Bortezomib Menghambat Proteasome Menekan

Pengaktifan Nuklear Factor-Kappa B (NF-120581B) dan

Memperbaiki Peradangan Mata Pada Percobaan Uveitis

Autoimmune (EAU)

Bortezomib adalah suatu penghambat proteasome yang digunakan untuk

perawatan kanker darah Sejak dapat menekan pengaktifan NF-120581B untuk proses peradangan bortezomib telah ditemukan proses aktivitas anti-radang Dalam studi ini kami mengevaluasi efek bortezomib pada experimental autoimmune uveitis

(EAU) pada tikus dan menyelidiki potensi mekanisme NF-120581B inaktif Bortezomib dosis tinggi (075MgKg) Bortezomib dosis rendah (015MgKg) atau larutan garam fosfat yang diberikan setelah induksi EAU Kita menemukan bahwa EAU diperbaiki oleh terapi bortezomib dosis tinggi dikombinasi dengan

bortezomib dosis rendah atau terapi PBS DNA mengikat aktivitas dari NF-120581B

yang menekan dan memunculkan mediator radang yang mencakup TNF-120572 IL-

1120572 IL-1120573 IL-12 IL-17 dan MCP-1 diturunkan pada kelompok terapi bortezomib dosis tinggi Hasil mendukung bahwa protease inhibitor adalah terapi yang menjanjikan untuk uveitis autoimun

1 PendahuluanUveitis merupakan penyebab utama kebutaan dan melemahnya

penglihatan Sekitar 15 -30 uveitis terjadi di koroid dan retina oleh karena itu diklasifikasikan menjadi uveitis posterior atau uveoretinitis [1] Uveitis posterior cenderung merusak photoreceptor sel dan menyebabkan kebutaan permanen Peradangan Intraocular sering dihubungkan dengan respon autoimun untuk protein retina [2] Dasar terapi uveitis adalah terapi immunosuppressive mencakup kortikosteroid antimetabolik dan alkylating agen Berkaitan dengan pembatasan dosis dan efek samping obat hasil terapi autoimmunemediated uveitis tak memuaskan [3] Pendekatan Novel untuk mengendalikan proses radang pada uveitis oleh sedang teliti dikembangkan baik pada manusia dan binatang [ 4]

Experimental autoimmune uveitis (EAU) di mana mata yang meradang dipengaruhi kekebalan aktif dari antigen retina yang paling sering digunakan adalah model rodent untuk studi uveitis autoimun [5] Histologi khas pada EAU uveitis posterior dengan infiltrasi sel radang ke rongga vitreus retina dan koroid dan menyebabkan kerusakan pada

lapisan sel photoreceptor [3] Nuclear Factor-Kappa B (NF-120581B)

1

mempunyai peranan sangat penting dalam peradangan Beberapa studi

sebelumnya sudah menunjukkan bahwa peningkatan aktivitas NF-120581B

pada EAU dan menekan NF-120581B dapat memperbaiki peradangan [67]

Beberapa mediator peradangan pengatur NF-120581B termasuk Interleukin-

( IL-) 1 IL-6 tumor necrosis faktor- ( TNF-) 120572 interferon- (IFN-) 120574 monocyte chemoattractant protein- (MCP-) 1 and inducible nitric oxide synthase (iNOS) ditemukan meningkat pada binatang dengan EAU dan

mungkin modulasi dengan terapi target NF-120581B [3]

Penurunan I120581B oleh proteasome penting untuk pengaktifan NF120581B

[89] Sementara itu penghambat aktivasi NF-120581B telah ditunjukkan pada penyakit autoimun dengan percobaan model binatang seperti miastenia gravis psoriasis radang sendi dan autoimmune encephalomyelitis [1013] Bagaimanapun sdikit pengetahuan mengenai efektivitas penghambat proteasome pada uveitis autoimun Di sini kami menunjukkan efektivitas bortezomib 26S penghambat proteasome penghambat IRBP pada EAU

2 Metode dan bahan21 Tikus Betina C57Bl6J (B6) Tikus-tikus (usia 8-12 minggu) telah

diperoleh dari Laboratorium Binatang Pusat di Cheng-Kung Nasional Universitas dan digunakan untuk semua eksperimen Semua eksperimen telah dilakukan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh Badan Kepedulian Binatang dan komite National Cheng-Kung University dan dengan pendapat ARVO untuk menggunakan binatang dalam riset mata

22 Induksi dan terapi EAU EAU seperti yang diuraikan sebelumnya dengan modifikasi [14] singkatnya tikus telah diimunisasi dengan

100 120583L larutan emulsi phosphate saline (PBS) berisi 200 120583g IRBP peptide1ndash20 (hIRBP1ndash20) (GPTHLFQPSLVLDMAKVLLD) dan

complete Freundrsquos adjuvant (CFA) berisi 500 120583g Mycobacterium tuberculosis inaktif H37RA (Difco Laboratories DetroitMI USA) Tikus menerima emulsi pada dua lokasi punggung bawah yang diikuti

injeksi intraperitoneal (ip) 15 120583g pertusis toksin (PTX) sebagai tambahan terapi Tikus diterapi dengan PBS bortezomib (Millennium Pharmaceuticals Cambridge BU) dosis 075 atau 015mgkg (kelompok Velcade (H) dan (L) resp) atau etanercept (EnbrelWyeth PharmaceuticalsHampshireUk) dosis 5mgkg dalam 01mL ip injeksi dua kali dalam satu minggu mulai pada hari EAU

23 Skor klinis EAU Fundus okuli mata tikus diuji dengan slit lamp dua kali seminggu dari 7 hari setelah induksi sampai akhir eksperimen

2

untuk tanda klinis EAU Dilatasi pupil menggunakan tropicamide dan phenylephrine hydrochloride solutions Peradangan secara klinis dinilai dengan skala 1-5 seperti diuraikan sebelumnya [15] Singkatnya 0= tidak (ada) radang 1= focal vasculitis le 5 bercak atau soft eksudat le 5 2= linier vasculitis atau bercak eksudat lt 50 retina 3= linier vasculitis atau bercak exudates ge 50 retina 4= perdarahan retina atau eksudat membandel dan vasculitis 5= exudative retinal detasemen atau perdarahan subretina (atau vitreus) Seekor tikus dipertimbangkan menderita uveitis jika sedikitnya salah satu matanya mempunyai skor dua atau lebih Uveitis jika score klinis tertinggi dicapai oleh mata manapun seekor tikus

24 Evaluasi histopatologi Mata utuh dikumpulkan saat puncak respon klinis (21 hari setelah induksi pada EAU) yang direndam formaldehida 10 kemudian menyimpannya sampai diproses

Keringkan dan perbaiki jaringan tempelkan pada paraffin dan 3 120583m potong jalur cornea-nervus optic dan kemudian stained dengan hematoxylin dan eosin ( HampE) ada tidaknya penyakit telah dievaluasi dalam blinded fashion oleh pengujian enam potongan bagian dari perbedaan level masing-masing mata Peradangan dalam grade histologi dinilai dalam skala 1-4 seperti diuraikan sebelumnya [16] Singkatnya 0 tidak ada perubahan 1 berarti infiltrasi sel sedikit dan fokal retina melipat 2 berarti infiltrasi sel sedang dan retina melipat 3 berarti infiltrasi sel sedang - banyak dan lipatan retina luas dengan detasemen 4 berarti infiltrasi sel banyak dengan detasemen retina berhamburan Oleh karena itu infiltrasi leukosit ke rongga vitreus dan lipatan retina dikatakan uveitis posterior

25 Preparat Retinal Lysate untuk Analisa Luminex Enukleasi mata dari euthanize tikus Bola mata dipotong tengah antara ora serat kutub posterior mata dipisahkan dari kutub anterior dan lensa Dari kutub posterior neurosnsori retina adalah ekstraksi dari lapisan epitel pigmen retina Ekstrak dari enam retina yang ditempatkan pada 300 120583L of 05NP-40 (Abcam) dalam es (satu menit) dan sonicated singkat lima kali dalam 10 menit dalam intensitas pemeriksaan 7 (MicrosonTM XL2000 Ultrasonic liquid processor Qsonica LLC Newton CT) Setelah membersihkan material tak larut oleh sentrifugasi (200 x g untuk 5 min) konsentrasi protein dari ekstrak retina terukur 280 dalam ND-1000 Spektrofotometer Kemudian retinal lysate digunakan untuk Analisa Luminex

26 Analisa mediator peradangan pada retina oleh Luminex Perhitungan

TNF-120572 IFN-120574 IL-1120572 IL-1120573 IL- 4 IL-6 IL-12 IL-17 dan MCP-1

3

pada jaringan retina menggunakan murine multiplexing bead immunoassays (Invitro genCarlsbad CA) sesuai instruksi pembuatan

Singkatnya 25 120583L sampel retina pada PBS yang diinkubasi dengan antibody-coupled beads Setelah urutan dicuci biotinylate pendeteksi antibody ditambahkan dalam beads dan reaksi campuran dideteksi oleh penambahan streptavidinphycoerythrin Set bead dianalisa menggunakan flow-based Luminex 200 suspension array system (Luminex Korporasi Austin TX AS)

27 Pengukuran Aktivitas Proteasome di Retina Aktivitas chymotrypsin dan trypsin padaproteasome retina dalam bortezomib atau terapi PBS tikus-tikus yang sacrificed 21 hari setelah induksi EAU ditentukan menggunakan kotak pengujian kadar proteasome (Proteasome-Glo menguji kadar Promega) sesuai instruksi pembuatan Singkatnya Suc-Llvy-Glo Substrate (untuk aktivitas chymotrypsin) atau Z-Lrr-Glo Substrate (untuk aktivitas trypsin) telah ditambahkan campuran Proteasome-Glo buffer dan reagen reaksi luciferin dan diinkubasi

pada suhu kamar selama1 jam Jaringan retina yang dipotong 100 120583L dalam es dingin PBS berisi 5mM EDTA diikuti sentrifugasi 12000 g

pada 4oC selama 10 menit 50 120583L sampel retina ditambah volume sama dari campuran reagen dan diinkubasi selama 90 beberapa menit Akhirnya luminesensi sampel retina dideteksi oleh suatu microplate luminometer (Promega)

28 Ekstrak protein inti dan mobilitas Electrophoretic Shift Assay

(EMSA) pada NF-120581B Ekstrak protein inti seperti yang telah dibahas sebelumnya [17] Singkatnya retina diiris 05 mL lysis buffer (10mMHEPES 15mMKCl 10mM MgCl2 10mM DTT dan 10mM PMSF) Jaringan yang homogeny di sentrifugasi 5000 g pada suhu

4∘C selama 10 menit Endapan suspense 200 120583L dari ekstraksi buffer (20mM HEPES 25 glycerol 15mM MgCl2 420mM NaCl 05mM

DTT 02mMEDTA 05mM PMSF dan 4 120583M leupeptin) serta suspense dari inkubasi di es selama 30 menit Sampel kemudian disentrifugasi pada 12000 g pada suhu 4∘C selama 30 menit Supernatant berisi protein inti dikumpulkan dan disimpan pada suhu - 70oC sampai dipergunakan Konsentrasi Protein telah ditentukan dengan asam bicinchoninic (Pierce Biotechnology Rockford IL)

EMSA dilakukan dengan NF-120581B DNA- pengikat system pendeteksi

protein (Pierce Biotechnology) sesuai instruksi pembuatan 10 120583g

protein inti diinkubasi dengan diberi label biotin NF-120581B konsensus oligonucleotide (51015840-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-31015840) selama 30 menit dalam pengikat buffer Spesifikasi DNA protein ditentukan

4

dengan menambahkan 100 kali kelebihan tidak diberi label NF-120581B oligonucleotide untuk kompetitif dibungkus 10 menit sebelum menambahkan biotin diberi label pemeriksaan

29 Analisa statistic Nilai ditunjukkan sebagai rata-rata plusmnSD Untuk perbandingan statistic data sudah dianalisis oleh Wilcoxon signed-

rank test Studentrsquos 119905-test or Chi-square test menggunakan software

prisma 50 dalam semua tes 119875 values lt 005 merupakan pertimbangan statistic yang penting

3 Hasil 31 Bortemozib Dosis Tinggi secara Signifikan Menurunkan Uveoretinitis

pada Tikus EAU EAU diinduksi pada tikus dengan menyuntikkan emulsi 200 μg of IRBP1ndash20 dengan CFA secara subkutan dan 15 μg toksin Pertussis (PTX) secara intraperitoneal seperti yang dijelaskan dalam Bagian 2 Pada waktu yang sama bortemozib berdosis tinggi (075 mgkg) dan berdosis rendah (015 mgkg) disuntikkan secara intraperitoneal pada tikus dan lalu dua kali seminggu hingga akhir eksperimen Sekelompok tikus yang menerima PBS bukan bortemozib bertindak sebagai kontrol Dalam kelompok perlakuan-PBS penyakit menunjukkan tanda inflamasi 9-15 hari kemudian dan berkembang selama 4-5 hari saat mencapai puncak Tikus yang menerima imunisasi IBRP1ndash20 ditambah dengan terapi bortemozib berdosis-tinggi menunjukkan penundaan yang signifikan pada awal penyakit dan nilai puncak EAU yang secara signifikan lebih rendah dari waktu ke waktu (Gambar 1(a) Tabel 1) Sementara kedua tikus perlakuan-saline dan perlakuan bortemozib berdosis rendah memiliki insiden penyakit yang lebih tinggi (14 dari 19 dan 10 dari 17 resp) kami mengamati bahwa tikus dengan perlakuan-bortemozib berdosis tinggi memiliki insiden EAU yang secara signifikan lebih rendah (3 dari 19 P lt 005) (Tabel 1) Tikus yang menerima perawatan saline memiliki nilai keparahan 216 plusmn 025 sementara tikus yang menerima perawatan bortemozib berdosis-tinggi memiliki nilai mean klinis keparahan 058 plusmn 018 (P lt 005) (Tabel 1) Tikus yang menerima perawatan bortemozib dosis-rendah menunjukkan nilai mean klinis keparahan 200 plusmn 023 yang mana tidak berbeda secara signifikan dari kelompok kontrol perlakuan-saline Fakta bahwa mayoritas tikus yang diberikan bortemozib berdosis tinggi memiliki nilai puncak 1 atau lebih rendah (yaitu ringan atau tidak ada penyakit) mengindikasikan aktivitas menekan dari bortemozib pada EAU Sebagai tambahan pemeriksaan HampE slide parafin berwarna tetap menunjukkan bagian retina dari tikus EAU yang menerima bortemozib berdosis-tinggi memiliki infiltrasi sel yang berkurang dalam rongga

5

vireous dan struktur layer retina kekurangan lipatan retina yang diamati dalam tikus perlakuan-saline (Gambar 1(b)ndash1(e)) Tidak ada kematian atau ekstraocular morbiditas yang berhubungan dengan perawatan bortemozib pada eksperimen hewan Berat badan dan tingkat haemoglobin tikus tidak berbeda secara signifikan antara kelompok perlakuan saline dan bortemozib pada akhir eksperimen (data tidak ditunjukkan) Juga tidak terdapat pertumbuhan tumor atau infeksi setelah perawatan bortemozib pada penelitian kami

32 Terapi Bortemozib Menekan EAU lebih dari Terapi Antagonis TNF-Alpha Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa antagonis TNF-α dapat menekan uveits pada manusia dan tikus [1819] Maka kami membandingkan efek penekanan EAU dengan bortemozib atau antagonis etanercept TNF-α Bortemozib (075 mgkg) atau etanercept (5 mgkg) disuntikkan pada tikus EAU dua kali seminggu dari hari induksi EAU Sekelompok tikus yang menerima PBS (01 mLtikus) bertindak sebagai kontrol Tikus yang menerima imunisasi IRPB1-20 ditambah perawatan dengan menunjukkan penundaan dalam onset penyakit dan memiliki nilai puncak EAU yang lebih rendah dari waktu ke waktu (Gambar 1(f) Tabel 2) Tikus yang menerima terapi etanercept juga memiliki insiden dan nilai mean puncak yang lebih rendah Akan tetapi perbedaan antara kelompok perlakuan saline- dan etanercept tidak mencapai signifikansi statistik (Tabel 2 P = 006) karenanya terapi dengan bortemozib menekan perkembangan dan parahnya EAU lebih efektif dari antagonis etanercept TNF-α Tidak ada kematian morbiditas pertumbuhan tumor atau infeksi yang berhubungan dengan perawatan bortemozib atau etanercept pada tikus EAU pada akhir eksperimen

33 Pengaruh Bortezomib pada Tingkat Mediator Inflamasi pada Retina Tikus EAU Kami lalu mengukur tingkat cytokine pada retina tikus EAU dengan terapi yang berbeda Saat membandingkan kelompok terapi-saline dengan kelompok terapi-bortezomib dosis rendah sementara tingkat cytokine tidak berbeda secara signifikan (Gambar 2(a)-2(i)) Sementara tingkat TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 pada retina secara signifikan lebih rendah pada tikus EAU yang diperlakukan dengan bortezomib dosis tinggi saat dibandingkan dengan tikus yang diberi prlakuan-saline (P lt 005 pada semua pembanding berpasangan) (Gambar 2(a) 2(b) 2(c) 2(f) 2(h) and 2(i)) Akan tetapi tidak terdapat perbedaan signifikan yang tercatat pada IFN-γ IL-4 dan IL-6 antara penerapan-bortezomib berdosis-tinggi dan penerapan-saline pada tikus EAU (Gambar

6

2(d) 2(e) dan 2(g)) Saat membandingkan kelompok perlakuan dengan bortezomib berdosis-tinggi dan berdosis-rendah kami menemukan bahwa tingkat TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 rendah pada kelompok bortezomib berdosis-tinggi dengan kelompok bottezomib berdosis-rendah (P lt 005 pada semua pembanding berpasangan) (Gambar 2(a) 2(b) 2(c) 2(f) 2(h) dan 2(i))

34 Penerapan Bortezomib secara Signifikan Menurunkan Aktivitas Proteasome tikus EAU Kami lalu melakukan aktivitas pengujian kadar proteasome protease untuk mengevaluasi efek menekan dari penerapan bortezomib pada jaringan retina Sinyal luminescence mengindikasikan aktivitas seperti-kimotripsin atau seperti-trypsin pada jaringan retina dari tikus EAU Sinyalny secara signifikan lebih rendah pada kelompok perlakuan-bortezomib berdosis-tinggi (P lt 005) (Gambar 3(a) dan 3(b)) Juga terdapat perbedaan signifikan pada luminescence sinyal antara bortezomib berdosis-rendah dan kelompok perlakuan-saline (Gambar 3(a) dan 3(b))

35 Peningkatan Pengikat dari NF-κB dan DNA pada tikus EAU Terhambar oleh perlakuan Bortemozib Keterlibatan jalur NF-κB saat terapi bortemozib pada EAU dianalisa dengan EMSA Dibandingkan dengan kelompok Na V ve pengikatan DNA NF-κB meningkat secara signifikan setelah induksi EAU (Gambar 4 pergeseran Na V ve dan Saline) Peningkatan aktivitas dari pengikatan DNA NF-κB setelah induksi EAU dengan nyata terhambat oleh terapi bortemozib berdosis-rendah Terapi bortemozib berdosis-tinggi lebih jauh menekan pengikatan DNA NF-κB (Gambar 4 Pergeseran Vel (L) dan Vel (H)) Menambahkan molar NF-κB tak berlabel 100 kali lipat penyelidikan seluruhnya memblok pengikatan dari penyelidikan berlabel pada DNA NF-κB kompleks (Gambar 4 Pengangkatan 100X) karenanya bortemozib menurunkan pengikatan dari DNA NF-κB secara dosis-responsif Hasil dari inhibisi protease (Gambar 3) dan pengikatan DNA NF-κB mengimplikasikan bahwaaktivasidariNF-κBsecara efektif ditekan olehpenghambatanproteasome

4 PembahasanHasil demonstrasi penelitian kami menunjukkan bahwa bortezomib

sebuah proteasom inhibitor 26S aktif dalam menekan pengaktifan NF-κBdan efektif dalam menghambat peradangan mata dan menurunkan produksi mediator inflamatory pada EAU Hasil kami mengindikasikan bahwa inhibisi

7

dari proteasome mungkin adalah pendekatan yang menjanjikan untuk terapi autoimun uveitis

Bukti baru-baru ini mengindikasikan bahwa NF-κB memiliki peran penting dalam EAU dan inhibisi dari pengaktifan NF-κB dapat mengurangi tingkat inflamasi jaringan dengan menurunkan mediator inflamator dan infiltrasisel keuvea

Karena degradasi proteasomal dari faktor inhibitor IκB penting bagi aktivasi NF-κB inhibisi dari proteasome mempertahankan NF-κB dapa keadaan tidak aktif dalam cytosol dan mencegah translokasi nucleus Inhibisi proteasome ditemukan efektif dalam terapi beberapa hewan model dari penyakit autoimun seperti myasthenia gravis psoriasis arthritis dan autoimmune encephalomyelitis [10ndash13] Lebih lagi Chan et al telah menunjukkan efek anti-inflamatory pada inhibitor proteasone pada induksi-endotoksin uveits pada tikus [17] Inhibitor proteasome bortezomib disebabkan karena aktivitasnya untuk menekan degradasi protein nonlysosomal telah digunakan pada perawatan kanker hematologis pda pengaturan klinis [20] Pada penelitian ini kami memilih bortemozib berdasarkan pada kemanjuran tingginya pada konsentrasi minimal dan dapat diterima dan dapat terkelolanya efek merugikan dalam merawat penyakit hematologi manusia [21] Untuk pengetahuan kita penelitian kami adalah yang pertama mendemonstrasikan efek anti-inflamatorynya pada EAU

Menjadi sebuah kondisi induksi-autoantigen autoimmune EAU memiliki inflamasi yang didominasi oleh respon inflamatory akut cytokine [3] Dalam penelitian kami kami menemukan bahwa tingkat dari mediator inflamatory termasuk di dalamnya TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 secara signifikan meningkat pada perlakuan-saline tikus EAU saat dibandingkan dengan mereka pada tikus na Vve (Gambar 3) TNF-α adalah cytokine proinflamasi utama dan memainkan peran utama dalam uveitis autoimmune [3] AntagonisTNF-α telah digunakan secara klinis untuk terapi gangguan ocular inflamatory dengan sukses [1922] Karenanya dalam penelitian ini kami membandingkan efek anti-inflamatory antara inhibitor proteasine bortemozib dan antagonis TNF-α etanercept pada EAU Etanercept sebuah protein chimeric dari reseptor TNF-α manusia dan bagian Fc dari rantai berat G immunoglobulin dapat menetralisir TNF-α dan menghalangi aktivitas proinflamatorynya baik pada manusia dan tikus [18 23 24] Kami menemukan bahwa perawatan bortemozib pada EAU tikus dapat menekan tidak hanya TNF-α namun juga banyak mediator inflamator lain seperti as IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 pada retina jadi autoimmune uveitis dapat lebih efektif menekan dengan bortemozib dibanding dengan antagonis etanercept TNF-α (Gambar 1(f)) Bortemozib

8

yang mana dapat menekan banyak inflamator cytokines melalui penghambatan aktivasi NF-κB tampaknya menjadi agen anti-inflamatory yang lebih baik dalam perawatan dari autoimmune uveitis dibanding antagonis TNF-α

Mekanisme dari efek antri-peradangan dari bortezomib bagaimanapun mungkin lebih kompleks dibanding inhibisi dari pengaktivan NF-κB Saat induksi EAU kiranya melibatkan keberadaan antigen dari antigen immunogenic molekul kompleks kelas I dan kelas II oleh histocompatibility utama inhibisi proteasome yang mana adalah komponen penting dari pemrosesan antigen juga mempengaruhi proses pengenalan autoimun pada tahap kekebalan dan stimulasi [25ndash29] sebagai tambahan karena itu inhibitor proteasome dapat menekan beberapa langkah kunci yang diperlukan dalam pengaktivasian respn autoimun pada EAU

Dalam penelitian kami tikus yang diperlakukan bortezomib dari hari yang sama saat diinduksi EAU untuk memastikan awal efek obat selama tahap awal pada perkembangan penyakit Kami tidak mengevaluasi kemanjuran obat saat diperlakukan setelah EAU berkembang sepenuhnya yang biasanya adalah kasus pada pengaturan klinis Pada akhir percobaan setelah pengobatan bortezomib atau etanercept tidak ada kematian pertumbuhan tumor atau infeksi berat yang tercata Namun karena proteasome dan distribusinya yang tersebar mengatur jangkauan luas dari fungsi biologis efeksamping sistemikyang berhubungan dengan inhibitor proteasome layak untuk dipertimbangandengan cermat

Sebagai kesimpulan kami mendemostrasikan pengujian perbaikan EAU pada tikus tergantung pada dosis Mengurangi peradangan intraocular berhubungan dengan penekan pengaktifan NF-κB dan menurunkan peningkatan dari banyak mediator peradangan Hasil kami mengindikasikan bahwa obat yang menargetkan proteasom mungkin adalah strategi pengobatan yang efektif untuk autoimun uveitis di masa depan

Gambar 1 Efek dari bortemozib pada EAU diinduksi dengan IRBP (a) Perbandingan nilai klinis dari tikus EAU yang diperlakukan dengan

bortemozib berdosis-tinggi (075mgkg) (garis merah 119899 = 19) bortemozib

berdosis-rendah (015mgkg) (garis hitam 119899 = 17) atau PBS (garis biru 119899 = 19) dalam 01 mL data menunjukkan bahwa nilai mean klinis (ordinate) dari tiap kelompok eksperimen dari waktu ke waktu (abscissca) dan jumlah dari tiga eksperimen independen Perbandingan dari tikus EAU dengan perlakuan-bortemozib berdosis-tinggi (jalur gejala klinis) (bergaris biru) dengan tikus perlakuan-saline (garis merah) menunjukkan perbedaan yang signifikan dan diindikasikan sebagai ( ) Perbandingan dari perlakuan-bortemozib berdosislowast

9

tinggi (garis biru) dengan perlakuan-bortemozib berdosis-rendah (garis hitam) pada tikus EAU juga menunjukkan perbedaan signifikan dan diindikasikan

sebagai ( ) lowast lowast119875lt 005 melalui Wilcoxon signedrank test (b) (c) (d) dan (e) photomicrographs dari jaringan retina HampE berwarna Representatif photomicrographs slide berwarna paraffin-tetap HampE dari (b) tikus naumlıve C57BL6 tanpa induksi EAU (c) tikus EAU yang menerima perawatan PBS 01mL ( mengindikasikan leukocytes dalam rongga vitreous lowast lowastlowast mengindikasikan lipatan retina) (d) tikus EAU yang menerima perawatan bortezomib dosis-rendah (015mgkg) ekperimen diulangi tiga kali dengan hasil yang serupa CGL layer sel ganglion INL layer atom dalam ONL layer atom luar (f) nilai klinis rata-rata dari waktu ke waktu pada tikus EAY

dengan bortezomib berdosis-tinggi (075mgkg) (garis biru119899 = 9) etanercept

(5mgkg) (garis hitam119899 = 6) atau perawatan saline (01 mLtikus) (garis

merah119899 = 7) Data menunjukan nilai mean klinis (ordinate) dari tiap kelompok eksperimen (abscissa) dan jumlah dari dua eksperimen independen

lowast119875lt 005 melalui signed-rank test

Gambar 2 Evaluasi dari ekspresi protein dari mediator inflamatory pada retina

tikus EAU pada analisis Luminex Penurunan ekspresi dari TNF-120572(a) IL-

1120572(b) IL-1120573(c) IL-17 (f) IL-12 (h) dan MCP-1 (i) relatif pada ekspresi dalam kelompok perlakuan-saline tercatat dalam kelompok bortezomib berdosis tinggi (Vel [H]) tapi tidak dalam kelompok bortezomib berdosis

rendah (Vel [L]) kecuali untuk TNF-120572 Sebagai tambahan tidak ada

perbedaan signifikan pada ekspresi IFN-120574(d) IL-4 (e) dan IL-6 (g) pada retina antara tikus bortezomib dan perlakuan-saline Data yang diekspresikan sebagai mean SD dari tiga eksperimen independen (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001 vmelalui -test siswa

Gambar 3 Evaluasi aktivitas seperti-chymotrypsin dan seperti-trypsin dari proteasome Dibandingkan dengan kelompok EAU perlakuan-saline terdapat penurunan aktivitas signifikan seperti-chymotrypsin (a) dan aktivitas seperti-trypsin (b) pada kelompok bortezomib [Vel (L)] dan dosis-tinggi [Vel (H)] Aktivitas juga ditandai secara rendah pada kelompok perlakuan-bortezomib berdosis-tinggi dibanding dengan kelompok bortezomibtreated berdosis-rendah Data diekspresikan sebagai mean plusmn SD dari mean pada 5 tikus untuk

tiap kelompok (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001

via Studentrsquos 119905-test

10

Gambar 4 EMSA untuk mengevaluasi NF-120581B pengikat aktivitas DNA pada

tikus dan perbedaan kelompok pada EAU tikus Garis 1 p50 subunit NF-120581B Garis 2 pemeriksaan Cuma-Cumafree probe (FP) Garis 3 tikus C57BL6 Garis 4 EAU tikus dengan terapi garam Garis 5 EAU tikus diterapi dengan bortezomib dosis rendah (Vel [L]) Garis 6 EAU tikus diterapi dengan

bortezomib dosis tinggi (Vel [H]) Garis 7 100 kali molar NF-120581B pmeriksaan

yang tidak diberi label Garis 8 anti-p65 subunit NF-120581B Sampel adalah kedua mata dari lima tikus pada masing-masing kelompok Data merupakan hasil dari tiga eksperimen

11

mempunyai peranan sangat penting dalam peradangan Beberapa studi

sebelumnya sudah menunjukkan bahwa peningkatan aktivitas NF-120581B

pada EAU dan menekan NF-120581B dapat memperbaiki peradangan [67]

Beberapa mediator peradangan pengatur NF-120581B termasuk Interleukin-

( IL-) 1 IL-6 tumor necrosis faktor- ( TNF-) 120572 interferon- (IFN-) 120574 monocyte chemoattractant protein- (MCP-) 1 and inducible nitric oxide synthase (iNOS) ditemukan meningkat pada binatang dengan EAU dan

mungkin modulasi dengan terapi target NF-120581B [3]

Penurunan I120581B oleh proteasome penting untuk pengaktifan NF120581B

[89] Sementara itu penghambat aktivasi NF-120581B telah ditunjukkan pada penyakit autoimun dengan percobaan model binatang seperti miastenia gravis psoriasis radang sendi dan autoimmune encephalomyelitis [1013] Bagaimanapun sdikit pengetahuan mengenai efektivitas penghambat proteasome pada uveitis autoimun Di sini kami menunjukkan efektivitas bortezomib 26S penghambat proteasome penghambat IRBP pada EAU

2 Metode dan bahan21 Tikus Betina C57Bl6J (B6) Tikus-tikus (usia 8-12 minggu) telah

diperoleh dari Laboratorium Binatang Pusat di Cheng-Kung Nasional Universitas dan digunakan untuk semua eksperimen Semua eksperimen telah dilakukan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh Badan Kepedulian Binatang dan komite National Cheng-Kung University dan dengan pendapat ARVO untuk menggunakan binatang dalam riset mata

22 Induksi dan terapi EAU EAU seperti yang diuraikan sebelumnya dengan modifikasi [14] singkatnya tikus telah diimunisasi dengan

100 120583L larutan emulsi phosphate saline (PBS) berisi 200 120583g IRBP peptide1ndash20 (hIRBP1ndash20) (GPTHLFQPSLVLDMAKVLLD) dan

complete Freundrsquos adjuvant (CFA) berisi 500 120583g Mycobacterium tuberculosis inaktif H37RA (Difco Laboratories DetroitMI USA) Tikus menerima emulsi pada dua lokasi punggung bawah yang diikuti

injeksi intraperitoneal (ip) 15 120583g pertusis toksin (PTX) sebagai tambahan terapi Tikus diterapi dengan PBS bortezomib (Millennium Pharmaceuticals Cambridge BU) dosis 075 atau 015mgkg (kelompok Velcade (H) dan (L) resp) atau etanercept (EnbrelWyeth PharmaceuticalsHampshireUk) dosis 5mgkg dalam 01mL ip injeksi dua kali dalam satu minggu mulai pada hari EAU

23 Skor klinis EAU Fundus okuli mata tikus diuji dengan slit lamp dua kali seminggu dari 7 hari setelah induksi sampai akhir eksperimen

2

untuk tanda klinis EAU Dilatasi pupil menggunakan tropicamide dan phenylephrine hydrochloride solutions Peradangan secara klinis dinilai dengan skala 1-5 seperti diuraikan sebelumnya [15] Singkatnya 0= tidak (ada) radang 1= focal vasculitis le 5 bercak atau soft eksudat le 5 2= linier vasculitis atau bercak eksudat lt 50 retina 3= linier vasculitis atau bercak exudates ge 50 retina 4= perdarahan retina atau eksudat membandel dan vasculitis 5= exudative retinal detasemen atau perdarahan subretina (atau vitreus) Seekor tikus dipertimbangkan menderita uveitis jika sedikitnya salah satu matanya mempunyai skor dua atau lebih Uveitis jika score klinis tertinggi dicapai oleh mata manapun seekor tikus

24 Evaluasi histopatologi Mata utuh dikumpulkan saat puncak respon klinis (21 hari setelah induksi pada EAU) yang direndam formaldehida 10 kemudian menyimpannya sampai diproses

Keringkan dan perbaiki jaringan tempelkan pada paraffin dan 3 120583m potong jalur cornea-nervus optic dan kemudian stained dengan hematoxylin dan eosin ( HampE) ada tidaknya penyakit telah dievaluasi dalam blinded fashion oleh pengujian enam potongan bagian dari perbedaan level masing-masing mata Peradangan dalam grade histologi dinilai dalam skala 1-4 seperti diuraikan sebelumnya [16] Singkatnya 0 tidak ada perubahan 1 berarti infiltrasi sel sedikit dan fokal retina melipat 2 berarti infiltrasi sel sedang dan retina melipat 3 berarti infiltrasi sel sedang - banyak dan lipatan retina luas dengan detasemen 4 berarti infiltrasi sel banyak dengan detasemen retina berhamburan Oleh karena itu infiltrasi leukosit ke rongga vitreus dan lipatan retina dikatakan uveitis posterior

25 Preparat Retinal Lysate untuk Analisa Luminex Enukleasi mata dari euthanize tikus Bola mata dipotong tengah antara ora serat kutub posterior mata dipisahkan dari kutub anterior dan lensa Dari kutub posterior neurosnsori retina adalah ekstraksi dari lapisan epitel pigmen retina Ekstrak dari enam retina yang ditempatkan pada 300 120583L of 05NP-40 (Abcam) dalam es (satu menit) dan sonicated singkat lima kali dalam 10 menit dalam intensitas pemeriksaan 7 (MicrosonTM XL2000 Ultrasonic liquid processor Qsonica LLC Newton CT) Setelah membersihkan material tak larut oleh sentrifugasi (200 x g untuk 5 min) konsentrasi protein dari ekstrak retina terukur 280 dalam ND-1000 Spektrofotometer Kemudian retinal lysate digunakan untuk Analisa Luminex

26 Analisa mediator peradangan pada retina oleh Luminex Perhitungan

TNF-120572 IFN-120574 IL-1120572 IL-1120573 IL- 4 IL-6 IL-12 IL-17 dan MCP-1

3

pada jaringan retina menggunakan murine multiplexing bead immunoassays (Invitro genCarlsbad CA) sesuai instruksi pembuatan

Singkatnya 25 120583L sampel retina pada PBS yang diinkubasi dengan antibody-coupled beads Setelah urutan dicuci biotinylate pendeteksi antibody ditambahkan dalam beads dan reaksi campuran dideteksi oleh penambahan streptavidinphycoerythrin Set bead dianalisa menggunakan flow-based Luminex 200 suspension array system (Luminex Korporasi Austin TX AS)

27 Pengukuran Aktivitas Proteasome di Retina Aktivitas chymotrypsin dan trypsin padaproteasome retina dalam bortezomib atau terapi PBS tikus-tikus yang sacrificed 21 hari setelah induksi EAU ditentukan menggunakan kotak pengujian kadar proteasome (Proteasome-Glo menguji kadar Promega) sesuai instruksi pembuatan Singkatnya Suc-Llvy-Glo Substrate (untuk aktivitas chymotrypsin) atau Z-Lrr-Glo Substrate (untuk aktivitas trypsin) telah ditambahkan campuran Proteasome-Glo buffer dan reagen reaksi luciferin dan diinkubasi

pada suhu kamar selama1 jam Jaringan retina yang dipotong 100 120583L dalam es dingin PBS berisi 5mM EDTA diikuti sentrifugasi 12000 g

pada 4oC selama 10 menit 50 120583L sampel retina ditambah volume sama dari campuran reagen dan diinkubasi selama 90 beberapa menit Akhirnya luminesensi sampel retina dideteksi oleh suatu microplate luminometer (Promega)

28 Ekstrak protein inti dan mobilitas Electrophoretic Shift Assay

(EMSA) pada NF-120581B Ekstrak protein inti seperti yang telah dibahas sebelumnya [17] Singkatnya retina diiris 05 mL lysis buffer (10mMHEPES 15mMKCl 10mM MgCl2 10mM DTT dan 10mM PMSF) Jaringan yang homogeny di sentrifugasi 5000 g pada suhu

4∘C selama 10 menit Endapan suspense 200 120583L dari ekstraksi buffer (20mM HEPES 25 glycerol 15mM MgCl2 420mM NaCl 05mM

DTT 02mMEDTA 05mM PMSF dan 4 120583M leupeptin) serta suspense dari inkubasi di es selama 30 menit Sampel kemudian disentrifugasi pada 12000 g pada suhu 4∘C selama 30 menit Supernatant berisi protein inti dikumpulkan dan disimpan pada suhu - 70oC sampai dipergunakan Konsentrasi Protein telah ditentukan dengan asam bicinchoninic (Pierce Biotechnology Rockford IL)

EMSA dilakukan dengan NF-120581B DNA- pengikat system pendeteksi

protein (Pierce Biotechnology) sesuai instruksi pembuatan 10 120583g

protein inti diinkubasi dengan diberi label biotin NF-120581B konsensus oligonucleotide (51015840-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-31015840) selama 30 menit dalam pengikat buffer Spesifikasi DNA protein ditentukan

4

dengan menambahkan 100 kali kelebihan tidak diberi label NF-120581B oligonucleotide untuk kompetitif dibungkus 10 menit sebelum menambahkan biotin diberi label pemeriksaan

29 Analisa statistic Nilai ditunjukkan sebagai rata-rata plusmnSD Untuk perbandingan statistic data sudah dianalisis oleh Wilcoxon signed-

rank test Studentrsquos 119905-test or Chi-square test menggunakan software

prisma 50 dalam semua tes 119875 values lt 005 merupakan pertimbangan statistic yang penting

3 Hasil 31 Bortemozib Dosis Tinggi secara Signifikan Menurunkan Uveoretinitis

pada Tikus EAU EAU diinduksi pada tikus dengan menyuntikkan emulsi 200 μg of IRBP1ndash20 dengan CFA secara subkutan dan 15 μg toksin Pertussis (PTX) secara intraperitoneal seperti yang dijelaskan dalam Bagian 2 Pada waktu yang sama bortemozib berdosis tinggi (075 mgkg) dan berdosis rendah (015 mgkg) disuntikkan secara intraperitoneal pada tikus dan lalu dua kali seminggu hingga akhir eksperimen Sekelompok tikus yang menerima PBS bukan bortemozib bertindak sebagai kontrol Dalam kelompok perlakuan-PBS penyakit menunjukkan tanda inflamasi 9-15 hari kemudian dan berkembang selama 4-5 hari saat mencapai puncak Tikus yang menerima imunisasi IBRP1ndash20 ditambah dengan terapi bortemozib berdosis-tinggi menunjukkan penundaan yang signifikan pada awal penyakit dan nilai puncak EAU yang secara signifikan lebih rendah dari waktu ke waktu (Gambar 1(a) Tabel 1) Sementara kedua tikus perlakuan-saline dan perlakuan bortemozib berdosis rendah memiliki insiden penyakit yang lebih tinggi (14 dari 19 dan 10 dari 17 resp) kami mengamati bahwa tikus dengan perlakuan-bortemozib berdosis tinggi memiliki insiden EAU yang secara signifikan lebih rendah (3 dari 19 P lt 005) (Tabel 1) Tikus yang menerima perawatan saline memiliki nilai keparahan 216 plusmn 025 sementara tikus yang menerima perawatan bortemozib berdosis-tinggi memiliki nilai mean klinis keparahan 058 plusmn 018 (P lt 005) (Tabel 1) Tikus yang menerima perawatan bortemozib dosis-rendah menunjukkan nilai mean klinis keparahan 200 plusmn 023 yang mana tidak berbeda secara signifikan dari kelompok kontrol perlakuan-saline Fakta bahwa mayoritas tikus yang diberikan bortemozib berdosis tinggi memiliki nilai puncak 1 atau lebih rendah (yaitu ringan atau tidak ada penyakit) mengindikasikan aktivitas menekan dari bortemozib pada EAU Sebagai tambahan pemeriksaan HampE slide parafin berwarna tetap menunjukkan bagian retina dari tikus EAU yang menerima bortemozib berdosis-tinggi memiliki infiltrasi sel yang berkurang dalam rongga

5

vireous dan struktur layer retina kekurangan lipatan retina yang diamati dalam tikus perlakuan-saline (Gambar 1(b)ndash1(e)) Tidak ada kematian atau ekstraocular morbiditas yang berhubungan dengan perawatan bortemozib pada eksperimen hewan Berat badan dan tingkat haemoglobin tikus tidak berbeda secara signifikan antara kelompok perlakuan saline dan bortemozib pada akhir eksperimen (data tidak ditunjukkan) Juga tidak terdapat pertumbuhan tumor atau infeksi setelah perawatan bortemozib pada penelitian kami

32 Terapi Bortemozib Menekan EAU lebih dari Terapi Antagonis TNF-Alpha Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa antagonis TNF-α dapat menekan uveits pada manusia dan tikus [1819] Maka kami membandingkan efek penekanan EAU dengan bortemozib atau antagonis etanercept TNF-α Bortemozib (075 mgkg) atau etanercept (5 mgkg) disuntikkan pada tikus EAU dua kali seminggu dari hari induksi EAU Sekelompok tikus yang menerima PBS (01 mLtikus) bertindak sebagai kontrol Tikus yang menerima imunisasi IRPB1-20 ditambah perawatan dengan menunjukkan penundaan dalam onset penyakit dan memiliki nilai puncak EAU yang lebih rendah dari waktu ke waktu (Gambar 1(f) Tabel 2) Tikus yang menerima terapi etanercept juga memiliki insiden dan nilai mean puncak yang lebih rendah Akan tetapi perbedaan antara kelompok perlakuan saline- dan etanercept tidak mencapai signifikansi statistik (Tabel 2 P = 006) karenanya terapi dengan bortemozib menekan perkembangan dan parahnya EAU lebih efektif dari antagonis etanercept TNF-α Tidak ada kematian morbiditas pertumbuhan tumor atau infeksi yang berhubungan dengan perawatan bortemozib atau etanercept pada tikus EAU pada akhir eksperimen

33 Pengaruh Bortezomib pada Tingkat Mediator Inflamasi pada Retina Tikus EAU Kami lalu mengukur tingkat cytokine pada retina tikus EAU dengan terapi yang berbeda Saat membandingkan kelompok terapi-saline dengan kelompok terapi-bortezomib dosis rendah sementara tingkat cytokine tidak berbeda secara signifikan (Gambar 2(a)-2(i)) Sementara tingkat TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 pada retina secara signifikan lebih rendah pada tikus EAU yang diperlakukan dengan bortezomib dosis tinggi saat dibandingkan dengan tikus yang diberi prlakuan-saline (P lt 005 pada semua pembanding berpasangan) (Gambar 2(a) 2(b) 2(c) 2(f) 2(h) and 2(i)) Akan tetapi tidak terdapat perbedaan signifikan yang tercatat pada IFN-γ IL-4 dan IL-6 antara penerapan-bortezomib berdosis-tinggi dan penerapan-saline pada tikus EAU (Gambar

6

2(d) 2(e) dan 2(g)) Saat membandingkan kelompok perlakuan dengan bortezomib berdosis-tinggi dan berdosis-rendah kami menemukan bahwa tingkat TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 rendah pada kelompok bortezomib berdosis-tinggi dengan kelompok bottezomib berdosis-rendah (P lt 005 pada semua pembanding berpasangan) (Gambar 2(a) 2(b) 2(c) 2(f) 2(h) dan 2(i))

34 Penerapan Bortezomib secara Signifikan Menurunkan Aktivitas Proteasome tikus EAU Kami lalu melakukan aktivitas pengujian kadar proteasome protease untuk mengevaluasi efek menekan dari penerapan bortezomib pada jaringan retina Sinyal luminescence mengindikasikan aktivitas seperti-kimotripsin atau seperti-trypsin pada jaringan retina dari tikus EAU Sinyalny secara signifikan lebih rendah pada kelompok perlakuan-bortezomib berdosis-tinggi (P lt 005) (Gambar 3(a) dan 3(b)) Juga terdapat perbedaan signifikan pada luminescence sinyal antara bortezomib berdosis-rendah dan kelompok perlakuan-saline (Gambar 3(a) dan 3(b))

35 Peningkatan Pengikat dari NF-κB dan DNA pada tikus EAU Terhambar oleh perlakuan Bortemozib Keterlibatan jalur NF-κB saat terapi bortemozib pada EAU dianalisa dengan EMSA Dibandingkan dengan kelompok Na V ve pengikatan DNA NF-κB meningkat secara signifikan setelah induksi EAU (Gambar 4 pergeseran Na V ve dan Saline) Peningkatan aktivitas dari pengikatan DNA NF-κB setelah induksi EAU dengan nyata terhambat oleh terapi bortemozib berdosis-rendah Terapi bortemozib berdosis-tinggi lebih jauh menekan pengikatan DNA NF-κB (Gambar 4 Pergeseran Vel (L) dan Vel (H)) Menambahkan molar NF-κB tak berlabel 100 kali lipat penyelidikan seluruhnya memblok pengikatan dari penyelidikan berlabel pada DNA NF-κB kompleks (Gambar 4 Pengangkatan 100X) karenanya bortemozib menurunkan pengikatan dari DNA NF-κB secara dosis-responsif Hasil dari inhibisi protease (Gambar 3) dan pengikatan DNA NF-κB mengimplikasikan bahwaaktivasidariNF-κBsecara efektif ditekan olehpenghambatanproteasome

4 PembahasanHasil demonstrasi penelitian kami menunjukkan bahwa bortezomib

sebuah proteasom inhibitor 26S aktif dalam menekan pengaktifan NF-κBdan efektif dalam menghambat peradangan mata dan menurunkan produksi mediator inflamatory pada EAU Hasil kami mengindikasikan bahwa inhibisi

7

dari proteasome mungkin adalah pendekatan yang menjanjikan untuk terapi autoimun uveitis

Bukti baru-baru ini mengindikasikan bahwa NF-κB memiliki peran penting dalam EAU dan inhibisi dari pengaktifan NF-κB dapat mengurangi tingkat inflamasi jaringan dengan menurunkan mediator inflamator dan infiltrasisel keuvea

Karena degradasi proteasomal dari faktor inhibitor IκB penting bagi aktivasi NF-κB inhibisi dari proteasome mempertahankan NF-κB dapa keadaan tidak aktif dalam cytosol dan mencegah translokasi nucleus Inhibisi proteasome ditemukan efektif dalam terapi beberapa hewan model dari penyakit autoimun seperti myasthenia gravis psoriasis arthritis dan autoimmune encephalomyelitis [10ndash13] Lebih lagi Chan et al telah menunjukkan efek anti-inflamatory pada inhibitor proteasone pada induksi-endotoksin uveits pada tikus [17] Inhibitor proteasome bortezomib disebabkan karena aktivitasnya untuk menekan degradasi protein nonlysosomal telah digunakan pada perawatan kanker hematologis pda pengaturan klinis [20] Pada penelitian ini kami memilih bortemozib berdasarkan pada kemanjuran tingginya pada konsentrasi minimal dan dapat diterima dan dapat terkelolanya efek merugikan dalam merawat penyakit hematologi manusia [21] Untuk pengetahuan kita penelitian kami adalah yang pertama mendemonstrasikan efek anti-inflamatorynya pada EAU

Menjadi sebuah kondisi induksi-autoantigen autoimmune EAU memiliki inflamasi yang didominasi oleh respon inflamatory akut cytokine [3] Dalam penelitian kami kami menemukan bahwa tingkat dari mediator inflamatory termasuk di dalamnya TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 secara signifikan meningkat pada perlakuan-saline tikus EAU saat dibandingkan dengan mereka pada tikus na Vve (Gambar 3) TNF-α adalah cytokine proinflamasi utama dan memainkan peran utama dalam uveitis autoimmune [3] AntagonisTNF-α telah digunakan secara klinis untuk terapi gangguan ocular inflamatory dengan sukses [1922] Karenanya dalam penelitian ini kami membandingkan efek anti-inflamatory antara inhibitor proteasine bortemozib dan antagonis TNF-α etanercept pada EAU Etanercept sebuah protein chimeric dari reseptor TNF-α manusia dan bagian Fc dari rantai berat G immunoglobulin dapat menetralisir TNF-α dan menghalangi aktivitas proinflamatorynya baik pada manusia dan tikus [18 23 24] Kami menemukan bahwa perawatan bortemozib pada EAU tikus dapat menekan tidak hanya TNF-α namun juga banyak mediator inflamator lain seperti as IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 pada retina jadi autoimmune uveitis dapat lebih efektif menekan dengan bortemozib dibanding dengan antagonis etanercept TNF-α (Gambar 1(f)) Bortemozib

8

yang mana dapat menekan banyak inflamator cytokines melalui penghambatan aktivasi NF-κB tampaknya menjadi agen anti-inflamatory yang lebih baik dalam perawatan dari autoimmune uveitis dibanding antagonis TNF-α

Mekanisme dari efek antri-peradangan dari bortezomib bagaimanapun mungkin lebih kompleks dibanding inhibisi dari pengaktivan NF-κB Saat induksi EAU kiranya melibatkan keberadaan antigen dari antigen immunogenic molekul kompleks kelas I dan kelas II oleh histocompatibility utama inhibisi proteasome yang mana adalah komponen penting dari pemrosesan antigen juga mempengaruhi proses pengenalan autoimun pada tahap kekebalan dan stimulasi [25ndash29] sebagai tambahan karena itu inhibitor proteasome dapat menekan beberapa langkah kunci yang diperlukan dalam pengaktivasian respn autoimun pada EAU

Dalam penelitian kami tikus yang diperlakukan bortezomib dari hari yang sama saat diinduksi EAU untuk memastikan awal efek obat selama tahap awal pada perkembangan penyakit Kami tidak mengevaluasi kemanjuran obat saat diperlakukan setelah EAU berkembang sepenuhnya yang biasanya adalah kasus pada pengaturan klinis Pada akhir percobaan setelah pengobatan bortezomib atau etanercept tidak ada kematian pertumbuhan tumor atau infeksi berat yang tercata Namun karena proteasome dan distribusinya yang tersebar mengatur jangkauan luas dari fungsi biologis efeksamping sistemikyang berhubungan dengan inhibitor proteasome layak untuk dipertimbangandengan cermat

Sebagai kesimpulan kami mendemostrasikan pengujian perbaikan EAU pada tikus tergantung pada dosis Mengurangi peradangan intraocular berhubungan dengan penekan pengaktifan NF-κB dan menurunkan peningkatan dari banyak mediator peradangan Hasil kami mengindikasikan bahwa obat yang menargetkan proteasom mungkin adalah strategi pengobatan yang efektif untuk autoimun uveitis di masa depan

Gambar 1 Efek dari bortemozib pada EAU diinduksi dengan IRBP (a) Perbandingan nilai klinis dari tikus EAU yang diperlakukan dengan

bortemozib berdosis-tinggi (075mgkg) (garis merah 119899 = 19) bortemozib

berdosis-rendah (015mgkg) (garis hitam 119899 = 17) atau PBS (garis biru 119899 = 19) dalam 01 mL data menunjukkan bahwa nilai mean klinis (ordinate) dari tiap kelompok eksperimen dari waktu ke waktu (abscissca) dan jumlah dari tiga eksperimen independen Perbandingan dari tikus EAU dengan perlakuan-bortemozib berdosis-tinggi (jalur gejala klinis) (bergaris biru) dengan tikus perlakuan-saline (garis merah) menunjukkan perbedaan yang signifikan dan diindikasikan sebagai ( ) Perbandingan dari perlakuan-bortemozib berdosislowast

9

tinggi (garis biru) dengan perlakuan-bortemozib berdosis-rendah (garis hitam) pada tikus EAU juga menunjukkan perbedaan signifikan dan diindikasikan

sebagai ( ) lowast lowast119875lt 005 melalui Wilcoxon signedrank test (b) (c) (d) dan (e) photomicrographs dari jaringan retina HampE berwarna Representatif photomicrographs slide berwarna paraffin-tetap HampE dari (b) tikus naumlıve C57BL6 tanpa induksi EAU (c) tikus EAU yang menerima perawatan PBS 01mL ( mengindikasikan leukocytes dalam rongga vitreous lowast lowastlowast mengindikasikan lipatan retina) (d) tikus EAU yang menerima perawatan bortezomib dosis-rendah (015mgkg) ekperimen diulangi tiga kali dengan hasil yang serupa CGL layer sel ganglion INL layer atom dalam ONL layer atom luar (f) nilai klinis rata-rata dari waktu ke waktu pada tikus EAY

dengan bortezomib berdosis-tinggi (075mgkg) (garis biru119899 = 9) etanercept

(5mgkg) (garis hitam119899 = 6) atau perawatan saline (01 mLtikus) (garis

merah119899 = 7) Data menunjukan nilai mean klinis (ordinate) dari tiap kelompok eksperimen (abscissa) dan jumlah dari dua eksperimen independen

lowast119875lt 005 melalui signed-rank test

Gambar 2 Evaluasi dari ekspresi protein dari mediator inflamatory pada retina

tikus EAU pada analisis Luminex Penurunan ekspresi dari TNF-120572(a) IL-

1120572(b) IL-1120573(c) IL-17 (f) IL-12 (h) dan MCP-1 (i) relatif pada ekspresi dalam kelompok perlakuan-saline tercatat dalam kelompok bortezomib berdosis tinggi (Vel [H]) tapi tidak dalam kelompok bortezomib berdosis

rendah (Vel [L]) kecuali untuk TNF-120572 Sebagai tambahan tidak ada

perbedaan signifikan pada ekspresi IFN-120574(d) IL-4 (e) dan IL-6 (g) pada retina antara tikus bortezomib dan perlakuan-saline Data yang diekspresikan sebagai mean SD dari tiga eksperimen independen (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001 vmelalui -test siswa

Gambar 3 Evaluasi aktivitas seperti-chymotrypsin dan seperti-trypsin dari proteasome Dibandingkan dengan kelompok EAU perlakuan-saline terdapat penurunan aktivitas signifikan seperti-chymotrypsin (a) dan aktivitas seperti-trypsin (b) pada kelompok bortezomib [Vel (L)] dan dosis-tinggi [Vel (H)] Aktivitas juga ditandai secara rendah pada kelompok perlakuan-bortezomib berdosis-tinggi dibanding dengan kelompok bortezomibtreated berdosis-rendah Data diekspresikan sebagai mean plusmn SD dari mean pada 5 tikus untuk

tiap kelompok (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001

via Studentrsquos 119905-test

10

Gambar 4 EMSA untuk mengevaluasi NF-120581B pengikat aktivitas DNA pada

tikus dan perbedaan kelompok pada EAU tikus Garis 1 p50 subunit NF-120581B Garis 2 pemeriksaan Cuma-Cumafree probe (FP) Garis 3 tikus C57BL6 Garis 4 EAU tikus dengan terapi garam Garis 5 EAU tikus diterapi dengan bortezomib dosis rendah (Vel [L]) Garis 6 EAU tikus diterapi dengan

bortezomib dosis tinggi (Vel [H]) Garis 7 100 kali molar NF-120581B pmeriksaan

yang tidak diberi label Garis 8 anti-p65 subunit NF-120581B Sampel adalah kedua mata dari lima tikus pada masing-masing kelompok Data merupakan hasil dari tiga eksperimen

11

untuk tanda klinis EAU Dilatasi pupil menggunakan tropicamide dan phenylephrine hydrochloride solutions Peradangan secara klinis dinilai dengan skala 1-5 seperti diuraikan sebelumnya [15] Singkatnya 0= tidak (ada) radang 1= focal vasculitis le 5 bercak atau soft eksudat le 5 2= linier vasculitis atau bercak eksudat lt 50 retina 3= linier vasculitis atau bercak exudates ge 50 retina 4= perdarahan retina atau eksudat membandel dan vasculitis 5= exudative retinal detasemen atau perdarahan subretina (atau vitreus) Seekor tikus dipertimbangkan menderita uveitis jika sedikitnya salah satu matanya mempunyai skor dua atau lebih Uveitis jika score klinis tertinggi dicapai oleh mata manapun seekor tikus

24 Evaluasi histopatologi Mata utuh dikumpulkan saat puncak respon klinis (21 hari setelah induksi pada EAU) yang direndam formaldehida 10 kemudian menyimpannya sampai diproses

Keringkan dan perbaiki jaringan tempelkan pada paraffin dan 3 120583m potong jalur cornea-nervus optic dan kemudian stained dengan hematoxylin dan eosin ( HampE) ada tidaknya penyakit telah dievaluasi dalam blinded fashion oleh pengujian enam potongan bagian dari perbedaan level masing-masing mata Peradangan dalam grade histologi dinilai dalam skala 1-4 seperti diuraikan sebelumnya [16] Singkatnya 0 tidak ada perubahan 1 berarti infiltrasi sel sedikit dan fokal retina melipat 2 berarti infiltrasi sel sedang dan retina melipat 3 berarti infiltrasi sel sedang - banyak dan lipatan retina luas dengan detasemen 4 berarti infiltrasi sel banyak dengan detasemen retina berhamburan Oleh karena itu infiltrasi leukosit ke rongga vitreus dan lipatan retina dikatakan uveitis posterior

25 Preparat Retinal Lysate untuk Analisa Luminex Enukleasi mata dari euthanize tikus Bola mata dipotong tengah antara ora serat kutub posterior mata dipisahkan dari kutub anterior dan lensa Dari kutub posterior neurosnsori retina adalah ekstraksi dari lapisan epitel pigmen retina Ekstrak dari enam retina yang ditempatkan pada 300 120583L of 05NP-40 (Abcam) dalam es (satu menit) dan sonicated singkat lima kali dalam 10 menit dalam intensitas pemeriksaan 7 (MicrosonTM XL2000 Ultrasonic liquid processor Qsonica LLC Newton CT) Setelah membersihkan material tak larut oleh sentrifugasi (200 x g untuk 5 min) konsentrasi protein dari ekstrak retina terukur 280 dalam ND-1000 Spektrofotometer Kemudian retinal lysate digunakan untuk Analisa Luminex

26 Analisa mediator peradangan pada retina oleh Luminex Perhitungan

TNF-120572 IFN-120574 IL-1120572 IL-1120573 IL- 4 IL-6 IL-12 IL-17 dan MCP-1

3

pada jaringan retina menggunakan murine multiplexing bead immunoassays (Invitro genCarlsbad CA) sesuai instruksi pembuatan

Singkatnya 25 120583L sampel retina pada PBS yang diinkubasi dengan antibody-coupled beads Setelah urutan dicuci biotinylate pendeteksi antibody ditambahkan dalam beads dan reaksi campuran dideteksi oleh penambahan streptavidinphycoerythrin Set bead dianalisa menggunakan flow-based Luminex 200 suspension array system (Luminex Korporasi Austin TX AS)

27 Pengukuran Aktivitas Proteasome di Retina Aktivitas chymotrypsin dan trypsin padaproteasome retina dalam bortezomib atau terapi PBS tikus-tikus yang sacrificed 21 hari setelah induksi EAU ditentukan menggunakan kotak pengujian kadar proteasome (Proteasome-Glo menguji kadar Promega) sesuai instruksi pembuatan Singkatnya Suc-Llvy-Glo Substrate (untuk aktivitas chymotrypsin) atau Z-Lrr-Glo Substrate (untuk aktivitas trypsin) telah ditambahkan campuran Proteasome-Glo buffer dan reagen reaksi luciferin dan diinkubasi

pada suhu kamar selama1 jam Jaringan retina yang dipotong 100 120583L dalam es dingin PBS berisi 5mM EDTA diikuti sentrifugasi 12000 g

pada 4oC selama 10 menit 50 120583L sampel retina ditambah volume sama dari campuran reagen dan diinkubasi selama 90 beberapa menit Akhirnya luminesensi sampel retina dideteksi oleh suatu microplate luminometer (Promega)

28 Ekstrak protein inti dan mobilitas Electrophoretic Shift Assay

(EMSA) pada NF-120581B Ekstrak protein inti seperti yang telah dibahas sebelumnya [17] Singkatnya retina diiris 05 mL lysis buffer (10mMHEPES 15mMKCl 10mM MgCl2 10mM DTT dan 10mM PMSF) Jaringan yang homogeny di sentrifugasi 5000 g pada suhu

4∘C selama 10 menit Endapan suspense 200 120583L dari ekstraksi buffer (20mM HEPES 25 glycerol 15mM MgCl2 420mM NaCl 05mM

DTT 02mMEDTA 05mM PMSF dan 4 120583M leupeptin) serta suspense dari inkubasi di es selama 30 menit Sampel kemudian disentrifugasi pada 12000 g pada suhu 4∘C selama 30 menit Supernatant berisi protein inti dikumpulkan dan disimpan pada suhu - 70oC sampai dipergunakan Konsentrasi Protein telah ditentukan dengan asam bicinchoninic (Pierce Biotechnology Rockford IL)

EMSA dilakukan dengan NF-120581B DNA- pengikat system pendeteksi

protein (Pierce Biotechnology) sesuai instruksi pembuatan 10 120583g

protein inti diinkubasi dengan diberi label biotin NF-120581B konsensus oligonucleotide (51015840-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-31015840) selama 30 menit dalam pengikat buffer Spesifikasi DNA protein ditentukan

4

dengan menambahkan 100 kali kelebihan tidak diberi label NF-120581B oligonucleotide untuk kompetitif dibungkus 10 menit sebelum menambahkan biotin diberi label pemeriksaan

29 Analisa statistic Nilai ditunjukkan sebagai rata-rata plusmnSD Untuk perbandingan statistic data sudah dianalisis oleh Wilcoxon signed-

rank test Studentrsquos 119905-test or Chi-square test menggunakan software

prisma 50 dalam semua tes 119875 values lt 005 merupakan pertimbangan statistic yang penting

3 Hasil 31 Bortemozib Dosis Tinggi secara Signifikan Menurunkan Uveoretinitis

pada Tikus EAU EAU diinduksi pada tikus dengan menyuntikkan emulsi 200 μg of IRBP1ndash20 dengan CFA secara subkutan dan 15 μg toksin Pertussis (PTX) secara intraperitoneal seperti yang dijelaskan dalam Bagian 2 Pada waktu yang sama bortemozib berdosis tinggi (075 mgkg) dan berdosis rendah (015 mgkg) disuntikkan secara intraperitoneal pada tikus dan lalu dua kali seminggu hingga akhir eksperimen Sekelompok tikus yang menerima PBS bukan bortemozib bertindak sebagai kontrol Dalam kelompok perlakuan-PBS penyakit menunjukkan tanda inflamasi 9-15 hari kemudian dan berkembang selama 4-5 hari saat mencapai puncak Tikus yang menerima imunisasi IBRP1ndash20 ditambah dengan terapi bortemozib berdosis-tinggi menunjukkan penundaan yang signifikan pada awal penyakit dan nilai puncak EAU yang secara signifikan lebih rendah dari waktu ke waktu (Gambar 1(a) Tabel 1) Sementara kedua tikus perlakuan-saline dan perlakuan bortemozib berdosis rendah memiliki insiden penyakit yang lebih tinggi (14 dari 19 dan 10 dari 17 resp) kami mengamati bahwa tikus dengan perlakuan-bortemozib berdosis tinggi memiliki insiden EAU yang secara signifikan lebih rendah (3 dari 19 P lt 005) (Tabel 1) Tikus yang menerima perawatan saline memiliki nilai keparahan 216 plusmn 025 sementara tikus yang menerima perawatan bortemozib berdosis-tinggi memiliki nilai mean klinis keparahan 058 plusmn 018 (P lt 005) (Tabel 1) Tikus yang menerima perawatan bortemozib dosis-rendah menunjukkan nilai mean klinis keparahan 200 plusmn 023 yang mana tidak berbeda secara signifikan dari kelompok kontrol perlakuan-saline Fakta bahwa mayoritas tikus yang diberikan bortemozib berdosis tinggi memiliki nilai puncak 1 atau lebih rendah (yaitu ringan atau tidak ada penyakit) mengindikasikan aktivitas menekan dari bortemozib pada EAU Sebagai tambahan pemeriksaan HampE slide parafin berwarna tetap menunjukkan bagian retina dari tikus EAU yang menerima bortemozib berdosis-tinggi memiliki infiltrasi sel yang berkurang dalam rongga

5

vireous dan struktur layer retina kekurangan lipatan retina yang diamati dalam tikus perlakuan-saline (Gambar 1(b)ndash1(e)) Tidak ada kematian atau ekstraocular morbiditas yang berhubungan dengan perawatan bortemozib pada eksperimen hewan Berat badan dan tingkat haemoglobin tikus tidak berbeda secara signifikan antara kelompok perlakuan saline dan bortemozib pada akhir eksperimen (data tidak ditunjukkan) Juga tidak terdapat pertumbuhan tumor atau infeksi setelah perawatan bortemozib pada penelitian kami

32 Terapi Bortemozib Menekan EAU lebih dari Terapi Antagonis TNF-Alpha Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa antagonis TNF-α dapat menekan uveits pada manusia dan tikus [1819] Maka kami membandingkan efek penekanan EAU dengan bortemozib atau antagonis etanercept TNF-α Bortemozib (075 mgkg) atau etanercept (5 mgkg) disuntikkan pada tikus EAU dua kali seminggu dari hari induksi EAU Sekelompok tikus yang menerima PBS (01 mLtikus) bertindak sebagai kontrol Tikus yang menerima imunisasi IRPB1-20 ditambah perawatan dengan menunjukkan penundaan dalam onset penyakit dan memiliki nilai puncak EAU yang lebih rendah dari waktu ke waktu (Gambar 1(f) Tabel 2) Tikus yang menerima terapi etanercept juga memiliki insiden dan nilai mean puncak yang lebih rendah Akan tetapi perbedaan antara kelompok perlakuan saline- dan etanercept tidak mencapai signifikansi statistik (Tabel 2 P = 006) karenanya terapi dengan bortemozib menekan perkembangan dan parahnya EAU lebih efektif dari antagonis etanercept TNF-α Tidak ada kematian morbiditas pertumbuhan tumor atau infeksi yang berhubungan dengan perawatan bortemozib atau etanercept pada tikus EAU pada akhir eksperimen

33 Pengaruh Bortezomib pada Tingkat Mediator Inflamasi pada Retina Tikus EAU Kami lalu mengukur tingkat cytokine pada retina tikus EAU dengan terapi yang berbeda Saat membandingkan kelompok terapi-saline dengan kelompok terapi-bortezomib dosis rendah sementara tingkat cytokine tidak berbeda secara signifikan (Gambar 2(a)-2(i)) Sementara tingkat TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 pada retina secara signifikan lebih rendah pada tikus EAU yang diperlakukan dengan bortezomib dosis tinggi saat dibandingkan dengan tikus yang diberi prlakuan-saline (P lt 005 pada semua pembanding berpasangan) (Gambar 2(a) 2(b) 2(c) 2(f) 2(h) and 2(i)) Akan tetapi tidak terdapat perbedaan signifikan yang tercatat pada IFN-γ IL-4 dan IL-6 antara penerapan-bortezomib berdosis-tinggi dan penerapan-saline pada tikus EAU (Gambar

6

2(d) 2(e) dan 2(g)) Saat membandingkan kelompok perlakuan dengan bortezomib berdosis-tinggi dan berdosis-rendah kami menemukan bahwa tingkat TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 rendah pada kelompok bortezomib berdosis-tinggi dengan kelompok bottezomib berdosis-rendah (P lt 005 pada semua pembanding berpasangan) (Gambar 2(a) 2(b) 2(c) 2(f) 2(h) dan 2(i))

34 Penerapan Bortezomib secara Signifikan Menurunkan Aktivitas Proteasome tikus EAU Kami lalu melakukan aktivitas pengujian kadar proteasome protease untuk mengevaluasi efek menekan dari penerapan bortezomib pada jaringan retina Sinyal luminescence mengindikasikan aktivitas seperti-kimotripsin atau seperti-trypsin pada jaringan retina dari tikus EAU Sinyalny secara signifikan lebih rendah pada kelompok perlakuan-bortezomib berdosis-tinggi (P lt 005) (Gambar 3(a) dan 3(b)) Juga terdapat perbedaan signifikan pada luminescence sinyal antara bortezomib berdosis-rendah dan kelompok perlakuan-saline (Gambar 3(a) dan 3(b))

35 Peningkatan Pengikat dari NF-κB dan DNA pada tikus EAU Terhambar oleh perlakuan Bortemozib Keterlibatan jalur NF-κB saat terapi bortemozib pada EAU dianalisa dengan EMSA Dibandingkan dengan kelompok Na V ve pengikatan DNA NF-κB meningkat secara signifikan setelah induksi EAU (Gambar 4 pergeseran Na V ve dan Saline) Peningkatan aktivitas dari pengikatan DNA NF-κB setelah induksi EAU dengan nyata terhambat oleh terapi bortemozib berdosis-rendah Terapi bortemozib berdosis-tinggi lebih jauh menekan pengikatan DNA NF-κB (Gambar 4 Pergeseran Vel (L) dan Vel (H)) Menambahkan molar NF-κB tak berlabel 100 kali lipat penyelidikan seluruhnya memblok pengikatan dari penyelidikan berlabel pada DNA NF-κB kompleks (Gambar 4 Pengangkatan 100X) karenanya bortemozib menurunkan pengikatan dari DNA NF-κB secara dosis-responsif Hasil dari inhibisi protease (Gambar 3) dan pengikatan DNA NF-κB mengimplikasikan bahwaaktivasidariNF-κBsecara efektif ditekan olehpenghambatanproteasome

4 PembahasanHasil demonstrasi penelitian kami menunjukkan bahwa bortezomib

sebuah proteasom inhibitor 26S aktif dalam menekan pengaktifan NF-κBdan efektif dalam menghambat peradangan mata dan menurunkan produksi mediator inflamatory pada EAU Hasil kami mengindikasikan bahwa inhibisi

7

dari proteasome mungkin adalah pendekatan yang menjanjikan untuk terapi autoimun uveitis

Bukti baru-baru ini mengindikasikan bahwa NF-κB memiliki peran penting dalam EAU dan inhibisi dari pengaktifan NF-κB dapat mengurangi tingkat inflamasi jaringan dengan menurunkan mediator inflamator dan infiltrasisel keuvea

Karena degradasi proteasomal dari faktor inhibitor IκB penting bagi aktivasi NF-κB inhibisi dari proteasome mempertahankan NF-κB dapa keadaan tidak aktif dalam cytosol dan mencegah translokasi nucleus Inhibisi proteasome ditemukan efektif dalam terapi beberapa hewan model dari penyakit autoimun seperti myasthenia gravis psoriasis arthritis dan autoimmune encephalomyelitis [10ndash13] Lebih lagi Chan et al telah menunjukkan efek anti-inflamatory pada inhibitor proteasone pada induksi-endotoksin uveits pada tikus [17] Inhibitor proteasome bortezomib disebabkan karena aktivitasnya untuk menekan degradasi protein nonlysosomal telah digunakan pada perawatan kanker hematologis pda pengaturan klinis [20] Pada penelitian ini kami memilih bortemozib berdasarkan pada kemanjuran tingginya pada konsentrasi minimal dan dapat diterima dan dapat terkelolanya efek merugikan dalam merawat penyakit hematologi manusia [21] Untuk pengetahuan kita penelitian kami adalah yang pertama mendemonstrasikan efek anti-inflamatorynya pada EAU

Menjadi sebuah kondisi induksi-autoantigen autoimmune EAU memiliki inflamasi yang didominasi oleh respon inflamatory akut cytokine [3] Dalam penelitian kami kami menemukan bahwa tingkat dari mediator inflamatory termasuk di dalamnya TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 secara signifikan meningkat pada perlakuan-saline tikus EAU saat dibandingkan dengan mereka pada tikus na Vve (Gambar 3) TNF-α adalah cytokine proinflamasi utama dan memainkan peran utama dalam uveitis autoimmune [3] AntagonisTNF-α telah digunakan secara klinis untuk terapi gangguan ocular inflamatory dengan sukses [1922] Karenanya dalam penelitian ini kami membandingkan efek anti-inflamatory antara inhibitor proteasine bortemozib dan antagonis TNF-α etanercept pada EAU Etanercept sebuah protein chimeric dari reseptor TNF-α manusia dan bagian Fc dari rantai berat G immunoglobulin dapat menetralisir TNF-α dan menghalangi aktivitas proinflamatorynya baik pada manusia dan tikus [18 23 24] Kami menemukan bahwa perawatan bortemozib pada EAU tikus dapat menekan tidak hanya TNF-α namun juga banyak mediator inflamator lain seperti as IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 pada retina jadi autoimmune uveitis dapat lebih efektif menekan dengan bortemozib dibanding dengan antagonis etanercept TNF-α (Gambar 1(f)) Bortemozib

8

yang mana dapat menekan banyak inflamator cytokines melalui penghambatan aktivasi NF-κB tampaknya menjadi agen anti-inflamatory yang lebih baik dalam perawatan dari autoimmune uveitis dibanding antagonis TNF-α

Mekanisme dari efek antri-peradangan dari bortezomib bagaimanapun mungkin lebih kompleks dibanding inhibisi dari pengaktivan NF-κB Saat induksi EAU kiranya melibatkan keberadaan antigen dari antigen immunogenic molekul kompleks kelas I dan kelas II oleh histocompatibility utama inhibisi proteasome yang mana adalah komponen penting dari pemrosesan antigen juga mempengaruhi proses pengenalan autoimun pada tahap kekebalan dan stimulasi [25ndash29] sebagai tambahan karena itu inhibitor proteasome dapat menekan beberapa langkah kunci yang diperlukan dalam pengaktivasian respn autoimun pada EAU

Dalam penelitian kami tikus yang diperlakukan bortezomib dari hari yang sama saat diinduksi EAU untuk memastikan awal efek obat selama tahap awal pada perkembangan penyakit Kami tidak mengevaluasi kemanjuran obat saat diperlakukan setelah EAU berkembang sepenuhnya yang biasanya adalah kasus pada pengaturan klinis Pada akhir percobaan setelah pengobatan bortezomib atau etanercept tidak ada kematian pertumbuhan tumor atau infeksi berat yang tercata Namun karena proteasome dan distribusinya yang tersebar mengatur jangkauan luas dari fungsi biologis efeksamping sistemikyang berhubungan dengan inhibitor proteasome layak untuk dipertimbangandengan cermat

Sebagai kesimpulan kami mendemostrasikan pengujian perbaikan EAU pada tikus tergantung pada dosis Mengurangi peradangan intraocular berhubungan dengan penekan pengaktifan NF-κB dan menurunkan peningkatan dari banyak mediator peradangan Hasil kami mengindikasikan bahwa obat yang menargetkan proteasom mungkin adalah strategi pengobatan yang efektif untuk autoimun uveitis di masa depan

Gambar 1 Efek dari bortemozib pada EAU diinduksi dengan IRBP (a) Perbandingan nilai klinis dari tikus EAU yang diperlakukan dengan

bortemozib berdosis-tinggi (075mgkg) (garis merah 119899 = 19) bortemozib

berdosis-rendah (015mgkg) (garis hitam 119899 = 17) atau PBS (garis biru 119899 = 19) dalam 01 mL data menunjukkan bahwa nilai mean klinis (ordinate) dari tiap kelompok eksperimen dari waktu ke waktu (abscissca) dan jumlah dari tiga eksperimen independen Perbandingan dari tikus EAU dengan perlakuan-bortemozib berdosis-tinggi (jalur gejala klinis) (bergaris biru) dengan tikus perlakuan-saline (garis merah) menunjukkan perbedaan yang signifikan dan diindikasikan sebagai ( ) Perbandingan dari perlakuan-bortemozib berdosislowast

9

tinggi (garis biru) dengan perlakuan-bortemozib berdosis-rendah (garis hitam) pada tikus EAU juga menunjukkan perbedaan signifikan dan diindikasikan

sebagai ( ) lowast lowast119875lt 005 melalui Wilcoxon signedrank test (b) (c) (d) dan (e) photomicrographs dari jaringan retina HampE berwarna Representatif photomicrographs slide berwarna paraffin-tetap HampE dari (b) tikus naumlıve C57BL6 tanpa induksi EAU (c) tikus EAU yang menerima perawatan PBS 01mL ( mengindikasikan leukocytes dalam rongga vitreous lowast lowastlowast mengindikasikan lipatan retina) (d) tikus EAU yang menerima perawatan bortezomib dosis-rendah (015mgkg) ekperimen diulangi tiga kali dengan hasil yang serupa CGL layer sel ganglion INL layer atom dalam ONL layer atom luar (f) nilai klinis rata-rata dari waktu ke waktu pada tikus EAY

dengan bortezomib berdosis-tinggi (075mgkg) (garis biru119899 = 9) etanercept

(5mgkg) (garis hitam119899 = 6) atau perawatan saline (01 mLtikus) (garis

merah119899 = 7) Data menunjukan nilai mean klinis (ordinate) dari tiap kelompok eksperimen (abscissa) dan jumlah dari dua eksperimen independen

lowast119875lt 005 melalui signed-rank test

Gambar 2 Evaluasi dari ekspresi protein dari mediator inflamatory pada retina

tikus EAU pada analisis Luminex Penurunan ekspresi dari TNF-120572(a) IL-

1120572(b) IL-1120573(c) IL-17 (f) IL-12 (h) dan MCP-1 (i) relatif pada ekspresi dalam kelompok perlakuan-saline tercatat dalam kelompok bortezomib berdosis tinggi (Vel [H]) tapi tidak dalam kelompok bortezomib berdosis

rendah (Vel [L]) kecuali untuk TNF-120572 Sebagai tambahan tidak ada

perbedaan signifikan pada ekspresi IFN-120574(d) IL-4 (e) dan IL-6 (g) pada retina antara tikus bortezomib dan perlakuan-saline Data yang diekspresikan sebagai mean SD dari tiga eksperimen independen (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001 vmelalui -test siswa

Gambar 3 Evaluasi aktivitas seperti-chymotrypsin dan seperti-trypsin dari proteasome Dibandingkan dengan kelompok EAU perlakuan-saline terdapat penurunan aktivitas signifikan seperti-chymotrypsin (a) dan aktivitas seperti-trypsin (b) pada kelompok bortezomib [Vel (L)] dan dosis-tinggi [Vel (H)] Aktivitas juga ditandai secara rendah pada kelompok perlakuan-bortezomib berdosis-tinggi dibanding dengan kelompok bortezomibtreated berdosis-rendah Data diekspresikan sebagai mean plusmn SD dari mean pada 5 tikus untuk

tiap kelompok (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001

via Studentrsquos 119905-test

10

Gambar 4 EMSA untuk mengevaluasi NF-120581B pengikat aktivitas DNA pada

tikus dan perbedaan kelompok pada EAU tikus Garis 1 p50 subunit NF-120581B Garis 2 pemeriksaan Cuma-Cumafree probe (FP) Garis 3 tikus C57BL6 Garis 4 EAU tikus dengan terapi garam Garis 5 EAU tikus diterapi dengan bortezomib dosis rendah (Vel [L]) Garis 6 EAU tikus diterapi dengan

bortezomib dosis tinggi (Vel [H]) Garis 7 100 kali molar NF-120581B pmeriksaan

yang tidak diberi label Garis 8 anti-p65 subunit NF-120581B Sampel adalah kedua mata dari lima tikus pada masing-masing kelompok Data merupakan hasil dari tiga eksperimen

11

pada jaringan retina menggunakan murine multiplexing bead immunoassays (Invitro genCarlsbad CA) sesuai instruksi pembuatan

Singkatnya 25 120583L sampel retina pada PBS yang diinkubasi dengan antibody-coupled beads Setelah urutan dicuci biotinylate pendeteksi antibody ditambahkan dalam beads dan reaksi campuran dideteksi oleh penambahan streptavidinphycoerythrin Set bead dianalisa menggunakan flow-based Luminex 200 suspension array system (Luminex Korporasi Austin TX AS)

27 Pengukuran Aktivitas Proteasome di Retina Aktivitas chymotrypsin dan trypsin padaproteasome retina dalam bortezomib atau terapi PBS tikus-tikus yang sacrificed 21 hari setelah induksi EAU ditentukan menggunakan kotak pengujian kadar proteasome (Proteasome-Glo menguji kadar Promega) sesuai instruksi pembuatan Singkatnya Suc-Llvy-Glo Substrate (untuk aktivitas chymotrypsin) atau Z-Lrr-Glo Substrate (untuk aktivitas trypsin) telah ditambahkan campuran Proteasome-Glo buffer dan reagen reaksi luciferin dan diinkubasi

pada suhu kamar selama1 jam Jaringan retina yang dipotong 100 120583L dalam es dingin PBS berisi 5mM EDTA diikuti sentrifugasi 12000 g

pada 4oC selama 10 menit 50 120583L sampel retina ditambah volume sama dari campuran reagen dan diinkubasi selama 90 beberapa menit Akhirnya luminesensi sampel retina dideteksi oleh suatu microplate luminometer (Promega)

28 Ekstrak protein inti dan mobilitas Electrophoretic Shift Assay

(EMSA) pada NF-120581B Ekstrak protein inti seperti yang telah dibahas sebelumnya [17] Singkatnya retina diiris 05 mL lysis buffer (10mMHEPES 15mMKCl 10mM MgCl2 10mM DTT dan 10mM PMSF) Jaringan yang homogeny di sentrifugasi 5000 g pada suhu

4∘C selama 10 menit Endapan suspense 200 120583L dari ekstraksi buffer (20mM HEPES 25 glycerol 15mM MgCl2 420mM NaCl 05mM

DTT 02mMEDTA 05mM PMSF dan 4 120583M leupeptin) serta suspense dari inkubasi di es selama 30 menit Sampel kemudian disentrifugasi pada 12000 g pada suhu 4∘C selama 30 menit Supernatant berisi protein inti dikumpulkan dan disimpan pada suhu - 70oC sampai dipergunakan Konsentrasi Protein telah ditentukan dengan asam bicinchoninic (Pierce Biotechnology Rockford IL)

EMSA dilakukan dengan NF-120581B DNA- pengikat system pendeteksi

protein (Pierce Biotechnology) sesuai instruksi pembuatan 10 120583g

protein inti diinkubasi dengan diberi label biotin NF-120581B konsensus oligonucleotide (51015840-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-31015840) selama 30 menit dalam pengikat buffer Spesifikasi DNA protein ditentukan

4

dengan menambahkan 100 kali kelebihan tidak diberi label NF-120581B oligonucleotide untuk kompetitif dibungkus 10 menit sebelum menambahkan biotin diberi label pemeriksaan

29 Analisa statistic Nilai ditunjukkan sebagai rata-rata plusmnSD Untuk perbandingan statistic data sudah dianalisis oleh Wilcoxon signed-

rank test Studentrsquos 119905-test or Chi-square test menggunakan software

prisma 50 dalam semua tes 119875 values lt 005 merupakan pertimbangan statistic yang penting

3 Hasil 31 Bortemozib Dosis Tinggi secara Signifikan Menurunkan Uveoretinitis

pada Tikus EAU EAU diinduksi pada tikus dengan menyuntikkan emulsi 200 μg of IRBP1ndash20 dengan CFA secara subkutan dan 15 μg toksin Pertussis (PTX) secara intraperitoneal seperti yang dijelaskan dalam Bagian 2 Pada waktu yang sama bortemozib berdosis tinggi (075 mgkg) dan berdosis rendah (015 mgkg) disuntikkan secara intraperitoneal pada tikus dan lalu dua kali seminggu hingga akhir eksperimen Sekelompok tikus yang menerima PBS bukan bortemozib bertindak sebagai kontrol Dalam kelompok perlakuan-PBS penyakit menunjukkan tanda inflamasi 9-15 hari kemudian dan berkembang selama 4-5 hari saat mencapai puncak Tikus yang menerima imunisasi IBRP1ndash20 ditambah dengan terapi bortemozib berdosis-tinggi menunjukkan penundaan yang signifikan pada awal penyakit dan nilai puncak EAU yang secara signifikan lebih rendah dari waktu ke waktu (Gambar 1(a) Tabel 1) Sementara kedua tikus perlakuan-saline dan perlakuan bortemozib berdosis rendah memiliki insiden penyakit yang lebih tinggi (14 dari 19 dan 10 dari 17 resp) kami mengamati bahwa tikus dengan perlakuan-bortemozib berdosis tinggi memiliki insiden EAU yang secara signifikan lebih rendah (3 dari 19 P lt 005) (Tabel 1) Tikus yang menerima perawatan saline memiliki nilai keparahan 216 plusmn 025 sementara tikus yang menerima perawatan bortemozib berdosis-tinggi memiliki nilai mean klinis keparahan 058 plusmn 018 (P lt 005) (Tabel 1) Tikus yang menerima perawatan bortemozib dosis-rendah menunjukkan nilai mean klinis keparahan 200 plusmn 023 yang mana tidak berbeda secara signifikan dari kelompok kontrol perlakuan-saline Fakta bahwa mayoritas tikus yang diberikan bortemozib berdosis tinggi memiliki nilai puncak 1 atau lebih rendah (yaitu ringan atau tidak ada penyakit) mengindikasikan aktivitas menekan dari bortemozib pada EAU Sebagai tambahan pemeriksaan HampE slide parafin berwarna tetap menunjukkan bagian retina dari tikus EAU yang menerima bortemozib berdosis-tinggi memiliki infiltrasi sel yang berkurang dalam rongga

5

vireous dan struktur layer retina kekurangan lipatan retina yang diamati dalam tikus perlakuan-saline (Gambar 1(b)ndash1(e)) Tidak ada kematian atau ekstraocular morbiditas yang berhubungan dengan perawatan bortemozib pada eksperimen hewan Berat badan dan tingkat haemoglobin tikus tidak berbeda secara signifikan antara kelompok perlakuan saline dan bortemozib pada akhir eksperimen (data tidak ditunjukkan) Juga tidak terdapat pertumbuhan tumor atau infeksi setelah perawatan bortemozib pada penelitian kami

32 Terapi Bortemozib Menekan EAU lebih dari Terapi Antagonis TNF-Alpha Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa antagonis TNF-α dapat menekan uveits pada manusia dan tikus [1819] Maka kami membandingkan efek penekanan EAU dengan bortemozib atau antagonis etanercept TNF-α Bortemozib (075 mgkg) atau etanercept (5 mgkg) disuntikkan pada tikus EAU dua kali seminggu dari hari induksi EAU Sekelompok tikus yang menerima PBS (01 mLtikus) bertindak sebagai kontrol Tikus yang menerima imunisasi IRPB1-20 ditambah perawatan dengan menunjukkan penundaan dalam onset penyakit dan memiliki nilai puncak EAU yang lebih rendah dari waktu ke waktu (Gambar 1(f) Tabel 2) Tikus yang menerima terapi etanercept juga memiliki insiden dan nilai mean puncak yang lebih rendah Akan tetapi perbedaan antara kelompok perlakuan saline- dan etanercept tidak mencapai signifikansi statistik (Tabel 2 P = 006) karenanya terapi dengan bortemozib menekan perkembangan dan parahnya EAU lebih efektif dari antagonis etanercept TNF-α Tidak ada kematian morbiditas pertumbuhan tumor atau infeksi yang berhubungan dengan perawatan bortemozib atau etanercept pada tikus EAU pada akhir eksperimen

33 Pengaruh Bortezomib pada Tingkat Mediator Inflamasi pada Retina Tikus EAU Kami lalu mengukur tingkat cytokine pada retina tikus EAU dengan terapi yang berbeda Saat membandingkan kelompok terapi-saline dengan kelompok terapi-bortezomib dosis rendah sementara tingkat cytokine tidak berbeda secara signifikan (Gambar 2(a)-2(i)) Sementara tingkat TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 pada retina secara signifikan lebih rendah pada tikus EAU yang diperlakukan dengan bortezomib dosis tinggi saat dibandingkan dengan tikus yang diberi prlakuan-saline (P lt 005 pada semua pembanding berpasangan) (Gambar 2(a) 2(b) 2(c) 2(f) 2(h) and 2(i)) Akan tetapi tidak terdapat perbedaan signifikan yang tercatat pada IFN-γ IL-4 dan IL-6 antara penerapan-bortezomib berdosis-tinggi dan penerapan-saline pada tikus EAU (Gambar

6

2(d) 2(e) dan 2(g)) Saat membandingkan kelompok perlakuan dengan bortezomib berdosis-tinggi dan berdosis-rendah kami menemukan bahwa tingkat TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 rendah pada kelompok bortezomib berdosis-tinggi dengan kelompok bottezomib berdosis-rendah (P lt 005 pada semua pembanding berpasangan) (Gambar 2(a) 2(b) 2(c) 2(f) 2(h) dan 2(i))

34 Penerapan Bortezomib secara Signifikan Menurunkan Aktivitas Proteasome tikus EAU Kami lalu melakukan aktivitas pengujian kadar proteasome protease untuk mengevaluasi efek menekan dari penerapan bortezomib pada jaringan retina Sinyal luminescence mengindikasikan aktivitas seperti-kimotripsin atau seperti-trypsin pada jaringan retina dari tikus EAU Sinyalny secara signifikan lebih rendah pada kelompok perlakuan-bortezomib berdosis-tinggi (P lt 005) (Gambar 3(a) dan 3(b)) Juga terdapat perbedaan signifikan pada luminescence sinyal antara bortezomib berdosis-rendah dan kelompok perlakuan-saline (Gambar 3(a) dan 3(b))

35 Peningkatan Pengikat dari NF-κB dan DNA pada tikus EAU Terhambar oleh perlakuan Bortemozib Keterlibatan jalur NF-κB saat terapi bortemozib pada EAU dianalisa dengan EMSA Dibandingkan dengan kelompok Na V ve pengikatan DNA NF-κB meningkat secara signifikan setelah induksi EAU (Gambar 4 pergeseran Na V ve dan Saline) Peningkatan aktivitas dari pengikatan DNA NF-κB setelah induksi EAU dengan nyata terhambat oleh terapi bortemozib berdosis-rendah Terapi bortemozib berdosis-tinggi lebih jauh menekan pengikatan DNA NF-κB (Gambar 4 Pergeseran Vel (L) dan Vel (H)) Menambahkan molar NF-κB tak berlabel 100 kali lipat penyelidikan seluruhnya memblok pengikatan dari penyelidikan berlabel pada DNA NF-κB kompleks (Gambar 4 Pengangkatan 100X) karenanya bortemozib menurunkan pengikatan dari DNA NF-κB secara dosis-responsif Hasil dari inhibisi protease (Gambar 3) dan pengikatan DNA NF-κB mengimplikasikan bahwaaktivasidariNF-κBsecara efektif ditekan olehpenghambatanproteasome

4 PembahasanHasil demonstrasi penelitian kami menunjukkan bahwa bortezomib

sebuah proteasom inhibitor 26S aktif dalam menekan pengaktifan NF-κBdan efektif dalam menghambat peradangan mata dan menurunkan produksi mediator inflamatory pada EAU Hasil kami mengindikasikan bahwa inhibisi

7

dari proteasome mungkin adalah pendekatan yang menjanjikan untuk terapi autoimun uveitis

Bukti baru-baru ini mengindikasikan bahwa NF-κB memiliki peran penting dalam EAU dan inhibisi dari pengaktifan NF-κB dapat mengurangi tingkat inflamasi jaringan dengan menurunkan mediator inflamator dan infiltrasisel keuvea

Karena degradasi proteasomal dari faktor inhibitor IκB penting bagi aktivasi NF-κB inhibisi dari proteasome mempertahankan NF-κB dapa keadaan tidak aktif dalam cytosol dan mencegah translokasi nucleus Inhibisi proteasome ditemukan efektif dalam terapi beberapa hewan model dari penyakit autoimun seperti myasthenia gravis psoriasis arthritis dan autoimmune encephalomyelitis [10ndash13] Lebih lagi Chan et al telah menunjukkan efek anti-inflamatory pada inhibitor proteasone pada induksi-endotoksin uveits pada tikus [17] Inhibitor proteasome bortezomib disebabkan karena aktivitasnya untuk menekan degradasi protein nonlysosomal telah digunakan pada perawatan kanker hematologis pda pengaturan klinis [20] Pada penelitian ini kami memilih bortemozib berdasarkan pada kemanjuran tingginya pada konsentrasi minimal dan dapat diterima dan dapat terkelolanya efek merugikan dalam merawat penyakit hematologi manusia [21] Untuk pengetahuan kita penelitian kami adalah yang pertama mendemonstrasikan efek anti-inflamatorynya pada EAU

Menjadi sebuah kondisi induksi-autoantigen autoimmune EAU memiliki inflamasi yang didominasi oleh respon inflamatory akut cytokine [3] Dalam penelitian kami kami menemukan bahwa tingkat dari mediator inflamatory termasuk di dalamnya TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 secara signifikan meningkat pada perlakuan-saline tikus EAU saat dibandingkan dengan mereka pada tikus na Vve (Gambar 3) TNF-α adalah cytokine proinflamasi utama dan memainkan peran utama dalam uveitis autoimmune [3] AntagonisTNF-α telah digunakan secara klinis untuk terapi gangguan ocular inflamatory dengan sukses [1922] Karenanya dalam penelitian ini kami membandingkan efek anti-inflamatory antara inhibitor proteasine bortemozib dan antagonis TNF-α etanercept pada EAU Etanercept sebuah protein chimeric dari reseptor TNF-α manusia dan bagian Fc dari rantai berat G immunoglobulin dapat menetralisir TNF-α dan menghalangi aktivitas proinflamatorynya baik pada manusia dan tikus [18 23 24] Kami menemukan bahwa perawatan bortemozib pada EAU tikus dapat menekan tidak hanya TNF-α namun juga banyak mediator inflamator lain seperti as IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 pada retina jadi autoimmune uveitis dapat lebih efektif menekan dengan bortemozib dibanding dengan antagonis etanercept TNF-α (Gambar 1(f)) Bortemozib

8

yang mana dapat menekan banyak inflamator cytokines melalui penghambatan aktivasi NF-κB tampaknya menjadi agen anti-inflamatory yang lebih baik dalam perawatan dari autoimmune uveitis dibanding antagonis TNF-α

Mekanisme dari efek antri-peradangan dari bortezomib bagaimanapun mungkin lebih kompleks dibanding inhibisi dari pengaktivan NF-κB Saat induksi EAU kiranya melibatkan keberadaan antigen dari antigen immunogenic molekul kompleks kelas I dan kelas II oleh histocompatibility utama inhibisi proteasome yang mana adalah komponen penting dari pemrosesan antigen juga mempengaruhi proses pengenalan autoimun pada tahap kekebalan dan stimulasi [25ndash29] sebagai tambahan karena itu inhibitor proteasome dapat menekan beberapa langkah kunci yang diperlukan dalam pengaktivasian respn autoimun pada EAU

Dalam penelitian kami tikus yang diperlakukan bortezomib dari hari yang sama saat diinduksi EAU untuk memastikan awal efek obat selama tahap awal pada perkembangan penyakit Kami tidak mengevaluasi kemanjuran obat saat diperlakukan setelah EAU berkembang sepenuhnya yang biasanya adalah kasus pada pengaturan klinis Pada akhir percobaan setelah pengobatan bortezomib atau etanercept tidak ada kematian pertumbuhan tumor atau infeksi berat yang tercata Namun karena proteasome dan distribusinya yang tersebar mengatur jangkauan luas dari fungsi biologis efeksamping sistemikyang berhubungan dengan inhibitor proteasome layak untuk dipertimbangandengan cermat

Sebagai kesimpulan kami mendemostrasikan pengujian perbaikan EAU pada tikus tergantung pada dosis Mengurangi peradangan intraocular berhubungan dengan penekan pengaktifan NF-κB dan menurunkan peningkatan dari banyak mediator peradangan Hasil kami mengindikasikan bahwa obat yang menargetkan proteasom mungkin adalah strategi pengobatan yang efektif untuk autoimun uveitis di masa depan

Gambar 1 Efek dari bortemozib pada EAU diinduksi dengan IRBP (a) Perbandingan nilai klinis dari tikus EAU yang diperlakukan dengan

bortemozib berdosis-tinggi (075mgkg) (garis merah 119899 = 19) bortemozib

berdosis-rendah (015mgkg) (garis hitam 119899 = 17) atau PBS (garis biru 119899 = 19) dalam 01 mL data menunjukkan bahwa nilai mean klinis (ordinate) dari tiap kelompok eksperimen dari waktu ke waktu (abscissca) dan jumlah dari tiga eksperimen independen Perbandingan dari tikus EAU dengan perlakuan-bortemozib berdosis-tinggi (jalur gejala klinis) (bergaris biru) dengan tikus perlakuan-saline (garis merah) menunjukkan perbedaan yang signifikan dan diindikasikan sebagai ( ) Perbandingan dari perlakuan-bortemozib berdosislowast

9

tinggi (garis biru) dengan perlakuan-bortemozib berdosis-rendah (garis hitam) pada tikus EAU juga menunjukkan perbedaan signifikan dan diindikasikan

sebagai ( ) lowast lowast119875lt 005 melalui Wilcoxon signedrank test (b) (c) (d) dan (e) photomicrographs dari jaringan retina HampE berwarna Representatif photomicrographs slide berwarna paraffin-tetap HampE dari (b) tikus naumlıve C57BL6 tanpa induksi EAU (c) tikus EAU yang menerima perawatan PBS 01mL ( mengindikasikan leukocytes dalam rongga vitreous lowast lowastlowast mengindikasikan lipatan retina) (d) tikus EAU yang menerima perawatan bortezomib dosis-rendah (015mgkg) ekperimen diulangi tiga kali dengan hasil yang serupa CGL layer sel ganglion INL layer atom dalam ONL layer atom luar (f) nilai klinis rata-rata dari waktu ke waktu pada tikus EAY

dengan bortezomib berdosis-tinggi (075mgkg) (garis biru119899 = 9) etanercept

(5mgkg) (garis hitam119899 = 6) atau perawatan saline (01 mLtikus) (garis

merah119899 = 7) Data menunjukan nilai mean klinis (ordinate) dari tiap kelompok eksperimen (abscissa) dan jumlah dari dua eksperimen independen

lowast119875lt 005 melalui signed-rank test

Gambar 2 Evaluasi dari ekspresi protein dari mediator inflamatory pada retina

tikus EAU pada analisis Luminex Penurunan ekspresi dari TNF-120572(a) IL-

1120572(b) IL-1120573(c) IL-17 (f) IL-12 (h) dan MCP-1 (i) relatif pada ekspresi dalam kelompok perlakuan-saline tercatat dalam kelompok bortezomib berdosis tinggi (Vel [H]) tapi tidak dalam kelompok bortezomib berdosis

rendah (Vel [L]) kecuali untuk TNF-120572 Sebagai tambahan tidak ada

perbedaan signifikan pada ekspresi IFN-120574(d) IL-4 (e) dan IL-6 (g) pada retina antara tikus bortezomib dan perlakuan-saline Data yang diekspresikan sebagai mean SD dari tiga eksperimen independen (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001 vmelalui -test siswa

Gambar 3 Evaluasi aktivitas seperti-chymotrypsin dan seperti-trypsin dari proteasome Dibandingkan dengan kelompok EAU perlakuan-saline terdapat penurunan aktivitas signifikan seperti-chymotrypsin (a) dan aktivitas seperti-trypsin (b) pada kelompok bortezomib [Vel (L)] dan dosis-tinggi [Vel (H)] Aktivitas juga ditandai secara rendah pada kelompok perlakuan-bortezomib berdosis-tinggi dibanding dengan kelompok bortezomibtreated berdosis-rendah Data diekspresikan sebagai mean plusmn SD dari mean pada 5 tikus untuk

tiap kelompok (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001

via Studentrsquos 119905-test

10

Gambar 4 EMSA untuk mengevaluasi NF-120581B pengikat aktivitas DNA pada

tikus dan perbedaan kelompok pada EAU tikus Garis 1 p50 subunit NF-120581B Garis 2 pemeriksaan Cuma-Cumafree probe (FP) Garis 3 tikus C57BL6 Garis 4 EAU tikus dengan terapi garam Garis 5 EAU tikus diterapi dengan bortezomib dosis rendah (Vel [L]) Garis 6 EAU tikus diterapi dengan

bortezomib dosis tinggi (Vel [H]) Garis 7 100 kali molar NF-120581B pmeriksaan

yang tidak diberi label Garis 8 anti-p65 subunit NF-120581B Sampel adalah kedua mata dari lima tikus pada masing-masing kelompok Data merupakan hasil dari tiga eksperimen

11

dengan menambahkan 100 kali kelebihan tidak diberi label NF-120581B oligonucleotide untuk kompetitif dibungkus 10 menit sebelum menambahkan biotin diberi label pemeriksaan

29 Analisa statistic Nilai ditunjukkan sebagai rata-rata plusmnSD Untuk perbandingan statistic data sudah dianalisis oleh Wilcoxon signed-

rank test Studentrsquos 119905-test or Chi-square test menggunakan software

prisma 50 dalam semua tes 119875 values lt 005 merupakan pertimbangan statistic yang penting

3 Hasil 31 Bortemozib Dosis Tinggi secara Signifikan Menurunkan Uveoretinitis

pada Tikus EAU EAU diinduksi pada tikus dengan menyuntikkan emulsi 200 μg of IRBP1ndash20 dengan CFA secara subkutan dan 15 μg toksin Pertussis (PTX) secara intraperitoneal seperti yang dijelaskan dalam Bagian 2 Pada waktu yang sama bortemozib berdosis tinggi (075 mgkg) dan berdosis rendah (015 mgkg) disuntikkan secara intraperitoneal pada tikus dan lalu dua kali seminggu hingga akhir eksperimen Sekelompok tikus yang menerima PBS bukan bortemozib bertindak sebagai kontrol Dalam kelompok perlakuan-PBS penyakit menunjukkan tanda inflamasi 9-15 hari kemudian dan berkembang selama 4-5 hari saat mencapai puncak Tikus yang menerima imunisasi IBRP1ndash20 ditambah dengan terapi bortemozib berdosis-tinggi menunjukkan penundaan yang signifikan pada awal penyakit dan nilai puncak EAU yang secara signifikan lebih rendah dari waktu ke waktu (Gambar 1(a) Tabel 1) Sementara kedua tikus perlakuan-saline dan perlakuan bortemozib berdosis rendah memiliki insiden penyakit yang lebih tinggi (14 dari 19 dan 10 dari 17 resp) kami mengamati bahwa tikus dengan perlakuan-bortemozib berdosis tinggi memiliki insiden EAU yang secara signifikan lebih rendah (3 dari 19 P lt 005) (Tabel 1) Tikus yang menerima perawatan saline memiliki nilai keparahan 216 plusmn 025 sementara tikus yang menerima perawatan bortemozib berdosis-tinggi memiliki nilai mean klinis keparahan 058 plusmn 018 (P lt 005) (Tabel 1) Tikus yang menerima perawatan bortemozib dosis-rendah menunjukkan nilai mean klinis keparahan 200 plusmn 023 yang mana tidak berbeda secara signifikan dari kelompok kontrol perlakuan-saline Fakta bahwa mayoritas tikus yang diberikan bortemozib berdosis tinggi memiliki nilai puncak 1 atau lebih rendah (yaitu ringan atau tidak ada penyakit) mengindikasikan aktivitas menekan dari bortemozib pada EAU Sebagai tambahan pemeriksaan HampE slide parafin berwarna tetap menunjukkan bagian retina dari tikus EAU yang menerima bortemozib berdosis-tinggi memiliki infiltrasi sel yang berkurang dalam rongga

5

vireous dan struktur layer retina kekurangan lipatan retina yang diamati dalam tikus perlakuan-saline (Gambar 1(b)ndash1(e)) Tidak ada kematian atau ekstraocular morbiditas yang berhubungan dengan perawatan bortemozib pada eksperimen hewan Berat badan dan tingkat haemoglobin tikus tidak berbeda secara signifikan antara kelompok perlakuan saline dan bortemozib pada akhir eksperimen (data tidak ditunjukkan) Juga tidak terdapat pertumbuhan tumor atau infeksi setelah perawatan bortemozib pada penelitian kami

32 Terapi Bortemozib Menekan EAU lebih dari Terapi Antagonis TNF-Alpha Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa antagonis TNF-α dapat menekan uveits pada manusia dan tikus [1819] Maka kami membandingkan efek penekanan EAU dengan bortemozib atau antagonis etanercept TNF-α Bortemozib (075 mgkg) atau etanercept (5 mgkg) disuntikkan pada tikus EAU dua kali seminggu dari hari induksi EAU Sekelompok tikus yang menerima PBS (01 mLtikus) bertindak sebagai kontrol Tikus yang menerima imunisasi IRPB1-20 ditambah perawatan dengan menunjukkan penundaan dalam onset penyakit dan memiliki nilai puncak EAU yang lebih rendah dari waktu ke waktu (Gambar 1(f) Tabel 2) Tikus yang menerima terapi etanercept juga memiliki insiden dan nilai mean puncak yang lebih rendah Akan tetapi perbedaan antara kelompok perlakuan saline- dan etanercept tidak mencapai signifikansi statistik (Tabel 2 P = 006) karenanya terapi dengan bortemozib menekan perkembangan dan parahnya EAU lebih efektif dari antagonis etanercept TNF-α Tidak ada kematian morbiditas pertumbuhan tumor atau infeksi yang berhubungan dengan perawatan bortemozib atau etanercept pada tikus EAU pada akhir eksperimen

33 Pengaruh Bortezomib pada Tingkat Mediator Inflamasi pada Retina Tikus EAU Kami lalu mengukur tingkat cytokine pada retina tikus EAU dengan terapi yang berbeda Saat membandingkan kelompok terapi-saline dengan kelompok terapi-bortezomib dosis rendah sementara tingkat cytokine tidak berbeda secara signifikan (Gambar 2(a)-2(i)) Sementara tingkat TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 pada retina secara signifikan lebih rendah pada tikus EAU yang diperlakukan dengan bortezomib dosis tinggi saat dibandingkan dengan tikus yang diberi prlakuan-saline (P lt 005 pada semua pembanding berpasangan) (Gambar 2(a) 2(b) 2(c) 2(f) 2(h) and 2(i)) Akan tetapi tidak terdapat perbedaan signifikan yang tercatat pada IFN-γ IL-4 dan IL-6 antara penerapan-bortezomib berdosis-tinggi dan penerapan-saline pada tikus EAU (Gambar

6

2(d) 2(e) dan 2(g)) Saat membandingkan kelompok perlakuan dengan bortezomib berdosis-tinggi dan berdosis-rendah kami menemukan bahwa tingkat TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 rendah pada kelompok bortezomib berdosis-tinggi dengan kelompok bottezomib berdosis-rendah (P lt 005 pada semua pembanding berpasangan) (Gambar 2(a) 2(b) 2(c) 2(f) 2(h) dan 2(i))

34 Penerapan Bortezomib secara Signifikan Menurunkan Aktivitas Proteasome tikus EAU Kami lalu melakukan aktivitas pengujian kadar proteasome protease untuk mengevaluasi efek menekan dari penerapan bortezomib pada jaringan retina Sinyal luminescence mengindikasikan aktivitas seperti-kimotripsin atau seperti-trypsin pada jaringan retina dari tikus EAU Sinyalny secara signifikan lebih rendah pada kelompok perlakuan-bortezomib berdosis-tinggi (P lt 005) (Gambar 3(a) dan 3(b)) Juga terdapat perbedaan signifikan pada luminescence sinyal antara bortezomib berdosis-rendah dan kelompok perlakuan-saline (Gambar 3(a) dan 3(b))

35 Peningkatan Pengikat dari NF-κB dan DNA pada tikus EAU Terhambar oleh perlakuan Bortemozib Keterlibatan jalur NF-κB saat terapi bortemozib pada EAU dianalisa dengan EMSA Dibandingkan dengan kelompok Na V ve pengikatan DNA NF-κB meningkat secara signifikan setelah induksi EAU (Gambar 4 pergeseran Na V ve dan Saline) Peningkatan aktivitas dari pengikatan DNA NF-κB setelah induksi EAU dengan nyata terhambat oleh terapi bortemozib berdosis-rendah Terapi bortemozib berdosis-tinggi lebih jauh menekan pengikatan DNA NF-κB (Gambar 4 Pergeseran Vel (L) dan Vel (H)) Menambahkan molar NF-κB tak berlabel 100 kali lipat penyelidikan seluruhnya memblok pengikatan dari penyelidikan berlabel pada DNA NF-κB kompleks (Gambar 4 Pengangkatan 100X) karenanya bortemozib menurunkan pengikatan dari DNA NF-κB secara dosis-responsif Hasil dari inhibisi protease (Gambar 3) dan pengikatan DNA NF-κB mengimplikasikan bahwaaktivasidariNF-κBsecara efektif ditekan olehpenghambatanproteasome

4 PembahasanHasil demonstrasi penelitian kami menunjukkan bahwa bortezomib

sebuah proteasom inhibitor 26S aktif dalam menekan pengaktifan NF-κBdan efektif dalam menghambat peradangan mata dan menurunkan produksi mediator inflamatory pada EAU Hasil kami mengindikasikan bahwa inhibisi

7

dari proteasome mungkin adalah pendekatan yang menjanjikan untuk terapi autoimun uveitis

Bukti baru-baru ini mengindikasikan bahwa NF-κB memiliki peran penting dalam EAU dan inhibisi dari pengaktifan NF-κB dapat mengurangi tingkat inflamasi jaringan dengan menurunkan mediator inflamator dan infiltrasisel keuvea

Karena degradasi proteasomal dari faktor inhibitor IκB penting bagi aktivasi NF-κB inhibisi dari proteasome mempertahankan NF-κB dapa keadaan tidak aktif dalam cytosol dan mencegah translokasi nucleus Inhibisi proteasome ditemukan efektif dalam terapi beberapa hewan model dari penyakit autoimun seperti myasthenia gravis psoriasis arthritis dan autoimmune encephalomyelitis [10ndash13] Lebih lagi Chan et al telah menunjukkan efek anti-inflamatory pada inhibitor proteasone pada induksi-endotoksin uveits pada tikus [17] Inhibitor proteasome bortezomib disebabkan karena aktivitasnya untuk menekan degradasi protein nonlysosomal telah digunakan pada perawatan kanker hematologis pda pengaturan klinis [20] Pada penelitian ini kami memilih bortemozib berdasarkan pada kemanjuran tingginya pada konsentrasi minimal dan dapat diterima dan dapat terkelolanya efek merugikan dalam merawat penyakit hematologi manusia [21] Untuk pengetahuan kita penelitian kami adalah yang pertama mendemonstrasikan efek anti-inflamatorynya pada EAU

Menjadi sebuah kondisi induksi-autoantigen autoimmune EAU memiliki inflamasi yang didominasi oleh respon inflamatory akut cytokine [3] Dalam penelitian kami kami menemukan bahwa tingkat dari mediator inflamatory termasuk di dalamnya TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 secara signifikan meningkat pada perlakuan-saline tikus EAU saat dibandingkan dengan mereka pada tikus na Vve (Gambar 3) TNF-α adalah cytokine proinflamasi utama dan memainkan peran utama dalam uveitis autoimmune [3] AntagonisTNF-α telah digunakan secara klinis untuk terapi gangguan ocular inflamatory dengan sukses [1922] Karenanya dalam penelitian ini kami membandingkan efek anti-inflamatory antara inhibitor proteasine bortemozib dan antagonis TNF-α etanercept pada EAU Etanercept sebuah protein chimeric dari reseptor TNF-α manusia dan bagian Fc dari rantai berat G immunoglobulin dapat menetralisir TNF-α dan menghalangi aktivitas proinflamatorynya baik pada manusia dan tikus [18 23 24] Kami menemukan bahwa perawatan bortemozib pada EAU tikus dapat menekan tidak hanya TNF-α namun juga banyak mediator inflamator lain seperti as IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 pada retina jadi autoimmune uveitis dapat lebih efektif menekan dengan bortemozib dibanding dengan antagonis etanercept TNF-α (Gambar 1(f)) Bortemozib

8

yang mana dapat menekan banyak inflamator cytokines melalui penghambatan aktivasi NF-κB tampaknya menjadi agen anti-inflamatory yang lebih baik dalam perawatan dari autoimmune uveitis dibanding antagonis TNF-α

Mekanisme dari efek antri-peradangan dari bortezomib bagaimanapun mungkin lebih kompleks dibanding inhibisi dari pengaktivan NF-κB Saat induksi EAU kiranya melibatkan keberadaan antigen dari antigen immunogenic molekul kompleks kelas I dan kelas II oleh histocompatibility utama inhibisi proteasome yang mana adalah komponen penting dari pemrosesan antigen juga mempengaruhi proses pengenalan autoimun pada tahap kekebalan dan stimulasi [25ndash29] sebagai tambahan karena itu inhibitor proteasome dapat menekan beberapa langkah kunci yang diperlukan dalam pengaktivasian respn autoimun pada EAU

Dalam penelitian kami tikus yang diperlakukan bortezomib dari hari yang sama saat diinduksi EAU untuk memastikan awal efek obat selama tahap awal pada perkembangan penyakit Kami tidak mengevaluasi kemanjuran obat saat diperlakukan setelah EAU berkembang sepenuhnya yang biasanya adalah kasus pada pengaturan klinis Pada akhir percobaan setelah pengobatan bortezomib atau etanercept tidak ada kematian pertumbuhan tumor atau infeksi berat yang tercata Namun karena proteasome dan distribusinya yang tersebar mengatur jangkauan luas dari fungsi biologis efeksamping sistemikyang berhubungan dengan inhibitor proteasome layak untuk dipertimbangandengan cermat

Sebagai kesimpulan kami mendemostrasikan pengujian perbaikan EAU pada tikus tergantung pada dosis Mengurangi peradangan intraocular berhubungan dengan penekan pengaktifan NF-κB dan menurunkan peningkatan dari banyak mediator peradangan Hasil kami mengindikasikan bahwa obat yang menargetkan proteasom mungkin adalah strategi pengobatan yang efektif untuk autoimun uveitis di masa depan

Gambar 1 Efek dari bortemozib pada EAU diinduksi dengan IRBP (a) Perbandingan nilai klinis dari tikus EAU yang diperlakukan dengan

bortemozib berdosis-tinggi (075mgkg) (garis merah 119899 = 19) bortemozib

berdosis-rendah (015mgkg) (garis hitam 119899 = 17) atau PBS (garis biru 119899 = 19) dalam 01 mL data menunjukkan bahwa nilai mean klinis (ordinate) dari tiap kelompok eksperimen dari waktu ke waktu (abscissca) dan jumlah dari tiga eksperimen independen Perbandingan dari tikus EAU dengan perlakuan-bortemozib berdosis-tinggi (jalur gejala klinis) (bergaris biru) dengan tikus perlakuan-saline (garis merah) menunjukkan perbedaan yang signifikan dan diindikasikan sebagai ( ) Perbandingan dari perlakuan-bortemozib berdosislowast

9

tinggi (garis biru) dengan perlakuan-bortemozib berdosis-rendah (garis hitam) pada tikus EAU juga menunjukkan perbedaan signifikan dan diindikasikan

sebagai ( ) lowast lowast119875lt 005 melalui Wilcoxon signedrank test (b) (c) (d) dan (e) photomicrographs dari jaringan retina HampE berwarna Representatif photomicrographs slide berwarna paraffin-tetap HampE dari (b) tikus naumlıve C57BL6 tanpa induksi EAU (c) tikus EAU yang menerima perawatan PBS 01mL ( mengindikasikan leukocytes dalam rongga vitreous lowast lowastlowast mengindikasikan lipatan retina) (d) tikus EAU yang menerima perawatan bortezomib dosis-rendah (015mgkg) ekperimen diulangi tiga kali dengan hasil yang serupa CGL layer sel ganglion INL layer atom dalam ONL layer atom luar (f) nilai klinis rata-rata dari waktu ke waktu pada tikus EAY

dengan bortezomib berdosis-tinggi (075mgkg) (garis biru119899 = 9) etanercept

(5mgkg) (garis hitam119899 = 6) atau perawatan saline (01 mLtikus) (garis

merah119899 = 7) Data menunjukan nilai mean klinis (ordinate) dari tiap kelompok eksperimen (abscissa) dan jumlah dari dua eksperimen independen

lowast119875lt 005 melalui signed-rank test

Gambar 2 Evaluasi dari ekspresi protein dari mediator inflamatory pada retina

tikus EAU pada analisis Luminex Penurunan ekspresi dari TNF-120572(a) IL-

1120572(b) IL-1120573(c) IL-17 (f) IL-12 (h) dan MCP-1 (i) relatif pada ekspresi dalam kelompok perlakuan-saline tercatat dalam kelompok bortezomib berdosis tinggi (Vel [H]) tapi tidak dalam kelompok bortezomib berdosis

rendah (Vel [L]) kecuali untuk TNF-120572 Sebagai tambahan tidak ada

perbedaan signifikan pada ekspresi IFN-120574(d) IL-4 (e) dan IL-6 (g) pada retina antara tikus bortezomib dan perlakuan-saline Data yang diekspresikan sebagai mean SD dari tiga eksperimen independen (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001 vmelalui -test siswa

Gambar 3 Evaluasi aktivitas seperti-chymotrypsin dan seperti-trypsin dari proteasome Dibandingkan dengan kelompok EAU perlakuan-saline terdapat penurunan aktivitas signifikan seperti-chymotrypsin (a) dan aktivitas seperti-trypsin (b) pada kelompok bortezomib [Vel (L)] dan dosis-tinggi [Vel (H)] Aktivitas juga ditandai secara rendah pada kelompok perlakuan-bortezomib berdosis-tinggi dibanding dengan kelompok bortezomibtreated berdosis-rendah Data diekspresikan sebagai mean plusmn SD dari mean pada 5 tikus untuk

tiap kelompok (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001

via Studentrsquos 119905-test

10

Gambar 4 EMSA untuk mengevaluasi NF-120581B pengikat aktivitas DNA pada

tikus dan perbedaan kelompok pada EAU tikus Garis 1 p50 subunit NF-120581B Garis 2 pemeriksaan Cuma-Cumafree probe (FP) Garis 3 tikus C57BL6 Garis 4 EAU tikus dengan terapi garam Garis 5 EAU tikus diterapi dengan bortezomib dosis rendah (Vel [L]) Garis 6 EAU tikus diterapi dengan

bortezomib dosis tinggi (Vel [H]) Garis 7 100 kali molar NF-120581B pmeriksaan

yang tidak diberi label Garis 8 anti-p65 subunit NF-120581B Sampel adalah kedua mata dari lima tikus pada masing-masing kelompok Data merupakan hasil dari tiga eksperimen

11

vireous dan struktur layer retina kekurangan lipatan retina yang diamati dalam tikus perlakuan-saline (Gambar 1(b)ndash1(e)) Tidak ada kematian atau ekstraocular morbiditas yang berhubungan dengan perawatan bortemozib pada eksperimen hewan Berat badan dan tingkat haemoglobin tikus tidak berbeda secara signifikan antara kelompok perlakuan saline dan bortemozib pada akhir eksperimen (data tidak ditunjukkan) Juga tidak terdapat pertumbuhan tumor atau infeksi setelah perawatan bortemozib pada penelitian kami

32 Terapi Bortemozib Menekan EAU lebih dari Terapi Antagonis TNF-Alpha Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa antagonis TNF-α dapat menekan uveits pada manusia dan tikus [1819] Maka kami membandingkan efek penekanan EAU dengan bortemozib atau antagonis etanercept TNF-α Bortemozib (075 mgkg) atau etanercept (5 mgkg) disuntikkan pada tikus EAU dua kali seminggu dari hari induksi EAU Sekelompok tikus yang menerima PBS (01 mLtikus) bertindak sebagai kontrol Tikus yang menerima imunisasi IRPB1-20 ditambah perawatan dengan menunjukkan penundaan dalam onset penyakit dan memiliki nilai puncak EAU yang lebih rendah dari waktu ke waktu (Gambar 1(f) Tabel 2) Tikus yang menerima terapi etanercept juga memiliki insiden dan nilai mean puncak yang lebih rendah Akan tetapi perbedaan antara kelompok perlakuan saline- dan etanercept tidak mencapai signifikansi statistik (Tabel 2 P = 006) karenanya terapi dengan bortemozib menekan perkembangan dan parahnya EAU lebih efektif dari antagonis etanercept TNF-α Tidak ada kematian morbiditas pertumbuhan tumor atau infeksi yang berhubungan dengan perawatan bortemozib atau etanercept pada tikus EAU pada akhir eksperimen

33 Pengaruh Bortezomib pada Tingkat Mediator Inflamasi pada Retina Tikus EAU Kami lalu mengukur tingkat cytokine pada retina tikus EAU dengan terapi yang berbeda Saat membandingkan kelompok terapi-saline dengan kelompok terapi-bortezomib dosis rendah sementara tingkat cytokine tidak berbeda secara signifikan (Gambar 2(a)-2(i)) Sementara tingkat TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 pada retina secara signifikan lebih rendah pada tikus EAU yang diperlakukan dengan bortezomib dosis tinggi saat dibandingkan dengan tikus yang diberi prlakuan-saline (P lt 005 pada semua pembanding berpasangan) (Gambar 2(a) 2(b) 2(c) 2(f) 2(h) and 2(i)) Akan tetapi tidak terdapat perbedaan signifikan yang tercatat pada IFN-γ IL-4 dan IL-6 antara penerapan-bortezomib berdosis-tinggi dan penerapan-saline pada tikus EAU (Gambar

6

2(d) 2(e) dan 2(g)) Saat membandingkan kelompok perlakuan dengan bortezomib berdosis-tinggi dan berdosis-rendah kami menemukan bahwa tingkat TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 rendah pada kelompok bortezomib berdosis-tinggi dengan kelompok bottezomib berdosis-rendah (P lt 005 pada semua pembanding berpasangan) (Gambar 2(a) 2(b) 2(c) 2(f) 2(h) dan 2(i))

34 Penerapan Bortezomib secara Signifikan Menurunkan Aktivitas Proteasome tikus EAU Kami lalu melakukan aktivitas pengujian kadar proteasome protease untuk mengevaluasi efek menekan dari penerapan bortezomib pada jaringan retina Sinyal luminescence mengindikasikan aktivitas seperti-kimotripsin atau seperti-trypsin pada jaringan retina dari tikus EAU Sinyalny secara signifikan lebih rendah pada kelompok perlakuan-bortezomib berdosis-tinggi (P lt 005) (Gambar 3(a) dan 3(b)) Juga terdapat perbedaan signifikan pada luminescence sinyal antara bortezomib berdosis-rendah dan kelompok perlakuan-saline (Gambar 3(a) dan 3(b))

35 Peningkatan Pengikat dari NF-κB dan DNA pada tikus EAU Terhambar oleh perlakuan Bortemozib Keterlibatan jalur NF-κB saat terapi bortemozib pada EAU dianalisa dengan EMSA Dibandingkan dengan kelompok Na V ve pengikatan DNA NF-κB meningkat secara signifikan setelah induksi EAU (Gambar 4 pergeseran Na V ve dan Saline) Peningkatan aktivitas dari pengikatan DNA NF-κB setelah induksi EAU dengan nyata terhambat oleh terapi bortemozib berdosis-rendah Terapi bortemozib berdosis-tinggi lebih jauh menekan pengikatan DNA NF-κB (Gambar 4 Pergeseran Vel (L) dan Vel (H)) Menambahkan molar NF-κB tak berlabel 100 kali lipat penyelidikan seluruhnya memblok pengikatan dari penyelidikan berlabel pada DNA NF-κB kompleks (Gambar 4 Pengangkatan 100X) karenanya bortemozib menurunkan pengikatan dari DNA NF-κB secara dosis-responsif Hasil dari inhibisi protease (Gambar 3) dan pengikatan DNA NF-κB mengimplikasikan bahwaaktivasidariNF-κBsecara efektif ditekan olehpenghambatanproteasome

4 PembahasanHasil demonstrasi penelitian kami menunjukkan bahwa bortezomib

sebuah proteasom inhibitor 26S aktif dalam menekan pengaktifan NF-κBdan efektif dalam menghambat peradangan mata dan menurunkan produksi mediator inflamatory pada EAU Hasil kami mengindikasikan bahwa inhibisi

7

dari proteasome mungkin adalah pendekatan yang menjanjikan untuk terapi autoimun uveitis

Bukti baru-baru ini mengindikasikan bahwa NF-κB memiliki peran penting dalam EAU dan inhibisi dari pengaktifan NF-κB dapat mengurangi tingkat inflamasi jaringan dengan menurunkan mediator inflamator dan infiltrasisel keuvea

Karena degradasi proteasomal dari faktor inhibitor IκB penting bagi aktivasi NF-κB inhibisi dari proteasome mempertahankan NF-κB dapa keadaan tidak aktif dalam cytosol dan mencegah translokasi nucleus Inhibisi proteasome ditemukan efektif dalam terapi beberapa hewan model dari penyakit autoimun seperti myasthenia gravis psoriasis arthritis dan autoimmune encephalomyelitis [10ndash13] Lebih lagi Chan et al telah menunjukkan efek anti-inflamatory pada inhibitor proteasone pada induksi-endotoksin uveits pada tikus [17] Inhibitor proteasome bortezomib disebabkan karena aktivitasnya untuk menekan degradasi protein nonlysosomal telah digunakan pada perawatan kanker hematologis pda pengaturan klinis [20] Pada penelitian ini kami memilih bortemozib berdasarkan pada kemanjuran tingginya pada konsentrasi minimal dan dapat diterima dan dapat terkelolanya efek merugikan dalam merawat penyakit hematologi manusia [21] Untuk pengetahuan kita penelitian kami adalah yang pertama mendemonstrasikan efek anti-inflamatorynya pada EAU

Menjadi sebuah kondisi induksi-autoantigen autoimmune EAU memiliki inflamasi yang didominasi oleh respon inflamatory akut cytokine [3] Dalam penelitian kami kami menemukan bahwa tingkat dari mediator inflamatory termasuk di dalamnya TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 secara signifikan meningkat pada perlakuan-saline tikus EAU saat dibandingkan dengan mereka pada tikus na Vve (Gambar 3) TNF-α adalah cytokine proinflamasi utama dan memainkan peran utama dalam uveitis autoimmune [3] AntagonisTNF-α telah digunakan secara klinis untuk terapi gangguan ocular inflamatory dengan sukses [1922] Karenanya dalam penelitian ini kami membandingkan efek anti-inflamatory antara inhibitor proteasine bortemozib dan antagonis TNF-α etanercept pada EAU Etanercept sebuah protein chimeric dari reseptor TNF-α manusia dan bagian Fc dari rantai berat G immunoglobulin dapat menetralisir TNF-α dan menghalangi aktivitas proinflamatorynya baik pada manusia dan tikus [18 23 24] Kami menemukan bahwa perawatan bortemozib pada EAU tikus dapat menekan tidak hanya TNF-α namun juga banyak mediator inflamator lain seperti as IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 pada retina jadi autoimmune uveitis dapat lebih efektif menekan dengan bortemozib dibanding dengan antagonis etanercept TNF-α (Gambar 1(f)) Bortemozib

8

yang mana dapat menekan banyak inflamator cytokines melalui penghambatan aktivasi NF-κB tampaknya menjadi agen anti-inflamatory yang lebih baik dalam perawatan dari autoimmune uveitis dibanding antagonis TNF-α

Mekanisme dari efek antri-peradangan dari bortezomib bagaimanapun mungkin lebih kompleks dibanding inhibisi dari pengaktivan NF-κB Saat induksi EAU kiranya melibatkan keberadaan antigen dari antigen immunogenic molekul kompleks kelas I dan kelas II oleh histocompatibility utama inhibisi proteasome yang mana adalah komponen penting dari pemrosesan antigen juga mempengaruhi proses pengenalan autoimun pada tahap kekebalan dan stimulasi [25ndash29] sebagai tambahan karena itu inhibitor proteasome dapat menekan beberapa langkah kunci yang diperlukan dalam pengaktivasian respn autoimun pada EAU

Dalam penelitian kami tikus yang diperlakukan bortezomib dari hari yang sama saat diinduksi EAU untuk memastikan awal efek obat selama tahap awal pada perkembangan penyakit Kami tidak mengevaluasi kemanjuran obat saat diperlakukan setelah EAU berkembang sepenuhnya yang biasanya adalah kasus pada pengaturan klinis Pada akhir percobaan setelah pengobatan bortezomib atau etanercept tidak ada kematian pertumbuhan tumor atau infeksi berat yang tercata Namun karena proteasome dan distribusinya yang tersebar mengatur jangkauan luas dari fungsi biologis efeksamping sistemikyang berhubungan dengan inhibitor proteasome layak untuk dipertimbangandengan cermat

Sebagai kesimpulan kami mendemostrasikan pengujian perbaikan EAU pada tikus tergantung pada dosis Mengurangi peradangan intraocular berhubungan dengan penekan pengaktifan NF-κB dan menurunkan peningkatan dari banyak mediator peradangan Hasil kami mengindikasikan bahwa obat yang menargetkan proteasom mungkin adalah strategi pengobatan yang efektif untuk autoimun uveitis di masa depan

Gambar 1 Efek dari bortemozib pada EAU diinduksi dengan IRBP (a) Perbandingan nilai klinis dari tikus EAU yang diperlakukan dengan

bortemozib berdosis-tinggi (075mgkg) (garis merah 119899 = 19) bortemozib

berdosis-rendah (015mgkg) (garis hitam 119899 = 17) atau PBS (garis biru 119899 = 19) dalam 01 mL data menunjukkan bahwa nilai mean klinis (ordinate) dari tiap kelompok eksperimen dari waktu ke waktu (abscissca) dan jumlah dari tiga eksperimen independen Perbandingan dari tikus EAU dengan perlakuan-bortemozib berdosis-tinggi (jalur gejala klinis) (bergaris biru) dengan tikus perlakuan-saline (garis merah) menunjukkan perbedaan yang signifikan dan diindikasikan sebagai ( ) Perbandingan dari perlakuan-bortemozib berdosislowast

9

tinggi (garis biru) dengan perlakuan-bortemozib berdosis-rendah (garis hitam) pada tikus EAU juga menunjukkan perbedaan signifikan dan diindikasikan

sebagai ( ) lowast lowast119875lt 005 melalui Wilcoxon signedrank test (b) (c) (d) dan (e) photomicrographs dari jaringan retina HampE berwarna Representatif photomicrographs slide berwarna paraffin-tetap HampE dari (b) tikus naumlıve C57BL6 tanpa induksi EAU (c) tikus EAU yang menerima perawatan PBS 01mL ( mengindikasikan leukocytes dalam rongga vitreous lowast lowastlowast mengindikasikan lipatan retina) (d) tikus EAU yang menerima perawatan bortezomib dosis-rendah (015mgkg) ekperimen diulangi tiga kali dengan hasil yang serupa CGL layer sel ganglion INL layer atom dalam ONL layer atom luar (f) nilai klinis rata-rata dari waktu ke waktu pada tikus EAY

dengan bortezomib berdosis-tinggi (075mgkg) (garis biru119899 = 9) etanercept

(5mgkg) (garis hitam119899 = 6) atau perawatan saline (01 mLtikus) (garis

merah119899 = 7) Data menunjukan nilai mean klinis (ordinate) dari tiap kelompok eksperimen (abscissa) dan jumlah dari dua eksperimen independen

lowast119875lt 005 melalui signed-rank test

Gambar 2 Evaluasi dari ekspresi protein dari mediator inflamatory pada retina

tikus EAU pada analisis Luminex Penurunan ekspresi dari TNF-120572(a) IL-

1120572(b) IL-1120573(c) IL-17 (f) IL-12 (h) dan MCP-1 (i) relatif pada ekspresi dalam kelompok perlakuan-saline tercatat dalam kelompok bortezomib berdosis tinggi (Vel [H]) tapi tidak dalam kelompok bortezomib berdosis

rendah (Vel [L]) kecuali untuk TNF-120572 Sebagai tambahan tidak ada

perbedaan signifikan pada ekspresi IFN-120574(d) IL-4 (e) dan IL-6 (g) pada retina antara tikus bortezomib dan perlakuan-saline Data yang diekspresikan sebagai mean SD dari tiga eksperimen independen (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001 vmelalui -test siswa

Gambar 3 Evaluasi aktivitas seperti-chymotrypsin dan seperti-trypsin dari proteasome Dibandingkan dengan kelompok EAU perlakuan-saline terdapat penurunan aktivitas signifikan seperti-chymotrypsin (a) dan aktivitas seperti-trypsin (b) pada kelompok bortezomib [Vel (L)] dan dosis-tinggi [Vel (H)] Aktivitas juga ditandai secara rendah pada kelompok perlakuan-bortezomib berdosis-tinggi dibanding dengan kelompok bortezomibtreated berdosis-rendah Data diekspresikan sebagai mean plusmn SD dari mean pada 5 tikus untuk

tiap kelompok (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001

via Studentrsquos 119905-test

10

Gambar 4 EMSA untuk mengevaluasi NF-120581B pengikat aktivitas DNA pada

tikus dan perbedaan kelompok pada EAU tikus Garis 1 p50 subunit NF-120581B Garis 2 pemeriksaan Cuma-Cumafree probe (FP) Garis 3 tikus C57BL6 Garis 4 EAU tikus dengan terapi garam Garis 5 EAU tikus diterapi dengan bortezomib dosis rendah (Vel [L]) Garis 6 EAU tikus diterapi dengan

bortezomib dosis tinggi (Vel [H]) Garis 7 100 kali molar NF-120581B pmeriksaan

yang tidak diberi label Garis 8 anti-p65 subunit NF-120581B Sampel adalah kedua mata dari lima tikus pada masing-masing kelompok Data merupakan hasil dari tiga eksperimen

11

2(d) 2(e) dan 2(g)) Saat membandingkan kelompok perlakuan dengan bortezomib berdosis-tinggi dan berdosis-rendah kami menemukan bahwa tingkat TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 rendah pada kelompok bortezomib berdosis-tinggi dengan kelompok bottezomib berdosis-rendah (P lt 005 pada semua pembanding berpasangan) (Gambar 2(a) 2(b) 2(c) 2(f) 2(h) dan 2(i))

34 Penerapan Bortezomib secara Signifikan Menurunkan Aktivitas Proteasome tikus EAU Kami lalu melakukan aktivitas pengujian kadar proteasome protease untuk mengevaluasi efek menekan dari penerapan bortezomib pada jaringan retina Sinyal luminescence mengindikasikan aktivitas seperti-kimotripsin atau seperti-trypsin pada jaringan retina dari tikus EAU Sinyalny secara signifikan lebih rendah pada kelompok perlakuan-bortezomib berdosis-tinggi (P lt 005) (Gambar 3(a) dan 3(b)) Juga terdapat perbedaan signifikan pada luminescence sinyal antara bortezomib berdosis-rendah dan kelompok perlakuan-saline (Gambar 3(a) dan 3(b))

35 Peningkatan Pengikat dari NF-κB dan DNA pada tikus EAU Terhambar oleh perlakuan Bortemozib Keterlibatan jalur NF-κB saat terapi bortemozib pada EAU dianalisa dengan EMSA Dibandingkan dengan kelompok Na V ve pengikatan DNA NF-κB meningkat secara signifikan setelah induksi EAU (Gambar 4 pergeseran Na V ve dan Saline) Peningkatan aktivitas dari pengikatan DNA NF-κB setelah induksi EAU dengan nyata terhambat oleh terapi bortemozib berdosis-rendah Terapi bortemozib berdosis-tinggi lebih jauh menekan pengikatan DNA NF-κB (Gambar 4 Pergeseran Vel (L) dan Vel (H)) Menambahkan molar NF-κB tak berlabel 100 kali lipat penyelidikan seluruhnya memblok pengikatan dari penyelidikan berlabel pada DNA NF-κB kompleks (Gambar 4 Pengangkatan 100X) karenanya bortemozib menurunkan pengikatan dari DNA NF-κB secara dosis-responsif Hasil dari inhibisi protease (Gambar 3) dan pengikatan DNA NF-κB mengimplikasikan bahwaaktivasidariNF-κBsecara efektif ditekan olehpenghambatanproteasome

4 PembahasanHasil demonstrasi penelitian kami menunjukkan bahwa bortezomib

sebuah proteasom inhibitor 26S aktif dalam menekan pengaktifan NF-κBdan efektif dalam menghambat peradangan mata dan menurunkan produksi mediator inflamatory pada EAU Hasil kami mengindikasikan bahwa inhibisi

7

dari proteasome mungkin adalah pendekatan yang menjanjikan untuk terapi autoimun uveitis

Bukti baru-baru ini mengindikasikan bahwa NF-κB memiliki peran penting dalam EAU dan inhibisi dari pengaktifan NF-κB dapat mengurangi tingkat inflamasi jaringan dengan menurunkan mediator inflamator dan infiltrasisel keuvea

Karena degradasi proteasomal dari faktor inhibitor IκB penting bagi aktivasi NF-κB inhibisi dari proteasome mempertahankan NF-κB dapa keadaan tidak aktif dalam cytosol dan mencegah translokasi nucleus Inhibisi proteasome ditemukan efektif dalam terapi beberapa hewan model dari penyakit autoimun seperti myasthenia gravis psoriasis arthritis dan autoimmune encephalomyelitis [10ndash13] Lebih lagi Chan et al telah menunjukkan efek anti-inflamatory pada inhibitor proteasone pada induksi-endotoksin uveits pada tikus [17] Inhibitor proteasome bortezomib disebabkan karena aktivitasnya untuk menekan degradasi protein nonlysosomal telah digunakan pada perawatan kanker hematologis pda pengaturan klinis [20] Pada penelitian ini kami memilih bortemozib berdasarkan pada kemanjuran tingginya pada konsentrasi minimal dan dapat diterima dan dapat terkelolanya efek merugikan dalam merawat penyakit hematologi manusia [21] Untuk pengetahuan kita penelitian kami adalah yang pertama mendemonstrasikan efek anti-inflamatorynya pada EAU

Menjadi sebuah kondisi induksi-autoantigen autoimmune EAU memiliki inflamasi yang didominasi oleh respon inflamatory akut cytokine [3] Dalam penelitian kami kami menemukan bahwa tingkat dari mediator inflamatory termasuk di dalamnya TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 secara signifikan meningkat pada perlakuan-saline tikus EAU saat dibandingkan dengan mereka pada tikus na Vve (Gambar 3) TNF-α adalah cytokine proinflamasi utama dan memainkan peran utama dalam uveitis autoimmune [3] AntagonisTNF-α telah digunakan secara klinis untuk terapi gangguan ocular inflamatory dengan sukses [1922] Karenanya dalam penelitian ini kami membandingkan efek anti-inflamatory antara inhibitor proteasine bortemozib dan antagonis TNF-α etanercept pada EAU Etanercept sebuah protein chimeric dari reseptor TNF-α manusia dan bagian Fc dari rantai berat G immunoglobulin dapat menetralisir TNF-α dan menghalangi aktivitas proinflamatorynya baik pada manusia dan tikus [18 23 24] Kami menemukan bahwa perawatan bortemozib pada EAU tikus dapat menekan tidak hanya TNF-α namun juga banyak mediator inflamator lain seperti as IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 pada retina jadi autoimmune uveitis dapat lebih efektif menekan dengan bortemozib dibanding dengan antagonis etanercept TNF-α (Gambar 1(f)) Bortemozib

8

yang mana dapat menekan banyak inflamator cytokines melalui penghambatan aktivasi NF-κB tampaknya menjadi agen anti-inflamatory yang lebih baik dalam perawatan dari autoimmune uveitis dibanding antagonis TNF-α

Mekanisme dari efek antri-peradangan dari bortezomib bagaimanapun mungkin lebih kompleks dibanding inhibisi dari pengaktivan NF-κB Saat induksi EAU kiranya melibatkan keberadaan antigen dari antigen immunogenic molekul kompleks kelas I dan kelas II oleh histocompatibility utama inhibisi proteasome yang mana adalah komponen penting dari pemrosesan antigen juga mempengaruhi proses pengenalan autoimun pada tahap kekebalan dan stimulasi [25ndash29] sebagai tambahan karena itu inhibitor proteasome dapat menekan beberapa langkah kunci yang diperlukan dalam pengaktivasian respn autoimun pada EAU

Dalam penelitian kami tikus yang diperlakukan bortezomib dari hari yang sama saat diinduksi EAU untuk memastikan awal efek obat selama tahap awal pada perkembangan penyakit Kami tidak mengevaluasi kemanjuran obat saat diperlakukan setelah EAU berkembang sepenuhnya yang biasanya adalah kasus pada pengaturan klinis Pada akhir percobaan setelah pengobatan bortezomib atau etanercept tidak ada kematian pertumbuhan tumor atau infeksi berat yang tercata Namun karena proteasome dan distribusinya yang tersebar mengatur jangkauan luas dari fungsi biologis efeksamping sistemikyang berhubungan dengan inhibitor proteasome layak untuk dipertimbangandengan cermat

Sebagai kesimpulan kami mendemostrasikan pengujian perbaikan EAU pada tikus tergantung pada dosis Mengurangi peradangan intraocular berhubungan dengan penekan pengaktifan NF-κB dan menurunkan peningkatan dari banyak mediator peradangan Hasil kami mengindikasikan bahwa obat yang menargetkan proteasom mungkin adalah strategi pengobatan yang efektif untuk autoimun uveitis di masa depan

Gambar 1 Efek dari bortemozib pada EAU diinduksi dengan IRBP (a) Perbandingan nilai klinis dari tikus EAU yang diperlakukan dengan

bortemozib berdosis-tinggi (075mgkg) (garis merah 119899 = 19) bortemozib

berdosis-rendah (015mgkg) (garis hitam 119899 = 17) atau PBS (garis biru 119899 = 19) dalam 01 mL data menunjukkan bahwa nilai mean klinis (ordinate) dari tiap kelompok eksperimen dari waktu ke waktu (abscissca) dan jumlah dari tiga eksperimen independen Perbandingan dari tikus EAU dengan perlakuan-bortemozib berdosis-tinggi (jalur gejala klinis) (bergaris biru) dengan tikus perlakuan-saline (garis merah) menunjukkan perbedaan yang signifikan dan diindikasikan sebagai ( ) Perbandingan dari perlakuan-bortemozib berdosislowast

9

tinggi (garis biru) dengan perlakuan-bortemozib berdosis-rendah (garis hitam) pada tikus EAU juga menunjukkan perbedaan signifikan dan diindikasikan

sebagai ( ) lowast lowast119875lt 005 melalui Wilcoxon signedrank test (b) (c) (d) dan (e) photomicrographs dari jaringan retina HampE berwarna Representatif photomicrographs slide berwarna paraffin-tetap HampE dari (b) tikus naumlıve C57BL6 tanpa induksi EAU (c) tikus EAU yang menerima perawatan PBS 01mL ( mengindikasikan leukocytes dalam rongga vitreous lowast lowastlowast mengindikasikan lipatan retina) (d) tikus EAU yang menerima perawatan bortezomib dosis-rendah (015mgkg) ekperimen diulangi tiga kali dengan hasil yang serupa CGL layer sel ganglion INL layer atom dalam ONL layer atom luar (f) nilai klinis rata-rata dari waktu ke waktu pada tikus EAY

dengan bortezomib berdosis-tinggi (075mgkg) (garis biru119899 = 9) etanercept

(5mgkg) (garis hitam119899 = 6) atau perawatan saline (01 mLtikus) (garis

merah119899 = 7) Data menunjukan nilai mean klinis (ordinate) dari tiap kelompok eksperimen (abscissa) dan jumlah dari dua eksperimen independen

lowast119875lt 005 melalui signed-rank test

Gambar 2 Evaluasi dari ekspresi protein dari mediator inflamatory pada retina

tikus EAU pada analisis Luminex Penurunan ekspresi dari TNF-120572(a) IL-

1120572(b) IL-1120573(c) IL-17 (f) IL-12 (h) dan MCP-1 (i) relatif pada ekspresi dalam kelompok perlakuan-saline tercatat dalam kelompok bortezomib berdosis tinggi (Vel [H]) tapi tidak dalam kelompok bortezomib berdosis

rendah (Vel [L]) kecuali untuk TNF-120572 Sebagai tambahan tidak ada

perbedaan signifikan pada ekspresi IFN-120574(d) IL-4 (e) dan IL-6 (g) pada retina antara tikus bortezomib dan perlakuan-saline Data yang diekspresikan sebagai mean SD dari tiga eksperimen independen (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001 vmelalui -test siswa

Gambar 3 Evaluasi aktivitas seperti-chymotrypsin dan seperti-trypsin dari proteasome Dibandingkan dengan kelompok EAU perlakuan-saline terdapat penurunan aktivitas signifikan seperti-chymotrypsin (a) dan aktivitas seperti-trypsin (b) pada kelompok bortezomib [Vel (L)] dan dosis-tinggi [Vel (H)] Aktivitas juga ditandai secara rendah pada kelompok perlakuan-bortezomib berdosis-tinggi dibanding dengan kelompok bortezomibtreated berdosis-rendah Data diekspresikan sebagai mean plusmn SD dari mean pada 5 tikus untuk

tiap kelompok (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001

via Studentrsquos 119905-test

10

Gambar 4 EMSA untuk mengevaluasi NF-120581B pengikat aktivitas DNA pada

tikus dan perbedaan kelompok pada EAU tikus Garis 1 p50 subunit NF-120581B Garis 2 pemeriksaan Cuma-Cumafree probe (FP) Garis 3 tikus C57BL6 Garis 4 EAU tikus dengan terapi garam Garis 5 EAU tikus diterapi dengan bortezomib dosis rendah (Vel [L]) Garis 6 EAU tikus diterapi dengan

bortezomib dosis tinggi (Vel [H]) Garis 7 100 kali molar NF-120581B pmeriksaan

yang tidak diberi label Garis 8 anti-p65 subunit NF-120581B Sampel adalah kedua mata dari lima tikus pada masing-masing kelompok Data merupakan hasil dari tiga eksperimen

11

dari proteasome mungkin adalah pendekatan yang menjanjikan untuk terapi autoimun uveitis

Bukti baru-baru ini mengindikasikan bahwa NF-κB memiliki peran penting dalam EAU dan inhibisi dari pengaktifan NF-κB dapat mengurangi tingkat inflamasi jaringan dengan menurunkan mediator inflamator dan infiltrasisel keuvea

Karena degradasi proteasomal dari faktor inhibitor IκB penting bagi aktivasi NF-κB inhibisi dari proteasome mempertahankan NF-κB dapa keadaan tidak aktif dalam cytosol dan mencegah translokasi nucleus Inhibisi proteasome ditemukan efektif dalam terapi beberapa hewan model dari penyakit autoimun seperti myasthenia gravis psoriasis arthritis dan autoimmune encephalomyelitis [10ndash13] Lebih lagi Chan et al telah menunjukkan efek anti-inflamatory pada inhibitor proteasone pada induksi-endotoksin uveits pada tikus [17] Inhibitor proteasome bortezomib disebabkan karena aktivitasnya untuk menekan degradasi protein nonlysosomal telah digunakan pada perawatan kanker hematologis pda pengaturan klinis [20] Pada penelitian ini kami memilih bortemozib berdasarkan pada kemanjuran tingginya pada konsentrasi minimal dan dapat diterima dan dapat terkelolanya efek merugikan dalam merawat penyakit hematologi manusia [21] Untuk pengetahuan kita penelitian kami adalah yang pertama mendemonstrasikan efek anti-inflamatorynya pada EAU

Menjadi sebuah kondisi induksi-autoantigen autoimmune EAU memiliki inflamasi yang didominasi oleh respon inflamatory akut cytokine [3] Dalam penelitian kami kami menemukan bahwa tingkat dari mediator inflamatory termasuk di dalamnya TNF-α IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 secara signifikan meningkat pada perlakuan-saline tikus EAU saat dibandingkan dengan mereka pada tikus na Vve (Gambar 3) TNF-α adalah cytokine proinflamasi utama dan memainkan peran utama dalam uveitis autoimmune [3] AntagonisTNF-α telah digunakan secara klinis untuk terapi gangguan ocular inflamatory dengan sukses [1922] Karenanya dalam penelitian ini kami membandingkan efek anti-inflamatory antara inhibitor proteasine bortemozib dan antagonis TNF-α etanercept pada EAU Etanercept sebuah protein chimeric dari reseptor TNF-α manusia dan bagian Fc dari rantai berat G immunoglobulin dapat menetralisir TNF-α dan menghalangi aktivitas proinflamatorynya baik pada manusia dan tikus [18 23 24] Kami menemukan bahwa perawatan bortemozib pada EAU tikus dapat menekan tidak hanya TNF-α namun juga banyak mediator inflamator lain seperti as IL-1α IL-1β IL-12 IL-17 dan MCP-1 pada retina jadi autoimmune uveitis dapat lebih efektif menekan dengan bortemozib dibanding dengan antagonis etanercept TNF-α (Gambar 1(f)) Bortemozib

8

yang mana dapat menekan banyak inflamator cytokines melalui penghambatan aktivasi NF-κB tampaknya menjadi agen anti-inflamatory yang lebih baik dalam perawatan dari autoimmune uveitis dibanding antagonis TNF-α

Mekanisme dari efek antri-peradangan dari bortezomib bagaimanapun mungkin lebih kompleks dibanding inhibisi dari pengaktivan NF-κB Saat induksi EAU kiranya melibatkan keberadaan antigen dari antigen immunogenic molekul kompleks kelas I dan kelas II oleh histocompatibility utama inhibisi proteasome yang mana adalah komponen penting dari pemrosesan antigen juga mempengaruhi proses pengenalan autoimun pada tahap kekebalan dan stimulasi [25ndash29] sebagai tambahan karena itu inhibitor proteasome dapat menekan beberapa langkah kunci yang diperlukan dalam pengaktivasian respn autoimun pada EAU

Dalam penelitian kami tikus yang diperlakukan bortezomib dari hari yang sama saat diinduksi EAU untuk memastikan awal efek obat selama tahap awal pada perkembangan penyakit Kami tidak mengevaluasi kemanjuran obat saat diperlakukan setelah EAU berkembang sepenuhnya yang biasanya adalah kasus pada pengaturan klinis Pada akhir percobaan setelah pengobatan bortezomib atau etanercept tidak ada kematian pertumbuhan tumor atau infeksi berat yang tercata Namun karena proteasome dan distribusinya yang tersebar mengatur jangkauan luas dari fungsi biologis efeksamping sistemikyang berhubungan dengan inhibitor proteasome layak untuk dipertimbangandengan cermat

Sebagai kesimpulan kami mendemostrasikan pengujian perbaikan EAU pada tikus tergantung pada dosis Mengurangi peradangan intraocular berhubungan dengan penekan pengaktifan NF-κB dan menurunkan peningkatan dari banyak mediator peradangan Hasil kami mengindikasikan bahwa obat yang menargetkan proteasom mungkin adalah strategi pengobatan yang efektif untuk autoimun uveitis di masa depan

Gambar 1 Efek dari bortemozib pada EAU diinduksi dengan IRBP (a) Perbandingan nilai klinis dari tikus EAU yang diperlakukan dengan

bortemozib berdosis-tinggi (075mgkg) (garis merah 119899 = 19) bortemozib

berdosis-rendah (015mgkg) (garis hitam 119899 = 17) atau PBS (garis biru 119899 = 19) dalam 01 mL data menunjukkan bahwa nilai mean klinis (ordinate) dari tiap kelompok eksperimen dari waktu ke waktu (abscissca) dan jumlah dari tiga eksperimen independen Perbandingan dari tikus EAU dengan perlakuan-bortemozib berdosis-tinggi (jalur gejala klinis) (bergaris biru) dengan tikus perlakuan-saline (garis merah) menunjukkan perbedaan yang signifikan dan diindikasikan sebagai ( ) Perbandingan dari perlakuan-bortemozib berdosislowast

9

tinggi (garis biru) dengan perlakuan-bortemozib berdosis-rendah (garis hitam) pada tikus EAU juga menunjukkan perbedaan signifikan dan diindikasikan

sebagai ( ) lowast lowast119875lt 005 melalui Wilcoxon signedrank test (b) (c) (d) dan (e) photomicrographs dari jaringan retina HampE berwarna Representatif photomicrographs slide berwarna paraffin-tetap HampE dari (b) tikus naumlıve C57BL6 tanpa induksi EAU (c) tikus EAU yang menerima perawatan PBS 01mL ( mengindikasikan leukocytes dalam rongga vitreous lowast lowastlowast mengindikasikan lipatan retina) (d) tikus EAU yang menerima perawatan bortezomib dosis-rendah (015mgkg) ekperimen diulangi tiga kali dengan hasil yang serupa CGL layer sel ganglion INL layer atom dalam ONL layer atom luar (f) nilai klinis rata-rata dari waktu ke waktu pada tikus EAY

dengan bortezomib berdosis-tinggi (075mgkg) (garis biru119899 = 9) etanercept

(5mgkg) (garis hitam119899 = 6) atau perawatan saline (01 mLtikus) (garis

merah119899 = 7) Data menunjukan nilai mean klinis (ordinate) dari tiap kelompok eksperimen (abscissa) dan jumlah dari dua eksperimen independen

lowast119875lt 005 melalui signed-rank test

Gambar 2 Evaluasi dari ekspresi protein dari mediator inflamatory pada retina

tikus EAU pada analisis Luminex Penurunan ekspresi dari TNF-120572(a) IL-

1120572(b) IL-1120573(c) IL-17 (f) IL-12 (h) dan MCP-1 (i) relatif pada ekspresi dalam kelompok perlakuan-saline tercatat dalam kelompok bortezomib berdosis tinggi (Vel [H]) tapi tidak dalam kelompok bortezomib berdosis

rendah (Vel [L]) kecuali untuk TNF-120572 Sebagai tambahan tidak ada

perbedaan signifikan pada ekspresi IFN-120574(d) IL-4 (e) dan IL-6 (g) pada retina antara tikus bortezomib dan perlakuan-saline Data yang diekspresikan sebagai mean SD dari tiga eksperimen independen (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001 vmelalui -test siswa

Gambar 3 Evaluasi aktivitas seperti-chymotrypsin dan seperti-trypsin dari proteasome Dibandingkan dengan kelompok EAU perlakuan-saline terdapat penurunan aktivitas signifikan seperti-chymotrypsin (a) dan aktivitas seperti-trypsin (b) pada kelompok bortezomib [Vel (L)] dan dosis-tinggi [Vel (H)] Aktivitas juga ditandai secara rendah pada kelompok perlakuan-bortezomib berdosis-tinggi dibanding dengan kelompok bortezomibtreated berdosis-rendah Data diekspresikan sebagai mean plusmn SD dari mean pada 5 tikus untuk

tiap kelompok (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001

via Studentrsquos 119905-test

10

Gambar 4 EMSA untuk mengevaluasi NF-120581B pengikat aktivitas DNA pada

tikus dan perbedaan kelompok pada EAU tikus Garis 1 p50 subunit NF-120581B Garis 2 pemeriksaan Cuma-Cumafree probe (FP) Garis 3 tikus C57BL6 Garis 4 EAU tikus dengan terapi garam Garis 5 EAU tikus diterapi dengan bortezomib dosis rendah (Vel [L]) Garis 6 EAU tikus diterapi dengan

bortezomib dosis tinggi (Vel [H]) Garis 7 100 kali molar NF-120581B pmeriksaan

yang tidak diberi label Garis 8 anti-p65 subunit NF-120581B Sampel adalah kedua mata dari lima tikus pada masing-masing kelompok Data merupakan hasil dari tiga eksperimen

11

yang mana dapat menekan banyak inflamator cytokines melalui penghambatan aktivasi NF-κB tampaknya menjadi agen anti-inflamatory yang lebih baik dalam perawatan dari autoimmune uveitis dibanding antagonis TNF-α

Mekanisme dari efek antri-peradangan dari bortezomib bagaimanapun mungkin lebih kompleks dibanding inhibisi dari pengaktivan NF-κB Saat induksi EAU kiranya melibatkan keberadaan antigen dari antigen immunogenic molekul kompleks kelas I dan kelas II oleh histocompatibility utama inhibisi proteasome yang mana adalah komponen penting dari pemrosesan antigen juga mempengaruhi proses pengenalan autoimun pada tahap kekebalan dan stimulasi [25ndash29] sebagai tambahan karena itu inhibitor proteasome dapat menekan beberapa langkah kunci yang diperlukan dalam pengaktivasian respn autoimun pada EAU

Dalam penelitian kami tikus yang diperlakukan bortezomib dari hari yang sama saat diinduksi EAU untuk memastikan awal efek obat selama tahap awal pada perkembangan penyakit Kami tidak mengevaluasi kemanjuran obat saat diperlakukan setelah EAU berkembang sepenuhnya yang biasanya adalah kasus pada pengaturan klinis Pada akhir percobaan setelah pengobatan bortezomib atau etanercept tidak ada kematian pertumbuhan tumor atau infeksi berat yang tercata Namun karena proteasome dan distribusinya yang tersebar mengatur jangkauan luas dari fungsi biologis efeksamping sistemikyang berhubungan dengan inhibitor proteasome layak untuk dipertimbangandengan cermat

Sebagai kesimpulan kami mendemostrasikan pengujian perbaikan EAU pada tikus tergantung pada dosis Mengurangi peradangan intraocular berhubungan dengan penekan pengaktifan NF-κB dan menurunkan peningkatan dari banyak mediator peradangan Hasil kami mengindikasikan bahwa obat yang menargetkan proteasom mungkin adalah strategi pengobatan yang efektif untuk autoimun uveitis di masa depan

Gambar 1 Efek dari bortemozib pada EAU diinduksi dengan IRBP (a) Perbandingan nilai klinis dari tikus EAU yang diperlakukan dengan

bortemozib berdosis-tinggi (075mgkg) (garis merah 119899 = 19) bortemozib

berdosis-rendah (015mgkg) (garis hitam 119899 = 17) atau PBS (garis biru 119899 = 19) dalam 01 mL data menunjukkan bahwa nilai mean klinis (ordinate) dari tiap kelompok eksperimen dari waktu ke waktu (abscissca) dan jumlah dari tiga eksperimen independen Perbandingan dari tikus EAU dengan perlakuan-bortemozib berdosis-tinggi (jalur gejala klinis) (bergaris biru) dengan tikus perlakuan-saline (garis merah) menunjukkan perbedaan yang signifikan dan diindikasikan sebagai ( ) Perbandingan dari perlakuan-bortemozib berdosislowast

9

tinggi (garis biru) dengan perlakuan-bortemozib berdosis-rendah (garis hitam) pada tikus EAU juga menunjukkan perbedaan signifikan dan diindikasikan

sebagai ( ) lowast lowast119875lt 005 melalui Wilcoxon signedrank test (b) (c) (d) dan (e) photomicrographs dari jaringan retina HampE berwarna Representatif photomicrographs slide berwarna paraffin-tetap HampE dari (b) tikus naumlıve C57BL6 tanpa induksi EAU (c) tikus EAU yang menerima perawatan PBS 01mL ( mengindikasikan leukocytes dalam rongga vitreous lowast lowastlowast mengindikasikan lipatan retina) (d) tikus EAU yang menerima perawatan bortezomib dosis-rendah (015mgkg) ekperimen diulangi tiga kali dengan hasil yang serupa CGL layer sel ganglion INL layer atom dalam ONL layer atom luar (f) nilai klinis rata-rata dari waktu ke waktu pada tikus EAY

dengan bortezomib berdosis-tinggi (075mgkg) (garis biru119899 = 9) etanercept

(5mgkg) (garis hitam119899 = 6) atau perawatan saline (01 mLtikus) (garis

merah119899 = 7) Data menunjukan nilai mean klinis (ordinate) dari tiap kelompok eksperimen (abscissa) dan jumlah dari dua eksperimen independen

lowast119875lt 005 melalui signed-rank test

Gambar 2 Evaluasi dari ekspresi protein dari mediator inflamatory pada retina

tikus EAU pada analisis Luminex Penurunan ekspresi dari TNF-120572(a) IL-

1120572(b) IL-1120573(c) IL-17 (f) IL-12 (h) dan MCP-1 (i) relatif pada ekspresi dalam kelompok perlakuan-saline tercatat dalam kelompok bortezomib berdosis tinggi (Vel [H]) tapi tidak dalam kelompok bortezomib berdosis

rendah (Vel [L]) kecuali untuk TNF-120572 Sebagai tambahan tidak ada

perbedaan signifikan pada ekspresi IFN-120574(d) IL-4 (e) dan IL-6 (g) pada retina antara tikus bortezomib dan perlakuan-saline Data yang diekspresikan sebagai mean SD dari tiga eksperimen independen (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001 vmelalui -test siswa

Gambar 3 Evaluasi aktivitas seperti-chymotrypsin dan seperti-trypsin dari proteasome Dibandingkan dengan kelompok EAU perlakuan-saline terdapat penurunan aktivitas signifikan seperti-chymotrypsin (a) dan aktivitas seperti-trypsin (b) pada kelompok bortezomib [Vel (L)] dan dosis-tinggi [Vel (H)] Aktivitas juga ditandai secara rendah pada kelompok perlakuan-bortezomib berdosis-tinggi dibanding dengan kelompok bortezomibtreated berdosis-rendah Data diekspresikan sebagai mean plusmn SD dari mean pada 5 tikus untuk

tiap kelompok (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001

via Studentrsquos 119905-test

10

Gambar 4 EMSA untuk mengevaluasi NF-120581B pengikat aktivitas DNA pada

tikus dan perbedaan kelompok pada EAU tikus Garis 1 p50 subunit NF-120581B Garis 2 pemeriksaan Cuma-Cumafree probe (FP) Garis 3 tikus C57BL6 Garis 4 EAU tikus dengan terapi garam Garis 5 EAU tikus diterapi dengan bortezomib dosis rendah (Vel [L]) Garis 6 EAU tikus diterapi dengan

bortezomib dosis tinggi (Vel [H]) Garis 7 100 kali molar NF-120581B pmeriksaan

yang tidak diberi label Garis 8 anti-p65 subunit NF-120581B Sampel adalah kedua mata dari lima tikus pada masing-masing kelompok Data merupakan hasil dari tiga eksperimen

11

tinggi (garis biru) dengan perlakuan-bortemozib berdosis-rendah (garis hitam) pada tikus EAU juga menunjukkan perbedaan signifikan dan diindikasikan

sebagai ( ) lowast lowast119875lt 005 melalui Wilcoxon signedrank test (b) (c) (d) dan (e) photomicrographs dari jaringan retina HampE berwarna Representatif photomicrographs slide berwarna paraffin-tetap HampE dari (b) tikus naumlıve C57BL6 tanpa induksi EAU (c) tikus EAU yang menerima perawatan PBS 01mL ( mengindikasikan leukocytes dalam rongga vitreous lowast lowastlowast mengindikasikan lipatan retina) (d) tikus EAU yang menerima perawatan bortezomib dosis-rendah (015mgkg) ekperimen diulangi tiga kali dengan hasil yang serupa CGL layer sel ganglion INL layer atom dalam ONL layer atom luar (f) nilai klinis rata-rata dari waktu ke waktu pada tikus EAY

dengan bortezomib berdosis-tinggi (075mgkg) (garis biru119899 = 9) etanercept

(5mgkg) (garis hitam119899 = 6) atau perawatan saline (01 mLtikus) (garis

merah119899 = 7) Data menunjukan nilai mean klinis (ordinate) dari tiap kelompok eksperimen (abscissa) dan jumlah dari dua eksperimen independen

lowast119875lt 005 melalui signed-rank test

Gambar 2 Evaluasi dari ekspresi protein dari mediator inflamatory pada retina

tikus EAU pada analisis Luminex Penurunan ekspresi dari TNF-120572(a) IL-

1120572(b) IL-1120573(c) IL-17 (f) IL-12 (h) dan MCP-1 (i) relatif pada ekspresi dalam kelompok perlakuan-saline tercatat dalam kelompok bortezomib berdosis tinggi (Vel [H]) tapi tidak dalam kelompok bortezomib berdosis

rendah (Vel [L]) kecuali untuk TNF-120572 Sebagai tambahan tidak ada

perbedaan signifikan pada ekspresi IFN-120574(d) IL-4 (e) dan IL-6 (g) pada retina antara tikus bortezomib dan perlakuan-saline Data yang diekspresikan sebagai mean SD dari tiga eksperimen independen (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001 vmelalui -test siswa

Gambar 3 Evaluasi aktivitas seperti-chymotrypsin dan seperti-trypsin dari proteasome Dibandingkan dengan kelompok EAU perlakuan-saline terdapat penurunan aktivitas signifikan seperti-chymotrypsin (a) dan aktivitas seperti-trypsin (b) pada kelompok bortezomib [Vel (L)] dan dosis-tinggi [Vel (H)] Aktivitas juga ditandai secara rendah pada kelompok perlakuan-bortezomib berdosis-tinggi dibanding dengan kelompok bortezomibtreated berdosis-rendah Data diekspresikan sebagai mean plusmn SD dari mean pada 5 tikus untuk

tiap kelompok (grafik batang) lowast119875lt 005 lowastlowast119875lt 001 dan lowastlowastlowast119875lt 0001

via Studentrsquos 119905-test

10

Gambar 4 EMSA untuk mengevaluasi NF-120581B pengikat aktivitas DNA pada

tikus dan perbedaan kelompok pada EAU tikus Garis 1 p50 subunit NF-120581B Garis 2 pemeriksaan Cuma-Cumafree probe (FP) Garis 3 tikus C57BL6 Garis 4 EAU tikus dengan terapi garam Garis 5 EAU tikus diterapi dengan bortezomib dosis rendah (Vel [L]) Garis 6 EAU tikus diterapi dengan

bortezomib dosis tinggi (Vel [H]) Garis 7 100 kali molar NF-120581B pmeriksaan

yang tidak diberi label Garis 8 anti-p65 subunit NF-120581B Sampel adalah kedua mata dari lima tikus pada masing-masing kelompok Data merupakan hasil dari tiga eksperimen

11

Gambar 4 EMSA untuk mengevaluasi NF-120581B pengikat aktivitas DNA pada

tikus dan perbedaan kelompok pada EAU tikus Garis 1 p50 subunit NF-120581B Garis 2 pemeriksaan Cuma-Cumafree probe (FP) Garis 3 tikus C57BL6 Garis 4 EAU tikus dengan terapi garam Garis 5 EAU tikus diterapi dengan bortezomib dosis rendah (Vel [L]) Garis 6 EAU tikus diterapi dengan

bortezomib dosis tinggi (Vel [H]) Garis 7 100 kali molar NF-120581B pmeriksaan

yang tidak diberi label Garis 8 anti-p65 subunit NF-120581B Sampel adalah kedua mata dari lima tikus pada masing-masing kelompok Data merupakan hasil dari tiga eksperimen

11