SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-2 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO · 2019-02-21 · SINTESIS TURUNAN...

SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-2 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO

TERHADAP MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9) SEBAGAI

KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Benedictus Wisnu Putra Jati

NIM: 158114102

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2019

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-2 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO

TERHADAP MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9) SEBAGAI

KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Benedictus Wisnu Putra Jati

NIM: 158114102

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2019


ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Barangsiapa Ingin Mutiara Harus Berani Terjun

di Lautan yang Dalam” (Ir. Soekarno)

“Sesungguhnya aku ini adalah Hamba Tuhan,

terjadilah padaku menurut perkataanMu itu” (St.

Perawan Maria) (Lukas 1:38)

Karya ini saya persembahkan kepada

Tuhan Yesus Kristus

Bapak, Ibu, dan Keluarga tercinta

Teman-teman dan sahabat

Teman-teman Farmasi Angkatan 2015

Dan Almamaterku Universitas Sanata Dharma


v


vi


vii

PRAKATA

Puji Syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas

berkat dan rahmat-Nya, skripsi yang berjudul Sintesis Turunan Arilamida-2 dan Uji

Aktivitas In Vitro Terhadap Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Sebagai

Kandidat Anti-Kanker Payudara dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun

sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

Skripsi ini merupakan bagian dari penelitian Maywan Hariono, Ph.D., Apt.

yang didanai oleh Indonesian Toray Science Foundation (ITSF) 2017-2018 dengan

judul “Synthesis, enzymatic assay, and molecular modelling of purine derivatives

targeting hemopexin domain of matrix metalloproteinase-9 (PEX-9) in the

discovery of novel anti-breast cancer”.

Penulis juga ingin memberikan apresiasi yang besar kepada berbagai pihak

yang telah memberikan dukungan, bimbingan, dan bantuan dalam penyelesaian

naskah skripsi ini, tanpa mereka penulis tidak akan bisasampai pada tahap ini. Oleh

karena itu, peneliti ingin mengucapkan terimakasih yang besar kepada:

1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt. selaku Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

3. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing skripsi yang

telah membimbing tim penelitian dengan sabar, selalu memberikan perhatian,

semangat, dukungan, motivasi, kritik, dan saran dari awal hingga akhir

penyusunan skripsi ini.

4. Ibu Phebe Hendra, M.Si., Ph.D., Apt. dan Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si.,

Apt. selaku dosen penguji yang selalu memberikan semangat, kritik, dan saran

yang membangun untuk penulis menyelesaikan skripsi ini.

5. Bapak Christianus Heru Setiawan, M.Sc., Apt. selaku dosen pembimbing

akademik yang selalu memberikan motivasi, semangat, dan perhatian untuk

kemajuan penulis.


viii

6. Bapak Matius Abdullah Chaidir dan Ibu Gertruda Tri Teguh Rahayu, S.Pd.

yang selalu memberikan dukungan, motivasi, semangat, dan doa untuk

mendampingi penulis menyelesaikan skripsi ini.

7. Teman-teman seperjuangan penelitian “Skripsi Kok Analog” Kevin, Krisna,

Ervan, Aldo, dan Sangga yang telah berjuang dan bekerja sama dengan penulis

melewati suka dan duka dalam menyelesaikan penelitian ini.

8. Sahabat tercinta “Dolan Squad” dan “Quebec” Aldo, Krisna, Retha, Bulin,

Inge, dan Masrud yang telah menjalani bersama masa suka dan duka dalam

dunia perkuliahan dalam tiga setengah tahun ini.

9. Teman dan keluarga Drug Discovery Research Group terutama para senior

Tito, Diana, dan Eko serta divisi penelitian dan pengembangan BEMF Farmasi

2017-2018 yang telah membantu penulis dalam penelitian ini.

10. Sahabat tercinta Almarhum Andreas Ardi Marwanto yang juga menjadi salah

satu motivasi penulis untuk masuk dalam dunia penemuan obat khususnya

kanker ini.

11. Aurel, Wanda, Laras, Rio, Echa, Dodo, Gilang, Ega, dan Vidan selaku sahabat

terbaik sejak kecil yang juga selalu hadir dalam jalinan persahabatan bersama

penulis.

12. Pak Parlan, Mas Kunto, Pak Wagiran, dan Mas Bimo selaku laboran yang

selalu membantu penulis dalam pelaksanaan penelitian.

13. Teman-teman kelas FSM C 2015 dan Angkatan 2015 yang memberikan

dinamika dan kenangan yang indah selama masa perkuliahan di farmasi.

14. Semua pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu telah mendukung

penyelesaian naskah skrripsi ini.

Penulis menyadari masih terdapat banyak kekurangan dalam skripsi ini.

Oleh karena itu penulis sangat mengharapkan kritik, saran, dan masukan yang

membangun untuk perbaikan skripsi ini. Penulis berharap skripsi ini dapat

bermanfaat untuk pengembangan ilmu pengetahuan dan penelitian khususnya

dalam bidang farmasi penemuan obat. Terimakasih.

Yogyakarta, 30 januari 2019

Penulis


ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ....................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................. ii

HALAMAN PENGESAHAN ......................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ..................................................................... iv

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ........................................... v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ......................................................... vi

PRAKATA ...................................................................................................... vii

DAFTAR ISI ................................................................................................... ix

DAFTAR TABEL ........................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xi

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xii

ABSTRAK ...................................................................................................... xiii

ABSTRACT .................................................................................................... xiv

PENDAHULUAN .......................................................................................... 1

METODE PENELITIAN ................................................................................ 4

HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................................... 7

KESIMPULAN ............................................................................................... 18

SARAN ........................................................................................................... 18

UCAPAN TERIMAKASIH ............................................................................ 19

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 20

LAMPIRAN .................................................................................................... 23

BIOGRAFI PENULIS .................................................................................... 32


x

DAFTAR TABEL

Tabel I. Hasil uji kelarutan senyawa turunan arilamida-2 ....................... 10

Tabel II. Hasil spektrum 1H-NMR senyawa arilamida-2 ......................... 11

Tabel III. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa arilamida-2 ........................ 14

Tabel IV. Hasil uji aktivitas in vitro senyawa turunan arilamida-2............ 18


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur senyawa dan farmakofor penting (a) senyawa 2 (Dufour

et al. 2011), (b) senyawa 3c (Alford et al. 2017), (c) senyawa

arilamida-2 ................................................................................... 3

Gambar 2. Reaksi substitusi asil nukleofilik antara benzokain dan 3-

bromopropionil klorida dengan menggunakan piridin sebagai

katalis nukleofil. .......................................................................... 8

Gambar 3. Hasil spektrum 1H-NMR senyawa turunan arilamida-2 .............. 10

Gambar 4. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa turunan arilamida-2 ............. 13

Gambar 5. Hasil spektrum inframerah (a) senyawa arilamida-2 (b)

benzokain (diadaptasi dari Anderson et al., 2004) ........................ 15

Gambar 6. Kromatogram (a) dan spektrum massa (b) turunan arilamida-2 .. 16


xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Dokumentasi hasil sintesis, dan profil KLT senyawa turunan

arilamida-2 ................................................................................ 23

Lampiran 2. Uji DAB-HCl ............................................................................ 25

Lampiran 3. Perhitungan bahan sintesis dan hasil rendemen senyawa

arilamida-2 ................................................................................ 26

Lampiran 4. Perbesaran puncak pada spektrum 1H-NMR ............................ 27

Lampiran 5. Usulan mekanisme fragmentasi molekul utuh dan base peak

senyawa arilamida-2 pada spektrometri massa ........................ 30

Lampiran 6. Desain well plate untuk uji aktivitas in vitro ............................ 31


xiii

ABSTRAK

Enzim MMP-9 diekspresikan secara tinggi pada kanker payudara dengan

permasalahan, inhibitor yang telah dirancang untuk enzim tersebut bersifat tidak

selektif sehingga menyebabkan efek samping yang merugikan. Pada penelitian ini

telah disintesis senyawa arilamida-2 sebagai penghambat MMP-9 yang dirancang

lebih selektif dengan menghambat hemopexin domain MMP-9 (PEX-9). Senyawa

arilamida-2 berhasil disintesis dengan mereaksikan benzokain dan 3-

bromopropionil klorida dengan katalisator piridin melalui mekanisme reaksi

substitusi nukleofilik asil. Senyawa hasil sintesis dilakukan uji organoleptis,

kelarutan, titik lebur, dan warna dengan DAB-HCl. Produk yang terbentuk berupa

serbuk berwarna putih, larut dalam etil asetat, kloroform, dan DMSO. Titik lebur

senyawa hasil sintesis adalah 116-124oC yang bereaksi negatif terhadap DAB-HCl

mengindikasikan gugus amina primer dari benzokain sudah tersubstitusi. Senyawa

hasil sintesis dipastikan strukturnya dengan menggunakan 1H-NMR, 13C-NMR,

FTIR, dan GC-MS. Spektrum 1H-NMR menunjukan proton etilen pada geseran

kimia 2-4 ppm dan karbon etilen pada 20-40 ppm untuk 13C-NMR. Gugus karbonil

amida dideteksi dengan FTIR muncul pada 1535 cm-1 sementara bobot molekul

senyawa hasil sintesis dideteksi dengan MS sebesar m/z 299. Hasil uji aktivitas in

vitro terhadap enzim MMP-9 menunjukan persentase penghambatan enzim MMP-

9 sebesar 36% yang berasosiasi dengan aktivitas rendah-sedang senyawa arilamida-

2 sebagai inhibitor MMP-9.

Kata kunci : Arilamida-2, kanker payudara, MMP-9, PEX-9, uji aktivitas in vitro


xiv

ABSTRACT

MMP-9 is highly expressed in breast cancer with the major issue, the

inhibitor which has been designed for the corresponding enzyme having non-

selective properties, therefore this causes some adverse drug reactions. In this study,

it has been synthesized arylamide-2 as MMP-9 inhibitor which is designed to be

more selective by inhibiting hemopexin domain of MMP-9 (PEX-9). Arylamide-2

was successfully synthesized by reacting benzocaine and 3-bromopropionyl

chloride using pyridine as the catalyst through the mechanism of acyl nucleophilic

substitution reactions. Synthesized compound was carried out by an organoleptic,

solubility, melting point, and color with DAB-HCl test. The product was formed as

a white powder which is soluble in ethyl acetate, chloroform, and DMSO. The

melting point of the synthetic product was measured at 116-124oC, while negatively

reacting with DAB-HCl indicating that primary amine has been substituted. The

synthesized compound structure was confirmed using 1H-NMR by showing

ethylene proton at 2-4 ppm whereas the ethylene-carbon appears at 20-40 ppm as

confirmed by 13C-NMR. The amide carbonyl group was indicated at 1535 cm-1 as

confirmed by FTIR while the molecular weight was detected using GC-MS by

showing m/z 299. The result showed that arylamide-2 was able to inhibit MMP-9

with percentage inhibition of 36% at 200 µg/ml concentration associating with its

potency as weak to moderate inhibitor of MMP-9 in searching of anti-breast cancer

candidate.

Keyword: Arylamide-2, breast cancer, MMP-9, PEX-9, in vitro activity bioassay


1

PENDAHULUAN

Kanker merupakan penyakit kedua penyebab utama kematian di dunia. Pada

tahun 2018, terdapat 18,1 juta kasus kanker baru di dunia. Kanker payudara

merupakan kasus yang paling sering terjadi pada wanita (World Health

Organization, 2018). Pada tahun 2013, kanker payudara merupakan salah satu

kanker dengan prevalensi tertinggi di Indonesia yaitu sebesar 0,5%. Daerah

Istimewa Yogyakarta merupakan provinsi dengan prevalensi kanker payudara

tertinggi yaitu sebesar 2,4% (Kementrian Kesehatan RI, 2016). Menurut World

Health Organization (2014), kematian akibat kanker payudara pada wanita di

Indonesia cukup tinggi yaitu sebesar 21,4%.

Kanker adalah penyakit yang ditandai dengan pertumbuhan sel yang tidak

normal dan tidak teratur yang disebabkan oleh mutasi genetik serta dapat

mengalami invasi dan penyebaran sel dari satu bagian tubuh ke bagian tubuh yang

lain. Metastasis menjadi penyebab utama kematian pada penderita kanker

(Pecorino, 2012). Menurut American Cancer Society (2018) metastasis sel kanker

ke organ-organ viseral seperti pankreas, kolon, dan paru-paru merupakan hal yang

paling membahayakan nyawa dengan memperpendek harapan hidup kurang dari 5

tahun pada 20% penderita kanker secara umum. Lebih daripada itu, metastasis

menyebabkan kematian pada 90% penderita kanker (Alford, 2017).

Pada tahun 2014, menurut penelitian yang dilakukan Yousef et al. (2014)

enzim Matrix Metalloproteinase 9 (MMP-9) diekspresikan tinggi pada sel kanker

payudara dibandingkan dengan sel payudara normal. Selain itu, ditemukan

overexpression MMP-9 pada kanker payudara jenis triple-negative dan Human

Epidermal Receptor Growth Factor Receptor 2 positive (HER 2-positive). Merdad

et al., (2014) juga mengemukakan bahwa MMP-9 diekspresikan tinggi pada 97,5

% penderita kanker payudara Infiltrating Ductal Carcinoma (IDC), serta pada 52-

62% penderita kanker payudara Human Epidermal Receptor (HER).

Enzim MMP-9 merupakan salah satu peptidase yang termasuk dalam

subfamilia dari enzim matrix metalloproteinase (MMP). MMP merupakan enzim

jenis zinc-dependent endopeptidase yang bekerja dengan mendegradasi protein

extracellular matrix (ECM). Di dalam tubuh manusia terdapat 23 jenis enzim MMP


2

yang diklasifikasikan kedalam 6 jenis subfamilia MMP berdasarkan spesifitasnya

terhadap substrat (collagenases, gelatinases, stromelysins, matrilysins, enamelysin,

membrane type MMPs) (Benson et al., 2013). MMP-9 tergolong ke dalam

subfamilia MMP gelatinase B karena substratnya adalah gelatin. Degradasi ECM

oleh MMP-9 sangat penting pada proses kanker untuk memicu proses angiogenesis

dan metastasis sel kanker yang dapat bermigrasi ke daerah tubuh yang lain

(Stankovic et al., 2010).

Melihat pentingnya peran enzim MMP pada kanker, beberapa industri

farmasi telah merancang beberapa obat yang memiliki sifat penghambatan pada

MMP (MMP inhibitors) yang diharapkan mampu menjadi salah satu terapi kanker.

Namun, sebagian besar obat tersebut gagal melewati uji klinis karena kurang

selektif sehingga menimbulkan efek samping yang besar. Sebagai contoh,

marimastat menimbulkan efek samping berupa nyeri muskoskeletal dan inflamasi

(Cathcart et al., 2015). Sebagian besar MMP memiliki struktur genomik yang sama

yaitu propeptide region, catalytic domain, linker peptide (hinge region), dan

hemopexin domain (Nagase et al., 2006). Kegagalan MMP inhibitors tersebut

karena sebagian besar obat yang telah dirancang sebagai MMP inhibitor memiliki

spesifisitas yang rendah (Vandenbroucke dan Libert, 2014). Hal ini disebabkan

obat-obat tersebut mentargetkan catalytic domain yang memiliki persamaan

sekuens asam-asam amino (homologi) yang tinggi pada sebagian besar MMP (43-

65%) (Dufour et al., 2011).

Hemopexin domain MMP-9 (PEX-9) memiliki perbedaan sekuens asam

amino dengan MMP yang lain dengan homologi sebesar 25-35% (Dufour et al.,

2011) yang menyebabkan masing-masing MMP spesifik terhadap substrat,

sehingga dapat dijadikan target untuk merancang MMP inhibitor yang selektif

(Piccard et al., 2007). Studi hemopexin domain pada MMP-9 (PEX-9) diperlukan

untuk pengembangan senyawa-senyawa yang lebih selektif. Alford et al. (2017)

telah melakukan penelitian terhadap PEX-9 dengan penemuan dan sintesis 14

senyawa aktif secara in silico dan in vitro. Senyawa yang paling aktif adalah

senyawa 3c dengan Kd = 320 nM. Penelitian Alford et al. (2017) tersebut

dilatarbelakangi oleh penelitian Dufour et al. (2011) yang sebelumnya telah


3

melakukan penelitian tentang PEX-9 dan menemukan 5 senyawa aktif berdasarkan

penapisan virtual dengan metode in silico, uji in vitro, dan uji in vivo pada tikus

yang telah diinduksi dengan sel kanker MDA-MDB 435 sehingga mengalami

karsinogenesis. Senyawa yang paling aktif adalah CID135415473

www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov yang dinamakan senyawa 2 dengan Kd = 2,2 μM.

Senyawa tersebut memiliki struktur relatif sederhana untuk disintesis sehingga

berpotensi untuk dikembangkan lebih lanjut. Gugus yang berperan dalam aktivitas

penghambatan PEX-9 adalah cincin planar yang memiliki interaksi dengan pocket

blade PEX-9 dan juga memiliki arilamida yang terhubung oleh rantai alkil untuk

berinteraksi di daerah permukaan pocket. Gambar 1(a) dan 1(b) menunjukkan

struktur senyawa 2 yang ditemukan oleh Dufour et al. (2011) dan Alford et al.

(2011).

(a)

(b)

(c)

Gambar 1. Struktur senyawa dan farmakofor penting (a) senyawa 2 (Dufour et al.

2011), (b) senyawa 3c (Alford et al. 2017), (c) senyawa arilamida-2.

Gugus difluorometoksi

Rantai alkil Cincin planar

Gugus Fluoro

Gugus arilamida Rantai alkil

Cincin planar

Gugus arilamida

Rantai alkil

Gugus arilamida

Gugus ester etil benzoat


http://www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/

4

Pada penelitian kali ini telah disintesis senyawa fragmen dari senyawa 2

dengan mengambil sebagian farmakofor yang penting, yang akan diberi nama

turunan arilamida-2. Farmakofor yang diadaptasi untuk disintesis ialah gugus

arilamida dan rantai alkil. Selain itu juga dilakukan modifikasi pada posisi para dari

cincin arilamida yaitu berupa ester etil benzoat. Struktur senyawa turunan

arilamida-2 dapat dilihat pada gambar 1(c). Senyawa akan disintesis dengan

mereaksikan benzokain dan 3-bromopropionil klorida dengan katalis piridin

melalui mekanisme reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA). Kemudian senyawa

turunan arilamda-2 tersebut akan diuji aktivitasnya terhadap enzim MMP-9 secara

in vitro. Penelitian ini diharapkan dapat menambah jumlah senyawa penghambat

PEX-9 yang diharapkan aktif dan selektif sebagai kandidat anti-kanker payudara.

METODE PENELITIAN

Bahan

Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian kecuali dinyatakan lain

bermutu analisis yang disuplai dari Sigma Aldrich dan Merck. Bahan-bahan untuk

sintesis meliputi: benzokain mutu farmasetis (ethyl 4-aminobenzoate), 3-

bromopropionil klorida mutu pro analisis, piridin mutu pro analisis, natrium

karbonat mutu teknis (Na2CO3), plat kromatografi lapis tipis (KLT) silika gel GF254,

pelarut organik sebagai fase gerak (n-heksana dan etil asetat) mutu pro analisis, dan

4-dimetilano benzaldehid HCl (DAB-HCl) mutu pro analisis. Bahan-bahan untuk

elusidasi struktur meliputi: pellet kalium bromide mutu pro analisis untuk FTIR dan

pelarut kloroform-D (CDCl3) pro analisis untuk NMR. Bahan-bahan untuk uji

aktivitas in vitro bermutu pro analisis meliputi: Kit enzim MMP-9 terdiri dari enzim

MMP-9 terliofilisasi, substrat peptide, dapar, peptida NNGH sebagai kontrol

positif, gliserol untuk rekonstitusi enzim, dan dimetilsulfoksida (DMSO) sebagai

pelarut sampel.

Alat

Pada tahap sintesis alat-alat yang digunakan meliputi: timbangan analitik

(Mettler Toledo®), pompa vakum (GAST model DOA-P504-BN), oven (Memmert


5

GmbH + Co.KG), labu alas bulat (pyrex), pengaduk magnetik, lempeng panas,

drupple plate, seperangkat alat uji titik lebur (Mettler Toledo®), lampu UV254, dan

alat gelas pada umumnya. Ala-alat yang digunakan pada elusidasi struktur meliputi:

kromatografi gas-spektrofotometer inframerah (GC-MS-QP2010S SHIMADZU),

spektrometer nuclear magnetic resonance (Bruker 700 MHz dan 176 MHz), dan

spektrometer massa. Alat-alat untuk uji in vitro meliputi: pipet mikro (Eppendorf),

micro well plate 96, pipet tips, inkubator, vortex, ELISA Tecan Infinite 200 PRO

microplate reader fluorescence.

Prosedur Penelitian

Sintesis Senyawa Arilamida-2 (Diadaptasi dari Arifiyanto, 2001)

Dalam labu alas bulat dimasukkan benzokain sebanyak 3,59 mmol (0,59 g)

kemudian ditambahkan piridin sebagai katalisator sebanyak 3,59 mmol (0,28 g ;

0,29 mL). Campuran diaduk selama 10 menit pada suhu kamar. 3-bromopropionil

klorida ditambahkan tetes demi tetes sebanyak sebanyak 4,00 mmol (0,41 mL).

Campuran diaduk kembali selama 30 menit hingga tebentuk padatan. Padatan

disaring kemudian dinetralkan dengan Na2CO3 10% dan dicuci dengan akuades

untuk menghilangkan sisa piridin, NaCl, dan CO2 sebagai produk samping. Serbuk

hasil sintesis kemudian dihitung rendemennya.

Uji Organoleptis

Senyawa hasil sintesis dideterminasi bentuk dan warnanya.

Uji Kelarutan

Senyawa hasil sintesis diletakkan pada tabung reaksi kemudian ditetesi

perlahan-lahan dengan kloroform, etil asetat, DMSO, etanol, air, n-heksana, dan

aseton hingga larut dan ditentukan kategori kelarutannya berdasarkan Farmakope

Indonesia V.

Rekristalisasi

Senyawa hasil sintesis ditetesi perlahan-lahan hingga tepat larut

menggunakan pelarut kloroform dan diuapkan perlahan-lahan hingga terbentuk

kristal.


6

Uji Warna dengan DAB-HCl

Senyawa hasil sintesis diletakan di drupple plate kemudian ditetesi DAB-

HCl. Perubahan warna dilihat dan dibandingkan dengan benzokain.

Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Serbuk hasil sintesis diuji kemurniannya dengan KLT menggunakan tiga

sistem fase gerak hasil orientasi yaitu n-heksana: etil asetat 1:3; 2:2; 3:1 (diadaptasi

dari metode Adhipandito, 2017) dan didapat fase gerak dengan pemisahan terbaik

yaitu n-heksana: etil asetat 3:1. Serbuk hasil sintesis dilarutkan dalam etil asetat dan

ditotolkan pada fase diam plat silika gel GF254 kemudian dieluasi dengan fase gerak

terpilih. Bercak dideteksi dibawah lampu UV254.

Uji Titik Lebur

Senyawa hasil sintesis dimasukan kedalam pipa kapiler kemudian

dimasukan ke dalam alat pengukur titik lebur. Suhu diatur 85-150oC kemudian

senyawa diamati suhu saat pertama kali melebur hingga semua habis. Jarak lebur

didokumentasikan.

Elusidasi Struktur

Senyawa hasil sintesis dielusidasi strukturnya menggunakan NMR, FTIR,

dan GC-MS yang dilakukan di Fakultas MIPA UGM, Sleman, DIY dan Institut

Farmasetikal dan Nutrasetikal, Malaysia dengan metode standar yang sudah

dilakukan di masing-masing tempat tersebut.

Uji aktivitas in vitro

Kit enzim MMP-9 terdiri dari enzim MMP-9 yang terliofilisasi, substrat

fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based MMP-9, dapar uji MMP-9,

dan NNGH inhibitor sebagai kontrol positif yang didapatkan dari Biovision. Enzim

yang terliofilisasi direkonstitusi dengan 110 µL gliserol 30% dalam deionised

water. Enzim yang sudah terekonstitusi dilarutkan dalam 550 µL dapar dan siap

digunakan untuk pengujian. Senyawa sampel disiapkan dengan cara dilarutkan

dalam DMSO dengan konsentrasi akhir 200 µg/mL di dalam 96-microwell plate.

Konsentrasi akhir DMSO dalam wellplate tidak lebih dari 2%. Setiap well berisi 44

µL dapar untuk uji senyawa hasil sintesis dan 45 µL dapar untuk kontrol negatif, 1


7

µL senyawa hasil sintesis, 5 µL enzim, dan 50 µL substrat, desain well plate untuk

uji in vitro dapat dilihat pada lampiran 6. Sampel dicampurkan dengan buffer dan

enzim dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 30 menit. Substrat (40 µM) sebanyak

50 µL ditambahkan ke dalam campuran tersebut dan diinkubasi kembali pada suhu

37ºC selama 60 menit. Fluorosensi dibaca menggunakan ELISA Tecan Infinite 200

PRO microplate reader fluorescence dengan panjang gelombang eksitasi 325 nm

dan emisi 393 nm dan dihitung persentase penghambatan enzim MMP-9 dengan

rumus:

1 −𝐵𝑎𝑐𝑎𝑎𝑛 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑒𝑛𝑦𝑎𝑤𝑎 ℎ𝑎𝑠𝑖𝑙 𝑠𝑖𝑛𝑡𝑒𝑠𝑖𝑠 − 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜

𝐵𝑎𝑐𝑎𝑎𝑛 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑓 − 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜 𝑥 100%

HASIL DAN PEMBAHASAN

Senyawa arilamida-2 disintesis dengan farmakofor cincin arilamida yang

dihubungkan oleh rantai alkil. Penelitian ini akan mengeksplorasi gugus para cincin

arilamida yaitu OCF2 pada senyawa 2 yang memiliki karakteristik electron

donating group (EDG) pada gugus OC-R dan electron withdrawing group (EWG)

pada gugus difluoro dengan penambahan gugus ester etil benzoat. Gugus ester etil

bezoat mewakili karakter gugus electron withdrawing group (EWG).

Sintesis Senyawa Arilamida-2

Metode sintesis senyawa arilamida-2 pada penelitian ini mengadaptasi dari

metode Arifiyanto (2001). Bamane et al. (2011). White et al. (2012). Reaksi yang

terjadi pada proses sintesis turunan arilamida-2 adalah substitusi nukleofilik asil

antara benzokain dan 3-bromopropionil klorida dengan katalisator piridin

(Montalbetti et al., 2005). Reaksi ini berlangsung antara gugus nukleofil NH2 pada

benzokain menggantikan gugus pergi -Cl yang berikatan dengan gugus karbon asil

pada 3-bromopropionil klorida (McMurry, 2016). Produk utama yaitu senyawa

arilamida-2 dan produk samping reaksi berupa asam klorida (HCl). Mekanisme

reaksi disajikan pada gambar 2.


8

Gambar 2. Reaksi substitusi asil nukleofilik antara benzokain dan 3-

bromopropionil klorida dengan menggunakan piridin sebagai katalis nukleofil.

Reaksi berlangsung selama 30 menit hingga terbentuk produk yang diduga

arilamida-2. Hal ini dibuktikan dengan nilai Rf pada profil KLT untuk benzokain

sebesar 0,62 dan senyawa yang diduga arilamida-2 sebesar 0,36 dengan fase gerak

n-heksana: etil asetat (3:1) yang disajikan pada Lampiran 1a menunjukkan hasil

sintesis mempunyai noda yang berbeda dari bahan awal sintesis (benzokain).

Produk awal hasil sintesis yang dihasilkan berupa padatan berwarna putih disajikan

pada Lampiran 1b. Produk awal sintesis dinetralkan dan dilakukan pencucian

dengan Na2CO3 dan akuades untuk menghilangkan NaCl, CO2 dan sisa piridin, pH

yang diukur setelah pencucian adalah 7. Senyawa hasil sintesis setelah pencucian

dan pengeringan berbentuk serbuk dan berwarna putih disajikan pada Lampiran 1c.

Hasil rendemen dari senyawa arilamida-2 sebanyak 81,48%, yang

perhitungan rendemennya disajikan pada lampiran 3. Rendemen yang dihasilkan

cukup tinggi karena sebagian besar 3-bromopropionil klorida hampir habis bereaksi

dengan benzokain. Hal ini dikarenakan gugus klorida pada 3-bromopropionil

klorida merupakan gugus pergi yang baik (Zhang et al., 2009) dan piridin mampu

mengkatalisis reaksi dengan baik (Montalbetti et al., 2005), sehingga memudahkan

serangan nukleofilik yang dilakukan oleh benzokain. Rekristalisasi serbuk hasil

sintesis menggunakan pelarut kloroform, namun dilakukan setelah pengujian titik

lebur. Rekristalisasi pada senyawa hasil sintesis berhasil dilakukan karena


9

kloroform memiliki titik didih yang rendah yaitu sebesar 62oC (Pubchem, 2019)

sehingga mudah menguap sempurna (volatile).

Uji warna dengan reagen DAB-HCl pada hasil sintesis ditujukan untuk

memastikan senyawa arilamida-2 telah terbentuk. Senyawa dengan gugus amina

primer akan bereaksi dengan DAB-HCl membentuk basa Schiff yang berwarna

jingga, sedangkan yang tidak memiliki gugus amina primer tidak akan bereaksi

(Adegoke, 2011). Senyawa arilamida-2 tidak bereaksi dengan DAB-HCl

membentuk warna jingga karena gugus amina primernya sudah tersubstitusi

menjadi amida. Mekanisme reaksi DAB-HCl dengan benzokain disajikan pada

Lampiran 2a, sedangkan hasil uji warna berupa produk warna jingga disajikan pada

Lampiran 2b.

Senyawa arilamida-2 dilakukan uji titik lebur yang bertujuan untuk melihat

kemurnian dengan membandingkan titik lebur dari senyawa hasil sintesis (produk)

dan bahan awal (benzokain). Hasil yang diperoleh pada penelitian 3 kali replikasi

yaitu pada rentang titik lebur di antara 119-127ºC, 114-124 ºC, dan 116-122 ºC

dengan rata-rata 116-124oC. Senyawa dikatakan murni secara titik lebur jika

memiliki rentang lebur sebesar 0,5-1,5oC (Mohrig et al., 2014). Hasil tersebut

berbeda dengan benzokain yang memiliki titik lebur 88-90ºC (Sigma Aldrich,

2019). Hasil uji titik lebur menunjukkan bahwa senyawa hasil sintesis belum murni

secara titik lebur. Hal ini dapat diatasi dengan pemurnian menggunakkan

kromatografi kolom, KLT preparatif, dan rekristalisasi. Rekristalisasi sudah

dilakukan namun karena keterbatasan alat uji titik lebur belum dapat dilakukan.

Selain uji organoleptis, warna, dan titik lebur, uji kelarutan juga dilakukan terutama

untuk menentukan pelarut yang akan digunakan dalam spektroskopi. Hasil uji

kelarutan senyawa arilamida-2 ditunjukkan pada Tabel I. Berdasarkan hasil uji

kelarutan, senyawa hasil sintesis larut dalam kloroform, etil asetat, dan DMSO

sehingga memiliki sifat kelarutan semi polar.


10

Tabel I. Hasil uji kelarutan senyawa turunan arilamida-2

Pelarut Senyawa Arilamida-2 Perbandingan Kategori

Kelarutan FI V

n-heksana sangat sukar larut 1: 1000

Kloroform larut 1:30

Etil asetat larut 1:20

Aseton agak sukar larut 1:60

Etanol agak sukar larut 1:100

Air sangat sukar larut 1:1000

DMSO larut 1:30

Elusidasi Struktur

Spektrometri Resonansi Magnetik Inti

Elusidasi struktur dilakukan dengan pelarut kloroform berdasarkan hasil uji

kelarutan yang dilakukan terhadap senyawa hasil sintesis. Selain itu, kloroform juga

tidak akan mengganggu pada pembacaan sinyal karena sinyal senyawa diprediksi

berbeda dengan sinyal kloroform. Spektrum 1H-NMR disajikan pada Gambar 3.

Gambar 3. Hasil spektrum 1H-NMR senyawa arilamida-2

X

Y


11

Tabel II. Hasil spektrum 1H-NMR senyawa arilamida-2

Proton Geseran

kimia (ppm)

Integrasi Splitting J Coupling

Constant

(Hz)

HA 1,39 3 triplet 7,7

HB 2,85 dan 2,98 2 triplet of

triplet

6,3 dan 6,3

HC 3,71 dan 3,89 2 triplet of

triplet

6,3 dan 6,3

HD 4,30 2 quartet 7,7

HE 7,61 2 doublet 7,7

HF 8,02 2 doublet 7

Pelarut (X) 7,26 - singlet -

H2O (Y) 1,60 - singlet -

Sinyal pada geseran kimia 1,39 ppm (integrasi 3) (J = 7,7 Hz) merupakan

sinyal dari proton HA. Integrasi menunjukkan jumlah proton pada atom yang

dikenai gelombang radio. Integrasi yang muncul sudah sesuai dengan teori karena

jumlah proton pada HA berjumlah 3. Sinyal yang muncul sudah sesuai berdasarkan

teori hukum pencacahan proton yaitu n+1 dengan n adalah jumlah proton tetangga

yang tidak ekivalen secara kimia, sehingga sinyal yang muncul berupa triplet

karena memiliki dua proton tetangga pada lingkungan kimia yang berbeda.

Perbesaran sinyal HA disajikan pada Lampiran 4a.

Sinyal pada geseran kimia 2,85 ppm (intergrasi 2) (J= 6,3 Hz) dan 2,98 (J=

6,3 Hz) ppm merupakan sinyal dari proton HB, sedangkan geseran kimia 3,71 ppm

(integrasi 2) (J= 6,3 Hz) dan 3,89 ppm (J= 6,3 Hz) merupakan sinyal dari proton

HC. Kedua sinyal tersebut menunjukkan proton pada rantai etilen yang fleksibel dan

seharusnya muncul sebagai triplet. Namun, hasil percobaan berupa triplet of triplet.

Hal ini dapat disebabkan oleh proton pada etilen bersifat free rotatable sehingga

pada sudut tertentu proton yang terikat pada atom C yang sama memiliki

lingkungan kimia yang berbeda, hal ini menyebabkan setiap proton mengenali

tetangganya sebanyak dua kali sehingga muncul dua triplet. Kejadian ini dipastikan

dengan jumlah integrasi dua triplet tersebut sebanding dengan 2 proton. Proton HC

memiliki geseran kimia yang lebih jauh dari proton HB karena berdekatan dengan

gugus halogen (Br) yang lebih bersifat elektronegatif (menarik elektron kulit


12

terluarnya) daripada gugus karbonil amida yang berdekatan dengan HB sehingga

membuat HC kurang terlindungi dari medan magnet luar (de-shielded) (Anderson,

2004). Perbesaran sinyal HB dan HC disajikan pada Lampiran 4b dan 4c.

Sinyal pada geseran kimia sekitar 4,30 ppm (integrasi 2) (J= 7,7 Hz)

merupakan sinyal dari proton HD. Sinyal yang muncul sudah sesuai berdasarkan

teori yaitu muncul berupa quartet karena memiliki tiga proton tetangga pada

lingkungan kimia yang berbeda. Geseran kimia proton HD bergeser pada ppm yang

lebih jauh daripada proton HA yang merupakan proton tetangganya karena proton

HD berikatan langsung dengan atom O yang elektronegatif sehingga cenderung

menarik elektron atom C pada HD dan membuat HD kurang terlindungi dari medan

magnet luar (de-shielded) serta mengubah orientasi spin-nya untuk bergeser pada

ppm yang lebih jauh. Perbesaran sinyal HD disajikan pada Lampiran 4d.

Sinyal pada geseran kimia 7,00 – 9,00 ppm merupakan daerah proton

aromatik (Silverstein et al., 2005). Sinyal yang muncul pada geseran kimia tersebut

adalah dua sinyal berbeda, yaitu pada geseran kimia sekitar 7,61 ppm dan 8,02 ppm.

Perbesaran pada geseran kimia tersebut ditunjukkan pada Lampiran 4e dan 4f.

Sinyal pada geseran kimia 7,61 ppm (integrasi 2) (J= 7,7 Hz) merupakan proton

HE, sedangkan sinyal 8,02 ppm, (integrasi 2) (J= 7 Hz) merupakan proton HF.

Proton HE lebih terlindungi (shielded) daripada proton HF karena berada di

lingkungan kimia dekat dengan gugus NH yang memiliki elektronegativitas lebih

rendah daripada gugus C=O karbonil yang dekat dengan proton HF (Anderson,

2004). Sinyal yang muncul pada kedua proton tersebut sudah sesuai dengan teori

yaitu berupa sinyal doublet karena hanya memiliki satu proton tetangga pada

lingkungan kimia berbeda. Pada geseran 7,26 pm merupakan sinyal X yaitu sinyal

dari pelarut kloroform sedangkan sinyal Y geseran kimia 1,60 ppm yang merupakan

sinyal H2O (Fulmer et al., 2010).

Kemudian dilakukan juga uji 13C-NMR dan hasilnya disajikan pada Gambar

4. Hasil 13C-NMR memuat hanya informasi geseran kimia atom C dengan isotop

13 karena kelimpahan isotop 13C yang rendah di alam (1,1%) (Anderson, 2004).

Berdasarkan hasil percobaan, geseran kimia pada 20,0-40,0 ppm (Vollhardt dan

Schore, 2014) menunjukan sinyal dari atom C alkil bromida, hal ini sudah sesuai


13

dengan hasil penelitian yaitu pada daerah tersebut terdapat 1 sinyal pada geseran

kimia 39,6 ppm menunjukkan atom CC pada rantai alkil (gugus etilen). Sementara

atom CB pada geseran kimia 26,7 ppm merupakan C etilen (alkil sekunder) yang

sesuai dengan hasil empiris terletak pada daerah geseran kimia 20,0-30,0 ppm

(Vollhardt dan Schore, 2014). Atom CB lebih terlindungi daripada CC karena atom

CC berikatan dengan atom Br yang merupakan penarik elektron yang lebih kuat

daripada gugus karbonil (C=O) amida yang berikatan dengan atom CB. Geseran

kimia pada 5,0-20,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014) menunjukan sinyal dari

atom C metil (alkil primer), hal ini sudah sesuai dengan hasil penelitian bahwa pada

geseran kima tersebut muncul 1 sinyal yang menunjukan atom CA dari rantai etil

ester pada 14,4 ppm. Sementara CD pada sinyal 60,9 ppm merupakan atom C yang

berikatan langsung dengan atom O ester yang sesuai berdasarkan hasil empiris

muncul pada geseran kimia 50,0-90,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014). Atom CA

lebih terlindungi daripada atom CD karena atom CD berikatan langsung dengan atom

O ester yang merupakan gugus penarik elektron.

Gambar 4. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa arilamida-2

Geseran kimia 110,0-160,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014) adalah

rentang atom-atom C pada cincin benzena. Hal ini sudah sesuai dengan hasil

penelitian yang menunjukan geseran kimia pada rentang tersebut dengan

munculnya 4 sinyal yaitu 118,9 ppm, 126,4 ppm, 130,9 ppm, dan 141,5 ppm yang

berkorespondensi dengan atom CE, CF, CG, dan CH pada cincin arilamida. Atom CE

X


14

lebih terlindungi daripada atom CG karena posisi CE lebih dekat pada gugus NH

yang memiliki elektronegativitas lebih rendah daripada C=O ester yang dekat

dengan atom CE (Anderson, 2004). Atom CH lebih tidak terlindung daripada CF

diduga akibat CH berikatan langsung dengan NH dan C=O amida yang merupakan

gugus elektronegatif, sedangkan CF tidak berikatan langsung dengan atom O

karbonil yang elektronegatif sehingga masih terlindungi oleh ikatan dengan atom C

karbonil (Anderson, 2004). Geseran kimia 150,0-180,0 ppm (Silverstein et al.,

2005) ppm merupakan rentang dari atom C karbonil amida dan ester. Hasil

penelitian menunjukan hasil yang sesuai yaitu terdapat dua sinyal atom CI ester dan

CJ amida pada geseran kimia 166,1 ppm dan 167,9 ppm. Sinyal X pada geseran

kimia 77,0 ppm merupakan sinyal dari pelarut kloroforom (Fulmer et al., 2010).

Tabel III. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa arilamida-2

Karbon Geseran kimia (ppm)

CA 14,4

CB 26,7

CC 39,6

CD 60,9

CE 118,9

CF 126,4

CG 130,9

CH 141,5

CI 166,1

CJ 167,9

Pelarut (X) 77

Spektrofotometri Inframerah

Elusidasi struktur dilanjutkan dengan menggunakan instrumen

spektrofotometer inframerah. Tujuan elusidasi struktur dengan spektrofotometer

inframerah adalah untuk mengidentifikasi gugus-gugus fungsional pada senyawa

hasil sintesis. Gugus fungsional yang memiliki momen dipol yang tinggi sangat

efektif menyerap radiasi inframerah sehingga menyebabkan ikatannya bervibrasi

baik secara mengulur (stretching) dan menekuk (bending) (Supratman, 2010). Hasil

elusidasi struktur senyawa hasil sintesis serta perbandingannya dengan bahan awal

(benzokain) dan keberadaan gugus fungsionalnya pada spektroskopi IR disajikan


15

pada gambar 5. Berdasarkan spektrum inframerah yang dihasilkan, terdapat pita

pada bilangan gelombang (ῡ) 1500 cm-1 yang menunjukan gugus C karbonil (C=O).

C=O tersebut merupakan C=O amida pada 1535 cm-1, sedangkan pada 1689 cm-1

menunjukan C=O ester. Keberadaan gugus C=O amida tersebut diperkuat dengan

adanya pita kembar yang satu ujungnya melebar pada daerah 3371 cm-1 dan 3464

cm-1 yang diduga merupakan gugus NH amida. Senyawa hasil sintesis diprediksi

sudah terbentuk dengan dukungan daerah sidik jari pada 500-1500 cm-1 yang sudah

berbeda dengan benzokain sebagai bahan awal sintesis.

(a)

(b)

Gambar 5. Hasil spektrum inframerah (a) senyawa arilamida-2 (b) benzokain

(diadaptasi dari Anderson et al., 2004)

HN-C=O R-O-C=O

C=O

daerah

sidik jari

daerah

sidik jari


16

Kromatografi Gas-Spektrometri Massa

Senyawa dielusidasi struktur dengan menggunakan kromatografi gas-

spektrometer massa yang bertujuan untuk menentukan bobot molekul dari senyawa

baru hasil sintesis (Anderson, 2004). Kromatografi gas bertujuan untuk memastikan

kemurnian senyawa hasil sintesis, ditandai dengan hasil kromatogram satu puncak.

Kromatografi gas dilakukan pada senyawa hasil sintesis karena berdasarkan sifat

fisika kimia senyawa dari hasil uji titik lebur menunjukkan titik lebur senyawa hasil

sintesis <200oC sehingga dapat diaplikasikan pada kromatografi gas dengan suhu

detektor 300oC. Hasil percobaan menunjukan bahwa senyawa hasil sintesis sudah

murni secara kromatografi gas ditunjukan dengan munculnya satu puncak pada

kromatogram (Rt 37 menit). Hasil kromatografi gas disajikan pada gambar 6(a).

(a)

(b)

Gambar 6. Kromatogram (a) dan spektrum massa (b) turunan arilamida-2

Pada gambar hasil spektrum massa (gambar 6(b)) terjadi perekaman

senyawa utuh hasil sintesis dengan isotop atom Br 79 g/mol yaitu sebesar m/z 299

pada spektrum paling kanan. Pola fragmentasi base peak (pola fragmentasi tertinggi


17

dan stabil) pada spektrum tersebut memiliki massa relatif per ion sebesar m/z 120.

Mekanisme fragmentasi tersebut dapat dilihat pada lampiran 5a dan 5b.

Uji Aktivitas In Vitro

Pada uji aktivitas in vitro, MMP-9 direaksikan dengan substrat peptida

untuk memutus ikatan peptidanya. Substrat merupakan peptida yang dihubungkan

gugus fluorofor (Aminometil kumarin) (Niccoloti, 2012) yang akan diputus ikatan

peptidanya oleh MMP-9 sehingga gugus fluorofornya terlepas dan terbaca

fluoresensinya sebagai aktivitas enzim. Kontrol positif pada pengujian ini adalah

peptida NNGH (Arg-Arg-Gly-His) (Biovision, 2019).

Pengujian in vitro pada arilamida-2 menunjukan persentase penghambatan

aktivitas enzim sebesar 36% pada konsentrasi 200 µg/mL. Pada konsentrasi ini,

senyawa arilamida-2 termasuk dalam kategori aktivitas rendah-sedang (Aderogba

et al., 2013) sehingga masih dapat dioptimasi konsentrasinya untuk mengetahui

kemungkinan aktivitas yang lebih baik. Namun, akibat keterbatasan sumber daya

(bahan baku) hal tersebut tidak dapat dilakukan dan disarankan untuk penelitian

selanjutnya. Optimasi konsentrasi dapat dilakukan hingga ≤ 500 µM (batas aktivitas

IC50) untuk memberikan aktivitas yang baik (Zu, et al., 2013), jika lebih dari itu

maka dapat dilakukan optimasi kembali strukturnya. Aktivitas yang rendah-sedang

dari senyawa arilamida-2 dapat disebabkan karena arilamida-2 hanya mengambil

satu karakteristik gugus pada posisi para cincin arilamida senyawa 2 Dufour et al.

2011 yaitu EWG (ester etil benzoat). Aktivitas arilamida-2 secara strukturnya dapat

ditingkatkan melalui optimasi struktur dengan penambahan gugus berkarakter EDG

seperti -NH-R, -NH-Ph, dan -Ph (McMurry, 2016). Tabel hasil uji aktivitas in vitro

disajikan pada tabel IV.


18

Tabel IV. Hasil uji aktivitas in vitro

Aktivitas enzim = rata-rata/32332 x 100%, Penghambatan enzim = 100 – aktivitas enzim

KESIMPULAN

Senyawa turunan arilamida-2 dapat disintesis dari benzokain dan 3-

bromopropionil klorida melalui reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA) dengan

katalisator piridin berupa serbuk putih, larut dalam etil asetat, kloroform, dan

DMSO, memiliki jarak lebur 116-124oC serta memiliki aktivitas penghambatan

kategori rendah-sedang terhadap MMP-9 secara in vitro sebesar 36 % pada

konsentrasi 200 µg/mL.

SARAN

Penelitian ini merupakan skrining awal untuk uji aktivitas in vitro sehingga

konsentrasi sampel masih dapat dioptimasi lagi untuk mendapatkan nilai persentase

penghambatan enzim yang lebih representatif. Optimasi konsentrasi sampel tidak

lebih dari 500 µM. Jika lebih dari itu, untuk meningkatkan aktivitasnya struktur

senyawa perlu dioptimasi dan didesain ulang dengan mempertimbangkan hubungan

struktur dan aktivitas.

Sampel Fluoresensi Rata-

rata

Aktivitas

enzim

(%)

Penghambatan

enzim

(%) ±SD R1 R2 R3

Blanko 9683 9349 9217 9416 0 0

Kontrol

negatif

32989 33687 30321 32332 100 0

Turunan

arilamida-2

23807 25072 23946 24275 64 36±3,03

Kontrol

positif

(peptida

NNGH)

5946 5946 7898 6597 0 100±4,92


19

UCAPAN TERIMA KASIH

Penulis berterima kasih kepada Indonesia Toray Science Foundation (ITSF)

2017-2018 atas dukungan dana untuk penelitian ini.


20

DAFTAR PUSTAKA

Adegoke, O.A. 2011. Analytical, Biochemical, and Synthetic Application of para-

dimethylaminobenzaldedid. International Journal of Pharmaceutical

Sciences Review and Research. 11(2):17-29.

Aderogba, M.A., Ndhlala, A.R., Rengasamy, K.R.R., dan Staden J.V.S. 2013.

Antimicrobial and Selected In Vitro Enzyme Inhibitory Effectsof Leaf

Extracts, Flavonols and Indole Alkaloids Isolated from Croton

menyharthii. Molecules.18:12633-12644.

Adhipandito, C. F. 2017. Sintesis Analog Purin (FFUSD-001) dan Studi In Silico

Terhadap Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Hemopexin Domain

sebagai Kandidat Anti-Kanker Payudara. Skripsi. Universitas Sanata

Dharma.

Anderson, R.J., Bendell, D.J., dan Groundwater P.W., 2004. Organic Spectoscopic

Analysis. Royal Society of Chemistry. London. United Kingdom.

Arifiyanto, A. 2001. Pengaruh Penambahan Basa Natrium Hidroksida dan Piridin

dalam Sintesis Benzoilanilida. Skripsi. Universitas Sanata Dharma.

Alford, V.M., Kamath, A., Ren, X., Kumar, K., Gan, Q., Awwa, M. et al. 2017.

Targeting the Hemopexin-like Domain of Latent Matrix

Metalloproteinase-9 (proMMP-9) with a Small Molecule Inhibitor

Prevents the Formation of Focal Adhesion Junctions. ACS Chemical

Biology.12: 1 - 44.

American Cancer Society. 2018. Global Cancer: Facts & Figures 2018. American

Cancer Society Inc., Atlanta.

Bamane, V., Rakholiya, V.K., Chitre, T.S. 2011. Application of schotten-baumann

reaction: synthesis of sometetrahydroquinoline-3-carbohydrazide

derivatives. Heterocyclic Letters. 1(3): 263-268.

Benson, C.S., Babu, S.D., dan Radhakrishna, S. 2013. Expression of matrix

metalloproteinases in human breast cancer tissues. Disease Markers.

34: 395 – 405.

Biovision. 2019. MMP-1 Inhibitor Screening Kit (Fluorometric).

https://www.biovision.com/mmp-1-inhibitor-screening-kit-

fluorometric.html. Diakses tanggal 12 Februari 2019.

Dirjen POM. 2014. Farmakope Indonesia Edisi V. Jakarta, Kementrian Kesehatan

Republik Indonesia.

Dufour, A., Sampson, N.S., Li, J., Kuscu, C., Rizzo, R.C., DeLeon, J.L. et al. 2011.

Small-Molecule Anticancer Compounds Selectively Target the

Hemopexin Domain of Matrix Metalloproteinase-9. Cancer Research.

71(14): 4977 - 4988.


21

Fulmer, G.R., Miller, A.J.M., Sherden, N.H. Gottlieb, H.E., Nudelman, A., Stoltz

B. M., Bercaw J.E., dan Goldberg K.I. 2010. NMR Chemical Shifts of

Trace Impurities: Common Laboratory Solvents, Organics, and Gases

in Deuterated Solvents Relevant to the Organometallic Chemist.

Organometallics. 29: 2176–2179.

Kementerian Kesehatan RI. 2016. Infodatin (Pusat Data dan Informasi

Kementerian Kesehatan RI): Stop Kanker. Jakarta, Kementerian

Kesehatan RI.

McMurry, J., 2016. Organic Chemistry, 9th Edition. Cengage Learning.

Massachusetts. USA.

Merdad, A., Karim, S., Schulten, H.J., Dallol, A., Buhmeida, A., Al-Thubaity, F. et

al. 2014. Expression of Matrix Metalloproteinases (MMPs) in Primary

Human Breast Cancer: MMP-9 as a Potential Biomarker for Cancer

Invasion and Metastasis. Anticancer Research. 34: 1355 – 1366.

Mohrig, J.R., Alberg, D.G., Hofmeister, G.E., Schatz, P.F., dan Hammond, C.N.

2014. Laboratory Techniques in Organic Chemistry: Supporting

Inquiry-Driven Experiments, 4th Edition. W. H. Freeman and Company.

New York. USA.

Montalbetti, C.A.G.N., dan Falque, V., 2005. Amide bond formation and peptide

coupling. Tetrahedron. 61: 10827 - 10852.

Nagase, H., Visse, R., dan Murphy, G. 2006. Structure and function of matrix

metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69: 562 -

573.

Nicolotti, O., Catto, M., Giangreco, I., Barletta, M., Leonetti, F., Stefanachi, A. et

al. 2012. Design, synthesis and biological evaluation of 5-hydroxy, 5-

substituted pyrimidine-2,4,6-triones as potent inhibitors of gelatinases

MMP-2 and MMP-9. European Journal of Medicinal Chemistry. 58:

368-376.

Pecorino, L. 2012. Molecular Biology of Cancer: Mechanisms, Targets, and

Therapeutics. 3rd Edition. Oxford University Press. Oxford. United

Kingdom.

Piccard, H., Van den Steen, P.E., dan Opdenakker, G., 2007. Hemopexin domains

as multifunctional liganding modules in matrix metalloproteinases and

other proteins. Journal of Leukocyte Biology. 81: 870 - 892.

Pubchem.2019. Chloroform. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. Diakses tanggal 12

Februari 2019.

Pubchem.2019. CID135415473. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. Diakses

tanggal 18 Januari 2019.


https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/

22

Sigma Aldrich. 2019. Benzocaine. https://www.sigmaaldrich.com. Diakses tanggal

20 Januari 2019.

Silverstein, R.M., Webster, F.X., dan Kiemle, D.J. 2005. Spectrometric

Identification of Organic Compound. 7th Edition. John Wiley & Sons,

Inc. Hoboken. USA.

Stankovic, S., Konjevic, G., Gopcevic, K., Jovic, V., Inic, M., dan Jurisic, V., 2010.

Activity of MMP-2 and MMP-9 in sera of breast cancer patients.

Pathology - Research and Practice. 206 (4): 241 - 247.

Supratman, U. 2010. Elusidasi Struktur Senyawa Organik. Widya Padjajaran.

Bandung. Indonesia.

Vandenbroucke, R.E., dan Libert, C., 2014. Is there new hope for therapeutic matrix

metalloproteinase inhibition?. Nature Reviews Drug Discovery. AOP.

Publikasi online 7 November 2014. Diakses tanggal 15 November

2018.

Vollhardt, P., dan Schore, N. 2014. Organic Chemistry: Structure and Function. 7th

Edition. W.H. Freeman and Company. New York. USA.

White, T.D., Berglund, K.D., Groh, J.M., Johnson, M.D., Miller, R.D., dan Yates,

M.H. 2012. Development of a Continuous Schotten−Baumann Route to

an Acyl Sulfonamide. Org. Process Res. Dev.16: 939−957.

World Health Organization. 2014. Cancer Country Profiles: Indonesia. Geneva,

WHO Press.

World Health Organization. 2018. Latest global cancer data: Cancer burden rises

to 18.1 million new cases and 9.6 million cancer deaths in 2018.

Geneva, WHO Press.

Yousef, E.M., Tahir, M.R., St-Pierre, Y., dan Gaboury, L.A. 2014. MMP-9

expression varies according to molecular subtypes of breast cancer.

BMC Cancer. 14 (609): 1 – 12.

Zhang, L., Wang, X.J., Wang, J., Grinberg, N., Krishnamurthy, D.K., dan

Senanayake, C.H. 2009. An improved method of amide synthesis using

acyl chlorides. Tetrahedron Letters. 50 (24): 2964 - 2966.

Zu, T., Cao, S., Su, P.C., Patel, R., Shah, D., Chokshi, H.B., Szukala, R. et al. 2013.

Hit Identification and Optimization in Virtual Screening: Practical

Recommendations Based Upon a Critical Literature Analysis. J. Med.

Chem. 1: 1-55.


https://www.sigmaaldrich.com/

23

LAMPIRAN

Lampiran 1. Dokumentasi hasil sintesis, dan profil KLT senyawa turunan

arilamida-2

Lampiran 1a. Hasil KLT sintesis senyawa turunan arilamida-2 yang menunjukkan

2 noda yang berbeda, yaitu benzokain (A) dengan nilai Rf 1 0,62 dan senyawa

arilamida-2 (B) dengan nilai Rf 2 0,36 . Fase gerak yang digunakan adalah n-

heksana : etil asetat (3:1). Deteksi di lampu UV254.

Lampiran 1b. Foto dari tahap sintesis senyawa arilamida-2 setelah dilakukan

proses pengadukan selama 30 menit.

2

1

A

B

Rf 1 = 0,62

Rf 2 = 0,36


24

Lampiran 1c. Hasil sintesis senyawa arilamida-2 setelah dilakukan penetralan pH

dan kemudian dikeringkan.


25

Lampiran 2. Uji DAB-HCl

Lampiran 2a. Mekanisme reaksi antara benzokain dengan DAB-HCl yang

membentuk basa Schiff yang berwarna jingga.

Lampiran 2b. Hasil uji DAB-HCl dengan benzokain (A) dan senyawa turunan

arilamida-2 (B). Pembentukan basa Schiff ditandai dengan warna jingga.

A B


26

Lampiran 3. Perhitungan bahan sintesis dan hasil rendemen senyawa arilamida-2

Perhitungan bahan:

1. Benzokain digunakan 3,59 mmol = 0,00359 mol

Berat molekul = 165 g/mol

0,00359 mol x 165 g/mol = 0,59 g

2. Piridin digunakan 3,59 mmol = 0,00359 mol

Berat molekul = 79,1 g/mol

Massa jenis = 0,982 g/mL

0,00359 mol x 79,1 g/mol = 0,284 g : 0,982 g/mL = 0,29 mL

3. 3-bromopropionil klorida digunakan 4 mmol = 0,004 mol

Berat molekul = 171,418 g/mol

Massa jenis = 1,701 g/mL

0,004 mol x 171,418 g/mol = 0,686 g : 1,701 g/mL = 0,41 mL

Reaksi Stoikiometri:

Benzokain + 3-bromopropionil klorida Arilamida-2 + HCl

3,59 mmol 4,00 mmol

3,59 mmol 3,59 mmol 3,59 mmol 3,59 mmol

0,41 mmol 3,59 mmol 3,59 mmol

Massa teoritis arilamida-2 = 3,59 mmol x 300 mmol/mg

= 1077 mg =1,08 g

Hasil rendemen:

Senyawa arilamida-2 = 0,88 g

1,08 g x 100%

= 81,48%


27

Lampiran 4. Perbesaran puncak pada spektrum 1H-NMR

Lampiran 4a. Perbesaran sinyal HA pada geseran kimia 1,39 ppm menunjukan

splitting triplet dengan integrasi 3 dan nilai J coupling constant yaitu 7,7 Hz.

Lampiran 4b. Perbesaran sinyal HB pada geseran kimia 2,85 ppm dan 2,98 ppm

menunjukan splitting triplet of triplet dengan integrasi 2 dan nilai J coupling

constant yaitu 6,3 Hz.


28

Lampiran 4c. Perbesaran sinyal HC pada geseran kimia 3,71 ppm dan 3,89 ppm

menunjukan splitting triplet of triplet integrasi 2 dan nilai J coupling constant yaitu

6,3 Hz.

Lampiran 4d. Perbesaran sinyal HD pada geseran kimia 4,36 ppm menunjukan

splitting quartet integrasi 2 dan nilai J coupling constant yaitu 7,7 Hz.


29

Lampiran 4e. Perbesaran sinyal HE pada geseran kimia 7,61 ppm menunjukan

splitting doublet integrasi 2 dan nilai J coupling constant yaitu 7,7 Hz.

Lampiran 4f. Perbesaran sinyal HF pada geseran kimia 8,02 ppm menunjukan

splitting doublet integrasi 2 dan nilai J coupling constant yaitu 7 Hz.


30

Lampiran 5. Usulan mekanisme fragmentasi molekul utuh dan base peak turunan

arilamida-2 pada spektrometri massa

Lampiran 5a. Usulan pola fragmentasi molekul utuh m/z 299

Lampiran 5b. Usulan pola fragmentasi base peak m/z 120


31

Lampiran 6. Desain well plate untuk uji aktivitas in vitro

Keterangan:

B : dapar

KP : senyawa kontrol positif (peptida NNGH)

TA2 : turunan arilamida-2

C : senyawa lain

E : enzim MMP-9

S : substrat enzim MMP-9

Angka : volume (mikroliter/µl)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A B100 B100 B100 B45

E5

S50

B45

E5

S50

B45

E5

S50

B44

KP_1

E5

S50

B44

KP_1

E5

S50

B44

KP_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B B44

TA2_1

E5

S50

B44

TA2_1

E5

S50

B44

TA2_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

C B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

D B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

E B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

F B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50

B44

C_1

E5

S50


32

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “Sintesis Turunan

Arilamida-2 dan Uji Aktivitas In Vitro terhadap Matrix

Metalloproteinase-9 (MMP-9) Sebagai Kandidat Anti-

Kanker Payudara” bernama lengkap Benedictus Wisnu

Putra Jati. Penulis merupakan anak sulung dari pasangan

Matius Abdullah Chaidir dan Gertruda Tri Teguh

Rahayu. Penulis lahir di Sleman, 13 Nopember 1996.

Pendidikan formal penulis diawali di TK Kanisius

Sorowajan (2002-2003), SD Kanisius Sorowajan (2003-

2009), SMP Pangudi Luhur 1 Yogyakarta (2009-2012),

dan SMA Kolese De Britto (2012-2015). Pendidikan

dilanjutkan hingga perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta. Penulis terlibat dalam beberapa kegiatan organisasi dan

kepanitiaaan, antara lain Bendahara Drug Discovery Research Group tahun 2017-

2019, koordinator divisi Perlengkapan dan Ketua kegiatan DESA MITRA 2016 dan

2017, anggota dan koordinator divisi Konsumsi kegiatan TITRASI 2016 dan 2017,

serta menjadi asisten praktikum mata kuliah Kimia Organik (2018) dan Kimia

Dasar (2018). Penulis juga terlibat dalam beberapa perlombaan tingkat nasional

antara lain sebagai peserta PICS 2017 di Institut Teknologi Bandung dan peserta

Poster Competition CADD 2018 di Bali. Penulis juga aktif mengikuti kegiatan

Drug Discovery Research Group yang bergerak memfasilitasi mahasiswa/i Farmasi

Sanata Dharma menekuni bidang penemuan obat baru.


SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-2 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO · 2019-02-21 · SINTESIS TURUNAN...

Documents

Transcript of SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-2 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO · 2019-02-21 · SINTESIS TURUNAN...