Tramadol hydrochloride (T) adalah sintetik 4-phenylpiperidine analog kodein, yang berisi dua kirai pusat dan dengan demikian memiliki empat stereoisomer. Trans-T, rasemat sebuah campuran 1R, 2R-T [(+) - Trans-T] dan 1S, 2S-T [(-) - Trans- T], adalah analgesik yang bekerja sentral dengan keberhasilan dan potensi berkisar antara opioid lemah dan morfin [1]. Tramadol menghasilkan analgesia dalam jangka pendek dan nyeri jangka panjang negara oleh sinergis menggabungkan lemah? -opioid dan monoaminergically. Mekanisme (noradrenalin dan serotonin) dimediasi [2]. Konsentrasi plasma terapeutik dalam kisaran 100-300 ng / ml [3]. Tramadol cepat dan hampir sepenuhnya diserap setelah pemberian oral dengan bioavailabilitas absolute hanya 65-70% karena metabolisme lintas pertama [4,5]. Ini analgesik cepat dan ekstensif dimetabolisme di hati.

Jalur metabolisme utama, O-dan N-desmethylation, melibatkan sitokrom P-450 isoenzim 2D6, 2B6 dan 3A4, masing-masing. Metabolit primer O-desmethyltramadol (M1) dan N-desmethyltramadol (M2) mungkin akan lebih dimetabolisme tiga metabolit sekunder tambahan yaitu, N, N-didesmethyltramadol (M3), N, N, O-tridesmethyltramadol(M4) dan N, O-didesmethyltramadol (M5). Pada tahap II, Odemethylated metabolit yang terkonjugasi dengan asam glukuronat dan asam sulfat sebelum ekskresi dalam urin. Dalam semua spesies, M1 dan M1 konjugat, M5 dan M5 konjugat dan M2 adalah metabolit utama, sedangkan M3, M4 dan M4 konjugat hanya dibentuk dalam jumlah kecil (kurang dari 1%) [6]. Hanya satu dari ini metabolit, O-desmethyltramadol (M1 metabolit), adalah farmakologi aktif. Kira-kira, 10-30% dari obat induk diekskresikan tidak berubah dalam urin.

HPLC) metode dengan ultraviolet [8-10], fluoresensi [11-13], elektrokimia [14] andMSdetection [15] telah dijelaskan untuk penentuan tramadol dan metabolit aktifnya (M1). Metode HPLC kiral [16-19] sangat penting bagi metabolit. Namun, metode analisis akiral masih berguna dalam beberapa studi farmakokinetik dan bioekivalensi serta investigasi forensik. Sejauh ini, hanya ada satu metode akiral penentuan simultan tramadol dan dua yang utama metabolit (M1 dan M2) dalam plasma manusia, yang juga dilakukan di lab kita sendiri

Untuk pengetahuan kita, tidak ada metode HPLC akiral divalidasi mampu kuantifikasi simultan tramadol dan tiga nya metabolit utama (M1, M2 dan M5) dalam plasma, urin atau air liur. Di antara metabolit ini, M2 dan M5 tidak farmakologi aktif. M5 metabolit dapat dibentuk baik oleh N-demetilasi M1 atau O-demethylation M2. Sebuah metabolic beralih mendukung peningkatan N-demetilasi T telah disarankan yang akibatnya dapat mempengaruhi konsentrasi M5 [21]. M5 sangat mirip dalam struktur dan lipofilisitas ke M1dan terdiri sebagian besar metabolit ini (sekitar 30%). Oleh karena itu, ketidakmampuan untuk memisahkan M5 menyebabkan kesalahan yang signifikan dalam pengukuran metabolit aktif (M1). Oleh karena itu, M5 - meskipun tidak aktif - adalah metabolit yang sangat penting dalam bioanalysis tramadol dan metabolitnya. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk meningkatkan kami sebelumnya.Metode HPLC diterbitkan untuk penentuan simultan tramadol dan tiga metabolit utama dalam plasma manusia. ItuMetode ini juga diuji dan dimodifikasi untuk digunakan dalam biologi lainnya sampel (urin dan air liur).

2.2. Persiapan larutan standar

Tramadol, M1, M2, M5and cis-tramadol dalam konsentrasi 1 mg / ml disiapkan secara terpisah dengan melarutkan 10 mg masing-masing senyawa dalam metanol. Solusi standar cis-tramadol (10? G / ml) dan (1? G / ml) untuk urine dan plasma / air liur yang sama disiapkan. Larutan standar dan stok semua senyawa disimpan pada 4 ° C. Semua saham dan standar solusi yang stabil selama 3 bulan pada suhu ini.

2.3. Aparatur dan kondisi kromatografi

Aparat kromatografi terdiri dari tekanan rendah pompa HPLC gradien, detektor fluoresensi [eksitasi panjang gelombang (Λex) 200 nm / panjang gelombang emisi (λem) 301 nm] dan sebuah degasser online, semua dari Knauer (Berlin, Jerman). A Rheodyne Model 7725i injektor dengan 100? L lingkaran itu yang digunakan. Data itu diperoleh dan diproses dengan cara Chrom- Gerbang kromatografi software (Knauer). Kromatografi Pemisahan dicapai oleh Kinerja ChromolithTM RP-18e 100mm × kolom 4.6mm (Merck, Darmastadt, Jerman) dilindungi oleh penjaga Cartridge ChromolithTM RP-18e 5mm x 4,6 mm. Untuk tahap mobile, campuran metanol: air (19:81, v / v) disesuaikan dengan pH 2,5 dengan fosfat asam (konsentrasi asam akhir dari sekitar 1,5 mM), disampaikan dalam mode isokratik pada laju alir 2 ml / menit.

2.4. Persiapan sampel

Persiapan sampel biologis adalah modifikasi.Metode kami dipublikasikan sebelumnya [20]. Kondisi terdiri pencampuran 120? l plasma dengan 50? l cis-tramadol sebagai intern standar (1? g / ml) dan 50? l NaOH (2N) dalam 2 ml Eppendorf tabung polypropylene dan kemudian penggalian dengan 1,25 ml etil asetat. Setelah agitasi vertikal (10 menit) dan sentrifugasi (10.000 × g, 2 menit), lapisan organik atas dipindahkan ke dalam tabung gelas berbentuk kerucut. Fase organik kemudian diuapkan di bawah aliran lembut udara dan dilarutkan dalam 120? L dari fase gerak. Untuk menerapkan ekstraksi untuk air liur, sampel pertama kali diencerkan dua kali dengan air suling, dan kemudian 100? L air liur diencerkan diekstraksi dan dilarutkan dalam 200? L fase gerak. Untuk sampel urin, 50? L urin langsung digunakan untuk ekstraksi dan dilarutkan dalam 2ml fase gerak. A 100? 1 aliquot dari masing-masing sampel kemudian disuntikkan ke HPLC sistem.

Abstrak

Tramadol, agen analgesik dan yang utama metabolitO-desmethyltramadol (M1), N desmethyltramadol(M2) dan O, N-didesmethyltramadol (M5) ini ditentukan secara bersamaan dalam plasmamanusia, air liur dan urin dengan cepat dan specificHPLCmethod. Preparationwas contoh sederhana, satu langkah, ekstraksi dengan etil asetat.Kromatografi pemisahan itu dicapai dengan kinerj ChromolithTM RP-18e 100 mm × 4. 6mm kolom, menggunakan campuran metanol: air (19:81,v/v) disesuaikan dengan pH 2.5 oleh asam fosfat,dalam mode isokratik pada laju alir dari 2 ml/min.

Fluoresensi deteksi (λex 200 nm/λem 301 nm)digunakan. Kurva kalibrasi yang linier (r2 mengatakan0.996) dalam rentang konsentrasi dalam plasma,air liur dan urin. Batas kuantifikasi adalah 2,5 ng/mluntuk semua senyawa. Kwalitas dalam dan antara haridalam pengukuranQC sampel pada empat konsentrasi yang diuji yangdapat diterima di semua cairan tubuh dianalisisdikembangkan prosedur diterapkan untuk menilaifarmakokinetik tramadol dan metabolit nya utamaberikut administrasi 100 mg oral dosis tunggaltramadol untuk sukarelawan sehat.