Abstrak

Sekitar 174 fungi endofit telah diisolasi dari beberapa tanaman obat, Camptotheca

acuminate. Dari 18 taxa yang diperoleh, fungi non-sporulating (48,9%), Alternaria (12,6%),

Phomopsis (6,9%), Sporidesmium (6,3%), Paecilomyces (4,6%) dan Fusarium (4,6%). ITS

rDNA assay mengindikasikan bahwa fungi non-sporulating termasuk pada pyrenomycetes dan

Loculoascomycetes ascomycetes atau anamorph lainnya. Hasil pengujian bioaktivitasnya ialah

27,6% fungi endofit memperlihatkan penghambatan terhadap sebagian besar indikator

mikroorganisme. 4,0% dan 2,3% fungi endofit memperlihatkan berturut-turut kemampuan

sitotoksik dan penghambatan protease. Fungi endofit dengan bioaktivitas terdistribusi lebih dari

12 taxa meliputi fungi non-sporulating, yang dipercaya sebagai sumber agen bioaktif.

Pendahuluan

Saat ini, fungi endofit dari tanaman diyakini sebagai sumber obat yang penting.

Kebanyakan senyawa dengan struktur baru dan berbagai aktivitas terus-menerus diisolasi.

Camptotheca acuminate merupakan tanaman obat yang berada di bawah tingkat perlindungan

oleh hukum nasional di Cina. Tanaman ini mengandung senyawa antikanker, yakni

camptothecin, dengan distribusi tertinggi dalam daun segar hingga 0,4%. Dalam lingkungan

hidup yang khusus, terdapat jamur endofit mengambil bagian dalam sintesis atau transformasi

camptothecin. Oleh karena itu, penting untuk mempelajari bahan bioaktif dari jamur endofit

diisolasi dari C. acuminata.

Sumber Fungi endofit

Ranting, kulit kayu dan akar C. acuminate diambil dari area konservasi alam Shaowu

Jiangshi ( Tanaman berumur 10 tahun) dan area konservasi alam Gunung Mingxi Jinzi (Tanaman

berumur 8 tahun), Provinsi Fujian, China Tenggara, pada ketinggian sekitar 200-400 m. Ukuran

ranting (8-12 x 1-2cm, panjang x diameter), akar (4-6 cm x 2-3 cm, panjang x diameter) dan kulit

kayu (8-12 x 3-5 x 0,3-1,5 cm, panjang x lebar x ketebalan) semuanya dilapisi dengan parafilm

untuk melindungi dari pengeringan selama perjalanan.

Isolasi dan Identifikasi Fungi Endofit

Isolasi Fungi endofit dilakukan dengan metode yang digambarkan oleh Huang et al.

(2001). Identifikasi jamur dilakukan secara tradisional dan metode molekuler. Terlebih dahulu

dilakukan karakteristik dan morfologi dari hasil penampakan (tubuh) dan spora (Ainsworth et al.

1973), yang menggunakan ITS sequence (urutan) rDNA untuk mengkarakteristik beberapa

kelompok non-sporulating. ITS1 primer (urutan : 5’-TCCGTAGGTGAACC-TGCGG-3’) dan

ITS4 primer (urutan : 5’-TCCT-CCGCTTATTGATATGC-3’) telah digunakan dan ITS1-5.8S-

ITS2 dibaca dengan PCR dan sesudah diurutkan, dibandingkan dengan laporan sequence (hasil

urutan) yang ada di GeneBank.

Fermentasi dan Persiapan Ekstrak Kasar.

Proses fermentasi dan perlakuan fermentasi broth dilakukan dengan metode yang kami

lakukan sebelumnya (Huang et al. 2001). Jenisnya (strain) memperlihatkan aktivitas sitotoksik

pada skrining pendahuluan dan difermentasi pada medium potato dekstrosa selama 7 hari pada

suhu 25oC. Hasilnya diekstraksi dengan campuran 80% etil asetat, 15% methanol dan 5% asam

formiat. Campuran ekstraksi tersebut dievaporasi untuk mendapatkan ekstrak padat. Ekstrak

tersebut digunakan untuk menentukan IC50 sitotoksik setelah ditambahkan dengan DMS.

Penentuan Aktivitas Antimikroba dan Sitotoksik

Aktivitas antimikroba diuji dengan teknik double layer (Gauthier 1975) dengan organism

indikator meliputi Bacillus subtilis ATCC 9372 (BS), Escherichia coli ATCC 25922 (EC),

Staphylococcus aureus ATCC 25923 (SA), Candida albicans As 2.538 (CA) dan Aspergillus

niger ACCC 30005 (AN). Aktivitas sitotoksik diuji dengan metode MTT (Mosmann 1983;

Huang et al. 2001). Sel tumor manusia KB, Raji dan HepG2 didapat dari Bank Cell Line, Ilmu

Akademi China. Cisplatin (Pabrik Farmasi Jinzhou, China) sebagai control positif.

Pengujian Sitotoksik dengan Metode MTT

Prinsip dari metode MTT adalah terjadinya reduksi garam kuning tetrazolium MTT (3-

(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid) oleh sistem reduktase. Suksinat

tetrazolium yang termasuk d alam rantai respirasi dalam mitokondria sel-sel yang hidup

membentuk kristal formazanberwarna ungu dan tidak larut air. Penambahan reagen stopper

(bersifat detergenik) akanmelarutkan kristal berwarna ini yang kemudian diukur absorbansinya

menggunakan ELISA reader. Intensitas warna ungu yang terbentuk proporsional dengan jumlah

sel hidup. Sehingga jika intensitas warna ungu semakin besar, maka berarti jumlah sel hidup

semakin banyak.

Penentuan Aktivitas Penghambatan Protease

Benzoylarginine-p-nitroanilida (BRpNA) (sigma Co.) digunakan sebagai substrat sintesis

spesifik untuk penentuannya. Reaksi campuran terdiri 40l Tris-HCl buffer (pH 8.5), 150 l 0,8

mg ml-1 BRpNA ( dilarutkan dalam 10% dimetilformamida), 20 l 0,2 mg ml-1 tripsin (250N.F.

U mg-1; Shenggong, Co., China) dan 20 l tested ferment broth. Campuran tersebut diinkubasi

pada suhu 37oC selama 30 menit, dilanjutkan penambahan 30 l asam asetat pada akhir reaksi.

Sistem reaksi tanpa enzim dan uji fermentasi broth dianggap sebagai blank kontrol sedangkan

bagian lainnya tanpa uji fermentasi broth dianggap sebagai kontrol negatif. Trypsin inhibitor

dari soybean (7000 BAEE U mg-1, Amresco, USA) dianggap sebagai kontrol positif. Density

sumuran diukuran dengan microplate reader ( M+ 3550, Bio-Rad) pada 405 nm (Liang et al.

2003). Ukuran Protease inhibitor dihitung dengan persamaan dan ID50 ditetapkan sebagai

pengenceran fermentasi broth bahwa hasilnya (paling sedikit) 50% menghambat aktivitas

protease.

Enzim protease berperan sebagai faktor virulensi pada proses metabolism berbagai

organisme patogen. Pada bakteri patogen, enzim ini menyebabkan berbagai penyakit, seperti:

malaria, kanker, tumor, SARS, bahkan penyakit degeneratif yaitu Alzheimer (Suhartono, 2000).

Suatu enzim protease dapat dihambat aktivitasnya menggunakan inhibitor protease. Melalui

adanya kemampuan ini, menyebabkan inhibitor protease memiliki potensi untuk dikembangkan

sebagai komponen bioaktif dalam upaya mengurangi penyebaran penyakit yang disebabkan oleh

bakteri patogen.

Hasil dan Pembahasan

Sekitar 174 jamur endofit diisolasi dari 18 pohon, terdapat 486 sampel jaringan (Tabel

1). Hasil dari identifikasi dengan metode morfologi tradisional menunjukkan bahwa jamur

endofit yang berlimpah di C. acuminata, dan non-bersporulasi jamur adalah kelompok terbesar

(48,9%) di antara semua isolate Alternaria (12,6%), Phomopsis (6,9%), Sporidesmium (6,3%),

Paecilomyces (4.6%) dan Fusarium (4,6%) adalah genus yang dominan.

Hasil tes menunjukkan bahwa bioaktivitas 48 strain (27,6%) menunjukkan aktivitas

antimikroba setidaknya terhadap satu indikator organisme. Di antara mereka, 54,2%,

20,8% dan 25,0% diisolasi tahun ini dari ranting, akar dan kulit kayu, masing-masing. 7 jamur

(4.0%) menunjukkan aktivitas sitotoksik dengan IC50 dari 2 mg ml-1 sampai 393 mg ml-1

terhadap diuji tumor cell lines (IC50 cisplatin adalah masing-masing 1.5,1.5 and 1.0 g ml-1

terhadap KB, HepG2 dan Raji cell lines). 4 jamur (2,3%) menunjukkan penghambatan protease

dengan ID50 11,5-45 (tingkat penghambatan sekitar 12,2 U ml-1 penghambat tripsin dari soybean,

ditemukan sekitar 56,5% terhadap tripsin).

Strain bioaktif yang diisolasi dari C. acuminata didistribusikan setidaknya dalam 12 taxa

(Tabel 2). Berbeda bioaktivitas yang ditemukan dalam setiap taxa yang berbeda. Misalnya,

75,0% dari strain Paecilomyces ditampilkan bioaktivitas dan pada Fusarium dan Phomopsis,

mencapai masing-masing setinggi 37,5% dan 33,3%. Jamur non-sporulating adalah kelompok

terbesar dan paling banyak didistribusikan antara lain jamur endofit yang diisolasi dari C.

acuminate dan itu juga merupakan sumber utama dari strain bioaktif. Dari sekitar 56 strain

dengan bioaktivitasnya, 27 diantaranya (48,2%) milik kelompok non-sporulating.

Menurut aktiivitas yang berbeda dan karakteristik lingkungannya, ITS rDNA dari 15

Jamur non-sporulating terpilih yang akan diurutkan (sequence). Hasil menunjukkan bahwa

semua 15 strain memiliki lebih dari 96% kesamaan dengan beberapa spesies di GeneBank,

termasuk setidaknya lima genus. Dari hubungan yang paling dekat, kami telah ditunjuk XZ-01

sampai Corynespora cassiicola, XZ-60 ke Glomerella cingulata (dengan kesamaan 100%) dan

strain lainnya sesuai genusnya. Kami berpendapat bahwa studi lebih lanjut terhadap klasifikasi

nonsporulating jamur tersebut dapat dicapai dengan metode molekul biologi (Gao et al. 2001).

Uji filogenetik non-bersporulasi jamur berdasarkan-ITS rDNA (Gambar 1) menunjukkan

bahwa 15 strain dapat diurutkan ke 4 bagia yang berbeda (kelompok). Bagian pertama adalah

kelompok monofiletik dengan hanya SXZ-01, yang memiliki kemiripan 100% dengan

Corynespora cassiicola. Bagian 2 terdiri dari SXZ-08 dan SXZ- 16, erat kaitannya dengan

Batryosphaeria parva dan B. rhodina.

Bagian 3 yang terbesar terdiri dari XZ-07 SXZ-19, XZ-29, XZ-26, XZ-40, XZ-19, NXZ-

05, XJ-05, XZ-05 dan XZ-22, terkait erat dengan beberapa spesies Diaporthe dan anamorph

Phomopsis (Mclaughlin et al. 2001). Bagian 4 terdiri dari XZ-60 (memiliki 100% kemiripan

dengan Glomerella cingulata) dan XJ-02 (Dekat dengan strain daun ascomycete its294). Menurut

uji filogenetik, bagian 4 dan bagian 3 memiliki hubungan dengan Pyrenomycetes. Singkatnya,

jamur non-bersporulasi yang diisolasi dari C. acuminata sebagian besar terdiri dari

Pyrenomycetes, Loculoascomycetes ascomycetes dan anamorph. Namun, diperlukan tes lebih

lanjut untuk identifikasi bagian dari kelompok.

Dalam isolasi umum dari jamur tanah, ascomycete selalu mencapai frekuensi isolasi yang

rendah dan dianggap sebagai jamur langka. Namun demikian, bukti molekuler menunjukkan

bahwa jamur langka ini lazim di berbagai jaringan C. acuminata. Meskipun mereka muncul

sebagai jamur non-bersporulasi yang pada umumnya, kita bisa efektif mengidentifikasi mereka

melalui biologi molekular teknologi. Telah dilaporkan bahwa baru-baru ini, jumlah zat bioaktif

yang dihasilkan oleh ascomycetes dan menunjukkan potensial untuk obat pengembangan

(Strobel dan Daisy 2003). Lebih dari 400 metabolit sekunder yang dihasilkan oleh

Pyrenomycetes ascomycetes (Huang dan Kaneka 1996). Dengan pada umumnya antimikroba,

antitumor dan aktivitas protease inhibitor, ascomycetes ini diisolasi dari C. acuminata yang

merupakan sumber potensial yang dapat diandalkan sebagai obat alami ..

Tugas Kuliah : Bioteknologi Terapan

Endophytic fungi from a pharmaceutical plant, Camptotheca acuminata: isolation, identification and

bioactivity

M. ARIFUDDIN P2500211005

PROGRAM STUDI FARMASI PASCASARJANA

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2012