SISTEMAS NANOPARTICULADOS PARA LA ENTREGA DE … · epilepsia (ensayo MES, maximal electroshock...
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SISTEMAS NANOPARTICULADOS PARA LA ENTREGA DE FÁRMACOS ANTIEPILÉPTICOS PARA EL TRATAMIENTO DE LA EPILEPSIA REFRACTARIA Sebastián Scioli Montoto a, b ; Germán Islan b ; María Esperanza. Ruiz a ; Mauricio Di Ianni a ; Manuel Couyoupetrou c ; María Laura Sbaraglini a ; Vera Alejandra Alvarez d ; Guido Oscar Pesce c ; Alan Talevi a ; Guillermo Raúl Castro b a Laboratorio de Investigación y Desarrollo de Bioactivos, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP, La Plata, Buenos Aires, Argentina. b Laboratorio de Nanobiomateriales, CINDEFI, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP, La Plata, Buenos Aires, Argentina. c Departamento de Farmacología, Instituto Nacional de Medicamentos (INAME), CABA, Buenos Aires, Argentina. d Grupo de Materiales Compuestos de Matriz Polimérica (CoMP), Instituto de Investigaciones en Ciencias y Tecnología de Materiales (INTEMA), Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Mar del Plata (UNMDP) – CONICET, Mar del Plata, Buenos Aires, Argentina Una de las posibles estrategias para enfrentar este problema consiste en “ocultar” al fármaco de los mecanismos de aclaramiento, permitiendo una mayor llegada del mismo al blanco molecular las nanopartículas sólidas lipídicas (NSL), resultan especialmente prometedoras ya que poseen una gran capacidad de permeación a través de la BHE, pero asociadas a una menor toxicidad intrínseca que su contraparte polimérica. Afecta a 50 millones de personas se ven afectadas por esta patología alrededor del mundo 1 / 3 De los pacientes sigue siendo refractario a las terapias tradicionales con fármacos antiepilépticos La epilepsia es el trastorno neurológico crónico grave más común caracterizado por convulsiones recurrentes tanto focales como generalizadas. Una hipótesis establece que esta resistencia se trataría de un problema farmacocinético, donde la sobreexpresión de transportadores de eflujo en la barrera hematoencefálica atentaría contra la biodisponibilidad de los fármacos antiepilépticos. El objetivo de este trabajo fue encapsular el FAE Carbamazepina (CBZ) en nanopartículas lipídicas (NSL y transportadores lipídicos nanoestructurados, TLN), biodegradables y no tóxicas, para obtener sistemas de liberación controlada, capaces de mejorar la distribución y aumentar la exposición cerebral del fármaco. Eficiencia de Carga La eficiencia de carga fue calculada por diferencia entre la cantidad inicial de CBZ agregada y la cantidad remanente en el filtrado luego de ultracentrifugar usando filtros. La cuantificación de la droga es llevada a cabo por un método por HPLC previamente validado. Características superficiales y morfológicas La distribución de tamaño de partículas e índice de polidispersión fueron medidos utilizando un equipo Nano ZS Zetasizer. El potencial Z fue determinado por anemometría laser con el mismo equipo. El análisis por microscopía de transmisión electrónica fue realizada usando un microscopio Jeol -1200 EX-II TEM. Las imágenes del microscopio de fuerza atómica fueron obtenidas utilizando Un microscopio de sonda de exploración multimodo equipado con un controlador Nanoscope V funcionando en modo tapping a temperatura ambiente. Síntesis Solución de tensioactivo Ceras ✓ Carbamazepina ✓ Carbamazepina (DMSO) ✓ Aceite Ultrasonicación Análisis térmico El análisis térmico se evaluó por calorimetría diferencial de barrido bajo atmósfera de nitrógeno. Se empleó una velocidad de calentamiento de 10ºC / min en el intervalo de 25-260 ºC. La estabilidad térmica se realizó mediante análisis termogravimétrico usando un aparato TGA Q500. Las mediciones se realizaron a una velocidad de calentamiento de 10 ºC / min bajo purga de nitrógeno. Estructura cristalina La estructura cristalina fue caracterizada por difracción de rayos X utilizando un difractómetro PANalytical X'Pert PRO. Los datos de los espectros de difracción se recogieron en el intervalo 2θ de 1-30º con un tiempo de adquisición de 1 segundo en cada paso pf 0,02º. Liberación Los estudios de disolución del CBZ liberada desde las nanopartículas se realizaron en un disolutor con paletas a 100 rpm usando 500 ml de buffer KH2PO4 (pH = 6,8) como medio de disolución, filtrado y desaereado con un filtro de nylon de 0,45 μm antes de su uso. Cada formulación se colocó en una membrana de diálisis prehidratada (MWCO 10 kDa) unida a la paleta y sumergida en un vaso. Ensayos In VIVO Los ensayos farmacológicos in vivo se realizaron en ratones Swiss albinos de 20 - 23 g de peso, utilizando un modelo agudo de epilepsia (ensayo MES, maximal electroshock seizure) para evaluar la actividad anticonvulsivante de la CBZ incorporada en las nanopartículas lipídicas. Se realizaron controles positivos (CBZ en solución de CMC 1%) y negativos (solución fisiológica) junto con el tratamiento con nanopartículas. Se evaluó la protección de todos los tratamientos a los 15 y 30 minutos y a las 1, 2 y 4 horas. %EE Días NSL NSL DMSO TLN TLN DMSO 0 95,30 95,63 94,77 94,70 30 91,21 88,95 90,73 89,27 60 92,74 90,76 91,08 88,40 Eficiencia de encapsulación Tamaño de partículas, potencial Z e IP Muestra Diámetro (nm) Potencial Z ( mV ) IP NSL 164,3 ( ± 2,7) - 6,0 ( ± 1,4) 0,147 ( ± 0,010) NSL DMSO 164,1 ( ± 4,6) - 6,3 ( ± 2,2) 0,158 ( ± 0,021) TLN 164,0 ( ± 3,2) - 2,4 ( ± 0,5) 0,173 ( ± 0,003) TLN DMSO 161,8 ( ± 3,0) - 4,1 ( ± 2,2) 0,170 ( ±0,010) Ensayo de liberación Permeabilidad en células MDCK Ensayos In Vivo Rayos X Se desarrollaron nanopartículas lipídicas conteniendo CBZ con características óptimas de tamaño, forma y permeabilidad, capaces de liberar la droga de manera sostenida, y con actividad antiepiléptica más prolongada respecto a una solución de la droga libre. Dicho desarrollo abre las puertas a nuevas alternativas para afrontar las limitaciones actuales de los FAEs en el tratamiento de la epilepsia refractaria. Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata (11/X545 y PRH 5.2 - Concejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET- PICT 0498) - Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (PICT 2011-2116, PICT 2013.3175)
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SISTEMAS NANOPARTICULADOS PARA LA ENTREGA DE FÁRMACOS ANTIEPILÉPTICOS PARA EL TRATAMIENTO DE LA EPILEPSIA REFRACTARIA
Sebastián Scioli Montotoa, b; Germán Islanb; María Esperanza. Ruiza; Mauricio Di Iannia; Manuel Couyoupetrouc; María
Laura Sbaraglinia; Vera Alejandra Alvarezd; Guido Oscar Pescec; Alan Talevia; Guillermo Raúl Castrob
a Laboratorio de Investigación y Desarrollo de Bioactivos, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP, La Plata, Buenos Aires, Argentina.b Laboratorio de Nanobiomateriales, CINDEFI, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP, La Plata, Buenos Aires, Argentina.c Departamento de Farmacología, Instituto Nacional de Medicamentos (INAME), CABA, Buenos Aires, Argentina.d Grupo de Materiales Compuestos de Matriz Polimérica (CoMP), Instituto de Investigaciones en Ciencias y Tecnología de
Materiales (INTEMA), Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Mar del Plata (UNMDP) – CONICET, Mar del Plata,Buenos Aires, Argentina
Una de las posibles estrategiaspara enfrentar este problemaconsiste en “ocultar” alfármaco de los mecanismos deaclaramiento, permitiendo unamayor llegada del mismo alblanco molecular
las nanopartículas sólidas lipídicas (NSL), resultan especialmente
prometedoras ya que poseen una gran capacidad de permeación a
través de la BHE, pero asociadas a una menor toxicidad intrínseca que
su contraparte polimérica.
Afecta a 50 millones depersonas se ven afectadas por estapatología alrededor del mundo
1/3De los pacientes sigue siendorefractario a las terapias tradicionalescon fármacos antiepilépticos
La epilepsia es el trastornoneurológico crónico grave máscomún caracterizado porconvulsiones recurrentes tantofocales como generalizadas.
Una hipótesis establece que esta resistencia se trataría de un problema farmacocinético, donde la sobreexpresión de
transportadores de eflujo en la barrera hematoencefálica
atentaría contra la biodisponibilidad de los
fármacos antiepilépticos.
El objetivo de este trabajo fue encapsular el FAE Carbamazepina (CBZ) en nanopartículas lipídicas (NSL y transportadores lipídicos
nanoestructurados, TLN), biodegradables y no tóxicas, para
obtener sistemas de liberación controlada, capaces de mejorar la
distribución y aumentar la exposición cerebral del fármaco.
Eficiencia de Carga
La eficiencia de carga fue calculada por diferenciaentre la cantidad inicial de CBZ agregada y lacantidad remanente en el filtrado luego deultracentrifugar usando filtros. La cuantificaciónde la droga es llevada a cabo por un método porHPLC previamente validado.
Características superficiales y morfológicas
La distribución de tamaño de partículas e índice depolidispersión fueron medidos utilizando un equipoNano ZS Zetasizer. El potencial Z fue determinadopor anemometría laser con el mismo equipo.El análisis por microscopía de transmisiónelectrónica fue realizada usando un microscopioJeol -1200 EX-II TEM.Las imágenes del microscopio de fuerza atómicafueron obtenidas utilizandoUn microscopio de sonda de exploración multimodoequipado con un controlador Nanoscope Vfuncionando en modo tapping a temperaturaambiente.
Sínt
esis
Solución de tensioactivo
Ceras
✓ Carbamazepina✓ Carbamazepina (DMSO)✓ Aceite
Ultrasonicación
Análisis térmico
El análisis térmico se evaluó porcalorimetría diferencial de barrido bajoatmósfera de nitrógeno. Se empleó unavelocidad de calentamiento de 10ºC / minen el intervalo de 25-260 ºC.La estabilidad térmica se realizómediante análisis termogravimétricousando un aparato TGA Q500. Lasmediciones se realizaron a una velocidadde calentamiento de 10 ºC / min bajopurga de nitrógeno.
Estructura cristalina
La estructura cristalina fue caracterizada por difracción de rayos X utilizando un difractómetro PANalytical X'Pert PRO. Los datos de los espectros de difracción se recogieron en el intervalo 2θ de 1-30º con un tiempo de adquisición de 1 segundo en cada paso pf 0,02º.
Liberación
Los estudios de disolución del CBZ liberada desde las nanopartículas se realizaron en un disolutor con paletas a 100 rpm usando 500 ml de buffer KH2PO4 (pH = 6,8) como medio de disolución, filtrado y desaereado con un filtro de nylon de 0,45 µm antes de su uso. Cada formulación se colocó en una membrana de diálisis prehidratada (MWCO 10 kDa) unida a la paleta y sumergida en un vaso.
Ensayos In VIVO
Los ensayos farmacológicos in vivo serealizaron en ratones Swiss albinos de 20 -23 g de peso, utilizando un modelo agudo deepilepsia (ensayo MES, maximalelectroshock seizure) para evaluar laactividad anticonvulsivante de la CBZincorporada en las nanopartículas lipídicas.Se realizaron controles positivos (CBZ en solución de CMC 1%) y negativos (solución fisiológica) junto con el tratamiento con nanopartículas. Se evaluó la protección de todos los tratamientos a los 15 y 30 minutos y a las 1, 2 y 4 horas.
%EE
Días NSL NSL DMSO TLN TLN DMSO
0 95,30 95,63 94,77 94,70
30 91,21 88,95 90,73 89,27
60 92,74 90,76 91,08 88,40
Eficiencia de encapsulación
Tamaño de partículas, potencial Z e IP
Muestra Diámetro (nm) Potencial Z (mV) IP
NSL 164,3 (±2,7) -6,0 (±1,4) 0,147 (±0,010)
NSL DMSO 164,1 (±4,6) -6,3 (±2,2) 0,158 (±0,021)
TLN 164,0 (±3,2) -2,4 (±0,5) 0,173 (±0,003)
TLN DMSO 161,8 (±3,0) -4,1 (±2,2) 0,170 (±0,010)
Ensayo de liberación
Permeabilidad en células MDCK Ensayos In Vivo
Rayos X
Se desarrollaron nanopartículas lipídicas conteniendo CBZ con características óptimas de tamaño, forma y permeabilidad, capaces de liberar la droga de manera sostenida, y con actividad antiepiléptica más prolongada respecto a una solución de la droga libre. Dicho desarrollo abre las puertas a nuevas alternativas para afrontar las limitaciones actuales de los FAEs en el tratamiento de la epilepsia refractaria.
Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata (11/X545 y PRH 5.2 - Concejo
Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET- PICT 0498) - Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (PICT
2011-2116, PICT 2013.3175)
