TRANSFORMASI GEN XILOGLUKANASE PADA BEBERAPA JENIS

EKSPLAN SENGON (Paraserianthes falcataria L. Nielsen) MELALUI

Agrobacterium tumefaciens

Naskah Publikasi

Skripsi

Untuk memenuhi sebagian persyaratan

guna memperoleh gelar Sarjana Sains

Oleh:

Tri Warseno

M0403010

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

2008

PERSETUJUAN

Naskah Publikasi

SKRIPSI

TRANSFORMASI GEN XILOGLUKANASE PADA BEBERAPA JENIS

EKSPLAN SENGON (Paraserianthes falcataria L. Nielsen) MELALUI

Agrobacterium tumefaciens

Oleh:

Tri Warseno

NIM. M0403010

Telah disetujui untuk dipublikasikan

Surakarta,

Menyetujui,

Pembimbing I Pembimbing II

Prof. Drs. Suranto,M.Sc., Ph.D. Dra. N. Sri Hartati, M.Si.

NIP. 131 472 192 NIP. 320 006 576

Mengetahui,

Ketua Jurusan Biologi

Dra. Endang Anggarwulan, M.Si.

NIP. 130 676 864

TRANSFORMATION OF XILOGLUCANASE GENE TO SEVERAL

EXPLANT TYPES OF SENGON (Paraserianthes falcataria L. Nielsen)

MEDIATED BY Agrobacterium tumefaciens

Tri Warseno1)

, Suranto1)

, Sri Hartati2)

Departement of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences

Sebelas Maret University, Surakarta 1)

Research Center For Biotechnology Indonesian Institute of Sciences 2)

ABSTRACT

Sengon (Paraserianthes falcataria L. Nielsen) is one of forestry crop

which have been developed and recommended for Industrial Timber Estate

(HTI). The economic value of this plant such as pulp, raw material of paper

industry (pulp and paper), construction, plywood, and also for energy was

widely known. To increase the wood quality of sengon in industry especially

for the pulp, sengon plantation in which consist higher cellulose were

required. Genetic engineering with the DNA technology for the crop

improvement in which the times taken where much shorten compare to

conventional one. Overexpression of xyloglucanase in poplar (Populus alba)

showed the growth enhancement and improved the cellulose depotition at

secondary xylem so wood quality yielded good progressively. The aim of this

research was to know the result of xyloglucanase gene transformation via

Agrobacterium tumefaciens vector of various explants type of sengon.

Callus, cotyledons and cotyledonary nodes were taken away from

sengon’s seed which germinated on hormon-free MS medium during 10 days

used for transformation. A. tumefaciens carrying recombinant plasmid

pAaXEG 300 bearing xyloglucanase and NPT II gene encoding kanamycin

resistance were used for transformation process. For cocultivation A.

tumefaciens with Optical Density (OD600) = 0,4; 0,6 and 0 (as control) value

was used. For callus induction 1mg TDZ and 0,25 mg/IAA were added to MS

medium respectively. For the selection purpose 300 mg/l kanamycin and 280

mg/l carbenisillin were added to MS medium. The putative transgenic

explants were tested on a gene integration test by PCR methode and the results

was checked by gel electroforesis. Putative transgenic explants then moved to

the somatic embryo induction medium to induce somatic embryo forming.

The results showed that the OD600 0,4 value showed much better than

OD600= 0,6 for the all of explants used, accordingly callus yielded highest

transformation efficiency value ( 40 %). PCR products examined, resulting

showed that six of the nine samples tested showed positif, indicating that

xyloglucanase gene has successfully integrated on the plant tissue.

Key words: xyloglucanase, Paraserianthes falcataria, explant types,

transformation

PENDAHULUAN

Salah satu tanaman kehutanan yang dikembangkan sebagai salah satu

komoditi HTI (Hutan Tanaman Industri) adalah sengon (Paraserianthes falcataria

L. Nielsen). Sengon mempunyai beberapa keunggulan yaitu dapat tumbuh dengan

cepat di daerah tropis, pada tanah miskin hara dan drainase yang kurang baik.

Sifatnya yang dapat tumbuh cepat sangat sesuai digunakan untuk reboisasi dan

penghijauan lahan-lahan kritis (Santoso, 1992). Kayu sengon merupakan salah

satu kayu yang banyak dimanfaatkan dalam produksi pulp dan kertas. (Nemoto,

2002).

Kayu sengon dapat digunakan untuk menghasilkan pulp yang berkualitas

karena kayu sengon memiliki berat jenis 0,49 dengan tingkat keawetan dan

kekuatannya tergolong ke dalam kelas awet IV/V dan kelas kuat IV/V (Hidayat, et

al., 2002). Selain itu karena warnanya yang terang, hanya sedikit proses bleaching

yang diperlukan untuk mendapatkan kertas putih yang baik kualitasnya (Nemoto,

2002). Untuk peningkatan pertumbuhan dan kualitas kayu sengon sebagai bahan

baku industri pulp maka diperlukan perbanyakan dan perbaikan sifat sengon

melalui rekayasagenetika. Rekayasa genetika dengan penerapan teknologi DNA

melalui transformasi genetik merupakan teknologi alternatif untuk perbaikan

tanaman dalam waktu yang relatif singkat (Siregar, 2002).

Adanya keterlibatan proses pemutusan ikatan xiloglukan dalam proses

elongasi (pemanjangan) sel, telah terbukti dengan adanya penemuan terdahulu

mengenai proses integrasi oligosakarida xiloglukan kedalam segmen-segmen

batang kacang polong (Pisum sativum) yang ternyata dapat melonggarkan dinding

sel dan mempercepat proses pemanjangan sel (elongasi). Overekspresi

xiloglukanase pada poplar (Populus alba) yaitu sejenis tanaman berkayu di daerah

subtropik terbukti dapat memacu pertumbuhan dan meningkatkan deposisi

selulosa pada xylem sekunder sehingga kualitas kayu yang dihasilkan semakin

baik (Park et al., 2004). Tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui hasil

transformasi gen xiloglukanase menggunakan vektor Agrobacterium tumefaciens

pada beberapa jenis eksplan tanaman sengon..

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini berlangsung dari bulan Mei 2007 – Januari 2008 di di

Laboratorium Biologi Molekuler Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI (Lembaga

Ilmu Pengetahuan Indonesia) Cibinong, Jawa Barat.

Penentuan Sensifitas Eksplan terhadap Antibiotik Kanamisin

Eksplan ditanam pada media MS yang mengandung beberapa tingkat

konsentrasi kanamisin, yaitu 0, 100, 200, 300, 400, dan 500 mg/l (masing-masing

15 eksplan). Pengamatan dilakukan setelah 4 minggu untuk mengetahui

pertumbuhan eksplan pada masing-masing tingkat konsentrasi.

Transformasi

Proses transformasi dilakukan dengan cara merendam eksplan (bagian

buku kotiledon, kotiledon dan kalus) dalam larutan bakteri Agrobacterium

tumefaciens dengan OD600 (Optical Density) = 0,4 dan 0,6 selama 5 menit. Semua

permukaan eksplan harus terendam oleh larutan bakteri tersebut. Eksplan

diletakkan di atas kertas saring steril untuk menyerap sisa bakteri dan dibiarkan

sampai mengering. Selanjutnya eksplan dikokultivasi pada media ½ MS selama +

24 jam (overnight) (Sudarmonowati dkk. (2005).

Seleksi dan Induksi Kalus Embriogenik Hasil Transformasi

Eksplan yang telah dikokultivasi dipindah kedalam cawan yang berisi

media induksi kalus. Media yang digunakan adalah media MS + 1 mg/l TDZ +

0,25 mg/l IAA (Tampubolon, 2007). Untuk media seleksi ditambahkan dengan

antibiotik yang mengandung 300 mg/l kanamisin serta 280 mg/l karbenisilin.

Kemudian eksplan diinkubasi dalam ruang kultur pada suhu 25 oC. Pengamatan

dilakukan untuk mengetahui jumlah eksplan yang bertahan dan mampu

membentuk kalus serta memberikan respon embriogenik. Eksplan yang dapat

bertahan pada media seleksi adalah putative transgenic yang akan diuji lebih

lanjut dengan PCR.

Uji Integrasi Gen Melalui PCR

Isolasi DNA tanaman dilakukan dengan menggunakan metode CTAB

berdasarkan Gillies et al.(1997) dengan penambahan PVP. Sebanyak 17,5 µl

akuades steril dimasukkan ke dalam tabung propilen 500 µl dan diikuti berturut-

turut dengan 2,5 µl PCR buffer 10 X; 1 µl MgCl2; 1 µl DNA template; 1 µl

forward primer;1 µl reverse primer; 0,5µl dNTP mix dan 0,5 µl enzim

polymerase (Invitrogen). Setelah ditutup komponen tersebut dicampur dengan

cara disentrifus dengan kecepatan 5000 rpm selama 1 menit. Kemudian tabung

propilen dimasukkan ke dalam mesin PCR untuk dilakukan amplifikasi. Primer

yang digunakan untuk amplifikasi:

1). Forward primer: 5’- GCTGCCAGTCTAGAGCGCCGCAGCGAC-3’,

2). Reverse primer: 3’- CAACGCACC TGGCGCCGGACTGCCCTC-5’

Kondisi PCR yang digunakan adalah denaturasi awal dilakukan pada suhu

95 oC selama 60 detik, denaturasi untuk siklus dilakukan pada suhu 95

oC selama

30 detik, kemudian diikuti dengan annealing pada suhu 56 oC selama 45 detik dan

elongasi pada suhu 72 oC selama 60 detik. Siklus ini diulang untuk 30 siklus dan

diikuti dengan elongasi akhir pada suhu 72 oC selama 7 menit. Hasil PCR diuji

melalui elektroforesis gel agarose. Gel agarose dibuat dengan konsentrasi 0,8 %.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Optimasi Media Seleksi

Untuk mengetahui sensitifitas eksplan tanaman P. falcataria terhadap

antibiotik kanamisin dan penggunaan antibiotik kanamisin yang tepat untuk media

seleksi, dilakukan percobaan dengan menumbuhkan eksplan tanaman P.

falcataria pada media MS dengan penambahan beberapa tingkat konsentrasi

kanamisin. Sensitivitas eksplan P. falcataria terhadap antibiotik kanamisin dapat

dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Hasil uji sensitivitas eksplan sengon terhadap kanamisin (n =15)

Konsentrasi Jumlah dan persentase (%) eksplan mati pada minggu ke-

Kanamisin (mg/l) 1 2 3 4

0 0/15 (0) 0/15 (0) 0/15 (0) 0/15 (0)

100 0/15 (0) 0/15 (0) 0/15 (0) 2/15 (13,33)

200 0/15 (0) 0/15 (0) 3/15 (20) 5/15 (33,33)

300 0/15 (0) 5/15 (33,33) 10/15 (66,67) 15/15 (100)

400 3/15 (20) 11/15 (73,33) 15/15 (100) 15/15 (100)

500 5/15 (33,33) 13/15 (86,67) 15/15 (100) 15/15 (100)

600 15/15 (100) 15/15 (100) 15/15 (100) 15/15 (100)

*) Keterangan: Angka di dalam kurung menunjukkan persentase

Dari penelitian optimasi media seleksi ini, dihasilkan bahwa antibiotik

kanamisin dengan konsentrasi 300 mg/l dapat digunakan sebagai konsentrasi

minimal yang dapat menghambat pertumbuhan dan merupakan konsentrasi lethal

minimum pada eksplan sengon, sehingga kanamisin dengan konsentrasi tersebut

dapat digunakan untuk menyeleksi kalus transforman yang resisten terhadap

kanamisin.

Optimasi Media Induksi Embrio Somatik

Media untuk menginduksi terbentuknya embrio somatik merupakan salah

satu aspek yang memegang peranan penting dalam penelitian transformasi gen

pada tanaman. Eksplan yang telah ditransformasi diharapkan dapat berkembang

dan beregenerasi membentuk embrio somatik atau tanaman utuh (planlet). Hasil

pengamatan secara visual perkembangan kalus pada 6 media induksi embrio

somatik pada minggu ke-4 setelah tanam dapat dilihat pada Tabel 2 dan Gambar

1.

Tabel 2. Penampakan visual perkembangan kalus pada media induksi embrio

somatik pada minggu ke-2 setelah tanam. Media Penampakan visual kalus

Struktur Warna Diameter Respon SE

M1 Friable Hijau kekuningan < 15 mm -

M2 Friable Hijau kekuningan < 15 mm -

M3 Friable Hijau kekuningan > 15 mm -

M4 Friable Hijau kekuningan > 15 mm -

M5 Friable Hijau kekuningan > 15 mm -

M6 Friable Hijau kekuningan > 15 mm +

*) Keterangan: (+) Kalus memberikan respon terbentuknya embriogenesis somatik

(-) Kalus tidak memberikan respon terbentuknya embriogenesis somatik

Struktur kalus pada semua jenis media secara umum tidak menunjukkan

perbedaan. Kalus yang muncul strukturnya friable (remah) dan berwarna hijau

kekuningan. Dari 6 jenis media yang digunakan hanya media M6 (Media MS +

0,1 mg/l TDZ + 0,25 mg/l IAA) yang merespon terjadinya embriogenesis somatik

dengan ditandai terbentuknya struktur seperti embrio pada beberapa eksplan.

Berdasarkan optimasi media pendewasaan ini eksplan yang telah lolos selanjutnya

dipindahkan ke media induksi yang responsif membentuk embrio somatik yaitu

media M6 (Media MS + 0,1 mg/l TDZ + 0, 25 mg/l IAA ).

Gambar 1. Hasil Pengamatan Visual Optimasi Media Induksi Embriogenesis Somatik.

Keterangan: A: Media MS0; B: Media ½ MS; C: Media MS + 0,1 mg/l TDZ; D: Media MS +

0,46 µM Kinetin; E: Media MS + 0,1 mg/l TDZ + 0,46 µM Kinetin; F: Media

MS + 0,1 mg/l TDZ + 0, 25 mg/l IAA

Hasil seleksi eksplan yang telah ditransformasi

Setelah 8 minggu pada media seleksi dilakukan pengamatan untuk

mengetahui persentase dari masing-masing parameter. Hasil analisis data untuk

masing-masing perlakuan dapat dilihat pada tabel 3 berikut.

Tabel 3. Hasil seleksi eksplan setelah 8 minggu pengamatan Nilai

Kerapatan

Bakteri

Jenis Eksplan Persentase

Rata-Rata

Eksplan

Bertahan (%)

Persentase Rata-

Rata Eksplan

mengalami

Overgrowth

(%)

Persentase

Rata-rata

Eksplan

Nekrosis (%)

Persentase

Rata-Rata

Eksplan

membentuk

kalus (%)

OD600 = 0

(Kontrol)

Kalus 100 a

0 a

0 a 88

de

Kotiledon 94 a

0 a

6 a

94 e

Buku kotiledon 92 a

0 a

8 a

80 d

OD600 = 0,4 Kalus 40 b 30

bc 30

b 28

bc

Kotiledon 38 b

26 b

36 b

24 b

Buku kotiledon 38 b 28

bc 34

b 34

c

OD600 = 0,6 Kalus 26 c

42 c

32 b

10 a

Kotiledon 24 c

40 bc

34 b 20

b

Buku kotiledon 26 c

40 bc

34 b

24 b

*) Keterangan: Angka yang diikuti dengan huruf yang sama pada satu kolom menunjukkan tidak

beda nyata pada uji DMRT dengan taraf uji 5 %.

Persentase eksplan yang bertahan pada media seleksi

A B C

D E F

Perubahan morfologi pada eksplan hasil transformasi mulai terlihat setelah

1 minggu dalam media seleksi yang mengandung kanamisin 300 mg/l, dimana

beberapa eksplan mulai mengalami pencoklatan, nekrosis atau membusuk.

Eksplan tersebut merupakan eksplan yang diduga tidak tertransformasi sehingga

tidak mampu bertahan dalam media yang mengandung kanamisin sedangkan

eksplan yang tertransformasi tetap segar (berwarna hijau) (Gambar 2).

Gambar 2. Perbandingan kalus putative transgenic dan yang nekrosis

Keterangan: A. Eksplan putative transgenic (masih tetap berwarna hijau dan membentuk

kalus baru)

B Eksplan yang tidak tertransformasi (berwarna coklat dan mengalami nekrosis

Hasil analisis sidik ragam (Anava) menunjukkan bahwa perbedaan nilai

kerapatan bakteri (Nilai OD) dan jenis eksplan menunjukkan pengaruh yang

signifikan terhadap persentase rata-rata eksplan bertahan (p < 0,05). Setelah

dilakukan Uji DMRT pada taraf uji 5 % menunjukkan bahwa nilai OD

menunjukkan pengaruh yang berbeda nyata pada persentase ekspan transforman

yang dapat bertahan pada media seleksi. Sebaliknya jenis eksplan tidak

menunjukkan pengaruh yang berbeda nyata terhadap kemampuan eksplan untuk

bertahan pada media seleksi.

Berdasarkan dari hasil seleksi eksplan hasil transformasi pada media

seleksi yang diberi 300 mg/l kanamisin diketahui bahwa persentase hidup eksplan

pada setiap perlakuan ternyata menunjukkan jumlah yang cukup rendah,

sedangkan eksplan yang ditumbuhkan pada media tanpa antibiotik (kontrol),

ternyata dapat tumbuh dan mampu membentuk kalus yang lebih baik. Hal ini

menunjukkan adanya proses seleksi terhadap sel-sel eksplan oleh kanamisin yang

digunakan pada media seleksi dan penambahan antibiotik kanamisin 300 mg/l

pada media seleksi sudah cukup efektif untuk menyeleksi sel-sel transforman pada

sengon.

B

A

100

40

26

94

38

24

92

38

26

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Pe

rse

nta

se

(%

)

Kalus Kotiledon Buku Kotiledon

Jenis Eksplan

Persentase Eksplan Tahan

OD 600= 0

OD 600= 0,4

OD 600= 0,6

Gambar 3. Persentase (%) eksplan yang bertahan pada media seleksi (setelah 8 minggu

pengamatan

Adanya eksplan yang mengalami pertumbuhan dan perkembangan setelah

transformasi dan ditanam di media seleksi merupakan indikasi awal

terintegrasinya T-DNA dari plasmid yang membawa gen resisten terhadap

antibiotik kanamisin (npt II) ke dalam sel-sel eksplan karena resistensi eksplan

tersebut merupakan ekspresi dari gen npt II.

Persentase kontaminasi oleh Agrobacterium (overgrowth)

Setelah 7-10 hari dipindah ke media seleksi (1 mg/l TDZ + mg/l 0,25

IAA + 300 mg/l kanamisin + 280 mg/l karbenisilin) eksplan ditumbuhi oleh

bakteri A. tumefaciens sehingga menyebabkan tanaman mengalami gangguan

pertumbuhan dan akhirnya mati. Hal tersebut dapat disebabkan oleh terjadinya

pertumbuhan bakteri yang berlebih (overgrowth) yang mengakibatkan tingkat

kompetisi bakteri sangat tinggi dan pertumbuhan eksplan terhambat atau mati

sehingga proses infeksi tidak efektif (Siswanto dkk., 1997).

0

30

42

0

26

40

0

28

40

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Pe

rse

nta

se

(%

)

Kalus Kotiledon Buku Kotiledon

Jenis Eksplan

Persentase Eksplan Mengalami Overgrowth

OD 600= 0

OD 600= 0,4

OD 600= 0,6

Gambar 4. Persentase (%) eksplan yangmengalami overgrowth pada media seleksi (setelah 8

minggu pengamatan

Hasil penelitian dengan perbedaan nilai OD dan jenis eksplan pada

eksplan yang ditransformasi menunjukkan pengaruh yang berbeda nyata terhadap

persentase rata-rata eksplan yang overgrowth apabila dibandingkan dengan

kontrol. Kerapatan bakteri dengan nilai OD600 = 0,6 menghasilkan eksplan dengan

tingkat overgrowth yang lebih tinggi daripada OD600 = 0,4 pada semua jenis

eksplan yang digunakan. Hal tersebut diduga karena pada OD600 = 0,6 kerapatan

bakteri terlalu tinggi sehingga bakteri tumbuh secara berlebih dan akhirnya

mengkontaminasi eksplan, mengakibatkan pertumbuhan terganggu bahkan

kematian eksplan.

Persentase Eksplan yang Nekrosis

Nekrosis dan kematian sel pada jaringan tanaman merupakan salah satu

faktor yang dapat mempengaruhi efisiensi transformasi yang diperantarai oleh

Agrobacterium (Gustavo et al., 1998). Tingkat reaksi nekrosis dilaporkan

tergantung pada beberapa parameter transformasi, meliputi jenis dan usia eksplan,

waktu prakultur, densitas inokulum bakteri dan lamanya infeksi, jenis dan

konsentrasi agen penyeleksi yang digunakan.

0

3032

6

36

34

8

34 34

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Pe

rse

nta

se

(%

)

Kalus Kotiledon Buku Kotiledon

Jenis Eksplan

Persentase Ekplan Nekrosis

OD 600= 0

OD 600= 0,4

OD 600= 0,6

Gambar 5. Persentase (%) eksplan yang mengalami nekrosis (setelah 8 minggu

pengamatan

Hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan nilai OD dan jenis eksplan

tidak berpengaruh secara nyata pada persentase eksplan yang nekrosis pada

eksplan transforman yang ditransformasi dengan menggunakan nilai OD600= 0,4

dan 0,6. Tetapi apabila dibandingkan dengan tanaman kontrol hasilnya

menunjukkan pengaruh yang beda nyata (Tabel 3). Berdasarkan hasil statistik

tersebut diduga bahwa proses transformasi mempengaruhi kondisi eksplan setelah

kokultivasi salah satunya adalah nekrosis pada eksplan.

Persentase Eksplan yang membentuk Kalus

Kemampuan eksplan untuk membentuk kalus pada media seleksi

merupakan salah satu parameter dari keberhasilan proses transformasi. Hal

tersebut menunjukkan bahwa eksplan yang tumbuh dan membentuk kalus

merupakan sel-sel yang telah berhasil tertransformasi dan ada indikasi untuk dapat

beregenerasi menjadi planlet. Hasil analisa data secara statistik menunjukkan

bahwa perbedaan kerapatan bakteri dan jenis eksplan memberikan pengaruh yang

berbeda nyata pada persentase eksplan yang membentuk kalus.

Perbandingan persentase ekslan yang mampu membentuk kalus

ditunjukkan pada Gambar 6. Pada eksplan yang ditransformasi persentase eksplan

yang dapat membentuk kalus baru tertinggi adalah yang berasal dari buku

kotiledon. Pada eksplan yang berasal dari kalus, kemampuan untuk membentuk

kalus yang baru lebih rendah daripada buku kotiledon. Hal tersebut dapat

disebabkan karena usia kalus yang sudah dewasa ketika ditransformasi sehingga

lebih sulit berproliferasi untuk membentuk kalus yang baru dibandingkan dengan

buku kotiledon yang mungkin lebih aktif dalam pembelahan sel.

88

28

10

94

2420

80

34

24

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Pe

rse

nta

se

(%

)

Kalus Kotiledon Buku Kotiledon

Jenis Eksplan

Persentase Eksplan Membentuk Kalus

OD600= 0

OD600= 0,4

OD600= 0,6

Gambar 6. Persentase (%) eksplan yang membentuk kalus (setelah 8 minggu pengamatan

Gambar 7. Morfologi eksplan hasil transformasi dan kontrol setelah 8 minggu pengamatan.

Keterangan: 1. Eksplan hasil transformasi dengan nilai OD600= 0,4

2. Eksplan hasil transformasi dengan nilai OD600= 0,6

A. Eksplan kontrol

B. Eksplan hasil transformasi

(XEG = Xiloglukanase)

1

2

1A

1B

2A

2B

Bila dibandingkan dengan tanaman kontrol, terlihat bahwa proses

transformasi mempengaruhi kemampuan eksplan dalam membentuk kalus. Selain

itu kalus yang berasal dari eksplan yang telah ditransformasi menunjukkan

pertumbuhan yang lebih rendah daripada kalus yang tidak ditransformasi (kontrol)

(Gambar 13). Hal ini diduga karena perlakuan transformasi dan insersi gen asing

ke dalam kromosom tanaman menyebabkan tanaman mengalami stress, sehingga

menghambat pertumbuhan dan daya regenerasinya.

Efisiensi Transformasi

Efisiensi transformasi merupakan salah satu parameter untuk mengetahui

keberhasilan transformasi gen pada tanaman. Pada penelitian ini nilai efisiensi

transformasi dihitung dengan membandingkan jumlah eksplan yang bertahan pada

medium seleksi pada akhir pengamatan dengan jumlah eksplan yang

dikokultivasi.

Tabel 4. Nilai efisiensi transformasi berdasarkan ketahanan kalus pada media seleksi (pengamatan

minggu ke-10).

Nilai Kerapatan

Bakteri

Jenis

Eksplan

Efisiensi Transformasi

(%)

OD600 = 0,4 Kalus 40

Kotiledon 36

Buku kotiledon 38

OD600 = 0,6 Kalus 24

Kotiledon 20

Buku kotiledon 25

*) Keterangan: Jumlah eksplan yang ditransformasi setiap perlakuan 50 eksplan

Berdasarkan hasil pengamatan terhadap parameter transformasi terutama

persentase eksplan yang mampu bertahan pada media seleksi setelah 10 minggu

pengamatan, nilai efisiensi transformasi yang diperoleh pada masing-masing

perlakuan seperti yang ditunjukkan pada Tabel 4. Nilai efisiensi transformasi

tertinggi terdapat pada eksplan kalus yang ditransformasi menggunakan

Agrobacterium tumefaciens dengan nilai OD600= 0,4 yaitu 40 % dan nilai

efisiensi transformasi yang terendah terdapat pada kotiledon yang ditransformasi

dengan nilai OD600= 0,6 yaitu 20 %.

Pertumbuhan dan perkembangan eksplan hasil transformasi pada media

induksi embrio somatik

Setelah 8 minggu ditanam pada media seleksi, kalus yang terbentuk

dipindahkan ke media perkembangan kalus, yaitu media MS ditambah dengan 0,1

mg/l TDZ dan 0,25 mg/l IAA (berdasarkan hasil optimasi media induksi) untuk

menginduksi terbentuknya embrio somatik. Pada media pendewasaan beberapa

eksplan baik kontrol maupun yang telah ditransformasi muncul beberapa struktur

yang menyerupai embrio setelah 3-4 minggu setelah tanam (Gambar 8).

Gambar 8. Beberapa struktur seperti embrio yang muncul pada media induksi embrio somatik.

Keterangan: 1A-1C = non transforman

2A-2F = transforman

Jumlah eksplan yang mampu membentuk embrio somatik pada media

pendewasaan pada penelitian ini masih terlalu sedikit. Dari 100 eksplan yang

dipindahkan ke media induksi hanya 9 ekplan yang dapat membentuk struktur

yang menyerupai embrio. Belum optimalnya pembentukan embrio somatik dalam

penelitian ini diduga karena belumnya tepatnya kualitas eksplan yang digunakan.

Ketidakmampuan eksplan untuk membentuk embrio somatik mungkin

disebabkan karena faktor media yang kurang optimal untuk meregenerasikan

kalus setelah transformasi. Jenis dan konsentrasi zat pengatur tumbuh yang kurang

1A 1B

2A 2B

2C

1C

2D 2E 2F

tepat mungkin termasuk di dalam faktor yang menyebabkan eksplan tidak mampu

membentuk embrio somatik secara optimal. Hal tersebut dapat dilihat pada

perlakuan kontrol yaitu kalus yang tidak mengalami transformasi ternyata juga

tidak dapat membentuk embrio somatik secara optimal dan embrio somatik yang

terbentuk hanya mencapai fase nodular/globular dan kemudian mengalami

pengkalusan lagi.

Penyebab lain rendahnya daya regenerasi eksplan transforman mungkin

dikarenakan adanya senyawa/ agen penyeleksi antibiotik pada media regenerasi.

Sel yang tidak mengandung gen ketahanan terhadap antibiotik tentunya akan

terseleksi dan mati, sebaliknya sel eksplan yang telah tertransformasi gen

ketahanan terhadap antibiotik akan lolos seleksi dan tumbuh terus dan dapat

membentuk embrio somatik. Penggunaan sistem seleksi antibiotik dilaporkan

sering menyebabkan kebanyakan sel yang tertransformasi tidak atau sulit

beregenerasi (Yu, et al., 2001; da Silva, et al., 2001). Hal tersebut diduga karena

adanya penghambat pertumbuhan atau toksin yang dikeluarkan dari sel non-

transgenik yang mati, atau karena terganggunya transportasi senyawa esensial

melalui jaringan mati tersebut (Haldrup et al., 1998).

Konsentrasi antibiotik yang digunakan untuk menghambat pertumbuhan

Agrobacterium setelah proses kokultivasi pada umumnya tinggi dan mungkin

mempengaruhi kultur tanaman dengan menghambat atau dapat juga meningkatkan

pertumbuhan dan regenerasi eksplan. Penelitian transformasi gen pada tanaman

pepaya (Yu, et al., 2001), kedelai (Wiebkie et al., 2006), Chrysanthemum dan

tembakau (da Silva, et al., 2001) yang menggunakan karbenisilin untuk

menghambat pertumbuhan A. tumefaciens setelah proses kokultivasi melaporkan

bahwa terjadi penurunan pertumbuhan kalus dan kemampuan eksplan untuk

membentuk embrio somatik yang cukup signifikan.

Uji Integrasi Gen Melalui PCR

Keberhasilan transformasi genetik tanaman ditandai dengan

terintegrasinya gen yang diintroduksikan ke dalam genom tanaman dan

terekspresi serta tetap terpelihara dalam seluruh proses pembelahan sel sampai

regenerasi tanaman. Analisis secara molekuler dimaksudkan untuk mengetahui

keberhasilan proses transfer gen xiloglukanase pada tanaman sengon hasil

transformasi. Setelah eksplan berumur 8 (delapan) minggu di media seleksi,

dilakukan isolasi DNA genom dan dianalisa dengan uji PCR untuk mendeteksi

keberadaan gen xiloglukanase dalam genom eksplan tersebut.

bp

12000

2000

1650

650

Gambar 9. A. DNA genom sengon hasil transformasi (2-5) dan kontrol ( 6-9)

B. DNA genom sengon hasil transfomasi (4-11) dan kontrol (1-3) (ulangan)

Hasil isolasi DNA pada Gambar 9 (A dan B) menunjukkan adanya pita

DNA yang diisolasi dari genom tanaman sengon. Ukuran DNA genom yang

diperoleh cukup besar dan banyak, yang ditandai dengan terlihatnya pita hasil

elektroforesis yang terang (tanda panah) dan dilihat dari dekatnya jarak migrasi

pita DNA. Berdasarkan hasil tersebut diketahui bahwa ukuran DNA genom

sengon lebih dari 12000 bp. Namun demikian, disamping DNA genom sengon

utuh sebagian ada yang terdegradasi yang tampak sebagai usapan (smear) di

bawah pita yang terang. Hal tersebut mungkin dikarenakan adanya degradasi dan

kerusakan DNA selama proses ekstraksi dan pemurnian DNA.

Uji PCR dilakukan dengan menggunakan primer spesifik untuk gen

xiloglukanase. DNA template diperoleh dari 9 eksplan putative transgenic dan 1

eksplan yang tidak ditransformasi sebagai kontrol.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

B A

bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

12000

5000

2000

1650

1000

850 709

650

500 400

300

200 100

Gambar 17. Hasil uji integrasi gen dengan PCR yang menunjukkan pita DNA berukuran 709 bp.

1. Marker /1 kb plus DNA Ladder (Invitrogen); 2. Plasmid XEG; 3-11. Tanaman

yang ditransformasi; 12. Tanaman kontrol; 13. Kontrol negatif PCR.

Hasil analisis PCR dari ketiga jenis eksplan yang resisten pada media

seleksi dapat dilihat pada Gambar 10. Dari 9 sampel tanaman putatif transgenic

diperoleh 6 sampel yang positif mengandung sisipan gen xiloglukanase. Dengan

adanya sampel yang menunjukkan pita berukuran 709 bp tersebut menunjukkan

bahwa gen xiloglukanase telah berhasil diintroduksikan ke dalam genom tanaman

sengon (P. falcataria (L.) Nielsen) melalui A. tumefaciens.

Untuk mengetahui keberhasilan introduksi gen dan kestabilannya pada

genom tanaman sebaiknya perlu dilakukan uji integrasi gen dengan PCR kembali

pada planlet hasil regenerasi dari kalus yang resisten kanamisin atau uji ekpresi

gen dengan menggunakan teknik Western Blott.

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, Pada tahap transformasi

penggunaan kerapatan bakteri pada nilai OD600= 0,4 menunjukkan hasil yang

lebih baik daripada OD600= 0,4. Pada penelitian ini penggunaan antibiotik

kanamisin dengan konsentrasi 300 mg/l sudah cukup efektif untuk menyeleksi sel-

sel transforman pada sengon. Pada tahap induksi embrio somatik menunjukkan

bahwa media induksi embrio somatik yang dapat membentuk struktur seperti

embrio adalah media MS + 0,1 mg/l TDZ + 0,25 mg/l IAA. Perbedaan jenis

eksplan dan kerapatan bakteri yang digunakan pada proses transformasi

berpengaruh terhadap keberhasilan transformasi gen xiloglukanase pada tanaman

sengon. Hasil analisa PCR menunjukkan 6 sampel positif terdapat gen

xiloglukanase dari 9 eksplan yang resisten kanamisin.

DAFTAR PUSTAKA

Da Silva, J.A.T., Fukai, S. 2001. “The Impact of Carbenisilin, Cefotaxime and

Vancomycin on Chrysanthemum and Tobacco TCL Morphogenesis and

Agrobacterium Growth”. J. Appl.Hort. 3(1): 3-12.

Gustavo A. de la Riva, J.G., Cabrera, R.V., Padron and C.A., Pardo. 1998.

Agrobacterium tumefaciens: A natural tool for plant transformation. EJB

Electronic J. of Biotech. 1 (3): 118-133.

Haldrup, A., S.G. Petersen, and F.T. Okkels. 1998. Positive selection: A plant

selection principle based on xylose isomerase, an enzyme used in the food

industry. Plant Cell Report 18: 76-81.

Hidayat , J.P. irianto., P. Ochsner dan IFSP. 2002. Informasi Singkat Benih P.

falcataria L. Nielsen. Direktorat Perbenihan Tanaman Kehutanan,

Bandung.

Nemoto, A. 2002. Farm Tree Planting and The Wood Industry In Indonesia: A

Study of Falcataria Plantations and The Falcataria Product Market in Java.

Policy Trend Report 2002: 42-51.

Park, Y.W.,Baba, K., Furuta, Y., Iida, I., Sameshima, K., Arai, M., Hayashi, T.

2004. “Enhanchement of Growth and Cellulose Accumulation by

Overexpression of Xyloglucanase in Poplar”. FEBS Letters 564 (2004) 183-

187.

Santoso, H.B. 1992. Budidaya Sengon. PT Kanisius (Anggota IKAPI),

Yogyakarta.

Siregar, E.B.M.S. 2002. Crop Improvement Via Genetic Engineering ( Perbaikan

Tanaman Via Rekayasa Genetika). Fakultas Pertanian Program Studi

Kehutanan Universitas Sumatera Utara, Medan.

Sudarmonowati, E., Hartati, S., Hartati, R., Park, Y.W., dan Hayashi, T.2005.

“Expression of Cellulase Gene in Paraserianthes falcataria.” Proceedings

of the 6 th International Wood Science Symposium LIPI-JSPS Core

University Program in The Field of Wood Science. August 29-31 2005.

388-394.

Tampubolon, C. 2007. Aplikasi Stek Pucuk, Kultur Jaringan, Induksi

Embriogenesis Somatik dan Analisis Isozim pada Program Bioteknologi

Sengon. Tugas Akhir. Program Diploma III Budidaya Hutan Tanaman

Fakultas Kehutanan. Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Gillies, A.C.M., Cornellius., J.P., Newton, A.C., Navaro, C., Hernandez, M. And

Wilson, J. 1997. Genetic variation in Costa Rica population of Tropical

timber species Cedrela odorata L. Assesed using RAPDs. Molec. ecol

6:1113-1115.

Wiebkie, B., Ferreira, F., Pasquali, G., Zanettini, MHB., Droste, A. 2006.

“Influence of antibiotic on embryogenic tissue and Agrobacterium

tumefaciens suppression in soybean genetic transformation.” Bragantia,

Campinas 65 (4): 543-551.

Yu, T.A., Yeh, S.D., Yang, J.S. 2001. “Effects of carbenisilin and cefotaxime on

callus growth and somatic embryogenesis from adventitious roots of

papaya”. Botanical Bulletin of Academia Sinica 42: 281-286.