tkptteknik khusus

8/18/2019 tkptteknik khusus

1/10

Berkala PENELITIAN AGRONOMI Oktober 2012

Vol. 1 No. 2 Hal. 164-17 3

ISSN: 2089-9858

® PS AGRONOMI PPsUNHALU

164

ANALISIS VARIASI GENETIK JAMBU METE ( ANACARDIUM OCCIDENTALE L.)

ASAL SULAWESI TENGGARA MENGGUNAKAN MARKA MOLEKULER AFLP

( Amplified Fragment Length Polimorphism)

Genetic Variation Analysis of Cashew Trees ( Anacardium occidentale L.)

in Southeast Sulawesi using AFLP

( Amplified Fragment Length Polymorphism)

Oleh:

Richael Syam1)

, Gusti Ray Sadimantara2*)

, dan Muzuni2)

.1)

Alumni S1 Agronomi Fakultas Pertanian Universitas Haluoleo2)

Dosen Fakultas Pertanian Universitas Haluoleo*) Alamat surat-menyurat: [email protected]

ABSTRACT. The research was done to study the presence of genetic variation of cashew ( Anacardium occidentale

L.) of four regencies of Southeast Sulawesi, i.e. Buton, Muna, Bombana and South Konawe regencies. The study

was conducted in 2 places; i.e. in The Genetic Laboratory, Biology Department, Mathematics and Science Faculty

of Haluoleo University for the DNA Isolation and in The Molecular Biology Laboratory of and Plant Cellular,

Research Centre for Biotechnological Resources and Biotechnology (PPSHB) Bogor Agricultural University for AFLP

stage. The research was conducted from November 2011 to June 2012. The research was conducted the first step

for searching of excellent cashew by observing genetic variation using AFLP ( Amplified Fragment Length

Polymorphism) technique. The research was started by doing isolation of cashew genome, cutting DNA with two

restriction enzymes (EcoRl dan Mse1), amplification selectively using four selective primer combinations, and

doing amplicon on gel electrophoresis poliacrylamid. Total strand obtained was 322. Percentage average of

polymorphisms obtained was 70,21% of four primer combinations showed the presence of genetic variation in

each sample. Dendrogram analysis showed that there were two groups; first group consisted of the cashew from

Buton, Muna and Bombana regencies and the second group was South Konawe regency that had a differencecompared with three other samples, i.e Buton, Muna and Bombana regencies.

Key words: Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), cashew tree, polymorphisms

ABSTRAK. Penelitian dilakukan untuk mempelajari adanya variasi genetik pada jambu mete ( Anacardium

occidentale L) yang berasal dari empat kabupaten di Sulawesi Tenggara yaitu : Kabupaten Buton, Kabupaten

Muna, Kabupaten Bombana dan Kabupaten Konawe Selatan. Penelitian dilaksanakan di dua tempat yakni di

Laboratorium Genetika Jurusan Biologi Fakultas MIPA, Universitas Haluoleo untuk tahapan Isolasi DNA dan

Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman, Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi

(PPSHB) Institut Pertanian Bogor untuk tahapan AFLP. Penelitian dilakukan mulai bulan November 2011 sampai

dengan bulan Juli 2012. Penelitian dilakukan sebagai langkah awal pencarian jambu mete unggul dengan melihat

variasi genetik menggunakan teknik AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism). Penelitian diawali dengan

mengisolasi genom jambu mete, memotong DNA dengan dua enzim restriksi (EcoRI dan MseI), mengamplifikasi

secara selektif dengan 4 kombinasi primer selektif, dan menjalankan amplikon pada elektroforesis gel

poliakrilamid. Jumlah pita yang didapatkan berjumlah 322 pita. Rata–rata persentase polimorfisme yang diperoleh

adalah 70,21% dari 4 kombinasi primer yang menunjukkan adanya variasi genetik pada setiap sampel. Hasil

dendrogram menunjukkan bahwa terdapat dua kelompok yaitu kelompok pertama terdiri dari sampel Kabupaten Buton,

Kabupaten Muna dan Kabupaten Bombana dan kelompok kedua yaitu Kabupaten Konawe Selatan. Jambu mete asal

Kabupaten Konawe Selatan memiliki perbedaan dibandingkan dengan ketiga sampel lainnya yaitu Kabupaten Buton,

Kabupaten Muna dan Kabupaten Bombana.

Kata kunci : Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), jambu mete, polimorfisme

PENDAHULUAN

Jambu mete ( Anacardium occidentale L.)

berasal dari Brasilia Tenggara, pertama kali dibawa

oleh pelaut Portugis ke Kepulauan Nusantara mela-

lui Malabar, India pada abad ke-15 dengan demi-

kian jambu mete telah lama dikenal di Indonesia,

namun belum dibudidayakan dengan baik. Pada


2/10

Berkala PENELITIAN AGRONOMI Oktober 2012 Vol. 1 No. 2 Hal. 164-173 ISSN: 2089-9858 ® PS AGRONOMI PPsUNHALU

Richael Syam et al ., 2012. Analisis Variasi Genetik Tanaman Jambu Mete ……………………………………………. 165

umumnya (98%) jambu mete diusahakan oleh

petani secara tercampur dengan tanaman industri

dan tanaman buah-buahan lain dan hanya sebagian

kecil saja (2 %) yang diusahakan oleh perkebunan

negara dan perkebunan besar swasta (Kemal,

2000).Jambu mete merupakan komoditas perke-

bunan yang strategis, karena tanaman ini merupa-

kan komoditas ekspor, yang mempunyai prospek

pasar dalam negeri dan dapat meningkatkan pen-

dapatan petani terutama di lahan-lahan marginal

yang banyak terdapat di Kawasan Timur Indonesia

seperti Sulawesi Tenggara, Sulawesi Selatan, NTB,

NTT, Maluku dan Bali (Zaubir dan Suryadi, 2003).

Biji jambu mete mempunyai nilai ekonomi

yang cukup baik, demikian pula cairan yang terkan-

dung dalam kulit biji yang disebut CNSL (Cashew

Nut Sheel Liquid ) merupakan bahan ekspor nontradisional, sedangkan limbah yang diperoleh dari

olahan cairan kulit biji merupakan bahan campuran

pembuatan hardboard . Buah semunya dapat dibuat

anggur dan sari buah. Kacang mete mengandung

protein rata-rata 19 % dan lemak rata-rata 47 %,

sedangkan sari buahnya mengandung vitamin A, B,

dan C. Kandungan vitamin C ini 3 - 4 kali lipat dari

kandungan sari buah jeruk (Van Eijnatten, 2011).

Komoditas jambu mete sebagai komoditas

perkebunan rakyat di daerah Sulawesi Tenggara

memiliki potensi yang besar untuk dikembangkan.

Nilai ekonomis komoditas jambu mete di SulawesiTenggara dapat terlihat dari nilai dan volume per-

dagangan antar pulau pada tahun 2002 dalam

bentuk gelondongan sebesar 2.157,40 ton dengan

nilai mencapai Rp. 8.689.410.000 sedangkan dalam

bentuk kacang sebesar 26 ton, dengan nilai Rp.

49.000.000.000 dan ekspor gelondongan mencapai

5.375.700.000,- dengan volume sebesar 102 ton

(BPMD Sultra, 2010).

Dalam bidang pemuliaan tanaman, pe-

manfaatan jambu mete hingga saat ini masih ter-

batas pada seleksi dan uji lapangan dengan meng-

gunakan karakter morfologi dalam mendeskripsikan

tanaman. Karakter morfologi telah banyak dipergu-

nakan, namun karakter morfologi memiliki kendala

yaitu adanya faktor lingkungan sehingga perbedaan

antar spesies berkerabat dekat seringkali sulit di-

amati. Kebanyakan karakter sulit dianalisis karena

tidak memiliki sistem pengendalian genetik yang

sederhana. Oleh karena itu, diperlukan adanya ana-

lisis molekuler. Teknik molekuler memberikan pe-

luang untuk mengembangkan dan mengidentifikasi

peta genetik dari suatu kultivar jambu mete. Pende-

katan genetika molekuler dengan menggunakan

penanda DNA telah berhasil membentuk penanda

molekuler yang mampu mendeteksi gen dan sifat-

sifat tertentu dan mengevaluasi keragaman dan

evolusi pada tingkat genetik. Beberapa teknik

penanda DNA tersebut adalah Random Amplified

Polymorphic DNA (RAPD), Restriction Fragment

Length Polymorphism (RFLP), Amplified Fragment

Length Polymorphism (AFLP), Simple Sequence

Repeat (SSR), Mikrosatelit (Hoon-Lim et al., 1999).Pemakaian penanda molekuler berdasar-

kan pola pita DNA telah banyak digunakan untuk

menyusun kekerabatan beberapa individu dalam

spesies maupun kekerabatan antar spesies. Penggu-

naan kekerabatan dapat dijadikan rujukan dalam

pemuliaan persilangan untuk mendapatkan keane-

karagaman yang tinggi dari hasil persilangan. Peng-

gunaan penanda DNA dapat membantu pelaksa-

naan pemilihan tetua persilangan yang memiliki

perbedaan tinggi secara genetik (Correa et al.,

1999).

Variasi genetik jambu mete dilihat daripolimorfisme yang digambarkan dengan perbedaan

pola pita yang dipisahkan berdasarkan ukuran berat

molekul. Polimorfisme adalah variasi alel pada lokus

DNA tertentu dari suatu populasi. Data polimor-

fisme dapat digunakan untuk melihat variasi genetik

pada populasi jambu mete. Variasi tersebut di-

harapkan terekspresi sampai tingkat fenotip jambu

mete. Salah satu teknik untuk mendeteksi adanya

variasi genetik adalah AFLP ( Amplified Fragment

Length Polymorphism). Prinsip dasar teknik AFLP

adalah mendeteksi perbedaan letak marka DNA di

seluruh genom yang berupa urutan basa tertentu.Deteksi marka DNA tersebut dilakukan dengan

amplifikasi secara selektif terhadap fragmen hasil

digesti dua enzim restriksi. Enzim restriksi yang

digunakan antara lain adalah EcoR1 (GAATTC) dan

Mse1 (TTAA). Amplifikasi dilakukan dengan primer

selektif yang terdapat tambahan tiga basa pada

ujung 3’. Primer dibagi menjadi dua, yaitu primer

dengan ujung pemotongan EcoRI dan primer untuk

ujung pemotongan MseI. Variasi genetik ditentukan

dengan 4 kombinasi primer yang berasal dari ujung

EcoRI dan MseI. Hasil amplifikasi selektif adalah

pita-pita DNA dengan berbagai ukuran yang dipi-

sahkan oleh elektroforesis gel poliakrilamida. Anali-

sis dilakukan untuk melihat jumlah dan keberadaan

pita-pita yang mampu menunjukkan variasi genetik

(Saunders, 2001).

Keunggulan teknik AFLP adalah dapat men-

deteksi variasi genetik tanpa memerlukan informasi

urutan basa genom. Selain itu, teknik AFLP memiliki

tingkat reproduksi yang tinggi berdasarkan ampli-

fikasi selektif fragmen hasil digesti genom (Mueller

dan Wolfenbarger, 1999). Teknik AFLP mampu

menganalisis genom secara menyeluruh sehingga

dihasilkan informasi yang memadai untuk mengana-

lisis variasi genetik (Mba dan Tohme, 2005).


3/10



Data hasil penelitian variasi genetik jambu

mete diharapkan dapat menunjukkan perbedaan

genetik jambu mete dan ekspresinya pada perbe-

daan karakter fenotip. Perbedaan genetik tersebut

dapat digunakan sebagai data awal untuk meleng-

kapi penelitian terhadap jambu mete yang lebihkompleks.

Berdasarkan uraian di atas, maka peneli-

tian ini dilakukan untuk mempelajari variasi genetik

jambu mete yang ditanam pada empat lokasi yang

berbeda di Sulawesi Tenggara menggunakan marka

molekuler AFLP.

BAHAN DAN METODE

Penelitian ini dilakukan di dua tempat

yaitu di Laboratorium Genetika Jurusan Biologi

Fakultas MIPA, Universitas Haluoleo untuk tahapanIsolasi DNA dan di Laboratorium Biologi Molekuler

dan Seluler Tanaman, Pusat Penelitian Sumber

Daya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) Institut

Pertanian Bogor untuk tahapan AFLP. Adapun

waktu penelitian ini dilakukan mulai bulan Novem-

ber 2011 sampai dengan bulan Juli 2012. Bahan

penelitian adalah daun muda jambu mete yang

diperoleh dari 4 lokasi yang berbeda di wilayah

Sulawesi Tenggara yaitu: di Kabupaten Muna,

Bombana, Buton, dan Konawe Selatan.

Bahan-bahan digunakan untuk isolasi DNA

dan elektroforesis gel agarosa antara lain buffer TE(Tris HCL : EDTA), buffer ekstraksi (CTAB 2 % ; EDTA

0,02 M pH 8,0 ; Tris HCl 0,1 M pH 8,0 ;NaCl 1,26 M;

H20 steril; PVP 3 %), kloroform isoamil (24 : 1),

nitrogen cair, etanol absolut, sodium asetat, enzim

RNase, agarosa, buffer TBE 0,5 x, etidium bromida

dan loading buffer. Bahan yang digunakan untuk

proses AFLP adalah enzim EcoRI dan MseI, 10 mM

ATP, 5 x RL-Buffer, 1 unit T4 DNA ligase, Milliq H 20,

5 mM dNTPs, 10 x super buffer, buffer TE, Taq-

polymerase (5 unit/µl), 5 Primer masing–masing

adalah P11-700 (GAC TGC GTA CAT GCA GAA), M48

(GAT GAG TCC TGA GTA AAC AC ), M49 (GAT GAG

TCC TGA GTA AAC AG), M50 (GAT GAG TCC TGA

GTA AAC AT ), M51 (GAT GAG TCC TGA GTA AAC

CA), masing-masing dengan kombinasi yaitu P11-

700 dengan M48, P11-700 dengan M49, P11-700

dengan M50, dan P11-700 dengan M51. Bahan

yang digunakan untuk elektroforesis gel poliakri-

lamid adalah loading buffer formamide (98% for-

mamide, 10 mM EDTA pH 8,0 dan 0,1% bromo-

phenol) gel poliakrilamid (50% long ranger, sanver-

tech), urea 40 g, etanol absolute, asam asetat

glacial, bind silane, repel silane, H2O, buffer TBE 10

x, ammonium persulfat 1,6% dan TEMED.

Alat yang digunakan adalah termos es,

pipet mikro 0,1 -2 µl, 2-20 µl, 20-200 µl, 100-1.000

µl, tip 10 µl ,100 µl, 1.000 µl, freezer-20o

C, lemari

pendingin 4o

C, mesin PCR, eppendorf 0,5 ml, 1,5

ml, dan 2,0 ml, pompa vakum, rak tabung, mesin

sentrifugasi, timbangan, vorteks, inkubator, water-

bath, oven, spatula, perangkat elektroforesis, dan

lumpang. Alat gelas yang digunakan adalah gelasukur, labu erlenmeyer, dan tabung penyimpanan

bahan serta peralatan gelas yang umum digunakan

di laboratorium.

Sampel yang digunakan berasal dari daun

jambu mete dari empat lokasi yang berbeda.

Adapun keempat lokasi pengambilan sampel, yaitu:

(a) Desa Bombana Wulu, Kec. Gu Kab. Buton, (b)

Desa Rarontole, Kec. Kabaena Kab. Bombana, (c)

Desa Wapunto Kec. Duruka Kab. Muna, dan (d)

Kebun Penelitian Onembute, Kab. Konawe Selatan.

Pengambilan sampel dilakukan secara acak dengan

mengambil daun yang masih muda atau pada pucukpertama. Sampel daun yang telah dipilih kemudian

dimasukkan dalam termos es untuk sementara

waktu sebelum dimasukkan dalam freezer.

DNA jambu mete diekstraksi dari bagian

daunnya dengan menggunakan metode CTAB

(cetyltrimetyl ammonium bromide). Sebelum dilaku-

kan ekstraksi, terlebih dahulu disiapkan buffer eks-

traksi, yang kebutuhannya tergantung dari jumlah

sampel yang akan diekstraksi. Sampel yang akan

diekstraksi di timbang (0,15 mg), lalu dipotong kecil-

kecil, digerus menggunakan lumpang dengan ban-

tuan nitrogen cair, dimasukkan dalam tabungeppendorf dan ditambahkan 1,5 ml buffer ekstraksi

divortex dan dipanaskan pada waterbath selama 30

menit pada suhu 650

C (setiap 5 menit sekali di-

keluarkan dan dibolak-balik) lalu disentrifuse pada

10.000 rpm selama 10 menit, suhu 4o

C, mengambil

supernatan lalu dimasukkan dalam eppendorf baru

dan ditambahkan 1 x volume kloroform isoamil

untuk melarutkan senyawa-senyawa organik.

Selanjutnya disentrifuse lagi pada 10.000

rpm selama 10 menit, suhu 4o

C, kemudian super-

natan diambil dan ditambahkan 1 x volume sodium

asetat dan 2 x volume etanol absolut dingin lalu

diendapkan selama 2 jam dalam freezer. Setelah

pengendapan kemudian disentrifuse lagi pada


C, kemudian

supernatan dibuang dan mengambil endapannya

yang berada pada bagian bawah. Selanjutnya

endapan tersebut ditambahkan dengan 500 μl

ethanol 70% untuk membersihkan dari sodium

asetat, dikocok sebentar lalu disentrifuse lagi pada


C lalu

endapannya diambil dengan membuang cairan

bagian atasnya kemudian dikeringkan pada suhu

37o

C di oven selama 20 menit hingga kering

kemudian ditambahkan 20-30 μl H2O, kocok hingga

larut dan selanjutnya larutan DNA disimpan pada di


4/10



freezer pada suhu -20o

C. Selanjutnya larutan DNA

ditambahkan enzim RNase hingga konsentrasi 100

μg/ml lalu diinkubasi pada suhu 37o

C selama 1 jam.

Selanjutnya larutan ditambahkan dengan 500 μl

buffer TE, dikocok lalu ditambahkan kloroform

isoamil alkohol (24 : 1).Larutan dihomogenkan dengan vorteks,

kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 11.000

rpm selama 10 menit. Cairan bagian atas kemudian

dipindahkan pada tabung baru. Sempel kemudian

ditambahkan 0,1 volume sodium asetat 3 M, pH 5,2

dan 2 volume etanol absolut. Tabung dibolak balik

perlahan lahan kemudian diinkubasi pada suhu -20o

C selama 30 menit. Pelet dikeringkan dengan

vakum selama 15 menit. Setelah pelet kering

kemudian ditambahkan buffer TE sebanyak 20-30

µl, tabung dipanaskan pada suhu 50o

C dengan

heatblock sampai pelet larut.Hasil isolasi DNA diuji dengan elektrofore-

sis gel agarosa 0,8 % menurut Sambrook dan

Russell (2001). Langkah pertama elektroforesis gel

agarosa adalah bahan agarosa ditimbang sebanyak

0,2 g dan dilarutkan dengan buffer TBE 0,5 x

sebanyak 25 ml di dalam labu erlenmeyer. Larutan

agarosa kemudian dipanaskan selama 30 detik. Gel

agarosa didiamkan pada suhu ruang selama 1 jam.

Gel agarosa yang telah dibekukan selama 1

jam siap untuk digunakan. Gel agarosa diletakkan

pada chamber elektroforesis yang telah diisi

dengan running buffer TBE 0,5 x. Loading buffersebanyak 1 µl dicampur dengan akuabides seba-

nyak 3 µl dan sampel sebanyak 2 µl. Percampuran

dilakukan diatas kertas parafilm. Campuran terse-

but kemudian dimasukkan kedalam sumur pada gel

agarosa. Marka yang digunakan adalah marka DNA

phage ʎ sebanyak 10 ng dan 30 ng. Elektroforesis

dilakukan dengan voltase 100 volt selama 20 menit.

Hasil elektroforesis kemudian dilihat di bawah sinar

ultraviolet.

Hasil positif gel agarosa adalah munculnya

pita yang berpendar jika gel dilihat di bawah sinar

ultraviolet. Hasil negatif elektroforesis gel agarosa

adalah tidak adanya pita yang berpendar jika gel

agarosa dilihat di bawah sinar UV. Ketebalan dan

intensitas pita DNA sampel dibandingkan dengan

marka DNA phage ʎ yang telah diketahui konsen-

trasinya. Hasil isolasi DNA jambu mete yang dida-

patkan disimpan pada suhu 4o

C, dan dapat digu-

nakan untuk aplikasi selanjutnya.

Digesti genom dilakukan menurut invitro-

gen (2003), digesti genom dilakukan dengan meng-

gunakan enzim restriksi EcoRI/MseI. Sampel genom

(500 ng dalam 5 µl), enzim EcoRI/MseI (0,5 µl), 5 x

RL-buffer (10 µl), dan milliqH2O (30 µl) sampai

volume 50 µl dicampurkan di dalam tabung

eppendorf 1,5 ml. Campuran kemudian dicampur

secara perlahan dan disentrifugasi singkat untuk

menurunkan seluruh cairan dalam tabung. Sampel

diinkubasi dalam inkubator selama 2 jam dengan

suhu 37o

C. Inkubasi sampel selama 15 menit pada

suhu 70oC dilakukan untuk menginaktivasi enzim.

Tabung diletakkan dalam kotak es sampai tahapselanjutnya

Ligasi adapter dilakukan menurut invitro-

gen (2003). Sampel yang telah didigesti ditambah-

kan larutan ligase adapter (2 µl), enzim T4 DNA

ligase (1 µl), 10 mM ATP, sampel dicampurkan

perlahan, disentrifugasi, kemudian diinkubasi pada

suhu 20o

C ± 2o

C selama 2 jam. Sampel diencerkan

10 kali dengan mengambil 10 µl sampel kemudian

dipindahkan ke tabung eppendorf 1,5 ml dan dila-

rutkan dengan 90 µl buffer TE. Sisa sampel disimpan

pada suhu -20o

C.

Preamplifikasi dilakukan menurut invitro-gen (2003) dengan modifikasi yaitu penambahan 5

mM dNTP. Preamplifikasi dilakukan dengan cara

mencampurkan sampel DNA (5 µl), pre-amp primer

mix (26 µl), 10 x super buffer (2 µl), 5 mM dNTP

sebanyak 0,8 µl, dan enzim Taq-polymerase (5

unit/µl) sebanyak 0,08 µl didalam tabung eppendorf

200 µl. Larutan dicampur secara perlahan. Sampel

dimasukkan ke dalam mesin PCR dengan 24 siklus

seperti 94o

C selama 30 detik, 56o

C selama 30 detik,

dan 72o

C selama 60 detik dengan temperatur akhir

4o

C. Hasil preamplifikasi disimpan pada suhu 20o

C

di freezer. Sebelum digunakan sebagai cetakanpada amplifikasi selektif, hasil preamplifikasi dien-

cerkan dengan milliqH2O.

Amplifikasi selektif dilakukan menurut in-

vitrogen (2003). Langkah yang dilakukan adalah

membuat campuran dengan komposisi primer EcoRI

sebanyak 0,5 µl dan primer MseI sebanyak 0,3 µl, 5

mM dNTPs (0,4 µl), 10 x super buffer (1,0 µl), milliq

H2O sebanyak 2,8 µl, dan enzim Taq-polymerase 5

unit/µl sebanyak 0,04 µl. Reaksi amplifikasi dilaku-

kan pada tabung mikrosentrifugasi 200 µl dengan

komposisi DNA sampel hasil preamplifikasi yang

telah diencerkan dan komposisi campuran. Larutan

dicampur perlahan. Amplifikasi dilakukan dengan

menggunakan mesin PCR. Program yang digunakan

adalah sebagai berikut: Satu siklus 94o

C selama 30

detik, 65o

C selama 30 detik (penurunan 0,7 0

C

setiap siklus hingga mencapai 56 0

C) dan 72o

C

selama 60 detik untuk 12 siklus dan sisa 24 siklus

dilakukan dengan suhu 94o

C selama 30 detik, suhu

56o

C selama 30 detik, dan suhu 72oC selama 60

detik dan diakhiri dengan suhu 10o

C.

Hasil amplifikasi selektif kemudian dianali-

sis dengan menggunakan elektroforesis gel poliakri-

lamid menurut Sambrook dan Russell (2001). Lang-

kah pertama adalah menyiapkan alat pencetak gel.

Alat–alat pencetak gel terdiri atas dua buah


5/10



lempeng kaca, dua buah pemisah, dan dua buah

penjepit kaca. Gel poliakrilamid 6% dapat dibuat

dengan cara mencampurkan 13,3 ml polyacrilamide

gel 45% (29 : 1), 41,4 ml H2O, 10 x TBE 10 ml, dan

urea 40 g. Larutan diinkubasi pada suhu 55o

C

sampai seluruh urea larut. Ammonium persulfate1,6% sebanyak 3,3 ml dan TEMED sebanyak 50 µl

ditambahkan pada larutan gel dan diaduk selama 5

menit.

Pencetak gel disiapkan dengan cara, kaca

panjang diberi campuran larutan bind silane, etanol

absolut, asam asetat glasial sebanyak 1 ml dan

disebar merata pada permukaan kaca dengan

menggunakan tisu. Setelah 5 menit kaca diberi

etanol absolut sebanyak 2 ml dan dilap dengan tisu.

Pencucian dengan etanol dilakukan sebanyak 3 kali.

Kaca pendek yang terhubung dengan tangki buffer

diberi repel silane sebanyak 2 ml dan disebarmerata pada seluruh permukaan kaca dengan tisu.

Setelah 10 menit, kaca diberi H2O dan dilap dengan

tisu.

Pencetak gel dirancang dengan cara, mele-

takkan pemisah setebal 0,4 mm diletakkan diatas

kaca pendek. Kaca panjang diletakkan diatas kaca

pendek dan pemisah. Kedua lempeng kaca kemu-

dian dijepit dengan penjepit pada kedua sisi,

kemudian bagian bawah kaca ditahan dengan

menggunakan karet silikon. Pencetak gel diletakkan

secara horizontal. Campuran gel dimasukkan ke

pencetak gel dengan menggunakan syringe 60 ml.

Gel kemudian didiamkan selama 30-60 menit.

Sharktooth comb diangkat secara perlahan ketika

gel sudah mengeras dan bagian comb yang tajam

dimasukkan ke dalam gel 1 mm, sehingga terbentukwell yang rata.

Gel diletakkan pada tangki elektroforesis.

Penampungan buffer atas diisi dengan 500 ml

buffer 1 x TBE, sedangkan penampungan buffer

bawah diisi dengan 350 ml buffer 1 x TBE. Sampel

DNA dicampur dengan loading buffer formamide

(20 µl). Sampel didenaturasi pada suhu 94o

C selama

lima menit kemudian langsung diletakkan. Sampel

dimasukkan ke dalam well dengan tips dan mikro-

pipet sebanyak 3µl. Elektroforesis dilakukan selama

3 jam 40 menit dengan daya 40 W. Setelah elek-

troforesis selesai, buffer dipindahkan dari tempatpenampungan. Pemisah dan kedua kaca dilepaskan

lalu gel menempel pada kaca panjang.

Analisis pita AFLP dilakukan dengan membe-

rikan angka 1 untuk keberadaan pita dan angka 0

untuk tidak adanya pita pada tabel data biner.

Jumlah seluruh pita dan baris yang mengandung

pita polimorfisme dihitung, kemudian persentase

polimorfisme dihitung berdasarkan rumus sebagai

berikut (Chen et al., 2004).

pita seluruhdenganbaris Polymorfis pitadenganbaris sme Polymorphi Persentase

_ _ _ _ _ _ _(%) _

Pita polimorfis adalah pita yang tidak ter-

dapat pada seluruh sampel sedangkan pita umum

adalah pita yang terdapat pada seluruh sampel.

Interpretasi pita dilakukan untuk mempermudah

dalam melihat lokasi pita-pita spesifik. Data binari

seluruh primer yang mengandung pita polimorfis

dimasukkan ke dalam program SPSS (Statistical

Package for Social Science) versi 15.0 metode

Complete Linkage fungsi Phi (1,0). Analisis data

biner menghasilkan gambar dendogram.

HASIL

Keterangan :

M1. Marker DNA phage λ (10 ng)

M2. Marker DNA phage λ (30 ng)

A. Kab. Konsel (60 ng/µl)

B. Kab. Bombana (20 ng/µl)

C. Kab. Muna (20 ng/µl)

D. Kab. Buton (5 ng/µl)

Gambar 4. Hasil isolasi DNA Genom Jambu Mete


6/10



bp A B C D

Gambar 5. Hasil pita AFLP dan rekaannya 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

Keterangan: A, B, C, D = Buton, Muna, Bombana, Konsel; M1, M2 = Marker 1, Marker 2; Kombinasi P11 – 700 dan M48, B. Kombinasi

P11 – 700 dan M49, C. Kombinasi P11 – 700 dan M50, D. Kombinasi P11 – 700 dan M51

PEMBAHASAN

Genom jambu mete diisolasi dari daun

jambu yang diambil dari daun muda. Genom meru-

pakan seluruh materi DNA pada suatu organisme.

Isolasi genom dilakukan dengan metode Bosquet

(1990). Isolasi genom menggunakan buffer eks-

traksi yang mengandung CTAB, merupakan deter-

gen yang dapat melisis membran sel dan mampumengendapkan polisakarida serta senyawa fenolik

yang terdapat pada tanaman jambu mete. Kemam-

puan CTAB mengendapkan polisakarida dan se-

nyawa fenolik dipengaruhi oleh konsentrasi garam.

Jika konsentrasi garam pada buffer lebih dari 0,5 M

maka CTAB dapat mengendapkan polisakarida dan

senyawa fenolik serta membentuk kompleks

dengan DNA. Konsentrasi garam yang digunakan

pada isolasi genom jambu mete adalah 1,26 M

sehingga polisakarida dan senyawa fenolik pada

jambu mete dapat diendapkan (Moore dan

Dowhan, 2002).Genom jambu mete dimurnikan dengan

senyawa kloroform isoamilalkohol (24:1) untuk

mengekstrasi protein dan RNase untuk melisiskan

RNA. Isopropanol atau etanol absolut dapat digu-

nakan untuk mengendapkan DNA dan etanol 70 %

untuk memisahkan genom dari garam-garam mine-

ral, serta melarutkan sisa CTAB. Pemurnian terse-

but bertujuan menghilangkan senyawa-senyawa

yang dapat menghambat reaksi enzimatis pada

proses AFLP (Weising et al., 1995).

Menurut Weising et al . (1995), konsentrasi

DNA dapat dihitung dengan membandingkanintensitas terang pita dan ketebalan pita DNA pada

gel agarosa dengan pita DNA pada marka DNA yang

telah diketahui konsentrasinya. Pita DNA sampel

jambu mete dibandingkan dengan pita DNA phage

λ.

Menurut Moore dan Dowhan (2002), jum-

lah total DNA yang diperoleh dapat diperbanyak

dengan menaikkan konsentrasi NaCl pada buffer

ekstraksi dan memodifikasi suhu serta waktu dalam

tahap presipitasi DNA dengan etanol absolut.

Hasil isolasi DNA yang diperoleh menunjukkan bahwa sampel jambu mete asal Kab. Konsel

memiliki konsentrasi DNA yang tertinggi (120 ng/µl)

dan jambu mete asal Kab. Buton (10 ng/µl) memiliki

konsentrasi DNA yang terendah. Tinggi dan rendah-

nya konsentrasi DNA yang diperoleh, hal ini mung-

kin disebabkan oleh maksimum tidaknya kerja

buffer ekstrasksi yang digunakan dalam melisis

dinding sel, komposisi dinding sel, proses pengge-

rusan dll. Konsentrasi DNA yang tinggi dapat meng-

indikasikan bahwa jumlah pita-pita DNA yang di-

hasilkan nantinya pada proses AFLP akan semakin

banyak. Adapun isolasi DNA dilakukan untuk me-mastikan ada tidaknya DNA yang diperoleh sebelum

dilakukan proses AFLP.

Pita–pita DNA dari seluruh primer diter-

jemahkan ke dalam bentuk data biner yaitu dengan

memberi angaka 1 bila terdapat pita dan angka 0

bila tidak terdapat pita. Berdasarkan data biner

tersebut, jumlah seluruh pita dihitung. Ukuran pita

AFLP yang diperoleh berkisar antara 50-700 pb

dengan berbagai ukuran menunjukkan bahwa

proses digesti dengan enzim restriksi, ligasi adapter,

preamplifikasi dan amplifikasi selektif telah berhasil

dilakukan.Teknik AFLP dapat mendeteksi polimor-

fisme pada sampel jambu mete dengan mengana-

460 bp

350 bp

100 bp

145 bp

225 p

50 bp

565 bp


7/10



lisis seluruh genom. Menurut Omoto dan Lurquin

(2004), polimorfisme yang dihasilkan menunjukkan

adanya perbedaan letak marka AFLP (urutan basa

pengenalan enzim restriksi EcoRI dan MseI dan

primer selektif) sehingga dapat diperoleh perbeda-

an informasi genetik pada setiap sampel. Perbe-daan ukuran fragmen DNA menghasilkan suatu pola

pita DNA tertentu. Teknik AFLP diawali dengan

memotong genom jambu mete dengan enzim EcoRI

dan MseI. Jambu mete termasuk organisme euka-

riot yang memiliki basa adenin dan timin yang lebih

tinggi daripada basa guanin dan sitosin. Analisis

AFLP dengan enzim EcoRI dan MseI bertujuan agar

polimorfisme yang didapatkan lebih rinci karena

komposisi basa adenin dan timin pada kedua enzim

(EcoRI dan MseI) lebih tinggi daripada basa guanin

dan sitosin (Vos et al., 1995).

Fragmen hasil digesti kemudian diligasidengan adapter secara simultan. Adapter merupa-

kan DNA untai ganda yang memiliki panjang sekitar

20 pb. Terdapat dua jenis adapter yaitu adapter

ujung pemotongan EcoRI dengan kelebihan basa

AATT pada ujung 5’ dan ujung pemotongan MseI

dengan kelebihan basa TA pada ujung 5’. Proses

ligasi dilakukan dengan bantuan enzim T4 DNA

ligase yaitu membentuk ikatan fosfodiester antara

ujung 5’ (ujung fosfat) dan ujung 3’ (ujung OH) pada

untai DNA (Struhl, 1993). Adapter berfungsi menya-

makan dua ujung pragmen hasil digesti dan sebagai

tempat menempelnya primer untuk proses amplifi-kasi selanjutnya. Hasil positif ligasi dapat dilihat

pada akhir proses AFLP karena urutan basa pada

primer sehingga bila proses ligasi gagal maka proses

amplifikasi tidak akan berjalan (Saunders et al.,

2001).

Fragmen hasil ligasi kemudian diamplifikasi

dengan teknik PCR. Amplifikasi pada AFLP dibagi

menjadi dua tahap yaitu preamplifikasi dan ampli-

fikasi selektif. Preamplifikasi dilakukan dengan pri-

mer selektif yaitu P11 - 700, M48, M49, M50, dan

M51.

Menurut Vos et al . (1995), preamplifikasi

bertujuan mengurangi kompleksitas fragmen hasil

digesti, sehingga tidak terjadi kesalahan penempe-

lan primer pada amplifikasi selektif dan mengurangi

hasil pita smear pada elektroforesis gel poliakri-

lamid.

Amplifikasi selektif dilakukan dengan pri-

mer selektif yang memiliki tambahan 3 basa pada

ujung 3’. Primer selektif adalah primer yang ber-

fungsi menyeleksi fragmen hasil digesti dengan

adanya basa–basa selektif pada ujung 3’. Kombinasi

primer digunakan untuk melihat polimorfisme (pola

pita) secara lengkap. Masing–masing primer memi-

liki komposisi basa–basa primer selektif. Basa-basa

selektif pada primer melekat pada fragmen hasil

digesti yang memiliki basa–basa berkomplemen.

Perbedaan basa–basa selektif pada setiap primer

mengakibatkan perbedaan amplifikasi fragmen,

sehingga menghasilkan perbedaan pita berdasar-

kan ukuran pita yang dihasilkan dari masing–masing

sampel. Perbedaan ukuran pita menggambarkanpolimorfisme dari sampel jambu mete (Saunders et

al., 2001).

Hasil pita yang diperoleh dari empat kom-

binasi primer dan empat sampel adalah sebanyak

322 pita (Tabel 1).

Tabel 1. Jumlah pita DNA berdasarkan sampel dan primer

Pasangan

Primer

Kab.

Buton

Kab.

Muna

Kab.

Bombana

Kab.

Konsel Total

P11-700-M48 16 25 13 26 80

P11-700-M49 12 27 12 23 74

P11-700-M50 10 10 14 15 49

P11-700-M51 22 21 35 41 119

TOTAL 60 83 74 105 322

Berdasarkan lokasi pita pada sampel jambu

mete maka pita–pita AFLP dapat dibagi menjadi

dua, yaitu pita umum (pita yang terdapat pada

setiap sampel) dan pita polimorfis (pita yang hanya

terdapat pada satu atau beberapa sampel). Poli-

morfisme ditandai dengan ada dan tidak adanya

pita pada suatu sampel yang disebabkan oleh per-

bedaan ukuran pita yang dihasilkan oleh setiap

sampel (Wang et al . 2003). Berdasarkan hasil pola

pita–pita AFLP dapat disimpulkan bahwa terdapat

polimorfisme pada 4 sampel jambu mete. Pita poli-

morfisme AFLP yang dihasilkan tidak dapat diten-

tukan sebagai alel atau lokus tertentu karena ana-

lisis dilakukan pada seluruh genom. Pita polimor-

fisme yang didapatkan tidak dapat dijadikan dasar

perbandingan karakter fenotip secara langsung

(Mba dan Tohme, 2005)Primer selektif digunakan untuk menye-

leksi fragmen berdasarkan komposisi basa–basa

pada primer. Perbedaan komposisi basa pada pri-

mer menghasilkan perbedaan fragmen yang teram-

plifikasi. Perbedaan fragmen tersebut kemudian di-

bedakan berdasarkan ukuran. Menurut Loh et al.

(2000), setiap kombinasi primer mampu menghasil-

kan pola pita yang spesifik untuk setiap sampel

sehingga dapat digunakan sebagai identitas sampel.

Perbedaan pola pita dapat menggambarkan perbe-

daan genetik pada setiap sampel jambu mete.

Perbedaan pola pita dapat ditunjukkandalam perbedaan jumlah pita yang dihasilkan.


8/10



Jumlah pita yang dihasilkan oleh setiap 4 kombinasi

primer berkisar antara 49–119 pita. Jumlah pita

yang terbanyak dihasilkan oleh pasangan primer

P11-700 dan M-51 yaitu 119 pita, sedangkan

jumlah pita terendah dihasilkan oleh pasangan pri-

mer P11-700 dan M-50 yaitu 49 pita. Berdasarkan jumlah pita yang diperoleh dapat disimpulkan

bahwa frekuensi kombinasi primer P11-700 dan M-

51 pada genom jambu mete lebih tinggi daripada

kombinasi primer P11-700 dan M-50.

Menurut Restrepo et al . (1999), komposisi

basa selektif pada primer akan mempengaruhi

jumlah pita DNA hasil AFLP. Primer dengan basa

sitosin atau guanin yang lebih banyak menghasilkan

jumlah pita yang lebih sedikit daripada primer

dengan komposisi basa adenin dan timin yang lebih

banyak karena basa sitosin dan guanin lebih selektif

dalam mengamplifikasi fragmen.Jumlah seluruh baris pita–pita AFLP 4 kom-

binasi primer adalah 141 baris. Dari seluruh baris

tersebut terdapat 42 baris yang mengandung pita

umum sedangkan baris pita polimorfis sebanyak 99

baris. Jumlah baris yang mengandung pita poli-

morfis dihitung dan diperoleh kisaran persentase

primer adalah 44,50–83,05%. Rata–rata persentase

baris polimorfis seluruh pasangan primer adalah

70,21%. Persentase polimorfisme diperoleh berda-

sarkan perbandingan jumlah baris yang mengan-

dung pita polimorfis dengan jumlah baris yang

mengandung pita umum kemudian dikalikan 100 %.Jumlah baris, baris umum, baris polimorfis dan per-

sentase polimorfis dari 4 kombinasi primer dapat

dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Jumlah baris, baris yang umum, baris polimorfis

dan persentase baris polimorfis dari 4 kombinasi primer

Kombinasi

primer

jumlah

baris

baris

umum

baris

polimorfis

persentase

polimorfis

(%)

P11-700-M48 32 12 20 62.50

P11-700-M49 32 10 22 68.75

P11-700-M50 18 10 8 44.50

P11-700-M51 59 10 49 83.05TOTAL 141 42 99 70.21

Berdasarkan penelitian Chen et al . (2004),

diperoleh persentase polimorfisme sebesar 70 %

dari 30 kultivar Aglaonema dengan 6 pasang pri-

mer. Hasil penelitian Chen et al . tersebut menun-

jukkan bahwa ke 6 pasang primer yang digunakan

dapat menggambarkan perbedaan genetik dengan

persentase polimorfisme 70%. Berdasarkan hasil

tersebut, Chen et al . berhasil membedakan secara

identik masing–masing kultivar Aglaonema.Berdasarkan hasil rata–rata persentase

polimorfisme jambu mete yang diperoleh yakni

sebesar 70,21%, maka dapat disimpulkan bahwa

jambu mete dari setiap sampel dapat dibedakan

secara genetik.

Penelitian dengan menggunakan marka

AFLP untuk mendeteksi polimorfisme pada bebe-

rapa spesies tanaman telah dilakukan. Aggarwal et al , mengidentifikasi 501 pita dari Oryza sativa L.

dengan persentase polimorfisme 65%. Singh et al .

menghasilkan 422 pita dari Azadiracht indica

dengan persentase polimorfisme 70%. Tomkins et

al, menghasilkan persentase 75% pada Hemerocallis

spp.

Menurut Vergara dan Bughara (2003),

tingginya tingkat polimorfisme menunjukkan tinggi-

nya keragaman genetik. Oleh karena itu, hasil per-

sentase polimorfisme empat sampel jambu mete

yang diperoleh memiliki keragaman genetik yang

tinggi. Keragaman genetik tersebut dapat digambar-kan dengan tingginya persentase polimorfisme.

Keunikan genetik jambu mete kemung-

kinan disebabkan oleh mutasi DNA dan rekombi-

nasi. Mutasi DNA dan rekombinasi secara seksual

merupakan faktor utama terjadinya variasi genetik

(Indrawan et al ., 2007). Teknik AFLP tidak mengana-

lisis gen–gen tertentu, tetapi hanya menganalisis

seluruh genom jambu mete melalui pola pita yang

terbentuk sehingga keunikan genetik yang diper-

oleh tidak dapat langsung diterjemahkan ke dalam

karakter fenotip. Menurut Griffiths et al. (2000),

karakter fenotip dipengaruhi oleh faktor genetikdan lingkungan. Oleh karena itu, data variasi gene-

tik jambu mete yang telah dilakukan dengan marka

AFLP perlu dibandingkan dengan analisis faktor ling-

kungan sehingga dapat digunakan untuk mengana-

lisis karakter fenotip jambu mete.

Elektroforesis gel poliakrimida pada peneli-

tian bertujuan memisahkan fragmen hasil amplifi-

kasi selektif. Teknik AFLP menggunakan elektro-

foresis gel poliakrilamida agar pita DNA dengan

perbedaan satu basa pada setiap sampel dapat

dianalisis. Gel poliakrilamid memiliki pori–pori yang

lebih kecil dari pada sel agarosa sehingga dapat

memisahkan pita DNA yang berukuran relatif kecil

(5-500 pb) dan mampu memisahkan fragmen

dengan perbedaan satu basa (Sambrook dan

Russell, 2001). Pita–pita DNA dari seluruh primer

diterjemahkan ke dalam bentuk data biner yaitu

dengan memberi angka 1 bila terdapat pita dan

angka 0 bila tidak terdapat pita. Data biner

kemudian diolah dengan metode SPSS, sehingga

didapatkan Proximity Matrix dan dendrogram

seperti pada Tabel 3.

Dendogram merupakan topologi pohon

filogenetik yang menggambarkan percabangan dan

pengelompokkan (clustering) sampel yang berderet

rata secara vertikal pada satu sisi pohon. Berdasar-


9/10



kan dendogram, maka dapat diketahui pola perca-

bangan dengan pengelompokkan sampel berdasar-

kan marka molekular AFLP. Software SPSS meng-

analisis data biner menjadi dendogram dengan

menggunakan perhitungan metode Complete

Linkage.

Tabel 3. Hasil Proximity Matrix dan dendogram jambu

mete pada 4 lokasi berbeda

Matrix File InputCase

Buton Muna Bombana Konsel

Buton 1.000 0.494 0.008 - 0.484

Muna 0.494 1.000 0.042 - 0.554

Bombana 0.008 0.042 1.000 - 0.280

Konsel - 0.484 - 0.554 - 0.280 1.000

Hasil dendogram menunjukkan bahwa dari

empat sampel jambu mete, terdapat dua kelompok

yaitu kelompok A yang terdiri atas jambu mete asal

Kab. Buton, Kab. Muna dan Kab. bombana sedang-

kan kelompok B terdiri atas jambu mete asal Kab.

Konsel. Pada kelompok A jambu mete asal Kab.

Bombana berdiri sendiri dan dibedakan dengan

jambu mete asal Kab. Muna dan Kab. Buton.

Pengelompokan sampel jambu mete ber-

dasarkan marka AFLP menunjukkan perbedaan dan

kemiripan genetik antar sampel. Perbedaan dan

kemiripan genetik tersebut dihasilkan berdasarkan

pola pita DNA (Mueller dan Wolfenbarger, 1999).

Sampel yang tergolong dalam satu kelompok memi-

liki pola pita yang mirip seperti pada jambu mete

asal Kab. Muna, Kab. Buton dan Kab. Bombana,

namun jambu mete asal Kab. Muna dan Kab. Buton

memiliki kemiripan yang lebih dekat dibandingkandengan Kab. Bombana.

Berdasarkan letak geografis, bahwa jambu

mete asal Kab. Muna dan Kab. Buton berada pada

wilayah kepulauan sedangkan jambu mete asal Kab.

Bombana dan Kab. Konsel berada pada wilayah

daratan. Adanya kemiripan genetik antara jambu

mete asal Kab. Muna dan Kab. Buton mungkin

disebabkan karena keduanya berada pada wilayah

kepulauan yang saling berdekatan. Pada penelitian

ini, jambu mete asal Kab. Konsel yang digunakan

adalah jambu mete unggul yang berasal dari Kebun

Penelitian Onembute. Sifat unggul yang dimilikioleh jambu mete asal Kab. Konsel menyebabkan

jambu mete asal Kab. Konsel memiliki kelompok

tersendiri dengan ketiga jambu mete lainnya.

Adapun sifat unggul tersebut seperti gelendong

berukuran panjang 2,5–3,0 cm dan lebar 2,0–2,25

cm, gelondong berbobot antara 7 g–10 gram per-

butir dan rendemen kacang mete berkisar 22 %.

Jambu mete asal Kab. Bombana yang

masuk satu kelompok dengan sampel Kab. Muna

dan Kab. Buton hal ini mungkin disebabkan karena

wilayah Kab. Bombana dulunya masuk dalam

wilayah administratif/kecamatan dari Kab. Buton

sehingga ada kemungkinan bahwa jambu mete yang

ada di wilayah Kab. Bombana berasal dari bibit

jambu mete yang berasal dari Kab. Buton.

Sebagai kesimpulan dari penelitian ini

bahwa: (1) Terdapat variasi genetik pada empat asal

sampel jambu mete yang digambarkan melalui poli-

morfisme dengan menggunakan marka molekulerAFLP, (2) Polimorfisme dapat dilihat pada perbedaan

pola pita AFLP dengan jumlah pita secara keseluruhan

322 pita dan rata-rata persentase polimorfisme sebesar

70,21% dari empat kombinasi primer selektif, dan (3)

Hasil dendrogram menunjukkan bahwa terdapat dua

kelompok yaitu kelompok pertama terdiri dari jambu

mete asal Kab. Buton, Kab. Muna dan Kab. Bombana

dan kelompok kedua yaitu jambu mete asal Kab.

Konsel. Jambu mete asal Kab. Konsel memiliki perbe-

daan dengan ketiga sampel jambu mete lainnya.


10/10



KEPUSTAKAAN

BPMD Provinsi Sulawesi Tenggara, 2010. Buku po-

tensi dan peluang investasi di daerah Sula-

wesi Tenggara. BPS Sultra.

Chen, J.J., P.S. Devanand, D.J. Norman, R.J. Henny

and C.T. Chao. 2004. Genetic relationship

of Aglaonema species and cultivars infer-

red from AFLP Markers. Annals of Botany

93: 157-166.

Correa, R.X., Ricardo V. A., Fabio G. F. Cosme D. C.,

Maurilio A. M., and Everaldo G. B. 1999.

Genetic distance in soybean based on

RAPD Markers.

Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C.

Lewontin and W.M. Gelbrat. 2000. An

introduction to genetic analysis.7th

ed.

W.H. Freeman, New York: xvii + 860 hlm.Hoon-Lim S, Peng Teng P. C., Lee Y. H., and Goh C. J.

1999. RAPD analysis of some species in the

genus vanda (Orchidaceae). Annuals of

Botany.

Indrawan, M., R.B. Primack dan J. Supriatna, 2007.

Biologi konservasi. rev. ed . Yayasan Obor

Indonesia. Jakarta.

Kemal, P., 2000. Jambu mete. SIM Pembangunan

Perdesaan. Bappenas. Jakarta.

Loh, J.P., R. Kiew, A. Kee, L.H. Gan and Y.Y. Gan.

1999. Amplified fragment length polymor-

phism (AFLP) provides molecular markers for the identification of caladium bicolor

cultivars. Annals of Botany 84: 155–161.

Mba, C. dan J. Tohme, 2005. Use of AFLP markers in

surveys of plant diversity. Methods in enzy-

mology. 395: 177–201.

Moore, D.D. and D. Dowhan. 2002. Preparation and

analysis of DNA. Dalam: Aususbel, F.M., R.

Brent, R.E. Kingston, D.D Moore, J.G.

Seidman, J.A. Smith dan K. Struhl, 1995.

Current protocol in molecular biology . Vol I.

John Wiley & Sons, Inc.: xxiv + 9.17.3 hlm

Mueller, U.G. dan L.L. Wolfenbarger, 1999. AFLP

genotyping and fingerprinting. Elsevier

Science 14: 389-394

Restrepo, S., M. Duque, J. Tohme and V. Verdier,

1999. AFLP fingerprinting: an efficient

technique for detecting genetic variation of

Xanthomonas axonopodis pv . Manihotis.

Microbiology 145: 107–114.

Sambrook, J. dan D.W. Russell, 2001. Molecular

cloning: A laboratory Manual. 3rd

ed . CSHL

Press, New York : xxvii + 18.136 + A.14.1 +

R.22 + I44 hlm.Saunders, J.A., S. Mischke, dan A.A. Hemeida, 2001.

The use of AFLP techniques for DNA finger-

printing in plants. Beckman Coulter, Inc.,

Fullerton. 9 hlm.

Van Eijnatten, C.L.M., 1991. Anacardium occidentale

L. (http://proseanet.org/prosea.eprosea_

detail.php?frt=&id=1468) diakses tanggal

10 September 2011.

Vergara, G.V and S.S. Bughara, 2003. AFLP analyses

of genetic diversity in bentgrass. Crop

Science, 43: 2162–2171.

Wang, Z.S., A.J. Baker, G.E. Hill and S.V. Edwards,2003. Reconciling actual and inferred

population histories in the house finch

(Carpodacus mexicanus) by AFLP analysis.

Evolution 57(12): 2852-2864.

Weising, K., Nybom, H., Wolff, K. and Meyer, W.,

1995. DNA fingerprinting in plant and

fungi. CRC Press. Boca Raton: 322 hlm.

Zaubir, R. dan R. Suryadi, 2003. Kriteria kesesuaian

tanah dan iklim tanaman jambu mete.

Litbang Jakarta.

tkptteknik khusus

Documents

Transcript of tkptteknik khusus