BAB 5. KONTROL MIKROBA

Kontrol mikroba dapat berupa mengeliminasi mikroba atau hanya

menghambat pertumbuhan dan semuanya tergantung pada tujuan yang hendak

dicapai. Sterilisasi adalah menghilangkan segala bentuk kehidupan (termasuk

virus). Peralatan medis termasuk suntikan dan perban harus dalam kondisi steril

sebelum digunakan. Kontaminasi akan mengakibatkan infeksi tambahan bahkan

kematian. Pasteurisasi merupakan teknik seleksi mikroba. Pada psteurisasi hanya

membunuh mikroba patogen seperti bakteri Tuberculosis, E. coli dan Salmonella

enterica, tetapi mikroba baik tidak terbunuh. Biasanya pasteurisasi diaplikasikan

pada susu, yaitu memanaskan susu pada suhu 72C selama 15 detik atau 66C

selama 15 menit.

METODE FISIK

Suhu

Suhu tinggi dapat membunuh mikroba. Membran sel dapat rusak (lisis) jika

diperlakukan pada suhu tinggi. Suhu tinggi juga dapat mendenaturasi enzim. Dua

metode suhu tinggi untuk megontrol pertumbuhan mikroba, yaitu panas kering dan

panas basah bertekanan. Air mempunyai kapasitas tinggi membawa panas dan uap

air mampu menahan lebih banyak panas daripada udara kering. Panas basah lebih

efektif dalam membunuh mikroba karena mampu meningkatkan laju penetrasi panas

ke substansi. Panas kering memiliki kemampuan setara panas basah jika waktu

pemanasan diperpanjang. Namun perlu diingat bahwa setiap mikorba memiliki

kemampuan bertahan terhadap paparan suhu. Tujuan kontrol mikroba melalui panas

adalah menurunkan populasi mikroba sampai pada tingkat tertentu yang dapat

diterima atau membunuh semua mikroba psikrofil dan mesofil. Faktor utama dalam

efektivitas perlakuan panas adalah komposisi lingkungan tempat mikroba tumbuh.

Lingkungan berasam dan berkadar garam tinggi meningkatkan laju pembuhan.

Salah satu metode pemanasan dalam membunuh mikroba adalah insinerasi.

Pada abad ke 14 insinerasi digunakan untuk mencegah wabah hitam (black plague),

yaitu memanaskan pada suhu sangat tinggi semua benda milik orang yang terinfeksi

penyakit. Namun teknik insirenasi ditinggalkan karena bersifat merusak. Namun

teknik insirenasi masih dipakai untuk mengatasi penyebaran virus flu burung dan

bakteri antraks.

Teknik sterilisasi kuno adalah tindalisasi. Tindalisasi adalah mendidihkan

larutan pada suhu kamar selama 30 menit sebanyak lebih dari 2 kali (dengan jeda

beberapa jam). Perlakuan jeda adalah untuk membiarkan endospora berubah

menjadi sel vegetatif yang sensitif panas. Biasanya 3 kali pendidihan mampu

membunuh semua endopora. Tindalisasi merupakan teknik sterilisasi sebelum

ditemukan autoklafasi.

Metode sterilisasi umum yang digunakan di laboratoriumd an rumah sakit

adalah autoklafasi. Autoklaf (Gambar 5.1) adalah pengembangan dari pressure

cooker. Autoklafasi biasanya dilakukan pada suhu 121C, tekanan 15-17 psi selama

sedikitnya 15 menit. Pada kondisi demikian semua bentuk kehidupan, sel vegetatif,

endospora, dan virus terbunuh. Semakin banyak media, maka semakin lama waktu

yang diperlukan untuk autoklafasi. Bakteri Bacillus stearothermophilus pembentuk

endospora merupakan bakteri assay dalam menentukan baik tidaknya proses

autoklafasi. Hal ini karena endospora B. Stearothermophilus mampu bertahan

selama 13 menit pada suhu 121C.

Panas kering (oven) sering digunakan untuk sterilisasi alat-alat metal. Hal ini

karena alat-alat metal tidak meleleh pada suhu 160—180C. Namun beberapa alat-

alat bedah dapat menurun ketajamannya jika disterilisasi dengan panas kering.

Gambar 5.1 Autoklaf

Panas kering (oven) sering digu autoklafasi tidak dapat dilakukan pada

substansi yang titik didihnya di bawah 100C maupun protein. Oleh karena itu,

substansi demikian disterilisasi dengan teknik pasteurisasi. Pada awalnya

pasteurisasi digunakan untuk mensterilisasi wine. Kemudia teknik ini banyak

diterapkan untuk sterilisasi susu, protein, dan vitamin. Mikroba patogen yang

biasanya terdapat dalam susu adalah Coxiella burnetti (penyebab demam Q),

Mycobacterium tuberculosis, Brucella, Staphylococcus, Salmonella and E. coli galur

O157:H7. Sekarang pasteurisasi diaplikasikan untuk sterilisasi wine, yogurt, keju, bir,

dan jus. Tabel 5.1 di bawah ini menunjukkan efektivitas teknik sterilisasi panas.

Tabel 5.1 Efektivitas teknik sterilisasi panas

Teknik Sterilisasi Suhu Pemanasan EfektivitasInsinerasi

Pendidihan

Tindalisasi

Autoklaf & Pressure Cooker

Panas kering (oven)

Panas kering (oven)

Pasteurisasi (batch)Pasteurisasi (flash)

>500C

100C

100C

121C; 15 psi; 15 menit

160C; 2 jam

170C; 1 jam

66C; 30 menit72C; 15 detik

Pada material nonflamable tetapi dapat merusak substansi selama proses berlangsung

30 menit mampu membunuh sel vegetatif, tetapi endospora tidak

Dengan 3 kali jeda 30 menit mampu membunuh endospora

Membunuh semua bentuk kehidupan

Efektif untuk material gelas, metal, tetapi tidak efektif untuk karet dan plastik

Sama seperti di atas (perhatikan penurunan waktu 50% untuk kenaikan 10C)

Membunuh sel vegetatif patogenSama seperti diatas (sering

diaplikasikan pada susu)

Suhu rendah tidak membunuh mikroba, tetapi hanya memperlambat bahkan

menghentikan proses metabolisme. Ketika mikroba dipindah ke suhu normal

pertumbuhannya maka mikroba tersebut akan tumbuh dan berkembang. Suhu

refrigerasi (4C) hanya mencegah pertumbuhan mikroba dan memperpanjang umur

makanan. Namun banyak bakteri yang masih bertahan hidup di suhu tersebut,

sehingga dapat mengkontaminasi makanan yang disimpan di dalam lemari es.

Pembekuan sampai suhu -20C dapat menghentikan metabolisme mikroba, tetapi

tidak merusak atau membunuh mikroba. Suhu rendah mampu menyimpan kultur

mikroba pada suhu -196C dalam nitrogen cair mampu menyimpan mikroba sampai

10 tahun tanpa membunuhnya.

Radiasi

Radiasi gelombang elektromagnetik berenergi tinggi (sinar gama, sinar X,

sinar UV, dan electron beam) dapat menghancurkan mikroba. Radiasi dapat dibagi

dalam 2 kelompok, yaitu radiasi ionik dan radiasi non-ionik. Radiasi ionik dapat

memindahkan elektron dari molekul sasaran, sehingga menjadi molekul ionik.

Sedangkan radiasi non-ionik tidak menghasilkan molekul ion. Dengan demikian

radiasi ionik lebih merusak daripada radiasi non-ionik. Sinar X, sinar gama, dan

electron beam adalah sinar beradiasi ionik, sedangkan sinar UV adalah sinar

beradiasi non-ionik.

Pada tingkat energi tinggi, sinar X dan sinar gama mampu mendenaturasi

protein, sedangkan pada tingkat energi rendah mampu mengeksitasi molekul

(misalnya air) menghasilkan produk reaktif (misalnya radikal bebas). Sinar X dan

sinar gama dapat merusak lemak membran sel. Sinar X dan sinar gama dapat

memutus ikatan antarbasa DNA, sehingga dapat menghasilkan mutasi DNA. Pada

itensitas lebih tinggi, sinar X dan sinar gama dapat membunuh mikroba (sterilisasi).

Sinar UV dapat merusak DNA, dengan membuat ikatan kovalen antarbasa,

sehingga menggagalkan proses replikasi dan transkripsi. Sinar UV dapat diserap

oleh banyak molekul. Oleh karena itu sinar UV hanya efektif pada sasaran tanpa

pelindung atau yang berada di permukaan. Namun sinar UV pendek (185 nm)

mampu menembus molekul air dan dapat digunakan untuk sterilisasi air pada reaktor

air limbah (sewage).

Jumlah radiasi untuk sterilisasi mikroba bervariasi tergantung pada banyak

faktor. Bakteri gram negatif lebih sensitif terhadap radiasi daripada bakteri gram

positif. Spora Bacillus dan Clostridium lebih resisten karena molekul khusus spora

yang melindungi terhadap radiasi. Jamur lebih resisten terhadap radiasi

dibandingkan bakteri.

Tabel 5.2 Resistensi mikroba terhadap radiasi

Mikroba Jenis Mikroba Nilai Gy* pada Makanan

Pseudomonas putidaCampylobacter jejuniE. coli (O157:H7)Lactobacillus speciesClostridium perfringens

(vegetative cells)Clostridium botulinum

(spores)Deinococcus radioduransAspergillus nigerSaccharomyces cerevisiaeCoxsackievirus

Bakteri gram negatif batang Bakteri gram negatif batang slender Bakteri gram negatif batang pendekBakteri gram positif batang Bakteri gram positif batang

Bakteri gram positif batang

Bakteri gram positif kokusKapangKhamirVirus

85140260600710

2300

2800500500

4500* G=Gray didefinisikan sebagai penyerapan 1 Joule radiasi per kilogram yang dapat menurunkan populasi 1/10 mikroba.

Filtrasi

Filtrasi adalah pemindahan mikroba dari larutan. Biasanya teknik ini

diaplikasikan pada larutan yang tidak tahan panas, seperti antibiotika dan vitamin.

Dalam industri bir, filtrasi dilakukan untuk menghilangkan khamir sebelum

pengemasan dalam botol. Terdapat 3 jenis filter, yaitu filter berlapis, filter

membran, dan membran nukleofor.

Filter berlapis merupakan jenis filter terkuno, yaitu terdiri dari berlapis-lapis

kertas dan asbestos (atau fiberglas). Filter berlapis tidak mampu menyaring semua

molekul, maka filter berlapis biasanya digunakan sebagai tindakan pra-filtrasi.

Asbestos dan fiberglas tahan terhadap panas, sehingga dapat dikombinasikan

dengan sterilisasi panas bertekanan.

Filter membran adalah filter yang biasa digunakan dalam filtrasi modern.

Filter membran terbuat dari polimer selulose asetat, selulose nitrat, polikarbonat,

poliester, polipropilen, atau polisulfon. Dengan mengontrol proses polimerisasi, maka

dapat dikontrol pula ukuran pori-pori pada filter membran.

Membran nukleofor diperoleh dari memaparkan film tipis polikarbonat

terhadap radiasi nuklir memperlemah polimer, kemudian diperlakukan dengan

etching solution untuk menghasilkan pori-pori. Membran nukleofor biasanya

digunakan untuk menjebak bakteri yang akan dipelajari secara mikroskopis.

Reduksi Air

Semua organisme memerlukan air. Oleh karena itu mereduksi air dari sampel

dapat menghambat pertumbuhan mikroba. Air dapat dihilangkan dengan berbagai

cara, seperti pemanasan, evaporasi, kering beku, atau penambahan garam atau

gula. Pada 3 teknik pertama air langsung dihilangkan dari lingkungan dan sel

mikroba, sedangkan teknik terakhir hanya mengikat air (tanpa menghilangkan) oleh

garam dan gula. Sebelum ditemukan teknik refrigerasi, penggarama merupakan

teknik pengawetan makanan umum. Meskipun demikian banyak mikroba yang dapat

hidup pada lingkungan kering seperti kapang, khamir. Bakteri patogen yang hidup di

dalam tubuh manusia, tidak mampu hidup di lingkungan kering.

METODE KIMIAWI

Kontrol mikroba dapat dilakukan dengan menambahkan kemikalia yang dapat

menghambat pertumbuhan atau membunuh mikroba. Metode kimiawi lebih

menungtungkan daripada metode fisik. Karena metode kimiawi bersifat proteksi

kontinyu sedangkan metode fisik hanya bersifat sementara. Sebagian besar

pengunaan kemikalia dilakukan dengan dosis rendah, karena kemikalia dapat

mengubah kondisi lingkungan, kondisi produk akhir, dan dapat menghasilkan produk

yang tidak diinginkan. Kemikalia juga dapat menghasilkan resistensi mikroba. Hal ini

menjadi perhatian khusus dalam dunia medis (antimikroba atau antibiotika).

Agen antimikroba adalah kemikalia yang dapat membunuh atau

menghambat mikroba. Banyak senyawa alami dan sintetik mempunyai aktivitas

antimikroba. Berdasarkan aktivitas penghambatan, maka kemikalia dibedakan

menjadi 3 kelompok, yaitu –statik, -sida, dan –litik. Akhiran –statik menunjukkan

kemikalia tersebut bersifat menghambatan pertumbuhan. Akhiran –sida

menunjukkan kemikalia tersebut bersifat membunuh. Akhiran –litik menunjukkan

kemikalia tersebut bersifat membunuh dan melisis. Jika kemikalia tersebut efektif

terhadap bakteri, maka disebut bakteristatik, bakterisida, dan bakterilisis. Demikian

halnya dengan fungi.

Efektivitas kemikalia terhadap mikroba tergantung jenis dan konsentrasi

kemikalia. Target agen antimikroba terhadap mikroba adalah merusak DNA,

mengoksidasi makromolekul seperti peptidoglikan dan lemak.

Antiseptik dan Disinfektan

Sejumlah kemikalia digunakan untuk mencegah infeksi atau sepsis. Oleh

karena itu kemikalia tersebut disebut antiseptik. Secara normal antiseptik mampu

membunuh kuman yang hidup di permukaan kulit tetapi aman bagi kulit itu sendiri

(tidak sampai terserap sampai ke dalam). Beberapa antiseptik seperti merkurial,

silver nitrat, larutan iodin, alkohol, dan deterjen sering digunakan sebagai cairan cuci

tangan dan diaplikasikan dalam produk sabun.

Tabel 5.3 Pengunaan antisptik dan disinfektan dan mekanisme aksinyaKemikalia Penggunaan Aksi

AntiseptikEtanol (50-70%)

Isopropanol (50-70%)

Larutan iodine (2% in 70% alcohol)

Silver nitrat (AgNO3)

Detergen (ammonium kuarterner)

Senyawa fenolat ( karbol, lisol, heksilresorsinol, heksaklorofen)

DisinfektanFormalin (8%)

Klorin (Cl2)

Merkuri klorida

Detergen (senyawa ammonium kuarterner)

Senyawa fenolat ( karbol, lisol, heksilresorsinol, heksaklorofen)

Etylen oksida (gas)

Antiseptik untuk kulit

Antiseptik untuk kulit

Antiseptik untuk kulit

Antiseptik umum, biasanya digunakan pada mata bayi

Antiseptik kulitAntisptik pada dosis

rendah

Disinfektan, membunuh spora

Disinfeksi air minum, disinfektan umum

Disinfektan, tetapi terkadang digunakan sebagai antiseptik

Pada dosis tinggi dan bersama kemikalia lain bersifat disinfeksi

Disinfektan pada dosisi tinggi

Disinfektan, biasanya untuk menstrilisasi substansi tidak tahan panas seperti karet dan plastik

Mendenaturasi protein dan melarutkan lipid

Mendenaturasi protein dan melarutkan lipid

Menonaktifkan protein

Mempresipitasi protein

Merusak membran selMendenaturasi protein dan

merusak membran

Bereaksi dengan gugus NH2, SH dan COOH

Membentuk asam hipoklorida (HClO; pengoksidasi kuat)

Menonaktif protein (bereaksi dengan gugus sulfida)

Merusak membran sel

Mendenaturasi protein dan merusak membran

Agen alkilasi

Disinfektan adalah kemikalia yang membunuh mikroba, tetapi tidak aman

jaringan hidup (misalnya kulit manusia). Beberapa disinfektan umum digunakan oleh

manusia adalah larutan klorin, tembaga sulfat, dan senyawa amonium kuarterner.

Bahkan terdapat disinfektan yang mampu membunuh segala bentuk kehidupan di

suatu area tertentu disebut sterilan. Disinfektan biasanya digunakan untuk

membersihkan lantai, dinding, dan langit-langit. Tujuan disinfeksi adalah

memperkecil kontaminasi.

Perbedaan antara antisptik dan disinfektan biasanya terletak pada dosis atau

konsentrasi aplikasi. Larutan 0,02% sodium hipoklorit (pemutih) mampu membunuh

mikroba patogen dan aman bagi manusia (jika ditelan). Namun pada dosis 6% tidak

ada seorangpun yang mau menelannya.

Sejumlah faktor dapat mempengaruhi efektivitas disinfektan. Biofilm dapat

mencegah dan menghambat difusi disinfektan. Biofilm merupakan agregasi mikroba

di permukaan substrat. Konsentrasi tinggi senyawa organik dapat menurunkan

efektivitas disinfektan. Endospora merupakan bentuk resistensi mikroba dan juga

tahan terhadap disinfektan, tetapi disinfektan tertantu (formalin dan pemutih) dapat

merusak endospora.

Pengawet (Preservatif)

Pengawet adalah agen statik yang ditambahkan ke makanan dan materi

medis untuk menghambat pertumbuhan mikroba. Senyawa pengawet harus aman

bagi saluran pencernaan dan peredaran darah.

Garam seperti propionat, sorbat, benzoat, dan laktat merupakan pengawet

yang berperan dalam meningkatkan konsentrasi proton di sitoplasma. Mereka

termasuk asam lemah dan non-polar dan mudah masuk ke dalam sel mikroba.

Akibatnya mikroba berusaha mempertahan nilai pH internal dengan memompa

keluar proton, sehingga alih-alih tumbuh, mikroba berusaha bertahan hidup dari

serangan asam. Pengawet asam lemah ini efektif pada nilai pH 5,5 atu lebih rendah.

Paraben adalah derivat fenol dan berefek pada membran sel. Paraben

menghambat pertumbuhan mikroba dengan merusak membran sel, sehingga uptake

nutrien terhambat dan meniadakan proton motive force.

Sulfit merupakan antioksidan efektif, mencegah browning buah. Sulfit

merupakan senyawa reaktif dan mudah menyerang protein, gugus prostetik, gula,

dan asam nukleat. Target sulfit adalah lemak membran, DNA (replikasi & translasi),

dan enzim.

Nitrat ditambahkan pada daging untuk menghambat pertumbuhan bakteri

penghasil toksin Clostridium botulinum. Nitrat bekerja dengan menghambat 2 enzim,

yaitu pyruvate-ferrodoxin oxidoreductase dan ferrodoxin.

Tabel 5.4 Pengunaan pengawet dan mekanisme aksinyaPengawet Penggunaan Dosis Efektif

Propionic acid and propionates

Sorbic acid and sorbates

Benzoic acid and benzoates

Sodium diacetateLactic acid

Methyl, propyl and heptyl paraben

Sulfur dioxide, sulfites

Sodium nitrite

Sodium chloride

Sugar

Wood smoke

Agen antifungi pada roti, cake, dan keju

Agen antifungi pada jeli, sirup, cake, dan keju.

Agen antifungi pada minuman ringan, margarin, cider, dan relishes

Agen antifungi pada rotiAgen antimikroba pada

keju, buttermilk, yogurt dan pickled foods

Agen antimikroba pada bir, jus buah, selai, jeli, sirup, dan wine

Agen antimikroba pada buah kering, anggur, dan molase

Agen antibakteri pada ikan dan daging

Mencegah kerusakan mikroba pada daging dan ikan

Mencegah kerusakan mikroba pada selai, dan jeli

Mencegah kerusakan mikroba pada daging, dan ikan

0. 3%

0. 2%

0. 1%

0. 3%Variasi

0.04 0.2 %

0.02-0.03 %

0.02 %

Variasi

Variasi

NA

Antibiotik

Antibiotik adalah kelompok kemikalia yang dapat menghambat atau

membunuh mikroba. Antibiotik memiliki berat molekul rendah dan efektif pada dosis

rendah. Antibiotik pertama kali ditemukan merupakan metabolit ter-ekskresi dari

mikroba, tetapi saat ini sebagian besar antibiotika merupakan produk sintetik dan

semisintetik (produk alami dengan modifikasi sintetik) dari industri farmasi. Antibiotik

sangat penting dalam mengatasi penyakit.

Menentukan efektivitas antibiotik dalam menghambat pertumbuhan mikroba

merupakan hal penting dalam aplikasi medis. Asay antimikroba yang baik harus

dapat memenuhi 2 hal penting, yaitu harus bersifat antimikroba dan diperoleh dosis

tepat yang efektif terhadap mikroba target. Efektivitas antimikroba tergantung pada

beberapa hal seperti sifat alami mikroba target, kondisi lingkungan, waktu kontak

mikroba dan agen, suhu, pH, dan jumlah aerasi.

Gambar 5.2 Metode MIC dalam menentukan efektivitas suatu antibiotik

Asay standar biasanya mengunakan metode MIC (minimum inhibitory

concentration) (Gambar 5.2). pada metode MIC harus diperoleh dosis minimal yang

mampu menghambat pertumbuhan mikroba. Pada situasi lain sangat penting untuk

menentukan MLC (minimal lethal concentration) yaitu dosis minimal yang mampu

membunuh mikroba.

Metode lain untuk menentukan efektivitas antibiotik adalah metode difusi

agar. Dalam metode ini kultur mikroba target ditumbuhkan merata di media agar. Di

tempat tertentu agen dibiarkan berdifusi ke media agar yang berisi kultur mikroba

target. Mekanisme difusi agen dapat melalui cakram kertas atau pembuatan

sumuran agar. Selama inkubasi agen akan terdifusi dan mikroba yang hidup dekat

difusi agen akan menyingkir. Jika agen memiliki aktivitas antibiotik, maka akan

dijumpai area bening disekitar difusi agen. Ukuran area bening mengindikasikan

kemampuan difusi dan antimikroba agen. Metode difusi penting untuk mengetahui

snesitivitas mikroba terhadap agen antibiotik.