Oleh : Imanuelle Orchidea (3325 10 2413)

Seminar Pra Skripsi

• Latar Belakang; Identifikasi Masalah; Pembatasan Masalah; Perumusan Masalah; Tujuan Penelitian; Manfaat Penelitian

INTRO (Pendahuluan)

Latar Belakang

Genom S.typhi

Identifikasi Masalah

• Bagaimana mengisolasi gen HSP 70 berukuran 1,9 kilobasa dari bakteri Salmonella enterica serovar typhi ?

• Bagaimana mengamplifikasi gen HSP 70 berukuran 1,9 kilobasa dari bakteri Salmonella enterica serovar typhi ?

• Bagaimana mengkarakterisasi hasil amplifikasi gen HSP 70 berukuran 1,9 kilobasa dari bakteri Salmonella entericaserovar typhi ?

• Bagaimana menentukan urutan nukleotida hasilamplifikasi gen HSP 70 berukuran 1,9 kilobasa dari bakteriSalmonella enterica serovar typhi ?

• Apakah gen HSP 70 Salmonella enterica serovar typhimemiliki homologi dengan gen HSP 70 bakteri lain?

Pembatasan dan Perumusan Masalah

• Pembatasan Masalah :

– Isolasi, amplifikasi, ,dan sekuensing gen HSP 70 S.typhi berukuran 1,9 kilobasa.

• Perumusan Masalah :

– Bagaimana mengisolasi, mengamplifikasi, mengkarakterisasi, dan menentukan urutannukleotida gen HSP 70 berukuran 1,9 kilobasa daribakteri S.typhi ?

Tujuan dan Manfaat Penelitian

• Tujuan Penelitian

– Memperoleh DNA S.typhi, amplikon, hasilkarakterisasi dan urutan nukleotida gen HSP 70 berukuran 1,9 kilobasa dari bakteri S.typhi.

• Manfaat Penelitian

– Studi awal untuk mengembangkan vaksin demamtifoid menggunakan gen HSP 70 S.typhi

KAJIAN TEORI

• Gejala :

– demam, pusing, lemah, sakit kepala, hilangnyanafsu makan, dehidrasi, diare, dan terkadangdisertai dengan muntah-muntah.

• Masa inkubasi : 1 minggu

• Lama penyakit : ± 6 minggu

• Kingdom : Bacteria

• Filum : Proteobacteria

• Kelas : Gamma Proteobacteria

• Ordo : Enterobacteriales

• Famili : Enterobacteriaceae

• Genus : Salmonella

• Spesies : Salmonella enterica

• Serotipe : typhi

Salmonella enterica serovar typhi

• 1-3,5 µm x 0,5-0,8 µm

• besar koloni rata-rata 2-4 mm

• Fakultatifanaerob/aerob

Hasil Akhir Proses Fagositosis

(1) Degradasi sebagian besar atau seluruh partikel asing atau mikroorganisme.

(2) Partikel atau mikroorganisme yang resisten terhadap degradasi akan ikut beredar ”berkendaraan” fagosit yang melahapnya.

(3) Tetap tinggal dalam sitoplasma tanpa merugikan atau membunuh fagosit.

• Protein : komponen utama metabolisme sel• STRESS mengganggu sintesis protein• RESPON STRESS Heat Shock Protein

• Heat Shock Protein diklasifikasikan berdasarkan sizemolekulnya

• Chaperone [HSP 70 (DnaK), HSP 40 (DnaJ), dan GrpE) :membantu pelipatan protein yang baru disintesis ke bentukmatur, membantu transpor protein melalui membran, membantu pelipatan kembali protein yang terdenaturasi.

• Chaperonin [HSP 60 (GroEL), HSP 10 (GroES) : berperan padaprotein yang misfolding.

• HSP 70 dan HSP 60 bekerja sama sebagai pemandu dalampelipatan protein

• Ditemukan di sitosol, dan mitokondria

HSP 70 S.typhi

• HSP 70 dikode oleh gen HSP 70 (dnaK).

Genom S.typhi

Gen HSP 70

• Nama sistematik : STY0012

• Nama gen : dnaK

• GeneID : 1246523

• Tipe gen : protein coding gene

• Lokasi : kromosom S.typhi 11594-13510 lokus STY0012

• Massa Molekul : 69,231.03------638 aa

• Minute/Centisome (%): 0.24

• Produk : protein DnaK (HSP 70)

• ATGGGTAAAA TTATTGGTAT CGACCTGGGT ACTACCAACT CTTGTGTAGC GATTATGGAT

• GGAACGCAGG CACGCGTGCT GGAGAACGCC GAGGGCGATC GCACTACGCC TTCTATCATT

• GCTTATACCC AGGATGGTGA AACTCTGGTT GGTCAGCCGG CTAAACGTCA GGCAGTGACA

• AACCCGCAAA ACACCCTGTT TGCGATTAAA CGCCTGATTG GCCGCCGCTT CCAGGACGAA

• GAAGTTCAAC GTGACGTTTC TATCATGCCG TACAAAATCA TCGGCGCCGA CAACGGCGAC

• GCATGGCTTG ATGTGAAAGG TCAGAAAATG GCGCCGCCGC AGATTTCTGC CGAAGTGCTG

• AAGAAAATGA AGAAAACGGC TGAAGATTAT CTGGGCGAAC CGGTAACTGA AGCGGTTATC

• ACCGTACCGG CTTACTTTAA CGATGCGCAG CGTCAGGCTA CCAAAGATGC TGGTCGTATC

• GCGGGGCTGG AAGTTAAACG TATCATCAAC GAACCGACTG CCGCAGCGCT GGCTTACGGT

• CTGGATAAAG AAGTCGGCAA CCGTACTATC GCGGTTTACG ACCTCGGTGG TGGTACTTTC

• GATATCTCTA TTATCGAAAT CGACGAAGTT GATGGCGAAA AAACCTTTGA AGTTCTGGCA

• ACCAACGGTG ATACCCACCT GGGTGGTGAA GACTTCGATA CCCGCCTGAT CAACTACCTC

• GTTGACGAGT TTAAGAAAGA TCAGGGCATC GACCTGCGTA ACGATCCGCT GGCCATGCAG

• CGCCTGAAAG AAGCCGCAGA AAAAGCCAAA ATCGAGCTGT CTTCTGCGCA GCAGACCGAC

• GTGAACCTGC CGTACATTAC CGCAGATGCC ACCGGTCCGA AACACATGAA CATCAAAGTG

• ACCCGTGCGA AACTGGAAAG CCTGGTTGAA GATCTGGTGA ACCGTTCTAT CGAGCCGCTG

• AAAGTCGCAC TGCAGGACGC TGGCCTGTCC GTGTCTGATA TCAACGACGT GATCCTCGTC

• GGCGGTCAGA CCCGTATGCC AATGGTGCAG AAAAAAGTGG CTGAGTTCTT CGGTAAAGAG

• CCGCGTAAAG ACGTTAACCC GGACGAAGCT GTGGCTATCG GCGCAGCGGT ACAGGGCGGC

• GTATTGACCG GTGATGTGAA AGACGTACTG CTGCTGGACG TTACCCCGCT GTCTCTGGGT

• ATCGAAACGA TGGGTGGCGT GATGACTCCG CTTATCACCA AAAACACCAC CATCCCGACC

• AAGCACAGCC AGGTGTTCTC TACTGCGGAA GACAACCAGT CTGCGGTAAC CATCCATGTG

• CTGCAGGGTG AGCGTAAACG TGCGTCTGAT AACAAATCTC TGGGTCAGTT CAACCTGGAT

• GGCATCAACC CGGCGCCGCG CGGTATGCCG CAGATCGAAG TCACCTTCGA TATCGATGCT

• GACGGTATCC TGCACGTCTC CGCGAAAGAT AAAAATAGCG GTAAAGAGCA GAAGATCACT

• ATCAAGGCGT CTTCTGGTCT GAACGAGGAA GAAATTCAGA AAATGGTTCG CGATGCAGAA

• GCGAACGCTG AATCCGACCG TAAGTTCGAA GAGCTGGTTC AGACCCGTAA CCAGGGTGAC

• CATCTGCTGC ACAGCACCCG TAAGCAGGTT GAAGAAGCAG GCGATAAACT GCCGGCTGAT

• GACAAAACCG CTATCGAGTC TGCGCTGAGC GCGCTGGAAA CTGCCCTGAA AGGCGAAGAT

• AAAGCCGCTA TCGAAGCGAA AATGCAGGAG CTGGCGCAGG TTTCCCAGAA ACTGATGGAA

• ATCGCTCAGC AGCAACATGC GCAGCAGCAG GCTGGCTCCG CCGACGCTTC TGCAAACAAT

• GCGAAAGATG ACGACGTTGT CGACGCTGAG TTTGAAGAAG TAAAAGATAA AAAATAA

• Perusakkan dan pembuangan dinding sel,

• Lisis sel

• Pembuangan debris sel, serta

• Pemisahan DNA dari protein dan RNA.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Primer

• Primer HSP 70 F : 5’-GGA TCC GGT AAA ATT ATT GGT ATC GAC-3’.

• Primer HSP 70 R : 5’-AAG CTT TTA TCT TTT ACT TCT TCA AAC TC-3’.

Karakterisasi Hasil Isolasi dan Produk PCR

• Menggunakan elektroforesis gel agarosa

Tujuan Operasional• Memperoleh biakan bakteri Salmonella enterica

serovar typhi dalam medium padat dan cair

• Memperoleh DNA Salmonella enterica serovar typhi

• Memperoleh amplikon gen HSP 70 S.typhi denganPolymerase Chain Reaction

• Mendapatkan hasil karakterisasi gen HSP 70 S.typhimenggunakan elektroforesis gel agarosa

• Memperoleh gen HSP 70 S.typhi terpurifikasi danurutan nukleotida gen HSP 70 S.typhi berukuran 1,9 kilobasa

Tempat dan Waktu Penelitian

• Tempat : Laboratorium Biokimia-BioteknologiFMIPA UNJ . dan Laboratorium MikrobiologiFMIPA UNJ,

• Waktu : Desember 2013-Maret 2014.

Metode : EKSPLORATIF

INSTRUMENTASI PENELITIAN

Peralatan dan Bahan yang Dibutuhkan

• Pembiakkan bakteri :– petri dish, pipet serologi, gelas kimia, tabung

reaksi,labu erlenmeyer, tabung reaksi, hot plate stirrer, jarum ose steril, pembakar bunsen, autoklaf, orbital shaker, dan laminar airflow.

– akuades , medium Salmonella-Shigella Agar danNutrient Broth

• Pembuatan glycerol stock:– Pipet serologi, pipet mikro, tabung ependorf steril– Glycerol, overnight culture S.typhi

• Isolasi genom S.typhi– tabung mikro 1.5 mL, Pipet mikro dengan tip steril,

berukuran 0.5-10 µL, 20-200 µL, dan 100-1000 µL, mikrosentrifuse, vortex, water bath 37oC dan 80oC, laminar airflow, dan lemari pendingin

– Overnight culture S.typhi , kit Wizard (Promega), etanol70%, dan isopropanol.

• Amplifikasi Gen HSP 70 S.typhi– tabung mikro steril 100 µL, pipet mikro 0.2-20 µL

dengan tip steril, thermal cycler, lemari pendingin.

– genom bakteri, kit PCR, dan primer.

Peralatan dan Bahan yang Dibutuhkan

Peralatan dan Bahan yang Dibutuhkan

• Karakterisasi dan Purifikasi Produk PCR

– kit elektroforesis gel agarosa, kit purifikasi, pipetmikro 0.2-20 µL dengan tip steril, UV transluminator, dan alat dokumentasi.

– produk PCR, DNA Ladder (Promega), Loading Dye 6x (Promega), buffer Tris Asetat EDTA 1x (Promega), gel agarosa 2 % (1 gram agarosa dan50 mL buffer TAE 1x), etidium bromide 0.1% (Promega )

PROSEDURPENELITIAN

1. Pembiakkan bakteri S.typhi pada medium padatdan cair

2. Pembuatan glycerol stock bakteri S.typhi

3. Isolasi genom bakteri S.typhi dengan kit Wizard dan Karakterisasinya

4. Penyiapan primer gen HSP 70

5. Amplifikasi gen HSP 70 berukuran 1,9 kilobasa

6. Karakterisasi hasil amplifikasi gen HSP 70 berukuran 1,9 kilobasa dengan elektroforesis gel agarosa

7. Purifikasi hasil amplifikasi gen HSP 70 dengan kit

8. Sekuensing dengan metode dideoxy Sanger

Pembiakkan S.typhi pada Medium Padat

Sterilisasi peralatan gelas(petri dish, erlenmeyer,

pipet,dll)

Petri dish steril

Membuat medium agar, dituangkan ke dalam petri dish,

dibiarkan mengeras

Biakan S.typhi pada agar miring

Digoreskan secara zig-zag padamedium agar steril

Inkubasi selama 16-18 jam pada 37oC

Diambil dengan jarum ose steril

dilakukan dalam laminar airflow

Pembiakan S.typhi pada Medium Cairdan Pembuatan Glycerol Stock

Biakan S.typhi pada SS Agar

Dicelupkan ke dalam 5 ml Medium cair Nutrien

Broth steril

Inkubasi selama 16-18 jam pada 37oC dengan aerasi

shaker 150 rpm

Overnight culture bakteriS.typhi dalam medium cair

Diambil dengan jarum ose steril

800 µL Overnight culture bakteri S.typhi dalam

medium cair

+

200 µL filter-sterilized glycerol

Dimasukkan ke tabung eppendorf 1 ml

Dihomogenkan laluDisimpan pada suhu -80oC

Isolasi genom bakteri S.typhi dengankit Wizard dan karakterisasinya

1 ml Overnight culture S.typhi

tabung mikrosentrifuse eppendorf steril 1,5 ml

Sentrifugasi 2 menit pada 13,000-16,000 g

Pellet sel Supernatan

+ 600 µL Nuclei Lysis Solution

Beaker glass berisidesinfektan

Dihomogenkan dengan pemipetan naik turun

Diinkubasi pada 80oC

Setelah homogen

Didinginkan

+3 µL RNase Solution

Tabung ditutup, dibolak-balikkan 2-5x

Diinkubasi pada 37oC selama 15-60 menit

Didinginkan kembali pada suhu kamar

+200 µL Protein Precipitation Solution

Divortex 20 detik Diinkubasi 5 menit dalam es

Sentrifugasi 3 menit pada 13,000-16,000 g

Pellet sel/ residu proteinSupernatan

Supernatan

Tabung eppendorf steril berisi isopropanol pada suhu kamar

Dibolak-balik hingga benang-benang DNA nampak

Sentrifugasi 2 menit pada 13,000-16,000 g

SupernatanPellet DNA

Dicuci dengan 600 µL etanol 70%

Tabung ditutup, dibolak-balikkan 2-5x

Dikeluarkan

Tabung dikeringkan

Sentrifugasi 2 menit pada 13,000-16,000 g (dapat diulang 2-3x)

Pellet DNA Supernatan

Pellet DNA

Dikeringanginkan 10-15 menit

+100 µL DNA Rehydration Solution

inkubasi 60 menit, pada 65o

homogenisasi selama inkubasi dengan tapping the tubeatau dapat juga diinkubasi semalam pada suhu kamar atau pada suhu 4oC

Hasil Isolasi DNA disimpan pada suhu 2-8oC

Karakterisasi Hasil Isolasi Genom S.typhi

Hasil Isolasi genom bakteri

Elektroforesis gel agarosa 1% dengan pewarna etidium bromide 0,1%

Dikarakterisasi dengan

Tahap Pembuatan Gel Agarosa 1 %

25 ml Tris Asetat EDTA 10x + 225 ml akuades

Buffer TAE 1x bubuk agarosa

Diambil 40 ml Ditimbang 0,4 gram

40 ml Buffer TAE 1x + 0,4 g bubuk agarosa

dididihkan didinginkan hingga 60oC

+ 2 µL etidium bromida

Larutan agarosa

Dituang ke dalam baki gel agarosa yang dilengkapi comb

Dibiarkan hingga gel menjadi padat

Comb diambil dengan hati-hati dari gel agarosa

Baki gel agarosa

Direndam dalam

Tahapan elektroforesis

300 ml larutan buffer TAE 1x

Tangki elektroforesis Baki gel agarosa

Dimasukkan ke

Sumur

Sumur 1

5 µL DNA genom bakteri + 2 µL Loading Dye Buffer 1x

5 µL DNA Ladder 100 bp + 1 µL Loading Dye Buffer 6x + 4 µL akuabides steril

Perangkat elektroforesis siap

Dialiri listrik 100V 30’ / 80V, 60’ / 70V, 90’

Hasil divisualisasi dengan UV transluminator 260 nm

Penyiapan Primer

• Primer HSP 70 F : 5’-GGA TCC GGT AAA ATT ATT GGT ATC GAC-3’.

• Primer HSP 70 R : 5’-AAG CTT TTA TCT TTT ACT TCT TCA AAC TC-3’.

Dimasukkan ke

Amplifikasi gen HSP 70 berukuran 1,9 kb

Pasangan primer HSP 70 @ 1,25 µL+Master Mix PCR 12,5 µL+Nuclease free water 9 µL+Sampel DNA genom bakteri 1 µL

Tabung PCR

Thermal cycler (35 siklus)

Denaturasi (95oC, 1 menit)

Annealing(57,5oC, 1menit)

Elongasi(72oC, 1menit)

Pemantapan produk(72oC, 1menit)

Karakterisasi Hasil Amplifikasi Gen HSP 70 Berukuran 1,9 Kb

Gen HSP 70 S.typhi 1,9 kb produk PCR

Elektroforesis agarosa 2%

(dibuat sesuai prosedur sebelumnya, takaran agarose gel dilipatduakan)

Pewarna EtBr 0,1%

Elektroforesis dilakukan pada 80 Volt selama 1jam

Visualisasi dengan lampu UV 260 nm

Purifikasi Hasil Amplifikasi Gen HSP 70 dengan Kit

Tabung eppendorf kosong Ditimbang, didapatkan mo

Gel agarosa berisi DNA Dipotong, dimasukkan ke tabungeppendorf kosong, ditimbang,

diperoleh m1Berat gel = m1-m0

+membrane binding solution 10 µL : 10 mg gel

Divortex periodik, inkubasi 10 menit @50-65oC

Sentrifugasi pada suhu kamar Larutan gel

Larutan gel SV minicolumn pada collection tube Inkubasi 1 menit

Sentrifugasi pada 16,000 gSV minicolumn dipindahkan dari Collection tube

Cairan pada Collection tube dibuang SV minicolumn dipasang lagi

Kolom dicuci dengan 500µL membrane wash solution dalam EtOH 95%

Sentrifugasi 1 menit pada 16,000 g

Collection tube dikosongkan, sentrifugasi 60s

SV minicolumn dipindah ke eppendorf tube steril

+50µL nuclease free waterDiinkubasi 1menit, Sentrifugasi 1 menit

pada 16,000 g

SV minicolumn dikeluarkan, eppendorf tube berisi DNA disimpan pada suhu -21 – 4oC

Sekuensing dengan metode dideoxySanger

• Keterangan : Sampel dikirim ke Macrogen, Korea untuk disekuensing

Sekuensing dengan automated sequencer

Kromatogram hasil sekuensing

Analisis ke bentuk FASTA

Analisis BLAST

Vielen Dank für Alles !