SDQRVRPDHYDQVL 3$' $6$3,%$/, RVVRQGDLFXVrepository.unair.ac.id/54414/2/KH 123-16 Mah i.pdf ·...
59
SKRIPSI IDENTIFIKASI Trypanosoma evansi PADA SAPI BALI (Bossondaicus) BERDASARKAN MORFOMETRI DAN Polymerase Chain Reaction Disusun oleh : HAYYU MAHARANI 061211131064 FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA 2016
Transcript of SDQRVRPDHYDQVL 3$' $6$3,%$/, RVVRQGDLFXVrepository.unair.ac.id/54414/2/KH 123-16 Mah i.pdf ·...
i
SKRIPSI
IDENTIFIKASI Trypanosoma evansi PADA SAPI BALI (Bossondaicus) BERDASARKAN MORFOMETRI
DAN Polymerase Chain Reaction
Disusun oleh :
HAYYU MAHARANI
061211131064
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2016
ii
IDENTIFIKASI Trypanosoma evansi PADA SAPI BALI ( Bossondaicus) BERDASARKAN MORFOMETRI
DAN Polymerase Chain Reaction ( PCR )
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
Pada
Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga
oleh
HAYYU MAHARANI
061211131064
Menyetujui
Komisi Pembimbing,
(Dr. Mufasirin, drh., M.Si.) (RetnoBijanti, drh., M.S.)
Pembimbing Utama Pembimbing Serta
iii
PERNYATAAN Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi yang berjudul :
IDENTIFIKASI Trypanosoma evansi PADA SAPI BALI
(Bos sondaicus) BERDASARKAN MORFOMETRI DAN Polymerase Chain Reaction
Tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan
di suatu perguruan tinggi dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat
karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali
yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Surabaya, Februari 2016
Hayyu Maharani NIM. 061211131064
iv
Telah diuji pada Seminar Hasil Penelitian
Tanggal : 22 Januari 2016
KOMISI PENILAI SEMINAR HASIL PENELITIAN
Ketua : Dr. Poedji Hastutiek, drh., M.Si
Sekretaris : M. Yunus, drh., M. Kes., Ph.D
Anggota : Dr. Jola Rahmahani, drh., M.Kes
Pembimbing I : Dr. Mufasirin, drh., M.Si
Pembimbing II : Retno Bijanti, drh., M.S
v
Telah diuji pada
Tanggal: 09 Februari 2016
KOMISI PENGUJI SKRIPSI
Ketua : Dr. Poedji Hastutiek, drh., M.Si
Anggota : M. Yunus, drh., M. Kes., Ph.D
Dr. Jola Rahmahani, drh., M.Kes
Dr. Mufasirin, drh., M.Si
Retno Bijanti, drh., M.S
Surabaya, 11 Februari 2016
Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Airlangga
Dekan,
Prof. Dr. Pudji Srianto,drh., M.Kes.
NIP. 195601051986011001
vi
UCAPAN TERIMA KASIH
Puji syukur Kehadirat Allah SWT atas karunia yang telah dilimpahkan
sehingga penulis dapat melaksanakan penelitian dan menyelesaikan penulisan
skipsi dengan judul“Identifikasi Trypanosoma evansipada Sapi Bali (Bos
sondaicus) berdasarkan morfometri dan Polymerase Chain Reaction”.Pada
kesempatan ini penulis ingin menyampaikan terima kasih kepada:
Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Prof. Dr. Pudji
Srianto, drh., M.Kes.dan staf pimpinan serta Prof. Hj. Romziah Sidik, PhD., drh.
atas kesempatan mengikuti pendidikan di Fakultas Kedokteran Hewan Universitas
Airlangga Surabaya.
Dr. Mufasirin, drh., M.Si. selaku dosen pembimbing pertama yang
bersedia memberikan bimbingan, sarandan nasehat yang berguna selama
penelitian serta dalam penyusunan naskah skripsi ini.
Retno Bijanti, drh., M.S.selaku pembimbing serta sekaligus sebagai dosen
pembimbing penelitian yang tiada henti membimbing penulis dengan ikhlas
dalam pelaksanaan penelitian dari awal hingga akhir dan memberi saya dorongan
untuk segera menyelesaikan penulisan skripsi.
Dr. Poedji Hastutiek, drh., M.Si. selaku ketua penguji, Muchammad
Yunus, drh., M.Kes., Ph.D. selaku sekretaris penguji, dan Dr. Jola Rahmahani,
drh, M.Kes.selaku anggota, atas saran yang membangun dalam penyusunan
skripsi.
Dr. I Komang Wiarsa Sardjana, drh., DEA.selaku dosen wali, atas segala
nasehat, kritik, saran dan bimbingan yang diberikan selama mengikuti pendidikan
di Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.
Ketua Departemen Parasitologi Veteriner dan staf Laboratorium Biologi
Molekuler Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga yang
telah memberikan ijin dan bantuan pada penelitian ini.
Seluruh staf pengajar Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga
atas wawasan keilmuan selama mengikuti pendidikan di Fakultas Kedokteran
Hewan Universitas Airlangga.
vii
Terima kasih kepada drh. Dilasdita Kartika Pradana selaku staf di Balai
Besar Veteriner Bali yang telah berkenan memberikan banyak bantuan selama
penelitian ini berlangsung.
Ayahanda Slamet Adi Wibowo dan Ibunda Siti Solekah serta kakak Taju
Mahadhikara yang telah memberikan dukungan, semangat, terutama doa yang
sangat memotivasi penulis dalam menyelesaikan penelitian dan penyusunan
skripsi. Radiaprima Kartika Wijaya, terima kasih atas bantuan, dukungan,
semangat dan doanya.
Terima kasih kepada teman seperjuangan yang telah banyak membantu
dan mendukung penelitian ini Lusiana Fitriyanti, Amira Nadia dan Anggun
Rahmawati, serta teman-teman yang namanya tidak mungkin disebutkan satu
persatu yang telah membantu terselesaikanya skripsi ini.
Semua pihak yang tidak bisa saya sebutkan satupersatu yang telah
mendukung baik secara langsung maupun tidak langsung demi
terselesaikannyapenelitian ini.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan,oleh
karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun. Semoga
penulisan skripsi ini dapat memberikan manfaatbagi pembaca dan bagi
perkembangan ilmu pengetahuan.
Surabaya, 22 Januari 2016
Penulis
viii
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ......................................................................................... i
HALAMAN PENGESAHAN ......................................................................... ii
HALAMAN IDENTITAS .............................................................................. iii
ABSTRACT .................................................................................................... vi
UCAPAN TERIMAKASIH ........................................................................... vii
DAFTAR ISI ................................................................................................... ix
DAFTAR TABEL ........................................................................................... xi
DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xii
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xiii
SINGKATAN DAN ARTI LAMBANG ...................................................... xiv
BAB 1 PENDAHULUAN ................................................................................1
1.1 Latar Belakang Penelitian ...............................................................1
1.2 Rumusan Masalah ...........................................................................5
1.3 Landasan Teori ................................................................................5
1.4 Tujuan Penelitian .............................................................................7
1.5 Manfaat Penelitian ...........................................................................7
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................8
2.1 Surra ................................................................................................8
2.1.1 Penyebab ...............................................................................8
2.1.2 Morfologi Trypanosoma evansi ............................................8
2.1.3 Hewan yang rentan ..............................................................10
2.1.4 Penularan .............................................................................10
2.1.5 Gejala klinis.........................................................................11
2.1.6 Patogenesis ..........................................................................12
2.1.7 Diagnosis .............................................................................13
2.2 Sapi Bali ........................................................................................14
2.3 Morfometri ....................................................................................17
ix
2.4 Polymerase Chain Reaction ..........................................................17
BAB 3 METODE PENELITIAN....................................................................19
3.1 Jenis Penelitian ..............................................................................19
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian .......................................................19
3.3 Materi Penelitian ...........................................................................19
3.3.1.1 Sampel ..............................................................................19
3.3.1.2 Bahan ulas darah ..............................................................19
3.3.1.3 Bahan isolasi DNA ...........................................................20
3.3.1.4 Alat penelitian ..................................................................20
3.4 Metode Penelitian .........................................................................21
3.4.1 Pembuatan ulas darah ..........................................................21
3.4.2 Pemeriksaan morfometri .....................................................21
3.4.3 Isolasi DNA .........................................................................22
3.4.3.1 Persiapan reagen isolasi ...............................................22
3.4.3.2 Ekstraksi DNA.............................................................22
3.4.4 Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) .........................23
3.4.5 Analisis hasil PCR ...............................................................24
3.5 Analisis Data .................................................................................24
3.6 Bagan Kerangka Operasional ........................................................25
BAB 4 HASIL PENELITIAN ........................................................................26
4.1 Hasil Pemeriksaan Ulas Darah dan Morfometri ...........................26
4.2 Hasil Pemeriksaan Menggunakan Metode PCR ...........................27
BAB 5 PEMBAHASAN .................................................................................29
BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN ..........................................................34
RINGKASAN .................................................................................................35
DAFTAR PUSTAKA .....................................................................................38
LAMPIRAN ....................................................................................................44
x
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
3.3 Susunan dan Posisi Nucleotida untuk Primer ITS1 CF/BR ...............20
4.1 Hasil Pemeriksaan Morfometri Trypanosoma sp. ..............................27
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
2.1 Morfologi Trypanosoma evansi ............................................................9
2.2 Sapi Bali betina ...................................................................................14
2.3 Sapi Bali jantan ...................................................................................15
3.1 Bagan kerangka operasional penelitian ...............................................25
4.1 Hasil pemeriksaan ulas darah Sapi Bali ..............................................26
4.2 Hasil elektroforesis PCR pada darah Sapi Bali ...................................28
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Gen Trypanosoma evansi ................................................................... 44
2. Letak penempelan primer foward ITS1 CF/BR pada sequence gen
Trypanosoma evansi ...........................................................................46
3. Letak penempelan primer reverse ITS1 CF/BR pada sequence
gen Trypanosoma evansi .....................................................................46
xiii
SINGKATAN DAN ARTI LAMBANG
% = Persen
ºC = Derajat Celcius
µl = microliter
bp = base pairs
dATP = Deoxyadenine Triphospate
dCTP = Deoxycitosine Triphospate
ddH2O =Double Distilled Water
dGTP = Deoxyguanine Triphospate
DNA = Deoxyribonucleic Acid
dNTP = Deoxynucleatide Triphospate
dTTP = Deoxytimine Triphospate
EDTA = Ethylen Diamine Tetra Acid
ELISA = Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EtBr = Ethidium Bromida
GPI = Glikosilphosphatidilinositol
mA = mili Ampere
mg = miligram
mm = milimeter
ng = nanogram
nm = nanometer
nt = nukleotida
PCR = Polymerase Chain Reaction
pH = power of Hydrogen
Primer F = Primer Forward
Primer R = Primer Reverse
Rpm = Revolutions per minute
rpm = Rotation per minute
TBE = Tris Borat EDTA
UV = Ultra Violet
V = Volt
1
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Penyakit surra merupakan salah satu penyakit strategis yang menyerang
hewan ternak yang disebabkan oleh Trypanosoma evansi (Luckins et al., 1992;
Dargantes et al., 2005). Trypanosomaevansi banyak ditemukan dalam
darahdanataujaringan hewan vertebrata(FAO, 1994).Parasitini ditularkan secara
mekanis oleh vektor lalat penghisap darah seperti Tabanus sp dan Stomoxys
sp(Payne et al., 1991, Luckins et al., 1992).
Trypanosoma evansi mempunyai induk semang yang beragam dari hewan
liar sampai hewan domestik termasuk ternak.Hewan domestik yang rentan adalah
kuda, sapi, kerbau, kambing, domba, babi, anjing dan kucing, sedangkan hewan
liar yang rentan diantaranya adalah badak (Vellayan et al., 2004), rusa (Adrian et
al., 2010), wallaby (Reid et al., 2001) dan bisa berpotensi sebagai sumber infeksi
untuk hewan domestik (Dargantes et al., 2005). Khusus pada sapi dan kerbau di
Indonesia, infeksi T. evansi dapat menyebabkan kerugian ekonomi yang sangat
besar dikarenakan ternak tersebut merupakan sumber produksi daging dan susu
(Manuel, 1998).
Trypanosoma evansi pada beberapa ternak mempunyai ukuran yang
bermacam-macam tergantung dari induk semang dan daerah geografisnya. Secara
umum T. evansi mempunyai panjang berkisar antara 15-34 µm dengan rata–rata
24 µm. Bentuk tubuh silinder tetapi kadang–kadang terjadi bentuk stumpy/gemuk.
Ukuran T. evansihampir sama dengan genus Trypanosoma lain, seperti T.
1
2
bruceiyang memiliki panjang berkisar antara 12-26 µm, T. gambiense dengan
panjang berkisar antara 15-30 µm dan T. cruzi dengan panjang berkisar antara 15-
20 µm (Levine, 1985).
Kasus penyakit surra pertama kali dilaporkan di Indonesia pada tahun
1897 pada populasi kuda di Pulau Jawa.Semenjak itu, secara sporadik menyebar
ke seluruh wilayah Indonesia (Partoutomo, 1996). Menurut Sukanto (1994),paling
tidak ada 11 provinsi di Indonesia (Aceh, Sumatra Utara, Lampung, Jawa Barat,
Jawa Tengah, Jawa Timur, Kalimantan Selatan, Sulawesi Utara, Nusa Tenggara
Barat, Bali dan Nusa Tenggara Timur) merupakan daerah endemik penyakit surra.
Penyakit surra pada sapi dan kerbau umumnya berlangsung lebih lambat,
bersifat kronis dan bahkan tanpa menunjukkan gejala klinis atau
subklinis.Respons imun terhadap infeksi T. evansi pada kerbau dan sapi relatif
lebih baik dari pada kuda sehingga ternak ruminansia besar tersebut lebih
tahan terhadap serangan penyakit surra. Penyakit dapat bersifat akut dan
mewabah pada ternak ruminansia ketika hewan mengalami stres, karena
dipekerjakan atau difungsikan terlampau berat, akibat kekurangan pakan atau air
dan faktor kondisi lingkungan kritis dan cuaca yang ekstrim (Soulsby,1982).
Di antara berbagai bangsa sapi yang terdapat di Indonesia, Sapi Bali
merupakan salah satu jenis sapi yang terdapat dalam jumlah yang cukup banyak
dan tersebar hampir ke seluruh Indonesia. Menurut Guntoro (2002), pada tahun
1990 jumlah populasi Sapi Bali di seluruh Indonesia mencapai sekitar 3 juta ekor
yang tersebar di berbagai provinsi, mulai dari Aceh hingga Irian Jaya. Dari
populasi tersebut sekitar 82% terdapat di 4 provinsi utama, dengan urutan
3
populasi yaitu Sulawesi Selatan sekitar 1.200.000 ekor, Nusa Tenggara Timur
600.000 ekor, Bali 450.000 ekordan Nusa Tenggara Barat 350.000
ekor.Sementara pada tahun 2002 seluruh populasi Sapi Bali di Indonesia
diperkirakan mencapai hampir 3,5 juta ekor (Guntoro 2002).
Sapi Bali (Bos sondaicus) merupakan jenis sapi yang unggul.Sapi Bali
didomestikasi pertama kali di Pulau Bali.Perkembangan Sapi Bali sangat cepat
dibandingkan dengan breed sapi potong lain di Indonesia, sehingga apabila Sapi
Bali terkena suatu penyakit seperti penyakit surra akan mudah menular
(Handiwirawan dan Subandriyo 2004). Penyakit surra pada Sapi Bali pernah
terjadi di Flores, Provinsi Nusa Tenggara Timur pada tahun 1971.Sebanyak 516
ekor Sapi Bali terserang penyakit surra (Mastra, 2011).Pada tahun 2009, kasus
penyakit surra pada Sapi Bali juga terjadi di Kecamatan Batu Engau, Kabupaten
Paser, Provinsi Kalimantan Timur.Dari 19 sampel yang diuji di laboratorium
BPPV Regional V Banjarbaru terdapat 8 sampel yang positif penyakit surra
(BPPV Regional V Banjarbaru, 2009).
Diagnosispenyakit surra di Indonesia umumnya masih berdasarkan laporan
kasus diagnosa klinis, pemeriksaan laboratoris secara mikroskopis terhadap
sampel preparat ulas darah dan atau teknik sentrifugasi mikrohematokrit. Akurasi
data diagnosis klinis dan sensitivitas metoda uji laboratoris tersebut relatif belum
optimal terutama pada manifestasi penyakit sub klinis sehingga cenderung tidak
mencerminkan kejadian penyakit yang sesungguhnya (Mastra, 2011). Pada
faseakut, tanda klinisyang biasa terlihat dilapanganadalah
demamintermitendisertai denganakumulasiparasitdalam darah(parasitemia), gejala
4
ini biasa terjadi pada kuda (Luckins, 1998; Thumbi, 2008).Sebagian penyakit
berlangsungkronis yang biasa terjadi pada sapi dan kerbau dan hasil pemeriksaan
ulas darah jumlahparasitdalam darah sedikit sekali bahkan tidak terdeteksi.
Tingkatparasitemia yang rendah akan menyebabkan diagnosis parasitologi
terhadap Trypanosomafalse negatif. DeteksiT. evansitidak
berhasilketikajumlahparasitterlalu rendah, seperti pada infeksikronis(Nantulya,
1994; Masakeetal., 2002; Desquesnes, 2002).Perlu ada alternatif teknik diagnosis
yang lebih sensitif terhadap infeksi Trypanosoma pada sapi yaitu penanda
molekuler dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR).
Pengembangan dan penerapan teknik PCR telah banyak digunakan untuk
diagnosis infeksi Trypanosomapada hewan.Untuk mengoptimalkandiagnosis
dengan PCR perlu mempertimbangkan beberapa faktor yang mempengaruhi
sensitivitas PCR, seperti kuantitas dan kualitas DNA yang ada di dalam sampel
(González et al., 2006).Pemeriksaan morfometri dan teknik PCR penting untuk
memperkuat diagnosis penyakit surra secara parasitologis
karenaketerbatasandiagnosis T.evansiyang ada dan disarankan untuk
menggunakan kombinasidaridua atau lebihteknik untukmeningkatkan
akurasidiagnosis(Monzonet al., 1990).
5
1.2. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan di atas, maka dapat
dirumuskan masalah yaitu : Bagaimana identifikasi dan morfologi Trypanosoma
evansiyang terdapat pada Sapi Bali (Bos sondaicus) berdasarkan morfometri dan
Polymerase Chain Reaction?
1.3. Landasan Teori
Pada tahun 1968-1969 wabah surra pada Sapi Bali terjadi di beberapa
daerah di Indonesia, termasuk terjadi di Flores, Provinsi Nusa Tenggara Timur
pada tahun 1971 terserang sebanyak 516 ekor Sapi Bali. Sementara dalam tahun
1974-1976 terjadi peningkatan kasus penyakit Surra di Provinsi Nusa Tenggara
Barat (Sukanto et al., 1994). Prevalensi Trypanosomiasis pada Sapi Bali di
Kabupaten/Kota Bima dan Sumbawa Besarrata-rata sebesar 15,3%. Hasil ini
mengindikasikan bahwa kejadian infeksi secara alami oleh parasit darah
patogen T. evansi pada Sapi Bali di Kabupaten/Kota Bima dan Sumbawa Besar
tersebar luas dan cendrung bersifat endemis (Mastra, 2011).Menurut data
pengujian dan diagnosa laboratorium BPPV Regional V Banjarbaru, pada tahun
2009 terjadi kasus penyakit surra di Kecamatan Batu Engau, Kabupaten Paser
Provinsi Kalimantan Timur pada Sapi Bali.Dari 19 sampel yang diuji terdapat 8
sampel positif penyakit surra (BPPV Regional V Banjarbaru, 2009).
Periode antara inokulasi pada hewan sehat dan waktu Trypanosoma dapat
dideteksi dalam plasma darah dengan observasi langsung disebut masa/periode
prepaten. Dengan mengetahui periode prepaten, penyakit ini kemudian dibedakan
6
menjadi dua kategori yaitu : kategori akut apabila jumlah parasit dalam darah
sangat tinggi dan terlihat gejala klinis. Dikategorikan kronis apabila jumlah parasit
dalam darah sedikit dan tidak tampak gejala klinis.Trypanosomiasis adalah
penyakit yang serius di banyak negara, seperti Afrika, Asia dan Amerika Latin
(Duvallet et al., 1999)
Trypanosoma evansi memiliki morfologi yang mirip dengan Trypanosoma
lain seperti T. equiperdum, T. brucei, T. gambiense dan T. rhodesiense.
Permukaan tubuhT.evansi diselubungi oleh lapisan protein tunggal yaitu
glikoprotein yang dapat berubah-ubah bentuk (variable surface glycoprotein).
Kemampuan glikoprotein yangdapat berubah bentuk, maka T. evansi dapat
memperdaya sistem kekebalan tubuh induk semang. Konsekuensinya akan
terjadi variasi antigenik (antigenic variation) tubuh akan selalu berusaha
membentuk antibodi yang berbeda-beda sesuai denganprotein permukaan yang
ditampilkan oleh T. evansi (Davilaet al., 2003).
Banyak cara yang dapat dilakukan untuk mengidentifikasi Trypanosoma,
baik dengan cara yang sederhana seperti pemeriksaan ulas darah dengan
pewarnaan, sampai dengan pemeriksaan dengan metode Polymerase Chain
Reaction (PCR). Metode PCR dapat mendeteksi asam nukleat parasit.Polymerase
Chain Reaction merupakan metode yang sangat sensitif yang dapat mendeteksi
satu Trypanosoma/ml darah (Davila etal.,2003) atau bahkan satu pikogram dari
DNA Trypanosoma yang ada pada DNA inang (Clausen etal.,1998).
Polymerase Chain Reaction adalah suatu metode memperbanyak fragmen
DNA spesifik secara in vitro.Prinsip metode PCR adalah perbanyakan rantai
7
DNA.Polymerase Chain Reaction juga dapat digunakan untuk mendeteksi
fragmen DNA tertentu dalam sampel.Proses PCR melibatkan serangkaian siklus
temperatur yang berulang masing–masing siklus terdiri atas tiga
tahapan.Polymerase Chain Reaction memanfaatkan enzim DNA polymerase yang
secara alami memang berperan dalam perbanyakan DNA pada proses replikasi.
Siklus PCR terdiri dari tiga tahap yaitu denaturasi, annealing dan polimerasi
(Gumilar et al., 2008).
1.4. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi dan mengetahui morfologi
Trypanosoma evansiyang terdapat pada Sapi Bali (Bos sondaicus) berdasarkan
morfometri dan Polymerase Chain Reaction.
1.5. Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini dapat memberikan informasi tentang identifikasi dan
morfologi Trypanosoma evansiyang terdapat pada Sapi Bali (Bos sondaicus)
berdasarkan morfometri dan Polymerase Chain Reaction, sehingga dapat
menambah pengetahuan dan sebagai referensi untuk penelitian selanjutnya.
8
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Penyakit Surra
2.1.1. Penyebab
Penyakit surra adalah nama penyakit yang diberikan pada hewan yang
terserang protozoa darah Trypanosoma evansi. Taksonomi Trypanosoma menurut
Levine (1985) adalah :
Kingdom : Animal
Filum : Sarcomastigophora
Sub Filum : Mastigophora
Kelas : Zoomastighoporasida
Ordo : Kinetoplastorida
Sub Ordo : Trypanosomarina
Family : Trypanosomatidae
Genus : Trypanosoma
Spesies : Trypanosoma evansi
2.1.2. Mofologi Trypanosoma evansi
Trypanosoma evansi berbentuk seperti daun, aktif membelah dengan
binary fission.Di bagian tengah tubuh terdapat inti yang mengandung kariosoma
(trofonukleus) yangbesar dan terletak hampir sentral (Ausvetplan, 2006).Gambar
morfologi T. evansi dapat dilihat pada Gambar 2.1.
8
9
Gambar 2.1 Morfologi Trypanosoma evansi Sumber : Levine (1985).
Trypanosoma evansimempunyai karakteristik ramping, ukuran kecil,
dibandingkan dengan Trypanosoma theileri, tetapi lebih besar dibandingkan
dengan T. congolense, mempunyai flagela bebas dan bergerak aktif (Desquesnes
et al., 2002).Pada Gambar 2.1 terlihat bahwa flagela timbul pada ujung posterior
dari bagian parabasal dan membentang sampai bagian anterior.Flagela di luar
ujung anterior tubuh sebagai flagela bebas berbentuk seperti cambuk.Flagela di
sepanjang tubuh membentuk membran bergelombang yang disebut undulating
membran.Trypanosoma evansi mempunyai panjang 15-34 µm dengan rata – rata
24 µm. Tubuh berbentuk silinder, tetapi kadangberbentuk stumpy/gemuk (Levine,
1985).
10
2.1.3. Hewan yang rentan
Hampir semua hewan berdarah panas rentan terhadap penyakit surra,
kecuali bangsa burung.Kuda paling tinggi kerentanannya diikuti unta, anjing, sapi
dan kerbau.Hewan percobaan seperti tikus, marmut dan kelinci juga termasuk
hewan yang rentan. Pada sapi dan kerbau, penyakit ini bersifat kronis, tetapi
dalam kondisi tertentu seperti kurang makan dan kerja terlalu keras, keganasan
penyakit akan meningkat dengan mortalitas sampai 80 % (Levine, 1985).
Trypanosoma evansi mempunyai inang yang beragam dari hewan liar
sampai hewan domestik. Diantara hewan domestik yang rentan adalah kuda,
sapi, kerbau, kambing, domba, babi, anjing dan kucing, sedangkan hewan liar
yang rentan diantaranya adalah badak (Vellayan et al., 2004), rusa (Adrianet
al., 2010), wallaby (Reid et al., 2001), dan bisa berpotensi sebagai sumber
infeksi untuk hewan domestik (Dargantes et al., 2005). Hewan coba seperti tikus
dan mencit juga sangat peka terhadap infeksi T. evansi (OIE, 2009).
2.1.4. Penularan
Penyakit surra di Indonesia ditularkan oleh lalat penghisap darah Tabanus
sp, Haematopota sp, Chrysop sp, Stomoxys spdan Haematobiasp. (Jones et al.,
1996). Insekta merupakan vektor mekanik, karena tidak terjadi perkembangan
siklus di dalam vektor dan Trypanosoma tertinggal di dalam probosis (Levine,
1985). Penularan infeksi Trypanosoma evansi sangat cepat pada beberapa hewan
karena sifat lalat, khususnya Tabanus sp yang menghisap darah terputus–putus
(dari satu hewan berpindah ke hewan lain) (Soulsby, 1982). Lalat Tabanus
11
yangpaling menonjol populasinya sebagai penyebar infeksi Trypanosoma evansi
di Indonesia adalah Tabanus rubidus dan Tabanus megalops (Sasmita dkk.,
2013).
Sebaran penyakit yang luas sangat dipengaruhi oleh topografi daerah dan
manajemen atau cara pemeliharaan ternak terutama yang dipelihara secara
tradisional dengan cara menggembalakan ternak secara bersama-sama di areal
padang pengembalaan. Batas tanah pertanian tidak jelas, ladang terbuka yang
hanya dibatasi oleh semak, sungai dan hutan masih banyak dijumpai didaerah ini
sebagai tempat berkumpul hewan ternak untuk merumput dan mencariair minum.
Kondisi lingkungan seperti ini juga sangat digemari oleh lalat pengisap darah
seperti Tabanus sp.,Stomoxyssp. Lalat Tabanus sp., merupakan salah satu vektor
penularan secara mekanik Trypanosomiasis yang sangat potensial pada hewan
ternak (Soulsby, 1982).
2.1.5. Gejala klinis
Gejala klinis yang khas penyakit surra adalah adanya oedema atau
pembengkakan pada daerah ventral atau bagian bawah tubuh seperti leher, legok
lapar dan kaki.Gejala klinis lain adalah terjadi perdarahan di bawah kulit, hidung,
mata dan anus. Gejala lain adalah anemia, demam selang seling (intermittent
fever) dan pada akhirnya terjadi kematian.Gejala klinis rambut rontok dapat
terjadi karena kondisi tubuh hewan yang menurun dan nafsu makan berkurang
(Ismudiono dkk., 2006). Gejala klinis khas yang lain apabila parasit menuju cairan
cerebrospinal akan menimbulkan gejala inkoordinasi gerak (Levine, 1985).
12
Bentuk akut penyakit dapat berlangsung sampai tiga bulan dan ditandai
dengan demam tidak teratur, penurunan berat badan yang progresif,
keratokonjungtivitis berulang dan plak urtikaria pada leher.Tanda klinis pada
kasus kronis kurang terlihat jelas.Pada hewan yang terinfeksi T. evansi,
produksiakan turun, hewan tampak lesu,rambut kasar, anemia dan demam
berulang (Hoare, 1972).
2.1.6. Patogenesis
Patogenesis penyaki surra bermula dari kelenjar saliva vektor lalat dan
ditularkan pada inang melalui gigitan (Wiser, 1999).Infeksi ditularkan dengan
penetrasi T. evansi ke dalam jaringan subkutan atau submukosa (Losos, 1986).
Parasit tersebut kemudian memasuki sistem peredaran darah, berkembang dan
akan bertambah secara logaritmik di dalam darah dalam waktu satu sampai tiga
hari setelah parasit ditemukan di dalam aliran darah (Noble and Noble., 1982;
Jefrey et al., 1983). Kerusakan endotel pembuluh darah menyebabkan oedema dan
perdarahan (Ressang, 1984).
Trypanosoma evansi menyebabkan reaksi inflamasi pada jaringan darah
dengan diikuti multifikasi parasit (Losos, 1986).Trypanosoma evansi bertambah
dalam darah secara berkala dan hal ini disertai demam pada hewan.Serangan
demam yang berulang disebabkan oleh invasi masal T. evansi ke dalam darah atau
perkembangbiakan yang cepat dalam darah (Ressang, 1984).
Trypanosoma evansi mengeluarkan toksin yang dikenal dengan nama
trypanotoksin yang dapat mempengaruhi sistem kerja tubuh hewan yang terinfeksi
13
(Levine, 1985). Trypanotoksin dapat merusak membran eritrosit yang dimulai
dengan ikatan antara kompleks antigen–antibodi atau komplemen, proses tersebut
menyebabkan anemia hemolitik (Morrison et al., 1981).Gangguan
imunopatologik yang paling penting pada trypanosomiasis adalah imunosupresi
yang ditandai anemia. Ikatan kompleks antigen – antibodi atau komplemen yang
beredar dalam darah pada permukaan eritrosit, bertanggung jawab terhadap
destruksi eritrosit dan proses ini menyebabkan terjadi hemolisis (Noble and
Noble., 1982).
Anemia hemolitik menyebabkan peningkatan destruksi eritrosit dengan
cara fagositosis pada limpa, hati, sumsum tulang dan di sirkulasi darah (Morrison
et al., 1981). Peningkatan destruksi eritrosit ditandai dengan adanya splenomegali
(Losos, 1986).
2.1.7. Diagnosis
Diagnosis penyakit surra berdasarkan gejala klinis yang muncul dan
dilakukan uji parasit, uji serologis dan uji molekuler untuk diagnosis konfirmatif
di laboratorium.Uji parasit diantaranya dilakukan dengan pemeriksaan
haematologi (mikroskopik), Microhematocrite Centrifugation Technique (MHCT)
dan Mouse Inoculation Test (MIT). Uji serologi dapat dilakukan dengan metode
Card Agglutination Test For Trypanosomes (CATT) dan Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay (ELISA), sedangkan uji molekuler menggunakan
Polymerase Chain Reaction (PCR) (Solihat, 2002).
14
2.2. Sapi Bali
Sapi Bali merupakan sapi potong asli Indonesia dan merupakan hasil
domestikasi dari Banteng (Bos bibos) (Hardjosubroto, 1994), dan merupakan sapi
asli Pulau Bali (Sutan, 1988).Sapi Bali menjadi primadona sapi potong di
Indonesia karena mempunyai kemampuan reproduksi tinggi, serta dapat
digunakan sebagai ternak kerja di sawah dan ladang (Moran, 1990; Putu et al.,
1998), persentase karkas tinggi, daging tanpa lemak (Pane, 1990), daya adaptasi
yang tinggi terhadap lingkungan dan persentase kelahiran dapat mencapai 80
persen (Tanari, 2001).Beberapa kekurangan Sapi Bali yaitu pertumbuhan lambat,
peka terhadap penyakit jembrana, penyakit Malignant Catarrhal Fever (MCF)
dan penyakit surra (Hardjosubroto, 1994).Gambar Sapi Bali dapat dilihat pada
Gambar 2.2 dan 2.3.
Gambar 2.2 Sapi Bali Betina Sumber :Wibisono (2009).
15
Gambar 2.3 Sapi Bali Jantan Sumber :Wibisono (2009).
Menurut Hardjosubroto (1994), Sapi Bali mempunyai klasifikasi
taksonomi sebagai berikut :
Phylum : Chordata
Subphylum : Vertebrata
Class : Mamalia
Sub class : Theria
Infra class : Eutheria
Ordo : Artiodactyla
Sub ordo : Ruminantia
Infra ordo : Pecora
Famili : Bovidae
Genus : Bos (cattle)
Sub-Genus : Bovine
Group : Taurinae
Spesies : Bos sondaicus (Banteng/Sapi Bali)
16
Sapi Bali (Bos sondaicus) berasal dari domestikasi Banteng dan dapat
beradaptasi dengan baik pada lingkungan setempat, dan sekarang sudah menyebar
di luar wilayah Indonesia (tropis dan sub tropis) (McCool, 1992; Sivarajasingham,
1992; Talib et al., 1998).Sapi Bali juga dapat ditemukan di kebun binatang dan
Taman Safari di luar negeri, secara liar dan terpelihara juga dapat dilihat pada
hutan-hutan tropis dan negara Asia Tenggara dan Australia Utara (Talib et al.,
1998).
Sapi Bali mempunyai ciri khusus antara lain, warna bulu merah bata, tetapi
yang jantan dewasa berubah menjadi hitam. Satu karakter lain yakni perubahan
warna sapi jantan kebirian dari warna hitam kembali pada warna semula yakni
coklat muda keemasan yang diduga karena hormon testosteron sebagai hasil
produk testes. Karakteristik lain yang harus dipenuhi dari ternak Sapi Bali murni
yaitu warna putih pada bagian belakang paha, pinggiran bibir atas, dan pada paha
kaki bawah mulai tarsus dan carpus sampai batas pinggir atas kuku, bulu pada
ujung ekor hitam, bulu pada bagian dalam telinga putih dan terdapat garis hitam
yang jelas pada bagian atas punggung. Bentuk tanduk pada jantan yang paling
ideal disebut bentuk tanduk silak congklok, yaitu jalannya pertumbuhan tanduk
dimulai dari dasar sedikit keluar lalu membengkok ke atas, kemudian pada ujung
membengkok sedikit keluar.Pada sapibetina bentuk tanduk yang ideal yang
disebut manggul gangsa yaitu pertumbuhan tanduk satu garis dengan dahi arah ke
belakang sedikit melengkung ke bawah dan pada ujung sedikit mengarah ke
bawah dan ke dalam.Tanduk ini berwarna hitam (Hardjosubroto, 1994).
17
2.3. Morfometri
Morfometri adalah suatu metode yang digunakan untuk menganalisis
organisme secara kuantitatif yang mencakup ukuran dan bentuk.Morfometri
digunakan sebagai alat untuk identifikasi parasit sejak zaman dahulu.Morfometri
dapat digunakan untuk mengukur dan mendeteksi perubahan bentuk.Tujuan utama
dari morfometri adalah untuk statistik uji hipotesis tentang faktor yang
mempengaruhi bentuk.Ukuran dan bentukdariparasitdapat
membuatkesalahan tentangidentifikasi spesies parasit karena pada beberapa
spesies parasit ditemukan memiliki ukuran dan bentuk yang hampir sama,oleh
karena itupengukuran morfometridapat membantu untuk mengidentifikasiparasit
(Javidet al., 2013).
2.4. Polymerase Chain Reaction
Polymerase Chain Reaction adalah metode amplifikasi suatu sekuen DNA
tertentu.Polymerase Chain Reaction merupakan cara yang sensitif, selektif dan
sangat cepat untuk memperbanyak sekuen DNA yang diinginkan (Murray et al.,
2006). Empat komponen utama pada proses PCR adalah (1) DNA cetakan, yaitu
fragmen DNA yang akan dilipatgandagakan, (2) oligonukleotida (primer), yaitu
suatu sekuen oligonukleotida pendek (15-25 basa nukleotida) yang digunakan
untuk mengawali sinstesis rantai DNA. Primer yang digunakan dalam PCR ada
dua, yaitu oligonukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah
satu rantai DNA cetakan pada ujung 5’ – fosfat dan oligonukleotida dengan
sekuen pada ujung 3’ –OH rantai DNA cetakan yang lain, (3)
18
deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), yang terdiri atas dATP, dCTP, dGTP,
dTTP dan (4) enzim DNA polimerase yaitu enzim yang berfungsi sebagai katalis
dalam reaksi sintesis rantai DNA. Komponen lain yang juga berperan penting
adalah buffer PCR (Yuwono, 2006).
Reaksi pelipatgandaan fragmen DNA dimulai dengan melakukan
denaturasi DNA tamplate (cetakan) sehingga rantai DNA yang berantai ganda
(double stranded) akan terpisah menjadi rantai tunggal (single stranded).
Denaturasi DNA dilakukan dengan menggunakan panas (95ºC) selama 1-2 menit,
kemudian suhu diturunkan menjadi 55ºC sehingga primer akan menempel
(annealing) pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. Proses
annealing bisa dilakukan selama 1-2 menit. Setelah dilakukan annealing,
oligonukleotida (primer) menempel pada DNA cetakan, suhu inkubasi dinaikkan
menjadi 72ºC selama 1,5 menit. Pada suhu ini, DNA polimerase akan melakukan
proses polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada
DNA cetakan. Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk
jembatan hidrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk,
dengan ikatan hidrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA baru hasil
polimerasi, selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu inkubasi
menjadi 95ºC. Rantai DNA yang baru tersebut, selanjutnya akan berfungsi
sebagai cetakan bagi reaksi polimerase selanjutnya (Yuwono, 2006).
19
BAB 3 MATERI DAN METODE
3.1. Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksploratif laboratoris yang hasilnya
disajikan secara deskriptif.
3.2. Tempat dan Waktu penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Departemen Parasitologi Veteriner
dan Laboratorium Biologi Molekuler Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Airlangga Surabaya. Waktu pelaksanaan penelitian pada bulan
Agustus 2015 – September 2015.
3.3. Materi penelitian
3.3.1. Bahan penelitian
3.3.1.1. Sampel
Sebanyak dua sampel diperoleh dari darah Sapi Baliyang diduga terinfeksi
Trypanosoma evansi berasal dari Kabupaten Jembrana yang didapatkan dari Balai
Besar Veteriner Bali. Sampel darah sebanyak 3 ml diambil melalui vena
jugularis, menggunakan 5 ml tabung venoject yang berisi larutan Ethylen Diamine
Tetra Acid (EDTA).
3.3.1.2. Bahanulas darah
Bahan untuk pemeriksaan ulas darah adalah darah, larutan pewarna
Giemsa 10%, minyak emersi dan methanol absolut.
19
20
3.3.1.3. Bahanisolasi DNA
Bahan untuk isolasi DNA adalah gSYNCTM DNA Extraction Kit
(Geneaid), yang meliputi (larutan GSTBuffer, GSB Buffer, W1 Buffer, Wash
Buffer,Proteinase K, Elution Buffer), Ethanol Absolut dan ddH2O.Bahan untuk
PCR adalah 2x KAPA Taq Extra Hotstart Ready Mix PCR Kit (KAPA
Biosystems).Sepasang primer ITS1 CF/BR dan distilled water. Bahan untuk
elektroforesis gel adalah agarosa, Tris Borat EDTA(TBE), Ethidium Bromida
(EtBr), Marker DNA dan loading dye.Susunan untuk primerITS1 CF/BR dapat
dilihat pada Tabel 3.3, dan posisi primer pada genom Trypanosoma evansi untuk
primer forward pada nomor 2117-2097 dan primer reverse pada nomor 2597-
2578 dapat dilihat pada Lampiran 1.
Tabel 3.3. Susunan untuk Primer ITS1 CF/BR
Primer Sekuens Posisi Panjang Pita
Forward 5’-CCGGAAGTTCACCGATATTG-3’ 2117-2097 480 bp
Reverse 5’-TGCTGCGTTCTTCAACGAA- 3’ 2597-2578
Sumber : Njiruet al.(2005)
3.3.2 Alat penelitian
Alat penelitian yang digunakan adalah glove disposable, masker,
Erlemeyer 1000 ml, disposablespuit 1 cc, disposable spuit 3 cc, sentrifus, tabung
Eppendorf, mikro pipet, jarum sonde, aluminium foil, gabus, gelas obyek, gelas
penutup, mikroskop, tissue, spidol marker dan frezer.
21
Alat untuk isolasi DNA dan PCR yang digunakan dalam penelitian yaitu
mesin PCR (Mastercycler Personal), Microcentrifuge (Hermle Z 400 K), water
bath (Gemmyco Water Bath YCW-010), vortex, mikropipet, tip, tabung
Eppendorf, microtube, timbangan digital, alat elektrophoresis, lampu UV, botol
reagen, cool box, optilab®, mikroskop dan laptop
3.4.Metode Penelitian
3.4.1. Pembuatan ulas darah
Darah diteteskan pada object glass,dibuat ulasan darah dan dikeringkan.
Kemudian difiksasi dengan methanol absolut selama 3 menit dan
dikeringkan.Proses selanjutnya adalah preparat diwarnai dengan Giemsa 10%
selama 45 menit. Setelah itu, dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan,
diperiksa dengan mikroskop dengan perbesaran 1000x dengan bantuan minyak
emersi.
3.4.2. Pemeriksaan morfometri
Pemeriksaan morfometri dilakukan dengan cara hasil ulas darah yang
positif terdapat T. evansi diperiksa di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x
dan difoto dengan menggunakan OptiLab®. Kemudian hasil foto Trypanosoma
tersebut diukur yang meliputi panjang dan lebar tubuh, panjang dan lebar inti,
panjang dan lebar kinetoplas, panjang undulating membran dan jarak inti ke
kinetoplas. Morfologi yang terlihat sesuai dengan deskripsi Soulsby (1982) untuk
spesies T. evansi.
22
3.4.3.Isolasi DNA
3.4.3.1. Persiapan reagen isolasi DNA
Larutan Wash buffer ditambahkan ethanol absolut sebanyak 100 ml dan
kemudian dicampur. Proteinase K dilarutkan dengan pelarut dengan cara
ditambahkan ddH2O sebanyak 1,10 ml dan disimpan dalam suhu 4o C (Geneaid,
2014).
3.4.3.2. Ekstraksi DNA menggunakan prosedur menurut Geneaid (2014)
Sampel darah ditambahkan PBS sampai volume akhir 200 µl dan
dicampur, kemudian dipindahkan pada 1,5 ml microsentrifus tube. 20 µl
proteinase K ditambahkan pada larutan dan divortex, kemudian diinkubasi pada
suhu 60o C selama 5 menit.Selama inkubasi tube dibalik setiap 2 menit.
Larutan yang sudah diberi PBS dan proteinase K kemudian ditambahkan
200 µl GSB bufferdandivortex selama 5 detik. Larutan diinkubasi pada suhu 60o C
selama 5 menit untuk memastikan lisat hancur.Selama inkubasi, tube dibolak
balik setiap 2 menit.
Larutan ditambahkan 200 µl alkohol absolut kemudian divortex selama 10
detik.GD column diletakkan pada tabung koleksi ukuran 2 ml, kemudian semua
campuran pada GD columndipindahkan dan disentrifugasi pada 14-16.000 x g
selama 1 menit. Selama dilakukan sentrifugasi, jika campuran tidak mengalir ke
GD columnmembrane waktu sentrifugasi diperlama sampai campuran mengalir ke
23
GD columnmembrane.2 ml tabung koleksi yang terisi dibuka kemudian GD
column dipindahkan pada 2 ml tabung koleksi yang baru.
Sebanyak 400 µl W1 buffer ditambahkan pada GD column, disentrifugasi
pada 14-16.000 x g selama 30 detik kemudian dibuang.GD columndiletakkan
kembali pada tabung koleksi ukuran 2 ml. Pada GD culumnditambahkan 600 µl
Wash buffer kemudian disentifugasi pada 14-16.000 x g selama 3 menit dan
dibuang. GD columndiletakkan kembali pada tabung koleksi ukuran 2 ml.
Standar volume elusi adalah 100 µl. Jika sampel yang digunakan sedikit,
volume elusi dikurangi menjadi 30-50 µl untuk meningkatkan konsentrasi
DNA.Konsentrasi DNA diukur dengan spektrofotometer dengan panjang
gelombang 260 nm.
3.4.4.Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR)
Campuran reaksi PCR dimasukkan dalam tabung Eppendorf, yang terdiri
atas 25 µl 2x KAPA Taq Extra HotStart Ready Mix with dye, 4-7 µl
templateDNA, primer (F: 1µl), primer (R: 1 µl) dan distilled water16-19 µl
sehingga total volume 50 µl.Campuran reaksi PCR dicampur sampai homogen
menggunakan vortex. Tabung Eppendorf selanjutnya dimasukkan kedalam mesin
PCR dengan menggunakan program persiapan dengan suhu 94º C selama 5 menit,
denaturasi 94º C selama 40 detik, anneling dengan suhu 58º C selama 40 detik,
extension rantai 72º C selama 90 detik, dan terminasi 72º C selama 5 menit.
Proses PCR menggunakan reaksi 35 kali (Njiru et al., 2005).
24
3.4.5. Analisis hasil PCR dengan elektroforesis gel agarosa
Hasil amplifikasi dari proses PCR yang telah dilakukan sebelumnya
kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) menggunakan alat
elektroforesis. Komposisi gel agarosa dibuat dengan melarutkan 0,3 gram agarosa
dalam 30 ml buffer TBE 1x dan ditambahkan larutan Ethidium Bromida (EtBr) 0,3
µl. Larutan tersebut kemudian dipanaskan hingga semua agarosa larut sempurna,
kemudian didinginkan hingga suhu larutan mencapai 60o C. Setelah larutan dingin
dituangkan ke dalam cetakan gel yang memiliki sisir sebagai pembentuk sumur
gel. Pada tiap sumuran gel dimasukkan 5 µl marker DNA yang telah dicampurkan
dengan 1 µl loading dye dan 7 µl sampel hasil PCR yang telah dicampurkan
dengan 1 µlloading dye.
Proses elektroforesis dilakukan dalam buffer TBE 1x sebagai media
penghantar arus pada tegangan 100 volt selama 45 menit. Hasil elektroforesis
kemudian divisualisasi dengan lampu UV dan difoto dengan kamera
digital.Sampel dinyatakan positif apabila didapatkan pita DNA 480 base pair
(bp).
3.5.Analisis data
Data penelitian berupa hasil pengukuran Trypanosoma evansi dan
amplifikasi DNA sampel. Pada metode PCR, sampel dinyatakan positif apabila
didapatkan pita DNA 480 base pair (bp). Data disajikan secara deskriptif (Njiru
et al,. 2005).
25
3.6.BaganKerangkaOperasionalPenelitian
Gambar 3.1. Bagan kerangka operasional penelitian
Sampel darah Sapi Bali
Pemeriksaan Ulas Darah
Pemeriksaan Morfometri
Ekstraksi DNA
Identifikasi hasil pemeriksaan terhadap Trypanosama evansi
PCR
26
BAB 4 HASIL PENELITIAN
4.1 Hasil Pemeriksaan Ulas Darah dan Morfometri
Hasil pemeriksaan ulas darah dari dua sampel darah Sapi Bali (Bos
sondaicus) yang berasal dari Kabupaten Jembrana Provinsi Bali menunjukkan
satu sampel positif (sampel B), Trypanosoma sp. berbentuk ramping, mempunyai
inti, kinetoplas, flagela bebas dan undulating membran.Hasil pemeriksaan ulas
darah pada Sapi Bali (Bos sondaicus) dapat dilihat pada Gambar 4.1.
Gambar 4.1 Hasil pemeriksaan ulas darah Sapi Bali (Bos sondaicus) pada
perbesaran 1000x terlihat adanya Trypanosoma sp.pada plasma darah.
26
27
Setelah diketahui adanya Trypanosoma sp.pada plasma darah Sapi Bali
(Bos sondaicus), maka dilakukan pemeriksaan morfometri dengan cara hasil foto
pemeriksaan ulas darah yang positif Trypanosoma sp. dengan menggunakan
mikroskop dengan perbesaran 1000x dan optilab®, kemudian dilakukan
pengukuran dengan menggunakan aplikasi yang berasal dari optilab® pada PC.
Hasil pemeriksaan morfometri dapat dilihat dari Tabel 4.1.
Tabel 4.1 Hasil pemeriksaan morfometri Trypanosoma sp. pada darah Sapi Bali (Bos sondaicus) yang berasal dari Kabupaten Jembrana Provinsi Bali.
Parameter Kisaran Rata-rata
Panjang 23,09 – 39,94 µm 32,47 µm
Lebar 1,82 – 4,34 µm 3,15 µm
Panjang Inti 5,21 – 11,41 µm 8,21 µm
Lebar Inti 1,56 – 4,19 µm 3,10 µm
Panjang Kinetoplas 2,34 – 9,05 µm 5,16 µm
Lebar Kinetoplas 1,78 – 4,58 µm 2,69 µm
Panjang Undulating
Membran
8,95 – 17,45 µm 12,77 µm
Jarak Inti ke Kinetoplas 10,57 – 19,36 µm 14,80 µm
4.2 Hasil Pemeriksaan Menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR)
Untuk memperkuat diagnosis dari hasil pemeriksaan ulas darah yang
positif merupakan Trypanosoma evansi, maka dilakukan pemeriksaan dengan
menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Hasil amplifikasi DNA
dari darah Sapi Bali (Bos sondaicus) yang berasal dari Kabupaten Jembrana
Provinsi Bali menggunakan Primer ITS1 CF/BR menghasilkan pita dengan
28
panjang 480 bp (positif). Hasil elektroforesis pada proses PCR sampel darah Sapi
Bali (Bos sondaicus) dapat dilihat pada Gambar 4.2.
Gambar 4.2 Hasil Elektroforesis PCR pada darahSapi Bali (Bos sondaicus). A. Darah Sapi Bali (Bos sondaicus) negatif; B.Darah Sapi Bali (Bos sondaicus) positif Trypanosoma evansi M. Marker DNA.
29
BAB 5 PEMBAHASAN
Hasil pemeriksaan ulas darah dari dua sampel darah Sapi Bali (Bos
sondaicus) yang berasal dari Kabupaten Jembrana Provinsi Bali, diketahui satu
sampel positif.Pemeriksaan mikroskopik hapusan darah menunjukkan adanya
spesies Trypanosoma sp. dengan karakteristik morfologi yang khas seperti
T. evansi.
Bentuk terlihat seperti daun dengan panjang sekitar 23,09 – 39,94 µm dan
rata-rata panjang adalah 32,47 µm. Lebar tubuh sekitar 1,82 – 4,34 µm dengan
rata-rata 3,15 µm. Inti yang terlihat berukuran panjang 5,21 – 11,41 µm rata-rata
8,21 µm dan lebar inti sekitar 1,56 – 4,19 µm, rata-ratanya 3,10 µm. Dalam
gambar juga terlihat adanya kinetoplas yang memiliki panjang sekitar 2,34 – 9,05
µm dan rata-ratanya 5,16 µm, lebar kinetoplas berkisar antara 1,78 – 4,58 µm
dengan rata-rata 2,69 µm, serta undulating membran dengan panjang sekitar 8,95
– 17,45 µm, rata-rata 12,77 µm. Jarak antara inti ke kinetoplas sekitar 10,57 –
19,36 µm, rata-rata 14,80 µm. Morfologi yang terlihat sama dengan deskripsi
Soulsby (1982)untuk spesies T. evansi.
Ketika diamati dalam sampel darah segar, T. evansi berbentuk ramping,
berukuran lebih kecil dibandingkan dengan T. theileri, tetapi lebih besar
dibandingkan dengan T. congolens. T. evansi memiliki extremitas posterior yang
tipis dan juga flagela bebas, aktif bergerak tetapi memiliki perpindahan yang
terbatas jika dilihat dari mikroskop.Apabila diamati pada preparat ulas darah tipis
dengan pewarnaan Giemsa, terlihat bentuk monomorfik tipis Trypanomastigot
(Hoare, 1972).
29
30
Trypanosoma evansi dapat ditemukan di dalam sirkulasi darah pada fase
infeksi akut. Trypanosoma evansi memiliki ukuran panjang 15 sampai 34 μm
dengan rata-rata 24 µm dan dapat membelah (binary fission) untuk
memperbanyak diri. Bentuk yang khas seperti daun atau kumparan adalah ciri
khusus dan ditemukan flagella yang panjang sebagai alat gerak. Di bagian tengah
tubuh terdapat inti. Salah satu ujung tubuh berbentuk lancip, sedangkan ujung
tubuh yang lain agak tumpul dan terdapat bentukan yang disebut kinetoplas
(Naiposposet al., 2014). Dalam penelitian ini, ukuran T. evansi pada Sapi Bali
terlihat lebih panjang dengan rata-rata 32,47 µm. Hal ini berbeda dengan ukuran
T. evansi yang ada pada kuda yaitu rata-rata 27,94 µm (Elshafie et al., 2013).
Peningkatan panjang rata-rata T. evansi berhubungan dengan virulensi (Gill,
1977). Ukuran dan bentuk T.evansi dalam darah tidak berkaitan dengan
karakteristik genetik, tetapi pertumbuhan parasit berhubungan dengan respons
imun inang (Tejeroet al., 2008).
Salah satu aspek penting dari T. evansi adalah kemampuannya secara
periodik untuk mengubah varian glikoprotein permukaan (VSG) (Herrera et al.,
2001). Trypanosoma ditutupi oleh varian glikoprotein permukaan (VSG) yang
merupakan penentu antigenik utama sistem kekebalan tubuh inang (Maudlin and
Miles., 2004). Variabilitas terletak pada kemampuan parasit yang dapat
melepaskan lapisan dan membuat lapisan yang baru dengan glikoprotein
permukaan lain (Bacchi, 2009). Variasi antigen dalam T. evansi menjadi
mekanisme primer penolakan respon imun induk semang (Maudlin and Miles.,
2004).
31
Sebuah studi di India melaporkan besar variasi yang signifikan dalam total
panjang isolat T. evansi antara kerbau dan anjing (John et al., 1992). Variasi yang
berbeda dapat diamati dalam morfologi T. evansi ditemukan pada spesies hewan
yang sama, oleh karena itu pengamatan biometrikal dapat memberikan hanya
perkiraan diagnosis (Stephen, 1986; Tamarit et al., 2011). Dengan demikian,
konfirmasi infeksi dengan teknik molekuler diperlukan untuk mengatasi
keragaman yang terlihat pada diagnosis berdasarkan morfologi.
Pada penelitian ini, terdapat satu sampel darah Sapi Bali yang diperiksa
dengan ulas darah maupun dikuatkan dengan pemeriksaan PCR menunjukkan
hasil yang negatif. Hali ini disebabkanrespons imun terhadap infeksi T. evansi
pada kerbau dan sapi relatif lebih baik dari pada kuda sehingga ternak
ruminansia besar tersebut lebih tahan terhadap serang penyakit surra. Menurut
Soulsby (1982), penyakit surra dapat bersifat akut dan mewabah pada ternak
ruminansia ketika hewan mengalami stres, karena dipekerjakan atau difungsikan
terlampau berat, akibat kekurangan pakan atau air dan faktor kondisi lingkungan
kritis dan cuaca yang ekstrim.
Dalam penelitian terdahulu juga tidak didapatkan penyakit surra akut atau
kematian pada sapi dan kerbau yang diamati selama lebih dari 2 tahun di lapangan
(Partoutomo et al., 1996). Faktor lain yang ikut berperan sebagai penentu
terjadinya sakit atau kematian hewan dengan penyakit surra di lapangan adalah
pemeliharaan, makanan dan ada atau tidaknya infeksi campuran. Infeksi yang
kronis juga ditandai dengan kenaikan suhu badan antara hari ke-1-5 pascainfeksi
yang selanjutnya suhu badan berfluktuasi pada nilai normal. Walaupun jumlah
32
parasit di dalam darah meningkat sampai jumlah yang sangat tinggi, tetapi suhu
badan tidak menunjukkan kenaikan, atau dapat dikatakan bahwa tidak ada korelasi
antara jumlah parasit di dalam darah dan kenaikan suhu badan (Partoutomo,
1996).
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah Polymerease Chains
Reaction(PCR), yang merupakan metode deteksi antigen yang mempunyai
spesifisitas dan sensitivitas yang tinggi. Hasil deteksi Trypanosoma evansi dengan
menggunakan metode PCR menunjukkan hasil positif dengan panjang pita 480
bp. Untuk indentifikasi T.evansi dengan metode PCR, persentase deteksi dan
sensitivitas PCR tergantung dari primer yang digunakan yang ditentukan oleh
jumlah salinan dan homologi primer urutan target. Ketika parasitemia kurang dari
103 parasit/ml darah, pada periode prepaten, perlu untuk menggunakan setidaknya
100 ng DNA dalam sampel (Gonzálezet al., 2006). Pada penelitian ini
menggunakan primer ITS1 CF/BR yang dapat mendeteksi sampai 0,01 pg DNA
T.evansi (Njiru et al., 2005).
Meskipun memiliki sensivitas rendah, teknik ulas darah untuk mendeteksi
adanya T.evansi banyak digunakan di lapangan karena cepat untuk mendiagnosis
dan lebih murah. Sampel harus diperiksa maksimal dalam waktu 3 jam setelah
pengambilan sampel karena kelangsungan hidup T. evansi yang terbatas (Holland
et al., 2001). Berbeda dengan pemeriksaan ulas darah, salah satu keuntungan dari
PCR adalah bahwa sampel DNA dapat di proses dalam waktu lebih dari 3 jam
setelah pengambilan sampel (Gonzáles et al., 2003;Singh et al.,2004).
33
Polymerase Chain Reaction (PCR) diketahui memiliki sensitivitas yang
tinggi dalam hal deteksi parasit (Masake et al., 2002).Pada awal infeksi, teknik
PCR menunjukkan sensitivitas 80%, sedangkan pada fase infeksi kronis, teknik
PCR 2-3 kali lebih sensitif (Desquesnes and Davila, 2002).Dalam penelitian ini,
ada kemungkinan bahwa Sapi Bali (Bos sondaicus) yang terdeteksi positif
T.evansi berada pada fase aktif infeksi yang dibuktikan dengan ditemukan parasit
yang beredar di dalam darah cukup banyak dan dapat dideteksi dengan
pemeriksaan ulas darah dan PCR.
Metode PCR sudah banyak dilakukan untuk mendeteksi antigen termasuk
T.evansi. Polymerase Chain Reaction dapat mendeteksi infeksi T.evansi baik
infeksi awal atau kronis dibandingkan dengan teknik parasitologi tradisional dan
teknik serologi (Wuytset al., 1995). Salah satu faktor keberhasilan uji PCR adalah
kemurnian sampel dan kadar DNA yang digunakan sebagai template. Metode
PCR memiliki ambang sensitivitas yang biasanya berkisar 1 sampai 20 parasit/ml
darah. Jika parasitemia lebih rendah dari tingkat ini, PCR tidak dapat mendeteksi
adanya infeksi (negatif)(Desquesnes and Davila, 2002).
34
BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN
6.1. Kesimpulan
Hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa morfologi Trypanosoma
evansiyang terdapat pada Sapi Bali (Bos sondaicus) berdasarkan morfometri
berukuran panjang berkisar antara 23,09 – 39,94 µm dengan rata-rata 32,47 µm
dan lebar 1,82 – 4,34 µm dengan rata-rata 3,15 µm, yang dikuatkan dengan hasil
PCR dengan ditemukan pita dengan panjang 480 bp.
6.2. Saran
Berdasarkan hasil penelitian, maka saran yang dapat diajukan adalah
diperlukan penelitian lebih lanjut pada daerah lain di wilayah Indonesia terutama
pada daerah sekitar Provinsi Bali untuk mengetahui tingkat kejadian penyakit
surra pada Sapi Bali (Bos sondaicus) dan variasi morfologi dengan berdasarkan
pengukuran morfometri yang dikuatkan dengan pemeriksaan PCR.
34
35
RINGKASAN
Hayyu Maharani.Identifikasi Trypanosoma evansipada Sapi Bali (Bos
sondaicus) berdasarkan morfometri dan Polymerase Chain Reaction. Penelitian
ini di bawah bimbingan Dr. Mufasirin,drh., M.Si selaku pembimbing utama dan
Retno Bijanti, drh., M.S. selaku pembimbing serta.
Penyakit surra merupakan salah satu penyakit strategis yang menyerang
hewan ternak yang disebabkan oleh Trypanosoma evansi.Penyakit surra pada Sapi
Bali pernah terjadi di Flores, Provinsi Nusa Tenggara Timur pada tahun
1971.Sebanyak 516 ekor Sapi Bali terserang penyakit surra.Pada tahun 2009,
kasus penyakit surra pada Sapi Bali juga terjadi di Kecamatan Batu Engau,
Kabupaten Paser, Provinsi Kalimantan Timur.Dari 19 sampel yang diuji di
laboratorium BPPV Regional V Banjarbaru terdapat 8 sampel yang positif
penyakit surra.
Pemeriksaan morfometri dan teknik PCR adalah metode yang penting
untuk memperkuat diagnosis penyakit surra karenaketerbatasandiagnosis
T.evansiyang ada pada teknikparasitologidan disarankan untuk menggunakan
kombinasidaridua atau lebihteknik untukmeningkatkan akurasidiagnosis.
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi dan mengetahui morfologi
Trypanosoma evansiyang terdapat pada Sapi Bali (Bos sondaicus) berdasarkan
morfometri dan Polymerase Chain Reaction.Penelitian ini dilakukan pada bulan
Agustus 2015 sampai September 2015.
35
36
Penelitian ini menggunakan dua sampel darah Sapi Bali yang berasal dari
Kabupaten Jembrana yang didapatkan dari Balai Besar Veteriner Bali.Darah Sapi
Bali kemudian diperiksa dengan metode ulas darah. Pemeriksaan morfometri
dilakukan dengan cara hasil ulas darah yang positif terdapat Trypanosoma sp.
diperiksa di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x dan difoto dengan
menggunakan OptiLab®. Kemudian hasil foto tersebut diukur morfometri
Trypanosoma sp. yang meliputi panjang dan lebar tubuh, panjang dan lebar inti,
panjang dan lebar kinetoplas, panjang undulating membran dan jarak inti ke
kinetoplas. Selanjutnya darah Sapi Bali diekstraksi untuk memperoleh DNA.
Deoxyribonucleic Acid (DNA) hasil ekstraksi kemudian diamplifikasi melalui
proses PCR dengan menggunakan primer ITS1 CF/BR. Proses PCR menggunakan
program persiapan dengan suhu 94º C selama 5 menit, denaturasi 94ºC selama 40
detik, anneling dengan suhu 58º C selama 40 detik, extension rantai 72º C selama
90 detik dan terminasi 72º C selama 5 menit. Proses PCR menggunakan reaksi 35
siklus.
Hasil pemeriksaan morfometri Trypanosoma sp. pada Sapi Bali adalah
panjang sekitar 23,09 – 39,94 µm dan rata-rata panjang adalah 32,47 µm. Lebar
tubuh sekitar 1,82 – 4,34 µm dengan rata-rata 3,15 µm. Inti yang terlihat
berukuran panjang 5,21 – 11,41 µm rata-rata 8,21 µm dan lebar inti sekitar 1,56 –
4,19 µm dengan rata-rata 3,10 µm. Kinetoplas yang memiliki panjang sekitar 2,34
– 9,05 µm dan rata-rata 5,16 µm, lebar antara 1,78 – 4,58 µm dengan rata-rata
2,69 µm, serta undulating membran dengan panjang sekitar 8,95 – 17,45 µm, rata-
rata 12,77 µm. Jarak antara inti ke kinetoplas sekitar 10,57 – 19,36 µm, rata-rata
37
14,80 µm.Hasil deteksi Trypanosoma sp.dengan menggunakan metode PCR
menunjukkan hasil positif T. evansi dengan panjang pita 480 bp.
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa morfologi T.
evansiyang terdapat pada Sapi Bali (Bos sondaicus) berdasarkan morfometri
berukuran panjang berkisar antara 23,09 – 39,94 µm dengan rata-rata 32,47 µm
dan lebar 1,82 – 4,34 µm dengan rata-rata 3,15 µm, yang dikuatkan dengan hasil
PCR dengan ditemukanpita dengan panjang 480 bpdan disarankan perlu penelitian
lebih lanjut di daerah lain terutama daerah yang berada di sekitar Kabupaten
Jembrana dan Kabupaten di Provinsi Bali serta daerah lain di Indonesia.
38
DAFTAR PUSTAKA Adrian, S.M., A.S. Rehana, L. Hassan and M.T. Wong, 2010. Outbreaks of
trypanosomiasis and the seroprevalence of Trypanosoma evansi in a deer breeding centre in Perak, Malaysia. Trop. Anim. Health. Product.42 (2):145-150.
Ausvetplan. 2006. Disease Strategy Surra. Australia: Primary Industries
Ministerial Council OIE. 2008. Trypanosoma Evansi Infection (including surra). Belgium.
Bacchi, C.J., 2009. Chemotherapy of human African
Trypanosomiasis.Interdisciplinary Perspective Infectious Disease.1–5. Balai Penyidikan dan Pengujian Veteriner Regional V Banjarbaru.2009. Peta
Hasil Pengujian Hewan Kalimantan. Clausen, P.H., A. Wiemann, R. Patzelt, D. Kakaire, C. Poetzsch, A. Peregrine and
D. Mehlitz, 1998. Use of a PCR assay for the specific and sensitive detection of Trypanosoma sp. in naturally infected dairy cattle in peri-urban Kampala, Uganda. Ann. N.Y. Acad. Sci. 849:21–31.
Dargantes, A.P., R.S.F. Campbell, D.B. Copeman and S.A. Reid. 2005.
Experimental Trypanosoma evansi infection in the goat. II. Pathology. J. Comp. Pathol. 133(2):267-276.
Dávila, A.M., H.M. Herrera, T. Schlebinger, S.S. Souza andY.M. Traub-Cseko,
2003.Using PCR for unraveling the cryptic epizootiology of livestock Trypanosomosis in the Pantanal, Brazil. Vet. Parasitol. 117:1–13.
Desquesnes, M., and A.M.R. Dávila. 2002. Applications of PCR-based tools for
detection and identification of animal Trypanosomes: a review and perspectives. Vet.Parasitol. 109:213–231.
Duvallet, G., S. de La Rocque, J.M. Reifenberg, P. Solano, T. Lefrançois, J.F.
Michel, Z. Bengaly, I. Sidibe, D. Cuisance and G. Cuny. 1999. Review on the molecular tools for the understanding of the epidemiology of animal Trypanosomosis in West Africa. Mem.Inst. Oswaldo Cruz. 94: 245–248.
Elshafie, E.I., R.A. Sani, L. Hassan,R. Sharma, A. Bashir,and I.A. Abubakar.
2013. Seroprevalence and risk factors of Trypanosoma evansiinfection in horses in Peninsular Malaysia. Res.Vet. Sci. 94: 285-289.
FAO. 1994. In "A systematic approach to tsetseand Trypanosomiasis Control,
Proceedingsof the FAO Panels of Experts, Rome Dec.
38
39
Geneaid. 2014. gSYNCTM DNA Extraction Kit. 1-10. Gill, B.S., 1977.Trypanosomes and Trypanosomiasis of Indian Livestock. ICAR,
New Delhi. González, E., B. González-Baradat, R. González, N. Linares, A. Mijares, T.
Perrone and M. Mendoza. 2006. Development oftechniquepolymerasechain reactionfor diagnosisof animalTrypanosomosiscaused byTrypanosoma evansi.Agro. Trop. 56:496–500.
Gumilar, G., F. M. T. Supriyanti dan H.H. Siti., 2008.Bioteknologi. Jurusan
Pendidikan Kimia FMIPA UPI. Bandung. Guntoro S., 2002. Membudidayakan Sapi Bali.Kanisius.Yogyakarta. Handiwirawan, E. dan Subandriyo. 2004. Potensi dan keragaman sumberdaya
genetik sapi bali. Lokakarya Nasional Sapi Potong. Pusat Penelitiandan Pengembangan Peternakan. Hlm. 50-60.
Hardjosubroto, W., 1994. Aplikasi Pemuliabiakan Ternak di Lapangan. PT.
Gramedia Widiasarana Indonesia. Jakarta. Herrera, H.M., L.P.C.T. Aquino, R.F. Menezes, L.C. Marques, M.A.V. Moraes,
K. Werther and R.Z. Machado.2001.Trypanosoma evansiexperimental infection in South American coati (Nasua nasua): clinical, parasitological and humoral immune response. Vet. Parasitol. 102: 209–216.
Herrera, H.M., A.M.R. Davila, A. Norek, U.G. Abreu, S.S. Souza, P.S. D’Andrea
andA.M. Jansen. 2004. Enzootiology of Trypanosoma evansi in Pantanal, Brazil.Vet.Parasitol. 125:263–275.
Hoare CA., 1972. The Trypanosomes of Mammals: a zoological monograph.
Blackwell Scientific Publications, Oxford, U.K, 749. Holland, W.G., F. Claes, N.G. Thanh, P.T. Tam and D. Verloo et al., 2001.A
comparative evaluation of parasitological tests and a PCR for Trypanosoma
evansi diagnosis in experimentally infected water buffaloes. Vet. Parasitol.97: 23-33.
Ismudiono, N. D. Retno, H. Anwar, R. Sidik, K. Soepranianondo, Y. Dhamayanti, R.S. Wahyuni, P. Srianto, D.S. Nazar, B. Sektiari, M. Yunus, F.A. Ratam, T. Nurhayati, dan S. Prawestirini. 2006. Laporan studi Kelayakan Pendirian Pusat pembibitan dan Pengembangan Ternak Kerbau Rawa di Kabupaten Kutai Kartanegara Kalimantan Timur. Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Surabaya.
40
Javid, A.K., A. Fayaz, Z.C. Mohammad, A.D. Javid, and T. Hidayatullah. 2013. On Morphology and Morphometry of Trichuris ovis Abildgaard, 1795 Recovered from Ruminants of Ladakh, India. J. Buffalo Sci. Res. 2:49-52.
Jefrey, H.C and Leach., 1983. Atlas Helminthologi dan Protozoologi Kedokteran. Edisi II. Penerbit E.G.C. Jakarta.Hlm : 61 – 63.
John, M.C., S. Nedunchelliyan, and K.S. Venkataraman. 1992. Biometrical
observations on different strains of Trypanosoma evansi. Vet. Parasitol. 43: 143-145.
Jones T. W., R.C. Payne,I.P. Sukanto, dan S. Partoutomo. 1996. Trypanosoma
evansi in the republic of Indonesia. Proceedings of the first Internet Conference on Salivarian Trypanosomes. FAO anim. prod. 136.
Levine, N. D. 1985. Veterinary Protozoology.1st Edition.Iowa Statet University Press. Ames.
Losos, G.J. 1986. Infectious Tropical Disease of Domestic Animal.IDRC. Canada.
Hlm : 183 – 263. Luckins, A. G., 1998. Epidemiology of Surra: unanswered questions. J. Protozool.
Res. 8:106-119. Luckins, A.G., N. Mclntyre, and P. Rae. 1992. Multiplication of Trypanosoma
evansi at the site of infection in skin of rabbits and cattle. Acta Tropica. 50:19-27.
Manuel, M. F., 1998. Sporadic outbreaks of Surra in the Philippines and its
economic impact.J. Protozool. Res. 8:131-138. Masake, R.A., J.T. Njuguna, C.C. Brown, and P.A.O.Majiwa. 2002. The
application of PCR ELISA to the detection of Trypanosoma brucei and T. vivax infections in livestock. Vet.Parasitol. 105:179-189.
Mastra, I.K., 2011. Seroprevalensi Trypanosomiasis Di Pulau Sumbawa, Propinsi
Nusa Tenggara Barat. Buletin Veteriner, BBVet Denpasar.23:79 Maudlin, I., P.H. Holmes, and M.A. Miles. 2004. The Trypanosomiasis. CABI
PublishingCAB International, Oxfordshire, U.K. 25–30, 283–331. McCool, C. 1992. Buffalo and Bali cattle: Exploiting their reproductive behaviour
and physiology. Trop. An. Health and Product.24: 165. Monzon C.M., O.A. Mancebo,and J.P. Roux. 1990. Comparison between 6
parasitological methods for diagnosis of Trypanosoma evansi in the subtropical area of Argentina. Vet. Parasitol. 36:141–146.
41
Moran.J.B., 1990.Performans dari sapi-sapi Pedaging di Indonesia dalam Kondisi
Pengelolaan Tradisional dan Diperbaiki. Laporan Seminar Ruminansia II. Pusat Penelitian dan Pengembangan Ternak. Bogor.
Morrison. W.I., M. Murray and W.I. McIntrye. 1981. Bovine Trypanosomiasis.
Desease of Cattle In The Tropic. Martinus Nijhoff Publisher. London. Hlm: 469 – 496.
Murray, R.K., D.K. Granner dan V.W. Rodwell.2006. Biokimia Harper. Penerbit
Buku Kedokteran EGC. Jakarta. Naipospos, T. S. P., P.P. Suseno, C. Basri, M.Z. Hasan, D. Sudiana., dan H. Latif.
2014. CIVAS. Trypanosomiasis (Surra). Nantulya, V. M., 1994. Suratex: a simple latexagglutination antigen test for
diagnosis ofTrypansoma evansi suratex infections(surra). Trop. Med. Parasitol. 45(1):9-1.
Njiru, Z.K., C.C. Constantine, S. Guya, J. Crowther, J.M. Kiragu, R.C.
Thompson, and A.M. Davila. 2005. The use of ITS1 rDNA PCR in detecting pathogenic African Trypanosomes. Parasitol. Res. 95:186–192.
Noble, E.R and G.A. Noble., 1982. Parasitologi ( Biologi Parasit Hewan ). Gadjah
Mada University Press. Hlm:67 – 69. Office International des Epizootics (OIE). 2009. Manual ofDiagnostic Tests
and Vaccine for Terrestrial Animals. New York, USA. Pane, I., 1990.Upaya peningkatan mutu genetik sapi Bali di P3 Bali.Prosiding
Seminar Nasional Sapi Bali.Bali. Partoutomo, S., 1996.Trypanosomiasis Caused by Trypanosoma evansi (Surra) in
Indonesia. Proceeding of A Seminar on Diagnostic Techniques for Trypanosoma evansi in Indonesia. Balitvet, Bogor: 1-9.
Payne, R. C., I. P. Sukanto, D. Djauhari, D. Partoutomo, S. Wilson, A. J. Jones,R.
Boid, and A. G. Luckins., 1991.Trypanosoma evansi infection in cattle, buffaloes andhorses in Indonesia. Vet. Parasitol. 38:109-119.
Pereira, D. E., P. J. L. Almeda, M. Ndao, B. Goosens, and S. Osaer.1998. PCR
primer evaluation for the detection of Trypanosome DNA in naturally infected goats. Vet. Parasitol.80:111-116.
42
Putu, I.G., P. Situmorang, A. Lubis, T.D. Chaniago, E. Triwulaningsih, T. Sugiarti, I.W. Mathius dan B. Sudaryanto. 1998. Pengaruh pemberian pakan konsentrat tambahan selama dua bulan sebelum dan sesudah kelahiran terhadap performan produksi dan reproduksi sapi potong. Prosiding Seminar Nasional Peternakan dan Veteriner. Bogor.
Reid S.A., A.Husein,andD.B. Copeman. 2001. Evaluation and improvement of
parasitological tests for Trypanosoma evansi infection. Vet. Parasitol. 102: 291–297.
Ressang, A.A., 1984. Trypanosomiasis. Patologi Khusus Veteriner. Edisi II.
Airlangga University Press.Hlm : 347 – 359.
Sasmita, R., P. Hastutiek, A. Sunarso, dan M. Yunus. 2013. Buku Ajar Arthropoda Veteriner. Airlangga University Press. Surabaya.
Singh, N., K.M.L. Pathak, and R. Kumar. 2004. A comparative evaluation of parasitological, serological and DNA amplification methods for diagnosis of natural Trypanosoma evansi infection in camels. Vet. Parasitol.126:365-373.
Sivarajasingham, S., 1992. Improvement of indigenous cattle and buffalo breeds
in South East Asia. Proceeding of the 6th AAAP Animal Science Congress. Bangkok. 151.
Solihat, L. 2002. Proses Pemeriksaan Sampel Penyakit-Penyakit Parasit Darah di Laboratorium Parasitologi Balivet. Temu Teknis Fungsional Non Peneliti.
Soulsby, E. J. L., 1982.Helminths, Arthropods, and Protozoa of Domesticated Animals.7th ed.Lea and Febriger. London. 514:532-536.
Stephen, L.E.,1986. Trypanosomiasis: a veterinary perspective. Pergamon Press,
Oxford. Sukanto, I.P., 1994. Petunjuk diagnosa parasit darah Trypanosoma, Babesia dan
Anaplasma dan Prosiding Seminar Penelitian Parasit Besar di Indonesia. Bogor. Hlm: 23-28.
Sutan, S.M., 1988. Perbandingan Performans Reproduksi dan Produksi antara
Sapi Brahman, Peranakan Ongole dan Bali di Daerah Transmigrasi Batumarta, Sumatra Selatan.Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Talib, C., A. Bamualim, dan A.Pohan., 1998. Problematika pengembangan sapi
bali dalam pemeliharaan di padang penggembalaan. Prosiding Seminar Nasional Peternakan dan Veteriner. Bogor.
43
Tamarit, A., M.T. Tejedor-Junco, M. González, J. Alberola And C. Gutierrez. 2011. Morphological and biometrical features of Trypanosoma evansi isolates from an outbreak in mainland Spain. Vet. Parasitol. 177: 152-156.
Tanari, M., 2001. Usaha Pengembangan Sapi bali sebagai Ternak Lokal dalam
Menunjang Pemenuhan Kebutuhan Protein asal Hewani di Indonesia. Tejero F., A. Roschman-González, T.M. Perrone-Carmona, and P.M. Aso. 2008.
Trypanosoma evansi: A quantitative approach to the understanding of the morphometry-hematology relationship throughout experimental murine infections. J. Protozool. Res. 18: 34-47.
Thumbi, S. M., F. A. McOdimba, R. O. Mosi, and J. O. Jung’a.,
2008.Comparative evaluationof three PCR base diagnostic assays for the detection of pathogenic Trypanosomes in cattleblood.Parasitol.Vec. 1:1-7.
Vellayan, S., M. Aidi,R.W. Radcliffe,L.J. Lowenstine,J. Epstein,S.A. Reid,D.E.
Paglia, R.M. Radcliffe, T.L. Roth, T.J. Foose, M. Khan, V. Jayam, S. Reza, and M. Abraham.2004. Trypanosomiasis (Surra) in The Captive Sumatran Rhinoceros (Dicerorhinus Sumatrensis Sumatrensis) in Peninsular Malaysia. Int Congr Entomol Proc Trop Vet. Med. 11:187-189.
Wibisono A., 2009. Silsilah sapi Bali. Wiser, M.F., 1999.Kinetoplastids.www.fao.org. Wuyts N., N. Chokesajjawatee, N. SarataphanAnd S. Panyim. 1995. PCR
amplification of crude blood on microscope slides in the diagnosis of Trypanosoma evansiin dairy cattle. Ann. Soc. Belge Med. Trop. 75:229–237.
Yuwono, T., 2006.Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Penerbit Andi.
Yogyakarta.
44
LAMPIRAN 1.Gen Trypanosoma evansi ORIGIN
1. ttagccatgc atgcctcaga atcactgcat tgcaggaatc tgcgcatggc
tcattacatc
61. gacgtaatc tgccgccaaa attttgcggt ctccgcatta ctggataact
tggcgaaacg
121. ccaagctaat acatgaacca atcggacgct ctctttttct atgtcgcggc
ttgtgtttac
181. gcacttgtcg tggcgatggg acgtccagcg aatgaatgaa attagaacca
acgcctccac
241. ccgggggcag taacactcag acgtgttgac tcaattcatt ccgtgcgaaa
gccgagcctt
301. gttgctcggc gtctactgac gaacaactgc cctatcagcc agtgatggcc
gtgtagtgga
361. ctgccatggc gttgacggga gcgggggatt agggttcgat tccggagagg
gagcctgaga
421. aatagctacc acttctacgg agggcagcag gcgcgcaaat tgcccaatgt
cgaaaaaata
481. cgatgaggca gcgaaaagaa atagagccga ccgtgcccta gtgcatggtt
gttttcaatg
541. ggggatactc aaacccatcc aatatcgagt aacaattgga ggacaagtct
ggtgccagca
601. cccgcggtaa ttccagctcc aaaagcgtat attaatgctg ttgctgttaa
agggttcgta
661. gttgaactgt gggccacgta gttttgtgcc gtgccagtcc cgtccacctc
ggacgtgttt
721. tgacccacgc cctcgtggcc cgtgaacaca ctcagataca agaaacacgg
gagcggttcc
781. tcctcacttt cacgcatgtc atgcatgcga gggggcgtcc gtgaatttta
ctgtgaccaa
841. aaaagtgcga ccaaagcagt ctgccgactt gaattacaaa gcatgggata
acgaagcatc
901. agccctgggg ccaccgtttc ggcttttgtt ggttttagaa gtccttggga
gattatgggg
961. ccgcgtgcct tgggtcggtg tttcgtgtct catttttgtg gcgcgcacat
tcggctcttc
1021. gtgatgtttt tttacattca ttgcgacgcg cggcttccag gaatgaagga
gggtagttcg
1081. ggggagaacg tactggtgcg tcagaggtga aattcttaga ccgcaccaag
acgaactaca
1141. gcgaaggcat tcttcaagga taccttcctc aatcaagaac caaagtgtgg
ggatcaaaga
1201. tgattagaga ccattgtagt ccacactgca aaccatgaca cccatgaatt
ggggaacatc
1261. attgggtgcc cgtgtggcgg ccttttgtgc cgaccctcgg ccccaattta
tttatcaatt
1321. tacgtgccta ttctatcacc cccggttccc tcttttgagg ttcttccggg
gttttttacg
1381. ggaatatcct cagcacgttt cttacttctt cacgcgaaag cttggaggtt
acagtctcag
1441. gggggagtac gttcgcaaga gtgaaactta aagaaattga cggaatggca
ccacaagacg
1501. tggagcgtgc ggtttaattt gactcaacac ggggaacttt accagatccg
gacagggtga
45
1561. ggattgacag atggagtgtt ctttctcgat cccctgaatg gtggtgcatg
gccgcttttg
1621. gtcggtggag tgatttgttt ggttgattcc gtcaacggac gagatccaag
ctgcccagta
1681. ggtgccggga ttgtccacac aggacagcag tccctccggc ggggattttt
tccccaacgg
1741. tggtcgtcat ccttcttttt acaggcccct tctctgcggg attccttgct
tttcgcgcaa
1801. ggtgagattt tgggcaacag caggtctgtg atgctcctca atgttctggg
cgacacgcgc
1861. actacaatgt cagtgagaac aagagtccga gcggcacttc acaatgtcgc
tcccgcttga
1921. tcaaaagagc ggggaaacca cggaatcacg tagacccact tgggaccgag
tattgcaatt
1981. attggtcgcg caacgaggaa tgtctcgtag gcgcagctca tcaaactgtg
ccgattacgt
2041. ccctgccatt tgtacacacc gcccgtcgtt gtttccgatg atggtgcaat
acaggtccgg
2101. aagttcaccgatattggatc ggaccgtcgctccgggcgaccgacttcaat
agaggaagca
2161. aaagtcgtaa caaggtagct gtaggtgaac ctgcagctgg atcattttct
gatatccatt
2221. atacaaaaaa gagcatattt atgtgcatgt ataaattgca cagtatgcaa
ccaaaaatat
2281. acatatatgt tttacatgta tgtgtttcta tatgccgttt gacatgggag
atgagggatg
2341. ctatacatag ttctgttatt ttctatcatg tatgtgtgtt agagtgtctg
tgttaatata
2401. ctttttaatg catgctctac ataatataca gtagtaataa cacagagaat
acgtatggaa
2461. tgcgtatctc tctatatata tttatgtata tatgctatgt gtatatcaac
ctcgcatatt
2521. ttctccctgt tgaccacggc tcccacaacg tgtcgcgatg
gatgacttttcttcctagtt
2581. cgttgaagaacgcagcacgc gcaagatgcgatcaattgta gcagaatcat
ttcattgccc
2641. aatctttgaa cgcaaacggc gcatgggaga agctctctcg agccatcccc
gtgcatgcca
2701. catttctcag tgtcgaatat aaaaacaaaa cacacaccta ttttgtgttg
ttcaacgcac
2761. gcaaaaaatc ccgccacctc tttctcctcg tgtggtgcat attcatgttt
gtgagtgtgc
2821. acatatacga tatctttcaa ctctttctac tcgcacgatg gtgtatgtca
cgcatatacg
2881. tgtgtgtagt gagtgatatg gaagagaaat gggaaaggca tatatatata
tgtatataca
2941. taatatatat gtgtgtggat ttgtgtgttg agcacatata aggaaaaagg
ttgtgtgtat
3001. atacagagag tctgtggcgg ttgggacatg tgtataaata tatatatgta
tatgtgtgtg
3061. ttccgctgtg gagattttat atcttacgga gagtgttcat atatatatgt
ttgtacgcat
3121. gtattttggc gccccgtata gagattaaaa aagaagagaa aaagtatgca
aaagaggcgg
3181. cggatagtgt gtatgtgtgt attcacagca agcaactata ttttgctgct
tgtgagtata
46
3241. tgcatatatg tacattatgt gcttgtgctt ctttcgtgta cgcttcactt
ttttatattg
3301. catttttcag acctgagtgt ggcaggacca cccgctaaac ttaagcatat
tactcagcgg
3361. aggaaaagaa aacaa
2. Letak penempelan primer foward ITS1 CF/BR pada sequenze gen Trypanosoma evansi
A lignment s tatis tic s for match #1
Score Expect Identities Gaps Strand
32.2 bits(16) 9e-06 16/16(100%) 0/16(0%) P lus/Plus
Query 5 AAGTTCACCGATATTG 20
||||||||||||||||
Sbjct 2117 AAGTTCACCGATATTG 2097
3. Letak penempelan primer reverse ITS1 CF/BR pada sequenze gen
Trypanosoma evansi
Al i gnment stati st i cs for match # 1
Score Expect Identities Gaps Strand
38.2 bits(19) 1e-07 19/19(100%) 0/19(0%) Plus/Minus
Query 1 TGCTGCGTTCTTCAACGAA 19
|||||||||||||||||||
Sbjct 2597 TGCTGCGTTCTTCAACGAA 2578
Sumber : National Center of Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov)
![01 format artikel ejournal mulai hlm ganjil...vhodpd lql glvhohqjjdudndq rohk uh]lp rugh edux glpdqd irupdolwdv ohelk glnhghsdqndq gdul sdgd nhq\dwddq +lqjjd sdvfd wxpedqjq\d uh]lp](https://static.fdokumen.com/doc/165x107/5e48f0a7e51ed14ef71750ae/01-format-artikel-ejournal-mulai-hlm-ganjil-vhodpd-lql-glvhohqjjdudndq-rohk.jpg)
