TUGAS PRAKTIKUM KIMIA PEMISAHAN DAN ELEKTROMETRIPERCOBAAN 5 PENENTUAN KADAR Cr DENGAN HPLCKELOMPOK 13AVRINA KUMALASARIM0311015

1. Prinsip kerja HPLCPada dasarnya prinsip kerja HPLC sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom, yang membedakan adalah fasa diam yang digunakan pada HPLC memiliki ukuran yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar sehingga keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien.Pada HPLC tekanan yang tinggi menyebabkan fasa gerak dapat bergerak lebih cepat sehingga difusi menjadi sekecil-kecilnya. Ukuran butir kecil pada fasa diam dan tekanan yang tinggi pada fasa gerak pada kromatografi kolom cair secara teori akan menghasilkan pemisahan yang sebaik-baiknya.

2. Keuntungan HPLC Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis. Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi. Kolom dapat digunakan kembali. Waktu analisa cukup singkat. HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil. Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya. Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

3. Perbedaan HPLC dengan GC HPLC mempunyai beberapa keunggulan daripada GC diantaranya :a. Dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap (non volatile), isolasi zat secara termal tidak stabil, pemisahan senyawa anorganik, dan dapat dioperasikan pada suhu kamar.b. HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.HPLCGC

Fasa diamFisa diam berupa adsorben yang tidak boleh larut dalam fasa gerak.Ukuran yang lebih kecil (5 s/d 10 mm) dan tekanan sampai 6000 psi. Ukuran yang kecil dari fasa diam menyebakan fasa diam mempunyai luas permukaan yang besar, keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien pemisahan dipertinggi.Fasa diam berupa suatu cairan bertitik didih tinggi dan proses serapannya lebih banyak berupa partisi yang berupa padatan dan adsopsi memainkan peranan utama.

Fasa gerakFasa gerak merupakan suatu cairan.fase gerak adalah gas seperti helium, hidrogen, atau nitrogen.

KolomAda 2 tipe:- Kolom analitik dengan performance tinggi, diameter dalam 1-6 mm- Kolom preparative, diameter lebih besarTabung kolom dibuat dari kaca dan baja tahan karat. Panjang kolom 0,3-6 meter atau lebih, rata-rata 0,9 m. Kolom yang lebih panjang akan menghasilkan resolusi bertambah baik, tetapi perlu tekanan tinggi. Tabung kolom dapat dikelilingi selubung air (water jacket) untuk pengaturan suhu. Jenis isi kolom (kemasan kolom) tergantung cara kromatografi yang dipakai (adsorpsi, partisi, atau penukaran ion). Ada dua tipe utama kolom dalam kromatografi gas-cair. Tipe pertama, tube panjang dan tipis berisi material padatan; Tipe kedua, lebih tipis dan memiliki fase diam yang berikatan dengan pada bagian terdalam permukaannya.Kolom biasanya dibuat dari baja tak berkarat dengan panjang antara 1 sampai 4 meter, dengan diameter internal sampai 4 mm. Kolom digulung sehingga dapat disesuakan dengan oven yang terkontrol secara termostatis.Kolom dipadatkan dengan tanah diatomae, yang merupakan batu yang sangat berpori. Tanah ini dilapisis dengan cairan bertitik didih tinggi, biasanya polimer lilin.

DetektorAda beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.Detektor yang paling banyak digunakan adalah detektor fotometer sinar tampak atau sinar ultraviolet, dan detektor indeks bias.Fungsi detektor untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan, dan mengukur banyaknya komponen. Syarat-syarat yang baik detektor adalah mempunyai kepekaan tinggi, gangguan noise sedikit, daerah respon linear cukup luas, memberikan respon terhadap semua tipe senyawa, dan tidak peka terhadap perubahan kecepatan aliran dan perubahan suhu.Ada beberapa tipe detektor yang biasa digunakan. Detektor ionisasi nyala merupakan detektor yang umum dan lebih mudah untuk dijelaskan daripada detektor alternatif lainnya.Dalam mekanisme reaksi detektor ionisasi nyala, pembakaran senyawa organik merupakan hal yang sangat kompleks. Selama proses, sejumlah ion-ion dan elektron-elektron dihasilkan dalam nyala. Kehadiran ion dan elektron dapat dideteksi.

Seluruh detektor ditutup dalam oven yang lebih panas dibanding dengan temperatur kolom. Hal itu menghentikan kondensasi dalam detektor.

Jumlah sampleSampel cuplikan harus dimasukkan ke dalam kolom sebagai lapisan setipis mungkin. Ukuran sampel sekitar 1-20 mL. Dua cara untuk melakukan injeksi: cara injeksi dan katup pemasukan cuplikan mikro (micro-sampling valve)

Sample harus mudah menguap dan memiliki kstabilan termal pada suhu pengoperasian. Sampel dimasukkan ke dalam aliran gas melalui lubang injeksi yang terletak pada bagian atas kolom. Suatu aliran gas yang sinambung mengelusi komponen-komponen dari kolom dan kemudian mencapai detektor yang dihububngkan dengan suatu sistem pencatat. Berikut diagramnya

Prinsip pemisahan / Prinsip kerjaMula-mula solven diambil melalui pompa Solven ini kemudian masuk ke dalam katup injeksi berputar, yang dipasang tepat pada sample loop. Dengan pertolongan mikrosiring, sample dimasukkan ke dalam sample loop yang kemudian bersama-sama dengan solven masuk ke dalam kolom. Hasil pemisahan dideteksi oleh detektor yang ditampilkan oleh perekam/recorder. Tekanan solven diatur dengan pengatur dan pengukur tekanan. Pompa memasok solven pada tekanan konstan hingga tekanan 4500 psi dengan laju alir rendah, yakni beberapa milliliter per menit.Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.

Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

Ada tiga hal yang dapat berlangsung pada molekul tertentu dalam campuran yang diinjeksikan pada kolom: - Molekul dapat berkondensasi pada fase diam. - Molekul dapat larut dalam cairan pada permukaan fase diam - Molekul dapat tetap pada fase gas Dari ketiga kemungkinan itu, tak satupun yang bersifat permanen.

Hasil akan direkam sebagai urutan puncak-puncak; setiap puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor. Sepanjang anda mengontrol secara hati-hati kondisi dalam kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang tampak-tentu saja anda atau seseorang lain telah menganalisa senyawa murni dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Area dibawah puncak sebanding dengan jumlah setiap senyawa yang telah melewati detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui komputer yang dihubungkan dengan monitor. Area yang akan diukur tampak sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar yang disederhanakan.

Perlu dicatat bahwa tinggi puncak tidak merupakan masalah, tetapi total area dibawah puncak. Dalam beberapa contoh tertentu, bagian kiri gambar adalah puncak tertinggi dan memiliki area yang paling luas. Hal ini tidak selalu merupakan hal seharusnya.Mungkin saja sejumlah besar satu senyawa dapat tampak, tetapi dapat terbukti dari kolom dalam jumlah relatif sedikit melalui jumlah yang lama. Pengukuran area selain tinggi puncak dapat dipergunakan dalam hal ini.

4. Bagian-bagian HPLC dan jelaskanPada dasarnya instrumen HPLC terdiri dari tandon (reservoir) cairan fase gerak, pompa, injector, kolom, detektor dan rekorder. 1. Tandon (Reservoir) Reservoir terbuat dari gelas atau stainless steel. Jumlahnya bisa satu, dua atau lebih. Reservoir yang baik disertai degessing system yang berfungsi untuk mengusir gas-gas terlarut dalam solvent. Gas terlarut tersebut antara lain oksigen. Degassing dilakukan dengan mengalirkan gas inert dengan kelarutan yang sangat kecil, misalnya helium. Sistem yang lebih lengkap disertai penyaring debu. Debu dan partikulat yang terbawa oleh solvent dapat menyumbat kolom. Degassing dapat juga dibuat sendiri dengan erlermeyer yang dilengkapi dengan pengaduk magnet, pemanas dan pompa vacum. Untuk memperoleh pemisahan yang optimum dianjurkan menggunakan solvent yang masih baru. 2. Pompa Fungsi pompa adalah untuk memompa fase gerak (solvent) ke dalam kolom dengan aliran yang konstan dan reproducible. Pompa harus memenuhi persyaratan: a) Dapat memberi tekanan sampai 6000 psi (360 atm) b) Tekanan yang dihasilkan bebas pulsa. c) Dapat mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 0,1 sampai 10 ml/ menit. d) Dapat mengalirkan fase gerak dengan reprodusibilitas yang tinggi. e) Tahan terhadap korosi (biasanya terbuat dari baja atau teflon). Ada beberapa jenis pompa, antara lain : a. Reciprocating pump: Terdiri dari ruang kecil, dimana solvent dipompa dengan piston yang bergerak maju mundur. Tekanan yang dihasilkan dapat mencapai 10.000 psi. b. Displacement Pump: Terdiri dari semacam alat suntik (syring) yang besar dengan kapasitas biasanya 250 ml. Solvent dialirkan dengan menggerakkan piston. c. Pneumatic Pump: Terdiri dari container yang berisi solvent yang dapat ditekan dengan suatu gas. Tekanan yang dihasilkan kurang dari 2000 psi. Sistim pemompaan ini dapat diatur secara manual atau dengan menggunakan kontrol sistem komputer. Berkenaan dengan aliran fase gerak, jika komposisi solvent dibuat tetap maka disebut isocratic elution. Hal ini dapat dilakukan dengan mencampur lebih dulu dua atau lebih solvent. Kemudian langkah selanjutnya adalah menaruhnya dalam satu reservoir atau dapat juga dengan menaruh masing-masing solvent pada reservoir yang berbeda dengan pompa masing-masing. Jika komposisi solvent dibuat berubah-ubah dari waktu ke waktu, maka cara ini disebut gradient elution, yang pelaksanannya dapat diatur dengan control system. Pompa perlu dirawat dengan baik, antara lain: a. Menggunakan solvent yang bebas debu/ partikulat. b. Pompa jangan dibiarkan kering, sehingga tidak terjadi geseran yang bisa mengakibatkan kebocoran pompa. c. Bila dalam solvent terdapat garam-garam, maka setelah selesai menggunakan alat ini, pompa harus dialiri air (aquadest) sampai bersih kemudian dibilas dengan methanol agar tidak terjadi pengendapan garam dalam dinding pompa. d. Jangan menjalankan pompa dalam keadaan kering.

3. Katup InjectorBagian ini merupakan tempat dimana sampel diinjeksikan untuk selanjutnya dibawa oleh fase gerak ke dalam kolom. Ada beberapa sistem injeksi: a. Syringe Injection; Injeksi menggunakan syringe yang dapat memompakan sampel dengan tekanan sampai 1500 psi. b. Stop Flow Injection: Termasuk jenis syringe injection, hanya injeksinya dengan cara memasukkan sampel ke dalam ruang injeksi (atau disebut mixing chamber, sementara itu aliran fase gerak dihentikan. Setelah sampel masuk lalu fase gerak dialirkan kembali dan sampel akan terbawa. c. Auto sampler (disebut juga Auto Injector) Terdiri dari suatu sistem yang dikendalikan oleh control system. Sampel ditaruh dalam wadah seperti tabung kecil bertutup. Tutup dapat ditembus oleh jarum pengisap. Sampel disedot secara otomatis dengan sistem pompa yang untuk selanjutnya dimasukkan ke dalam aliran fase gerak. Pada auto sampler ini dapat dipasang 100 sampel sekaligus. Dengan sistem HPLC akan bekerja sendiri melakukan analisis, termasuk mencuci sendiri sistem injeksinya setelah melakukan injeksi.

4. Kolom (Column)a. Bahan kolom, ukuran kolom dan ukuran partikel isi kolom. Kolom merupakan jantung dari HPLC, sebab kunci keberhasilan analisis sangat tergantung pada efisiensi kolom sebagai alat untuk memisah-misahkan senyawa dalam campuran yang kompleks. Kolom terbuat dari stainless steel yang dibor halus atau dari gelas. Untuk yang dibuat dari gelas pada umumnya kurang terhadap tekanan, hanya dipakai di bawah 600 psi dan di pasaran tersedia bermacam-macam jenis kolom dari berbagai pabrik. Ukuran kolom antara 10 sampai 30 cm, berbentuk lurus, diameter dalam 4 sampai 10 mm dan ukuran partikel dalam kolom 5 sampai 10 um. Ada juga kolom dengan ukuran yang lebih kecil, panjang 3 sampai 7,5 cm; diameter dalam 1 sampai 4,6 mm, ukuran partikel 3 sampai 5 um. Dalam pemakaian yang berhati-hati, digunakan kolom pengaman (grand column) yang dipasang sebelum kolom analitik. Kolom ini berisi packing yang sama dengan kolom analitik, ukurannya kolom lebih pendek dengan partikel yang ukurannya lebih besar. Kolom ini akan menahan debu partikulat yang ikut terelusi sehingga umur kolom analitik lebih panjang. Contoh perbandingan waktu dan hasil kolom panjang dan pendek untuk campuran theobromine, theophyline, BHET, caffein yang menunjukkan bahwa kolom, pendek dapat memisahkan sampel hanya dalam waktu 120 detik (2 menit), sedang kolom panjang perlu waktu 6 menit. Kolom analitik ada pula yang dapat diatur suhunya. Sebenarnya yang diatur bukan kolomnya tetapi ruang dimana kolom ditempatkan. Ruang ini disebut column oven dan kolomnya disebut thermostat column. Dengan cara seperti ini dapat diatur suhu kolom 1000 sampai 1500. b. Jenis Column Packing (Isi Kolom) Ada dua jenis packing kolom yang telah digunakan dalam kromatografi cair. yaitu berupa partikel porous dan partikel pelliculer. Isi kolom yang berbentuk pellicular terdiri dari partikel berbentuk bola, non porous terbuat dari gelas atau polimer. Partikel ini dilapis dengan suatu lapisan tipis yang porous dari silika, alumina atau penukar ion. Pelapisan dapat dilakukan dengan penambahan phase diam yang akan ditahan oleh partikel secara absorbsi atau dengan jalan mereaksikan bagian permukaan partikel tersebut dengan bahan organik tertentu. Dari reaksi ini dihasilkan suatu lapisan permukaan yang mempunyai sifat tertentu. Lapisan yang terbentuk selanjutnya disebut phase terikat (bonded phase). Packing kolom yang berupa silika, permukaannya terdiri dari silika yang dihidrolisis, baik dengan pemanas atau perendaman dalam HCL sehingga gugus silanol bersifat polar. Untuk mendapatkan permukaan dengan gugus yang sifatnya non polar dapat diikatkan siloxane. Ini diperoleh dengan menghidrolisis permukaan silika dengan organochlorosilan.

5. Detektor Setelah sampel melewati kolom maka komponen-komponennya akan terpisah-pisah dan keluar dari kolom dengan waktu yang berbeda-beda. Komponen yang sudah terpisah ini secara berturut-turut akan melewati suatu detektor dan akan dibaca kadarnya. Detektor yang digunakan harus sesuai dengan jenis zat yang dianalisis. a. Detektor UV Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri abssorbsi. Sampel yang dianalisis harus menyerap sinar UV. Setelah sampel melewati kolom lalu dilewatkan Flow-cell. Intensitas sinar keluar akan lebih kecil daripada sinar masuk karena ada yang diabsorbsi oleh sampel. Besarnya absorbsi yang dinyatakan dengan ukuran absorban sebanding dengan kadar zat yang dianalisis. Detektor ini sifatnya spesifik, artinya hanya dapat digunakan untuk zat-zat yang menyerap sinar UV. Panjang gelombang sinar UV yang biasa digunakan adalah 254 nm. b. Detektor Fluoresensi Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri. Sampel dikenai sinar UV yang sesuai, maka zat ini akan berfluoresensi. Sinar yang dipancarkannya ditangkap dengan phototube. Intensitas sinar Fluoresensi ini akan sebanding dengan kadar sampel yang diamati. Detektor ini lebih sensitif daripada detektor UV. Pemakaian sumber sinar laser akan memberikan sensitivitas yang sangat tinggi. Untuk zat yang tidak berfluoresensi dapat dilakukan derivitisasi yang menghasilkan zat yang dapat berfluoresensi. Derivatisasi sering dilakukan terhadap asam amino. c. Detektor Indeks Refraksi (Refraksi Index Detector = RID) Detektor ini bekerja atas dasar perbedaan indeks refraksi sampel dengan solvent. Semua larutan suatu zat mempunyai indeks bias yang spesifik, oleh karena itu detektor ini dapat digunakan untuk hampir semua zat. 6. Recorder Hasil pembacaan detektor kemudian diolah oleh suatu processor kemudian dikirim ke recorder. Recorder akan membuat suatu tampilan. Dalam kromatografi tampilan ini disebut chromathogram. Untuk HPLC dilengkapi seperangkat software yang dapat menghitung luas kromatogram dan bahkan sekaligus menghitung kadarnya.

5. Macam-macam detectora. Detektor UV Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri abssorbsi. Sampel yang dianalisis harus menyerap sinar UV. Setelah sampel melewati kolom lalu dilewatkan Flow-cell. Intensitas sinar keluar akan lebih kecil daripada sinar masuk karena ada yang diabsorbsi oleh sampel. Besarnya absorbsi yang dinyatakan dengan ukuran absorban sebanding dengan kadar zat yang dianalisis. Detektor ini sifatnya spesifik, artinya hanya dapat digunakan untuk zat-zat yang menyerap sinar UV. Panjang gelombang sinar UV yang biasa digunakan adalah 254 nm. b. Detektor Fluoresensi Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri. Sampel dikenai sinar UV yang sesuai, maka zat ini akan berfluoresensi. Sinar yang dipancarkannya ditangkap dengan phototube. Intensitas sinar Fluoresensi ini akan sebanding dengan kadar sampel yang diamati. Detektor ini lebih sensitif daripada detektor UV. Pemakaian sumber sinar laser akan memberikan sensitivitas yang sangat tinggi. Untuk zat yang tidak berfluoresensi dapat dilakukan derivitisasi yang menghasilkan zat yang dapat berfluoresensi. Derivatisasi sering dilakukan terhadap asam amino. c. Detektor Indeks Refraksi (Refraksi Index Detector = RID) Detektor ini bekerja atas dasar perbedaan indeks refraksi sampel dengan solvent. Semua larutan suatu zat mempunyai indeks bias yang spesifik, oleh karena itu detektor ini dapat digunakan untuk hampir semua zat.