BAB IPENDAHULUAN

Obat herbal telah diterima secara luas di hampir seluruh Negara di dunia. Menurut WHO, negara- negara di Afrika, Asia dan Amerika Latin menggunakan obat herbal sebagai pelengkap pengobatan primer yang mereka terima. Bahkan di Afrika, sebanyak 80% dari populasi menggunakan obat herbal untuk pengobatan primer (WHO, 2003). Faktor pendorong terjadinya peningkatan penggunaan obat herbal di negara maju adalah usia harapan hidup yang lebih panjang pada saat prevalensi penyakit kronik meningkat, adanya kegagalan penggunaan obat modern untuk penyakit tertentu di antaranya kanker serta semakin luas akses informasi mengenai obat herbal di seluruh dunia (Sukandar E Y, 2006).WHO merekomendasi peng- gunaan obat tradisional termasuk herbal dalam pemeliharaan kesehatan masyarakat, pencegahan dan pengobatan penyakit, terutama untuk penyakit kronis, penyakit degeneratif dan kanker. WHO juga mendukung upaya-upaya dalam peningkatan keamanan dan khasiat dari obat tradisional (WHO, 2003). Penggunaan obat tradisional secara umum dinilai lebih aman dari pada penggunaan obat modern. Hal ini disebabkan karena obat tradisional memiliki efek samping yang relatif lebih sedikit dari pada obat modern.Seiring berkembangnya zaman, peneliti mulai tertarik untuk mengetahui senyawa aktif dari herbal yang berkhasiat untuk kesehatan. Salah satu obat herbal yang digunakan adalah solal kapsul -sitosterol yang mengandung -sitosterol sebagai komponen utama. -sitosterol dikenal dapat mengontrol kadar kolesterol, mengurangi aktivitas sel sanker, meningkatkan kesehatan kelenjar prostat dan meningkatkan kekebalan tubuh manusia. -sitosterol juga dapat ditemukan dalam minyak nabati, seperti minyak gandum, minyak biji kapas, minyak kacang, minyak kacang kedelai dan lain sebagainya.Mengingat akan kayanya manfaat -sitosterol, banyak teknik analisis yang telah digunakan, diantaranya: KLT, GC, GC-MS untuk menganalisis -sitosterol yang terkandung pada suatu tanaman. Salah satu teknik yang sangat baik untuk menganalisis -sitosterol dalam obat-obatan herbal dan minyak nabati adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC). Teknik HPLC digunkan karena memiliki beberapa kelebihan, diantaranya yaitu:Kelebihan dari teknik HPLC ini antara lain :1. HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.2. HPLC memiliki detector dengan kepekaan yang tinggi3. Teknik ini memiliki daya memisah yang tinggi4. Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya5. Dalam HPLC dapat memberikan beberapa ribu lempeng teoritis hanya dalam beberapa cm sehingga memungkinkan analisis kolom yang sangat kecil (sedikit fase gerak yang dikonsumsi)6. Biaya pelarut jauh lebih rendah dibandingkan LC kuno7. Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar Oleh karena pertimbangan ini, maka dilakukanlah penelitian tentang Analisa -sitosterol pada obat herbal dan minyak sayur menggunakan HPLC.

BAB IITINJAUAN TEORITISA. -sitosterol -sitosterol adalah sterol yang ditemukan pada tanaman, yang merupakan subkomponen utama kelompok sterol yang dikenal sebagai pitosterol. Senyawa ini berwarna putih dan memiliki struktur kimia yang sangat mirip dengan kolesterol. Beta-sitosterol banyak ditemukan dalam dedak padi, bibit gandum, minyak jagung, dan kedelai. Strukturnya adalah sebagai berikut:

Gambar 1. Struktur -sitosterolBetasitosterol

Nama IUPAC: 5-Kolesten-24p-etil-3p-ol

Rumus molekul: C29H50O

Nama lain: (24R)-etilkolest-5-en-3--ol, betasitosterin, 24 -etilkolesterol,cinchol(Jannah, 2013)-sitosterol kaya akan manfaat, diantaranya:

a. Mengontrol Kolesterol

Selama tiga dekade terakhir -sitosteroltelah diketahui dapat mengurangi kadar kolesterol. Struktur -sitosterol mempunyai kemiripan dengan kolesterol, sehingga dapat memblokir penyerapan kolesterol dengan cara penghambatan kompetitif. Meskipun -sitosterol tidak diserap dengan baik oleh tubuh (5-10%), bila dikonsumsi dengan kolesterol secara efektif memblokir penyerapan kolesterol, yang mengakibatkan menurunkan kadar kolesterol serum. Beta-sitosterol juga dapat meningkatkan profil lipoprotein (HDL, LDL).b. Meningkatkan Kesehatan Prostat

Mencegah danmengobati masalahprostatsepertibenign prostatic hyperplasia (BPH), dengan mengkonsumsi beberapa jenis herba seperti: ekstrak palmetto, Pygeum africanum, jelatang menyengat, dan biji labu, yang mengandung -sitosterol. -sitosterol dapat mengaktivasi siklus sphingomyelin dan menginduksi apoptosis di LNCaP sel kanker prostat manusia secara invitro. Ada juga laporan yang menunjukkan bahwa - sitosterol memiliki beberapa aktivitas anti-inflamasi di prostat.c. Mempunyai Efek Anti-Kanker

Beta-sitosterol bertindak melawankanker, dengan caramengurangi pertumbuhan prostat manusia dan sel kanker usus besar. etasitosterol juga dapat mencegah leukemia limfositik.d. Meningkatkan KekebalanBeta-sitosterol dapat meningkatkankekebalan atlet yang sering menderita tekanan kekebalan dan mengurangi respon inflamasi selama masa latihan dan kompetisi. Beta-sitosterol telah menunjukkan tidak hanya untuk meningkatkan kekebalan tubuh tetapi juga untuk meningkatkan proliferasi limfosit dan aktivitas sel. Hal ini sangat berguna untuk orang-orang yang secara fisik stres, secara medis tidak sehat atau baru sembuh dari sakit.Selain hal di atas -sitosterol juga memiliki kemampuan untuk meredakan peradangan, menyembuhkan borok, meningkatkan denyut rahim dan mengurangi kram. Betasitosterol ini juga memiliki aktivitas anti-virus, anti-bakteri dan anti-jamur (Berges, 1995).

6

B. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC)1. PengertianKromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. KCKT paling sering digunakan untuk : menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam- asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis; menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi.Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu : Low pressure (tekanan rendah), dan High pressure (tekanan tinggi 76 bar biasanya memakai satuan kpa/kilo paskal). Pada HPLC terdapat oven untuk pemanas karena pada partikel kecil, cairan ditekan terjadi gesekan maka digunakan pendingin dan tekanan tinggi (cairan ditekan menggunakan pompa kemudian didorong, jika ditarik cairan masuk). Tekanan harus 76 bar, antara fase diam dan fase gerak terjadi gesekan sehingga temperatur meningkat maka harus diturunkan (dengan pendingin liebig/ ion exchange) karena ikatannya bisa lepas dan bisa juga terjadi bleeding. Temperatur pada HPLC digunakan untuk menjaga temperatur dalam kolom konstan.2. Instrumen AlatInstrumentasiHPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

Gambar 2. Instrumen Alat HPLC1. Fasa gerakFasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.Persyaratan fasa gerak HPLC:a. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.b. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatografi.c. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.d. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.e. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).f. Sesuai dengan detector.

2. Pompa Pompa dalam HPLC dapat dianalogkan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus.Persyaratan pompa yang digunakan dalam HPLC:a. Menghasilkan tekanan sampai 600psi (point/in2)b. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 ml/menitc. Bahan tahan korosiTujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.3. InjectorSampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.4. Kolom dan fasa diamAda 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:a. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 l/menit).b. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.c. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.5. DetektorDetektor padaHPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: a. mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;b. mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil; c. stabil dalam pengopersiannya;d. mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita;e. signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier);f. tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan penentuan kuantitatif. HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar (Bella, 2009).

BAB IIIANALISA -SITOSTEROL DALAM OBAT HERBAL DAN MINYAK SAYUR MENGGUNAKAN HPLC.Analisa - sitosterol yang terkandung dalam obat herbal dan minyak sayur menggunakan teknik HPLC secara kualitatif, yaitu didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.Sampel yang digunakan terdiri dari obat herbal Solal kapsul - sitosterol, minyak gandum, minyak biji kapas, minyak kacang dan minyak kacang kedelai. Semua sampel disaring sesuai untuk kebutuhan HPLC. Standar yang digunakan adalah - sitosterol dengan konsentrasi 1 mg/ aml yang dibuat dengan cara melarutkannya dengan kloroform.Adapun kondisi peralatan HPLC yang digunakan adalah sebagai berikut:Fase Diam: Silika gel dalam kolom RP-C-18Fase gerak: 15 % Ethanol dan 85 % asetonitrilLaju alir fase gerak: 1 ml/menitDetektor: UV-VisSuhu kolom: 250CDengan bantuan pompa, fasa gerak dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solute-solute yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solute tersebut akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Adapun hasil kromatogram yang diperoleh adalah sebagai berikut:

Fig. 3: HPLC chromatogram of -sitosterol standard and solal betasitosterol capsules was performed in the mobile phase as 100 Acetonitrile at pH 6.5 and showed retension time of 67.25 and 67.89 repectively.

Fig. 4: HPLC chromatogram of -sitosterol standard was performed in 95% Acetonitrile and 5% ethanol and showed retension time was 55.75

Fig. 5: HPLC chromatogram of -sitosterol standard and solal betasitosterol capsules was performed in the mobile phase 85% Acetonitrile and 15% ethanol showed retension time of 36.23 and 36.81 repectively .Table 1: The Retension time of -sitosterols of the vegetable oils detected by HPLC.S/No.Vegetable oilRetension time

1.Wheat germ oil36.91

2.Cotton seed oil36.21

3.Soya been oil36.47

4.Peanut oil36.12

5.solal betasitosterol capsules36.81

6.-sitosterol standard36.23

(Kakade, 2012)Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample. Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Dari kromatogram-kromatogram diatas, hanya menghasilkan satu puncak. Hal ini menandakan bahwasannya sampel yang digunakan telah murni dan mengandung -sitosterol, hal ini juga dapat dilihat dari waktu retensinya, dimana waktu retensi sampel hampir sama dengan waktu retensi -sitosterol standar.

BAB IVKESIMPULANKromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode analisis dan dapat digunakan baik untuk analisis - sitosterol pada obat herbal dan minyak sayur. Analisis menggunakan HPLC dilakukan secara kualitatif, dimana waktu retensi dari - sitosterol standar dibandingkan dengan waktu retensi dari sampel. Dari data waktu retensi yang diperoleh menandakan bahwa waktu retensi - sitosterol hampir sama dengan waktu retensi sampel yang menidentifikasikan bahwa sampel positif mengandung - sitosterol.

DAFTAR PUSTAKA

Bella, Lisa.2009. Skripsi Optimasi Fase Gerak Laju Alir pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin dan Dextrometorfan HBr dalam Sirup dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Medan: Fakultas Farmasi Universitas Sumatra Utara.

Gritter, Roy J, dkk. 1991. Pengantar Kromatografi Edisi Kedua. Bandung: ITB

Hendayana, Sumar, dkk. 1994. Kimia Analitik Instrumen Edisi Kesatu. Semarang: IKIP Semarang Press.

. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. Bandung: PT Remaja Rosdakarya Offset. Bandung.

Jannah, Hilyatul, I Made Sudarma dan Yayuk Andayani. 2013. Analisis Senyawa Fitosterol Dalam Ekstrak Buah Buncis (Phaseolus vulgaris L.). Chem. Prog. Vol. 6, No.2. November 2013.

Johnson, Edward L, dkk. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Bandung: ITB

Kakade, Akshada N dan C.S. Magdum. 2012. HPLC Analysis of -sitosterol in Herbal Medicine and vegetable Oils. International Journal of Pharmacy and Life sciences. Departmen of Pharmaceutical Chemistry. Rajarambapu College of pharmacy, Sangli. India

Sukandar E. 2006. Tren dan Paradigma Dunia Farmasi, Industri-Klinik- Teknologi Kesehatan. Disampaikan dalam orasi ilmiah Dies Natalis ITB, http://itb.ac.id/focus/focus_file/orasi-ilmiah-dies-45.pdf. Diakses Tanggal 13 Desember 2014.