20

TINJAUAN PUSTAKA

Seledri (Apium graveolens leach)

Seledri merupakan tanaman tegak, tahunan, tinggi 25-100 cm, batang

bersegi dan beralur membujur, bunga banyak dan berwarna putih kehijauan.

Dapat dibudidayakan dimana-mana dari dataran rendah sampai dataran tinggi

(IPTEK 2005). Tanaman ini lebih dikenal masyarakat sebagai sayuran. Disamping

hanya sekedar sebagai sayuran, seledri jauh lebih bermanfaat yakni sebagai obat

penyakit.

Diantara manfaat tanaman seledri sebagai obat penyakit itu adalah

mengobati hipertensi, gout, diabetes, diare, mencegah stroke dan urine keruh

(Sinar Harapan 2003). Selain itu akar seledri juga berkhasiat memacu enzim

pencernaan dan peluruh kencing atau diuretik, buah dan bijinya sebagai pereda

kejang (antipasmodik), menurunkan kadar asam urat darah, antirematik,

karminatif dan sedatif serta herbanya bersifat tonik, memacu enzim pencernaan,

menurunkan tekanan darah, peluruh kencing, peluruh haid, mengelurkan asam

urat darah yang tinggi (Ixoranet 2007) serta seledri dapat digunakan untuk

mencegah masuk angin, menghilangkan rasa mual dan sebagai pelengkap sayur.

Seledri juga mengandung senyawa metabolit sekunder diantaranya herba

seledri mengandung flavonoid, saponin, tanin, apiin, minyak atsiri, apigenin,

kolin, vitamin A, B, C, zat pahit asparagin, apigenin dan akarnya mengandung

asparagin, manit, zat pati, lendir minyak atsiri pentosa, glutamin dan tirosin serta

bijinya mengandung apiin, minyak atsiri, apigenin dan alkaloid (Ixoranet 2007).

Kemudian seledri juga mengandung gizi berupa air, protein, lemak, karbohidrat,

serat, kalsium, besi, riboflavin, nikotinamida dan asam askorbat (Ashari 1995).

Data ilmiah yang mendukung tentang khasiat senyawa aktif dalam seledri.

Diantaranya pemakaian infus daun seledri dengan kadar 10 persen sebanyak 5

ml/kg bb menurunkan kadar asam urat darah kera (Winata dan Wilman 1988

dalam ixoranet 2007), pemberian ekstrak seledri dengan cara peras maupun

refluks dapat menurunkan tekanan darah kucing (Dondokambey 1985 dalam

Ixoranet 2007), efek diuresis infusa daun seledri pada tikus putih (Setiawan &

Putri 2007), Juga beberapa Paten diantaranya Paten (6352728 tahun 2002 dan

6576274 tahun 2003) yang berisi estrak tunggal seledri tetapi efikasi yang ditelaah

21

adalah antiinflamasi dan Paten (P00200400339 tahun 2004) yang berisi tentang

formula ekstrak gabungan seledri dan sidaguri untuk antigout. Berdasarkan studi

literatur juga penelitian tentang seledri yang dihubungkan dengan penyakit gout

dan inhibitor enzim xantin oksidase masih sangat sedikit, diantaranya Ramdhani

(2004) yang menyebutkan bahwa senyawa bioaktif seledri yang dapat

menghambat aktivitas enzim xantin oksidase merupakan senyawa dari golongan

flavonoid, Paten (6589573 tahun 2003) berisi tentang inhibitor enzim xantin

oksidase yang diperoleh dari tanaman banaba (Lagerstroemia speciosa) serta

Iswantini dan Darusman (2004), dalam penelitiannya diketahui bahwa ekstrak

kasar seledri memiliki daya inhibisi terhadap enzim xantin oksidase cukup tinggi,

lebih kuat dari kemampuan produk jamu komersial lainnya seperti jamu dua

walet, jamu jaya asli dan jamu keju jimpe. Sementara uji kinetika inhibisi xantin

oksidase pernah dilakukan tetapi menggunakan senyawa aktif sidaguri (Sida

rhombifolia L.) dimana tipe kinetika awal dengan menggunakan metode Line Weaver-

Burk mengarah ke inhibisi kompetitif (Hidayat 2006), Sedangkan penelitian tentang

uji kinetika ekstrak kasar dan hasil fraksinasinya yang dihubungkan dengan

penyakit gout dan inhibitor xantin oksidase serta penentuan senyawa aktifnya

belum pernah dilakukan.

Xantin Oksidase

Peristiwa timbulnya gout tak terlepas dari peran serta enzim xantin

oksidase. Enzim ini mampu mengubah xantin menjadi asam urat melalui reaksi

oksidasi seperti ditunjukan oleh Gambar 1

Gambar 1 Pengubahan xantin menjadi asam urat (Hille 2006)

Xantin oksidase (Gambar 2) merupakan suatu kompleks enzim yang terdiri dari

molibdenum, FAD dan Fe2S2 sebagai pusat reaksi redoks. Enzim ini terdiri dari

dua subunit identik yang saling berhadapan, memiliki 1332 residu asam amino

Xantin Asam urat

NH

HN

NH

N

O

O NH

HN

NH

HN

O

O

O

H2O2

xantin oksidase

O2 + H2O

22

dengan bobot molekul sekitar 270000 Da. Selain fungsi katalisis mengubah

hipoxantin menjadi xantin maupun xantin menjadi asam urat, telah ditemukan

fungsi lain dari enzim ini dalam mengkatalisis reduksi nitrat dan nitrit menjadi

nitrit oksida (Millar et al. 2002) dan sekaligus menyebabkan pembentukan radikal

superoksida yang dapat menyebabkan peradangan (Bodamyali et al. 2002).

Gambar 2 Model struktur enzim xantin oksidase (Hille 2006)

Enzim xantin oksidase di dalam tubuh manusia terdapat pada hati, jika enzim ini

terdapat diluar hati mengindikasikan kerusakan fungsi hati (Hille 2006).

Flavonoid dan Alkaloid

Enzim xantin oksidase mengkatalisis purin menjadi asam urat. Allopurinol

secara farmakologis dapat digunakan dalam mengatasi sakit gout dengan cara

menginhibisi aktivitas xantin oksidase. Nakanishi (1990) melaporkan flavonoid

krisin, baekeilin, isorhamnetin, dan ester asam kafeat juga tergolong efektif dalam

mengatasi sakit gout. Studi invitro menunjukkan bahwa beberapa flavonoid

terutama letuolin dan apigenin dapat juga bekerja sebagai inhibitor xantin

oksidase dengan daya kerja yang hampir sama dengan allopurinol (Cos et al.

1998). Inhibitor xantin oksidase lain, namun dengan daya inhibisi rendah adalah

antosianidin dan proantosianidin (Duke 1999), hesperetin dan teaflavin-3,3’-

digalat juga dapat berperan sengai inhibitor enzim xantin oksidase (Dew et al.

2005), serta derivat apigenin dari palhinhaea cernua juga dapat menjadi inhibitor

enzim xantin oksidase dengan daya inhibisi yang cukup tinggi (Jiao et al. 2006).

Sementara itu Jen at al (2000) juga melaporkan hubungan antara struktur

flavonoid dengan aktivitasnya sebagai inhibitor xantin oksidase disebabkan

23

karena adanya gugus hidroksil (gugus –OH) pada C-5 dan C-7 dan ikatan rangkap

antara C-2 dan C-3.

Alkaloid merupakan senyawa kimia bersifat basa yang mengandung satu

atau lebih atom nitrogen, umumnya tidak berwarna, berwarna jika mempunyai

struktur kompleks dan bercicin aromatik. Alkaloid tumbuhan juga dipercaya

sebagai obat gout yang mampu menekan dan mengurangi frekuensi serangan akut

dan menghilangkan rasa nyeri dengan cara menghambat síntesis dan pelepasan

leukotrien (Mycek 1997). Contoh penggunaan alkaloid secara komersial adalah

kolkisin yang diisolasi dari tanaman Colchium autumnale. Materia Medika (1995)

mengatakan bahwa ada golongan alkaoid dari suatu tanaman tertentu dipercaya

menghambat produksi enzim xantin oksidase, senyawa kimia lainnya adalah

polifenol dan flavonoid. Suatu senyawa dalam tanaman yang analog dengan purin

pun dapat dimanfaatkan sebagai inhibitor bagi xantin oxidase, dan dilaporkan juga

bahwa alkaloid yang terkandung dalam biji seledri mempunyai efek sedatif dan

antikonsulvan pada tifus (Ixoranet 2007).

Gout (Asam Urat)

Gout atau asam urat adalah salah satu bentuk penyakit artritis yang

disebabkan oleh penumpukkan kristal asam urat pada sendi yang ditandai dengan

pembengkakan dan biasanya menyerang pada ibu jari kaki (Bardin 2003). Secara

garis besar gout termasuk ke dalam reumatik artikular bersama-sama dengan

osteoartritis dan artritis reumatoid. Kadar asam urat normal dalam darah berkisar

antara 25-75 µg/ml dengan volume urin yang dieksresikan per harinya antara 250

hingga 750 mg (Pachla et al. 1987). Kandungan asam urat yang tinggi dalam

darah Hiperurisemia tidak mesti berakhir dengan terbentuknya gout, namun gout

selalu didahului oleh hiperurisemia (Mycek et al. 2001) dan Sturrok (2000) juga

melaporkan hal yang sama.

Bagi wanita, konsentrasi normal asam urat berkisar antara 25-60 µg/ml,

sedangkan bagi pria adalah 30-70 µg/ml (Artiss & Entwistle 1981). Bagi wanita

konsentrasi asam urat di atas 60 µg/ml sudah dapat dikatakan hiperurisemia,

namun tidak bagi pria selama konsentrasinya di bawah 70 µg/ml. Walaupun

batasan normal hiperurisemia pada pria lebih besar dari wanita, namun pria

24

memiliki resiko terkena serangan gout jauh lebih tinggi dibanding wanita. Data

rasio hiperurisemia dan gout di Jawa pada tahun 2001 antara pria dan wanita

menunjukkan perbandingan 2:1 untuk kasus hiperurisemia dan 34:1 untuk kasus

gout (Heryanto 2003), Juandy (2007) melaporkan terdapat 730 kasus gout baru

dari 47.150 responden selama dua belas tahun terakhir.

Tingginya kadar asam urat dalam darah pada penderita gout maupun

hiperurisemia diakibatkan oleh faktor produksi asam urat berlebihan, obesitas,

diabetes yang disertai dengan tekanan darah tinggi (Galvan et al. 1995), hal yang

sama juga dilaporkan oleh Schumacher (2006) & Rematologi Amerika (2007)

hingga stress tinggi (Montgomery et al. 1993) dan faktor makanan terutama

protein hewani maupun nabati atau sayur-sayuran kaya purin dalam jumlah

banyak (Juandy 2007). Pada kasus obesitas ataupun diabetes, sebagian besar lipid

dan glukosa diubah bentuk menjadi asetil-CoA dilanjutkan dengan reaksi

pembentukan α-ketoglutarat disertai pembebasan sejumlah energi dalam siklus

asam sitrat. α-ketoglutarat ini kemudian bereaksi dengan asam amino dalam

serangkaian reaksi dan berakhir dengan terbentuknya glutamin. Glutamin inilah

yang kemudian dimetabolisir menjadi asam nukleat (basa purin). Purin yang

terbentuk ini dalam keadaan normal memiliki peluang untuk membentuk asam

urat (Voet & Voet 2001).

Mekanisme pembentukan asam urat dari protein bermula dari degradasi

diet protein menjadi asam amino. Beberapa asam amino ini selanjutnya

didegradasi membentuk glutamat. Glutamat yang terbentuk selanjutnya

dimetabolisir membentuk α-ketoglutarat, aspartat, dan sebagian membentuk

glutamin. Ketika glutamin bereaksi dengan fosforibosil pirofosfat (PRPP, suatu

gula derivatif dari ribosa-5-fosfat) maka akan terbentuk fosforibosalamin.

Fosforibosalamin merupakan prekursor bagi pembentukan asam nukleat purin.

Melalui serangkaian reaksi yang melibatkan penambahan asam amino glisin,

glutamin, aspartat, dan koenzim N10-formil-THF (tetra hidro folat) akan terbentuk

inosin monofosfat (IMP). IMP merupakan prekursor dalam sintesis purin, IMP

ini yang selanjutnya diubah bentuk menjadi AMP dan GMP maupun bentuk basa

bebasnya, adenin dan guanin. Melalui mekanisme regulasi sel, purin yang

terbentuk ini selanjutnya dimetabolisir untuk beberapa keperluan diantaranya

25

sintesis senyawa berenergi tinggi seperti ATP, bahan baku dalam pelaksanaan

ekspresi genetik (sintesis protein) ataupun transformasi genetik, dan beberapa

purin ini dikatabolisme membentuk asam urat (Gambar 3).

Gambar 3 Protein dan pembentukan asam urat (Mycek et al. 2001)

Obat Gout

Strategi pengobatan gout pada umumnya adalah dengan menurunkan

kadar asam urat sampai di bawah titik jenuhnya. Allopurinol (Gambar 4)

merupakan obat gout yang paling efektif dalam menghambat pembentukan asam

urat yang dipakai masyarakat selama ini. Walaupun murah, dengan harga eceran

Rp. 2700,00 per stripnya (Kimia Farma 2004), namun obat ini diketahui sangat

berbahaya bila tidak digunakan dengan hati-hati. Dilaporkan telah terjadi kasus

kematian sebanyak 156 jiwa dari total 600 pasien (26%) akibat mengkonsumsi

allopurinol (Sydpath 1999). Penggunaan allopurinol dilaporkan dapat menjadi

penyebab kejadian difusi vaskuler yang berakhir dengan kematian. Allopurinol

Sintesis Purin

Ribosa-5-fosfat

Katabolisme Purin

IMP

Hipoksantin

(inosin, adenosin, guanosin)

AMP

Adenosin

Inosin

GMP

Xantin

Guanosin

Guanin

Protein

PRPP + glutamin(12 reaksi)

Asam Urat

26

juga dapat menyebabkan gangguan pencernaan, timbulnya ruam di kulit,

berkurangnya jumlah sel darah putih dan kerusakan hati (Medicastore 2007).

Selain itu, penggunaan allopurinol dapat mengakibatkan hipersensitifitas yang

akan terus melemahkan respon tubuh penderita terhadap konsentrasi allopurinol,

sehingga pengguna allopurinol cenderung mengalami penambahan dosis

pemakaian.

Gambar 4 Struktur allopurinol (Terkeltaub 2005)

Oksipurinol yang merupakan hasil penguraian allopurinol di dalam tubuh,

merupakan suatu senyawa yang memiliki efek penghambatan yang sama namun

lebih lama dibandingkan allopurinol dalam menghambat kerja xantin oksidase.

Dilaporkan bahwa oksipurinol memiliki waktu paruh yang cukup lama, sekitar

21,2±0,4 jam, lebih lama dibandingkan allopurinol yang memiliki waktu paruh

1,3±0,1 jam (Yarindo Farmatama 2003). Efek oksipurinol ini yang kemudian

diduga kuat menjadi penyebab kejadian difusi vaskuler.

Melihat beragamnya efek samping yang ditimbulkan obat sintetis, sangat

diperlukan obat-obatan sejenis yang memiliki khasiat yang sama dengan harga

terjangkau, dan efek samping yang sesedikit mungkin. Untuk tujuan itu, maka

studi pemanfaatan tumbuhan sebagai obat alternatif harus terus dijalankan

mengingat penggunaan bahan alami sebagai sumber obat pada dasarnya jauh lebih

aman dan jauh dari kemungkinannya toksik karena kandungannya yang masih

lengkap walaupun pemakaiannya dalam jumlah yang besar (Sidik et al. 1995)

Cos et al (1998) melaporkan bahwa beberapa senyawa flavonoid bersifat

antioksidan dan dapat menghambat kerja enzim xantin oksidase maupun reaksi

superoksida. Kemudian dilaporkan juga senyawa flavonoid dari stereospermum

personatum selain bersifat antioksidan, senyawa tersebut juga dapat menghambat

kerja enzim xantin oksidase (Kumar et al. 2005). Flavonoid merupakan golongan

senyawa polifenol yang terdiri atas 15 karbon sebagai kerangka dasarnya. Kelima

27

belas atom tersebut membentuk dua cincin aromatik (C6) yang terikat pada rantai

propana (C3) sehingga membentuk susunan C6-C3-C6 (Gambar 5 ). Dari susunan

ini dapat dihasilkan 3 jenis struktur, yaitu flavonoid (1’B-2C),isoflavonoid (1’B-

3C), dan 1 neoflavonoid (1’B-4C). Flavonoid terdapat pada semua bagian

tumbuhan mulai dari daun, akar kulit kayu, tepung sari, nektar, bunga, buah,

hingga biji (Markham 1982).

Flavonoid quersetin, quersitin, miristin, dan mirisetin asal tanaman salam

(Eugenia polyantha) berkhasiat dalam menghambat kerja enzim xantin oksidase

(Schemeda et al. 1987). Demikian halnya dengan flavonoid chriysin, batcalein,

isorhamnetin, dan ester asam kafeat juga berkhasiat dalam menghambat xantin

oksidase (Nakanhisi 1990). Penelitian Cos et al (1998) flavonoid luteolin dan

apigenin (Gambar 5) memiliki kemampuan menginhibisi terhadap xantin oksidase

dengan kemampuan daya inhibisi mendekati allopurinol, kemudian senyawa

bioaktif polifenol yang terdapat pada teh, yaitu teaflavin, teaflavin-3-galat,

teaflavin-3-3’-digalat, (-)-epigalokatekin-3-galat, dan asam galat mampu

menghambat kerja enzim xantin oksidase dalam membentuk asam urat melalui

mekanisme inhibitor kompetitif (Jen et al. 2000). Aktivitas tertinggi dimiliki oleh

asam galat yang mampu memberikan efek penghambatan hingga di atas 50%.

Dew et al (2005) melaporkan bahwa flavonoid teaflavin-3,3’-digalat berperan

sebagai penghambat enzim xantin oksidase. Selain itu juga dilaporkan bahwa

derivat apigenin (yang merupakan senyawa golongan flavonoid) asal tumbuhan

palhinhaea cernua juga berperan sebagai penghambat enzim xantin oxidase (Jiao

et al. 2006), dimana semua penelitian di atas dilakukan secara invitro.

Gambar 5 Struktur flavonoid apigenin (Cos et al. 1998)

Adanya ikatan rangkap pada flavonoid memungkinkan untuk

melangsungkan reaksi adisi (oksidasi oleh xantin oksidase), adanya ikatan

rangkap pada atom C2 dengan C3 akan mengakibatkan posisi ring B co-planar

28

terhadap ring A sehingga lebih memudahkan dalam berinteraksi dengan enzim

zantin oksidase. Selain itu adanya gugus hidroksil yang terdapat pada flavonoid

turut berperan dalam memberikan efek penghambatan (Cos et al. 1998).

Selain flavonoid, alkaloid tumbuhan dipercaya dapat juga berfungsi

sebagai obat yang mampu menekan sekaligus mengurangi frekuensi serangan akut

dan menghilangkan rasa nyeri dengan cara menghambat sintesis dan pelepasan

leukotrien (Mycek et al. 2001). Materia Medika (1995) mengatakan bahwa

terdapat golongan alkaoid dari suatu tanaman tertentu dipercaya menghambat

produksi enzim xantin oksidase, senyawa kimia lainnya adalah polifenol dan

flavonoid. Suatu senyawa dalam tanaman yang analog dengan purin pun dapat

dimanfaatkan sebagai inhibitor bagi xantin oxidase, dan dilaporkan juga bahwa

alkaloid yang terkandung dalam biji seledri mempunyai efek sedatif dan

antikonsulvan pada tikus (Ixoranet 2007).

Kinetika Inhibisi Enzim

Enzim merupakan unit fungsional dari metabolisme sel yang terdiri atas

protein makromolekul dengan mekanisme kinetika yang mirip dengan katalis

heterogen dengan aktivitas reaksi yang sangat spesifik. Faktor-faktor utama yang

dapat mempengaruhi aktivitas enzim antara lain konsentrasi enzim, konsentrasi

substrat, jumlah produk yang terbentuk, adanya senyawa inhibitor dan aktivator,

pH, kekuatan ion, serta suhu lingkungan (Thenawijaya 1995).

Reaksi enzimatis bekerja dengan urut-urutan yang terartur, enzim

mengkatalis ratusan reaksi bertahap yang menguraikan molekul nutrien, reaksi

yang menyimpan dan mengubah energi kimiawi, dan yang membuat

makromolekul sel dari prekusor sederhana. Di antara sejumlah enzim yang

berpartisipasi di dalam metabolisme ada yang dinamakan dengan enzim pengatur

(regulasi enzim) yang dapat mengenali berbagai isyarat metabolik dan mengubah

kecepatan katalitiknya sesuai dengan isyarat yang diterima. Melalui aktivitasnya,

sistem enzim terkoordinasi dengan baik, menghasilkan suatu hubungan yang

sesuai diantara sejumlah aktivitas metabolik yang berbeda yang diperlukan untuk

menunjang kehidupan (Webb 1963).

29

Mekanisme regulasi enzim dilakukan melalui kontrol ketersediaan enzim

dan kontrol aktivitas enzim. Dalam kontrol ketersediaan enzim, keberadaan enzim

diatur oleh sel, pengaturan kapan suatu enzim disintesis dan kapan akan

didegradasi bergantung pada ketersediaaan subtrat dan produk. Proses degradasi

dan síntesis enzim dapat berlangsung dalam hitungan menit (pada bakteri) hingga

jam (pada organisme tingkat tinggi). Pada kontrol aktivitas, aktivitas katalitik

enzim dipengaruhi oleh struktur sisi aktif tempat enzim dan subtrat berikatan.

Aktivitas struktur tersebut dapat dilakukan melalui mekanisme penambahan suatu

molekul tertentu (efektor allosterik) atau dengan modifikasi kovalen seperti

fosforilasi dan defosforilasi pada residu asam amino spesifik pada sisi aktif enzim

tersebut (Voet & Voet 2001).

Dalam mempelajari kinetika enzim, berbagai faktor penentu laju aktivitas

dipelajari secara lebih seksama dan kondisinya diatur sedemikian rupa dengan

harapan reaksi yang terjadi dapat lebih terkendali dan murni hanya diakibatkan

oleh interaksi enzim-substrat. Untuk beberapa keperluan, seperti dalam

mempelajari kemampuan senyawa bioaktif sebagai obat (inhibitor/aktivator

enzim), terhadap lingkungan tempat reaksi enzim tersebut berlangsung

ditambahkan senyawa bioaktif dengan konsentrasi tertentu dan pola kinetika yang

terbentuk diperbandingkan dengan pola kinetika dasarnya (hanya interaksi enzim-

substrat) untuk melihat adanya perubahan pola kinetika (Price & Stevens 2004).

Beberapa senyawa bioaktif asal tumbuhan ketika ditambahkan ke dalam

sistem reaksi enzimatis dapat berperan sebagai aktivator, yang berarti dapat

meningkatkan laju reaksi pembentukan produk dan beberapa justru dapat

menyebabkan penurunan laju reaksi (inhibitor). Secara kimiawi, suatu inhibitor

akan sulit dibedakan dari aktivator. Kedua senyawa ini dapat jelas dibedakan jika

keduanya telah berinteraksi dengan enzim yang secara langsung akan

mempengaruhi laju reaksinya. Ikatan inhibitor ataupun aktivator dengan enzim

dapat mengubah kemampuan daya katalisatornya. Hal ini secara umum terjadi

akibat adanya perubahan struktur enzim ketika suatu inhibitor ataupun aktivator

berinteraksi dengannya (Boyer 1970).

Mekanisme inhibisi dapat berlangsung secara kompetitif, unkompetitif atau

nonkompetitif. Pada jenis inhibisi kompetitif, terjadi kompetisi antara substrat

30

dengan inhibitor dalam memperebutkan sisi aktif dari enzim (Gambar 6). Reaksi

akan terjadi dan produk akan dihasilkan, walaupun enzim bereaksi dengan

inhibitor. Produk yang dihasilkan dari inhitor akan berbeda jenisnya dengan

produk yang dihasilkan dari subtrat. Pada jenis penghambatan ini, adanya

inhibitor dapat menyebabkan perubahan nilai KM (konstanta Michaelis-Menten)

menjadi lebih besar dari nilai KM semula tanpa mengubah nilai Vmax-nya

(kecepatan maksimum reaksi enzimatis). Vmax pada jenis inhibisi kompetitif tetap

dapat tercapai, namun membutuhkan waktu yang lebih lama dari kondisi

normalnya dan untuk mempercepatnya dapat dilakukan penambahan konsentrasi

substrat yang akan memperbesar peluang bagi subtrat untuk berikatan dengan sisi

aktif enzim, yang pada akhinrnya dapat membantu meningkatkan Vmax.

Gambar 6 Pola kinetika inhibisi yang terbentuk akibat adanya inhibitor kompetitif(Price & Stevens 1996)

Inhibitor kompetitif, umumnya memiliki struktur yang serupa dengan

subtrat. Sebagai contoh adalah allopurinol, yang strukturnya hampir sama dengan

xantin atau subtrat asli (Gambar 7 ). Allopurinol dapat berikatan dengan enzim

xantin oksidase pada sisi aktifnya membentuk ikatan yang terdiri dari kombinasi

ikatan kovalen, elektrostatik, dan ikatan hidrogen. Allopurinol memiliki afinitas

puluhan kali lebih kuat terhadap enzim xantin oksidase dibandingkan xantin. Oleh

karena itu, apabila dalam lingkungan terdapat inhibitor ini bersama-sama

bersama-sama dengan subtrat (xantin), maka allopurinol yang akan lebih bereaksi

dengan xantin oksidase membentuk produk (oksipurinol) dibandingkan dengan

subtratnya sendiri, sehingga efek penghambatan pembentukan asam urat dapat

berlangsung terus selama masih terdapat allopurinol dalam lingkungan (Voet &

Voet 2001).

31

Gambar 7 Struktur allopurinol dan struktur xantin (Hille 1996)

Inhibisi kompetitif oleh produk reaksi sangat bermanfaat untuk

menghentikan atau menurunkan kerja enzim ketika telah terbentuk cukup produk

untuk kebutuhan biokimiawi sel (salah satu bentuk regulasi / kendali metabolik).

Pada jenis inhibisi unkompetitif, inhibitor terikat padsa sisi allosterik enzim

setelah terbentuk komplek enzim-subtrat. Pada jenis inhibisi ini, inhibitor tidak

dapat langsung berikatan dengan enzim dalam keadaan bebas, namun hanya dapat

terikat jika telah terbentuk kompleks enzim-subtrat (Gambar 8 ). Dalam bentuk

kompleks enzim-subtrat*inhibitor, enzim akan kehilangan sifat katalisatornya

(inaktif) dan produk tidak akan terbentuk. Produk hanya akan terbentuk, jika

inhibitor terlepas dari kompleks enzim-subtrat*inhibitor.

Gambar 8 Pola kinetika inhibisi yang terbentuk akibat adanya inhibitorunkompetitif (Price & Stevens 1996)

Umumnya, inhibisi unkompetitif terjadi akibat adanya akumulasi produk

dari reaksi enzim itu sendiri dan sangat jarang dijumpai pada reaksi enzim yang

melibatkan hanya satu subtrat dan satu produk. Pola kinetika yang terbentuk

akibat adanya inhibitor pada jenis inhibisi unkompeitif ini adalah terjadinya

penurunan nilai KM dan Vmax dari keadaan normalnya (Voet & Voet 2001).

Pada jenis inhibisi nonkompetitif, antara subtrat dan inhibitor tidak terjadi

kompetisi dalam memperebutkan sisi aktif enzim. Inhibitor dan subtrat tidak

memiliki kemiripan struktur. Inhibitor berikatan dengan enzim pada lokasi diluar

32

sisi aktifnya. Efek penghambatan akan terjadi karena inhibitor berikatan dengan

sisi allosterik enzim, dan akan mengubah bentuk sisi aktif enzim seperti

ditunjukkan pada Gambar 9. Akibat dari jenis inhibisi ini adalah terjadinya

penurunan Vmax tanpa mengubah nilai KM-nya (Voet & Voet 2001).

Gambar 9 Pola kinetika inhibisi yang terbentuk akibat adanya inhibitornonkompetitif (Price & Stevens 1996)

Berbeda dengan jenis inhibisi unkompetitif, pada inhibisi nonkompetitif,

inhibitor dapat membentuk ikatan dengan enzim dalam keadaan bebasnya

disamping dapat membentuk ikatan dengan kompleks enzim-subtrat. Ikatan

inhibitor terhadap enzim bebas dan kompleks enzim-subtrat dapat meyebabkan

terbentuknya kompleks enzim*inhibitor dan enzim-subtrat*subtrat yang bersifat

tidak produktif, karena kedua kompleks ini tidak dapat membentuk produk

(Gambar 7). Produk hanya akan terbentuk jika ikatan inhibitor terlepas dari

kompleks enzim-subtrat*inhibitor. Reaksi sampingan yang sangat merugikan

akibat pengaruh inhibitor pada jenis penghambatan ini adalah besarnya peluang

bagi sisi aktif enzim untuk berubah secara permanen dari keadaan alaminya jika

terbentuk komplek enzim*inhibitor dengan ikatan yang sangat kuat. Hal ini akan

menyebabkan enzim kehilangan reaktifitasnya secara permanen.

Suatu senyawa aktif yang akan digunakan sebagai kandidat obat bagi

penyakit kelainan metabolik (akibat aktivitas enzim), harus melalui serangkaian

uji kinetika. Pengujian ini diharapkan dapat memberikan informasi tipe

hambatannya. Sehingga dapat dipastikan bahwa suatu senyawa yang diisolasi

tersebut benar-benar aman dan tidak akan mengubah struktur enzim secara

permanen. Penentuan pola kinetika inhibisi enzim dapat ditentukan dengan

menggunakan metode Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk, Dixon, Hanes atau

Eddie-Hofstee seperti terlihat pada Tabel 1.

33

Tabel 1. Metode penentuan mekanisme inhibisi enzim (Price & Stevens 1996)

KM (1+ ) + S (1+ )

Michaelis-Menten

LineWeaver-Burk

Dixon

Hanes

Kompetitif Nonkompetitif Unkompetitif

Vm

Vmapp

KmKmapp

V = Km + S

Vm (S)

Vm (S)V =

KM + S (1+ )Ki

IS

VS

S + IVmapp

Km = Kmapp

Ki

Vm

S

VS

S + I

V = Km + S

Vm (S)

Vm (S)V =

Ki

I I

Vm

Km (1+ ) + SKiI

Vm . SV =

Vmapp

Km Kmapp

S

S + I

V = Km + S

Vm (S)V

S

-Km -Kmapp

1/Vm = 1/Vmapp

Km 11/V = (1 + I/Ki) +

Vm Vm

1/S

1/V

S

S + I Km 1 11/V = +

Vm S Vm

-Km = -Kmapp

1/Vmapp

Km 11/V = (1 + I/Ki) + (1 + I/Ki)

Vm Vm

1/S

1/V

1/VmS

S + I Km 1 11/V = +

Vm S Vm

-Kmapp

Km 1 11/V = +

Vm S Vm1/S

1/V

1/Vmapp

1/VmSS + I

Km 11/V = + (1 + I/Ki)

Vm Vm

-Km

I

Km + (S) Km1/V = + (I)

Vm (S) Vm.Ki.(S)1/V

-Ki

S1S2

S1 <S2

S1

S2 S1 <S2

1/V

-Ki I

Km + (S) Km + (S)1/V = + (I)

Vm (S) Vm.Ki.(S)S1S2

S1 <S2

1/V

I

Km + (S) (S)1/V = + (I)

Vm (S) Vm.Ki.(S)Km- Ki (1 + )

S

V = Vm.(1 + I/Ki) - Km.V/(s)

V

V/SV = Vm.(1 + I/Ki) - Km.V/(s)..(1 + I/Ki)

V

V/S

tg = -Km

Vm = Vmapp V = Vm – Km .V/(s)

tg = -Kmapp

tg = -Kmtg = -KmappVmapp

Vm V = Vm – Km .V/(s)

V = Vm – Km .V/(s) . (1 + I/Ki)

V

V/S

= tg = tg-Km = -Kmapp

Vmapp

Vm V = Vm – Km .V/(s)Eddie-Hofstee

Km SS/V = (1 + I/Ki) + (1 + I/Ki)

Vm Vm

Km SS/V = (1 + I/Ki) +

Vm Vm

Km SS/V = + (1 + I/Ki)

Vm Vm

Km SS/V = +

Vm Vm

S/V

S

Kmapp (1 + I/Ki)Vmapp KmVm

Km SS/V = +

Vm Vm

S

S/VKmapp (1 + I/Ki)Vmapp KmVm

Km SS/V = +

Vm Vm

S/VKmapp (1 + I/Ki)Vmapp Km

VmS

Metode

Nilai KM dan Vmax sangat sulit ditentukan secara tepat berdasarkan grafik

Michaelis-Menten, sehingga untuk mendapatkan nilai Vmaks dan KM yang lebih

tepat persamaan Michaelis-Menten tersebut ditransformasikan kepersamaan

Lineweaver-Burk, Dixon, Hanes atau Eddie-Hofstee. Metode Lineweaver-Burk

merupakan metode awal penentuan kinetika enzim, dari persamaan ini hanya

34

diperoleh Vmaks, KM dan (afinitas inhibitor), sementara untuk mendapatkan

konsatanta inhibitor (Ki) maka perlu dilakukan uji kinetika lanjut menggunakan

metode Dixon.

Penelitian tentang kinetika inhibisi enzim xantin oksidase

Beberapa senyawa baham alam seperti flavonoid telah diketahui bersifat

inhibitor bagi enzim xantin oksidase dan di harapkan bermanfaat dalam

pencegahan panyakit asam urat. Mekanisme tipe hambatan yang terjadi umumnya

mengarah pada jenis inhibisi kompetitif namun beberapa mengarah pada jenis

inhibisi nonkompetitif. Berikut beberapa penenlitian mengenai sifat inhibisi

kompetitif dan nonkompetitif yang dilakukan secara invitro diantaranya flavonoid

dan senyawa polifenol dilaporkan berperan sebagai inhibitor kompetitif terhadap

enzim xantin oksidase, diantaranya adalah teaflavin, teaflavin-3-galat, teaflavin-3-

3’-digalat, (-)-epigalokatekin-3-galat, dan asam galat (Jen et al. 2000), teaflavin -

3,3’-digalat (Dew et al. 2005), serta apigenin-4’-O-(2”-O-p-coumaroyl)- -D-

glukopiranosida yang merupakan derivat apigenin (Jiao et al. 2006). Sedangkan

beberapa golongan flavonol meliputi jenis flavonol krisin, luteolin, kaemferol,

kuersetin, mirisetin, dan isorhamnetin dilaporkan memiliki efek hambatan

terhadap xantin oksidase melalui mekanisme inhibitor nonkompetitif (Nagao et al.

1997), beberapa kelompok flavonol dan polifenol asal teh seperti (-)-epikatekin,

(-)-epigalokatekin, (-)-epikatekin galat (Aucump et al. 1997). Selain itu flavonoid

flavonol kaemferol asal teh hijau (Park et al. 2006) dan kalkon juga mempunyai

daya inhibisi yang sangat kuat terhadap enzim xantin oksidase (Beiller 1951

dalam Martin 2007) tetapi disini tidak dijelaskan tipe inhibisinya.

Flavonoid mampu menghambat enzim xantin oksidase karena adanya

kemiripan struktur antara flavonoid dengan xantin (subtrat). Kerja spesifik xantin

oksidase terhadap xantin melalui reaksi transfer/penambahan oksigen pada atom C

nomor 2 dan C nomor 8 (gambar 5) oleh asam amino pada sisi aktif enzim disertai

dengan reduksi kofaktor Molibdat, dari Mo(VI) menjadi Mo(IV) (Massey et al,

1970). Besarnya kekuatan inhibisi flavonoid sangat dipengaruhi oleh besarnya

kekuatan mereduksi/derajat oksidasi yang dapat dilihat dari sejumlah gugus fungsi

hidroksil (-OH) dan karboksi (-C=O) di dalamnya. Hasil peneletian Jen et al

35

(2000) menunjukkan bahwa kekuatan inhibisi teaflavin-3-3’-digalat>teaflavin-3-

galat>(-)-epigalokatekin-3-galat>teaflavin. Jiao et al (2006) juga melaporkan

bahwa gugus fungsi hidroksil dan karboksil yang terdapat pada flavonoid

mempengaruhi besarnya daya inhibisi.

Fourir Transformation Infra Red (FT-IR)

FT-IR merupakan metode analisis kualitatif suatu senyawa kimia.

Instrumentasi FT-IR terdiri atas sumber radiasi, sampel kompartemen,

monokromator, detektor, amplifier dan rekorder (sistem pembacaan). Radiasi

inframerah yang digunakan untuk analisis senyawa kimia adalah pada panjang

gelombang sekitar 4000 – 670 cm-1. Panjang gelombang ini menyebabkan energi

elektromagnetik radiasi inframerah gugus-gugus atom bervibrasi. Vibrasi alamiah

gugus molekul yang sesuai dengan radiasi inframerah akan menyebabkan

interaksi medan listrik sehingga akan terjadi perubahan-perubahan vibrasi yang

menunjukan terjadinya absorpsi inframerah yang berupa puncak-puncak tertentu.

Spektrum pada FT-IR dapat terbentuk dengan cara melewatkan radiasi inframerah

ke sampel yang kemudian diproses melalui alat interferometer yang dibaca oleh

detektor berupa sinyal. Sinyal ini yang kemudian diubah menjadi bentuk

spektrum dengan bantuan komputer berdasarkan operasi matematika fourir

transform (Choltup at el. 1988).

Metode ini dapat digunakan untuk menentukan gugus fungsi suatu

senyawa kimia, seperti dilakukan oleh Jiao at el (2006) yang mencoba

menganalisis gugus fungsi senyawa aktif yang berperan dalam menghambat

enzim xantin oksidase dari palhinhaea cernua diperoleh serapan gugus fungsi

pada panjang gelombang 3249 – 3500 cm-1 (hidroksil), 1714 & 1659 cm-1

(karbonil) serta 1586 & 1455 cm-1 (penil).

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

HPLC atau kromatografi cair kinerja tinggi merupakan teknik pemisahan

dan analisis kuantitatif atau kualitatif suatu senyawa. Instrumentasi HPLC terdiri

atas reservoir yang berisi fase gerak, sebuah pompa untuk memompa fase gerak

melalui sistem bertekanan tinggi, injektor, kolom yang merupakan tempat

36

terjadinya pemisahan, detektor yang berfungsi untuk menditeksi keberadaan

senyawa dan integrator yang berfungsi untuk memperkuat pembacaan sinyal oleh

detektor. Sinyal ini yang kemudian diubah menjadi bentuk spektrum dengan

bantuan komputer (Kellner et al. 2004).

Penggunan analisis kualitatif dari metode ini bertujuan untuk memurnikan

suatu senyawa yang akan dianalisis lebih lanjut, seperti dilakukan oleh Park et al

(2006) yang mencoba memisahkan senyawa aktif yang dapat menghambat enzim

xantin oksidase yang berasal dari teh hijau dengan menggunakan HPLC, yang

kemudian senyawa aktif tersebut dianalisis lebih lanjut dan diperoleh senyawa

flavonol kaemferol.

Liquid Chromatography Mass Spectroscopy (LC-MS)

LC-MS merupakan metode analisis kuantitatif yang merupakan kombinasi

antara kromatografi cair dengan spektroskopi massa. Instrumentasi LC-MS terdiri

atas inlet-LC, sumber ion, tekanan permukaan, Mass analyzer, detektor,

instrument kontrol dan proses data. Prinsip dari metode analisis ini adalah ionisasi

molekul, dimana molekul ditembak oleh radikal bermuatan positif sehingga

terfragmen lebih lanjut dan terditeksi ion-ion positifnya. Kumpulan ion-ion yang

dihasilkan merupakan karakteristik suatu molekul. Spektrum LC-MS dapat

terbentuk dengan melewatkan sumber ion ke sampel yang kemudian diproses

dengan suhu tinggi (karena sampel masih dalam bentuk cair setelah dipisahkan

oleh LC) melalui suatu alat mass analyser yang kemudian dibaca oleh detektor

berupa sinyal. Sinyal ini yang kemudian diubah menjadi bentuk spektrum dengan

bantuan komputer (Willard et al. 1988).

Metode ini digunakan untuk menentukan massa molekul dan rumus

molekul yang sangat membantu dalam elusidasi struktur molekul baik organik

maupun anorganik. Seperti yang dilakukan oleh Jiao at el (2006) yang

menganalisis rumus molekul senyawa aktif yang dapat menghambat enzim xantin

oksidase dari palhinhaea cernua dengan LC-MS memperoleh bobot molekul

(m/z) sebesar 579,1200 dengan rumus molekul C30H27O12.

37

Nuclear Magnetik Resonance (NMR)

NMR merupakan metode kualitatif yang didasarkan pada telaah absorpsi

radiasi frekuensi radio oleh inti. Instrumentasi NMR terdiri atas superkondukting

magnit, shimcoil-shim power supply, detektor RF, digitizer, pulse program, RF

source, RF amplifier dan komputer untuk memproses data. Prinsip dari NMR

adalah semua inti yang bermuatan akan mengalami spin (perputaran) pada sumbu

inti dengan menghasilkan suatu dipol magnit sepanjang sumbu dengan

momentum megnetik. Bila inti tersebut diletakkan dalam suatu medan magnet

kuat akan mengalami rotasi atau spin pada sumbu inti dan energi unsur tersebut

akan pecah menjadi 2 tingkat energi terkuantisasi atau lebih sebagai akibat sifat

magnit inti tersebut. Transisi antara tingkat-tingkat energi yang terjadi karena di

induksi medan magnit dapat terjadi bila mengabsorpsi radiasi elektromagnetik

dengan frekuensi yang tepat. Lingkungan kimia dalam molekul mempengaruhi

absorpsi oleh inti dalam suatu meden megnit. Spektrum nmr dapat terbentuk

dengan melewatkan radiasi eletromagnetik ke sampel yang kemudian diproses

melalui peralatan medan magnit sehingga dibaca oleh detektor radio frekuensi

berupa sinyal. Sinyal ini yang kemudian diubah menjadi bentuk spektrum dengan

bantuan komputer (Breitmaier 1993).

Metode ini dapat digunakan dalam menentukan struktur molekul organik

dan anorganik dengan tingkat akurasi yang tinggi. Seperti dilakukan oleh Jiao et

al (2006) yang menganalisis struktur senyawa aktif yang dapat menghambat

enzim xantin oksidase dari palhinhaea cernua diperoleh struktur 5,7-dihidroksi-2-

(4-hidroksipenil)-4H-1-benzopiran-4-on-4’-o-(2”-o-p-kumaroil)- -D-

glukopiranosida.