TUGAS KELOMPOK

MATA KULIAH : TABM

1. Pada cara kerja isolasi protein terdapat berbagai macam bahan kimia yang digunakan, antara lain di bawah ini. Jelaskan fungsi dari bahan kimia tersebuta. Tween-20b. PMSFc. Etanol absolut

d. Ammonium persulfat/APS

2. Pada waktu analisa SDS- PolyAcrylamide Gel Electrophoresis/PAGE digunakan sistem separating gel 12 %, stacking gel 3 %. Stacking renggang tp ada acrilamid, memberi kesempatan pada sampel untuk tertahan sementara, krn konsentrasi separating lbh pekat 12%a. Apakah yang dimaksud elektroforesis ?

b. Apakah fungsi kedua sistem tersebut ?c. Jelaskan bagaimanakah terjadinya proses terbentuknya gel?

3. Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul protein. Jelaskan faktor-faktor tersebut !

4. Hasil elektroforesis dilakukan distaining dan selanjutnya didestaining. Apakah tujuan staining dan destaining ? brilian blue5. Dalam preparasi sampel/isolat protein digunakan penambahan Reducing Sample Buffer/RSB dengan perbandingan 1:1. Jelaskan, mengapa dilakukan penambahan RSB untuk memutuskan polipeptida globuler jadi linierSampel turun lewat celah2 jaring2 gel,

Jawaban

1. E

2. a. Elektroforesis adalah sebuah metode untuk separasi atau pemisahan sebuah molekul besar (seperti protein, fragmen DNA, RNA dll) dari campuran molekul yang serupa. Elektroforesis digunakan untuk memisahkan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Sebuah arus listrik dilewatkan melalui medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan.Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium (misal agarosa), maka molekul tersebut akan bergerak dari muatan negatif menuju muatan positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada rasio muatan terhadap massanya dan bentuk molekulnya (Yuwono,2008).b. - Stacking gel merupakan salah satu gel yang digunakan dalam SDS-PAGE. Stackinggel merupakan gel pengumpul atau gel penimbun yang terletak pada bagian atas. Stacking gel dibuat dengan campuran antara akrilamid 30%, Tris HCl 1 M pH 6,8, sterilaquades, SDS 10%, Ammonium Phosphate (APS) 10%, dan temed (Utami, 2007). Stacking gel diperlukan dalam elektroforesis protein karena digunakan untuk mencetak sumuran (well), selain itu digunakan untuk menimbun atau memekatkan protein menjadi satu jalur yang sempit sebelum protein itu memasuki gel pemisah (separating gel). Stacking geljuga digunakan untuk menahan sementara agar sampel bermigrasi pada waktu yang bersamaan. Pada saat elekroforesis protein, protein akan tertarik ke bagian bawah arus listrik. Protein yang memiliki berat molekul paling kecil bergerak cepat sehingga tertarik sampai bagian bawah gel, sedangkan protein yang memiliki berat molekul paling besarakan berada pada bagian atas dari gel (Utami, 2007).

- Main gel (separating gel) merupakan gel yang komposisinya paling banyak dan terletak dibagian bawah alat. Main gel (separating gel) berfungsi untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekulnya. c. Gel poliakrilamida secara kimia terbentuk dari polimerisasi akrilamid yang berikatan secara cross-linkdengan N,N'-methylenebisacryl-amide. Reaksinya adalah polimeri-sasi radikal bebas dengan bantuan ammonium persulfat (APS) sebagai inisiator dan N,N,N',N'-tetramethylenediamine(TEMED) sebagai katalis.3. Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein menurut Soedarmadji (1996) yakni: a. Ukuran molekul protein

Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil.b. Konsentrasi gelMigrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.c. Buffer (penyangga) Dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam buffer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam buffer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.d. Medium penyangga

Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid (Sudarmadji, 1996). Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil akan berpindah lebih bebas di dalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid.e. Kekuatan voltase

Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan.

Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai selalu harus searah (bukan bolak balik).

f. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperatur tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.