hari. Fungsi dari pengocokan adalah untuk meningkatkan aerasi dari kultur

fermentasi dan dispersi dari miselium (Hanson, 2008 dalam Ramadhan, 2011).

Kalsium karbonat ditambahkan ke dalam media untuk menjaga stabilitas pH dari

kultur fermentasi (Ramadhan, 2011). Penggunaan medium cair pada proses

fermentasi dikarenakan jenis dan konsentrasi komponen-komponen medium dapat

diatur sesuai dengan yang diinginkan, dapat memberikan kondisi yang optimum

untuk pertumbuhan, dan pemakaian medium lebih efektif (Ansori, 1992 dalam

Sulistyaningrum 2008). Proses fermentasi bertujuan untuk menghasilkan sel

kapang endofit dalam jumlah yang banyak sehingga senyawa metabolit yang

dihasilkan dapat optimal (Ramadhan, 2011).

Setelah 14 hari, medium cair hasil fermentasi diambil sebanyak 10 mL

dengan menggunakan pipet volumetri steril dan dimasukkan ke dalam tabung

sentrifugasi steril ukuran 15 mL. Proses sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan

3000 rpm selama 20 menit, kemudian supernatan diambil dan digunakan untuk uji

aktivitas antibakteri sebagai larutan uji.

4.5 Uji Aktivitas Antibakteri

Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi cakram. Pada

penelitian kali ini digunakan kertas cakram steril yang berdiameter 6 mm. Sebanyak

20 µl larutan uji diserap ke dalam cakram steril dan kemudian ditunggu sampai

cakram kering. Hal ini bertujuan agar larutan uji terserap semua ke dalam cakram.

Cakram yang telah kering kemudian diletakkan di atas media uji yang telah

mengandung bakteri dan diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37℃. Hasil positif

dari uji aktivitas antibakteri ditunjukkan dengan adanya zona jernih di sekitar

cakram sehingga menandakan terjadinya penghambatan pertumbuhan oleh larutan

uji.

Berdasarkan pengukuran zona hambat dari uji aktivitas antibakteri, terdapat

lima isolat kapang yang membentuk zona hambat terhadap pertumbuhan bakteri

uji. Kelima isolat kapang tersebut yaitu DT 1, DT 10, DS 4, DS 5 dan DM 3. Zona

hambat yang terbentuk pada bakteri uji dapat dilihat pada tabel 4.5.

41


Tabel 4.5. Diameter Zona Hambat yang Terbentuk pada Uji Aktivitas Antibakteri

(mm)

Isolat kapang

endofit

S. dysentriae S. aureus B. Subtilis H. pylori S. thypimurium

DT 1 7,8 mm - 7,3 mm 7,9 mm -

DT8 - - - - -

DT 10 8,85 mm 7,6 mm 8,8 mm 8,8 mm -

DS 4 - - 8,2 mm -

DS 5 - - - 8,3 mm -

DM 3 7,8 mm 7,45 mm 7,45 mm 7,6 mm -

Isolat DT 1

Supernatan dari isolat DT 1 menunjukkan aktivitas terhadap tiga bakteri uji

yaitu S.dysentriae , B.subtilis, dan H.pylori. Aktivitas paling baik dari isolat ini

ditunjukkan terhadap bakteri uji H.pylori dengan membentuk zona hambat sebesar

7,9 mm.

Isolat DT 8

Supernatan dari isolat DT 8 tidak menunjukkan aktivitas terhadap kelima

bakteri uji. Hal ini berbeda dengan hasil seleksi kapang dengan metode agar disk

yaitu isolat DT 8 menunjukkan aktivitas terhadap tiga bakteri uji (S.dysentriae,

S.aureus dan B.subtilis). Terdapat beberapa faktor yang menyebabkan hasil uji

aktivitas menjadi negatif, yaitu: kondisi yang kurang mendukung sehingga proses

fermentasi kurang optimal dan metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang

endofit tidak larut dalam pelarut yang digunakan untuk fermentasi.

Isolat DT 10

Supernatan dari isolat DT 10 menunjukkan aktivitas terhadap empat bakteri

uji yaitu S.dysentriae, B.subtilis, S.aureus dan H.pylori. Aktivitas paling baik dari

isolat ini ditunjukkan terhadap bakteri uji S.dysentriae dengan membentuk zona

hambat sebesar 8,85 mm.

Isolat DS 4

Supernatan dari isolat DS 4 hanya menunjukkan aktivitas terhadap satu

bakteri uji yaitu H.pylori dengan diameter zona hambat sebesar 8,2 mm. Pada uji

seleksi sebelumnya, isolat DS 4 aktif terhadap kelima bakteri uji. Perbedaan hasil

42


pada seleksi kapang dengan metode agar disk dan pada uji aktivitas antibakteri

dikarenakan proses fermentasi yang kurang optimal sehingga senyawa metabolit

sekunder yang dihasilkan kurang maksimal.

Isolat DS 5

Supernatan dari isolat DS 5 menunjukkan aktivitas terhadap satu bakteri uji

yaitu H.pylori dengan diameter zona hambat sebesar 8,3 mm.

Isolat DM 3

Supernatan dari isolat DM 3 menunjukkan aktivitas terhadap empat bakteri

uji yaitu S.dysentriae, B.subtilis, S.aureus dan H.pylori. Aktivitas paling baik dari

isolat ini ditunjukkan terhadap bakteri uji S.dysentriae dengan membentuk zona


Menurut penelitian Matashoh et al. (2014), senyawa metabolit sekunder

yang terdapat pada tanaman Solanum nigrum adalah saponin, tanin, flavanoid,

steroid, terpenoid, dan alkaloid. Senyawa metabolit sekunder yang berperan dalam

aktivitas antibakteri adalah senyawa tanin, saponin, alkaloid, dan flavanoid.

Senyawa tanin bekerja dengan cara mengikat protein sehingga

pembentukan dinding sel bakteri terhambat. Senyawa saponin menyebabkan

penurunan tegangan permukaan sel dan menyebabkan sel lisis. Senyawa alkaloid

memiliki efek antibakteri dengan cara membantu sel-sel darah putih untuk

mengeleminasi mikroorganisme berbahaya, (Jeffery dan Harbone, 2000 dalam

Matashoh et al., 2014). Flavonoid memiliki aktivitas antibakteri dengan cara

mengikat asam amino nukleofilik pada protein dan dinding sel bakteri yang

menyebabkan kerusakan struktur protein dan inaktivasi enzim (Matashoh et al.,

2014).

4.6 Karakteristik Kapang Endofit yang Memiliki Aktivitas Antibakteri

Isolat kapang endofit yang mempunyai aktivitas terhadap bakteri uji

kemudian dikarakterisasi secara makroskopik dan mikroskopik. Pengamatan

morfologi kapang secara makroskopik dilakukan dengan mengamati karakteristik

koloni suatu biakan, antara lain meliputi: warna dan struktur permukaan koloni; ada

atau tidaknya tetes eksudat; dan ada atau tidaknya lingkatan kosentris. Pengamatan

43


secara mikroskopik dilakukan dengan metode slide culture dan kapang endofit

diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x.

Hasil karakteristik isolat kapang endofit yang memiliki aktivitas antibakteri

dapat dilihat pada tabel 4.6.

Tabel 4.6. Hasil Karakterisasi Kapang Endofit yang Memiliki Aktivitas Antibakteri

Isolat Kapang

Endofit

Makroskopik Mikroskopik

DT 1 Memiliki diameter 8 cm

Miselium berwarna coklat

dan putih agak kekuningan

menyerupai serat

Permukaan kapang rata,

koloni berbentuk bulat

mempunyai lingkaran

konsentris

Sebalik koloni kapang

berwarna hitam kecoklatan

(gambar 23 hal 66)

Hifa bercabang cabang

dan bersekat (gambar 24

hal 66)

DT 10 Diameter kapang pada 7,5

cm

Miselium bewarna putih

seperti kapas

Pada permukaan koloni

tampak garis garis kosentris

yang bewarna abu-abu.

Di bagian tengah, kapang

bewarna abu abu.

Hifa bercabang dan

bersekat (Gambar 26 hal

67)

44


Lanjutan Tabel 4.6. Hasil Karakterisasi Kapang Endofit yang Memiliki Aktivitas

Antibakteri

Isolat Kapang

Endofit


DT 10 Permukaan kapang tidak

rata dengan koloni

berbentuk bulat

Sebalik koloni kapang

bewarna putih kecoklatan.

(Gambar 25 hal 67)

DS 4 Diameter kapang mencapai

2,9 cm.

Miselium berwarna hijau tua

kekuningan.

Permukaan kapang

bergelombang dan koloni

berbentuk elips

Sebalik koloni bewarna

hijau kekuningan.

(Gambar 27 hal 68)

Hifa bersekat dan

bercabang (Gambar 28

hal 68).

DS 5 Diameter kapang mencapai

4,9 cm.

Miselium berwarna abu abu

dan pinggiran koloni

bewarna putih

Mempunyai garis-garis

konsentris.

Permukaan kapang rata dan


Hifa bersekat dan

bercabang (Gambar 30

hal 69).

45


Lanjutan Tabel 4.6. Hasil Karakterisasi Kapang Endofit yang Memiliki Aktivitas

Antibakteri

Isolat Kapang

Endofit


DS 5 Sebalik koloni bewarna

coklat muda dan coklat tua

kehitaman.

(Gambar 29 hal 69)

DM 3 Miselium berwarna abu-abu

dan pinggiran koloni

bewarna putih.

Bagian tengah kapang,

kapang berwarna

kecoklatan.

Diameter kapang mencapai

6,35 cm.

Permukaan kapang rata dan


Sebalik koloni bewarna

putih kecoklatan dan terlihat

garis-garis kosentris yang

berwarna coklat.

(Gambar 31 hal 70)

Hifa bersekat dan

bercabang.

Pada bagian ujung hifa,

terdapat cabang yang

banyak dan berbentuk

seperti kipas (Gambar 32

hal 70)

46

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Telah berhasil diisolasi 14 isolat kapang endofit dari daun tanaman leunca

(Solanum nigrum).

2. Isolat DT 1 aktif terhadap bakteri S.dysentriae dengan diameter zona

hambat sebesar 7,8 mm; S.aureus sebesar 7,6 mm; dan H.pylori sebesar 7,9

mm

3. Isolat DT 10 aktif terhadap bakteri S.dysentriae dengan diameter zona

hambat sebesar 8,85 mm; S.aureus sebesar 7,6 mm; B.subtilis sebesar 8,8

mm; dan H.pylori sebesar 8,8 mm.

4. Isolat DS 4 aktif terhadap bakteri H.pylori dengan diameter zona hambat

sebesar 8,2 mm.

5. Isolat DS 5 aktif terhadap bakteri H.pylori dengan diameter zona hambat

sebesar 8,3 mm.

6. Isolat DM 3 aktif terhadap bakteri S.dysentriae dengan diameter zona

hambat sebesar 7,8 mm; S.aureus sebesar 7,45 mm; B.subtilis sebesar 7,45

mm; dan H.pylori sebesar 7,6 mm.

7. Aktivitas antibakteri paling tinggi ditunjukkan oleh supernatan kapang DT

10 yang diisolasi dari daun tanaman Solanum nigrum bagian bawah dekat

percabangan batang.

8. Supernatan fermentasi yang dihasilkan dari 6 isolat kapang endofit tidak

menunjukkan aktivitas penghambatan pertumbuhan pada Salmonella

enterica sv thypimurium.

47


5.2 Saran

1. Perlu dilakukan pembuatan kurva pertumbuhan kapang endofit.

2. Perlu dilanjutkan proses ekstraksi dari suspensi kapang endofit hasil

fermentasi agar diperoleh metabolit sekunder yang berpotensi sebagai

antibakteri.

3. Perlu dilakukan proses optimasi kondisi fermentasi.

4. Identifikasi molekuler terhadap kapang endofit yang berpotensi sebagai

antibakteri.

48

DAFTAR PUSTAKA

Ali NS, Singh K, Khan MI, Rani S. Protective effect of ethanolic extracts of

Solanum nigrum on the blood sugar of albino rats. IJPSR. 1(9): 2010; 97-99.

Atika, Dian. 2007. Uji Aktivitas Antimikroba Hasil Fermentasi Kapang Endofit

yang Diisolasi dari Akar, Batang, Daun Tanaman Garcinia fruticosa Lauterb

dan Garcinia latriflora Blume serta Akar dan Daun Tanaman Garcinia cowa

Roxb. Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas

Indonesia: Depok

Bryan, AH, Bryan CA, Bryan CG. 1963. Bacteriology Principle and Practice. New

York: Barnes&Noble: 189-191, 238-247.

Castillo UF., GA. Strobel, EJ. Ford, WM Hess, H. Poter, JB. Jenson, H. Albert, R.

Robinson, MA. Condron, DB. Teplow, D. Stevens and D. Yaver. 2002.

Munumbicins, wide spectrum antibiotics produced by Streptomyces NRRL

30562, endophytic on Kennedia nigriscans. Microbiology 148:2675-2685.

Castillo UJ., K. Harper, GA. Strobel., J. Sears, K. Alesi, E.Ford, J. Lin, M. Hunter,

M. Maranta, H. Ge. D. Yaver, JB. Jensen, H. Porter, R. Robinson, D. Millar,

WM. Hess, M. Condron, and D. Teplow. 2003. Kakandumycins, novel

antibiotics from Streptomyces sp. NRRL 30566, an endophyte of Grevillea

pteridifolia. FEMS Lett. 24: 183-190.

Chauhan, Rajani, Km.Ruby, Aastha Shori, Jaya Dwivedi. 2012. Solanum nigrum

with Dinamic Therapeutic Role : A Review. International Journal of

Pharmaceutical Sciences Review and Research. 15 (1). 65-71.

Darmawati, Sri dan Sri Sinto Dewi. 2008. Efek Ekstrak Buah Pare (Momordica

charantia L) terhadap Zona Hambat Pertumbuhan Salmonella typhi

Penyebab Salmonellosis. Universitas Muhammadiyah Semarang. Vol. 1 No.1

Dwidjoseputro.1990. Dasar- Dasar Mikrobiologi. Cetakan XI. Jakarta : Penerbit

Djambatan. Hal. 134.

Elfina, D., Atria, M., Rodensia,MR. 2010. Isolasi dan Karakterisasi Fungi Endofit

dari Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) sebagai Antimikroba

Terhadap Candida albicans, Staphyloccuc aureus, dan Eschericia coli.

Pekanbaru: Jurusan Biologi FMIPA-UR,p.1-4

49


Fatiqin, Awalul. 2009. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Endofit dari Daun dan Kulit

Pulai (Alstonia scholaris) sebagai Penghasil Senyawa Antibakteri Terhadap

Bakteri Eschericha coli dan Staphylococcus aureus. Skripsi. Fakultas Sains

dan Tekhnologi. Universitas Islam Negeri: Malang

Gandjar, I., W. Syamsuridzal dan A. Octari. 2006. Mikologi dasar dan terapan.

Jakarta: Yayasan Obor Indonesia

Harrison L., C.Teplow., M. Rinaldi., and GA Strobel. 1991. Pseudomycins, a family

of novel peptides from Pseudomonas Syringae, possessing broad spectrum

antifungal activity. J.Gen.Microbiol .137 : 2857-2865

http://bioweb.uwlax.edu/bio203/s2008/pluym_evan/classification.htm.Diakses

tanggal 17 Juni 2015

Izza, Iffa. 2011. Isolasi, Karakterisasi dan Identifikasi Bakteri Endofit dari

Tanaman Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa) yang Berpotensi Sebagai

Penghasil Antimikrobia. Skripsi. Fakultas Sains dan Tekhnologi. Universitas

Islam Negeri Sunan Kalijaga: Yogyakarta

Jain R, Sharma A, Gupta S, Sarethy IP, Gabrani R, Solanum nigrum: Current

Perspectives on Therapeutic Properties. Alternative Medicine Review, LLC.

16 (1):2011, 78-85.

Jauhari, Lendra Tantowi. 2010. Seleksi dan Identifikasi Kapang Endofit Penghasil

Antimikroba Penghambat Pertumbuhan Mikroba Patogen. Skripsi. Fakultas

Sains dan Tekhnologi. Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah: Jakarta

Jawetz, E., J.L. Melnick., E.A. Adelberg., G.F. Brooks., J.S. Butel., dan L.N.

Ornston. 1995. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi ke -20 (Alih bahasa :

Nugroho & R.F.Maulany). Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC.

Jawetz, Melanick, &Adelberlg’s. 2002. Medical microbiology. International

Edition. Twenty Second Edition. Mc Graw Hill: 180, 197-198, 217-219,229-

230

Jawetz. 2001. Mikrobiologi Kedokteran. Salemba Medika. Jakarta.

Jawetz; Melnick; dan Adelberg’s. 2005. Mikrobiologi Kedokteran. Salemba

Medika. Jakarta

Kaitu, Sidharta, dan Atmojo. 2013. Aktivitas Antibakteri Fungi Endofit Jahe Merah

(Zingeber officinale var.rubrum) Terhadap Escherichia coli dan

http://bioweb.uwlax.edu/bio203/s2008/pluym_evan/classification.htm

50


Streptococcus pyogenes. Skripsi. Fakultas Teknobiologi. Universitas

Atmajaya:Yogyakarta

Kumala Shirly, Erlita Agustina dan Priyo Wahyudi. 2006. Uji Aktivitas

Antimikroba Metabolit Sekunder Kapang Endofit Tanaman Trengguli

(Cassia fistula L). Jurnal Farmasi Indonesia. 3(2): 97-102

Kusuma, Sri Agung Fitri M.Si.,Apt. 2009. Staphylococcus aureus. Makalah.

Fakultas Farmasi. Universitas Padjajaran. Bandung

Lay, B. W. dan Hasto wo, S. (1992). Mikrobiologi . Bogor: Penerbit IPB . Hal 98

- 101, 293, 302.

Li J, Li Q, Feng T. Antitumour activity of crude polysaccharides isolated from

Solanum nigrum on U-14 cervical carcinoma bearing mice. Phytother Res.

2007; 8-5.

Madigan, M.T., Martinko, J.M., dan Parker, J. 2003. Biology of microorganisms.

Tenth Edition. Prentice Hall, USA : 707-726, 815-818, appendix 2 A-5 – A-

13

Matasyoh, Lexa G et al. 2014. Antimicrobial Assay and Phyto-chemical Analysis

of Solanum Nigrum Complex Growing in Kenya. African Journal of

Microbiology Research. Vol.8(50)

McNeil, B. and Harvey, L.M. 2008. Practical Fermentation Technology, 42, 70-

90, 100-101, John Wiley & Son Ltd., England.

Miller,RV.,CM.Miller, D. Garton-Kinney, B. Redgrave, J. Sears, M. Condron, D.

Teplow, and GA. Strobel. 1998. Ecomycins, unique antimycotics from

Pseudomonas viridflava. J. Appl. Microbiol. 84:937-944.

Muto M, Mulabagal V, Huang HC, Takahashi H, Tsay HS. Huang JW. Japan

toxicity of black nightshade (Solanum nigrum) extracts on Alternaria

brassicicola, causal agent of black leaf spot of Chinese cabbage (Brassica

pekinensis) .Department of International Agricultural Development. Tokyo

University of Agriculture, Sakuragaoka, Setagaya-ku, Tokyo.

Neu, C. H. 1992. The crisis in antibiotic resistence. Science.257:1064-1073

Pelczar, Michel J. Jr dan E.C.S. Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi cetakan

kesatu. Penerjemah: Ratna Sri H, dkk. Jakarta: UI Press.

Pratiwi, S.T., 2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga, Jakarta.

51


Prima I, Raditya. 2012. CRC Farmasi UGM-Leunca (Solanum nigrum L.)

http://www.ccrc.farmasi.ugm.ac.id/?page_id=2339, diakses tanggal

16/06/2015 pukul 8.05.

Purwanto. 2011. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Penghambat Polimerisasi HEM

dari Fungi Endofit Tanaman Artemisia annuna L. Tesis. Fakultas Farmasi.

Universitas Gadjah Mada: Yogyakarta

Radji, Maksum. 2005. Peranan Biotekhnologi dan Mikroba Endofit dalam

Pengembangan Obat Herbal. Majalah Ilmu Kefarmasian. Vol II no 3:113-126

Rahman, Ansori. 1992. Teknologi Ferm entasi. Jakarta: Penerbit Arcan; 1-3, 149-

182

Ramadhan, M. Gama. 2011. Skrining dan Uji Aktivitas Penghambatan 𝛼-

Glukosidase dari Kapang Endofit Daun Johar (Casia siamea Lamk.). Skripsi.

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Indonesia:

Depok

Rante, Herlina., Burhanuddin T, dan Soendaria Intan. 2013. Isolasi Fungi Endofit

Penghasil Senyawa Antimikroba dari Daun Cabai Katokkon (Capsicum

annuum L var.chinensis) dan Profil KLT Bioautografi. Majalah Farmasi dan

Farmakologi. Vol 17 no 2. (39-46)

Ryan, K.J., J.J. Champoux, S. Falkow, J.J. Plonde, W.L. Drew, F.C. Neidhardt, and

C.G. Roy. 1994. Medical Microbiology An Introduction to Infectious

Diseases. 3rd ed. Connecticut: Appleton&Lange. p.254.

Silaban, Lowysa Wanti. 2009. Skrining Fitokimia Dan Uji Aktivitas Antibakteri

Dari Kulit Buah Sentul ( Sandoricum Koetjape (Burm. f.) Merr) Terhadap

Beberapa Bakteri Secara In Vitro. Skripsi. Fakultas Farmasi. Universitas

Sumatera Utara: Medan

Sinaga, Ernawati., Noverita, dan Dinah Fitria. 2003. Daya Antibakteri Jamur

Endofit yang Diisolasi dari Rimpang Lengkuas (Alpinia galanga Sw.).

Fakultas Biologi. Universitas Nasional: Jakarta

Sinamarta, Rumella., Sylvia L, dan Harmastini S. 2007. Isolasi Mikroba Endofilitik

dari Tanaman Obat Sambung Nyawa (Gynura procumbens) dan Analisis

Potensinya sebagai Antimikroba. Berk. Penel. Hayati: 13 (85-90)

52


Siswandono, Soekardjo B. Kimia Medisinal. Surabaya: Airlangga University Press.

1995: 270, 351-406.

Smith, J.E. 1990. Prinsip Bioteknologi. Penerjemah: Sumo U.F. Jakarta:

Gramdium; 1-3.

Sridhar TM, Josthna P, Naidu CV. 2011. In vitro antibacterial activity and

phytochemical analysis of Solanum nigrum (Linn.) - An important antiulcer

medicinal plant. Journal of Experimental Sciences. 2(8); 24-29

Stone, J.K., J.D. Polishool dan J.F White Jr. (2004). Endophytic fungi in M.S.

Foster, G.F Bills dan G.M Mueller (Ed). Biodiversity of fungi: Inventory and

monitoring method (hlm 241-270). Burlinton: Elsevier Academic Press

Strobel G, Bryn Daisy. 2003. Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their

Natural Product. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67:491-502.

Strobel GA., RV. Miller, C. Miller, M. Condron, DB. Teplow, and WM. Hess.

1999. Cryptocandin, a potent antimycotic from endophytic fungus

Cryptosporiopsis quercina. Microbiology 145: 1919-1926.

Subashini, Rajakannu et al. 2013. Comparative Evaluation of Antimicrobial

Activity of Selected Three Herbal Plants Extract with Digital Image

Processing Technique. Department of Biomedical Engineering, SSN Collefe

of Engineering. ((2):14-26

Sugoro, Y.I, Windusari, dan D. Tetriana. 2008. Dosis Inaktif dan Kadar Protein

Klebsiella pneumonia K5 Hasil Iradiasi Gamma. Jurnal Ilmiah Aplikasi

Isotop dan Radiasi. Vol.4, No.1

Syahruchrahman, A et al. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta : Fakultas

Kedokteran Universitas Indonesia. 1993: 103-180.

Tan RX, Zou WX. 2001. Endophytes: a rich source of functional metabolites. Nat

Prod Rep;18: 4483459.

Tehuteru, Edi Setiawan. 2009. Penatalaksanaan infeksi Helicobacter pylori pada

anak. Jurnal Kedokteran Trisakti vol. 23 no. 3

Utami, Syarifah. 2009. Aktivitas Antibakteri Distilat Rimpang Lengkuas Merah

(Alphinia purpurea) dan Ekstrak Daun Mengkudu (Marinda citrifolia L).

Skripsi. Fakultas Sains dan Tekhnologi. Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah: Jakarta

53


Volk, W.A dan Wheeler M.F. 1988. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Penerbit

Erlangga

Wahyudi, P. 1997. Mikroba Endofitik Penghasil Materi yang bermanfaat. Sub

Direktorat Biotekhnologi Direktorat Pengkajian Ilmu Kehidupan Deputi

Bidang Pengkajian Ilmu Dasar dan Imu Terapan BPP Tekhnolog: 1-9

Walker, J.M. & Gingold, E.B. 1993. Molecular Biology and Biotechnology third

edition. Cambridge: The Royal Society of Chemistry; 1

Warsa, U.C. 1994. Staphylococcus dalam Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran.

Edisi Revisi. Jakarta : Penerbit Binarupa Aksara. hal. 103-110

Yulia, Prima Roza. 2005. Isolasi dan Seleksi Kapang Endofit Penghasil

Antimikroba pada Berbagai Tanaman Obat Tradisional Indonesia. Skripsi.

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Indonesia:

Depok

54


Gambar.1. Tanaman Solanum nigrum

Gambar.2. Contoh Kultur Kapang Endofit Majemuk daun DS (Daun Sedang)

Gambar.3. Contoh Kultur Kapang Endofit Majemuk daun DM (Daun Muda)

55


Gambar.4. Contoh Kultur Kapang Endofit Majemuk daun DT (Daun DT)

DT 1

DT 4

DT 6

DT 8

DT 9

DT 10

Gambar 5. Hasil Isolat Kapang Endofit Daun Tanaman Leunca (Solanum nigrum)

56


DT 11

DS 1

DS 2

DS 4

DS 5

DS 7

DM 1

DM 3

Gambar 6. Hasil Isolat Kapang Endofit Daun Tanaman Leunca (Solanum nigrum)

57


Staphylococcus aureus menggunakan

pewarnaan Gram dengan perbesaran

100x

Shigella dysentriae menggunakan


100x

Bacillus subtilis menggunakan


100x

Salmonella enterica sv thypimurium

menggunakan pewarnaan Gram

dengan perbesaran 100x

Helicobacter pylori menggunakan


100x

Gambar.7.Pengamatan Mikroskopik Bakteri Uji

58


DS 4

DT 10

DT 1

Keterangan:

DT 1 : membentuk diameter zona

hambat sebesar 7,5 mm



DS 4 : membentuk diameter zona


Gambar.8. Hasil Seleksi Isolat Kapang Endofit terhadap S.dysentria

DT 1

DT 8

DT 10

DS 4 DS 5

DM 3

Keterangan:







DS 4 : membentuk diameter zona


DM 3 : membentuk diameter zona


Gambar.9. Hasil Seleksi Isolat Kapang Endofit terhadap S.aureus

59


DT 1

DT 8

DT 10

DS 4

DM 3

Gambar.10. Hasil Seleksi Isolat Kapang Endofit terhadap B.subtilis

Keterangan:

DT 1 : membentuk diameter zona hambat sebesar 8,7 mm



DS 4 : membentuk diameter zona hambat sebesar 7,9 mm

DM 3 : membentuk diameter zona hambat sebesar 8,55 mm

60


DT 10

DS 4

DM 3

Gambar.11. Hasil Seleksi Isolat Kapang Endofit terhadap H.pylori

Keterangan:



DM 3 : membentuk diameter zona hambat sebesar 7,0 mm

DT 1

DS 4

Gambar.12. Hasil Seleksi Isolat Kapang Endofit terhadap S. thypimurium

Keterangan:



61


Keterangan:

DT 1 : membentuk diameter

zona hambat sebesar 7,8 mm



DM 3 : membentuk diameter


Kloramfenikol : membentuk

zona hambat sebesar 19,9 mm.

Gambar.13. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Supernatan Isolat Kapang Endofit

DT1, DT 10 dan DM 3 Terhadap S.dysentriae

Keterangan:

DT 8 : Tidak memberikan zona

hambat

DS 4 : Tidak memberikan zona

hambat


hambat

Kloramfenikol : membentuk

zona hambat 19,00 mm.

Gambar.14. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Supernatan Isolat Kapang Endofit DT

8, DS 4, dan DS 5 Terhadap S.dysentriae.

62


Keterangan:

DT 1 : tidak memberikan zona

hambat





Kloramfenikol : membentuk zona

hambat 17,00 mm


DT1, DT 10 dan DM 3 Terhadap S.aureus

Keterangan:


hambat


hambat


hambat


hambat 18,00 mm.


8, DS 4, dan DS 5 Terhadap S.aureus

63


Keterangan:








hambat 17,60 mm.


DT1, DT 10 dan DM 3 Terhadap B.subtilis

Keterangan:


hambat


hambat


hambat


hambat 18,40 mm.


8, DS 4, dan DS 5 Terhadap B.subtilis

64


Keterangan:





DM 3 : membentuk diameter



hambat 17,50 mm.


1, DT 10 dan DM 3 Terhadap H.pylori

Keterangan:


hambat

DS 4 : membentuk diameter


DS 5 : membentuk diameter



hambat 17,10 mm.


8, DS 4, dan DS 5 Terhadap H.pylori

65


Keterangan:


hambat


hambat


hambat


hambat 20,80 mm.


DT1, DT 10 dan DM 3 Terhadap S.enterica sv thypimurium

Keterangan:


hambat


hambat


hambat


hambat 20,30 mm.


8, DS 4, dan DS 5 Terhadap S.enterica sv thypimurium.

66


Permukaan Koloni

Sebalik Koloni

Gambar.23. Pengamatan Makroskopik Isolat DT1 yang Diisolasi dari

Daun Tanaman Solanum nigrum

Gambar.24. Pengamatan Mikroskopik Isolat DT1 yang Diisolasi dari Daun Tanaman

Solanum nigrum

67


Permukaan Koloni

Sebalik Koloni

Gambar.25. Pengamatan Makroskopik Isolat DT10 yang Diisolasi dari


Gambar.26. Pengamatan Mikroskopik Isolat DT10 yang Diisolasi dari Daun

Tanaman Solanum nigrum

68


Permukaan Koloni

Sebalik Koloni

Gambar.27. Pengamatan Makroskopik Isolat DS4 yang Diisolasi dari Daun


Gambar.28. Pengamatan Mikroskopik Isolat DS 4 yang Diisolasi dari Daun


69


Permukaan Koloni

Sebalik Koloni

Gambar 29. Pengamatan Makroskopik Isolat DS5 yang Diisolasi dari


Gambar.30. Pengamatan Mikroskopik Isolat DS 5 yang Diisolasi dariDaun


70


Permukaan Koloni

Sebalik Koloni

Gambar.31 .Pengamatan Makroskopik Isolat DM 3 yang Diisolasi dari Daun


Gambar.32.Pengamatan Mikroskopik Isolat DM 3 yang Diisolasi dari Daun


71


LAMPIRAN I

Bagan Tahapan Penelitian

Sampel tanaman

Sterilisasi permukaan

Isolasi kapang endofit

Pemurnian dan peremajaan isolat

Skrining kapang yang berpotensi sebagai antibakteri

Fermentasi kapang endofit

Uji aktivitas Antibakteri

72


Lampiran II

Surat Hasil Determinasi Tanaman Leunca (Solanum nigrum)

73


Lampiran III

Bagan Tahapan Isolasi Kapang Endofit

Sampling Tanaman

Cuci bersih dengan air mengalir

Sterilisasi Permukaan

Sampel

Alkohol 70% NaOCl 5,25% Alkohol 70%

Potong daun dengan ukuran 1x1 cm

Tanam pada medium PDA, inkubasi 14 hari

Pemurnian

Peremajaan

74


Lampiran IV

Tahapan Pemurnian

Kapang endofit yang

tumbuh pada medium

isolasi

Isolat kapang yang telah

murni

working culture dan

stock culture

Sedikit hifa kapang

dipindahkan Dipindakan ke agar

miring PDA duplo

75


Lampiran V

Tahapan Identifikasi Bakteri Uji

Preparat dibersihkan

dengan etanol 70%

Dilewatkan pada api bunsen Preparat ditetesi dengan

NaCl 0,9% steril

Preparat kering Preparat difiksasi pada api

bunsen

Diletakkan satu ose bakteri

pada preparat dan diratakan

dengan ose

Diteteskan larutan

karbol kristal

ungu 0,5%

Diteteskan cairan

lugol

Preparat dicuci

dengan alkohol

96%

Diteteskan safranin

Preparat diamati dengan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 10x100

76


Lampiran VI

Tahapan Pembuatan Kurva Pertumbuhan Bakteri

Biakan bakteri yang

berumur 24 jam + NaCl

0,9 % 5 mL

2 mL suspensi bakteri

dimasukkan ke dalam

200 mL nutrient broth

Diambil 3 mL (pada

menit ke 0 dan tiap 30

menit)

Diukur dengan menggunakan

spektrofotometri dengan panjang

gelombang 600 nm

media NB diinkubasi pada

pengocokan 120 rpm dengan

temperature 37℃

77


Lampiran VII

Tahapan Seleksi Kapang yang Berpotensi sebagai Antibakteri dengan

Metode Agar Disk

Pembuatan suspensi bakteri

Bakteri uji yang telah

berumur 24 jam,

ditambahkan dengan 5

mL NaCl 0,9% steril

Diambil 100𝜇𝐿 suspensi

bakteri dan dimasukkan ke

dalam 10 mL Nutrient broth

Diinkubasi pada shaker

inkubator sesuai

dengan waktu yang

ditentukan

Seleksi isolat kapang endofit yang bersifat Antibakteri

1 mL suspensi

bakteri

10 mL

media agar

Cawan digoyang perlahan agar

suspensi tersebar merata

Cawan petri yang sudah berisi medium

dan suspensi bakteri, ditanamkan isolat-

isolat kapang endofit

Diinkubasi

selama 24 jam

pada suhu 37℃

dan diamati

zona

hambatnya

78


Lampiran VIII

Bagan Cara Kerja Fermentasi

Sentrifuge 3000 rpm, 20 menit

Diambil supernatannya dan dijadikan larutan uji

Kultur murni kapang endofit

Fermentasi pada Medium PDY

Shaker 130 rpm selama 14 hari pada suhu 37℃

Suspensi koloni diambil 10 mL dan diletakkan pada

tabung sentrifugasi ukuran 15mL

Uji aktivitas antibakteri

79


Lampiran IX

Tahapan Uji Aktivitas Antibakteri

Pembuatan suspensi bakteri

Bakteri uji yang telah

berumur 24 jam,

ditambahkan dengan 5

mL NaCl 0,9% steril

Diambil 100𝜇𝐿 suspensi

bakteri dan dimasukkan ke

dalam 10 mL Nutrient broth

Diletakkan pada shaker

inkubator sesuai

dengan waktu yang

ditentukan

Uji aktivitas antibakteri

1 mL suspensi

bakteri

10 mL media

agar

Cawan digoyang

perlahan agar suspensi

tersebar merata

80


Cawan petri yang sudah berisi medium dan suspensi bakteri, ditanamkan

cakram-cakram yang sebelumnya telah diteteskan supernatan dari isolat

kapang endofit dengan konsentrasi 20𝜇𝐿/ cakram.

Isolat III

Isolat II

Isolat I

Kontrol +

(kloramfenikol)

Kontrol

Kontrol –

(akuades)

Diinkubasi pada suhu 37℃

selama 24 jam dan diukur

zona hambatnya

81


Lampiran X

Tahapan Karakteristik Kapang Endofit yang Mempunyai Aktivitas

Antibakteri

Bersihkan

dengan alkohol

70%

Tambahkan setetes

medium agar

Ambil sedikit

miselium

diinkubasi

selama 7 hari

pada suhu

kamar

Teteskan dengan

larutan metilen

blue

Preparat diamati dengan

menggunakan mikroskop dengan

perbesaran 10x100

Tutup dengan

cover glass

Letakkan pada

preparat

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA ISOLASI DAN UJI...

Documents

Transcript of UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA ISOLASI DAN UJI...