SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-6 DAN UJI …Sintesis Senyawa Turunan Arilamida-6 (diadaptasi dari...

SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-6 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO

TERHADAP ENZIM MATRIX METALLOPROTEINASE - 9 (MMP-9)

SEBAGAI KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

Program Studi Farmasi

Diajukan oleh :

Sangga Putra Dewa

NIM : 158114128

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2019

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-6 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO

TERHADAP ENZIM MATRIX METALLOPROTEINASE - 9 (MMP-9)

SEBAGAI KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

Program Studi Farmasi

Diajukan oleh :

Sangga Putra Dewa

NIM : 158114128

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2019


ii


iii


iv

HALAMAN PESEMBAHAN

The World Is Filled With Nice People.

If You Can't Find One Be One

-SOPO GAWE NGANGGO-

KARYA INI KUPERSEMBAHKAN KEPADA:

TUHAN YANG MAHA ESA YANG SELALU MEMBERKATI DAN MEMBERIKAN

RAHMAT BERLIMPAH DIMANA PUN DAN KAPAN PUN SAYA BERADA.

IBU DAN KAKAK YANG SELALU MEMBERIKAN DOA, NASIHAT, SEMANGAT DAN

YANG SELALU MEMBERIKAN YANG TERBAIK BAGI DIRIKU

SAHABAT DAN TEMAN-TEMAN ANGKATAN 2015 YANG MEMBERIKAN

DUKUNGAN DAN HIBURAN

SERTA

ALMAMATER TERCINTA : UNIVERSITAS SANATA DHARMA.


v


vi


vii

PRAKATA

Puji dan Syukur penulis haturkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena

atas berkat dan rahmat-Nya, skripsi yang berjudul “Sintesis Turunan Arilamida-6

Dan Uji Aktivitas In Vitro Terhadap Enzim Matrix Metalloproteinase - 9 (MMP-

9) Sebagai Kandidat Anti-Kanker Payudara” dapat selesai dengan baik dan pada

waktu yang tepat. Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian Maywan

Hariono, Ph.D., Apt. yang didanai oleh Indonesia Torray Foundation periode

2017/2018 dengan judul “ Synthesis,Enzyme assay, and Molecular Modelling of

Purin Derivatives Targeting Hemopexin Domain of Matrix Metalloproteinase-9

(PEX-9) in the Discovery of Novel Anti-Breast Cancer”. Skripsi ini merupakan

salah satu syarat untuk mendapatkan gelar sarjana Farmasi (S. Farm) di

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Proses penyusunan skripsi ini melibatkan banyak pihak, baik secara

langsung atau pun secara tidak langsung. Pada kesempatan ini, penulis

mengucapkan terima kasih kepada:

1. Dr. Yustina Sri Hartini, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta

2. Dr. Christine Patramurti, Apt., selaku Kepala Program Studi Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta

3. Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing skripsi “Sintesis

Turunan Arilamida-6 Dan Uji Aktivitas In Vitro Terhadap Enzim Matrix

Metalloproteinase - 9 (MMP-9) Sebagai Kandidat Anti-Kanker Payudara”

yang telah membimbing tim penelitian dengan sangat sabar dan dapat

meluangkan waktunya untuk penyusunan naskah skripsi penelitian ini.

4. Dr. Christine Patramurti, Apt., dan Damiana Sapta Candrasari, S.Si. M.Sc.

selaku dosen penguji yang telah memberikan arahan dan masukan yang

membangun terbentuknya naskah skripsi ini dari awal hingga akhir penelitian

ini.

5. Pak Parlan (Laboran Laboratorium Kimia Organik), Pak Kunto (Laboran

Laboratorium Kimia Analisis), dan Mas Bimo (Laboran Laboratorium Kimia

Analisis Instrumen).


viii


ix

ABSTRAK

Kanker adalah pertumbuhan sel atau jaringan yang tidak terkendali

sehingga sel tersebut akan terus tumbuh dan menyerang ke tempat lain yang jauh

dari tempat semula yang disebut sebagai metastasis. Enzim yang berperan

mendegrasi Extra Cellular Matrix sehingga sel dapat bermetastasis adalah MMP.

MMP-9 ditemukan banyak diekspresikan pada kanker payudara tipe triple

negative & HER-2 Positive. MMP inhibitor yang sudah dikembangkan

bermasalah pada selektivitasnya karena menarget catalytic domain sehingga

menyebabkan efek samping seperti sindrom muskuloskeletal. Penelitian

sebelumnya menemukan senyawa yang aktif menarget MMP-9 pada sisi yang

lebih selektif yaitu hemopexin domain. Pada penelitian ini disintesis senyawa

arilamida-6 yang didesain berdasarkan farmakofor senyawa aktif dari senyawa

penuntun yaitu arilamida dan rantai alkil. Senyawa arilamida tersebut disintesis

melalui reaksi substitusi nukleofilik asil dari sulfametazin dengan 3-

bromopropionil klorida dengan katalisator piridin pada suhu kamar. Senyawa

hasil sintesis dipastikan strukturnya dengan metode spektroskopi yaitu FTIR,

NMR dan MS. Senyawa hasil sintesis selanjutnya diuji hambatannya terhadap

aktivitas MMP-9 in vitro. Hasil penelitian menunjukkan senyawa turunan

arilamida 6 memiliki persen penghambatan sebesar 57 % pada konsentrasi IC50

sebesar 411 µM. Kesimpulannya arilamida-6 mempunyai aktivitas yang poten

menghambat MMP-9 sehingga berpeluang sebagai kandidat anti kanker payudara.

Kata kunci : Arilamida, Kanker, MMP-9, Sintesis, Uji Aktivitas,.


x

ABSTRACT

Cancer is an uncontrolled cell growth that expands to grow and attack

other areas far away from the origin, called as metastasis. Enzyme which acts to

degrade Extra Cellular Matrix leading to metastasis is MMP. MMP-9 was found

to be extremely expressed in triple negative & HER-2 Positive breast cancer.

MMP inhibitors that have been developed but having problems with their

selectivity because they target catalytic domain which cause side effects such as

musculoskeletal syndrome. Previous study had found active compounds targeting

MMP-9 on the more selective site i.e. hemopexin domain. In this study, arilamide-

6 was designed basing on the structure of the lead compounds having arylamide

and alkyl chains as the pharmacophores. This compound was synthesized through

a nucleophilic acyl substitution from sulfametazine with 3-bromopropionyl

chloride with a pyridine as the catalyst at room temperature. The compound was

confirmed by using FTIR, NMR and MS and then tested for its activity to inhibit

MMP-9 in vitro. The results showed that arylamide-6 had a percentage inhibition

of 57% with IC50 of 411 µM. In conclusion, arilamide-6 has a potent activity to

inhibit MMP-9 and thus has an opportunity as an anti-breast cancer candidate.

keyword : Arylamid, Cancer , MMP-9, Synthesis , In vitro assay.


xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN SAMPUL ………………………………………………. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING……………………….. ii

HALAMAN PENGESAHAN …………………………………….…… iii

HALAMAN PERSEMBAHAN………………………………………… iv

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI…………… v

PRAKATA…………………………………………………….…...…… vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA……………………………..… viii

DAFTAR ISI………………………………………………………..….. ix

DAFTAR TABEL……………………………………………………... x

DAFTAR GAMBAR……………………………………………….….. xi

DAFTAR LAMPIRAN………………………………………………... xii

ABSTRAK……………………………………………………………… xiii

ABSTRACT……………………………………………..…………….… xiv

PENDAHULUAN……………………………………………………... 1

METODE PENELITIAN……………………………………………… 3

HASIL DAN PEMBAHASAN………………………………………... 5

KESIMPULAN………………………………………………………... 19

SARAN……………………………………………………………........ 19

UCAPAN TERIMA KASIH………………………………………........ 19

DAFTAR PUSTAKA………………………………………………….. 20

LAMPIRAN…………………………………………………………… 22

PROFIL PENULIS…………………………………….………………. 33


xii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel. I Hasil uji kelarutan produk sintesis …………………………… 9

Tabel II. Perhitungan % inhibisi senyawa arilamida-6 ……………..…. 17


xiii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Stuktur Compound 2 dengan menunjukkan gugus fungsi

yang penting (Dufour et al., 2011)…………………….…..

2

Gambar 2. Reaksi Substitusi Nukleofilik Asil antara sulfametazin dan

3-bromopropionil klorida dengan katalis piridin………….

6

Gambar 3. Reaksi penetralan produk hasil sintesis oleh Na2CO3 6

Gambar 4. (a) sulfametazin (b) produk hasil sintesis setelah dilakukan

pencucian dan penetralan pH……………..…………….…

7

Gambar 5. Hasil KLT produk hasil sintesis …………………….…… 8

Gambar 6. Hasil spektrum 1H-NMR produk sintesis…………..….….. 11

Gambar 7. Hasil spektrum 13

C-NMR produk hasil sintesis………..…. 13

Gambar 8. Spektrum inframerah produk sintesis………….………….. 14

Gambar 9. Spektrum inframerah sulfametazin…………………….…. 14

Gambar 10. Kromatogram GC arilamida-6 dengan intensitas masing-

masing puncak A (10.9 %), B (5,4%), C (4,6%), D (7,8%),

E ( 52,3%) , F (5,4%) , dan G (13,2 %).……..…………...

15

Gambar 11. Spektrum massa produk hasil sintesis…...…………...…… 16

Gambar 12. Substrat terikat dengan gugus fluofor sehingga ketika

terpotong oleh enzim (MMP-9), gugus fluofor akan

terlepas dari substrat dan terbaca fluorosensinya oleh

spektrofluorometri (diadaptasi dari Nicolotti, 2012)……...

17

Gambar 13. Kurva log hubungan konsentrasi arilamida-6 dengan

persen inhibisi…...…………………….…………………...

19


xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Produk hasil sintesis setelah distirer selama 30 menit…… 22

Lampiran 2. Mekanisme reaksi DAB HCl dengan sulfametazin ….….. 22

Lampiran 3. Wujud warna produk dibandingkan dengan sulfametazin

setelah direaksikan dengan DAB HCl...………....……….

23

Lampiran 4. Perhitungan bahan dan hasil rendemen senyawa turunan

arilamida-6…………………………………………….….

23

Lampiran 5. Perbesaran spektrum proton HA dan HB………................. 25

Lampiran 6. Perbesaran spektrum proton HC dan HD ………...…......... 26

Lampiran 7. Perbesaran spektrum proton HF ……………..……..……. 26

Lampiran 8. Mekanisme fragmentasi Sulfamida m/z 65 dan m/z 349… 27

Lampiran 9. Mekanisme fragmentasi base peak m/z 200………..……. 27

Lampiran 10. Tata letak 96-microwell plate uji aktivitas in vitro …...…. 28

Lampiran 11. Perhitungan IC50 arilamida-6…………………………..… 28


1

PENDAHULUAN

Kanker adalah pertumbuhan sel atau jaringan yang tidak terkendali

sehingga sel tersebut akan terus tumbuh (American Cancer Society, 2018). Jika

kanker sudah berada pada tahap akhir, sel kanker dapat berpindah dan menyerang

ke tempat lain yang jauh dari tempat semula yang disebut sebagai metastasis

(Welch et al., 2000). Proses metastasis disebabkan oleh adanya interaksi yang

tidak terkendali antara sel kanker malignant dengan komponen dari matriks

ekstraseluler (Extra Cellular Matrix = ECM). Terdapat suatu enzim yang disebut

matrix metalloproteinase (MMP) yang termasuk dalam famili endopeptidase.

Enzim tersebut berperan dalam memodulasi komposisi dan integritas dari ECM

sehingga ECM akan terdegrasi. Menurut Yousef et al (2014), peningkatan MMP-

9 yang signifikan ditemukan pada sel payudara yang terkena kanker dibandingkan

dengan sel payudara normal. Studi tersebut menyimpulkan bahwa ekspresi

berlebihan MMP-9 merupakan ciri khas dari perkembangan kanker payudara tipe

triple-negative dan HER2-positive (Yousef et al., 2014).

Pada kondisi normal, ekspresi MMP-9 yang berlebih akan dikontrol oleh

inhibitor alami yaitu Tissue Inhibitor Metalloproteinase (TIMP). Namun pada

kondisi karsinogenesis, jumlah TIMP tidak mencukupi sehingga memerlukan

inhibitor dari luar (Brew dan Nagase, 2010). Untuk menghambat aktivitas MMP

tersebut, terdapat beberapa penghambat MMP yang telah diuji klinis sampai fase

III namun bermasalah karena selektivitasnya yang menarget catalytic domain.

Marimastat adalah contoh penghambat MMP yang pada uji klinis menunjukkan

efek samping berupa sindroma muskuloskeletal (Khalid dan Javaid, 2016). Efek

samping tersebut disebabkan oleh kemiripan struktur dari MMP itu pada bagian

catalytic domain sehingga tidak hanya MMP-9 saja yang dihambat, namun juga

MMP lain yang secara normal dibutuhkan oleh tubuh untuk proses fisiologi yang

sudah disebutkan diatas juga akan dihambat (Cathcart et al., 2015).

Penelitian terbaru melaporkan, salah satu domain dari MMP-9 yaitu

hemopexin mempunyai struktur berbeda di antara semua MMP. Hal ini menarik

untuk dijadikan target dalam penemuan obat anti kanker karena bersifat lebih

selektif Dufour et al., (2011) Ugarte-Berzal, et al., (2016).


2

Pada penelitian yang dilakukan oleh Dufour et al. (2011) menemukan

senyawa dari zinc database dengan kode zinc 135415473 (~{N}- [4-

(difluoromethoxy) phenyl]-2- [(6-oxo)-4- propyl-1~{H}- pyrimidin-2-yl)

sulfanyl] acetamide; www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) yang kemudian disebut

Compound 2 yang merupakan senyawa yang paling aktif dengan Kd = 2,2 μM.

Aktivitas penghambatan PEX-9 tersebut diprediksi berdasarkan keberadaan cincin

planar yang berinteraksi dengan kantung aktif pada struktur blade PEX-9 dan aril

amida yang berikatan di daerah sekitar permukaan luar kantung aktif. Struktur

compound 2 disajikan pada Gambar 1a.

(a)

(b) (c)

(d)

Gambar 1. Struktur molekul (a) Compound 2, (b) Adipandhito (2017), (c) Ludji (2017),

dan (d) turunan arilamida-6

Penelitian Alford et al., (2017) juga menemukan senyawa aktif merujuk

pada senyawa Dufour dengan Kd = 320 nM. Adhipandito (2017) dan Ludji (2017)

telah mensintesis senyawa (1b dan 1c) yang juga mengadaptasi farmakofor

Rantai

alkil

Gugus

Arilamida Cincin planar


3

compound 2 yaitu arilamida dan rantai alkil yang mempunyai aktivitas

penghambatan masing-masing 11% dan 67%. Senyawa 1b lebih aktif daripada 1a

mungkin disebabkan adanya EWG pada posisi para sehingga menarik untuk

dilakukan eksplorasi pada bagian tersebut. Pada penelitian ini akan disintesis

fragmen dari Compound 2 yaitu aril amida yang diperpanjang dengan rantai alkil

beserta gugus penarik elektron pada posisi para dari cincin aril amida yang akan

diberi nama arilamida-6. Senyawa tersebut mempunyai 2 farmakofor yaitu

arilamida dan rantai alkil beserta tambahan gugus penarik elektron berupa

sulfonamida-4,6-dimetilpirimidin. Oleh karena itu, senyawa arilamida-6

diprediksi mempunyai aktivitas penghambatan terhadap enzim MMP-9 karena

memodifikasi gugus fungsional pada posisi para dengan gugus sulfonamida

dimetil pirimidin. Karakter EWG diwakili oleh cincin pirimidin dan SO2 dan EDG

diwakili oleh gugus NH.

METODE PENELITIAN

Bahan

Kecuali dinyatakan lain, semua bahan kimia yang digunakan bermutu

analisis yang disuplai oleh Sigma Aldrich dan Merck. Bahan utama yang

digunakan untuk sintesis adalah sulfametazin (4-amino-N-(4,6-

dimethylpyrimidin-2-yl)benzenesulfonamide), 3-bromopropionil klorida, piridin,

plat silika gel GF254, n-heksana, etil asetat, dimetilaminobenzaldehid HCl (DAB-

HCl),Na2CO3 dan aquadest. Bahan untuk elusidasi struktur yaitu pellet kalium

bromida untuk FTIR dan pelarut DMSO-D6 untuk NMR. Bahan untuk uji in vitro

yaitu kit enzim MMP-9 (Biovision) terdiri dari enzim MMP-9 manusia yang

diliofilisasi, substrat peptida, bufer, peptida NNGH (asparagin-asparagin-glisin-

histidin) sebagai kontrol positif, gliserol untuk mengencerkan enzim, dan

dimetilsulfoksida sebagai pelarut sampel.

Alat Penelitian

Labu alas bulat (pyrex),Timbangan analitik (Mettler Toledo®), pompa

vakum (GAST model DOA-P504-BN), dan oven (Memmert GmbH+Co.KG),

alat uji titik lebur (Mettler Toledo®), lampu UV254 dan alat gelas pada umumnya.


4

Alat untuk elusidasi struktur: spektrofotometer inframerah (Shimadzu),

spektrometer Nuclear Magnetic Resonance (Bruker 176 dan 700 MHz), dan

spektrometer massa (Waters® Xevo®). Pengujian dengan spektrometer Nuclear

Magnetic Resonance dilakukan di Institut Farmasetikal dan Nutrasetikal Malaysia

sedangkan Pengujian dengan spektrometer inframerah dan massa dilakukan di

Fakultas MIPA Kimia UGM. Alat untuk uji in vitro pipet mikro (Eppendorf),

micro well plate 96, pipet tips, inkubator, vortex, ELISA microplate reader

fluorescence. Uji bioassay dilakukan di Laboratorium Sentral Universitas

Padjajaran.

Tata Cara Penelitian

Sintesis Senyawa Turunan Arilamida-6 (diadaptasi dari Arifiyanto, 2001)

Dalam labu alas bulat dimasukkan sulfametazin sebanyak 3,59 mmol (0,99

mg) kemudian ditambahkan piridin sebagai katalisator sebanyak 3,59 mmol (0,43

mL). Campuran diaduk selama 10 menit pada suhu kamar lalu diteteskan secara

bertahap 3-bromopropionil klorida sebanyak 4,00 mmol (0,61 mL). Campuran

diaduk kembali selama 30 menit dan dimonitor dengan KLT. Hasil sintesis

dimurnikan dengan cara menyaring campuran dilanjutkan dengan pencucian

dengan Na2CO3 hingga pH netral lalu dibilas berkali-kali dengan aquadest.

Padatan dikeringkan lalu dilakukan uji pendahuluan

Uji Pendahuluan

Produk hasil sintesis dilakukan uji kimiawi dengan DAB-HCl. Senyawa

lalu diuji dengan kromatografi lapis tipis (KLT) fase diam plat silika gel GF254

dan fase gerak n-heksana: etil asetat (1:3). Kemudian dilakukan uji organoleptis

(bentuk dan warna), titik lebur, kelarutan dan dihitung rendemennya. Setelah itu

dilakukan elusidasi struktur dengan metode spektroskopi inframerah, spektroskopi

NMR (1H-NMR dan

13C-NMR) dan GC-MS (kromatografi gas-spektrofotometri

massa).

Uji aktivitas in vitro

Kit enzim MMP-9 mengandung enzim MMP-9 yang terliofilisasi, substrat

FRET-based MMP-9, bufer uji MMP-9 dan NNGH inhibitor sebagai kontrol

positif. Enzim yang terliofilisasi direkonstitusi dengan 110 µL gliserol 30% dalam


5

deionised water. Enzim yang sudah terekonstitusi diencerkan dalam 550 µL bufer

dan siap digunakan untuk pengujian. Senyawa sampel disiapkan dengan cara

dilarutkan dalam DMSO dengan konsentrasi akhir 200 µg/mL di dalam 96-

microwell plate. Konsentrasi final DMSO dalam wellplate tidak lebih dari 2%.

Sampel 1 µL dicampurkan dengan bufer 44 µL dan enzim 5 µL/wellplate.

Campuran diinkubasi dalam suhu 37ºC selama 30 menit. Substrat (50 µM) dengan

volume 50 µL/wellplate ditambahkan ke dalam campuran dan diinkubasi dalam

suhu 37ºC selama 60 menit. Fluorosensi dibaca menggunakan Tecan(infinite

200Pro) Microplate Reader dengan panjang gelombang 325/393 nm. Perhitungan

dari IC50 dibuat dengan menyiapkan 4 seri larutan dengan konsentrasi yang

berbeda.

Larutan seri dibuat empat seri konsentrasi 50, 100, 200, dan 300 µg/ml.

Setelah itu akan didapatkan kurva antara konsentrasi sampel dengan presentase

penghambatan enzim. Berdasarkan kurva tersebut akan didapatkan persamaan

regresi non linier polinomial y=ax2+bx+ c yang digunakan untuk menghitung

IC50.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Sintesis senyawa turunan arilamida-6

Sintesis senyawa turunan arilamida dilakukan dengan mereaksikan

sulfametazin dan 3-bromopropionil klorida dengan katalisator piridin melalui

reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA). Reaksi substitusi adalah reaksi kimia yang

melibatkan penggantian gugus pergi dari suatu senyawa dengan gugus fungsi

yang lain (Smith dan March, 2007). Sulfametazin dipilih karena memiliki gugus

amina primer yang berikatan dengan benzena sehingga dapat membentuk gugus

arilamida dan memiliki gugus EDG dan EWG yang akan ditelusuri pengaruh

aktivitas penghambatannya. Karakter EWG diwakili oleh cincin pirimidin dan

SO2 dan EDG diwakili oleh gugus NH. Dipilih senyawa 3 bromopropionil klorida

karena memiliki gugus karbonil dan gugus klorida sebagai gugus pergi yang baik.

Meskipun Cl adalah gugus pergi yang baik, namun sifat elektronegatifnya

menyebabkan masih terikat pada C karbonil yang bersifat elektro positif sehingga

memerlukan katalisator piridin untuk mempercepat lepasnya gugus pergi. Selain


6

itu piridin dipilih karena tidak menghidrolisis produk amida yang terbentuk.

Reaksi sulfametazin dengan 3-bromopionil klorida membentuk senyawa turunan

arilamida-6 dengan katalis piridin akan disajikan pada Gambar 2.

Gambar 2. Reaksi Substitusi Nukleofilik Asil antara sulfametazin dan 3-bromopropionil

klorida dengan katalis piridin

Uji pendahuluan

Produk awal hasil sintesis berwarna kuning jingga dan berbentuk padatan

(lampiran 1) yang kemudian dinetralkan menggunakan Na2CO3 dan dicuci dengan

H2O. Penetralan tersebut bertujuan menghilangkan produk samping yaitu HCl

agar tidak menghidrolisis produk sedangkan pencucian bertujuan untuk

menghilangkan produk hasil penetralan berupa NaCl dan sisa piridin yang tidak

ikut bereaksi. reaksi pencucian produk hasil sintesis akan disajikan pada gambar

3.

Gambar 3. Reaksi penetralan produk hasil sintesis oleh Na2CO3

Bahan awal yaitu sulfametazin berwarna putih (Gambar 4a) sedangkan

senyawa yang terbentuk berwarna kuning (Gambar 4b). Perbedaan warna tersebut

mengindikasikan bahwa senyawa berhasil disintesis. Hal ini disebabkan oleh

perpanjangan kromofor pada produk hasil sintesis, sehingga menjadi berwarna

kuning. Kemudian uji pendahuluan dilakukan dengan reaksi warna DAB HCl


7

untuk mengetahui amina yang sudah tersubstitusi. Senyawa yang memiliki gugus

amina primer akan bereaksi dengan DAB membentuk basa Schiff berwarna

jingga, sedangkan amina yang sudah tersubstitusi tidak akan bereaksi (Adegoke,

2011). Hasil percobaan menunjukkan bahwa produk hasil sintesis sudah tidak

berwarna jingga mengindikasikan sudah tersubstitusinya gugus amina primer dari

sulfametazin. Mekanisme reaksi DAB HCl dengan sulfametazin disajikan pada

Lampiran 2 sedangkan wujud warna produk dibandingkan dengan sulfametazin

setelah direaksikan dengan DAB HCl dapat dilihat pada lampiran 3.

(a) (b)

Gambar 4. (a) sulfametazin (b) produk hasil sintesis setelah dilakukan pencucian dan

penetralan pH.

Uji kualitatif yang kedua dilakukan dengan uji KLT yang menunjukkan

perbedaan Rf antara produk hasil sintesis ( Rf 0,59 ) dengan sulfametazin ( Rf

0,57). walaupun perbedaannya tidak signifikan, namun masih diyakini bahwa

produk sintesis sudah terbentuk. Kemiripan nilai Rf tersebut diduga karena

polaritas terhadap sistem KLT antara kedua sampel adalah tinggi. Pada produk

hasil sintesis meskipun terdapat penambahan gugus yang bersifat non polar yaitu

gugus etilen namun diimbangi dengan penambahan gugus yang bersifat polar

yaitu gugus C karbonil dan atom Br. Optimasi lebih lanjut diperlukan untuk

menentukan sistem KLT yang sesuai. Berdasarkan hasil uji KLT (Gambar 5)

dapat diamati bahwa senyawa target yang dielusi menggunakan fase n-heksana :

etil asetat (3:1) memiliki profil noda yang berbeda dibanding sulfametazin.


8

Gambar 5. Hasil KLT produk hasil sintesis

Senyawa kemudian diuji titik lebur untuk mengetahui jarak lebur antara

senyawa target dengan sulfametazin. Jika terdapat perbedaan antara sulfametazin

dengan senyawa hasil sintesis maka prediksi bahwa arilamida-6 sudah terbentuk

semakin kuat. Selain itu, jarak lebur mengindikasikan kemurnian suatu senyawa

yang apabila berjarak antara 0,5-1,5°C maka dinyatakan murni secara titik lebur

(Mohrig et al., 2014). Kemudian didapatkan bahwa senyawa target memiliki titik

lebur yang berbeda dengan senyawa awal yaitu sebesar 236,2-238,3°C sedangkan

sulfametazin sebesar 198- 199°C (O‟neil et al., 2001). Senyawa target memiliki

jarak lebur 2,1°C yang berarti senyawa belum murni. Hal ini disebabkan karena

proses pemurnian yang kurang optimal.

Rendemen produk sebesar 89,65 %. Hasil perhitungan rendemen

ditunjukkan pada Lampiran 4. Rendemen yang didapatkan tinggi karena gugus –

Cl merupakan gugus pergi yang baik sehingga mempermudah serangan

nukleofilik dari sulfametazin. Selain berasal dari produk hasil sintesis, hasil

rendemen yang ditinggi diduga karena adanya impurities, terbukti dari hasil uji

titik lebur yang berjarak >1,5 °C.

Produk hasil sintesis kemudian diuji kelarutannya. Hasil uji kelarutan

produk sintesis ditunjukkan pada Tabel I.

4,7

cm

Rf Sulfametazin = 2,7

cm /4,7 cm = 0,57

Rf produk = 2,8 cm /4,7

cm = 0,59

2,7

cm

2,8

cm

SMZT TARGET


9

Tabel I. Hasil uji kelarutan produk hasil sintesis

Pelarut Kelarutan Produk Hasil Sintesis

Etanol Tidak larut

Etil Asetat Tidak larut

Kloroform Tidak larut

n-heksana Tidak larut

Asetonitril Tidak larut

Aseton Agak sukar larut (1:80)

DMSO Larut (1:20)

Elusidasi struktur

Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti 1H

Kerangka hidrokarbon senyawa hasil sintesis ditentukan dengan

spektroskopi NMR yang terdiri dari 1H dan

13C. Gambar 6 adalah hasil spektrum

1H-NMR produk sintesis. Sinyal pada geseran kimia 2,00–3,00 ppm merupakan

daerah proton alkil (Vollhardt dan Schore, 2014). Sinyal pada geseran kimia 2,30

ppm (integrasi= 6) merupakan sinyal dari proton HE. HE adalah proton dimetil

pada gugus pirimidin karena berbentuk singlet dan memiliki integrasi 6. Hal ini

telah sesuai dengan teori, karena proton ini tidak memiliki tetangga yang ekivalen

secara magnetik.

Sinyal pada geseran kimia 2,98 ppm (integrasi= 2) (J= 6,3 Hz) dan 2,99

ppm (integrasi= 2) (J= 6,3 Hz) menunjukan sinyal dari proton HB, sedangkan

sinyal yang terdapat pada geseran kimia 3,73 ppm (integrasi= 2) (J= 6,3 Hz) dan

3,71 ppm (integrasi= 2) (J= 6,3 Hz) menunjukan sinyal dari proton HA. Proton

HA merupakan proton yang terdapat pada rantai alkil yang berdekatan dengan

atom halogen (Br), sedangkan proton HB merupakan proton yang terdaopat pada

rantai alkil yang berdekatan dengan gugus karbonil. Proton HA terdapat pada


10

geseran kimia yang lebih jauh daripada proton HB, karena berdekatan dengan

atom Br yang bersifat lebih elektronegatif dibandingkan dengan gugus karbonil

pada amida sehingga proton HA kurang terlindungi dari medan magnet luar (de-

shielded). Kedua sinyal tersebut menunjukkan sinyal triplet karena dapat

merasakan 2 atom H pada tetangga sebelahnya . Perbesaran spektrum proton HA

dan HB ditunjukkan pada Lampiran 5.

Sinyal pada geseran kimia 7,00–8,00 ppm merupakan daerah proton

aromatic (Vollhardt dan Schore, 2014). Pada geseran kimia tersebut ditemukan 2

sinyal yaitu pada 7,75 ppm (integrasi= 2) (J= 9,1 Hz); dan 7,92 ppm (integrasi= 2)

(J= 9,1 Hz); (integrasi 2). Sinyal pada geseran kimia 7,92 ppm menunjukkan

proton HD, sedangkan sinyal pada geseran kimia 7,75 ppm merupakan proton HC.

Proton HC dan HD merupakan proton yang terletak pada gugus benzena cincin

arilamida. Proton HD kurang terlindungi (de-shielded) dibandingkan dengan

proton HC, karena proton HD berada pada lingkungan kimia yang berdekatan

dengan gugus O=S=O yang memiliki karakter EWG lebih kuat dibandingkan

dengan gugus NH yang berdekatan dengan proton HC. Sinyal pada geseran kimia

7,92 ppm dan 7,75 ppm menunjukkan sinyal ganda (doublet). Hal ini telah sesuai

dengan teori, karena memiliki satu proton tetangga dalam lingkungan kimia yang

berbeda. Perbesaran spektrum proton HC dan HD ditunjukkan pada Lampiran 6.

Sinyal pada geseran kimia 8,31 ppm (integrasi 1) (J= 4,9 Hz)

menunjukkan proton HF yang berada pada cincin pirimidin dengan menunjukkan

sinyal triplet. Dalam hal pola splitting, Hal ini tidak sesuai dengan teori yang

seharusnya muncul sebagai sinyal singlet karena tidak memiliki proton tetangga

dengan lingkungan kimia yang berbeda. Perbedaan hasil sinyal ini disebabkan

oleh fenomena long range coupling. Fenomena ini terjadi karena antara proton HF

dan atom H pada kedua metil HE terhubung oleh rantai hidrokarbon yang

membentuk seperti huruf „W‟, sehingga jaraknya semakin mendekat dan dapat

merasakan proton tetangga yang jauh. Proton ini muncul sebagai triplet, karena

bisa merasakan dua proton tetangga yang berasal dari proton HE dimetil yang

terdapat pada cincin pirimidin (Dona et al., 2016). Perbesaran spektrum proton HF

ditunjukkan pada Lampiran 7.


11

Gambar 6. Hasil spektrum 1H-NMR produk sintesis.

Spektrometri Resonansi Magnetik Inti 13

C

Pada 13

C-NMR, pembacaan hanya dapat diindikasikan dari geseran

kimianya. Sedangkan splitting, integrasi, dan J coupling constant tidak dapat

digunakan sebagai indikator pembacaan karena 13

C memiliki momen magnetik

yang rendah yaitu sebesar 67,28% radians/Tesla dan kelimpahan 13

C di alam

sangat kecil, yaitu sebesar 1,08% sehingga menyebabkan pola splitting dan

integrasi menjadi tidak spesifik (Pavia et al., 2015). Gambar 7 adalah hasil

spektrum 13

C-NMR produk sintesis. Berdasarkan tabel geseran kimia spektrometri

resonansi magnetik inti 13

C, rantai alkil terletak pada rentang geseran kimia 10,0-

60,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014). Atom CK berada pada geseran kimia 23,8

ppm yang menunjukkan atom C pada alkil yang berdekatan dengan gugus

benzena pirimidin. Berdasarkan tabel geseran kimia, atom C yang terikat pada

atom Br akan berada pada rentang 30,00-60,00 (Vollhardt dan Schore, 2014).

Hasil pada spektrum sudah sesuai dengan tabel yaitu atom CA yang berikatan


12

dengan atom Br berada pada geseran kimia 40,7 ppm. Sedangkan atom CB yang

berada pada geseran kimia 29,3 ppm yang menunjukkan atom C yang berdekatan

dengan gugus karbonil pada amida, cenderung lebih terlindungi karena tidak

berikatan langsung dengan gugus halogen Br.

Pada gugus benzena yang tersubstitusi, geseran kimia berada pada

rentang 120,0-160,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014). Atom CD, CE, CF, dan CG

merupakan atom C yang terletak pada gugus benzena cincin arilamida. Atom CE

berada pada geseran kimia 118,7 ppm, sedangkan atom CF pada 129,5 ppm. Atom

CE lebih terlindungi dibandingkan dengan atom CF, karena atom CF terletak

berdekatan dengan gugus O=S=O yang memiliki karakter EWG lebih kuat

dibandingkan dengan gugus NH yang berdekatan dengan atom CE. Atom CD

berada pada geseran kimia 143,1 ppm, sedangkan atom CG pada 158,1 ppm. Atom

CG kurang terlindungi dibandingkan dengan atom CD, hal ini juga disebabkan

karena atom CG berdekatan dengan gugus O=S=O yang memiliki karakter EWG

lebih kuat dibandingkan dengan gugus NH yang berdekatan dengan atom CD.

Pada cincin pirimidin, terdapat atom CH, CI,dan CJ yang secara berturut-

turut ditunjukkan dengan geseran kimia 157,0 ppm; 130,4 ppm; dan 112,6 ppm.

Atom CJ paling terlindungi dibandingkan dengan atom C lainnya pada benzena

pirimidin, karena atom CK tidak berdekatan dengan atom elektronegatif. Dua atom

CI lebih terlindungi dibandingkan dengan atom CH . Hal ini disebabkan, karena

gugus metil bersifat EDG sehingga atom CI akan terlindungi dari medan magnet

luar. Atom CH paling tidak terlindungi (de-shielded), karena atom CH berikatan

dengan atom N heterosiklik yang bersifat EWG dan amina .

Hasil spektra produk sintesis menunjukkan bahwa atom C pada amida

berada pada geseran kimia 169,4 ppm yaitu atom CC . Hal ini telah sesuai dengan

teori, yaitu C karbonil (C=O) amida akan berada pada rentang geseran kimia

150,0-180,0 ppm (Silverstein et al., 2005).


13

Gambar 7. Hasil spektrum 13

C-NMR produk sintesis

Berdasarkan analisis 1H-NMR dan

13C-NMR, dapat disimpulkan bahwa

struktur hidrokarbon produk sintesis sudah sesuai dengan struktur arilamida-6.

Spektroskopi Inframerah

Spektroskopi Inframerah digunakan untuk melihat gugus fungsi yang ada

didalam suatu senyawa. Spektroskopi Inframerah hanya dapat mendeteksi gugus

fungsional yang memiliki momen dipol yang besar. Spektrum inframerah dibagi

menjadi 2 daerah yaitu daerah sidik jari (500-1500 cm-1

) dan daerah fundamental

(1500 cm-1

-4000 cm-1

). Daerah sidik jari merupakan identitas yang dimiliki oleh

setiap senyawa organik sehingga akan berbeda pada setiap senyawa. Daerah

fundamental merupakan daerah yang akan menunjukkan gugus fungsional yang

terdapat pada setiap senyawa. Hasil analisis spektrum produk sintesis disajikan

pada Gambar 8. Berdasarkan spektrum inframerah yang diperoleh, terdapat pita

pada daerah sekitar bilangan gelombang (ῡ) 1597,06 cm-1

yang menunjukan gugus

C karbonil (C=O). C=O tersebut merupakan C=O amida karena pada daerah

3379,29-3448,72 cm-1

terdapat pita melebar yang diduga sebagai NH amida. Hasil


14

spektra juga didukung dengan pembacaan yang berbeda baik pada daerah sidik

jari maupun daerah fundamental pada sulfametazin sebagai bahan baku. Pada

spektrum sulfametazin tidak ditemukan pita ulur tajam pada daerah 1600 cm-1

dan

pada bilangan gelombang 3300 cm-1

pita NH terlihat sebagai kembar, karena tidak

tersubstitusi. Spektrum inframerah sulfametazin akan disajikan pada Gambar 9.

Gambar 8. Spektrum inframerah produk sintesis

Gambar 9. Spektrum inframerah sulfametazin (diadaptasi dari Terry Mills III, 2005)

Pemeriksaan Kromatografi Gas-Spektra Massa

Elusidasi struktur menggunakan spektoskopi massa berguna untuk


15

mengetahui bobot molekul suatu senyawa. Sedangkan kromatografi gas berfungsi

untuk memisahkan senyawa hasil sintesis dari impurities sebelum dilakukan

deteksi menggunakan spektrometer massa. Produk hasil sintesis dapat

menggunakan kromatografi gas karena memiliki titik lebur <300°C, yaitu 236,2-

238,3°C. Dari uji pendahuluan titik lebur diperoleh jarak lebur > 1,5 °C yang

menandakan produk tidak murni. Hasil tersebut dibuktikan dengan kromatografi

gas produk hasil sintesis yang menunjukkan lebih dari 1 puncak. Pada

kromatogram kromatografi gas terdapat 7 puncak,namun hanya ada 1 puncak

yang dominan mengindikasikan produk yang diharapkan terbentuk. sudah sesuai

dengan Puncak pada menit ke 42 menunjukkan produk hasil sintesis yang

dideteksi massanya oleh spektrometer massa sebesar m/z 414. Kromatogram gas

dari senyawa target disajikan pada Gambar 10.

Gambar 10. Kromatogram GC arilamida-6 dengan intensitas masing-masing puncak A

(10.9 %), B (5,4%), C (4,6%) , D (7,8%), E ( 52,3%) , F (5,4%) , dan G (13,2 %).

Pada hasil elusidasi spektrometer massa, bobot molekul utuh produk

sintesis seharusnya 414. Namun pada hasil penelitian, bobot molekul produk

sintesis yang berhasil dideteksi menunjukkan bobot molekul per ion(m/z) terbesar

yaitu 349. Hilangnya massa per ion sebesar 65 diduga akibat produk hasil sintesis

yang memiliki gugus sulfoamida akan mengalami proses fragmentasi SO2 (m/z

65) diikuti dengan penataan ulang gugus amina pada posisi para dari benzena


16

(Sun et al., 2008). Hal ini menyebabkan m/z senyawa yang terdeteksi paling

kanan mengalami pengurangan m/z sebanyak 65. Mekanisme fragmentasi dan

penataan ulang ini dapat dilihat pada Lampiran 8. Fragmen yang tertinggi (base

peak) menunjukkan fragmentasi yang paling banyak terjadi dan stabil muncul

pada m/z 200. Mekanisme fragmentasi yang menghasilkan base peak dapat dilihat

pada Lampiran 9. Spektrum massa produk hasil sintesis dapat dilihat pada

Gambar 11.

Gambar 11. Spektrum massa produk hasil sintesis

Uji aktivitas In Vitro

Senyawa target kemudian diuji aktivitas penghambatan terhadap enzim

MMP-9 in vitro. Enzim MMP-9 yang memiliki aktivitas proteolitik karena

termasuk protease yang akan memotong ikatan peptida. Substrat pada pengujian

ini terikat dengan gugus fluofor sehingga ketika terpotong oleh MMP-9, gugus

fluofor akan terlepas dari substrat dan terbaca fluorosensinya oleh

spektrofluorometri pada panjang gelombang 325/393 nm (Nicolotti, 2012).

Kontrol negatif akan menghasilkan fluorosensi yang tinggi karena terdiri dari

enzim dan substrat tanpa adanya inhibitor sehingga akan menunjukkan aktivitas

enzim yang akan dianggap sebesar 100%, sedangkan kontrol positif dan sampel

akan menghasilkan fluorosensi yang lebih rendah dari kontrol negatif karena

menunjukkan adanya penghambatan pada aktivitas enzim. Ilustrasi pemotongan

ikatan peptida oleh enzim akan ditunjukkan pada gambar 12.


17

Gambar 12. Substrat terikat dengan gugus fluofor sehingga ketika terpotong oleh enzim

(MMP-9), gugus fluofor akan terlepas dari substrat dan terbaca fluorosensinya oleh

spektrofluorometri (diadaptasi dari Nicolotti, 2012)

Hasil fluorosensi sampel, kontrol negatif, dan kontrol positif dikurangi

dengan blanko akan didapatkan persentase aktivitas enzim dengan rumus

sedangkan persentase penghambatan enzim

didapatkan dengan rumus (100% - persentase aktivitas enzim (%)). Senyawa

arilamida-6 memiliki persen penghambatan sebesar 57% pada konsentrasi 200

µg/mL sehingga dapat dihitung IC50nya. IC50 merupakan konsentrasi terkecil dari

sampel yang dapat menghambat aktivitas enzim sedikitnya 50%. Nilai IC50

didapatkan dengan membuat 4 seri konsentrasi larutan, yaitu 50;100; 200; dan

300 µg/mL. Kemudian didapatkan persentase penghambatan dari masing-masing

konsentrasi. Data kemudian akan diolah menggunakan software Microsoft Excell

dengan membuat regresi non linear dengan nilai r2= 0,9945 . Berdasarkan regresi

non linear, diperoleh persamaan y = -195,71x2+1085,7 x – 1398,7. y adalah %

inhibisi dan x adalah konsentrasi. Kurva log hubungan konsentrasi arilamida-6

dengan persen inhibisi akan disajikan pada Gambar 13. Untuk menghitung nilai

IC50, angka 50 dimasukkan sebagai y sehingga diperoleh x sebagai log konsentrasi

minimal yang menghambat 50% aktivitas enzim MMP-9. Pada perhitungan

dihasilkan 2 nilai prediksi untuk IC50 yaitu X1 = 169,82 µg/mL dan X2 = 2041


18

µg/mL. dari kedua nilai X ,X1 mempunyai nilai yang lebih rasional karena masih

dalam rentang konsentrasi satu seri larutan sampel yaitu 50-300 µg/mL sehingga

X1 ditetapkan sebagai IC50 untuk turunan arilamida-6 dalam menghambat aktivitas

MMP-9. Satuan IC50 kemudian dikonversi ke µM karena merupakan senyawa

tunggal yaitu 411 µM. Senyawa dikategorikan : sangat aktif (konsentrasi yang

diperlukan <1 μM), aktif (1-25 μM), sedang (25-50 μM), rendah (50-100 μM),

sangat rendah (100-500 μM), dan inaktif (>500 μM) (Gubler et al., 2012).

Berdasarkan nilai IC50 yang digunakan, senyawa arilamida-6 memiliki aktivitas

yang sangat rendah, namun Zhu et al (2013) mengatakan terdapat 56 publikasi

penelitian menyatakan bahwa IC50 pada rentang 100-500 μM sudah dapat

dinyatakan aktif untuk studi pendahuluan. Sehingga disimpulkan bahwa senyawa

arilamida-6 aktif menghambat enzim MMP-9 in vitro. Perhitungan % inhibisi

senyawa arilamida-6 disajikan pada Tabel II.

Tabel II. Perhitungan % inhibisi senyawa arilamida-6

Sampel Reading 1 Reading 2 Reading 3 Purata reading

Blanko 9683 9349 9217 9416

Kontrol (-) 32989 33687 30321 32332

kontrol (+) 5946 5946 7898 6597

Senyawa

arilamida-6

24200 25023 20384 23202

Sampel Purata-blanko % aktivitas enzim % inhibisi

Blanko -

kontrol (-) 22916 100 0

kontrol (+) -2819 -12 112

arilamida-6 13786 43 57


19

y = -195.71x2 + 1085.7x - 1398.7R² = 0.9945

0

20

40

60

80

100

120

2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 2.70 2.80

Kurva Hubungan Log Konsentrasi Arilamida-6 dengan persen Inhibisi

Gambar 13. Kurva log hubungan konsentrasi arilamida-6 dengan persen inhibisi

KESIMPULAN

Hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa arilamida-6 dapat disintesis

dari Sulfametazin dan 3-bromopropionil klorida dengan katalis piridin melalui

mekanisme reaksi SNA. Senyawa turunan arilamida-6 memiliki aktivitas

penghambatan terhadap enzim MMP-9 setelah melalui uji in vitro Senyawa

arilamida-3 dapat menghambat aktivitas MMP-9 sebesar 57% pada konsentrasi

200 µg/mL dan nilai IC50 sebesar 411 μM dalam menghambat aktivitas enzim

MMP-9.

SARAN

Dengan terbuktinya senyawa arilamida-6 dapat menghambat MMP-9,

maka penelitian dapat dilanjutkan dengan uji in vitro terhadap sel kanker MDA

MB-231 untuk menguji potensi menghambat metastasis.

UCAPAN TERIMA KASIH

Ucapan terima kasih disampaikan kepada Indonesia Toray Science

Foundation (ITSF) 2017-2018 dan divisi penelitian dan pengembangan BEMF

universitas Sanata Dharma atas dukungan dana selama penelitian.

64± 48

88 ± 33 103 ± 4 105 ± 1


20

DAFTAR PUSTAKA

Adegoke, O.A., 2011. Analytical, biochemical and synthetic applications of para-

dimethylaminobenzaldehyde. International Journal of Pharmaceutical

Sciences Review and Research, 11 (2), 17–29.

Adhipandito, C. F. (2017). Sintesis Analog Purin (FFUSD-001) dan Studi In

Silico Terhadap Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Hemopexin Domain

sebagai Kandidat Anti-Kanker Payudara.

Alford, V.M., Kamath, A., Ren, X., Kumar, K., Gan, Q., Awwa, M., et al., 2017.

Targeting the Hemopexin-like Domain of Latent Matrix Metalloproteinase-9

(proMMP-9) with a Small Molecule Inhibitor Prevents the Formation of Focal

Adhesion Junctions. ACS Chemical Biology, 12 (11), 2788–2803.

American Cancer Society, 2018. Cancer Facts & Figures 2018. American

Cancer Society.

Arifiyanto, A., 2001. Pengaruh Penambahan Basa Natrium Hidroksida dan Piridin

dalam Sintesis Benzoilanilida.

Brew, K., & Nagase, H., 2010. The tissue inhibitors of metalloproteinases

(TIMPs): An ancient family with structural and functional diversity.

Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research, 1803 (1),

55–71.

Cathcart, J., Pulkoski-Gross, A., and Cao, J., 2015. Targeting matrix

metalloproteinases in cancer: Bringing new life to old ideas. Genes and

Diseases, 2 (1), 26–34.

Dufour, A., Sampson, N.S., Li, J., Kuscu, C., Rizzo, R.C., DeLeon, J.L., Zhi, J.,

Jaber, N., Liu, E., Zucker, S., and Cao, J., 2011. Small-molecule anticancer

compounds selectively target the hemopexin domain of matrix

metalloproteinase-9. Cancer Research, 71 (14), 4977–4988.

Dona, A.C., Kyriakides, M., Scottb, F., Shephardb, E.A., Varshavic, D.,Veselkov,

K., dan Everettc, J.R. 2016. A guide to the identification

ofmetabonomics/metabolomics experiments. Computational and

StructuralBiotechnology Journal. 19.

Kementrian Kesehatan RI Pusat Data dan Informasi Kesehatan, 2015. Stop

Kanker. infodatin-Kanker, hal 3.

Khalid, A. dan Asim Javaid, M., 2016. Matrix Metalloproteinases: New Targets in

Cancer Therapy. Journal of Cancer Science & Therapy, 8 (6), 143–153.

Li, Z., 2012. Identification of Small Molecules that Bind to the Hemopexin

Domain of Matrix Metalloproteinase-9. Stony Brook University.

Ludji, D.P.K.S., 2017. Sintesis Analog Purin (FUSD-002) dan Studi In Silico

Terhadap Matrix Metalloproteinase-9 Hemopexin Domain sebagai Kandidat

Anti-Kanker Payudara. Skripsi. Universitas Sanata Dharma.

Mohrig, J.R., Alberg, D.G., Schatz, P.F., Holfmeister, G.E., Schatz, P.F., dan

Hammond, C.N., 2014. Laboratroy Techniques in Organic Chemistry:

Supporting Inquiry- Driven Experiements.

Nicolotti, O., Catto, M., Giangreco, I., Barletta, M., Leonetti, F., Stefanachi, A., et

al., 2012. Design, synthesis and biological evaluation of 5-hydroxy, 5-

substituted pyrimidine-2,4,6-triones as potent inhibitors of gelatinases MMP-

2 and MMP-9. European Journal of Medicinal Chemistry, 58, 368-376.


21

O‟Neil, M.J., Smith,A., Heckelman, P.E., Obenchain Jr., J.R., Gallipeau, J.A.R.,

et al., 2001. The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and

Biologicals. 13th Edition. MERC & CO., INC. 1406.

Pavia, D.L., Lampman, G.M., Kriz, G.S., dan Vyvyan, J.R. 2015. Introduction To

Spectroscopy. 5th Edition. Cengage Learning. United States of America.

Smith, M.B. dan March, J., 2007. March’s Advanced Organic Chemistry:

Reactions, Mechanisms and Structure, 6th Edition. John Wiley & Sons, Inc.

Torre, L. and Rebecca Siegel, A.J., 2015. Global Cancer Facts & Figures 3rd

Edition. American Cancer Society, (800), 1–64.

Terry Mills III, James Conrad Roberson, Christian C. Matchett, Mathew J.

Simon, Mark D. Burns, Robert J. Ollis Jr., 2005. - Instrumental Data for

Drug Analysis - 6 Volume Set. vol 4-CRC Press

Ugarte-Berzal, E., Vandooren, J., Bailón, E., Opdenakker, G., and García-Pardo,

A., 2016. Inhibition of MMP-9-dependent degradation of gelatin, but not

other MMP-9 substrates, by the MMP-9 hemopexin domain blades 1 and 4.

Journal of Biological Chemistry, 291 (22), 11751–11760.

Welch, D.R., Steeg, P.S., and Rinker-Schaeffer, C.W., 2000. Molecular biology of

breast cancer metastasis. Genetic regulation of human breast carcinoma

metastasis. Breast Cancer Research, 2 (6), 408–416.

Yousef, E.M., Tahir, M.R., St-Pierre, Y., and Gaboury, L. a, 2014. MMP-9

expression varies according to molecular subtypes of breast cancer. BMC

Cancer, 14 (1), 1–12.

Zhang, L., Wang, X. jun, Wang, J., Grinberg, N., Krishnamurthy, D.K., dan

Senanayake, C.H., 2009. An improved method of amide synthesis using acyl

chlorides. Tetrahedron Letters, 50 (24), 2964–2966.

Zhu, T., Cao, S., Su, P.C., Patel, R., Shah, D., Chokshi, H.B., Szukala, R.,

Johnson, M.E., and Hevener, K.E., 2013. Hit Identification and Optimization

in Virtual Screening: Practical Recommendations Based On a Critical

Literature Analysis. Journal of Medicinal Chemistry, 56 (17), 6560–6572.


22

LAMPIRAN

Lampiran 1. Produk hasil sintesis setelah distirer selama 30 menit

Lampiran 2. Mekanisme reaksi DAB HCl dengan sulfametazin


23

Lampiran 3. Wujud warna produk dibandingkan dengan sulfametazin setelah

direaksikan dengan DAB HCl

Produk hasil sintesis ditunjukkan pada rongga droplet sebelah kanan “INT”.

Sulfametazin ditunjukkan pada rongga doplet sebelah kiri “SMZT”

Lampiran 4. Perhitungan bahan dan hasil rendemen senyawa turunan

arilamida-6

Perhitungan bahan

Sulfametazin = mol sulfametazin x Mr sulfametazin

= 3,59 mmol x 278,33 g/mol

= 0,00359 mol x 278,33 g/mol

= 0,999 g = 1 g

3-bromopropionil klorida = mol 3-bromopropionil klorida x Mr

= 5,39 mmol x 171,418 g/mol

= 0,00539 mol x 171,418 g/mol

= 0,92 g

3-bromopropionil klorida = gram 3-bromopropionil : massa jenis

= 0,92 g : 1,701 g/mL


24

= 0,540 mL

Piridin = mol piridin x Mr piridin

= 7,18 mmol x 79,1 g/mol

= 0,00718 mol x 79,1 g/mol

= 0,57 g

Piridin = gram piridin x massa jenis piridin

= 0,57 g : 0,982 g/mL

= 0,580 mL

Rendemen

Berat teoritis = mol arilamida-6 x Mr arilamida-6

= 3,59 mmol x 413,25 g/mol

= 0,00359 mol x 413,25 g/mol

= 1,48357 g

Rendemen arilamida-6

= 𝑏er𝑎𝑡 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑑𝑎𝑝𝑎𝑡/ 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠 100%

= 1330 mg/1483,57 mg x 100%

= 89,65%


25

Lampiran 5. Perbesaran spektrum proton HA dan HB


26

Lampiran 6. Perbesaran spektrum proton HC dan HD

Lampiran 7. Perbesaran spektrum proton HF


27

Lampiran 8. Mekanisme fragmentasi Sulfamida m/z 65 dan m/z 349

Lampiran 9. Mekanisme fragmentasi base peak (m/z 200)


28

Lampiran 10. Tata letak 96-microwell plate uji aktivitas in vitro

B100 : Blanko 100 μL

B44 : Blanko 44 μL

B43 : Blanko 43 μL

B45 : Blanko 45 μL

Sp1 : Sampel 1 μL (Senyawa Arilamida-6)

In2 : NNGH Inhibitor 2 μL

E5 : Enzim MMP-9 5 μL

Sb50: Substrat 50 μL

Lampiran 11. Perhitungan IC50 arilamida-6

Sampel Reading 1 Reading 2 Reading 3 Purata

Reading

Blanko (B) 9683 9349 9217 9416

Kontrol (-) 40684 41975 41625 41428

Konsentransi Sampel 50 µL 13601 38620 11034 21085

Konsentransi Sampel 100

µL

7163 6754 25511 13143

Konsentransi Sampel 200 9420 8969 6949 8446


29

µL

Konsentransi Sampel 300

µL

8014 7337 7793 7793

Sampel Purata -

Blanko

% Aktivitas

Enzim

% Inhibisi

Blanko (B)

Kontrol (-) 32012 100 0

Konsentransi Sampel 50 µg/mL 11669 36 64

Konsentransi Sampel 100 µg/mL 3727 12 88

Konsentransi Sampel 200 µg/mL -970 -3 103

Konsentransi Sampel 300 µg/mL -1623 -5 105

Konsentrasi Sampel Log Konsentrasi (x) % Inhibisi (y)

50 µg/mL 1,70 64

100 µg/mL 2,00 88

200 µg/mL 2,30 103

300 µg/mL 2,48 105

Konsentrasi

Sampel Reading

Reading -

Blanko

%Aktivitas

Enzim

%Inhibisi

Enzim SD

50

µg/mL

R1 13601 4185 13 87

48 R2 38620 29204 91 9

R3 11034 1618 5 95


30

100

µg/mL

R1 7163 -2253 -7 107

33 R2 6754 -2662 -8 108

R3 35511 16095 50 50

200

µg/mL

R1 9420 4 0 100

4 R2 8969 -447 -1 101

R3 6949 -2467 -8 108

300

µg/mL

R1 8014 -1402 -4 104

1 R2 7337 -2079 -6 106

R3 8029 -1387 -4 104

Persamaan non linear yang didapatkan adalah y = -195,71x2 + 1085,7x – 1398,7

Untuk menghitung IC50, dimasukkan angka 50 sebagai y, dan nilai x dicari

menggunakan rumus √

.

y = 50 untuk IC50

y = -195,71x2 + 1085,7x – 1398,7

50 = -195,71x2 + 1085,7x – 1398,7

0 = -195,71x2 + 1085,7x – 1398,7 - 50

0 = -195,71x2 + 1085,7x – 1448,7

a = (-195,71) b = 1085,7 c = (-1448,7)

𝑏 √𝑏 𝑎𝑐

𝑎

√


31

√

√

Antilog X1 = 169,82 µg/mL Antilog X2 = 2041µg/mL

𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖

𝑔

𝑜

= 411 µM

𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖

𝑔

𝑜

= 4943 µM


32

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “Sintesis Turunan

Arilamida-6 Dan Uji Aktivitas In Vitro Terhadap Enzim

Matrix Metalloproteinase - 9 (MMP-9) Sebagai

Kandidat Anti-Kanker Payudara” memiliki nama

lengkap Sangga Putra Dewa. Penulis lahir di Purworejo

tanggal 20 September 1996 sebagai anak keempat dari

empat bersaudara dari pasangan Hartoko dan Tri Runtut

Widayanti. Pendidikan formal yang pernah ditempuh

penulis adalah menyelesaikan pendidikan di TK Loning

(2002-2003), SD N Loning (2003-2009), SMP Pius

Bakti Utama Kutoarjo (2009-2012) dan SMA Pius Bakti

Utama Bayan (2012-2015). Penulis melanjutkan

pendidikannya di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada

tahun 2015. Selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma penulis terlibat dalam berbagai kegiatan dan organisasi, antara lain

Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas Farmasi (BEMF Farmasi) sebagai anggota

divisi Organisasi tahun (2017). Selain itu penulis pernah menjadi anggota divisi

acara (2015) Panitia Pharmacy Performance Road to School, Koordinator

Perlengkapan (2016) dan Steering Commite dan penanggung jawab (2017)

Panitia Tiga Hari Temu Akrab Farmasi (2016), anggota divisi acara Panitia

Latihan Kepemimpinan I (2016), anggota divisi acara Proton (LCC, LKTI dan PI)

(2017), Panitia Faction sebagai anggota Humas (2016), Panitia Faction#2 sebagai

Ketua Umum (2017), Panitia Pharmacy Performance sebagai anggota

Perlengkapan (2017), dan Panitia Kunjungan Industri sebagai anggota Dana dan

Usaha (2018). Pada bidang akademik penulis pernah menjadi asisten dosen

Praktikum Kimia Organik (2017 & 2019), Praktikum Kimia Dasar ( 2018) dan

Praktikum Analisis Farmasi (2019).


SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-6 DAN UJI …Sintesis Senyawa Turunan Arilamida-6 (diadaptasi dari...

Documents

Transcript of SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-6 DAN UJI …Sintesis Senyawa Turunan Arilamida-6 (diadaptasi dari...