SINTESIS DNA PADA PROKARIOTBanyak hal mendasar pada mekanisme replikasi DNA paling jelas apabila digambarkan oleh proses yang terjadi pada bakteri E. coli, basil yang hidup secara simbiotis di dalam kolon manusia. Organism ini telah diteliti secara mendalam dan berfungsi sebagai model untuk proses yang lebih kompleks (dan karenanya lebih sulit dipahami) yang terjadi pada sel eukariotik.

Replikasi Bersifat Dua Arah Replikasi DNA untai-ganda sirkular pada kromosom E. coli dimulai dengan pengikatan protein (DnaA) pada satu titik awal, yang ditandai oriC. Dua untai induk terpisah dalam regio ini., dan kedua untai disalin secara serempak. Sintesis dimulai di titik awal dan berlangsung pada dua garpu replikasi yang bergerak menjauhi titik awal dalam dua arah (bidirectional), (ke dua arah pada saat yang sama). Replikasi terakhir pada sisi lain dari kromosom di titik terminasi. Satu putaran sintesis, yang melibatkan penggabungan lebih dari 4 juta nukleotida pada masing-masing untai DNA baru, diselesaikan dalam waktu sekitar 40 menit.

Replikasi Bersifat Semikonservatif Masing-masing kromosom anak memiliki satu untai DNA induk dan satu untai komplementer yang baru disintesis. Oleh karena itu, replikasi dikatakan sebagai semikonservatif, yaitu, untai-untai induk dipertahankan tetapi tidak lagi bersama-sama. Masing-masing untai induk berpasangan dengan untai yang baru disintesis.

Pembukaan Untai Induk Pada replikasi diperlukan pemisahan untai-untai DNA induk mendahului garpu replikasi. Helikase membuka/menguraikan pilinan (unwind) DNA induk, dan protein pengikat untai-tunggal mencegah untai-untai tersebut kembali bergabung dan melindungi untai-untai tersebut dari enzim yang memutuskan DNA untai-tunggal. Topoisomerase, enzim yang dapat memutuskan dan menyambung untai DNA, membebaskan supercoiling yang terbentuk akibat penguraian pilinan dupleks induk. Topoisomerase utama dalam sel bakteri adalah DNA girase.

Kerja DNA PolimeraseEnzim yang mengkatalisis sintesis DNA dikenal dengan nama DNA polimerase. E. coli memiliki tiga DNA polimerase, Pol I, Pol II, dan Pol III. Pol III adalah enzim replikatif. Semua DNA polimerase yang telah diteliti menyalin untai cetakan DNA dalam arah 3 ke 5, menghasilkan untai baru dalam arah 5 ke 3. Deoksiribinukleosida trifosfat berfungsi sebagai prekursor, molekul yang berfungsi sebagai substrat, untuk penambahan nukleotida ke rantai yang sedang tumbuh tersebut.Nukleotida yang baru masuk tersebut membentuk pasangan basa dengan nukleotida komplementer pada untai cetakan, membentuk ikatan ester dengan gugus 3-hidroksil bebas di ujung rantai yang sedang tumbuh, dan pirofosfat dilepaskan. Pelepasan pirofosfat dan pemutusan selanjutnya oleh pirofosfatase menghasilkan energi yang mendorong proses polimerisasi.DNA polimerase yang mengkatalisis sintesis untai baru selama replikasi memperlihatkan prosesivitas (processivity), yaitu, enzim ini tetapi terikat ke untai cetakan induk (bukan terlepas lalu menyatu kembali) sewaktu dilakukan penambahan nukleotida ke lantai yang sedang tumbuh. Akibatnya, sintesis berlangsung jauh lebih cepat dibandingkan apabila enzim ini tidak memperlihatkan prosesivitas.

Eliminasi Kesalahan Pembentukan Pasangan BasaPada E. coli, enzim replikatif Pol III juga melakukan fungsi menyunting atau mengoreksi cetakan percobaan (proofreading). Enzim ini memiliki aktivitas 35-eksonuklease selain aktivitas polimerase. Apabila nukleotida di ujunga rantai yang sedang tumbuh membentuk pasangan basa yang salah dengan untai cetakan, Pol III mengeluarkan nukleotida ini sebelum menlanjtukan pemanjangan rantai yang sedang tumbuh tersebut. Aktivitas penoreksian cetakan percobaan ini mengeliminasi sebagian besar kesalahan pembentukan pasangan basa sewaktu kesalahan tersebut terjadi. Dalam produk DNA akhir, hanya sekitar satu pasangan basa dalam sejuta yang tidak sepadan; angka kesalahan sekitar 10-6. Apabila aktivitas pengoreksian cetakan percobaan ini secara eksperimental dikeluarkan dari enzim ini, angka kesalahan meningkat menjadi sekitar 10-3.Setelah replikasi, mekanisme perbaikan dapat mengganti basa yang tidak sepadan yang lolos dari pengoreksian cetakan percobaan tersebut. Kedua proses ini (pengkoreksian cetakan percobaan dan perbaikan psangan yang tidak sepadan) menghasilkan angka kesalahan keseluruhan sekitar 10-10, yaitu kurang dari satu pasangan basa yang tidak sepadan dalam 10 milyar. Oleh karena itu, tingkat kebenaran/kejituan replikasi DNA sangatlah tinggi.

Fungsi Primer RNA Karena DNA polimerase tidak dapat memulai sintesis untai baru, diperlukan suatu primer. Primer ini adalah oginikleotida RNA. Primer disintesis dalam arah 5 ke 3 oleh suatu RNA polimerase (primase) yang menyalin untai cetakan DNA. DNA polimerase pada awalnya menambahkan sebuah deoksiribonukleotida ke gugus 3-hidroksil pada primer lalu melanjutkan untuk menambahkan deoksiribonukleotida ke ujung-3 untai yang sedang tumbuh.

Sintesis DNA di Garpu ReplikasiKedua untai induk disalin pada waktu yang sama dalam arah garpu replikasi, suatu pengamatan yang sulit disesuaikan dengan aktivitas DNA polimerase yang diketahui yang dapat menghasilkan rantai hanya dalam arah 5 ke 3. Karena kedua untai induk berjalan dalam arah berlawanan relatif satu sama lain, sintesis seharusnya berlangsung dalam arah 5 ke 3 menuju garpu pada satu untai cetakan dan dalam arah 5 ke 3 menjauhi garpu pada untai cetakan yang satunya.Okazaki memecahkan dilemma ini dengan membuktikan bahwa sintesis pada satu untai, yang disebut untai pendahulu (leading strand), berlanjut dalam arah 5 ke 3 menuju garpu. Untai yang lain, yang disebut lagging strand (untai yang tertinggal), disintesis secara diskontinu dalam fragmen pendek. Fragmen ini, diberi nama fragmen Okazaki, dibentuk dalam arah 5 ke 3 (menjauhi garpu), tetapi kemudian disatukan sehingga, secara keseluruhan, sintesis berlangsung menuju ke garpu replikasi. Pada E. coli, fragmen Okazaki memiliki panjang antara 1.000 sampai 2.000 nukleotida.

Fungsi DNA LigaseSeiring dengan berlangsungnya proses replikasi, primer RNA dikeluarkan dari fragmen Okazaki, mungkin akibat kerja gabungan dari DNA polimerase I (Pol I) dan RNase H. Pol I mengisi celah-celah yang terjadi akibat pengeluaran primer. Karena DNA polimerase tidak dapat menyatukan dua rantai polinukleotida menjadi satu, diperlukan suatu enzim tambahan, yaitu DNA ligase, untuk melakukan fungsi ini. Gugus 3-hidroksil di ujung fragmen diligasi ke gugus fosfat di ujung fragmen berikutnya.