Sifat Gel Filtrasi Sephadex

JenisKisaran Pemisahan

(berat molekul)

Penyerapan Air

(g air/g gel

kering)

Volume Kolom

(ml/g gel

kering)

G-10 Sampai 700 1,0 2

G-15 Sampai 1500 1,5 3

G-25 100-5.000

1.000-5.000 (Protein)

2,5 5

G-50 500-10.000

1.500-30.000 (Protein)

5,0 10

G-75 1.000-50.000

3.000-80.000 (Protein)

7,5 12-15

G-100 1.000-100.000

4.000-150.000

(Protein)

10,0 15-20

G-150 1.000-150.000

5.000-300.000

(Protein)

15,0 20-30

G-200 1.000-200.000

5.000-600.000

(Protein)

20,0 30-40

MEKANISME PENUKAR ION

Prinsip Kerja Gel

Filtrasi

Prinsip Kerja Gel

Penukar Ion

JENIS PENUKAR ION

• KATION KUAT : DOWEX 50, POLIMER :

POLISTIREN TERSULFONASI

• KATION LEMAH: AMBERLITE I C 50,

POLIMER: ASAM AKRILAT

TERKONDENSASI

• ANION KUAT: DOWEX 1, POLIMER:

POLISTIREN CH2N Me3Cl

• ANION LEMAH: DOWEX 3, POLIMER :

POLISTIREN AMIN SEKUNDER

GAMBAR TANAMAN BIDURI

Memotong / melukai

(pucuk, batang, daun,

tangkai daun)

GETAH (PUTIH)

• Ekstraksi enzim protease dari getah biduri

dilakukan secara SALTING OUT (Noda et

al., 1994 dengan modifikasi) menggunakan

amonium sulfat pada tingkat kejenuhan 35-

80%.

Ekstraksi enzim protease dari

getah biduri

1. Getah biduri diencerkan dengan buffer phosphat

0.05 M pH 7

2. sentrifus dingin suhu 4oC pada kecepatan 8000

rpm, 10 MENIT

3. supernatan getah di pisahkan dari endapannya

(GUM & NON-PROT)

4. Sampel supernatan ditambahkan garam

ammonium sulphat pada tingkat kejenuhan 35%,

50%, 65% dan 80%

1. disentrifus dingin suhu 4oC pada kecepatan 8000

rpm selama 10 menit.

2. endapan yang diperoleh dari sentrifus dingin

didialisis dengan larutan buffer phosphat 0.05 M

pH 7 selama 3 x 24 jam pada membran selofan.

3. Dialisis dilakukan untuk memisahkan protein

enzim dari ion garam, ion logam dan molekul-

molekul kecil, sehingga dapat memurnikan

protein enzim.

1. dikeringkan dengan freeze drying.

2. EKSTRAK PROTEIN DIPURIFIKASI

DGN KOLOM PENUKAR ION

3. enzim kering DILARUTKAN pada buffer

phosphat 0,05 M pH 7

4. larutan enzim protease biduri dilewatkan

pada kolom kromatografi penukar ion

positif CM sephadex C-50.

1. Kolom dielusi dengan menggunakan

gradien NaCl pada konsentrasi antara 0

sampai 1 M.

2. Eluent ditampung 5 ml pada tabung reaksi

sebanyak 63 fraksi (5 ml/tabung). Setiap

fraksi dianalisa protein dan aktivitas

enzimnya.

1. Fraksi yang mengandung aktivitas dikumpulkan,

kemudian difreezing selama 24 jam (sampai

beku).

2. Enzim beku tersebut difreeze-drying selama 3

hari, sampai didapat enzim kering.

3. Ensim beku dianalisa kadar protein terlarut,

aktivitas proteolitik dan aktivitas spesifiknya