TRANSFORMASI GEN

Ir. Makhziah, MP

UPN “Veteran” Jawa Timur

1

Transformasi GenMasuknya gen target (DNA rekombinan) ke dalam sel inang.

Proses Transfer Gen:a.Biologisb.Mekanisc.Kimia

2

3

A. TRANSFER GEN SECARA BIOLOGIS

Hasil cloning gen

dikonjugasi, antara: pBR322 + pGV 3850 (E. coli) (Agrobacterium)

Jenis Agrobacterium:1.Agrobacterium Tumefacient2.Agrobacterium Rhizogen

4

1. Agrobacterium tumefaciens (At)

Penyebab tumor “CROWN GALL”

sintesis asam amino “OPINE”

sumber carbon & nitrogen  

5

Nama Plasmid : Ti (Tumor inducing)

sifat : stabil dalam At. pada suhu < 30 C

Segmen Ti : Transfer DNA (T-DNA) Virulence (Vir) Konjugasi Replikasi plasmid

6

2. Agrobacterium Rhizogene (Ar)

Penyebab ” Hairy Root “

Nama Plasmid : Ri (Root Inducing)

Segmen : sama dg AtTransfer DNA (T-DNA) Virulence (Vir) Konjugasi Replikasi plasmid

7

MEKANISME TRANSFER DNA 

menginfeksi sel tanamanAgrobacterium Eksudate

Asetosyringone (AS) Induksi transkripsi gen-gen vir. Aktifasi: Gen vir. A Gen vir. G Gen vir. D “Single stranded nick” “ Gen vir. E Lepasnya single stranded “T-DNA”

Integrasi dalam sel tanaman

8

9

10

11

MEKANISME TRANSFER GEN MELALUI Ti PLASMID

12

IDENTIFIKASI TRANSFORMASI Plasmid dimasuki gen ketahanan antibiotik (selectable marker)  

misal: KANAMYCIN RESISTANCE

b. Analisis DNA 

PCR (Polymerase Chain Reaction)

13

B. SECARA MEKANIS a. Microinjection Cara : Immobilisasi : 1. Immobilisasi protoplas Polylisine 2. Holding Pipette mobilization  Efisiensi Transformasi tergantung :

Lokasi injeksiBentuk fisik DNAKonsentrasi DNA

14

TEKNIK MIKRO INJEKSI

15

Microinjection into the cell of a potato callus.

Using fine cannulae, DNA that codes for a fluorescent protein was inserted into onion cells. Two days after the injection, the green dye can be seen. The integration of the foreign DNA into the onion genome was successful

MIKRO INJEKSI pada KENTANG & BAWANG MERAH

16

b. Electroporation Listrik tegangan tinggi (± 2500 V) “Reversible Break-Down” membran protoplas DNA masuk ke protoplas Faktor-faktor yang mempengaruhi :1.Voltage2.Waktu3.Umur sel/jaringan4.Bagian tanaman

17

18

19

PROSES TRANSFER GEN CARA ELEKTROPORASI

20

PERALATAN ELEKTROPORASI

21

ELEKTROPORASI PADA JAGUNG

22

Particle BombardmentDigunakan untuk memasukkan DNA/ gen ke dalam tanaman yang sulit diregenerasikan dari protoplas Particle :Gold Coated DNA/GeneTungsten Yang digunakan gas : Helium

23

24

PERALATAN PARTICLE BOMBARDMENT

25

MEKANISME PENEMBAKAN GEN by PARTICLE BOMBARDMENT

26

PENEMBAKAN GEN PADA TANAMAN PISANG

27

The End