Vol. 15 No. 2 Tahun 2007 Identifikasi Kepala Spermatozoa Kerbau

Identifikasi Kepala Spermatozoa Kerbau, Sapi dan Domba Secara Morfometri

Morphology Identification of Buffalo, Cattle and Sheep Spermatozoas Head B. Tappa, F. Afiati dan S. SaidPusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Jl. Raya Cibinong Km 46 Bogoremail: afiati_btk@yahoo.com

AbstractBackground: Spermatozoa separation is one of efficiency effort to change the ratio of chromosome X and Y bearer. One of separation technique is albumin coloumn method. Determination of spermatozoa head size in every animal species is very helpfull in chromosome X and Y spermatozoa separation, especially to fix the albumin coloumn. The study of identification size of buffalo, cattle and sheep spermatozoa conducted to give information about separation of X- and Y- chromosome bearing spermatozoa method. Methods: Semen was collected from Simmental (Bos taurus), Water Buffalo (Bubalus bubalis) bulls and Merino Ram (Ovis aries) that rasised in Center of Biotecnology Research -LIPI, Cibinong. Semen collected by artificial vagina. Semen then analyzed macroscapically (volume, colour, smell, pH, and consistency) and microscopically, and continued by morphometri. Collected data were analysis by Fisher’s LSD. Result: Motility and membrane plasma intact of spermatozoa both of buffalo and sheep were significantly different, however, significantly higher (P<0,01) in cattle. Size of spermatozoa was significantly (P<0,01) decrease at cattle (7,01±0,13m and 4,23±0,18m), sheep (8,94±0,24m and 4,59±0,24m) and buffalo (8,33±0,24m and 4,32±0,22m). The width/length ratio (%) of spermatozoa was also decrease gradually at cattle (51,34±0,24), sheep (51,86±0,23) and buffalo (60,34±0,15). This research indicate that size of cattle, sheep and buffalo spermatozoa were different. These data were very useful to be made reference in technique separation of buffalo, cattle and sheep of X- and Y- chromosome bearing spermatozoa.

Key words : buffalo, cattle, sheep, spermatozoa, morphometri

AbstrakLatar Belakang: Pemisahan spermatozoa merupakan salah satu upaya efisiensi dalam mengubah rasio spermatozoa pembawa kromosom X dan Y. Salah satu teknik pemisahan yang telah dilakukan adalah metoda kolom albumin. Penentuan ukuran kepala spermatozoa pada setiap jenis ternak sangat membantu dalam penentuan metode pemisahan spermatozoa pembawa kromosom X dan Y, khususnya dalam menentukan konsentrasi kolom albumin. Penelitian identifikasi ukuran kepala spermatozoa pada kerbau, sapi dan domba Ini dilakukan untuk memberikan informasi penentuan metode pemisahan spermatozoa pembawa kromosom X dan kromosom Y. Metode: Semen dikoleksi dari sapi pejantan unggul Simmental (Bos taurus), kerbau belang (Bubalus bubalis) dan domba merino (Ovis aries) yang dipelihara di kandang hewan Puslit Bioteknologi-LIPI, Cibinong. Penampungan semen dilakukan dengan metoda vagina buatan. Semen kemudian diperiksa secara makroskopis (volume, warna, bau, pH, konsistensi) dan mikroskopis, serta pemeriksaan morfometri. Data yang diperoleh diuji dengan Fisher’s LSD. Hasil: Tidak terdapat perbedaan pada motilitas dan keutuhan membran plasma spermatozoa kerbau dan domba, tetapi berbeda sangat nyata (P<0,01) dengan spermatozoa sapi. Ukuran panjang dan lebar kepala spermatozoa menurun secara nyata (P<0,01) pada sapi (7,01±0,13m dan 4,23±0,18m), domba (8,94±0,24m dan 4,59±0,24m) dan kerbau (8,33±0,24m dan 4,32±0,22m). Rasio ukuran lebar/panjang kepala (%) spermatozoa kerbau sebesar 60,34±0,15; spermatozoa sapi 51,34±0,24 dan spermatozoa domba 51,86±0,23. Terdapat perbedaan nyata pada ukuran kepala spermatozoa sapi, domba dan kerbau. Data ini sangat bermanfaat untuk dijadikan acuan dalam teknik pemisahan spermatozoa pembawa kromosom X dan Y pada sapi, domba dan kerbau.

Kata kunci: kerbau, sapi, domba, spermatozoa, morfometri

159

Tappa, Afiati, Said Jurnal PROTEIN

PENDAHULUAN

Tujuan utama suatu usaha peternakan adalah untuk meningkatkan efisiensi ekonomi dalam memproduksi daging dan susu. Dalam peternakan modern kegiatan inseminasi buatan telah dilakukan secara luas, dengan demikian peningkatan mutu ternak terus dilakukan. Pengujian konsentarsi sperma dan morfologi spermatozoa merupakan dasar hubungan kondisi spermatozoa yang dapat menentukan tingkat abnormal dan dapat berpengaruh pada fertilitas ternak (Januskaukas dan Zilinskas, 2002). Penentuan morfologi yang akurat pada setiap ejakulat memperlihatkan tingkat kesuburan pejantan. Tetapi tidak ada korelasi antara bobot badan pejantan dengan panjang spermatozoa. Juga tidak ada hubungan antara dimensi kepala spermatozoa dan massa genom atau jumlah kromosom serta waktu estrus (Gage, 1998). Korelasi antara tingkat motilitas dan tingkat fertilitas dapat menjadi parameter kualitas semen. Pengujian morfologi semen menggunakan mikroskop cahaya dengan teknik berbeda akan menghasilkan keakuratan yang berbeda (Januskaukas dan Zilinzkas, 2002). Evaluasi spermatozoa secara makroskopis dan mikroskopis dapat menentukan kualitas spermatozoa, karena menurut Revay, et.al. (2004) teknik pewarnaan sel dapat menentukan morfologi dan integritas membran meliputi morfologi, spermatozoa normal, daya tahan hidup dan keutuhan akrosom. Pengukuran morfometri kepala spermatozoa hasil pembekuan terhadap morfometri kepala spermatozoa dilakukan pada sapi (Gravance, et.al., 1998) dan kambing (Hidalgo et.al., 2005) dengan teknik pewarnaan DIFF-QUIK (DF).

Morfometri kepala spermatozoa dapat dipengaruhi juga oleh suhu, seperti yang telah dilakukan oleh Hidalgo et.al. (2007) yang mengukur dimensi kepala spermatozoa rusa. Davis dan Gravance (1993) membandingkan persentase spermatozoa normal pada semen manusia yang dicuci dengan semen yang tidak dicuci (kontrol). Perbandingan morfometri dilakukan dengan teknik pewarnaan papanicalaou (PAP) dan pronounced Gee-Zin (GZIN). Pengukuran meliputi panjang, lebar, area dan perimeter. Garcia et.al. (2006)

melakukan tiga teknik pewarnaan yaitu rapid panoptic, hemacolor dan Harri’s haematoxylin (HH) untuk melihat tingkat keakuratan morfometri. Sedangkan Hirai et.al. (2001) mengukur karakteristik spermatozoa babi secara kuantitatif dengan melakukan pewarnaan modifikasi Farelly yaitu aniline blue dan crystal violet.

Pemisahan spermatozoa merupakan salah satu upaya efisiensi dalam mengubah rasio spermatozoa pembawa kromosom X dan Y. Salah satu teknik pemisahan yang telah dilakukan adalah metoda kolom albumin (Bovine Serum Albumin, BSA) dengan tingkat keberhasilan 75-80% sperma Y (Krzyzaniak dan Hafez, 1993). Keberhasilan teknik albumin tergantung dari spesies, motilitas spermatozoa, penanganan semen saat pemisahan, konsentrasi albumin dan perbedaan tingkat konsentrasi albumin untuk memperoleh spermatozoa motil ( X atau Y) yang lebih tinggi (Meistrich, 1982). Kaiin et.al. (2003) mengemukakan bahwa viabilitas spermatozoa X atau spermatozoa Y yang dipisahkan dengan kolom BSA bertingkat 2%:4% dan 5%:10% masih memenuhi syarat pelaksaan inseminasi buatan setelah disimpan selama 5 hari dengan tingkat motilitas 60% dan 65% untuk spermatozoa X serta 57,5% dan 52,5% untuk spermatozoa Y. Pada medium pemisah pengganti BSA (albumen, putih telur) 30%:50% menghasilkan 73% spermatozoa X pada fraksi atas dan 73,5% (albumen 30%) spermatozoa Y pada fraksi bawah (albumen 50%) (Saili, 1999), sedangkan Afiati et.al. (2004) yang menggunakan kolom BSA 5%:10% mampu memperoleh spermatozoa X sebesar 72%±5,3 pada fraksi atas dan spermatozoa Y sebesar 77%±6,5 pada fraksi bawah.

Penentuan ukuran kepala spermatozoa pada setiap jenis ternak sangat membantu dalam penentuan metode pemisahan spermatozoa pembawa kromosom X dan Y, khususnya dalam menentukan konsentrasi kolom albumin. Oleh karena itu peneilitian ini bertujuan untuk mengetahui ukuran kepala spermatozoa kerbau, sapi dan domba secara morfometri dengan teknik pewarnaan eosin-nigrosin dalam memberikan informasi metode

160

Vol. 15 No. 2 Tahun 2007 Identifikasi Kepala Spermatozoa Kerbau

pemisahan spermatozoa pembawa kromosom X dan spermatozoa Y.

MATERI DAN METODE PENELITIAN

Penampungan SemenSemen dikoleksi dari sapi pejantan

unggul Simmental (Bos taurus), kerbau belang (Bubalus bubalis) dan domba merino (Ovis aries) yang dipelihara di kandang hewan Puslit Bioteknologi-LIPI, Cibinong. Penampungan semen dilakukan dengan metoda vagina buatan. Semen yang tertampung kemudian dibawa ke laboratorium untuk diperiksa keadaan makroskopis (volume, warna, bau, pH, konsistensi) dan mikroskopis (gerakan massa, motilitas, hidup/mati, konsentrasi, membran plasma utuh/MPU).

Evaluasi Spermatozoa secara MorfometrikSampel sperma yang terkoleksi diperiksa

secara morfometri melalui teknik apusan menggunakan eosin-nigrosin 2% (Toelihere, 1993) dengan bantuan mikroskop pembesaran 10 x 40. Pengukuran dilakukan menggunakan lensa okuler yang dilengkapi dengan skala mikro (Olympus HD-2). Sampel sperma yang diukur sebanyak 500 sel, sedangkan menurut Gravance, et.al. (1998) pengukuran morfometri kepala sperma sebanyak 200 sel dengan melihat panjang, lebar, lebar/panjang, area dan perimeter.

Ukuran lebar dan panjang kepala spermatozoa dapat dilihat pada Gambar 1. dan Gambar 2

.

Gambar 1. Lebar kepala spermatozoa Gambar 2. Panjang kepala spermatozoa

Rancangan PercobaanRancangan percobaan yang digunakan

dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap. Data yang dihasilkan dianalisis dengan analysis of variance menggunakan program Data Analisis (Excel). Bila terdapat perbedaan dilanjutkan dengan uji Fisher’s LSD.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Kualitas spermatozoa Evaluasi semen secara makroskopis

(volume, pH, konsistensi, warna, bau) dan

mikroskopis (motilitas, konsentrasi, membran plasma utuh, hidup/mati dan abnormalitas) segera setelah proses penampungan semen sangat penting artinya sebelum melakukan proses lebih lanjut terhadap semen tersebut. Evaluasi motilitas, membran plasma utuh dan abnormalitas merupakan bagian indikator-indikator yang digunakan dalam menilai kualitas speramtozoa. Kualitas spermatozoa yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 1

.Tabel 1. Kualitas spermatozoa kerbau, sapi dan domba (%)

Parameter Kerbau Sapi DombaMotilitas 74,5b 85a 75b

Membran plasma utuh 78,17b 85,6a 80,12b

Abnormalitas tn 11,31 10 12,5 Keterangan : superskrip yang berbeda dalam baris yang sama berbeda nyata(P<0,01)

161

Tappa, Afiati, Said Jurnal PROTEIN

Gomendio and Rodan (1991) mengemukakan bahwa panjang spermatozoa pada mamalia dapat beradaptasi dan berkompetisi. Dikemukakan juga bahwa panjang spermatozoa berkorelasi positif terhadap motilitas sperma, tergantung pada ukuran kepala spermatozoa dan tingkat fertilitas. Motilitas adalah kemampuan spermatozoa untuk bergerak maju (progresif). Daya gerak progresif sangat menentukan kualitas spermatozoa dalam hubungannya dengan kemampuan fertilisasi spermatozoa (Saili, 1999). Hasil penelitian menunjukkan tidak terdapat perbedaan pada motilitas kerbau dan domba, tetapi keduanya berbeda nyata lebih kecil (P<0,01) dengan motilitas sapi; masing-masing sebesar (%) 74,5; 75 dan 85.

Kemampuan bagian ekor sel spermatozoa untuk mengembung dalam medium hipoosmotik merupakan suatu ciri dari sel sperma yang masih memiliki integritas membran dan fungsi normal. Hasil penelitian menunjukkan bahwa nilai MPU kerbau tidak berbeda dengan MPU domba, tapi berbeda nyata lebih kecil (P<0,01) dengan nilai MPU sapi dengan nilai masing-masing (%) 78,17; 80,12 dan 85,6. Keterpaparan spermatozoa pada larutan yang bersifat hipotonis dan perubahan-

perubahan yang terjadi akibat kondisi tersebut disebut osmotic shock (Zavos et.al., 1998).

Abnormalitas yang terjadi pada spermatozoa dapat berupa abnormalitas primer ataupun abnormalitas sekunder (Toelihere, 1993). Variasi dimensi kepala spermatozoa dapat dilihat juga pada tingkat struktur abnormal kromatin. Dimana

perubahan struktur kromatin ini dapat terjadi pada tingkat skrotum dan dapat meningkatkan keabnormalan morfologi spermatozoa (Karabinus, et.al., 1997). Hasil penelitian spermatozoa kerbau, sapi dan domba menunjukkan tingkat abnormalitas yang rendah, yaitu sebesar 10%-12,5%, nilai ini masih memenuhi syarat IB, karena menurut Toelihere (1993) semen yang baik mempunyai tingkat abnormalitas lebih kecil dari 20%.

Ukuran kepala spermatozoa kerbau, sapi dan domba

Salah satu cara dalam mengidentifikasi ternak adalah dengan evaluasi secara morfometrik, yaitu mengukur bagian terpanjang dan terlebar kepala spermatozoa. Hasil pengukuran kepala spermatozoa kerbau, sapi dan domba dapat dilihat pada Tabel 2, Gambar 3 dan Gambar 4.

Tabel 2. Perbandingan Ukuran Panjang dan Lebar Kepala Spermatozoa

Keterangan : superskrip yang berbeda dalam kolom yang sama berbeda nyata (P<0,01)

Gambar Rasio lebar dan panjang kepala Gambar 4. Ukuran panjang dan lebar

Jenis Ternak SpesifikasiPanjang (m) Lebar (m) Lebar/Panjang (%)

Kerbau 7,01±0,13c 4,23±0,18 c 60,34±0,15 c

Sapi 8,94±0,24 a 4,59±0,24 a 51,34±0,24 a

Domba 8,33±0,24 b 4,32±0,22 b 51,86±0,23 b

162

Vol. 15 No. 2 Tahun 2007 Identifikasi Kepala Spermatozoa Kerbau

3. spermatozoa kepala spermatozoa

Bearden dan Fuquay (1984) memberi batasan tentang ukuran besar kepala spermatozoa sapi, panjang kepala spermatozoa sebesar 8 – 10 m, lebar kepala 4 - 5m dan besar kepala spermatozoa sebesar 35 - 40 m. Hasil kali panjang dan lebar kepala spermatozoa sapi pada penelitian ini sebesar 41,03m, nilai ini sesuai dengan uraian Toelihere (1993) yang mengemukakan bahwa hasil kali panjang dan lebar kepala spermatozoa kira-kira 32 - 45 m. Data penelitian menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan antara morfometri (panjang dan lebar) kepala spermatozoa domba (8,33m dan 4,32m) serta spermatozoa kerbau (7,01m dan 4,23m), tetapi berbeda nyata lebih besar (P<0,01) bila dibandingkan dengan morfometri kepala spermatozoa sapi (8,94m dan 4,59m), masing-masing pada ukuran panjang dan lebar kepala spermatozoa. Rasio lebar dan panjang kepala spermatozoa kerbau (60,34%) berbeda nyata lebih besar (P<0,01) dibanding pada domba (51,86%) dan sapi (51,34%). Hasil pengukuran kepala spermatozoa sapi lebih kecil bila dibandingkan dengan hasil pengukuran Kondracki, et.al. (2006), yaitu sebesar 10,11±0,57 panjang (m); (5,21±0,43) lebar (m) dan 51,55±4,13 rasio lebar/panjang (%). Tetapi lebih besar dari hasil pengukuran kepala spermatozoa sapi hasil pengukuran Morrow and Gage (2001) panjang 8,56 m, lebar 4,39 m dan rasio lebar/panjang 51,3 (%). Pengukuran secara morfometrik yang dilakukan Tappa et.al. (2006) mengidentifikasi kepala spermatozoa sapi HG sebesar (panjang, µm) 8.94 ± 0.49 dan (lebar, µm) 4.59 ± 0.49.

Pengukuran morfometri kepala spermatozoa pada penelitian ini dilakukan dengan pewarnaan eosin-nigrosin (Toelihere, 1993). Herreros et.al. (2006) melakukan tiga teknik pewarnaan yaitu rapid panoptic, hemacolor dan Harri’s haematoxylin (HH) untuk melihat tingkat keakuratan morfometri. Hasil menunjukkan pencucian dan pewarnaan memberikan pengaruh yang sangat nyata terhadap tingkat keakuratan dimensi kepala spermatozoa. Hidalgo et.al. (2005) melihat pengaruh pembekuan pada dimensi kepala spermatozoa kambing dengan teknik pewarnaan DIFF-QUIK (DF). Spermatozoa beku nyata

lebih kecil (P<0,001) dibanding spermatozoa segar dengan ukuran panjang 8,34m vs 8,53m; lebar 3,99m vs 4,10m; area 28,6m vs 29,06m dan perimeter 22,13m vs 22,34m. Hidalgo et.al. (2007) melakukan penelitian untuk melihat pengaruh suhu terhadap dimensi kepala spermatozoa rusa. Tidak terdapat perbedaan antara suhu 0-44C terhadap nilai morfometrik pada lebar dan area, tetapi berbeda antara panjang dan perimeter (P<0,05), yaitu pada kelompok suhu 0-10C dihasilkan panjang dan perimeter berturut-turut 8,57m dan 22,45m; suhu 11-22C (8,55m dan 22,42m); suhu 23-30C (8,49m dan 22,24m); suhu 31-40C (8,47m dan 22,14m).

Hirai et.al. (2001) mengukur karakteristik spermatozoa babi secara kuantitatif pada babi dengan melakukan pewarnaan modifikasi Farelly yaitu aniline blue dan crystal violet dengan mengukur area dalam mikrometer kuadrat (m2), panjang dalam mikrometer (m), lebar dalam mikrometer (m) dan perbandingan lebar dan panjang dalam persen (%). Digunakan 200 sel dari 4 slide dengan menghitung sebanyak 50 sel pada setiap slide, sedangkan pada sapi dalam satu slide sel yang diukur maksimal sebanyak 60 sel (Boersma et.al., 1993).

KESIMPULAN DAN SARAN

Jenis ternak yang berbeda menghasilkan ukuran kepala yang berbeda, baik pada ukuran panjang ataupun pada ukuran lebar. Ukuran kepala spermatozoa domba lebih besar dari kepala spermatozoa kerbau, tetapi lebih kecil dari spermatozoa sapi.

Pemeriksaan kepala spermatozoa secara morfometri dapat dijadikan dasar bagi penelitian pemisahan spermatozoa, terutama pemisahan menggunakan metode kolom albumin.

DAFTAR PUSTAKA

Afiati, F., M. Gunawan, E.M. Kaiin. S. said dan B. Tappa. 2004. Mengubah Rasio Sperma X dan Y Dengan Kolom Bovine Serum Albumin (BSA).

163

Tappa, Afiati, Said Jurnal PROTEIN

Prosiding Seminar Nasional Industri Peternakan Modern. Puslit Bioteknologi LIPI bekerja sama dengan Dispet Prop. Sulawesi Selatan. Hal. 106-112.

Boersma, A.A., Braun J., Stolla R. 1993. Influence of Random Factors and Two Different Staining Procedures on Computer-Assisted Sperm Head Morphometry in Bulls. Reprod. Domestic Anim. 34:77-82

Davis RO, Gravance CG. 1993. Standardization of Specimen Preparation, Staining and Sampling Methods Improves Automated Sperm-Head Morphometry Analysis. Fertil Steril 59 (2): 412-417

Garcia, H.M., I.M. Aparicio, F.J. Baron, G. Marin and M.C. Gil. 2006. Standardization of Simple Preparation, Staining and Sampling Methods for Automated Sperm Head Morphometry Analysis of Boar Spermatozoa. Int. Jour. Androl. 29 (5): 553 -563

Gage, M.J.G. 1998. Mammalian Sperm Morphometry. Proc.Royal Sci. Vol. 265 (97-103)

Gomendio, M. and E.R.S. Roldan. 1991. Sperm Competition Influences Sperm Size in Mammals. Proc. Royal Society of London Series B-Biological Science. 243:181-185.

Gravance, C. G., R. Vishwanath, C. Pitt, D.L. Garner and P.J. Casey. 1998. Effects of Cryopreservation on Bull Sperm Head Morphometry. J. Androl 19(6): 704-709

Hidalgo, M., I. Rodriguez, J. Dorado dan J. Sanz. Influence of Environmental Temperature on Sperm Head Morphometry in Florida Bucks. http://www.uco.es/organiza/departementos/medicina-cirugia/reproduccion/documentos/public9.pdf. [31 Januari 2007]

Hidalgo, M., I. Rodriguez, J. Dorado dan J. Sanz. 2005. Morphometric Sperm Head Dimensions of Goat

Spermatozoa Are Affected by Cryopreservation. http://www.uco.es/organiza/departementos/medicina-cirugia/reproduccion /documentos/ poster 11.pdf. [31 Januari 2007]

Hirai, M., A. Boersma. A. Hoeflich, E. Wolf, J. Foll, R. Aumuller dan J. Braun. 2001. Objectively Measured Sperm Motility and Sperm Head Morphometry in Boars (Sus Scrofa): Relation to Fertility and Seminal Plasma Growth Factors. J. Andrology 22(1): 104-110

Januskaukas, A. dan H. Zilinkas. 2002. Bull Semen Evaluation Post-Thaw And Relation Of Semen Characteristics To Bull Fertility. Veterinarija ir zootechnika. T. 17 (39).

Kaiin, E.M., F. Afiati, M. Gunawan dan B. Tappa. 2003. Pengaruh Penyimpanan pada Temperatur 5ºc terhadap Viabilitas Spermatozoa Sapi Hasil Pemisahan. Prosiding Seminar nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Puslitbangnak. Hal 73-76.

Karabinus, D.K., C.J. Vogler, R.G. Sacke, D.P. Evenson. 1997. Chromatin Struktural Changes in Sperm After Scrotal Insulation in Holstein Bulls. Jour. of Andrology. 18:549-555

Krzyzaniak, L.T. dan E.S.E. Hafez. 1993. X- And Y- Chromosome Bearing Spermatozoa. Dalam E.S.E. Hafez. 1993. Reproduction in farm animals. 6th. Ed. Lea and Febiger. Philadelphia.

Kondracki, S., D. Banaszewska, A. Wysokinska, J. Chomicz. 2006. Sperm Morfology of Cattle and Pigs. Reprod. Fertil. 6, Suppl.2:99-104

Meistrich, M.L. 1982. Potential and Limitations of Phisical Methods for Separation of Sperm Bearing An X- And Y- Chromosome dalam R.P. Amann and G.E. Seidel. 1982. Prospects for sexing mammalian sperm. Colorado Assosiated University Press. USA.

164

Vol. 15 No. 2 Tahun 2007 Identifikasi Kepala Spermatozoa Kerbau

Revay, T., S. Nagy, A. Kovacs, M.E. Edvi, A. Hidas, W. Rens dan I. Gustavsson. 2004. Head Area Mesurements of Dead, Live, X- and Y- Bearing Bovine Spermatozoa. Reproduction, Fertility and Development 16(7); 681-687.

Saili, T. 1999. Efektivitas Penggunaan Albumen sebagai Medium Separasi dalam Upaya Mengubah Rasio Alamiah Spermatozoa Pembawa Kromosom X dan Y pada Sapi. Thesis. Program Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Tappa, B., S. Said, E.M. Kaiin dan F. Afiati. 2006. Identifikasi Spermatozoa Pembawa Kromosom X dan Y dari Hasil Pemisahan Semen Sapi. Seminar Bioteknologi. (belum diterbitkan)

Toelihere, M. R. 1993. Inseminasi Buatan pada Ternak. Penerbit Angkasa. Bandung.

Zavos, P.N.Z., J.R. Correa, P. Aslanis, S. Antypas and P.M. Zavos. 1998. Occurrence of Osmotic Shock in Human Spermatozoa: Its Effects on The Qualitative Measurements of Frozen-Thawed Spermatozoa. Middle East Fertility Society Journal 3 (1).

165