ANALISA KEHALALAN DENGAN SDS-PAGE

Oleh Kelompok 3B :

Miyadah Samiyah 1111102000034Silvia Aryani 1111102000039

Rosita Pracima 1111102000041Euis Chodidjah 1111102000046Laila Novilia M. 1111102000050

Syaima 1111102000056

Definisi• SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis

teknik pemisahan molekul-molekul protein berdasarkan perbedaan berat masing-masing (Davis, 1994; Campbell dkk., 2002).

• SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) sejenis detergen yg berfungsi mendenaturasikan protein, memberikan muatan negatif pd protein, dan molekul hidrofobik (tidak suka air) (Seidman & Moore, 2000).

• Gel poliakrilamid hasil polimerasi monomer akrilamid & bisakrilamid (Martin, 1996). Poliakrilamid dihasilkan dr sebuah sistem yg menghasilkan radikal bebas yaitu dgn penambahan ammonium persulfat (APS) sbg inisiator & tetrametilendiamin (TEMED) sbg pengkatalis (Sambrook & Russell, 2001).

Pembentukan gel poliakrilamid melalui inisiasi APS dan TEMED

Komponen SDS-

PAGE

SDS

Gel Poliakrilami

d

Sistem Buffer

Perwarnaan atau

staining

Destaining

Peralatan

SDS

Gel Poliakrilamid

Sistem Buffer Continous System menggunakan 1 jenis gel yaitu menggunakan

resolving gel, Discontinous System menggunakan 2 jenis gel berupa resolving gel

dan stacking gel. Stacking gel utk menahan sementara agar sampel bermigrasi pd waktu yg

bersamaan. Resolving gel utk memisahkan molekul-molekul yg ada berdasarkan berat molekulnya (Boyer, 1993).

Perwarnaan atau stainingZat pewarna untuk pewarnaan sekaligus utk mengetahui berjalan atau tidaknya proses running.

Pewarnaan gel pada teknik SDS-PAGE:  Commasie blue staining pewarna tekstil trifenilmetana, dan lebih

sering digunakan di dalam teknik SDS PAGE. Kelebihan: harga relatif murah, mengikat protein secara spesifik, bekerja cepat.

Silver salt staining kelebihan: hasilnya lebih akurat jika dibandingkan coomassie blue staining. Kekurangan: harga lebih mahal dan membutuhkan waktu yang lebih lama (Boyer, 1993).

Pewarnaan dengan: (A) silver salt staining, (B) commasie blue staining. 

Destaining Perendaman gel dlm destaining solution utk memudahkan pegamatan. Destaining  digunakan utk membersihkan gel dr pewarna sehingga pita dpt terlihat (Boyer 1993: 139).

Peralatan Comb utk membentuk well pd gel.  Casting frame tempat utk glass plates.  Casting stand tempat dipasangnya casting frame.  Stanks wadah meletakkan perangkat elektroforesis. Micropipette dan tips utk mengambil, mencampurkan & memindahkan sampel ke

dalam well.

Prinsip Dasar Prinsip dr SDS-PAGE adalah dgn

memanfaatkan perbedaan kemampuan migrasi masing-masing molekul protein. Kemampuan migrasi tiap molekul akan berbeda disebabkan perbedaan berat molekul protein (Davis, 1994; Campbell dkk., 2002).

Protein dpt dipisahkan berdasarkan ukuran massanya dgn elektroforesis gel poliakrilamid dgn sistem gerak. Sebelumnya, campuran protein dipanasi dgn SDS utk menyelubungi molekul protein menyebabkan interaksi nonkovalen terganggu shg molekul protein dlm struktur primer (Watson, 2007). Setelah SDS, protein yg sama berada dlm bentuk linear yg mengeliminasi semua lipatan & melapisi protein tsb dgn ion negatif (Malcolm Campbell, 1998).

Kompleks protein SDS kemudian dielektroforesis, shg semua molekul protein bergerak menuju kutub positif. Ketika elektroforesis selesai, protein dlm gel dpt ditampakkan oleh pewarnaan dgn perak atau zat warna seperti Commasie blue, yang akan menampakkan beberapa pita (Watson, 2007).

Skema mekanisme separasi protein berdasarkan berat molekul dengan SDS-PAGE.

Anggap saja protein-protein tsb terdenaturasi & dilapisi dgn ion negatif dgn SDS, yg bergerak di dlm gel. Kebanyakan protein akan mempunyai panjang yg berbeda, utk berbagai macam ikatan asam amino dlm membentuk struktur primer sebuah protein. Protein akan mempunyai berat molekul yg berbeda-beda protein akan berpindah ke kutub positif pd kecepatan yg berbeda protein dgn ukuran yg lebih besar akan kesulitan utk melewati pori-pori yg lebih kecil, sedangkan protein dgn ukuran yg lebih kecil bisa melewati saluran-saluran tersebut, shg dpt bermigrasi lewat gel dgn lebih cepat Protein yg lebih kecil & lebih cepat akan berada di kutub positif & protein dgn ukuran besar akan berada di kutub negatif.

Gambar tsb menunjukkan suatu SDS-PAGE dimana protein-protein telah bermigrasi lewat saluran-saluran di poliakrilamid.

Poliakrilamid memisahkan protein sesuai berat molekulnya saja, dan tdk dpt membedakan antara urutan asam aminonya. Hal yg dpt terjadi adalah mendapatkan dua protein yg mempunyai berat molekul yg sama dgn konstruksi asam amino yg berbeda. (Campbell 1998).

Pembahasan Jurnal

SDS-PAGE

Pendahuluan• Globalisasi dalam semua aspek telah membawa konsekuensi

dalam banyak produk makanan lokal dan impor makanan baik halal atau haram dengan mudahnya dapat ditemukan.

• Adanya kekhawatiran karena mayoritas penduduk di Indonesia adalah Muslim.

• Salah satu contoh produk yang biasa digunakan adalah gelatin.• Adanya keterbatasan pada sumber sapi, mengharuskan

produsen mengambil sumber gelatin dari babi yang dinyatakan harganyapun juga lebih murah.

• Penerapan ini tentu saja bermasalah bagi kaum muslim dimana sumber gelatin tersebut menurut kaidah islam haram untuk digunakan.

• Oleh karena itu, perlu untuk mengembangkan metode untuk membedakan spesies asal gelatin dengan cara mengidentifikasi profil gelatin yang berbeda dari sumber yang berbeda melalui studi intra struktur molekul.

• Menggunakan instrumen FTIR, UV-Vis, dan SDS-PAGE

Pendahuluan

• Hafidz et.al. (2011) menyebutkan bahwa ada tiga komposisi asam amino yang berbeda antara gelatin sapi dan gelatin babi, yaitu glisin, prolin dan residu arginin.

• Namun perbedaan ini perlu diperiksa dan dikombinasikan dengan perlakuan hidrolisis enzimatik untuk mengidentifikasi perbedaan dalam berat molekul dengan SDS-PAGE (Sodium Sulphate Duodecil Polyacrylamide Gel Electrophoresis) untuk membedakan tingkat gelatin antara sapi dan babi.

• Dalam penelitian ini, digunakanlah enzim pepsin untuk dapat menghidrolisis ke dua sumber gelatin agar mendapatkan fragmen peptida dari gelatin yang berbeda dalam berat molekul.

Bahan– Powdered porcine gelatin type A (Catalogue No. G8150) – bovine gelatin type B (Catalogue No. G1393) – Powdered pepsin (Sigma Aldrich catalog number 76218.

NaH2PO4.5H2O and Na2HPO4 for Phosphate buffer pH 6.0, Sample buffer for electrophoresis (Tris-HCl,glycerol, bromophenol blue and β-merkapto etanol)

– Running buffer for electrophoresis (Tris-glycine)– Acrylamide– Bis-acrylamide– SDS (sodium duodecyl sulphate)– Tris base– TEMED (N,N,N’,N’-tertamethyl ethylenediamine)– APS (Ammonium persulfate)– Coomasie Brilaint blue G250– NaCl (s)– Methanol– Acetic acid glacial– SDS-PAGE Protein Standards catalog no. 161-0318 (Biorad).

Metode1. Hidrolisis Gelatin

Tabung 1 (1A dan 1B) •1 g bubuk gelatin (tipe A dan B) dilarutkan 7 ml dari 25 Mm buffer asetat Ph 4,5

Tabung 2 (2A dan 2B) •Ekstrak pepsin dilarutkan 3 ml larutan buffer + bubuk enzim dengan aktivitas 32.000 USP/mg

Tabung 3 (kontrol) •Ekstrak pepsin dilarutkan dalam 3 ml larutan buffer

Campurkan

(Sampel 4A

Dan 4B)

Tabung kontrol, sampel A dan B inkubasi pada

suhu 600C dengan interval waktu 1, 2, 3, 4,

dan 5 jam.

Masing-masin tabung ambil 1 ml aliquot. Sesuaikan

pH sampai titik isoelektrik dan disentrifugasi

pada 10.000 rpm

Spektrum supernatan diukur dengan spektrofotometer UV dan

FTIK, sedangkan endapan dengan SDS-PAGE

2. Analisis spektrum gelatin dengan UV Spektrofotometer

• Larutan gelatin (A dan B)

DilarutkanDengan spektrofotometer UV Perkin Elner Lambda 25 dengan λ kisaran 200-400 nm dan kec. Scan 10nm.Kalibrasi instrumen dengan aquadest sebagai blanko. Kemudian amati hasil spektrum.

3. Pengukuran dengan FTIR untuk kedua gelatin

Menggunakan Perkin Elmer (USA) FTIR spektrofotometer dengan detektor

DTGS-KBr

Semua spektrum direkam dalam

kisaran 4000-650 cm-1 dengan resolusi

4 cm-1

Semua pengukuran dilakukan dalam

suasana kering pada suhu kamar (25 ±

0,5 oC).

hasilnya disajikan dalam Transmitansi (%

T) unit.

4. Analisis elektroforesis gelatinS

a

m

p

e

l

(

1

g

)

d

il

a

r

u

t

k

a

n

d

a

l

a

m

1

0

m

l

d

a

ri

5

%

l

a

r

u

t

a

n

S

D

S

(

w

/

v

).

Kemudian sentrifugasi pada 6000 rpm selama 3 menit.

Supernatan kemudian dicampur dengan buffer sampel (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 yang mengandung 4% (b / v) SDS dan 20% (v / v) gliserol pada rasio 1:1 (v / v).

SDS-PAGE Protein Standards catalog no. 161-0318 (Biorad) digunakan sebagai standart.

Cont’

Hasil dan Pembahasan

• Ikatan peptida yang serupa untuk kedua gelatin terdapat pada range 100-200 kDa

• Terdapat tiga perbedaan yang signifikan yang dapat terlihat dari fragmen pita dengan berat molekul 36,8 dan 28,6 kDa pada gelatin sapi yang tidak ditemukan pada gelatin sapi.

• Perbedaan selanjutnya terlihat dari fragmen pita di bawah 28,6 kDa, dimana pada gelatin babi hanya ditemukan satu pita, sedangkan pada gelatin sapi ditemukan dua fragmen pita.

• Menurut Zhang et al. (2009), kolagen sapi dan babi tipe I mengandung banyak segmen dengan urutan asam amino yang identik dan beberapa segmen mengandung residu asam amino yang berbeda. Peptida yang berhubungan dengan segmen yang mengandung residu asam amino yang berbeda dapat digunakan sebagai penanda peptida untuk membedakan antara gelatin sapi dan babi.

• Dibandingkan dengan metode yang dilaporkan dalam literatur, perbedaan gelatin menurut urutan penanda peptida dapat memberikan informasi yang pasti tentang asal spesies gelatin

Kesimpulan

• Gelatin sapi dan babi dihidrolisis dengan pepsin memberikan perbedaan karakteristik fragmen molekuler di kedua fragmen gelatin. Analisis menggunakan SDS-PAGE menunjukkan bahwa ada dua pita pada gelatin babi dengan berat molekul masing-masing 36,8 kDa dan 28,6 kDa. Berdasarkan hasil spektroskopi FTIR UV-VIS, kedua jenis spektrum dari kedua gelatin sedikit berbeda dalam dua fragmen gelatin. Hal ini menunjukkan bahwa hidrolisis gelatin menyebabkan perubahan jumlah dan lokasi gugus karbonil peptida di kedua gelatin.

Daftar Pustaka

Boyer, R. 1993. Modern experimental biochemistry. California: The Benjamin, Cummings publishing company, Inc

Campbell, N.A., J.B. Reece, L.G. Mitchell. 2002. Biologi. Terj. dari Biology; oleh Lestari, R. dkk. Jakarta: Erlangga

Campbell, M. A. "SDS/PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)". 1998. <http://www.bio.davidson.edu/Biology/Courses/Molbio/SDSPAGE/SDSPAGE.html> (30 January 1998).

Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology. 2nd ed. Norwola: Appleton & Lange

Martin, R. 1996. Gel electroforesis: Nucleid acids. Oxford: Bros Scientific Publishers Ltd.

Sambrook, J. & D. W. Russell. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual vol 2. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbour  Laboratory Press

Seidman, L.A. & C.J. Moore. 2000. Basic laboratory for biotechnology: Textbook and laboratory reference. New Jersey: Prentice Hall, Inc.

Watson, David G. 2007.  Analisis Farmasi : Buku Ajar Untuk Mahasiswa Farmasi danPraktisi Kimia Farmasi Edisi 2. Jakarta : Buku Kedokteran EGC

Hermanto, Sandra dkk. 2012. Jurnal: Differentiation of Bovine and Porcine Gelatin Based on Spectroscopic and Electrophoretic Analysis. Jakarta